CN108135845B - 用于体内核酸表达的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于在受试者中产生一种或多种蛋白质和/或生物活性核酸分子的表达(例如，在治疗水平下持续产生治疗作用所需的延长的时间段)的组合物、系统、试剂盒以及方法。在某些实施方案中，提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包括第一组合物，所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构；以及第二组合物，所述第二组合物包含治疗有效量的不含CpG或CpG减少的表达载体(例如，不与脂质体缔合的非病毒表达载体)，其中所述表达载体包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)一种或多种第一治疗性蛋白，和/或ii)一种或多种第一生物活性核酸分子。

Description

用于体内核酸表达的系统和方法
本申请要求2015年9月18日提交的美国临时申请序列号62/220,646的优先权，所述申请以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明提供用于在受试者、人或非人哺乳动物中表达一种或多种蛋白质或生物活性核酸分子(例如，在治疗水平下持续产生治疗作用所需的延长的时间段)的组合物、系统、试剂盒以及方法。在某些实施方案中，提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包括第一组合物，所述第一组合物包含聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、阳离子胶束、阳离子乳液或阳离子聚合物)；以及第二组合物，所述第二组合物包含不含CpG或CpG减少的表达载体(例如，不与脂质体或其他载体缔合的非病毒表达载体)，所述表达载体包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)一种或多种第一治疗性蛋白，和/或ii)一种或多种第一生物活性核酸分子。在其他实施方案中，此类第一和第二组合物被顺序地(例如全身性地)施用至受试者，以使得所述治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在所述受试者中表达(例如，在治疗水平下持续至少5天或至少50天，以使得治疗疾病或病状或改变生理或疾病性状)。
技术背景
最简单的非病毒基因递送系统使用裸表达载体DNA。将游离DNA直接注射到某些组织(特别是肌肉)中已经显示产生高水平的基因表达，并且这种方法的简单性已使得其在许多临床方案中采用。具体地说，这种方法已经应用于癌症的基因疗法，其中DNA可直接注射到肿瘤中，或者可注射到肌细胞中以便表达可充当癌症疫苗的肿瘤抗原。
尽管质粒DNA的直接注射已显示产生基因表达，但总体表达水平远低于用病毒或脂质体载体。由于存在血清核酸酶，裸DNA通常也被认为不适于全身施用。结果，质粒DNA的直接注射似乎仅限于涉及直接注射容易地进入的组织如皮肤和肌细胞的一些应用。
发明内容
本发明提供了用于在受试者中表达一种或多种蛋白质和/或生物活性核酸分子(例如，在治疗水平下持续在宿主中产生治疗作用所需的延长的时间段)的组合物、系统、试剂盒以及方法。在某些实施方案中，提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包括第一组合物，所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)；以及第二组合物，所述第二组合物包含治疗有效量的不含CpG或CpG减少的表达载体(例如，不与脂质体缔合的非病毒表达载体)，其中所述表达载体包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白(或非治疗性蛋白，如标记蛋白)，和/或ii)第一生物活性核酸分子。在某些实施方案中，所述表达载体包含编码第二、第三和/或第四治疗性或非治疗性蛋白和/或第二、第三或第四生物活性核酸分子的第二、第三或第四核酸序列。在一些实施方案中，所述第一核酸序列进一步编码第二、第三、第四、第五和/或第六治疗性蛋白和/或第二、第三、第四、第五和/或第六生物活性核酸分子。在其他实施方案中，此类第一和第二组合物被顺序地(例如全身性地)施用至受试者，以使得所述治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在所述受试者中表达(例如，在治疗水平下，持续至少5天或至少50天，或至少100...200...或至少400天，以使得治疗疾病或病状或改变生理性状)。
在一些实施方案中，本文提供在受试者(例如人或非人哺乳动物)中表达第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子的方法，所述方法包括：a)向受试者施用(例如全身性地)第一组合物，其中所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)，并且其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子(例如，核酸在所述组合物中不可检测或几乎不可检测)；以及b)向所述受试者施用(例如全身性地、血管内等)第二组合物(例如，在施用所述第一组合物的约2...10...50...100...200...300...400分钟内开始)，其中所述第二组合物包含一定量的表达载体(例如，不与脂质体或任何其他载体缔合的非病毒表达载体)，其中所述表达载体是不含CpG或CpG减少的，其中所述表达载体中的每种包含核酸序列，所述核酸序列编码：i)第一、第二、第三、第四、第五和/或第六治疗性蛋白或非治疗性蛋白，和/或ii)第一、第二、第三、第四、第五和/或第六生物活性核酸分子。在某些实施方案中，作为施用所述第一组合物和施用所述第二组合物的结果，所述第一治疗性或非治疗性蛋白和/或所述生物活性核酸分子在所述受试者中表达(例如，在关于疾病或病状的治疗水平下，持续至少5...50...100...300天...400天或更长时间，或者在足以改变生理或疾病性状的有效水平下)。在某些实施方案中，存在于所述第一组合物中的聚阳离子结构(例如，空脂质体)具有约20-85nm(例如20...25...30...40...45...50...55...60...65...70...75...80...85nm)的z-平均直径。在某些实施方案中，所述聚阳离子结构是具有约72-76nm的z-平均直径的空脂质体，并且是小单层囊泡。
在一些实施方案中，本文提供在受试者中表达第一治疗性或非治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子的方法，所述方法包括：a)向受试者施用第一组合物，其中所述受试者具有疾病或病状的至少一种症状，或至少具有待改变的生理性状，其中所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)，并且其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)在施用所述第一组合物的约100分钟或约200...或400分钟内向所述受试者施用(或开始施用)第二组合物，其中所述第二组合物包含治疗有效量的表达载体，其中所述表达载体是不含CpG或CpG减少的，其中所述表达载体各自包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性或非治疗性蛋白，和/或ii)第一生物活性核酸分子；c)向所述受试者施用地塞米松棕榈酸酯和/或中性脂质，所述地塞米松棕榈酸酯和/或中性脂质在所述第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中(例如，在施用所述第一或第二组合物的100或200...或400分钟内)。在一些实施方案中，作为施用所述第一组合物、施用所述第二组合物和施用地塞米松棕榈酸酯和/或中性脂质的结果，所述第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在所述受试者中在关于所述疾病或病状的治疗水平下或在足以改变所述生理或疾病性状的有效水平下表达。
在某些实施方案中，地塞米松棕榈酸酯是在所述第一组合物中，并且其中2.0％至6.0％(例如2.0％...2.5％...3.0％)的所述第一组合物的包含地塞米松棕榈酸酯。在某些实施方案中，地塞米松棕榈酸酯在所述第三组合物中施用，其在施用所述第一和/或第二组合物之前施用，或在所述第一和/或第二组合物之后施用，但在其100...400分钟内施用。在某些实施方案中，所述方法还包括d)向所述受试者施用地塞米松，所述地塞米松在所述第一和/或第二和/或第三组合物中，或存在于第四组合物中(例如，在施用所述第一或第二或第三组合物的100或300分钟内开始，如在所述施用中的任一者之前或在其他施用之后)。在某些实施方案中，存在于所述第一组合物中的聚阳离子结构(例如，空脂质体)具有约20-85nm(例如20...25...30...40...45...50...55...60...65...70...75...80...85nm)的z-平均直径。在某些实施方案中，所述聚阳离子结构是具有约72-76nm的z-平均直径的空脂质体，并且是小单层囊泡。在一些实施方案中，A)比例是10∶1至18∶1；B)2.0％至6.0％的所述第一组合物包含地塞米松或地塞米松棕榈酸酯；和/或C)所述表达载体中的每种各自仅包含单个表达盒(即，每种载体中不存在其他表达盒)，其中所述表达盒包含编码第一治疗性蛋白的第一核酸序列和编码第二治疗性蛋白的第二核酸序列，并且其中所述表达盒编码在所述第一核酸序列与所述第二核酸序列之间的自裂解肽序列(或其他裂解序列)。在某些实施方案中，所述自裂解肽包含FMDV 2A。在具体实施方案中，所述第一治疗性蛋白包含单克隆抗体轻链，并且所述第二治疗性蛋白包含所述单克隆抗体的重链(例如，当在受试者中表达时所述轻链和重链组合以形成单克隆抗体片段(例如，Fab)或单克隆抗体)。在某些实施方案中，所述聚阳离子结构包含空脂质体。在具体实施方案中，存在于所述第一组合物中的空脂质体具有约50-85nm的平均直径。在某些实施方案中，所述方法还包括施用药剂或另外的调控表达载体，所述药剂或另外的调控表达载体在所述第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中，其中与不向所述受试者施用所述药物剂时相比(例如对于仅需要表达特定有限时间量的治疗剂来说)，所述药剂增加或减少在治疗或有效水平下的表达和/或在所述治疗或有效水平下的表达的时间长度。在具体实施方案中，所述药剂选自秋水仙碱、地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、中性脂质、丙戊酸、茶碱、西地那非、氨来呫诺、氯喹、SAHA以及L-精氨酸+西地那非。
在一些实施方案中，所述表达载体各自还包含调控核酸序列，其中所述调控核酸序列减少在不存在所述调控核酸序列的情况下将发生的第一核酸序列的表达的持续时间。在其他实施方案中，所述调控核酸序列选自由以下各项组成的组：启动子、增强子、编码第二蛋白质的第二核酸序列和/或第二生物活性核酸分子。在另外的实施方案中，所述第一组合物中的第一量的聚阳离子结构包含至少第一种和第二种不同类型的阳离子脂质体的混合物，与在所述方法中采用仅所述第一种或仅所述第二种类型的阳离子脂质体时第一治疗性蛋白和/或第一生物活性核酸分子的表达相比，所述混合物降低这种表达。在具体实施方案中，所述治疗性蛋白在高于1ug/ml(例如，1.1-1.5ug/ml)的水平下表达，并且其中所述治疗性蛋白在所述受试者中在所述水平下表达至少连续7天(例如，至少7...21...50...100...或400天)。
在某些实施方案中，本文提供在受试者中表达第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子的方法，所述方法包括：a)向受试者施用(例如，全身性地)第一组合物，其中所述受试者具有疾病或病状的至少一种症状，或具有待改变的至少一种生理性状(例如，造血干细胞的水平)，其中所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)，并且其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)在施用所述第一组合物的约2...10...25...100...200或400分钟内开始(或完成)向所述受试者施用(例如，全身性地)第二组合物，其中所述第二组合物包含治疗有效量的表达载体(例如质粒)，其中所述表达载体是不含CpG或CpG减少的(例如，所述表达载体的核酸序列已被改变为含有比通常存在于所述载体中的序列的野生型型式中更少的CpG二核苷酸，其中所述表达载体各自包含核酸序列，所述核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白(或第一和第二治疗性蛋白，或第一、第二和第三治疗性蛋白等)，和/或ii)第一生物活性核酸分子(或第一和第二或更多生物活性核酸分子)，并且其中，作为施用所述第一组合物和施用所述第二组合物的结果，并且其中，作为施用所述第一和第二组合物的结果，所述治疗性蛋白和/或所述生物活性核酸分子在所述受试者中在关于所述疾病或病状的治疗水平下或在足以改变所述生理或疾病性状的有效水平下表达。
在某些实施方案中，在第二组合物中所述表达载体不与聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液))或其他分子缔合(并且在所述第二组合物中不存在可检测的聚阳离子结构)。在其他实施方案中，所述表达载体是裸非病毒表达载体(例如，质粒)。在某些实施方案中，所述表达载体是病毒表达载体(例如，腺相关病毒载体或腺病毒载体或合成mRNA、miRNA、核酶或shRNA核酸载体)。在具体实施方案中，所述第一和/或第二组合物全身、局部、经皮、皮内、口服、肌内、静脉内、到胃肠道、膀胱中或通过肺吸入或通过鞘内或心室内途径施用。
在某些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白和/或一种或多种生物活性核酸分子在连续日在所述受试者中在治疗或有效水平下表达至少5...20...63...100...200...300天...1年或更长。在一些实施方案中，所述方法还包括：c)在施用所述第一和第二组合物至少5...20...63...100...200...300天...或1年后测试所述受试者(例如，身体成像或扫描)或来自所述受试者的样品(例如，血液、血清、血浆、组织、尿液等)，以及确定所述治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在所述受试者中在所述治疗或有效水平下表达(例如，由于第一和第二组合物的单一治疗，治疗水平在受试者中持续在所述受试者中产生治疗作用所需的时间段)。在另外的实施方案中，所述方法还包括：d)产生指示所述治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在所述受试者中在所述治疗或有效水平下表达(例如，持续一定量的时间)的书面和/或电子报告。在其他实施方案中，将所述报告从进行所述测试的实验室发送至治疗临床医生或从业者和/或患者。
在一些实施方案中，所述治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在至少50pg/ml...100...500...1000...1500...4000...8000...9500...1,000,000pg/ml(1ug/ml)...1.5ug/ml或更高的水平下表达，并且其中测定来自所述受试者的血液、血清或血浆样品(或其他生物样品)以确定在施用所述第一和第二组合物后实现治疗或有效水平持续至少5...7...10...25...45...63...150...300天或更长时间。在其他实施方案中，所述治疗性蛋白在至少50pg/ml或至少100pg/ml或至少500、1,000,000pg/ml(1ug/ml)...1.5ug/ml或更高的水平下表达，并且其中所述治疗性蛋白在所述受试者中在所述水平下表达至少连续5...7...10...25...45...63...150...300...350天。在某些实施方案中，在施用所述第一和第二组合物后至少48小时后，所述治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在所述受试者中表达(例如，在治疗水平下)而无临床上显著的升高的毒性(例如，如通过ALT(丙氨酸转氨酶)和/或AST(天冬氨酸转氨酶)所测量)。
在某些实施方案中，所述治疗性蛋白是人G-CSF(例如，如由SEQ ID NO：1编码，或与SEQ ID NO：1具有至少98％同一性的序列)并且在受试者中在至少100pg/ml的治疗水平下(如在血液、血清或血浆样品中所测量)表达，其中所述治疗性蛋白在所述受试者中表达至少7天，并且其中所述疾病、病状或生理性状选自由以下各项组成的组：由化学疗法引起的中性粒细胞减少症、干细胞供体或受体的血液中造血干细胞的水平不升高、心脏变性、脑缺血、肌萎缩性侧索硬化、嗜中性粒细胞缺乏病以及辐射暴露。在具体实施方案中，所述G-CSF表达至少5或6或7天但不超过约10天(例如，使用药物、启动子/增强子组合、在核酸载体内的另外表达盒或另外表达的蛋白质以将产生限制至约10天，以避免由表达超过约10天引起的任何毒性嗜中性粒细胞相关的副作用)。在其他实施方案中，所述治疗性蛋白是利妥昔单抗或类似的抗CD20抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白是人因子IX或类似的蛋白质。
在具体实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白和/或一种或多种生物活性核酸分子在所述治疗水平下在受试者中表达足够量的时间以减少或消除至少一种症状(或所有症状)而所述受试者不必接受向所述受试者提供所述治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子的任何其他治疗。在其他实施方案中，在足够时间期间，所述受试者不接受任何其他特定治疗(例如，没有向所述受试者提供治疗性蛋白或生物活性核酸分子的其他特定的治疗性治疗)。在某些实施方案中，所述受试者具有一种或多种疾病的多种症状，并且其中所述足够量的时间是使得所述疾病和/或所述病状的多种症状的全部或基本上全部在所述受试者中减轻或消除(例如，永久性地或持续至少20天...50天...200天...1年或更长)。在其他实施方案中，在足够的时间期间，所述受试者不接受任何其他疾病特异性治疗。
在一些实施方案中，所述聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)的第一量是约0.01-70、30-50或20-60微摩尔/1千克的受试者(例如，0.01...1...10...20...40...或60微摩尔/千克)。在其他实施方案中，所述聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质)的第一量与表达载体的治疗有效量的比例是0.5∶1至25∶1纳摩尔的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质)与1μg的表达载体(例如，0.5∶1...1∶1...4∶1...8∶1...12∶1...17∶1...21∶1...或25∶1)。在某些实施方案中，所述聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质)的第一量与表达载体的治疗有效量的比例是7∶1至13∶1纳摩尔的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质)与1μg的表达载体。在具体实施方案中，所述表达载体的治疗有效量是0.001-8.0毫克的表达载体/1千克的受试者(例如，0.001...0.1...3.0...4.5...5.7...7.1...8.0毫克/千克)。在一些实施方案中，表达载体的治疗有效量是0.001至1μg/1千克的受试者(例如，0.001...0.01...0.1...1μg/千克的受试者)。在某些实施方案中，所述表达载体的治疗有效量是约0.01-4.0毫克的表达载体/1千克的受试者。
在一些实施方案中，所述第一核酸序列编码第一、或第一和第二、或第一、第二和第三治疗性蛋白。在另外的实施方案中，所述第一核酸序列编码所述生物活性核酸分子。在其他实施方案中，所述受试者是人。在另外的实施方案中，所述表达载体不含CpG。在其他实施方案中，所述表达载体是CpG减少的。在其他实施方案中，所述治疗性蛋白是人蛋白质或动物蛋白质。
在一些实施方案中，所述聚阳离子结构不含有胆固醇(例如不含胆固醇的空阳离子胶束或脂质体)。在某些实施方案中，所述阳离子脂质体各自包含至少60％DOTAP和/或DPTAP(例如60％...75％...85％...95％...98％...100％DOTAP和/或DPTAP)。在其他实施方案中，全部或基本上全部的阳离子脂质体是多层囊泡。在其他实施方案中，全部或基本上全部的阳离子脂质体是单层囊泡。在其他实施方案中，所述阳离子脂质体各自包含至少99％DOTAP或99％DPTAP。在其他实施方案中，所述空阳离子脂质体各自包含DOTAP和胆固醇。在另外的实施方案中，所述阳离子脂质体各自包含约三分之一的胆固醇和约三分之二的DOTAP和/或DPTAP。在其他实施方案中，所述第一核酸序列编码人G-CSF(例如，如在SEQID NO：1中所示)。
在某些实施方案中，所述生物活性核酸分子包含选自以下的序列：shRNA序列、miRNA序列、反义序列、核酶和/或CRISPR单一引导RNA序列(sgRNA)。在其他实施方案中，所述CRISPR sgRNA包含：i)Cas9核酸酶募集序列(tracRNA)，和ii)与sgRNA靶位点杂交的靶标特异性序列(crRNA)。在具体实施方案中，所述生物活性核酸分子靶向人p65(亦称NF-κ-Bp65或RELA)。
在其他实施方案中，所述表达载体中的每种还包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码：i)第二治疗性蛋白，和/或ii)第二生物活性核酸分子。在一些实施方案中，所述表达载体中的每种还包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码：i)第三和/或第四治疗性蛋白，和/或ii)第三和/或第四生物活性核酸分子。在其他实施方案中，所述表达载体中的每种还包含与第一核酸序列缔合的第一启动子和与第二核酸序列缔合的第二启动子，并且其中所述第一和第二启动子相同或不同。在其他实施方案中，与在所述第二核酸不存在和/或不由所述表达载体表达时所述第一核酸序列的治疗或有效表达水平和/或所述治疗或有效表达水平的时间长度相比，所述表达水平或时间长度降低。在其他实施方案中，所述第一核酸序列在治疗水平下表达至少5天，但少于21天(例如，5...7...13...16...20...以及21天)。在某些实施方案中，所述第一核酸序列编码治疗性蛋白，并且其中所述治疗性蛋白包含人G-CSF。
在其他实施方案中，当所述表达载体中的每种包含与所述第一核酸序列缔合的第一启动子和第一增强子时，所述表达载体提供在治疗或有效水平下持续第一时间长度和/或在第一表达水平下的表达，并且其中当不同于所述第一启动子的第二启动子置换所述表达载体上的第一启动子和/或不同于所述第二增强子的第二增强子置换所述表达载体上的第二启动子时改变所述第一时间长度和/或表达水平。在其他实施方案中，在治疗或有效水平下持续第一时间长度的表达是持续至少10...15...45...100...200...300天，并且其中用第二启动子和/或第二增强子置换使在所述治疗或有效水平下的表达减少至少于10...15...45...100...200天的第二时间长度。在其他实施方案中，所述表达载体中的每种包含第一启动子和第一增强子，并且其中所述第一启动子和所述第一增强子引起在治疗水平下持续至少5天但少于21...15...或10天的表达。在具体实施方案中，所述第一核酸序列编码治疗性蛋白，并且其中所述治疗性蛋白包含人G-CSF。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用一种或多种药物剂，所述一种或多种药物剂在所述第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中，其中与不向受试者施用所述一种或多种药物剂时相比，所述一种或多种药物剂增加或减少第一核酸的表达(例如，在治疗或有效水平下，和/或在所述治疗或有效水平下的表达的时间长度)。在具体实施方案中，所述药物剂增加受试者中第一核酸的表达水平，并且其中所述药物选自秋水仙碱、免疫抑制剂、地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、西地那非或L-精氨酸+西地那非。在某些实施方案中，所述药物(例如，地塞米松或地塞米松棕榈酸酯)以聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质组合物)的2.0％与6.0％之间，如以2.0％...2.5％...3.5％..4.5％或6.0％存在。在其他实施方案中，在施用聚阳离子结构和载体组合物之前或之后，向受试者施用所述药物(例如，地塞米松或地塞米松棕榈酸酯)。在某些实施方案中，存在于所述第一组合物中的聚阳离子结构(例如，空脂质体)具有约20-85nm(例如20...25...30...40...45...50...55...60...65...70...75...80...85nm)的z-平均直径。在某些实施方案中，所述聚阳离子结构是具有约72-76nm的z-平均直径的空脂质体，并且是小单层囊泡。
在其他实施方案中，与未向受试者施用所述药物剂时相比，当向所述受试者施用所述药物剂时，治疗性蛋白以高至少两倍(或高至少3或4或5倍)的水平表达。在具体实施方案中，所述药物剂降低第一核酸序列的表达水平，并且其中所述药物剂是L-精氨酸。在其他实施方案中，与未向受试者施用所述药物剂时相比，当向所述受试者施用所述药物剂时，治疗性蛋白以低至少两倍(或至少三倍或四倍)的水平表达。在一些实施方案中，所述药物剂包含抗炎剂。在另外的实施方案中，所述药物剂选自由以下各项组成的组：氨来呫诺、氯喹、丙戊酸、茶碱、DHA、前列腺素以及SAHA。
在其他实施方案中，所述表达载体不含可操作的基质附着区(MAR)序列。在某些实施方案中，所述表达载体不含可操作的EBNA-1和/或EBV病毒序列。在某些实施方案中，就在所述施用所述第一和第二组合物之前，受试者的血压未改变(例如，无物理转染助剂应用于所述受试者以尝试增加第一核酸序列的表达)。
在具体实施方案中，所述治疗水平和/或有效水平是至少150...100...500...1000...1500...5000...1,000,000pg/ml(1ug/ml)...1.5ug/ml或更高，并且其中来自受试者的血液、血清或血浆样品(或其他生物样品)在施用所述第一和第二组合物后至少7...10...25...45...63...150...300...400天或更长被测定为在所述治疗水平和/或有效水平下。在具体实施方案中，将来自受试者的样品用ELISA测定法或通过质谱法进行测试以测定表达水平。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的中性脂质体，其中所述中性脂质体存在于所述第一和/或第二组合物中，和/或在第三组合物中施用，并且其中所述治疗有效量的中性脂质体在施用所述第二组合物之前施用至受试者。在某些实施方案中，所述中性脂质体至少包含选自以下的材料：phospholipon 90H、氢化大豆PC、硬脂酸以及棕榈酸。在其他实施方案中，所述治疗有效量的中性脂质体存在于第一组合物中或存在于施用至受试者的第三组合物中。在其他实施方案中，所述中性脂质体是多层囊泡或被挤压至0.2或0.1um。在具体实施方案中，施用治疗有效量的中性脂质体引起受试者中第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子与不向所述受试者施用中性脂质体时发生的相比高至少3..4...25...100...350...或600倍的表达。在某些实施方案中，施用至受试者的空阳离子脂质体与中性脂质体的比例介于约2∶1与1∶5之间(例如，2∶1...1∶1...2∶5...1∶5)。
在一些实施方案中，本文提供在受试者中表达第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子的方法，所述方法包括：a)向受试者施用第一组合物，其中所述第一组合物包含抗炎剂；以及b)在施用所述第一组合物的约2分钟...20分钟...1小时...24小时...5天...7天...9天或更长时间内向所述受试者施用或开始施用第二组合物，其中所述第二组合物包含治疗有效量的聚合复合物，其中每种聚合复合物包含表达载体和聚乙烯亚胺，其中所述表达载体是不含CpG或CpG减少的，其中每种表达载体包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白(和/或第一和第二蛋白质)，和/或ii)第一(和/或第一和第二)生物活性核酸分子，并且其中作为施用所述第一组合物和施用所述第二组合物的结果，所述第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在所述受试者中表达。在其他实施方案中，所述受试者具有疾病或病状的至少一种症状，或具有至少一种期望被改变的生理性状，并且其中所述第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在关于所述疾病、病状或待改变的生理性状的治疗水平下表达。在一些实施方案中，所述抗炎剂选自由以下各项组成的组：氨来呫诺、氯喹和N-辛二酰苯异羟肟酸(SAHA)。
在一些实施方案中，所述表达载体包含质粒或其他非病毒载体。在其他某些实施方案中，步骤b)中的施用通过全身性地施用第二组合物来完成。
在一些实施方案中，本文提供系统或试剂盒，所述系统或试剂盒包括：a)第一组合物，所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)，其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)第二组合物，所述第二组合物包含治疗有效量的表达载体(例如，非病毒且不与脂质体或其他载体分子缔合)，其中所述表达载体是不含CpG或CpG减少的，其中所述表达载体中的每种包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白或非治疗性蛋白，和/或ii)第一生物活性核酸分子。在其他实施方案中，所述表达载体是裸非病毒表达载体(例如，质粒)。在某些实施方案中，以下情况中的至少一种适用：i)其中第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体)与治疗有效量的表达载体的比例是2∶1至25∶1或5∶1至25∶1；ii)其中2.0％至6.0％的第一组合物包含地塞米松棕榈酸酯；iii)其中所述第一组合物还包含中性脂质，并且iv)其中所述聚阳离子结构包含空脂质体，并且其中存在于所述第一组合物中的空脂质体具有约20-85nm(例如，20...25...30...40...45...50...55...60...65...70...75...80...85nm)的z-平均直径。在某些实施方案中，所述载体是病毒载体(例如，AAV或腺病毒载体)。在具体实施方案中，所述治疗性蛋白是人G-CSF(例如，如在SEQ ID NO：1中所示)。
在具体实施方案中，所述聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体)的第一量是介于0.1至7.0毫摩尔(例如，0.1...5.0...7.0毫摩尔)或1.5与5.0毫摩尔之间(例如，用于施用至人受试者的合适量)。在其他实施方案中，所述聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体)的第一量与表达载体的治疗有效量的比例是0.5∶1至25∶1纳摩尔的空阳离子脂质与1μg的表达载体(例如，0.5∶1...1∶1...5∶1...10∶1...15∶1...25∶1)。在一些实施方案中，所述聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质)的第一量与表达载体的治疗有效量的比例是7∶1至13∶1纳摩尔的聚阳离子结构与1μg的表达载体(例如，7∶1...10∶1...或13∶1)。在其他实施方案中，所述表达载体的治疗有效量在0.1与800毫克之间(例如，用于施用至人受试者的合适量，如当载体是质粒时)。在某些实施方案中，所述量是1...25...400或800毫克的用于人施用的表达载体。
在其他实施方案中，所述第一核酸序列编码第一治疗性蛋白。在另外的实施方案中，所述第一核酸序列编码所述生物活性核酸分子。在具体实施方案中，所述表达载体不含CpG。在其他实施方案中，所述表达载体是CpG减少的。在其他实施方案中，所述第一治疗性蛋白是人蛋白质。在其他实施方案中，所述第一核酸序列编码治疗性蛋白，并且其中所述治疗性蛋白包含人G-CSF、利妥昔单抗、单克隆抗体或单克隆抗体片段(例如，Fab)或人因子IX。
在某些实施方案中，所述空阳离子脂质体、胶束或乳液各自包含至少60％DOTAP和/或DPTAP(例如，60％...75％...85％...95％...98％...100％DOTAP和/或DPTAP)，并且可不含胆固醇(例如，组合物中无可检测的胆固醇)。在其他实施方案中，全部或基本上全部的空阳离子脂质体、胶束或乳剂是多层囊泡。在其他实施方案中，全部或基本上全部的空阳离子脂质体、胶束或乳剂是单层、多层或寡层囊泡。在其他实施方案中，所述空阳离子脂质体、胶束或乳液各自包含至少99％DOTAP或至少99％DPTAP，并且可不含胆固醇。在其他实施方案中，所述空阳离子脂质体各自包含DOTAP和/或DPTAP和胆固醇。在另外的实施方案中，所述空阳离子脂质体、胶束或乳液各自包含约三分之一的胆固醇和约三分之二的DOTAP和/或DPTAP。
在某些实施方案中，所述第一生物活性核酸分子包含选自以下的序列：siRNA或shRNA序列、miRNA序列、反义序列以及CRISPR单一引导RNA序列(sgRNA)。在其他实施方案中，所述CRISPR sgRNA包含：i)Cas9核酸酶募集序列(tracRNA)，和ii)与sgRNA靶位点杂交的靶标特异性序列(crRNA)。
在其他实施方案中，所述表达载体中的每种还包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码：i)第二治疗性蛋白，和/或ii)第二生物活性核酸分子。在其他实施方案中，所述表达载体中的每种还包含与第一核酸序列缔合的第一启动子和与第二核酸序列缔合的第二启动子，并且其中所述第一和第二启动子相同或不同。
在一些实施方案中，所述试剂盒和系统还包括第一容器和第二容器，并且其中第一组合物存在于所述第一容器中，且第二组合物存在于所述第二容器中。在其他实施方案中，试剂盒和系统还包括包装部件(例如，纸板盒、塑料袋等)，其中所述第一容器和所述第二容器在所述包装部件内部。
在某些实施方案中，所述试剂盒和系统还包括一种或多种药物剂，其中所述药物剂存在于第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中。在另外的实施方案中，所述药物剂选自秋水仙碱、免疫抑制剂、地塞米松、西地那非、L-精氨酸或L-精氨酸+西地那非。在其他实施方案中，所述药物剂包含抗炎剂。在其他实施方案中，所述药物剂选自由以下各项组成的组：氨来呫诺、丙戊酸、茶碱、氯喹以及SAHA。
在具体实施方案中，所述表达载体不含可操作的基质附着区(MAR)序列。在另外的实施方案中，所述表达载体不含可操作的EBNA-1和/或EBV病毒序列。
在某些实施方案中，所述试剂盒和系统还包括治疗有效量的中性脂质体，其中所述中性脂质体存在于第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中。在另外的实施方案中，所述治疗有效量的中性脂质体存在于第一组合物中。在其他实施方案中，所述中性脂质体是多层或寡层或单层囊泡。在其他实施方案中，空阳离子脂质体或胶束与中性脂质体的比例在约2∶1与1∶5之间(例如，2∶1...1∶1...3∶5...1∶5)。
在一些实施方案中，本文提供用于组合用于治疗适于用第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子的体内表达治疗的疾病的第一组合物和第二单独的组合物，其中所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)，其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)包含治疗有效量的表达载体的第二组合物，其中所述表达载体是不含CpG或CpG减少的，其中所述表达载体中的每种包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白，和/或ii)第一生物活性核酸分子。
在某些实施方案中，本文提供在受试者中表达第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子的方法，所述方法包括：a)向受试者施用第一组合物，其中所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)，并且其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)在施用所述第一组合物的约100分钟或200分钟内向所述受试者施用第二组合物，其中所述第二组合物包含治疗有效量的非病毒表达载体，其中所述表达载体是不含CpG或CpG减少的，其中所述表达载体各自包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白，和/或ii)第一生物活性核酸分子，并且其中作为施用所述第一组合物和施用约所述第二组合物的结果，所述第一治疗性蛋白和/或所述生物活性核酸分子在所述受试者中在高于(例如，至少150...300...575...1000...1500...2000...5000...或1,000,000pg/ml)的水平下表达(例如，如在来自所述受试者的血清样品中所测量(例如，在距所述第一和第二施用7...25...50天后)。
在某些实施方案中，本文提供方法，所述方法包括：向受试者施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的不含CpG或CpG减少的非病毒表达载体并且包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白，和/或ii)第一生物活性核酸分子，并且其中作为施用所述第一和第二组合物的结果，所述第一治疗性蛋白和/或所述生物活性核酸分子在所述受试者中在高于100pg/ml(例如，至少150...400...1200...2000...5000...或超过1,000,000pg/ml)的水平下表达(例如，如在来自所述受试者的血清样品中所测量(例如，在距所述第一和第二施用7...25...50天后)。
在某些实施方案中，所述聚阳离子结构包含空阳离子脂质体、胶束或乳液。在其他实施方案中，所述聚阳离子结构包含以下中的一种或多种(单独地或与聚阳离子结构组合)：直链或支链聚乙烯亚胺、树枝状聚合物(例如，基于乙二胺、聚赖氨酸、聚精氨酸和硫酸鱼精蛋白的第四代聚酰胺-胺型(pamaam)树枝状聚合物)、聚赖氨酸以及硫酸鱼精蛋白。在某些实施方案中，所述聚阳离子结构作为阳离子乳液提供。在具体实施方案中，所述乳液中的表面活性剂选自：氯化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基溴化铵等。在其他实施方案中，所述乳液还包含中性组分，如吐温、斯盘和甘油三酯。在具体实施方案中，所述乳液包含阳离子脂质，例如像DOTAP、DPTAP、DOTMA或DDAB。在一些实施方案中，所述乳液是自乳化乳液或微乳液(SEDDS、SMEDDS)。
在一些实施方案中，本文提供在受试者中表达第一和第二蛋白质和/或第一和第二生物活性核酸分子的方法，所述方法包括：a)向受试者施用第一组合物，其中所述受试者具有疾病或病状的至少一种症状，或至少具有待改变的生理性状，其中所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构，并且其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)在施用所述第一组合物的约100分钟内向所述受试者施用第二组合物，其中所述第二组合物包含治疗有效量的表达载体，其中所述表达载体是非病毒的且是不含CpG或CpG减少的，其中所述表达载体各自包含：i)第一表达盒，所述第一表达盒编码：A)第一蛋白质，和/或B)第一生物活性核酸分子；以及ii)第二表达盒，所述第二表达盒编码：A)第二蛋白质，和/或B)第二生物活性核酸分子。在某些实施方案中，作为施用所述第一组合物和施用所述第二组合物的结果，所述第一和第二蛋白质和/或所述第一和第二生物活性核酸分子在所述受试者中在关于所述疾病或病状的治疗水平下或在足以改变所述生理或疾病性状的有效水平下表达。
在具体实施方案中，所述第一蛋白质包含单克隆抗体轻链，并且所述第二蛋白质包含所述单克隆抗体的重链。在其他实施方案中，所述第一和第二表达盒均包含调控元件。在另外的实施方案中，所述调控元件在所述第一和第二表达盒中是相同的或不同的。
附图描述
图1示出实施例1中使用的各种不含CPG的质粒构建体的示意图。
图2示出h-GCSF的不含CpG的修饰的核酸序列(SEQ ID NO：1)和h-GCSF的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。在SEQ ID NO：1中以下划线示出CpG二核苷酸已被消除的位置。
图3示出通过顺序IV阳离子脂质体注射、随后IV DNA载体注射在小鼠中产生的血清人G-CSF水平的图。
图4示出在顺序IV阳离子脂质体、然后DNA载体注射21天后WBC和绝对嗜中性粒细胞计数的直方图。
图5示出通过顺序IV注射单或双盒hG-CSF单一质粒载体在小鼠中产生的血清人G-CSF水平。
图6示出在IV注射阳离子脂质体、然后含有DNA的与hG-CSF基因连接的不同启动子-增强子组合21天后小鼠中的血清hG-CSF水平。
图7示出在顺序IV注射阳离子脂质体、然后单独或与特定药物一起的单盒EF1-荧光素酶DNA 7天后的小鼠肺荧光素酶水平。
图8示出在顺序IV注射阳离子脂质体、然后单独或与某些药物一起的双盒EF1-hG-CSF-EF1-荧光素酶DNA7天后的小鼠肺荧光素酶水平。
图9示出在顺序IV注射阳离子脂质体、然后含有一系列不同的启动子-增强子组合(各自有或无MAR且全部与荧光素酶基因连接)中的一种的DNA载体10天后的小鼠肺荧光素酶水平。
图10示出在IV注射PEI：EF-1 Luc DNA复合物或顺序IV注射阳离子脂质体、随后相同的EF-1 Luc DNA 1天或5天后的小鼠肺荧光素酶水平。
图11示出在顺序IV注射7种不同的阳离子脂质体制剂中的一种、然后单盒EF1-荧光素酶DNA 1天后的小鼠肺荧光素酶水平。
图12示出在IV注射单独或与四种不同的药物中的一种混合的PEI：EF-1 Luc DNA复合物1天后的小鼠脾荧光素酶水平。
图13示出在顺序IV注射阳离子脂质体、然后一系列双盒EF-1-Luc-hG-CSF DNA载体中的一种1天或7天后的小鼠肺荧光素酶水平。
图14示出在顺序IV阳离子脂质体注射(在有或无共注射中性脂质体的情况下)、随后IV注射双盒单一质粒载体1天后在小鼠中产生的血清人G-CSF水平。
图15示出在顺序IV阳离子脂质体与中性脂质体共注射、随后IV注射双盒质粒载体1或7天后在小鼠中产生的血清人G-CSF水平。
图16示出在顺序IV阳离子脂质体注射SUV、0.1μm挤出或MLV阳离子脂质体、随后IV注射EF1-hG-CSF质粒载体7天后在小鼠中产生的血清人G-CSF水平。
图17示出来自实施例2的结果，其中阳离子脂质体、随后不含CPG的人G-CSF DNA载体的一次顺序IV注射在小鼠中产生超治疗性人G-CSF血清蛋白质水平持续至少接下来428天。
图18示出来自实施例3的结果，其中表明阳离子脂质体、随后不含CPG的人G-CSFDNA载体的一次顺序IV注射在大鼠中产生超治疗性人G-CSF血清蛋白质、WBC和ANC水平，伴随正常ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)。
图19示出来自实施例3的结果，其中表明由DPTAP产生的阳离子脂质体介导体内转染。
图20示出如通过丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血清水平测量的毒性在24小时升高2至5倍，并且在顺序注射阳离子脂质体、随后质粒DNA后48小时恢复至对照水平。
图21示出将2.5摩尔％地塞米松棕榈酸酯(DexP)并入阳离子DOTAP脂质体中在顺序IV注射后24小时增加hG-CSF的表达，同时降低毒性，如通过ALT水平至接近背景水平所测量。
图22示出IV注射含有2.5％地塞米松棕榈酸酯的DOTAP脂质体降低毒性，如通过ALT水平至背景水平所测量，同时显著增加人G-CSF蛋白质水平。
图23示出地塞米松的预注射和后注射显著增加hG-CSF蛋白质水平，同时降低毒性，如通过ALT水平至接近背景水平所测量。
图24示出操纵脂质：DNA比例增加hG-CSF水平、同时降低毒性，如通过ALT水平至背景水平所测量。
图25示出IP预注射地塞米松、随后在阳离子DOTAP脂质体中的2.5摩尔％地塞米松棕榈酸酯、然后编码利妥昔单抗的双盒单一质粒DNA载体显著增加小鼠中随时间推移的血清利妥昔单抗水平。
图26示出地塞米松预注射，随后DexP阳离子脂质体加中性脂质、然后编码利妥昔单抗的双盒单一质粒DNA载体的一次IV顺序注射在小鼠中产生全功能利妥昔单抗蛋白质的延长的血清水平。
图27示出在IV顺序注射双盒单一质粒利妥昔单抗DNA载体后6周时测试的小鼠血清与重组利妥昔单抗蛋白质类似地结合靶CD20+人B淋巴瘤(Raji)细胞。
图28来自利妥昔单抗DNA载体注射的小鼠的血清中的利妥昔单抗蛋白质诱导与重组利妥昔单抗类似水平的Raji CD20+人B细胞的溶解。
图29示出IP预注射地塞米松、然后中性脂质加在DOTAP脂质体中的2.5摩尔％地塞米松棕榈酸酯增加大鼠中随时间推移的血清利妥昔单抗水平。
图30示出利妥昔单抗双盒单一质粒DNA载体的密码子优化在顺序IV注射后24小时进一步增加血清利妥昔单抗水平。
图31示出密码子优化的双盒单一质粒利妥昔单抗DNA载体的一次顺序IV阳离子脂质体注射产生延长的血清利妥昔单抗水平。
图32示出选定药物的预注射显著增加通过顺序IV阳离子脂质体注射密码子优化的双盒单一质粒利妥昔单抗DNA载体产生的血清利妥昔单抗水平。
图33示出编码通过2A自裂解肽序列隔开的利妥昔单抗重链和轻链的单盒DNA载体的顺序IV注射产生显著血清利妥昔单抗蛋白质水平。
图34示出操纵脂质：DNA比例增加血清利妥昔单抗水平、同时降低毒性，如通过ALT水平至接近背景水平所测量。
图35示出用丙戊酸或茶碱预处理显著增加通过顺序IV阳离子脂质体注射密码子优化的EF-1驱动的编码人因子IX cDNA的质粒载体产生的血清人因子9水平。
图36示出在实施例中使用的利妥昔单抗(抗CD20)双盒质粒的排列。在此图中，以下缩写适用：M：Mar(M1：β-Glo，M2：21q21以及M3：IFNβ)；K：Kozak序列(K1：AAGCTTTCC，SEQID NO：3；K2：AAGCCACC，SEQ ID NO：4)；增强子：mCMV或hCMV；启动子：CMV或EF1；5′UTR：I126或htlv；H：嵌合重链cDNA；L：嵌合轻链cDNA；以及pA：聚A。
图37示出在实施例中使用的利妥昔单抗(抗CD20)单一(双顺反子(bisicontronic))质粒的排列。在此图中，以下缩写适用：K：Kozak序列(K1：AAGCTTTCC K2，SEQ ID NO：3；AAGCCACC，SEQ ID NO：4)；增强子：mCMV或hCMV；启动子：CMV或EF1；5′UTR：1126或htlvH：嵌合重链cDNA；L：嵌合轻链cDNA；F：弗林蛋白酶(F1：RHQR；F2：RAKR)；2A肽：P2A或F2A；以及pA：聚A
图38示出在实施例中使用的人因子IX质粒的排列。以下缩写适用于此图：M：Mar(M1：β-Glo和M3：IFNβ)；Kozak2：Kozak序列2(AAGCCACC，SEQ ID NO：4)；增强子：mCMV；启动子：EF1；5′UTR：1126；hFIX：人因子XI cDNA；以及pA：聚A
图39示出在以下实施例中使用的表达利妥昔单抗的重链和轻链(下划线)的双顺反子单盒质粒构建体(SEQ ID NO：5)的一个实例(编号8，G4)。
图40示出在以下实施例中使用的表达利妥昔单抗的重链和轻链(下划线)的双盒非优化的抗CD20无CpG的质粒构建体(SEQ ID NO：6)的一个实例(编号2)。
图41示出在以下实施例中使用的表达利妥昔单抗的重链和轻链(下划线)的双盒非优化的抗CD20无CpG的质粒构建体(SEQ ID NO：7)的一个实例(编号4)。
图42示出在以下实施例中使用的表达利妥昔单抗的重链和轻链(下划线)的双盒MAR欠优化的抗CD20质粒构建体(SEQ ID NO：8)的一个实例(编号4)。
图43示出在以下实施例中使用的表达利妥昔单抗的重链和轻链(下划线)的双盒含MAR的优化的抗CD20质粒构建体(SEQ ID NO：9)的一个实例(编号6)。
图44示出在以下实施例中使用的表达人因子IX的质粒构建体(SEQ ID NO：10)的一个实例(编号4)。
定义
如本文所用，短语“CpG减少的”是指具有比核酸序列或表达载体的野生型型式中存在的更少CpG二核苷酸的核酸序列或表达载体。“不含CpG”是指主题核酸序列或载体不具有任何CpG二核苷酸。含有CpG二核苷酸(例如，人G-CSF的野生型型式)的初始序列可通过改变核酸序列而进行修饰以除去CpG二核苷酸。此类CpG二核苷酸可不仅在编码序列中、而且在非编码序列中合适地减少或消除，所述非编码序列包括例如5′和3′非翻译区(UTR)、启动子、增强子、聚A、ITR、内含子以及存在于核酸分子或载体中的任何其他序列。
如本文所用，“空脂质体”是指不含核酸分子但可含有其他生物活性分子的脂质体(例如，仅由脂质分子本身或仅由脂质分子和小分子药物组成的脂质体)。
如本文所用，“空阳离子胶束”是指不含核酸分子但可含有其他生物活性分子的阳离子胶束(例如，仅由脂质和表面活性剂分子本身组成或仅由脂质和表面活性剂分子以及小分子药物组成的胶束)。
如本文所用，“空阳离子乳液”是指不含核酸分子但可含有其他生物活性分子的阳离子乳液或微乳液。
详述
本发明提供用于在受试者中产生蛋白质或生物活性核酸分子的表达(例如，在治疗水平下持续延长的时间段)的组合物、系统、试剂盒以及方法。在某些实施方案中，提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包括第一组合物，所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)；以及第二组合物，所述第二组合物包含治疗有效量的不含CpG或CpG减少的表达载体(例如，不与脂质体缔合的非病毒表达载体)，其中所述表达载体包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白，和/或ii)第一生物活性核酸分子。在其他实施方案中，此类第一和第二组合物被顺序地(例如全身性地)施用至受试者，以使得所述第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子在所述受试者中表达(例如，在治疗水平下持续至少5天或至少50天，以使得治疗疾病或病状或改变生理性状)。
在本公开的实施方案的开发过程中进行的工作已经表明，阳离子脂质体的单次注射(例如静脉内注射)、之后不久接着注射(例如静脉内注射)编码治疗性蛋白的不含CpG的载体产生比蛋白质的治疗血清水平高许多倍(例如高10-20倍)的循环蛋白水平持续延长的时期。这种施用还使循环嗜中性粒细胞计数在治疗后数周增加许多倍。
在本公开的实施方案的开发过程中进行的工作(例如，如在以下实施例1中所示)已经表明，单次静脉内注射阳离子脂质体、两分钟后接着静脉内注射编码人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的不含CpG的质粒载体产生比治疗性血清hG-CSF水平(大于或等于100pg/ml)高10-20倍的循环hG-CSF蛋白水平持续至少63天(参见图3)。这种施用也使循环嗜中性粒细胞计数在静脉内注射至小鼠后3周增加了10倍(图4)。相比之下，即使在注射后第3天，含有相似但含CpG的hG-CSF质粒载体的阳离子脂质体-DNA复合物的一次全身注射也不能产生可检测到的(＞20pg/ml)hG-CSF蛋白水平，并且在注射后的任何点未能增加嗜中性粒细胞计数(参见Tu等人，JBC，275(39)：30408-30416，2000；以引用的方式整体并入本文)。此外，在实施例1中提出的用于延长人G-CSF的在治疗水平下的表达的方法似乎不在小鼠中引起显著毒性。
因此，本文提供的用于体内表达的方法克服了迄今为止阻止全身性非病毒基因递送的成功治疗应用的关键限制。也就是说，它无法在治疗水平下表达递送的基因持续产生重要的治疗或生理学终点通常所需的延长的时期。如实施例1中所示，本文提供的方法的实施方案用非病毒载体实现治疗性蛋白的这种持久表达，而不必将病毒基因并入载体中。这是重要的，因为其他方法依赖于插入至少一种病毒基因加上其蛋白质产物所结合的病毒DNA序列(EBNA-1基因连同插入DNA载体中的重复序列的EBV家族)一直需要以便克服这种瞬时基因表达限制(参见，Tu等人，上文)。此外，除了实施例1(图1)中在63天后发现的高hG-CSF蛋白水平外，在注射后第14、21、28和49天测量并发现了类似的高表达水平，从而表明一旦达到，这些高治疗水平长期维持。而且，实施例2在图17中显示超过400天的高表达水平。这种高水平和长期表达显著优于由MODERNA提供的mRNA方法，如在美国8,754,062的图3中针对hG-CSF所示，所述mRNA方法在单次IV注射后仅产生至多4天的治疗水平。
此外，本文提供的系统、方法和组合物提供能够更精确地控制递送基因在治疗水平下的表达的持续时间的通用(例如，非病毒)基因递送和表达平台。这种控制递送基因的表达的持续时间的能力解决了基因疗法领域内另一种迄今为止关键的未满足的需求，即控制蛋白质在治疗水平下表达的持续时间的能力。具体地说，现在存在广泛和扩展范围的FDA批准的重组分泌型人蛋白质疗法。不同的批准的蛋白质疗法必须在治疗水平下存在持续非常不同的持续时间，以便有效且安全地治疗患者。不同蛋白质疗法的推荐治疗持续时间从不到两周(hG-CSF)到患者的一生(因子IX)变化。例如，对于每个三周化疗周期的仅前10天每天给予重组人G-CSF蛋白Neupogen。在每个每日Neupogen剂量后大约14小时，血清hG-CSF水平恢复至基线。使用这种10天治疗方案，因为其嗜中性粒细胞增加作用仅在化疗诱导的嗜中性粒细胞减少症的这一大约10天时期期间指示。从第11天到第21天的G-CSF升高通常不是有益的，因为患者自身的嗜中性粒细胞产生能力恢复。给予Neupogen超过第10天可引起有毒的嗜中性粒细胞相关副作用。相比之下，抗-TNF抗体常规施用数月或数年，并且因子IX置换持续患者的一生。因此，不同的蛋白质必须在治疗水平下产生持续不同的持续时间，从不到两周到患者的一生。因此，能够控制其在患者中产生的在治疗水平下的基因表达的持续时间的基因治疗方法实现治疗终点，同时避免了广泛范围的现在FDA批准的人治疗性蛋白的有毒副作用。本文提供了可用于提供这种控制的各种技术。以下描述五种示例性方法。
第一，在某些实施方案中，将第二表达盒插入单一质粒DNA载体或其他载体中。如实施例1中所示，与所使用的产生治疗性hG-CSF水平至少63天的单一表达盒hG-CSF质粒载体(图3)相比，添加第二盒将产生的hG-CSF蛋白的治疗水平在小鼠中限制至不到两周(图5)。值得注意的是，驱动荧光素酶基因的第二表达盒在IV注射的小鼠中也在较高可控水平下表达。
第二，如实施例1中所示，在单盒质粒载体中产生了一系列不同的不含CPG的启动子-增强子组合，所述载体在小鼠中在单次IV注射后在治疗水平下表达hG-CSF持续一系列不同的持续时间(图6)。值得注意的是，含有并入不同启动子增强子组合的不同盒的多表达盒单一质粒DNA载体能够在不同的水平下表达不同的治疗性蛋白持续与单一DNA载体不同的持续时间。这允许单一DNA载体表达多种不同的治疗性蛋白(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种治疗性蛋白)。然后使每种单独的蛋白质在其适当的治疗水平下表达所需的持续时间。这种方法是克服现在由在单个患者中将两种或更多种重组蛋白疗法组合而导致的高昂成本的一种方式。
第三，如实施例1中所描述，表明共同注射现有FDA批准的药物(单独地或与阳离子脂质体的选定组合)能够选择性地增加或降低小鼠中通过顺序IV注射递送的基因的表达的水平/持续时间(图7和图8)。
第四，如实施例1中所示，改变阳离子脂质体大小以及脂质组合物也可控制通过顺序阳离子脂质体、然后DNA注射递送的基因的表达的水平和持续时间(图11)。
第五，如实施例14中所示，中性脂质以及地塞米松和地塞米松棕榈酸酯的添加可增加基因表达的持续时间(图26和图29)。相比之下，施用单独中性脂质可减少基因表达的持续时间(图14和图15)。
此外，一些文献还描述基质附着区(MAR)应被并入DNA载体中以便在其IV注射后产生延长的表达(Argyros等人，J Mol Med(2011)89：515-529，以引用的方式整体并入本文)。相比之下，在本公开的实施方案的开发过程中进行的工作表明，此类MAR元件的存在不增加且在一些载体中减少通过IV顺序注射阳离子脂质体、随后不含CPG的质粒DNA产生的基因表达的持续时间(图9)。
在某些实施方案中，本公开使用不含载体DNA的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳液)，所述聚阳离子结构在载体施用之前施用至受试者。在某些实施方案中，所述聚阳离子结构是阳离子脂质和/或作为乳液提供。本公开不限于所使用的阳离子脂质，所述阳离子脂质在一些实施方案中可由以下中的一种或多种组成：DDAB，二甲基双十八烷基溴化铵；DPTAP(1，2-二棕榈酰基3-三甲基铵丙烷)；DHA；前列腺素，N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N--三甲基铵甲基硫酸酯；1，2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷，(包括但不限于二油酰基(DOTAP)、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、二硬脂酰基)；1，2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷，(包括但不限于二油酰基、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、二硬脂酰基)；DOTMA，N-[1-[2，3-双(油酰基氧基)]丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵；DOGS，双十八烷基酰胺甘氨酰精胺；DC-胆固醇，3.β.-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇；DOSPA，2，3-二油酰基氧基-N-(2(精胺甲酰胺基)-乙基)-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯；1，2-二酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(包括但不限于二油酰基(DOEPC)、二月桂酰基、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、二硬脂酰基、棕榈酰基-油酰基)；β-丙氨酰基胆固醇；CTAB，十六烷基三甲基溴化铵；diC14-脒，N-叔丁基-N′-十四烷基-3-十四烷基氨基丙脒；14Dea2，O，O′-二十四烷酰基-N-(三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物；DOSPER，1，3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙基酰胺；N，N，N′，N′-四甲基-N，N′-双(2-羟乙基)-2，3-二油酰基氧基-1，4-丁烷二铵碘化物；1-[2-酰氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基-)咪唑啉鎓氯化物衍生物如1-[2-(9(Z)-十八碳烯酰基氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七碳烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)，1-[2-(十六烷酰基氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DPTIM)；1-[2-十四烷酰基氧基)乙基]-2-十三烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DMTIM)(例如，如Solodin等人(1995)Biochem.43：13537-13544中所描述，以引用的方式并入本文)；在季胺上含有羟烷基部分的2，3-二烷基氧基丙基季铵化合物衍生物，如1，2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)；1，2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)；1，2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟基丙基溴化铵(DORIE-HP)，1，2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟基丁基溴化铵(DORIE-HB)；1，2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟基戊基溴化铵(DORIE-HPe)；1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)；1，2-二棕榈基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)；1，2-二硬脂基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)(例如，如Felgner等人(1994)J.Biol.Chem.269：2550-2561中所描述，以引用的方式整体并入本文)。许多上述脂质可从例如Avanti Polar Lipids，Inc.；Sigma Chemical Co.；Molecular Probes，Inc.；Northern Lipids，Inc.；Roche MolecularBiochemicals；以及Promega Corp获得。
在某些实施方案中，本公开使用CpG减少的或不含CpG的表达载体。含有CpG二核苷酸(例如，人G-CSF的野生型型式)的初始序列可通过改变核酸序列而进行修饰以除去CpG二核苷酸。图2示出人G-CSF的不含CpG的型式，其具有已被改变以除去加下划线的CpG的序列。此类CpG二核苷酸可不仅在编码序列中、而且在非编码序列中合适地减少或消除，所述非编码序列包括例如5′和3′非翻译区(UTR)、启动子、增强子、聚A、ITR、内含子以及存在于核酸分子或载体中的任何其他序列。CpG二核苷酸可位于所选氨基酸的密码子三联体内。存有五种氨基酸(丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和精氨酸)，所述氨基酸具有一个或多个含有CpG二核苷酸的密码子三联体。所有五种这些氨基酸具有不含CpG二核苷酸的可改变以避免CpG、但仍然编码如以下表1中所示的相同氨基酸的替代密码子。因此，在选定氨基酸的密码子三联体内分配的CpG二核苷酸可改变为缺少CpG二核苷酸的相同氨基酸的密码子三联体。
表1
Figure BDA0001600862350000301
另外，在编码区内，应考虑三联体之间的界面。例如，如果氨基酸三联体在C-核苷酸中结束，C-核苷酸然后接着是仅以G-核苷酸(例如，缬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸)开始的氨基酸三联体，则第一个氨基酸三联体的三联体被改变为不以C-核苷酸结束的三联体。用于制备CpG序列的方法在例如美国专利号7，244，609中示出，所述专利以引用的方式并入本文。由INVIVOGEN提供的商业服务也可用于产生不含CpG(或CpG减少)的核酸序列和载体。
以下表2中提供了可用于本文所述的载体中的示例性启动子和增强子。此类启动子和本领域中已知的其他启动子可单独使用或与本领域中已知的增强子中的任一种或多种增强子一起使用。另外，当从同一载体表达多种蛋白质或生物活性核酸分子(例如2、3、4或更多种)时，相同或不同的启动子可与主题核酸序列结合使用。
表2
Figure BDA0001600862350000302
Figure BDA0001600862350000311
本公开不受所表达的治疗性蛋白的类型限制。在某些实施方案中，所述治疗性蛋白包含抗体或抗体片段(例如F(ab)或F(ab′)2)。在其他实施方案中，所述治疗性蛋白选自由以下各项组成的组：抗炎蛋白、凝血蛋白、抗癌蛋白、抗败血症蛋白等。
实施例
实施例1
使用阳离子脂质体、随后不含CPG的表达载体的顺序注射的体内蛋白质表达
此实施例描述使用体内蛋白质表达，使用阳离子脂质体、时间紧密地随后不含CPG的表达载体的顺序注射的各种工作。
方法
脂质体制备。从Avanti极性脂质购买纯DOTAP脂质作为冻干粉末。通过将冻干粉末以20毫摩尔的脂质浓度重新悬浮于5％右旋糖于水中的溶液中来制备纯DOTAP阳离子脂质体。然后将溶液涡旋15分钟以形成多层囊泡(MLV)，平均粒度350nm，如通过激光散射所测量。然后通过在浴超声波仪中超声处理由MLV形成平均粒度75nm的小单层囊泡(SUV)。
质粒构建。图1中提供所采用的载体的一般示意图。一般来说，不含CpG的DNA质粒载体通常由以下元件组成：连接至目标基因(如h-GCSF(615bp)或soLux(1653bp))的mCMV/EF1/1126(851bp)或hCMV/hCMV/HTLV(873bp)的增强子/启动子/5′UTR，最小聚A(63bp)，源自β球蛋白(434bp)、21q21(1055bp)或IFN(820bp)的MAR，以及R6K Ori/Kanr(卡那霉素抗生素抗性)表达盒(1206bp)。将R6KOri/Kanr DNA设计为含有三个核酸内切酶限制酶位点DraIII、EcoRI和NheI的基础载体。它是使用Gibson组装技术(NEB，MA)由gBlock四个DNA片段(IDT，IA)组装的。对于含有MAR的质粒，在DraIII-EcoRI位点处将β球蛋白MAR插入基础载体中。图2中示出h-GCSF的不含CpG的核酸序列。
使用puc19质粒主链通过将每个DNA元件顺序插入在EcoRI与XbaI之间来构建所述表达盒。含有5′EcoRI和NheI位点的增强子/启动子元件分别与EcoRI、EcoRV、BstEII、BglII和XbaI位点处的5′UTR、基因、pA或pA-MAR以及puc19连接。然后将表达盒用EcoRI-XbaI消化并在EcoRI-NheI处插入到基础载体中，从而产生含有可用于插入第二表达盒插入的限制性位点的表达质粒。然后通过将hG-CSF表达盒在EcoRI-NheI处插入到基础载体中来构建双重(Luc和GCSF)盒表达质粒。随后将第二Luc表达盒在EcoRI-NheI处插入到G-CSF表达质粒中，从而产生含有双盒Luc和GCSF的单一质粒载体。
质粒纯化。将不含内毒素的质粒在5′Prime Endo-free Maxi柱上如下纯化。简言之，将含有所述质粒的200ml细菌在37C下生长过夜，且然后收集。将细菌细胞按照制造商的方案溶解。使用EndoFree过滤器CS除去内毒素。将异丙醇添加至溶解产物中，且然后负载到柱上。在连续洗涤后，将柱离心并空气干燥10分钟以确保残留的乙醇被除去。然后用1ml乳酸林格氏液从柱上洗脱DNA。
小鼠。21g雌性CD-1小鼠购自Charles River。根据IACUC批准的指导方针进行圈养、护理和所有程序。
小鼠中阳离子脂质体、然后质粒DNA的顺序注射。每组注射三至五只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射阳离子脂质体(MLV或SUV)，两分钟后接着单次IV注射不含CPG的质粒DNA载体。
获得且然后分析小鼠血清的人G-CSF水平。将每只小鼠麻醉且然后经由颌下静脉放血。然后从全血中分离血清并以pg/ml测量人G-CSF水平，如使用R和D系统人G-CSF ELISA严格按照制造商的说明书所进行。
获得且然后分析小鼠组织的荧光素酶活性。将肺用500ul的1x裂解缓冲液(Promega，WI)均质化。将匀浆在4C下以3000x g离心10分钟并收集上清液。使用20μl的上清液和100μl的荧光素酶试剂使用GloMax(R)光度计(Promega，WI)测定荧光素酶活性10秒。
结果/描述
通过顺序IV阳离子脂质体注射、随后IV DNA载体注射在小鼠中产生的血清人G- CSF水平
每组注射五只小鼠。每只小鼠接受800纳摩尔纯DOTAP阳离子脂质体(MLV或SUV)的单次IV注射，两分钟后接着单次IV注射80μg的mCMV-EF 1-hGCSF、hCMV-hCMV-hGCSF或mCMV-EF1-荧光素酶不含CPG的质粒DNA载体。在IV注射后第7天开始且之后每隔7天评定血清hG-CSF水平。
如图3中所示，在注射后第7天，含有hG-CSF基因的所有三种DNA载体都产生超治疗hG-CSF水平(需要≥100pg/ml来增加嗜中性粒细胞水平)。此后，hG-CSF水平逐渐上升直到第21天，且然后保持稳定直到第63天(所分析的最后时间点)。相比之下，在整个实验过程中，通过相同的IV顺序注射EF1-荧光素酶DNA载体产生的hG-CSF水平是不可检测的。
在顺序IV阳离子脂质体、然后DNA载体注射21天后的WBC和绝对嗜中性粒细胞计数
在顺序IV注射DOTAP MLV、两分钟后接着单次IV注射含EF1-hGCSF或EF-1荧光素酶的不含CPG的质粒DNA载体后第21天从4只小鼠的组中收集全血。然后由加州大学戴维斯分校兽医诊断实验室以盲检方式分析来自每只小鼠的血液的总WBC以及绝对嗜中性粒细胞计数。
如图4中所示，当与接受EF1-荧光素酶质粒DNA载体的顺序注射的模拟注射的对照相比时，一次顺序IV注射DOTAP阳离子脂质体、随后IV注射EF1-hG-CSF DNA在注射21天后使绝对嗜中性粒细胞计数增加大约10倍并使总WBC增加大约4倍。这些结果证明hG-CSF基因编码的蛋白质产物在处理的小鼠中完全起作用。总之，由EF1-hG-CSF DNA载体产生的绝对嗜中性粒细胞计数的高水平增加加上在第21天产生的高于治疗性hG-CSF蛋白水平10-15倍(参见图3)，证明单次顺序IV注射阳离子脂质体、随后不含CPG的DNA载体可产生现在FDA批准的重组人蛋白疗法的延长的治疗作用。
通过顺序IV注射单或双盒hG-CSF单一质粒载体在小鼠中产生的血清人G-CSF水平
在顺序IV注射800纳摩尔的纯DOTAP MLV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射40μgEF1-荧光素酶--EF1-hGCSF(2表达盒)或EF1-hGCSF(1表达盒)不含CPG的单一质粒DNA载体后第6天或第14天从四只小鼠的组中收集血清。
如图5中所示，在注射后第6天，含有hG-CSF基因的单盒以及双盒DNA载体各自产生分别951和423Pg/ml的超治疗血清hG-CSF水平(需要≥100pg/ml来增加嗜中性粒细胞计数)。单盒载体在第14天产生甚至更高的治疗水平，1941pg/ml。相比之下，在第14天由双盒单一质粒DNA载体产生的hG-CSF水平已经下降至亚治疗水平(93pg/ml)，因为低于100pg/ml的hG-CSF蛋白水平是亚治疗性的。因此，添加第二表达盒可控制第一盒中所含基因的表达的持续时间。
在IV注射阳离子脂质体、然后含有DNA的与hG-CSF基因连接的不同启动子-增强子 组合21天后小鼠中的血清hG-CSF水平
在顺序IV注射800纳摩尔的纯DOTAP MLV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射60μg的连接至以下增强子-启动子组合中的一种的hG-CSF基因：mCMV-EF1、hCMV-hCMV、hCMV-h铁蛋白轻链、hCMV-h铁蛋白重链、hCMV-葡萄糖调控的蛋白78或mCMV-h铁蛋白轻链(各自在不含CPG的单盒DNA载体中)21天后，从四只小鼠的组中收集血清。
如图6中所示，在第21天通过mCMV-EF-1(2120pg/ml)、hCMV-hCMV(1516pg/ml)、hCMV-FerL(699pg/ml)、hCMV-Grp78(343pg/ml)和mCMV-FerL(303pg/ml)驱动的DNA载体(各自连接至hG-CSF基因)产生一系列超治疗性hG-CSF血清水平。相反，hCMV-FerH-hG-CSF DNA载体(52pg/ml)产生亚治疗性hG-CSF水平。总之，这些结果揭示，改变启动子-增强子组合可在单次注射21天后产生一系列不同的hG-CSF蛋白水平，从高于治疗性水平超过20倍到亚治疗性水平。(需要hG-CSF蛋白水平≥100pg/ml来增加嗜中性粒细胞计数)。
在顺序IV注射阳离子脂质体、然后单独或与药物一起的单盒EF1-荧光素酶DNA 7 天后的小鼠肺荧光素酶水平
在顺序IV注射800纳摩尔的单独或含有2mg/kg的L-精氨酸、0.01mg/kg秋水仙碱或1mg/kg地塞米松的纯DOTAP MLV阳离子脂质体7天后，从四只小鼠的组中收集肺。在每种情况下，阳离子脂质体注射两分钟后接着IV注射40μg的mCMV-EFl-荧光素酶不含CPG的单盒DNA载体。
如图7中所示，当与接受顺序注射单独DOTAP MLV的小鼠(对照)相比时，接受秋水仙碱或地塞米松连同脂质体的小鼠在肺中显示更高的荧光素酶活性。相比之下，接受L-精氨酸和脂质体的小鼠不能增加基因表达水平。因此，将选定药物与脂质体一起共注射可增加通过顺序阳离子脂质体、然后DNA注射递送的基因的表达的水平和持续时间。
在顺序IV注射阳离子脂质体、然后单独或与药物一起的双盒EF1-hG-CSF--EF1-荧 光素酶DNA 7天后的小鼠肺荧光素酶水平
在顺序IV注射800纳摩尔的单独或含有2mg/kg的L-精氨酸、1mg/kg地塞米松、0.02mg/kg西地那非、0.1mg/kg丙戊酸或2mg/kg的L-精氨酸加0.02mg/kg西地那非(VIAGRA)的纯DOTAP MLV阳离子脂质体7天后，从4只小鼠的组中收集肺。在每种情况下，阳离子脂质体注射两分钟后接着IV注射40μg的EF1-荧光素酶--EF1-hGCSF(一种2表达盒不含CPG的单一质粒DNA载体)。
如图8中所示，当与接受顺序注射单独DOTAP MLV的小鼠(对照)相比时，接受单独地塞米松、丙戊酸或西地那非或L-精氨酸加西地那非连同脂质体的小鼠在肺中显示更高的荧光素酶活性。相比之下，接受L-精氨酸或丙戊酸连同脂质体的小鼠低于对照或可与对照比较。因此，取决于共同注射的药物，所递送的基因的表达水平可增加或降低。
在顺序IV注射阳离子脂质体、然后含有一系列不同的启动子-增强子组合(各自有 或无MAR且全部与荧光素酶基因连接)中的一种的DNA载体10天后的小鼠肺荧光素酶水平
在顺序IV注射800纳摩尔的纯DOTAP MLV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射40μg的连接至以下增强子-启动子组合中的一种的荧光素酶基因：hCMV-hCMV、hCMV-人铁蛋白重链、hCMV-CBOX(人羧基肽酶B1)、mCMV-hCMV、mCMV-CBOX和mCMV-EF1(各自连接至不含CPG的单盒DNA载体中的荧光素酶基因)10天后，从三只小鼠的组中收集肺。
图9示出缺乏MAR且含有与hCMV、铁蛋白重链或CBOX启动子连接的hCMV增强子的DNA载体产生比含有MAR元件的相应载体更高的肺荧光素酶水平。相比之下，含有MAR和与hCMV、EF1或CBOX启动子连接的mCMV增强子两者的DNA载体未能产生与缺乏MAR元件的相应载体一样高的肺荧光素酶水平。因此，缺乏MAR的不含CPG的DNA载体可产生比含有MAR的载体更持久的表达。
在IV注射PEI：EF-1Luc DNA复合物或顺序IV注射阳离子脂质体、随后相同的EF- 1Luc DNA 1天或5天后的小鼠肺荧光素酶水平
在IV注射12.5μg的以1∶4N∶P比例与22kDa线性PEI复合的不含CPG的EF-1-Luc DNA载体或顺序IV注射900纳摩尔的纯DOTAP MLV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射40μg的相同EF-1-Luc DNA载体1天或5天后，从三只小鼠的组中收集肺。
图10示出在注射后第一天肺荧光素酶水平在注射PEI：DNA的小鼠中始终高于顺序地注射后阳离子脂质体、然后DNA的小鼠。然而，到第五天在注射PEI：DNA的小鼠中，肺荧光素酶水平降低了大约100倍。与此形成直接对比的是，到注射后第5天，来自顺序IV注射的小鼠的肺荧光素酶水平上升。荧光素酶水平在顺序注射的小鼠中比存在于也在第5天杀死的注射PEI：DNA的小鼠中的荧光素酶水平高150倍。因此，当与作为PEI：DNA复合物注射的相同不含CPG的DNA比较时，顺序阳离子脂质体、然后DNA注射在较晚的时间点产生更高水平的基因表达。
在顺序IV注射7种不同的阳离子脂质体制剂中的一种、然后单盒EF1-荧光素酶DNA 1天后的小鼠肺荧光素酶水平。
在顺序IV注射800纳摩尔的纯DOTAP MLV、纯DOTAP SUV、DOTAP∶胆固醇2∶1MLV、DOTAP∶二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)1∶1MLV、DSTAP MLV、乙基DSPC MLV或DOTAP∶DOBAQ 1∶1MLV阳离子脂质体1天后，从四只小鼠的组中收集肺。在每种情况下，阳离子脂质体注射两分钟后接着IV注射80μg的mCMV-EF1-荧光素酶不含CPG的单盒DNA载体。
如图11中所示，当与接受顺序IV注射纯DOTAP MLV的小鼠中的肺荧光素酶水平相比时，接受DOTAP SUV、DOTAP∶chol或DOTAP∶DOPC阳离子脂质体制剂的小鼠产生接近DOTAPMLV或更高的基因表达水平。相比之下，接受DSTAP、乙基DSPC或DOTAP∶DOBAQ MLV的小鼠产生非常低或几乎不可检测的肺荧光素酶水平。产生接近DOTAP MLV的基因表达水平的所述DOTAP SUV是出人意料的，因为当作为阳离子脂质体：DNA复合物注射时，DOTAP MLV产生比DOTAP SUV高超过1700倍的基因表达水平(参见Nature Biotechnology，15：167-173；1996，以引用的方式整体并入本文)。
在IV注射单独或与四种不同的药物中的一种混合的PEI∶EF-1Luc DNA复合物1天 后的小鼠脾荧光素酶水平。
在IV注射12.5μg的以1∶4N∶P比例与22kDa线性PEI复合的不含CPG的EF-1-Luc DNA载体1天后，从三只小鼠的组中收集脾。在接受IV PEI∶DNA复合物之前两小时，小鼠接受腹膜内注射1ml的单独或含有200μg氨来呫诺、1mg氯喹、200μg的SAHA或300μg的托法替尼/每只小鼠的5％DMSO。
图12示出在注射不含CPG的DNA之前预注射抗炎剂氨来呫诺、氯喹或SAHA增加基因表达水平，而预注射托法替尼未能增加基因表达。氨来呫诺(具体地说，一种TBK1诱导的干扰素活化途径的选择性抑制剂)增加了基因表达水平。因此，预注射选定抗炎剂可进一步提高用于基因疗法的不含CPG的DNA的有效性。
在顺序IV注射阳离子脂质体、然后一系列双盒EF-1-Luc--hG-CSF DNA载体中的一 种1天或7天后的小鼠肺荧光素酶水平
在顺序IV注射800纳摩尔的纯DOTAP MLV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射40μg的EF1-Luc--EF1-hGCSF、EF1-Luc--hCMV-hCMV-hGCSF、EF1-Luc--hCMV-hCBOX-hGCSF、EF1-Luc--hCMV-hREG1-hGCSF或EF1-Luc--mCMV-hCBOX-hGCSF2表达盒不含CPG的单一质粒DNA载体1或7天后，从四只小鼠的组中收集肺。
图13示出当与接受顺序注射在每个盒中含有EF1启动子的EF1-Luc--EF1-hGCSF双盒表达载体的小鼠(对照)相比时，接受含有在一个盒中的EF1启动子和在第二盒中的另一启动子的其他四种双盒DNA载体中的每种的小鼠在注射后第一天和第七天均在肺中显示始终较高的荧光素酶活性。在每个盒中含有不同启动子的双盒载体产生在每个时间点比在两个盒中均含有EF-1启动子的双盒载体所产生的高达到十倍或更高的肺荧光素酶水平。因此，在多盒载体的不同盒中使用不同的启动子元件可显著增加它们产生的基因表达的水平和持续时间。
在顺序IV阳离子脂质体注射(在有或无共注射中性脂质体的情况下)、随后IV注射 双盒单一质粒载体1天后在小鼠中产生的血清人G-CSF水平。
中性MLV脂质体由Phospholipon 90H，Lipoid GmbH制备。这种产品的脂肪酸含量是15％棕榈酸、85％硬脂酸。通过在旋转蒸发器上在有机溶剂中干燥脂质、然后将干燥的脂质膜以50毫摩尔的脂质浓度重新悬浮于5％右旋糖于水中的溶液中或通过将脂质水合成在5％w/v右旋糖中的干燥粉末来制备脂质体。两者均在60℃下制备。然后将溶液涡旋15分钟以形成MLV。在顺序IV注射单独缓冲液(对照)、单独或与1000纳摩尔中性MLV共注射的1000纳摩尔纯DOTAP SUV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射120μg EF1-荧光素酶--EF1-hGCSF(2表达盒)不含CPG的单一质粒DNA载体或1400纳摩尔的单独或与1000纳摩尔中性MLV共注射的纯DOTAP SUV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射100μg的EF1-荧光素酶--EF1-hGCSFDNA后第1天，从四只小鼠的组中收集血清。
如图14中所示，在顺序共注射纯DOTAP SUV连同中性MLV、然后EF1-荧光素酶--EF1-hGCSF DNA后一天产生的血清hG-CSF水平当与在无中性MLV的情况下顺序注射DOTAPSUV相比时增加3倍至600倍。因此，将中性脂质体与阳离子脂质体一起共注射可显著增加产生的基因表达的峰值水平。另外，共注射中性脂质体似乎消除通过在不共注射中性脂质体的情况下顺序注射不同比例的阳离子脂质体与DNA而产生的基因表达水平的变化。
在顺序IV阳离子脂质体与中性脂质体共注射、随后IV注射双盒质粒载体1或7天后 在小鼠中产生的血清人G-CSF水平
在顺序IV注射与1000纳摩尔中性MLV共注射的1000纳摩尔纯DOTAP SUV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射120μg不含CPG的EF1-荧光素酶--EF1-hGCSF DNA或与1400纳摩尔中性MLV共注射的1000纳摩尔纯DOTAP SUV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射100μg的EF1-荧光素酶--EF1-hGCSF DNA后第7天，从四只小鼠的组中收集血清。还在顺序IV注射仅缓冲液(对照)、分别与1000、750、500、250或100纳摩尔中性MLV共注射的800纳摩尔纯DOTAPSUV阳离子脂质体、两分钟后接着IV注射90μg的EF1-荧光素酶--EF1-hGCSF后第1天，从四只小鼠的组中收集血清。
如图15中所示，与在注射后一天在相同小鼠中产生的hG-CSF水平相比，通过共注射纯DOTAP SUV连同中性MLV产生的血清hG-CSF水平下降大约100倍(关于在这些相同小鼠的注射后第1天产生的hG-CSF水平，参见图14)。因此，与阳离子脂质体一起共注射中性脂质体可强烈改变递送的基因的峰值以及长期表达。另外，共注射的中性与阳离子脂质体的比例决定共注射的中性脂质体增加顺序递送的基因的表达的程度。
在顺序IV注射不同的阳离子脂质体制剂、然后单盒不含CPG的EF1-hG-CSF DNA7天 后的小鼠血清hG-CSF水平。
在顺序IV注射800或1000纳摩尔纯DOTAP SUV或MLV阳离子脂质体7天后，从四只小鼠的组中收集血清。注射三种阳离子脂质体制剂中的每一种两分后接着IV注射100或120μg的mCMV-EF1-h-G-CSF不含CPG的单盒DNA载体。通过在Lipex挤出装置中在高氩气压力下通过一定大小的聚碳酸酯膜顺序挤出来由MLV制备0.1μm挤出阳离子脂质体。
如图16中所示且部分取决于所注射的纳摩尔阳离子脂质体与μg DNA的比例，纯DOTAP SUV和0.1μm挤出阳离子脂质体产生了与由MLV阳离子脂质体所产生的一样有效的高水平hG-CSF表达。因此，当用于顺序阳离子脂质体、然后不含CPG的DNA注射时，SUV以及0.1μm挤出(寡层)阳离子脂质体与MLV一样有效。
实施例2
长期表达
在此实施例中，将每组五只小鼠顺序注射800纳摩尔的DOTAP MLV或SUV，随后90ug含有EF1或hCMV驱动的hG-CSF cDNA的不含CPG的质粒载体。对于注射后的随后428天以7或14天间隔评定人G-CSF蛋白的血清水平。如下进行获得并分析小鼠血清的人G-CSF水平。将每只小鼠麻醉并经由颌下静脉放血。使用来自BD的血清分离管从全血中分离血清。使用R&D系统人G-CSF ELISA，经由严格按照制造商的说明书进行的ELISA，以pg/ml测量人G-CSF水平。结果在图17中示出，并且显示在接受单次IV注射DOTAP SUV脂质体、然后EF1-huG-CSF质粒DNA载体后至少428天，在完全免疫活性小鼠中产生了人G-CSF蛋白的超治疗水平。
实施例3
大鼠中的蛋白质表达
在此实施例中，将250gm Sprague-Dawley雌性大鼠#22和23顺序注射6000纳摩尔的DOTAP SUV，然后300ug含有EF1驱动的hG-CSF DNA载体的不含CPG的质粒载体。在注射后以7天间隔评定人G-CSF蛋白、WBC和绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)的血清水平。在仅第1天评定血清ALT和AST水平。所有都由加州大学戴维斯分校比较病理学实验室评定。如以下图18和表3中所示，在单次IV注射后，在注射EF1-huG-CSF的大鼠中产生hG-CSF蛋白的超治疗水平以及显著升高的WBC和ANC持续至少22天。在注射后第1天测量的ALT和AST与未注射大鼠的背景对照水平可比较。
表3
Figure BDA0001600862350000421
实施例4
DPTAP脂质体
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射900纳摩尔的DOTAP、DMTAP或DPTAP(1，2-二棕榈酰基3-三甲基铵丙烷)SUV脂质体、两分钟后接着单次IV注射70ug的编码hG-CSF的EF-1质粒DNA载体。在注射后24小时通过ELISA测定hG-CSF的血清水平。图19示出HuG-CSF蛋白存在于来自用DOTAP或DPTAP而不是DMTAP处理的小鼠的血清中。这些数据表明多种阳离子脂质可介导体内转染，并且可通过选择脂质载体来控制蛋白质产生的水平。
实施例5
毒性在48小时内消退
在此实施例中，每组注射三只小鼠。小鼠购自查尔斯河实验室。如所指示，每只小鼠接受单次IV注射1000纳摩尔、1200纳摩尔或1400纳摩尔的DOTAP SUV脂质体，两分钟后接着单次IV注射100μg、120μg或140μg的不含CPG的EF-1驱动的编码荧光素酶的质粒DNA载体。在注射后24小时或48小时收集血清。在加州大学戴维斯分校比较病理学实验室测定ALT和AST测量值。如图20中所示，在顺序注射24小时，在所有脂质、然后DNA组中ALT和AST的血清水平升高2至5倍。在48小时，血清ALT和AST水平恢复至对照(背景)水平(由模拟注射组显示)。这些数据表明，如通过ALT/AST测量的毒性是急性的(在注射24小时内存在)且短暂的(到48小时消失)。
实施例6
具有DexP的脂质体
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射900纳摩尔的纯DOTAP SUV脂质体或者每只小鼠接受单次IV注射900纳摩尔的纯DOTAP SUV脂质体或含有指示摩尔％的与并入脂质体双层的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的脂质体。将5％胆固醇棕榈酸酯(CholP)并入脂质体双层中用作对照。在此两分钟后接着单次IV注射90ug编码hG-CSF的质粒DNA。在注射后24小时通过ELISA测定血清hG-CSF水平，并且在加州大学戴维斯分校比较病理学实验室测定ALT测量值。如图21中所示，在顺序注射后24小时时，如通过ALT水平测量的毒性比在仅用乳酸林格氏溶液模拟注射的动物(ALT对照)中所观察到的高2-3倍。将2.5％地塞米松棕榈酸酯(DexP)并入脂质体双层中产生增加hG-CSF的峰值表达以及在24小时时将ALT水平降低至背景(正常)水平的1.5倍以内的双重作用。
实施例7
DexP降低毒性且增加表达
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射900纳摩尔的纯DOTAP SUV脂质体或含有2.5摩尔％的与并入DOTAP脂质体的脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的脂质体。在此两分钟后接着单次IV注射130ug(高)或40μh(低)的EF-1驱动的编码hG-CSF的质粒DNA载体。在IV注射前2小时用IP注射1微摩尔地塞米松棕榈酸酯处理两个组。在注射后24小时通过ELISA测定血清hG-CSF水平，并且在24小时时由加州大学戴维斯分校比较病理学实验室测定ALT测量值。如图22中所示，顺序注射130ug的DNA在24小时后产生比40ug的DNA显著更高的hG-CSF蛋白水平。在任一DNA剂量下在脂质体中包含2.5摩尔％的地塞米松棕榈酸酯进一步增加hG-CSF蛋白水平。另外，即使在更高的DNA剂量下，在脂质体中并入地塞米松棕榈酸酯也将ALT水平降低至背景(正常)水平的1.5倍以内。
实施例8
预和后Dex注射
在此实施例中，将小鼠IP预注射15mg/kg的托法替尼或40mg/kg的地塞米松，2小时后接着顺序IV注射900纳摩尔DOTAP SUV，然后70ug不含CPG的EF-1驱动的hG-CSF质粒载体。在注射DNA后2小时施用另一次IP注射托法替尼或地塞米松。如图23中所示，在顺序阳离子脂质体、然后DNA注射之前以及之后施用地塞米松均显着增加HuG-CSF蛋白水平，同时将毒性降低在背景(正常)水平的1.5倍内。相比之下，免疫抑制剂托法替尼的预注射和后注射均未实现这两种作用。
实施例9
脂质与DNA比例
在此实施例中，向每组三只小鼠给予IV注射900、1000、1200或1500纳摩尔的DOTAPSUV脂质体，所述脂质体含有2.5摩尔％的与并入DOTAP脂质体的脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)、悬浮在乳酸林格氏液(LR)中至每次注射100uL的最终体积，2分钟后接着以每次注射100μL注射40、60或75ug不含CPG的EF-1驱动的hG-CSF质粒载体。模拟注射的小鼠仅接受LR而没有脂质或DNA。24小时后测定hG-CSF蛋白和ALT的血清水平。如图24中所示，顺序注射DOTAP SUV脂质与质粒DNA(纳摩尔脂质∶mg DNA)比例低于26∶1的小鼠的hG-CSF蛋白和ALT水平产生显著更高的hG-CSF蛋白水平，同时防止毒性，如通过产生在不接受脂质和DNA注射的对照小鼠中的背景(正常)水平的1.5倍以内或等于背景(正常)水平的ALT水平所证明。
实施例10
利妥昔单抗表达
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射1000纳摩尔的纯DOTAP阳离子脂质体或含有2.5摩尔％的与并入DOTAP脂质体的脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的脂质体。在此两分钟后，接着单次IV注射100ug的编码利妥昔单抗重链和轻链的双盒单一质粒DNA载体(参见图36、40和41中的构建体)。在注射后24小时且然后以7天间隔通过ELISA测定血清利妥昔单抗水平。将小鼠放血并如针对G-CSF一样分离血清。施用从Eagle Biosciences获得的Immunoguide ELISA测量利妥昔单抗水平并根据说明书进行。如图25中所示，IP地塞米松预处理加上在DOTAP脂质体中并入2.5摩尔％地塞米松棕榈酸酯使注射后血清利妥昔单抗水平增加超过5倍持续至少三周。
实施例11
利妥昔单抗表达
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射1000纳摩尔的纯DOTAP阳离子脂质体或含有2.5摩尔％的与并入DOTAP脂质体的脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的脂质体。在此两分钟后，接着单次IV注射100ug的编码利妥昔单抗的EF-1驱动的双盒单一质粒DNA载体(参见图36、40和41中的构建体)。一组在IV注射前两小时用IP注射40mg/kg地塞米松(Dex)和1000纳摩尔中性脂质(NL)DMPC进行处理。在注射后24小时且之后以7天间隔通过ELISA测定注射小鼠的血清利妥昔单抗水平。如图26中所示，在一次注射后，所有小鼠都产生显著水平的血清利妥昔单抗蛋白持续至少12周。接受Dex、DexP和NL的组合的小鼠随时间推移产生显著更高的血清利妥昔单抗水平。这些数据表明单次顺序注射双盒利妥昔单抗质粒DNA载体可在动物中产生显著水平的血清利妥昔单抗蛋白超过90天。
实施例12
双盒单一质粒利妥昔单抗表达
在此实施例中，将Raji细胞(100万个/样品)与小鼠血清样品或重组利妥昔单抗(50ng/ml)一起在含有EDTA和0.5％BSA的FACS结合缓冲液中在4C下孵育1小时。在洗涤后，将样品与荧光标记的第二抗体(抗人IgG-PE)一起孵育30分钟，洗涤并使用Accuri流式细胞仪进行分析。对于每个样品记录3500与5000次之间的事件。所述实验重复两次，具有相似的结果。
图27示出展示针对四种实验条件的荧光强度的FACS图。上图显示含有来自对照(HuG-CSF)DNA质粒载体注射的小鼠的小鼠血清或单独第二抗体的样品，所述样品在PE通道中展示较低背景荧光水平(约300)。下面两个图示出重组利妥昔单抗蛋白(左图)和利妥昔单抗质粒DNA载体施用后的小鼠血清(右图)。如以下表4中所示，两种样品均显示比背景高10倍以上的荧光强度，从而证明存在于小鼠血清中的利妥昔单抗与表达CD20的靶人Raji B细胞结合至与重组利妥昔单抗蛋白类似的程度。因此，在注射双盒单一质粒利妥昔单抗DNA载体后六周存在于小鼠血清中的利妥昔单抗以完全功能性的方式结合CD20+靶人B细胞。
表4
Figure BDA0001600862350000471
实施例13
功能性利妥昔单抗被表达
在此实施例中，使用RPMI+10％FBS培养基将Raji细胞(5x104个细胞/孔)接种在96孔板中。第二天，将细胞与利妥昔单抗(1、10ug/ml)或小鼠血清样品(20μl/孔)一起在室温下孵育1小时。然后向所有孔中加入20ul合并的正常人血浆(Innovative Research)(除利妥昔单抗对照条件外)，并将板在37C下再孵育12小时。根据制造商的说明使用Promega细胞滴度glo试剂测量细胞存活力。在图28中，值被示出为与使用来自注射huG-CSF DNA质粒DNA载体的小鼠的血清的对照条件的变化百分比。在血清收集前8至78天，从五个不同的接受单次顺序注射双盒单一质粒利妥昔单抗DNA载体的小鼠组测试单独小鼠血清。
此实施例的结果在图28中示出。首先通过ELISA分析来自先前注射双盒单一质粒利妥昔单抗DNA载体的小鼠的血清以定量血清利妥昔单抗浓度。在细胞溶解测定中添加这些含有利妥昔单抗的血清然后显示它们以与重组利妥昔单抗(Invivogen)可比较的方式溶解CD-20+人Raji B细胞。此外，在11周时期内，跨5次独立的注射实验从动物中分离出具有记录的溶解活性的功能性血清利妥昔单抗蛋白，从而证明其随时间推移的可重现的溶解功效。
实施例14
利妥昔单抗的增强的表达
在此实施例中，将每组两只250gm Sprague-Dawley雌性大鼠首先预注射40mg/kg地塞米松，然后在有或无4400纳摩尔的中性DMPC脂质的情况下顺序注射4400纳摩尔的含有2.5摩尔％的与并入脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的DOTAP SUV脂质体，然后360μg的含有EF1驱动的利妥昔单抗cDNA的双盒单一质粒DNA载体(参见图36、40和41中的构建体)。在注射后以7天间隔评定人利妥昔单抗蛋白的血清水平。图29示出在单次IV注射后还接受中性脂质至少15天的大鼠中产生了显著更高水平的血清利妥昔单抗蛋白。
实施例15
密码子优化的利妥昔单抗表达
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射1000纳摩尔的含有2.5摩尔％的与并入DOTAP脂质体的脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的脂质体。在此两分钟后，接着单次IV注射100ug的编码利妥昔单抗的双盒单一质粒EF-1驱动的DNA载体(参见图36、42和43中的构建体)。编号的质粒(图30中)是原始不含CpG的但未密码子优化的利妥昔单抗DNA序列的密码子优化的型式。在注射后24小时通过ELISA测定利妥昔单抗的血清水平。图30示出在顺序注射后24小时，密码子优化的DMA载体6产生比非密码子优化的利妥昔单抗DNA载体显著更高水平的血清利妥昔单抗蛋白。
实施例16
密码子优化的利妥昔单抗表达
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射含有2.5摩尔％的与并入脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的DOTAP阳离子脂质体(如所指示，900纳摩尔或1050纳摩尔)。在此两分钟后，接着单次IV注射75ug的编码利妥昔单抗的双盒密码子优化的单一质粒DNA(参见图36、42和43中的构建体)。在IV注射前2小时用IP注射40mg/kg地塞米松处理两个组。在注射后24小时且之后以7天间隔通过ELISA测定血清利妥昔单抗水平。图31示出密码子优化的双盒单一质粒利妥昔单抗DNA载体的一次顺序IV注射产生延长的血清利妥昔单抗水平持续至少接下来60天。在单次IV顺序注射后，血清利妥昔单抗水平随时间推移升高。
实施例17
丙戊酸和茶碱增加蛋白质表达
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射1050纳摩尔的含有2.5摩尔％的与并入DOTAP脂质体的脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的脂质体。在此两分钟后接着单次IV注射75ug编码利妥昔单抗的双盒质粒DNA。在IV注射前2小时用IP注射40mg/kg地塞米松处理所有组。在图32中所指示的情况下，还通过IP注射15mg/kg丙戊酸(VPA)、2mg/kg VPA、30mg/kg茶碱(Theo)或15mg/kg Theo对动物进行预处理。在注射后24小时通过ELISA测定血清利妥昔单抗水平。图32示出通过用药物丙戊酸或茶碱预处理显著增加了所产生的血清利妥昔单抗水平，因此提供用于进一步增强蛋白质水平而不改变脂质或DNA的剂量的框架。
实施例18
双或单盒利妥昔单抗表达
在此实施例中，将小鼠IP预注射40mg/kg地塞米松。两小时后，将小鼠顺序注射1050或1500纳摩尔的含有2.5摩尔％的与并入脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的DOTAP SUV脂质体，随后60μg或75μg的质粒DNA。所注射的质粒DNA构建体是密码子优化的双盒单一质粒DNA载体(参见图36、42和43中的构建体)或含有通过2A自裂解肽DNA序列隔开的利妥昔单抗重链和轻链序列的密码子优化的单盒质粒(参见图36、37和39中的构建体)。在注射后24小时通过ELISA测定血清利妥昔单抗水平。图33示出在顺序注射后24小时，接受含有2A肽的编码利妥昔单抗的单盒载体的小鼠产生接近400ng/ml的血清水平，大约为双盒载体产生的水平的三分之一。因此，显著的利妥昔单抗血清水平可通过双或单盒含2A含肽的DNA载体产生。
实施例19
脂质与DNA比例和利妥昔单抗表达
在此实施例中，向每组三只小鼠给予IV注射900、1050、1200、1500或1650纳摩尔的DOTAP SUV脂质体，所述脂质体含有2.5摩尔％的与并入脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)、悬浮在乳酸林格氏液(LR)中至每次注射100uL的最终体积，2分钟后接着以每次注射100uL注射75ug不含CPG的双盒单一质粒利妥昔单抗载体。模拟注射的小鼠仅接受LR而没有脂质或DNA。24小时后测定利妥昔单抗蛋白和ALT的血清水平。图34示出顺序注射DOTAP SUV脂质与质粒DNA(纳摩尔脂质：mg DNA)比例低于15∶1的小鼠的利妥昔单抗蛋白和ALT水平产生显著更高的利妥昔单抗蛋白水平，同时产生在不接受脂质和DNA注射的对照小鼠中的背景(正常)ALT水平的1.5倍以内的血清ALT水平。
实施例20
使用丙戊酸或茶碱情况下的因子IX表达
在此实施例中，每组注射三只小鼠。每只小鼠接受单次IV注射1500纳摩尔的含有2.5摩尔％的与并入脂质体双层中的棕榈酸酯共价连接的地塞米松(DexP)的DOTAP SUV脂质体。在此两分钟后，接着单次IV注射60ug的编码人因子IX cDNA的密码子优化的EF-1驱动的单盒DNA载体(参见图38和44中的构建体)。在IV注射前2小时用IP注射40mg/kg地塞米松处理所有组。在指示的情况下，还通过IP注射2mg/kg丙戊酸(VPA)或30mg/kg茶碱(Theo)对动物进行预处理。在注射后24小时通过ELISA测定血清人因子IX水平。将每只小鼠如针对G-CSF一样放血。将血液收集到含有EDTA钾或柠檬酸钠的管中以防止凝结并离心以获得血浆。根据制造商的说明书使用对人因子IX具有特异性的AssayPro ELISA来测量因子IX表达。图35示出在24小时时产生的血清人因子IX水平在接受人因子IX DNA载体加上用丙戊酸或茶碱预处理的小鼠中显著更高。
实施例21
脂质体的大小测定
在此实施例中，测定了各种脂质体的大小。具体地说，表5中的脂质体在5％w/w葡萄糖中制备，并且使用准弹性激光散射来测定大小。这些DOTAP脂质体的Z-平均粒度示于表5中。
表5
脂质体类型 Z-平均粒度(nm)
DOTAP多层脂质体(MLV) 339
DOTAP 0.1微米挤出MLV 146
DOTAP超声处理的脂质体(SUV) 74
本申请中提及的所有公布和专利均以引用的方式并入本文。本发明的所描述的方法和组合物的各种修改和变化对于本领域的技术人员将显而易见，而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合具体优选的实施方案描述了本发明，但应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地局限于所述具体实施方案。事实上，对于相关领域的技术人员来说显而易见的用于进行本发明的所描述模式的各种修改意图在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> DNARx
<120> 用于体内核酸表达的系统和方法
<130> DNARX-34520/WO-1/ORD
<150> US 62/220,646
<151> 2015-09-18
<160> 10
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 615
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
atggctggac ctgccaccca gagccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg 60
cacagtgcac tctggacagt gcaggaagcc acccccctgg gccctgccag ctccctgccc 120
cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa gtgaggaaga tccaggggga tggggcagct 180
ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag ctgtgccacc ctgaggagct ggtgctgctg 240
ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag 300
ctggcaggct gcttgagcca actccatagt ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag 360
gccctggaag ggatctcccc tgagttgggt cccaccttgg acacactgca gctggatgtt 420
gctgactttg ccaccaccat ctggcagcag atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg 480
cagcccaccc agggtgccat gcctgccttt gcctctgctt tccagagaag ggcaggaggg 540
gtcctggttg cctcccatct gcagagcttc ctggaggtgt cctacagagt tctaagacac 600
cttgcccagc cctga 615
<210> 2
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln
1 5 10 15
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro
20 25 30
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
35 40 45
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
50 55 60
Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
65 70 75 80
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
85 90 95
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
100 105 110
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
115 120 125
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
130 135 140
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
145 150 155 160
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
165 170 175
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
180 185 190
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
195 200 205
<210> 3
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
aagctttcc 9
<210> 4
<211> 8
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
aagccacc 8
<210> 5
<211> 4308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
cactatgtgg acatgaattc aattggctag caggagtcaa tgggaaaaac ccattggagc 60
caagtacact gactcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacat aaggtcaata 120
gggggtgagt caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac attgagtcaa tagggacttt 180
ccaatgggtt ttgcccagta cataaggtca atgggaggta agccaatggg tttttcccat 240
tactgacatg tatactgagt cattagggac tttccaatgg gttttgccca gtacataagg 300
tcaatagggg tgaatcaaca ggaaagtccc attggagcca agtacactga gtcaataggg 360
actttccatt gggttttgcc cagtacaaaa ggtcaatagg gggtgagtca atgggttttt 420
cccattattg gcacatacat aaggtcaata ggggtgacta gtggagaaga gcatgcttga 480
gggctgagtg cccctcagtg ggcagagagc acatggccca cagtccctga gaagttgggg 540
ggaggggtgg gcaattgaac tggtgcctag agaaggtggg gcttgggtaa actgggaaag 600
tgatgtggtg tactggctcc acctttttcc ccagggtggg ggagaaccat atataagtgc 660
agtagtctct gtgaacattc aagcttctgc cttctccctc ctgtgagttt ggtaagtcac 720
tgactgtcta tgcctgggaa agggtgggca ggagatgggg cagtgcagga aaagtggcac 780
tatgaaccct gcagccctag acaattgtac taaccttctt ctctttcctc tcctgacagg 840
ttggtaacca agccaccatg ggctggtccc tgatcctgct gttcctggtg gctgtggcca 900
ccagagtgct gagccaggtg cagctgcagc agcctggggc tgagcttgtg aaacctgggg 960
cctctgtgaa gatgagctgc aaggcctctg gctacacctt caccagctac aacatgcact 1020
gggtcaagca gacccctggc agaggcctgg aatggattgg agccatctac cctggcaatg 1080
gggacacctc ctacaaccag aagttcaagg gcaaggccac cctgacagct gacaagagca 1140
gcagcacagc ctacatgcag ctgtccagcc tgacctctga ggactctgct gtgtactact 1200
gtgccaggtc cacctactat gggggagact ggtacttcaa tgtgtgggga gctggcacca 1260
cagtgacagt gtctgctgcc agcaccaagg gcccctctgt gtttcctctg gcccccagca 1320
gcaagagcac ctctggggga acagctgccc tgggctgcct tgtgaaggac tacttccctg 1380
agcctgtgac tgtgtcctgg aactctgggg ccctgacatc tggggtgcac accttccctg 1440
cagtgctgca gtccagtggc ctgtactccc tgtcctctgt tgtgacagtg cccagctcca 1500
gcctgggcac ccagacctac atctgcaatg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg 1560
acaagaaggc tgagcccaag agctgtgaca agacccacac ctgtcccccc tgtcctgccc 1620
ctgaactgct gggaggacct tctgtgttcc tgttcccacc caagcccaag gataccctga 1680
tgatcagcag aacccctgaa gtgacctgtg tggtggtgga tgtgtcccat gaggacccag 1740
aagtgaagtt caattggtat gtggatgggg tggaagtgca caatgccaag accaagccca 1800
gagaggaaca gtacaacagc acctacagag tggtgtctgt gctgactgtg ctgcaccagg 1860
actggctgaa tggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg ccagccccca 1920
ttgagaaaac catcagcaag gccaagggcc agcctagaga accccaggtg tacacactgc 1980
cccctagcag ggatgagctg accaagaacc aggtgtccct gacatgcctt gtgaaaggct 2040
tctacccctc tgacattgct gtggaatggg agagcaatgg acagcctgag aacaactaca 2100
agaccacccc ccctgtgctg gactctgatg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag 2160
tggacaagtc cagatggcag cagggcaatg tgttcagctg ctctgtgatg catgaggccc 2220
tgcacaacca ctacacccag aaaagcctgt ccctgtcccc tggcaagaga gcaaagaggg 2280
caccagtgaa acagactttg aattttgacc ttctcaagtt ggcaggagat gtggagtcca 2340
accctggacc tatggacttc caggtgcaga tcatcagctt tctgctgatc tctgcctctg 2400
tgatcatgag cagaggccag attgtgctga gccagagccc tgccatcctg tctgcaagcc 2460
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
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<211> 5147
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aagaccaccc cccctgtgct ggactctgat ggctcattct tcctgtacag caagctgaca 2160
gtggacaagt ccagatggca gcagggcaat gtgttcagct gctctgtgat gcatgaggcc 2220
ctgcacaacc actacaccca gaaaagcctg tccctgtccc ctggcaagtg aagatctact 2280
tctggctaat aaaagatcag agctctagtg atctgtgtgt tggttttttg tgtctgcatt 2340
ctagcaggag tcaatgggaa aaacccattg gagccaagta cactgactca atagggactt 2400
tccattgggt tttgcccagt acataaggtc aatagggggt gagtcaacag gaaagtccca 2460
ttggagccaa gtacattgag tcaataggga ctttccaatg ggttttgccc agtacataag 2520
gtcaatggga ggtaagccaa tgggtttttc ccattactga catgtatact gagtcattag 2580
ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaata ggggtgaatc aacaggaaag 2640
tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat agggactttc cattgggttt tgcccagtac 2700
aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt ttttcccatt attggcacat acataaggtc 2760
aataggggtg actagtggag aagagcatgc ttgagggctg agtgcccctc agtgggcaga 2820
gagcacatgg cccacagtcc ctgagaagtt ggggggaggg gtgggcaatt gaactggtgc 2880
ctagagaagg tggggcttgg gtaaactggg aaagtgatgt ggtgtactgg ctccaccttt 2940
ttccccaggg tgggggagaa ccatatataa gtgcagtagt ctctgtgaac attcaagctt 3000
ctgccttctc cctcctgtga gtttggtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg 3060
ggcaggagat ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctagacaatt 3120
gtactaacct tcttctcttt cctctcctga caggttggta accaagccac catggacttc 3180
caggtgcaga tcatcagctt tctgctgatc tctgcctctg tgatcatgag cagaggccag 3240
attgtgctga gccagagccc tgccatcctg tctgcaagcc ctggggagaa agtgaccatg 3300
acctgcagag ccagcagctc tgtgtcctac atccactggt tccagcagaa gcctggcagc 3360
agccccaagc cttggatcta tgccaccagc aacctggcat ctggggtgcc agtcagattc 3420
tctggctctg gatctggcac cagctacagc ctgaccatca gcagagtgga agctgaggat 3480
gctgccacct actactgcca gcagtggacc agcaatcccc ccacctttgg agggggcacc 3540
aagctggaaa tcaagagaac agtggctgcc ccctctgtgt tcatcttccc accctctgat 3600
gagcagctga agtctggaac agcctctgtt gtgtgcctgc tgaacaactt ctaccccaga 3660
gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaat gccctgcagt ctggcaactc ccaggaatct 3720
gtgacagagc aggacagcaa ggactccacc tactccctga gcagcaccct gaccctgagc 3780
aaggctgact atgagaagca caaagtgtat gcctgtgaag tgacccacca gggcctgtcc 3840
agccctgtga ccaagagctt caacagaggg gagagctgaa gatctacttc tggctaataa 3900
aagatcagag ctctagtgat ctgtgtgttg gttttttgtg tctgcattct agctctagtg 3960
atcagcagtt caacctgttg atagtatgta ctaagctctc atgtttaatg tactaagctc 4020
tcatgtttaa tgaactaaac cctcatggct aatgtactaa gctctcatgg ctaatgtact 4080
aagctctcat gtttcatgta ctaagctctc atgtttgaac aataaaatta atataaatca 4140
gcaacttaaa tagcctctaa ggttttaagt tttataagaa aaaaaagaat atataaggct 4200
tttaaaggtt ttaaggtttc ctaggttatc ctcatatgag ctcttagaaa aactcatcca 4260
gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa 4320
gtcttttctg taatgaagga gaaaactcac ccaggcagtt ccataggatg gcaagatcct 4380
ggtatctgtc tgcaattcca actcttccaa catcaataca acctattaat ttcccctcat 4440
caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac cactgaatct ggtgagaatg 4500
gcaaaagatt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg ccagccattt ctctcatcat 4560
caaaatcact ggcatcaacc aaaccattat tcattcttga ttgggcctga gccagtctaa 4620
atactctatc agagttaaaa ggacaattac aaacaggaat ggaatgcaat cttctcagga 4680
acactgccag ggcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttcc aatacctgga 4740
atgctgtttt ccctgggatg gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gttctgataa 4800
aatgcttgat ggttggaaga ggcataaatt cagtcagcca gtttagtctg accatctcat 4860
ctgtaacatc attggcaaca gaacctttgc catgtttcag aaacaactct ggggcatctg 4920
gcttcccata caatctatag attgtggcac ctgattgccc aacattatct ctagcccatt 4980
tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatct tggcctggag caagaggttt 5040
ctctttgaat atggctcata catgtgcacc tcctatagtg agttgtatta tactatgcag 5100
atatactatg ccaatgttta attgtcag 5128
<210> 9
<211> 7413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
cactatgtgt taattaaaat tatctctaag gcatgtgaac tggctgtctt ggttttcatc 60
tgtacttcat ctgctacctc tgtgacctga aacatattta taattccatt aagctgtgca 120
tatgatagat ttatcatatg tattttcctt aaaggatttt tgtaagaact aattgaattg 180
atacctgtaa agtctttatc acactaccca ataaataata aatctctttg ttcagctctc 240
tgtttctata aatatgtacc agttttattg tttttagtgg tagtgatttt attctctttc 300
tatatatata cacacacatg tgtgcattca taaatatata caatttttat gaataaaaaa 360
ttattagcaa tcaatattga aaaccactga tttttgttta tgtgagcaaa cagcagatta 420
aaaggaattt gaattctcat agctagcagg agtcaatggg aaaaacccat tggagccaag 480
tacactgact caatagggac tttccattgg gttttgccca gtacataagg tcaatagggg 540
gtgagtcaac aggaaagtcc cattggagcc aagtacattg agtcaatagg gactttccaa 600
tgggttttgc ccagtacata aggtcaatgg gaggtaagcc aatgggtttt tcccattact 660
gacatgtata ctgagtcatt agggactttc caatgggttt tgcccagtac ataaggtcaa 720
taggggtgaa tcaacaggaa agtcccattg gagccaagta cactgagtca atagggactt 780
tccattgggt tttgcccagt acaaaaggtc aatagggggt gagtcaatgg gtttttccca 840
ttattggcac atacataagg tcaatagggg tgactagtgg agaagagcat gcttgagggc 900
tgagtgcccc tcagtgggca gagagcacat ggcccacagt ccctgagaag ttggggggag 960
gggtgggcaa ttgaactggt gcctagagaa ggtggggctt gggtaaactg ggaaagtgat 1020
gtggtgtact ggctccacct ttttccccag ggtgggggag aaccatatat aagtgcagta 1080
gtctctgtga acattcaagc ttctgccttc tccctcctgt gagtttggta agtcactgac 1140
tgtctatgcc tgggaaaggg tgggcaggag atggggcagt gcaggaaaag tggcactatg 1200
aaccctgcag ccctagacaa ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggttgg 1260
taaccaagcc accatgggct ggtccctgat cctgctgttc ctggtggctg tggccaccag 1320
agtgctgagc caggtgcagc tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaaac ctggggcctc 1380
tgtgaagatg agctgcaagg cctctggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt 1440
caagcagacc cctggcagag gcctggaatg gattggagcc atctaccctg gcaatgggga 1500
cacctcctac aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagctgaca agagcagcag 1560
cacagcctac atgcagctgt ccagcctgac ctctgaggac tctgctgtgt actactgtgc 1620
caggtccacc tactatgggg gagactggta cttcaatgtg tggggagctg gcaccacagt 1680
gacagtgtct gctgccagca ccaagggccc ctctgtgttt cctctggccc ccagcagcaa 1740
gagcacctct gggggaacag ctgccctggg ctgccttgtg aaggactact tccctgagcc 1800
tgtgactgtg tcctggaact ctggggccct gacatctggg gtgcacacct tccctgcagt 1860
gctgcagtcc agtggcctgt actccctgtc ctctgttgtg acagtgccca gctccagcct 1920
gggcacccag acctacatct gcaatgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa 1980
gaaggctgag cccaagagct gtgacaagac ccacacctgt cccccctgtc ctgcccctga 2040
actgctggga ggaccttctg tgttcctgtt cccacccaag cccaaggata ccctgatgat 2100
cagcagaacc cctgaagtga cctgtgtggt ggtggatgtg tcccatgagg acccagaagt 2160
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gctgaatggc aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgccag cccccattga 2340
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caccccccct gtgctggact ctgatggctc attcttcctg tacagcaagc tgacagtgga 2580
caagtccaga tggcagcagg gcaatgtgtt cagctgctct gtgatgcatg aggccctgca 2640
caaccactac acccagaaaa gcctgtccct gtcccctggc aagtgaagat ctacttctgg 2700
ctaataaaag atcagagctc tagtgatctg tgtgttggtt ttttgtgtct gcattctagc 2760
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aatgagcctt ctgatgaagt agtcttttca ttatttcaga tattagaaca ctaaaattct 3060
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tctcaatgtt agtctccaaa ttctattgac ttcaactcaa gagaatataa agagctagtc 3180
tttatacact ctttaaggta tgatatcatc tggaaagtaa caaaattgat gcaaatttga 3240
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ctctaattcc ttccatttga tctttcatac acaatctggt tctgatgtat gttttttgga 3360
tgcacttttc aactccaaaa gacagagcta gttactttct tcctggtgct ccaagcactg 3420
tatttgtatc tgtattcaag ccctttgcaa tattgtactg gatcattatt tcacctctag 3480
gatggcttcc ccaggcaact tgtgttcacc cagagactac attttgtatc ttgttgacct 3540
ttgaacttcc accagtgtct aaaaataata tgtatgcaaa attacttgct atgagaatgt 3600
ataattaaac aatataaaaa ggagaagcaa ggagagaaac acaggtgtgt atttgtgttt 3660
gtgtgcttaa aaggcagtgt ggaaaaggaa gaaatgccat ttatagtgag gagacaaagt 3720
tatattacct cttatctggc ttttaaggag attttgctga gctaaaaatc ctatattcat 3780
agaaaagcct tacctgagtt gccaatacct caattcagtc tagcaggagt caatgggaaa 3840
aacccattgg agccaagtac actgactcaa tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta 3900
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gggtttttcc cattactgac atgtatactg agtcattagg gactttccaa tgggttttgc 4080
ccagtacata aggtcaatag gggtgaatca acaggaaagt cccattggag ccaagtacac 4140
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catatataag tgcagtagtc tctgtgaaca ttcaagcttc tgccttctcc ctcctgtgag 4500
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tgtgtgttgg ttttttgtgt ctgcattcta gcagtcaata tgttcacccc aaaaaagctg 5460
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gacccattga tatatgtaag tgacctatga aaaaaatatg gcattttaca atgggaaaat 5700
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gtactaagct ctcatgtttc atgtactaag ctctcatgtt tgaacaataa aattaatata 6420
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atcctggtat ctgtctgcaa ttccaactct tccaacatca atacaaccta ttaatttccc 6720
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atcatcaaaa tcactggcat caaccaaacc attattcatt cttgattggg cctgagccag 6900
tctaaatact ctatcagagt taaaaggaca attacaaaca ggaatggaat gcaatcttct 6960
caggaacact gccagggcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttccaatac 7020
ctggaatgct gttttccctg ggatggcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagttct 7080
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ccatttatac ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcttggcc tggagcaaga 7320
ggtttctctt tgaatatggc tcatacatgt gcacctccta tagtgagttg tattatacta 7380
tgcagatata ctatgccaat gtttaattgt cag 7413
<210> 10
<211> 3492
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
cactatgtgg acatgaattc aattggctag caggagtcaa tgggaaaaac ccattggagc 60
caagtacact gactcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacat aaggtcaata 120
gggggtgagt caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac attgagtcaa tagggacttt 180
ccaatgggtt ttgcccagta cataaggtca atgggaggta agccaatggg tttttcccat 240
tactgacatg tatactgagt cattagggac tttccaatgg gttttgccca gtacataagg 300
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cccattattg gcacatacat aaggtcaata ggggtgacta gtggagaaga gcatgcttga 480
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cactggtgga cagagccacc tgtctgagaa gcaccaagtt caccatctac aacaacatgt 2040
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aagaaaagac caagctgaca tgaagatcta cttctggcta ataaaagatc agagctctag 2280
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gttgatagta tgtactaagc tctcatgttt aatgtactaa gctctcatgt ttaatgaact 2400
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tccaactctt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcatcaaaaa taaggttatc 2820
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ttctttccag acttgttcaa caggccagcc atttctctca tcatcaaaat cactggcatc 2940
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agcatccatg ttggaattta atcttggcct ggagcaagag gtttctcttt gaatatggct 3420
catacatgtg cacctcctat agtgagttgt attatactat gcagatatac tatgccaatg 3480
tttaattgtc ag 3492

Claims (15)

1.第一组合物和第二组合物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于执行在受试者中表达第一治疗性蛋白和/或生物活性核酸分子的方法，
其中所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构，
其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子，
其中所述第二组合物包含治疗有效量的非病毒表达载体，
其中所述非病毒表达载体是不含CpG或CpG减少的，
其中所述非病毒表达载体各自包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码：i)第一治疗性蛋白，和/或ii)第一生物活性核酸分子，并且
所述方法包括：
a)向受试者施用第一组合物，
其中所述受试者具有疾病或病状的至少一种症状或具有至少一种待改变的生理性状；
b)在施用所述第一组合物的约300分钟内向所述受试者施用第二组合物；和
c)向所述受试者施用地塞米松和/或地塞米松棕榈酸酯，所述地塞米松和/或地塞米松棕榈酸酯在所述第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中，并且
其中，作为所述施用所述第一组合物、所述施用所述第二组合物和所述施用所述地塞米松和/或地塞米松棕榈酸酯的结果，所述第一治疗性蛋白和/或所述生物活性核酸分子在所述受试者血清中的表达水平为至少9,500pg/ml。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述聚阳离子结构包含空脂质体，并且其中存在于所述第一组合物中的所述空脂质体具有约20-85nm的z-平均直径。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述表达载体中的每种各自仅包含单一表达盒，其中所述表达盒包含编码所述第一治疗性蛋白的所述第一核酸序列和编码第二治疗性蛋白的第二核酸序列。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述地塞米松棕榈酸酯是在所述第一组合物中，并且其中2.0％至6.0％的所述第一组合物包含所述地塞米松棕榈酸酯，和/或其中所述第一量的聚阳离子结构与所述治疗有效量的非病毒表达载体的比例是5:1至25:1。
5.如权利要求1所述的用途，其还包括施用药剂或另外的调控表达载体，所述药剂或另外的调控表达载体在所述第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中，其中与不向所述受试者施用所述药剂时相比，所述药剂增加或减少在所述治疗或有效水平下的所述表达和/或在所述治疗或有效水平下的所述表达的时间长度。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述药剂选自秋水仙碱、地塞米松、丙戊酸、茶碱、西地那非、氨来呫诺、氯喹、SAHA以及L-精氨酸+西地那非。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述表达载体各自还包含调控核酸序列，其中所述调控核酸序列减少在不存在所述调控核酸序列的情况下将发生的所述第一核酸序列的表达的持续时间。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述调控核酸序列选自由以下各项组成的组：启动子、增强子、编码第二蛋白质的第二核酸序列和/或第二生物活性核酸分子。
9.如权利要求1所述的用途，进一步包括施用中性脂质，所述中性脂质在所述第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中。
10.如权利要求1所述的用途，其中在所述第一和第二组合物之前向所述受试者施用所述第三组合物，并且其中所述第三组合物包含地塞米松。
11.如权利要求1所述的用途，其中所述地塞米松棕榈酸酯在所述第一组合物中作为所述聚阳离子结构的一部分。
12.第一组合物和第二组合物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于执行在受试者中表达第一蛋白质和第二蛋白质和/或第一生物活性核酸分子和第二生物活性核酸分子的方法，
其中所述第一组合物包含第一量的聚阳离子结构，
其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子，
其中所述第二组合物包含治疗有效量的非病毒表达载体，
其中所述非病毒表达载体是非病毒的并且是不含CpG或CpG减少的，
其中所述非病毒表达载体各自包含：
i)第一表达盒，所述第一表达盒编码：A)第一蛋白质，和/或B)第一生物活性核酸分子，以及
ii)第二表达盒，所述第二表达盒编码：A)第二蛋白质，和/或B)第二生物活性核酸分子，并且
所述方法包括：
a)向受试者施用第一组合物，
其中所述受试者具有疾病或病状的至少一种症状或至少具有待改变的生理性状；
b)在施用所述第一组合物的约300分钟内向所述受试者施用第二组合物，和
c)向所述受试者施用地塞米松和/或地塞米松棕榈酸酯，所述地塞米松和/或地塞米松棕榈酸酯在所述第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中，并且
其中，作为所述施用所述第一组合物，所述施用所述第二组合物，和所述施用所述地塞米松和/或地塞米松棕榈酸酯的结果，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质和/或所述第一生物活性核酸分子和所述第二生物活性核酸分子在所述受试者血清中的表达水平为至少9,500pg/ml。
13.如权利要求12所述的用途，进一步包括施用中性脂质，所述中性脂质在所述第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中。
14.如权利要求12所述的用途，其中在所述第一和第二组合物之前向所述受试者施用所述第三组合物，并且其中所述第三组合物包含地塞米松。
15.如权利要求12所述的用途，其中所述地塞米松棕榈酸酯在所述第一组合物中作为所述聚阳离子结构的一部分。
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