KR20230025941A - 비-erk mapk 경로 억제제-내성 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

비-erk mapk 경로 억제제-내성 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20230025941A
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딘 웰쉬
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Abstract

본 발명은 특히 비-ERK MAPK 경로 억제제 치료법에 대해 저항성이거나 내성이 있는 암의 작용을 치료하거나 개선시키기 위한 방법, 약제학적 조성물 및 키트를 제공한다. 또한, ERK 억제제 치료법으로부터 이득을 얻을 수 있는 암을 갖는 대상체를 확인하는 방법, 비-ERK MAPK 경로 억제제에 대해 저항성이거나 내성이 있는 암세포에서 RSK의 인산화를 억제하는 방법을 제공한다.

Description

비-ERK MAPK 경로 억제제-내성 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING NON-ERK MAPK PATHWAY INHIBITOR-RESISTANT CANCERS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은, 미국 특허출원 61/919,551 (2013.12.20)의 우선권을 주장하는 PCT 국제 출원 PCT/US2014/071749 (2014. 12.19)의 부분 연속출원인 미국 특허출원 15/161,137 (2016.5.20)에 대한 이권을 주장하며, 이들 모두는 본원에 전체가 인용되는 것처럼, 이들 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명은, 특히, 대상체에서, 비-ERK MAPK 경로 억제제 치료법에 대해 저항성이거나 내성이 있는 암의 작용을 치료하거나 개선시키기 위한 방법, 약제학적 조성물 및 키트를 제공한다.
참조로 포함된 서열 리스트
본 출원은, 2016년 5월 20일자로 생성된, 전체 크기 351 KB의 "0398850pct.txt"의 서열 리스트 텍스트 파일로서 본원 출원시 동시에 제출된 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 참조를 함유한다. 상기한 서열 리스트는 37 C.F.R. § 1.52(e)(5)에 따라 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 신호전달 경로의 성분들을 표적화하는 약물 억제제들은 다양한 암, 특히 BRAF 단백질 키나아제에 돌연변이를 갖는 암에 대한 임상적 효능을 나타낸다. RAF 및 MEK 억제제 둘다는 진행된 전이성 BRAF 돌연변이체 흑색종에서의 단일 제제 용도로 허가되었다. BRAF 및 MEK 억제제 활성은, 단독 또는 병용으로도 기타 암에서 예측할 수 없었고, BRAF 돌연변이 갑상선 및 폐암에서 효능이 유력하고, BRAF 돌연변이 결장직장암에서는 단지 주변 활성만 갖는다.
다른 표적화된 치료법에서와 같이, RAF 및 MEK 억제제에 대한 질환 반응의 패턴은, 약물이 사용되는 암에 존재하는 내인성 유전자 이종성에 의해 영향받는 것으로 보인다. 예를 들면, PTEN 및 PI3K 세포 성장 신호전달 경로를 활성화시키는 다른 변이를 포함한 특정 유전자 변화들은, RAF 억제제 베무라페닙을 사용하여 치료된 BRAF 돌연변이 흑색종에서 불량한 초기 반응 및/또는 비교적 빠른 진행을 예측할 수 있는 것으로 나타났다. 마찬가지로, MEK 유전자 좌(loci)에서의 직접적인 돌연변이는 BRAF, MEK 또는 병용된 약물 치료 이후 진행되는 종양에서 드러나는 것으로 보인다. RAS 및 RAF 유전자 증폭 및 스플라이싱 돌연변이들로부터의 몇몇 추가 예들은, 종양원성 다면발현이 표적화된 약물 치료의 선택압과 직면하게 되는 경우 획득된 약물 내성(acquired durg resistance)이 생긴다는 것을 시사한다.
상기와 같은 측면에서, 종양원성 경로의 다양한 교점들(nodes)을 이상적으로 억제하고, 다양한 암 게놈의 적응적(adaptive) 능력을 뛰어넘는 선택압의 부과를 유도함에 의해 병용제로 효과적인 신규한 표적화된 제제에 대한 필요성이 존재하였다. 본 출원은 상기 및 기타 필요성을 충족하는 것이다.
발명의 요지
본원 발명의 한 실시형태는, 비-ERK MAPK 경로 억제제 치료법에 대해 저항성이거나 내성이 있는 암의 작용을 대상체에서 치료하거나 개선시키기 위한 방법이다. 상기 방법은 상기 대상체에게 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여함을 포함한다.
본원 발명의 또다른 실시형태는 암의 작용을 대상체에서 치료하거나 개선시키기 위한 방법이다. 상기 방법은:
(a) BRAF 억제제 치료법, MEK 억제제 치료법 또는 BRAF 및 MEK 억제제 치료법에 대해 저항성이거나 내성이 된 암이 있는 대상체를 확인하는 단계; 및
(b) 상기 저항성 또는 내성 암이 있는 대상체에게 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 ERK 억제제의 유효량을 투여함을 포함한다.
본원 발명의 추가의 실시형태는, BRAF 억제제 치료법, MEK 억제제 치료법 또는 이들 둘 다에 대해 저항성이거나 내성이 있는 암의 작용을 대상체에서 치료하거나 개선시키기 위한 방법이다. 상기 방법은 상기 대상체에게 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여함을 포함한다.
본원 발명의 또다른 실시형태는 ERK 억제제를 사용한 치료법으로 혜택을 보는 암을 갖는 대상체를 확인하기 위한 방법이다. 상기 방법은:
(a) 상기 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 대상체가 하기 마커들:
(i) RAF 이소형들간의 전환,
(ii) 수용체 티로신 키나아제 (RTK) 또는 NRAS 신호전달의 상향조절,
(iii) 미토겐 활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 신호전달의 재활성화,
(iv) MEK 활성화 돌연변이의 존재,
(v) 돌연변이 BRAF의 증폭,
(vi) STAT3 상향조절,
(vii) MEK에 대한 억제제의 결합을 직접 차단하거나 구성적 MEK 활성을 초래하는 MEK의 알로스테릭 포켓에서의 돌연변이
중 하나 또는 그 이상을 갖는지를 결정하기 위해 상기 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 마커들 중 하나 또는 그 이상의 존재는, 상기 대상체의 암이 BRAF 및/또는 MEK 억제제 치료법에 대해 저항성 또는 내성이며 상기 대상체가 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 ERK 억제제를 사용한 치료법으로 혜택을 보게 될 것임을 확인시켜준다.
본원 발명의 추가의 실시형태는, 비-ERK MAPK 경로 치료법에 대해 저항성이거나 내성이 있는 암의 작용을 대상체에서 치료하거나 개선시키기 위한 약제학적 조성물이다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 및 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 포함한다.
본원 발명의 또다른 실시형태는, 비-ERK MAPK 경로 치료법에 대해 저항성이거나 내성이 있는 암의 작용을 대상체에서 치료하거나 개선시키기 위한 키트이다. 상기 키트는 본원 발명에 따른 상기 약제학적 조성물들 중 임의의 것을 이의 사용 지침서와 함께 포장하여 포함한다.
본원 발명의 또다른 실시형태는, 비-ERK MAPK 경로 억제제에 대해 저항성이거나 내성인 암 세포에서 RSK의 인산화를 억제하기 위한 방법이다. 상기 방법은 상기 암 세포 내에서 RSK의 인산화가 억제되기에 충분한 시간동안 상기 암 세포를 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량과 접촉시킴을 포함한다.
본원 발명의 또다른 실시형태는, 비절제성 또는 전이성 BRAF600 돌연변이-양성 흑색종을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 600 mg BID의 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여함을 포함한다.
본원 발명의 또다른 실시형태는, 비절제성 또는 전이성 BRAF600 돌연변이-양성 흑색종을 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 600 mg의 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 포함한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)이 있는 이같은 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 비용의 지불과 함께 요청이 있을 경우 청에 의해 제공될 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 제1 달 동안 사람 악성 흑색종 세포주 (A375 세포)에서 용량 상승 연구의 진행과정을 보여준다. 다양한 처리들 (트라메티닙 (2형 MEK 억제제), 다브라페닙 (BRAF 억제제), 및 BVD-523 (ERK1/2 억제제))은 표시된 바와 같다.
도 2a 내지 도 2h는 제1 달에 증가된 제제(들)에 대한 민감성에서의 변화를 추적하는 증식 검정의 결과를 보여준다. 다양한 처리들 (트라메티닙, 다브라페닙, BVD-523 및 파시탁셀)은 그래프의 상단에 표시된 바와 같다. 그래프의 우측 해설은 용량 상승 연구에서 나타난 다양한 세포 유형을 보여준다. 예를 들면, "다브라페닙"은 용량 상승 연구의 제1 달로부터 다브라페닙의 최고 용량으로 처리된 세포를 지칭한다. 모세포(parental)는 약물로 처리되지 않은 대조군 세포(control cells)를 지칭한다. 도 2a, 도 2c 및 도 2g는 대조군에 대해 정규화된 것이고, 도 2d, 도 2f 및 도 2h는 원데이터(raw data)를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 제2 달 동안 A375 세포에서의 용량 상승 연구의 진행과정을 보여준다. 다양한 처리들 (트라메티닙, 다브라페닙 및 BVD-523)은 표시된 바와 같다.
도 4a 내지 도 4h는 제2 달에 증가된 제제(들)에 대한 민감성에서의 변화를 추적하는 증식 검정의 결과를 보여준다. 다양한 처리들 (트라메티닙, 다브라페닙, BVD-523 및 파시탁셀)은 그래프의 상단에 표시된 바와 같다. 그래프의 우측 해설은 용량 상승 연구에서 나타난 다양한 세포 유형을 보여준다. 예를 들면, "다브라페닙"은 용량 상승 연구의 제2 달로부터 다브라페닙의 최고 용량으로 처리된 세포를 지칭한다. 모세포는 약물로 처리되지 않은 대조군 세포를 지칭한다. 도 4a, 도 4c 및 도 4g는 대조군에 대해 정규화된 것이고, 도 4d, 도 4f 및 도 4h는 원데이터를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5h는 도　4a 내지 도 4h로부터의 단지 모세포 및 BVD-523 세포주 데이터만을 보여준다. 다양한 처리들 (트라메티닙, 다브라페닙, BVD-523 및 파시탁셀)은 표시된 바와 같다. 도 5a, 도 5c 및 도 5g는 대조군에 대해 정규화된 것이고, 도 5d, 도 5f 및 도 5h는 원데이터를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 제3 달 동안 사람 악성 세포주 (A375 세포)에서 용량 상승 연구의 진행과정을 보여준다. 다양한 처리들 (트라메티닙, 다브라페닙 및 BVD-523)은 표시된 바와 같다.
도 7은 용량 상승 검정으로부터의 DMSO 대조군 웰에서 성장시킨 세포에 적용된 증식 검정의 결과를 보여주는 히스토그램이다.
도 8a 내지 도 8d는 당해 연구의 제3 달 동안의 증식 검정을 보여주는 일련의 선 그래프이다. 다양한 처리들 (트라메티닙, 다브라페닙, BVD-523 및 파시탁셀)은 그래프의 상단에 표시된 바와 같다. 그래프의 우측 해설은 용량 상승 연구에서 나타난 다양한 세포 유형을 보여준다. 예를 들면, "다브라페닙"은 용량 상승 연구의 제3 달로부터 다브라페닙의 최고 용량으로 처리된 세포를 지칭한다. 모세포는 약물로 처리되지 않은 대조군 세포를 지칭한다.
도 9a 내지 도 9d는 도 8a 내지 도 8d로부터의 모세포, 다브라페닙 및 BVD-523 세포주 데이터만을 보여준다.
도 10a는 알라마 블루 (Alamar Blue) 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 트라메티닙/다브라페닙 병용의 억제율%를 나타내는 용량 매트릭스이다. 도 10b는 트라메티닙/다브라페닙 병용에 대한 블리스 초과를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 10c 및 도 10d는 알라마 블루 (Alamar Blue) 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 다브라페닙 및 트라메티닙 단일 제제 처리에 대한 생존율(viability) %를 보여준다. 도 10e는 알라마 블루 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 다브라페닙 및 트라메티닙 병용 처리에 대한 생존율 %를 보여준다.
도 11a는 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo) 세포 생존성 검정을 사용하여 A375 세포에서 트라메티닙/다브라페닙 병용의 억제율 %를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 11b는 트라메티닙/다브라페닙 병용에 대한 블리스 초과를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 11c 및 도 11d는 셀타이터-글로 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 다브라페닙 및 트라메티닙 단일 제제 처리에 대한 생존율 %를 보여준다. 도 11e는 셀타이터-글로 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 다브라페닙 및 트라메티닙 병용 처리에 대한 생존율 %를 보여준다.
도 12a는 알라마 블루 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 BVD-523/다브라페닙 병용의 억제율 %를 나타내는 용량 매트릭스이다. 도 12b는 BVD-523/다브라페닙 병용에 대한 블리스 초과를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 12c 및 도 12d는 알라마 블루 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 다브라페닙 및 BVD-523 단일 제제 처리에 대한 생존율 %를 보여준다. 도 12e는 알라마 블루 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 다브라페닙 및 BVD-523 병용 처리에 대한 생존율 %를 보여준다.
도 13a는 셀타이터-글로 세포 생존성 검정을 사용하여 A375 세포에서 BVD-523/다브라페닙 병용의 억제율 %를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 13b는 BVD-523/다브라페닙 병용에 대한 블리스 초과를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 13c 및 도 13d는 셀타이터-글로 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 다브라페닙 및 BVD-523 단일 제제 처리에 대한 생존율 %를 보여준다. 도 13e는 셀타이터-글로 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 다브라페닙 및 BVD-523 병용 처리에 대한 생존율 %를 보여준다.
도 14a는 알라마 블루 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 트라메티닙/BVD-523 병용의 억제율 %를 나타내는 용량 매트릭스이다. 도 14b는 트라메티닙/BVD-523 병용에 대한 블리스 초과를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 14c 및 도 14d는 알라마 블루 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 BVD-523 및 트라메티닙 단일 제제 처리에 대한 생존율 %를 보여준다. 도 14e는 알라마 블루 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 BVD-523 및 트라메티닙 병용 처리에 대한 생존율 %를 보여준다.
도 15a는 셀타이터-글로 세포 생존성 검정을 사용하여 A375 세포에서 트라메티닙/BVD-523 병용의 억제 %를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 15b는 트라메티닙/BVD-523 병용에 대한 블리스 초과를 보여주는 용량 매트릭스이다. 도 15c 및 도 15d는 셀타이터-글로 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 BVD-523 및 트라메티닙 단일 제제 처리에 대한 생존율 %를 보여준다. 도 15e는 셀타이터-글로 세포 생존성 검정을 사용한 A375 세포에서 DMSO만으로 처리한 대조군에 비해 BVD-523 및 트라메티닙 병용 처리에 대한 생존율 %를 보여준다.
도 16a 내지 도 16d는 다양한 농도(nM)의 BVD-523, 다브라페닙 (Dab) 및 트라메티닙(Tram)으로 4시간 처리한 후 A375 세포에서 MAPK 신호전달의 웨스턴 블롯 분석을 보여주는 일련의 영상이다. 별도로 지시되는 경우를 제외하곤 각각의 레인에 40 μg의 총 단백질을 로딩하였다. 이 실험에서, 이중 샘플을 수거하였다. 도 16a 및 도 16b는 이중 샘플로부터의 결과를 나타낸다. 유사하게, 도 16c 및 도 16d는 또한 이중 샘플로부터의 결과를 나타낸다. 도 16a 및 도 16b에서, pRSK1는 A375 세포에서 다른 마커들에 비해 비교적 약한 신호를 나타냈다. 셀 시그날링(Cell Signaling (cat. #11989))으로부터의 상이한 pRSK1-S380 항체를 시험하였으나 검출가능한 신호를 나타내지 않았다 (데이터 도시안됨). 도 16c 및 도 16d에서, pCRAF-338은 최소의 신호를 나타냈다.
도 17a 내지 도 17d는 다양한 농도(nM)의 BVD-523, 다브라페닙 (Dab) 및 트라메티닙(Tram)으로 4시간 처리한 후 사람 결장직장암종 세포주 (HCT116 세포)에서 MAPK 신호전달의 웨스턴 블롯 분석을 보여주는 일련의 영상이다. 별도로 지시되는 경우를 제외하곤 각각의 레인에 40 μg의 총 단백질을 로딩하였다. 이 실험에서, 이중 샘플을 수거하였다. 도 17a 및 도 17b는 이중 샘플로부터의 결과를 나타낸다. 유사하게, 도 17c 및 도 17d는 또한 이중 샘플로부터의 결과를 나타낸다. 도 17a 및 도 17b에서, pRSK1 수준은 HCT116 세포에서 매우 낮은 것으로 보이고, 도 17c 및 도 17d에서, pCRAF-338 신호 또한 매우 약하였다.
도 18a 내지 도 18d는 다양한 농도(nM)의 표시한 것과 같은 BVD-523 ("BVD523"), 트라메티닙("tram") 및/또는 다브라페닙 ("Dab")으로 24시간 처리한 후 A375 흑색종 세포에서 세포 주기 및 아폽토시스 신호전달의 웨스턴 블롯 분석을 보여주는 일련의 영상이다. 별도로 지시되는 경우를 제외하곤 각각의 레인에 50 μg의 총 단백질을 로딩하였다. 이 실험에서, 이중 샘플을 수거하였다. 도 18a 및 도 18b는 이중 샘플로부터의 결과를 나타낸다. 유사하게, 도 18c 및 도 18d는 또한 이중 샘플로부터의 결과를 나타낸다. 도 18a 및 도 18b에서, 절단된 PARP (89kDa)에 상응하는 크기의 밴드는 나타나지 않았다.
도 19는 BVD-523이 표적화된 약물에 대한 획득된 내성을 생체내에서 치료할 수 있음을 보여준다. 환자 유래의 세포주 ST052C를, MAPK-경로 유도된 치료법으로 10개월 동안 치료한 후 진행된 BRAFV600E 흑색종 환자로부터 분리하였다. 생체외 처리된 ST052C는 50 mg/kg BID의 다브라페닙에 대한 획득된 교차 내성을 나타냈다. 한편, BVD-523은 100 mg/kg BID로 단일 제제로서 ST052C에 효과적이었다.
도 20은 본원에 사용된 용량 상승 프로토콜을 나타내는 플로우차트이다.
도 21은 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 (MAPK) 경로의 도식을 보여준다.
도 22a 내지 도 22e는 단일 제제 증식 검정의 결과를 보여준다. 증식 결과는 BVD-523 (도 22a), SCH772984 (도 22b), 다브라페닙 (도 22c), 트라메티닙 (도 22d) 및 파클리탁셀 (도 22e)로의 처리에 대해 도시되어 있다.
도 23a 내지 도 23o는 BVD-523과 다브라페닙 병용의 결과를 보여준다. 도 23a는 RKO 모세포(parental cell)에서 상기 병용제에 대한 억제율(%)을 나타내는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 23b 및 도 23c는 도23a의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정 결과를 도시한다. 도 23d는 도 23a의 상기 병용제에 대한 로에베(Loewe) 초과를 보여주고, 도 23e는 도 23a의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다. 도 23f는 RKO MEK1 (Q56P/+) - 클론 1 세포에서의 상기 병용제의 억제율(%)을 보여주는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 23g 및 도 23h는 도 23f의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정의 결과를 도시한다. 도 23i는 도 23f의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 23j는 도 23f의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다. 도 23k는 RKO MEK1 (Q56P/+) - 클론 2 세포에서의 상기 병용제의 억제율(%)을 보여주는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 23l 및 도 23m은 도 23k의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정의 결과를 도시한다. 도 23n은 도 23k의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 23o는 도 23k의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다.
도 24a 내지 도 24o는 SCH772984과 다브라페닙 병용의 결과를 보여준다. 도 24a는 RKO 모세포에서 상기 병용제에 대한 억제율(%)을 나타내는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 24b 및 도 24c는 도24a의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정 결과를 도시한다. 도 24d는 도 24a의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 24e는 도 24a의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다. 도 24f는 RKO MEK1 (Q56P/+) - 클론 1 세포에서의 상기 병용제의 억제율(%)을 보여주는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 24g 및 도 24h는 도 24f의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정의 결과를 도시한다. 도 24i는 도 24f의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 24j는 도 24f의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다. 도 24k는 RKO MEK1 (Q56P/+) - 클론 2 세포에서의 상기 병용제의 억제율(%)을 보여주는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 24l 및 도 24m은 도 24k의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정의 결과를 도시한다. 도 24n은 도 24k의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 24o는 도 24k의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다.
도 25a 내지 도 25o는 트라메티닙과 다브라페닙 병용의 결과를 보여준다. 도 25a는 RKO 모세포에서 상기 병용제에 대한 억제율(%)을 나타내는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 25b 및 도 25c는 도 25a의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정 결과를 도시한다. 도 25d는 도 25a의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 25e는 도 25a의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다. 도 25f는 RKO MEK1 (Q56P/+) - 클론 1 세포에서의 상기 병용제의 억제율(%)을 보여주는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 25g 및 도 25h는 도 25f의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정의 결과를 도시한다. 도 25i는 도 25f의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 25j는 도 25f의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다. 도 25k는 RKO MEK1 (Q56P/+) - 클론 2 세포에서의 상기 병용제의 억제율(%)을 보여주는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 25l 및 도 25m은 도 25k의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정의 결과를 도시한다. 도 25n은 도 25k의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 25o는 도 25k의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다.
도 26a는 시험된 병용제에 대한 로베(Lowe) 용적을 도시한다. 도 26b는 시험된 병용제에 대한 블리스(Bliss) 용적을 도시한다. 도 26c는 시험된 병용제에 대한 상승작용 스코어를 도시한다.
도 27a 내지 도 27i는 MEK 획득된 내성에서 MAPK 및 이펙터 경로 신호전달에서의 변화를 도시한다. 동질유전자 RKO 모세포 및 MEK1 (Q56P/+) 세포를 화합물로 4 또는 24 시간 처리한 후 지시된 항체로 면역블롯팅한다. 다브라페닙은 BRAF 억제제였고 트라메티닙은 MEK 억제제였다. 도 27a는 RKO MEK1 (Q56P/+) 세포에서의 증가된 신호전달을 도시한다. 도 27b 및 도 27c는 RKO 모세포 (27b) 및 RKO MEK1 (Q56P/+) (27c) 세포에서의 실험 1 (실시예 7 참고)에서와 같이 4시간 처리한 결과를 도시한다. 도 27d 및 도 27e는 RKO 모세포 (27d) 및 RKO MEK1 (Q56P/+) (27e) 세포에서의 실험 2 (실시예 7 참고)에서와 같이 4시간 처리한 결과를 도시한다. 도 27f 및 도 27g는 RKO 모세포 (27f) 및 RKO MEK1 (Q56P/+) (27g) 세포에서의 실험 2 (실시예 7 참고)에서와 같이 4시간 처리한 결과를 도시한다. 도 27h 및 도 27i는 RKO 모세포 (27h) 및 RKO MEK1 (Q56P/+) (27i) 세포에서의 결과의 요약을 도시한다.
도 28a 및 도 28e는 BVD-523 및 SCH772984 병용의 결과를 도시한다. 도 28a는 A375 세포에서 상기 병용제에 대한 억제율(%)을 나타내는 용량 매트릭스를 도시한다. 도 28b 및 도 28c는 도 28a의 상기 병용제에서의 단일 제제 증식 검정 결과를 도시한다. 도 28d는 도 28a의 상기 병용제에 대한 로에베 초과를 보여주고, 도 28e는 도 28a의 상기 병용제에 대한 블리스 초과를 보여준다.
도 29a 내지 도 29f는 신규한 ERK1/2 억제제 BVD-523 (울릭서티닙)의 발견 및 특징분석을 나타낸다. 도 29a는 BVD-523가 가역적 ATP-경쟁적 방식의 억제를 나타냄을 증명한다. 이것은 도 29b에 도시된 바와 같이 ATP 농도가 증가함에 따라 ERK2의 억제에 대한 IC50 값의 선형 증가에 의해 입증된다. 도 29c는 용량-반응 곡선의 대표적인 플롯을 도시하고 도 29d는 시간에 따른 IC50 플롯을 도시한다. 도 29e는 음성 대조 단백질 p38과 비교한, ERK2 및 포스포-ERK2 (pERK2)에 대한 BVD-523의 결합을 도시한다. 도 29f는 ERK 억제제 SCH772984 및 피라졸릴피롤과 비교한, ERK2에 대한 BVD-523 결합을 도시한다.
도 30a 내지 도 30d는 BVD 523이 시험관내에서 세포 증식을 억제하고 카스파제 3 및 카스파제 7 활성을 증가시킴을 보여준다. 도 30a는, RAS 패밀리 구성원 및 RAF의 존재에 의해 정의되는 것과 같이, MAPK 경로 돌연변이를 갖는 세포에서 BVD-523이 우선적 활성을 나타냄을 입증한다. 또한, 도 30b에 도시된 것과 같이, BVD-523은 세포 주기의 G1기에서 민감성 세포주를 차단한다. 도 30c는 BVD-523이 A375, WM266 및 LS411N 암세포주에서 72시간 노출 후 카스파제 활성의 농도 및 시간 의존적 증가를 유도하였음을 보여준다. 도 30d는 MAPK 경로 및 이펙터 단백질이 BRAF V600E-돌연변이 A375 세포에서 급성 (4시간) 및 지속적 (24시간) BVD-523 처리에 의해 조절됨을 보여준다.
도 31a 내지 도 31c는 생체내 BVD-523 항-종양 활성을 도시한다. BVD-523 단일치료로, A375(도 31a) 및 Colo205 세포주 (도 31b) 이종이식 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여준다 (a P<0.0001, 비히클 대조군과 비교; 14일 및 18일째 CPT-11만 투여). 약어: BID, 1일 2회; CMC, 카복시메틸셀룰로즈; QD, 매일; Q4D, 4일마다. 도 31c는 Colo205 이종이식편에서, 증가된 ERK1/2 포스포릴화가 BVD-523 농도와 상호관련있음을 보여준다.
도 32a는 ERK1/2 억제제의 신호전달 효과를 도시한다. RPPA를 사용하여, 단백질에 대한 효과를 세포주 (A375, AN3Ca, Colo205, HCT116, HT29 및 MIAPaca2)에서 ERK1/2 억제제 BVD-523 (BVD), Vx11e (Vx), GDC-0994 (GDC), 또는 SCH722984 (SCH)로 처리한 후 측정한다. 도 32b는 ERK 억제제 BVD-523, GDC-0994, 및 Vx11e가 SCH722984와 비교하여 포스포-ERK (ERK 1/2 T202 Y204)에 대해 차별적 효과를 가짐을 보여준다; 포스포-RSK (p90 RSK 380) 및 사이클린 D1은 시험된 ERK 억제제에 의해 억제된다. 약어: BRAFi, BRAF 억제제; MEKi, MEK 억제제. 도 32c는 BVD-523, 트라메티닙, SCH722984, 또는 다브라페닙으로 처리 후 RKO 세포주로부터의 세포 및 핵 분획에 대한 웨스턴 블롯 검정을 도시한다. 히스톤 H3 (핵 편재된 단백질) 및 HSP90 (세포질 편재된 단백질)을 양성 대조군으로 포함시켜 핵 및 세포질 분획이 적절히 향상되었는지를 확인한다; 핵 분획은 높은 H3를 갖고 세포질 분획은 보다 높은 HSP90을 갖는다.
도 33은 ERK 억제제 BVD-523, Vx11, GDC-0994 및 SCH772984 (SCH)가 포스포-ATK 수준에서 세포주-의존적 변화를 나타냄을 보여준다. 약어: DMSO, 디메틸 설폭사이드.
도 34a 내지 도 34d는 BRAF/MEK 억제에 대한 내성 모델에서 BVD-523이 활성을 나타냄을 보여준다. 증가된 약물 농도로의 노출 후 BRAF V600E A375 세포에서 BVD-523, 다브라페닙 또는 트라메티닙에 대한 내성의 발현을 표시한다. 처리들간에 내성 획득의 동력학(kinetics)이 확실히 비교될 수 있도록 하기 위하여 언제 용량이 증가될 수 있는지 결정하기 위한 엄격한 세트의 "기준"이 적용되었다 (참고, 실시예 1). 시간은 IC50의 승수에 대하여 나타난다; 플롯팅된 선의 각각의 포인트는 배지의 변화 또는 세포 분열을 나타낸다. 도 34a는 BVD-523의 존재하에 세포를 성장에 적응시키는 것이 다브라페닙 또는 트라메티닙을 사용하는 경우에서 보다 더 도전적임(challenging)을 나타낸다. 도 34b는 병용된 BRAF (다브라페닙) + MEK (트라메티닙) 억제에 대한 내성을 획득하기 위해 배양된 A375 세포에 BVD-523 민감성이 보유됨을 도시한다. 도 34c에서, 세포를 96 시간 동안 화합물로 처리하고 CellTiter-Glo®로 생존성을 평가하였다. BVD-523 활성은, MEK1 Q56P의 내인성 이형접합 녹-인(knock-in)으로 인해 BRAF (다브라페닙) 및 MEK (트라메티닙) 억제제에 대한 교차 내성인 BRAF V600E RKO 세포 내에서 보유된다. 도 34d는 BRAF V600E-돌연변이 세포주 RKO 내에서 pRSK의 BVD-523 억제가 MEK1 Q56P (MEK 및 BRAF 억제에 대한 내성 부여)의 존재하에 유지됨을 보여준다. SW48 세포주 내로의 KRAS 돌연변이 대립유전자의 녹-인 (knock-in)으로 MEK 억제제 트라메티닙 및 셀루메티닙에 대한 민감성이 상당히 사라지지만, BVD-523 에 대한 민감성은 상대적으로 유지된다.
도 35a는 베무라페닙-재발된 환자로부터 유래된 이종이식편에서 BVD-523의 생체내 활성을 도시한다. 평균 종양 용적 (± SEM)이 BVD-523 100 mg/kg BID 단독, 다브라페닙 50 mg/kg BID 단독, 및 BVD-523 100 mg/kg BID 플러스 다브라페닙 50 mg/kg BID에 대해 도시되어 있다. 약어: BID, 1일 2회; SEM, 평균의 표준 오차.
도 36a 내지 도 36d는 병용된 BVD-523 및 BRAF 억제의 이점을 도시한다. 도 36a 및 도 36b는, 75-144 mm3의 초기 종양 용적을 갖는 A375 BRAF V600E-돌연변이 흑색종 세포주 이종이식 모델에서, BVD-523 플러스 다브라페닙의 병용이 각각의 제제 단독으로의 치료에 비해 우수한 항종양 활성을 나타냈음을 보여준다. 도 36c 및 도 36d는 투약 초기에 거대 종양 용적 (700 내지 800 mm3)을 갖는 동일 모델로부터의 유사한 데이터를 보여준다. 평균 종양 성장 (좌측 패널) 및 카플린-마이어 생존 (우측 패널)의 플롯이 각각의 연구에 대해 제시된다. 약어: BID, 1일 2회; QD, 1일 1회.
도 37a는, KRAS 대립유전자로 엔지니어링된 SW48 결장직장 세포에서 파클리탁셀에 대한 반응이 대조군에 비해 변화되지 않았음을 보여준다. 도 37b는 BVD-523 및 베무라페닙 사이의 병용 상호작용을 도시하는데, 이는 로에베 합 공식 및 블리스 독립 모델 (Loewe Additivity and Bliss Independence Models)을 사용하여 농도의 8 Х 10 매트릭스를 사용하여 평가하고 호리즌 챌리스 (Horizon's Chalice, Bioinformatics Software)로 분석하였다. 챌리스는, 용량 매트릭스를 가로지르는 부가치(additive)로서의 예상값을 초과하는 계산된 억제 초과값을 히트맵(heat map)으로 디스플레이하고, 로에베 모델에 기초하여 정량적 "상승작용 스코어"를 리포팅함으로써, 잠재적 상승적 상호작용을 식별가능하게 한다. 그 결과는, BVD-523 및 베무라페닙 사이의 상호작용이 적어도 상가적이고, 일부의 경우, BRAF V600E 돌연변이를 함유하는 흑색종 세포주에서 상승적임을 시사한다. 도 37c는 BVD-523과 다브라페닙의 병용이 A375 BRAF V600E 흑색종 세포에서 획득된 내성의 개시를 현저히 지연시킴을 보여준다. 다브라페닙 단독 또는 BVD-523 또는 트라메티닙과 병용된 다브라페닙의 농도 상승에 반응한 일시적인 내성의 획득을 평가하였다. 처리들간에 적응의 동력학(kinetics)이 확실히 비교될 수 있도록 하기 위하여 언제 용량이 증가될 수 있는지에 대한 엄격한 세트의 "기준"이 적용되었다 (참고, 실시예 1).
도 38은 사람 전혈에서 BVD-523이 생체외에서 PMA-자극된 RSK1/2 포스포릴화를 억제함을 보여준다. 평균 BVD-523 농도 데이터 세트를 (―)로 표시한다. BVD-523의 각각의 농도에 대해 n = 20이다. 약어: PBMC, 말초혈 단핵 세포; RSK, 리보솜 S6 키나아제.
도 39a는 정상 상태 BVD-523 약동학을 도시한다 (사이클 1, 제15일). 빨간 점선은 EC50 200 ng/mL HWB를 나타낸다. 약어: AUC, 곡선하 면적; BID, 1일 2회; Cmax, 최대 농도; EC50, 50% 최대 유효 농도; HWB, 사람 전혈; SD, 표준 편차. 도 39b는 사람 전혈에서 BVD-523에 의한 ERK 포스포릴화의 약력학적 억제를 도시한다. 약어: BID, 1일 2회; pRSK, 포스포-RSK; RSK, 리보솜 S6 키나아제.
도 40a는 BVD-523으로 치료한 환자에서의 최고의 방사선촬영 반응을 도시한다. 연구 치료의 ≥1 용량을 투여받고 >1 치료시 종양 평가를 받은 (25/27; 2는 표적 병소의 스캔 둘다를 받지 않았다), RECIST v1.1 에 의해 측정된 질환을 갖는 모든 환자들을 포함시켰다. 반응은, 각각의 표적 병소의 최장 직경의 합에서 기준선으로부터의 변화로 측정하였다. 나타낸 용량은 반응 시점에 환자가 받은 용량이다. 점선은 RECIST v1.1에 따른 부분 반응에 대한 역치를 나타낸다. 약어: CRC, 직장결장암; NET, 신경내분비 종양; NSCLC, 비-소세포 폐암; NSGCT, 비정상피종성배세포종양; PNET, 췌장 NET; PTC, 유두갑상선암; RECIST v1.1, 고형 종양에서의 반응 평가 기준 버전 1.1; SLD, 최장 직경의 합. 도 40b는 BVD-523으로 치료된 BRAF-돌연변이 흑색종을 갖는 61세 환자에서 확인된 부분 반응의 컴퓨터 단층촬영 스캔을 나타낸다.
도 41은 종양 반응 및 종양 진행을 도시한다. BVD-523으로 치료된 반응-측정가능한 환자에서의 종양 반응, 종양 진행 및 치료 지속기간의 스위머 플롯이 도시되어 있다. 종축의 원점은 랜덤화 날짜 또는 참조 개시일에 상응한다. 분석 종료일: 2015년 12월 1일. 약어: BID, 1일 2회.
발명의 상세한 설명
본 발명의 하나의 실시형태는 대상체에서 암의 작용의 치료 또는 개선 방법이고, 여기서, 암은 비-ERK MAPK 경로 억제제 치료법에 대해 저항성 또는 내성이다. 상기 방법은 대상체에게 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 유효량을 투여함을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)", "치료(treatment)" 및 이의 문법적인 변형은 개별적인 대상체에게 프로토콜, 용법, 프로세스 또는 치료법을 수행함을 의미하고, 여기서, 대상체, 예를 들면, 환자에서 생리적인 반응 또는 극복을 획득하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 방법 및 조성물은 질환 증상의 발병을 느리게 하거나 질환 또는 상태의 개시를 지연시키거나 질환 발달의 진행을 멈추는데 사용될 수 있다. 그러나, 모든 치료된 대상체는 특정 치료 프로토콜, 용법, 프로세스 또는 치료법에 반응하지 않을 수 있기 때문에, 치료는 각각의 모든 대상체 또는 대상체 집단, 예를 들면, 환자 집단에서 목적하는 생리적인 반응 또는 극복이 성취되는 것을 요구하지 않는다. 따라서, 제공된 대상체 또는 대상체 집단, 예를 들면, 환자 집단은 치료에 반응하는데 실패하거나 치료에 부적합하게 반응한다.
본원에 사용된 용어 "개선하다(ameliorate)", "개선하는(ameliorating)" 및 이의 문법적인 변형은 대상체에서 질환의 증상의 중증도를 감소시킴을 의미한다.
본원에 사용된 "대상체(subject)"는 포유동물, 바람직하게는, 사람이다. 사람 이외에, 본 발명의 범위 내에 포유동물의 범주는, 예를 들면, 농장 동물, 가축 동물, 실험실용 동물 등을 포함한다. 농장 동물의 일부 예는 소, 돼지, 말, 염소 등을 포함한다. 가축 동물의 일부 예는 개, 고양이 등을 포함한다. 실험실 동물의 일부 예는 영장류, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그 등을 포함한다.
본 발명에서, BVD-523은 화학식 (I)에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염에 상응한다:
화학식 (I)
Figure pat00001
BVD-523은, 예를 들면, 미국 특허 제7,354,939호에 개시된 방법에 따라서 합성할 수 있다. BVD-523의 둘 다의 에난티오머 에난티오머 및 라세미 혼합물은 또한 본 발명의 범위 내에 고려된다. BVD-523은, 문헌[참조: Hatzivassiliou et al. (2012)]에 사용된 SCH772984 및 피리미딘 구조와 같은 특정의 다른 ERK1/2 억제제와 고유하고 별개인 것으로 여겨지는, 작용 기전을 갖는 ERK1/2 억제제이다. 예를 들면, SCH772984와 같은 다른 ERK1/2 억제제는, ERK의 자동인산화를 억제하고[참조: Morris et al., 2013], 반면 BVD-523은 ERK의 자동인산화를 가능하게 하면서 여전히 ERK를 억제한다. [참조: 예를 들면, 도 18).
본원에 사용된 단어 "내성(resistant)" 및 "저항성(refractory)"은 상호교환적으로 사용된다. 비-ERK MAPK 경로 억제제 치료법 치료에 대한 "내성"이 있음은 비-ERK MAPK 억제제가 암 치료시 감소된 효능을 갖는다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "비-ERK MAPK 억제제"는 ERK1/2 억제제를 제외하고 세포 성장의 감소 또는 세포 사멸 증가를 야기하는 MAPK 경로의 단백질 또는 다른 구성원의 활성, 발현 또는 인산화를 감소시키는 임의의 물질을 의미한다. 본원에 사용된 "ERK1/2 억제제" (i) 예를 들면, ERK1/2에 결합하여 ERK1 및/또는 ERK2와 직접적으로 상호작용하고, (ii) ERK1 및/또는 ERK2 단백질 키나아제의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 의미한다. 따라서, MEK 억제제 및 RAF 억제제와 같은 ERK1/2의 업스트림에서 작용하는 억제제는, 본 발명에 따른 ERK1/2 억제제가 아니다(그러나 이들은 비-ERK MAPK 억제제이다). 본 발명에 따른 ERK1/2 억제제의 비-제한적 예는 AEZS-131 (Aeterna Zentaris), AEZS-136 (Aeterna Zentaris), BVD-523 (BioMed Valley Discoveries, Inc.), SCH-722984 (Merck & Co.), SCH-772984 (Merck & Co.), SCH-900353 (MK-8353) (Merck & Co.), 약제학적으로 허용되는 이의 염, 및 이의 조합을 포함한다.
포유동물 MAPK 케스케이드의 개요를 도 21에 나타낸다. MAPK 경로는 예를 들면, 문헌[참조: Akinleye et al., 2013]에서 검토된다. 간단히, 도 21에서 ERK1/2 모듈에 대해(연자색 박스, MAPK 1/2 신호전달 케스케이드는 수용체 티로신 키나아제 (RTK)로의 리간드 결합에 의해 활성화된다. 활성화된 수용체는 어댑터 단백질 Grb2 및 SOS를 동원하고 인산화하고, 이는 이어서 막-결합 GTPase Ras와 상호작용하고, 이의 활성화를 야기한다. 이의 활성화된 GTP-결합 형태에서, Ras는 RAF 키나아제 (A-RAF, B-RAF, 및 C-RAF/RAF-1)를 동원하고 활성화한다. 활성화된 RAF 키나아제는 MAPK 1/2 (MKK1/2)를 활성화시키고, 이는 차례로 ERK1/2의 활성화 서열 Thr-Glu-Tyr에서 트레오닌 및 티로신 잔기의 인산화를 촉매화한다. JNK/p38 모듈에 대해(도 21에서 황색 박스), 업스트림 키나아제, MAP3Ks, 예를 들면, MEKK1/4, ASK1/2, 및 MLK1/2/3은, MAP2K3/6 (MKK3/6), MAP2K4 (MKK4), 및 MAP2K7 (MKK7)을 활성화시킨다. 이들 MAP2K는 이어서 JNK1, JNK2, 및 JNK3, 뿐만 아니라 p38 α/β/γ/δ를 포함하는 JNK 단백질 키나아제를 활성화시킨다. 이의 기능을 실행하기 위해, JNKs는 c-Jun, ATF-2, NF-ATc1, HSF-1 및 STAT3을 포함하는 수개의 전사 인자를 활성화시킨다. ERK5 모듈에 대해(도 21에서 청색 박스), MAP2K5 (MKK5)의 키나아제 업스트림은 MEKK2 및 MEKK3이다. MEK5의 최고 특성화된 다운스트림 표적은 ERK5이고, 이는 또한 큰 MAP 키나아제 1 (BMK1)로서 공지되어 있는데, 다른 MAPKs의 크기의 2배이기 때문이다.
본 발명에 따른 비-ERK MAPK 경로 억제제의 비-제한적 예는 RAS 억제제, RAF 억제제 (예를 들면, A-RAF, B-RAF, C-RAF (RAF-1)의 억제제), MEK 억제제, 및 이의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 비-ERK MAPK 경로 억제제는 BRAF 억제제, MEK 억제제, 및 이의 조합이다.
본원에 사용된 "RAS 억제제"는 (i) 예를 들면, RAS에 결합하여 RAS와 직접적으로 상호작용하고, (ii) RAS의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 의미한다. 비-제한적 예시적인 RAS 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 (예를 들면, 티피파르닙 및 로나파르닙), 파르네실 그룹-함유 소분자(예를 들면, 살리라시브 및 TLN-4601), 마우러(Maurer)에 의해 개시된 DCAI [참조: Maurer et al., 2012], 시마(Shima)에 의해 개시된 Kobe0065 및 Kobe2602 [참조: Shima et al., 2013], HBS 3 [참조: Patgiri et al., 2011], 및 AIK-4 (Allinky)를 포함한다.
본원에 사용된 "RAF 억제제"는 (i) 예를 들면, RAF에 결합하여 RAF와 직접적으로 상호작용하고, (ii) A-RAF, B-RAF, 및 C-RAF (RAF-1)와 같은 RAF의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 의미한다. BRAF 억제제를 포함하는 비-제한적 예시적인 RAF 억제제는 다음을 포함한다:
화합물 7
Figure pat00002
(리(Li) 등),
화합물 9
Figure pat00003
(Id.),
화합물 10
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화합물 13
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화합물 14
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화합물 15
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화합물 16
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화합물 18
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화합물 19
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화합물 20
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화합물 21
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화합물 22
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화합물 23
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화합물 24
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화합물 25
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화합물 26
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화합물 27
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화합물 28
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화합물 30
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화합물 31
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화합물 32
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화합물 33
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화합물 34
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화합물 35
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화합물 36
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화합물 37
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화합물 38
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화합물 39
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화합물 40
Figure pat00030
(Id.),
AAL881 (Novartis); AB-024 (Ambit Biosciences), ARQ-736 (ArQule), ARQ-761 (ArQule), AZ628 (Axon Medchem BV), BeiGene-283 (BeiGene), BIIB-024 (MLN 2480) (Sunesis & Takeda), b-raf 억제제 (Sareum), BRAF 키나아제 억제제 (Selexagen Therapeutics), BRAF siRNA 313 (tacaccagcaagctagatgca) 및 523 (cctatcgttagagtcttcctg) [참조: Liu et al., 2007], CTT239065 (Institute of Cancer Research), 다브라페닙 (GSK2118436), DP-4978 (Deciphera Pharmaceuticals), HM-95573 (Hanmi), GDC-0879 (Genentech), GW-5074 (Sigma Aldrich), ISIS 5132 (Novartis), L779450 (Merck), LBT613 (Novartis), LErafAON (NeoPharm, Inc.), LGX-818 (Novartis), 파조파닙 (GlaxoSmithKline), PLX3202 (Plexxikon), PLX4720 (Plexxikon), PLX5568 (Plexxikon), RAF-265 (Novartis), RAF-365 (Novartis), 레고라페닙 (Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Inc.), RO 5126766 (Hoffmann-La Roche), SB 590885 (GlaxoSmithKline), SB699393 (GlaxoSmithKline), 소라페닙 (Onyx Pharmaceuticals), TAK 632 (Takeda), TL-241 (Teligene), 베무라페닙 (RG7204 또는 PLX4032) (Daiichi Sankyo), XL-281 (Exelixis), ZM-336372 (AstraZeneca), 약제학적으로 허용되는 이의 염, 및 이의 조합.
본원에 사용된 "MEK 억제제"는 (i) 예를 들면, MEK에 결합하여 MEK와 직접적으로 상호작용하고, (ii) MEK의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 의미한다. 따라서, RAS 억제제 및 RAF 억제제와 같은 MEK의 업스트림에서 작용하는 억제제는, 본 발명에 따른 MEF 억제제가 아니다. MEK 억제제의 비-제한적 예는 탄저병 독소, 안트로퀴노놀 (Golden Biotechnology), ARRY-142886 (6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산 (2-하이드록시-에톡시)-아미드) (Array BioPharma), ARRY-438162 (Array BioPharma), AS-1940477 (Astellas), AS-703988 (Merck KGaA), 벤타마피모드 (Merck KGaA), BI-847325 (Boehringer Ingelheim), E-6201 (Eisai), GDC-0623 (Hoffmann-La Roche), GDC-0973 (코비메티닙) (Hoffmann-La Roche), L783277 (Merck), 탄저병 독소의 치명적 인자 부분, MEK162 (Array BioPharma), PD 098059 (2-(2'-아미노-3'-메톡시페닐)-옥사나프탈렌-4-온) (Pfizer), PD 184352 (CI-1040) (Pfizer), PD-0325901 (Pfizer), 피마세르팁 (Santhera Pharmaceuticals), RDEA119 (Ardea Biosciences/Bayer), 레파메티닙 (AstraZeneca), RG422 (Chugai Pharmaceutical Co.), RO092210 (Roche), RO4987655 (Hoffmann-La Roche), RO5126766 (Hoffmann-La Roche), 셀루메티닙 (AZD6244) (AstraZeneca), SL327 (Sigma), TAK-733 (Takeda), 트라메티닙 (Japan Tobacco), U0126 (1,4-디아미노-2,3-디시아노-1,4-비스(2-아미노페닐티오)부타디엔) (Sigma), WX-554 (Wilex), YopJ 폴리펩타이드 [참조: Mittal et al., 2010], 약제학적으로 허용되는 이의 염, 및 이의 조합을 포함한다.
이러한 실시형태의 하나의 양상에서, 리보솜 s6 키나아제 (RSK)의 실질적으로 모든 인산화는 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 투여 후 억제된다. RSK 인산화의 정황에서 본원에 사용된, "실질적으로 모두"는 50% 초과의 감소, 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 감소를 의미한다.
이러한 실시형태의 또다른 양상에서, 암은 MAPK 활성을 갖는다. 본원에 사용된 "MAPK 활성"을 갖는다는 것은, ERK의 단백질 업스트림이 활성일 아닐 수 있지만 ERK의 단백질 다운스트림이 여전히 활성임을 의미한다. 이러한 암은 고형 종양 암 또는 혈액 암일 수 있다.
본 발명에서, 암은 고형 암 및 혈액 암 둘 다를 포함한다. 고형 암의 비-제한적 예는 부신피질 암종, 항문 암, 방광 암, 골 암 (예를 들면, 골육종), 뇌 암, 유방 암, 카르시노이드 암, 암종, 자궁경부 암, 결장 암, 자궁내막 암, 식도 암, 간외 담관 암, 암의 유잉 부류(Ewing family of cancers), 두개외 배아 세포 암, 안 암, 담낭 암, 위 암, 배아 세포 종양, 임신 영양막 종양, 두경부암 암, 하인두 암, 섬 세포 암종, 신장 암, 대장 암, 후두 암, 백혈병, 입술 및 구강 암, 간 종양/암, 폐 종양/암, 림프종, 악성 중피종, 메르켈 세포 암종, 균상식육종, 골수형성이상 증후군, 골수증식성 장애, 코인두 암, 신경모세포종, 경구 암, 입인두 암, 골육종, 난소 상피 암, 난소 배아 세포 암, 췌장 암, 부비동 및 비강 암, 부갑상선 암, 음경 암, 뇌하수체 암, 혈장 세포 신생물, 전립선 암, 횡문근육종, 직장 암, 신장 세포 암, 신장 골반 및 요관의 이행 세포 암, 침샘 암, 세자리(Sezary) 증후군, 피부 암(예를 들면, 피부 t-세포 림프종, 카포시 육종, 비만 세포 종양, 및 흑색종), 소장 암, 연조직 육종, 위 암, 고환암, 가슴샘종, 갑상선 암, 요도 암, 자궁 암, 질 암, 외음부 암, 및 윌름스 종양을 포함한다.
혈액 암의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 백혈병, 예를 들면, 성인/소아 급성 림프모구 백혈병, 성인/소아 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 털 세포 백혈병, 림프종, 예를 들면, AIDS-관련 림프종, 피부 T-세포 림프종, 성인/소아 호지킨 림프종, 균상식육종, 성인/소아 비-호지킨 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 세자리 증후군, 피부 T-세포 림프종, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 뿐만 아니라 다른 증식성 장애, 예를 들면, 만성 골수증식성 장애, 랑게르한스 세포 조직구증, 다발성 골수종/혈장 세포 신생물, 골수형성이상 증후군, 및 골수형성이상/골수증식성 신생물을 포함한다.
바람직하게는, 암은 대장 암, 유방 암, 췌장 암, 피부 암, 및 자궁내막 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 암은 흑색종이다.
이러한 실시형태의 또다른 양상에서, 상기 방법은 추가로 대상체에게 암의 작용을 치료 또는 개선하기에 효과적인 적어도 하나의 추가 치료학적 제제 투여함을 포함한다. 추가 치료학적 제제는 항체 또는 이의 단편, 세포독성 제제, 독소, 방사성핵종, 면역조절제, 광활성 치료학적 제제, 방사선민감성 제제, 호르몬, 항-혈관 신생 제제, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 "항체"는 천연 발생 면역글로불린 뿐만 아니라 비-천연 발생 면역글로불린을 포함하고, 예를 들면, 단일 쇄 항체, 키메라 항체 (예를 들면, 사람화 뮤린 항체), 및 이종접합(heteroconjugate) 항체 (예를 들면, 이중특이성 항체)를 포함한다. 항체의 단편은 항원에 결합하는 것들, (예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, 및 rIgG)을 포함한다. 또한 예를 들면, 문헌을 참조한다[참조: Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York (1998)]. 용어 항체는 또한 이가 또는 이중특이성 분자, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 및 테트라바디(tetrabodies)를 포함한다. 용어 "항체"는 추가로 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘 다를 포함한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 치료학적 항체의 예는 리툭시맙 (Rituxan), 세툭시맙 (Erbitux), 베바시주맙 (Avastin), 및 이브리투모맙 (Zevalin)을 포함한다.
본 발명에 따른 세포독성 제제는 DNA 손상제, 항대사물질, 항-미세관 제제, 항생제 등을 포함한다. DNA 손상제는 알킬화 제제, 백금-기반 제제, 중격 제제(intercalating agents), 및 DNA 복제의 억제제를 포함한다. DNA 알킬화 제제의 비-제한적 예는 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 우라무스틴, 멜팔란, 클로람부실, 이포스파미드, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 부설판, 테모졸로마이드, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 프로드럭, 및 이의 조합을 포함한다. 백금-기반 제제의 비-제한적 예는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 사트라플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 프로드럭, 및 이의 조합을 포함한다. 중격 제제의 비-제한적 예는 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 프로드럭, 및 이의 조합을 포함한다. DNA 복제 억제제의 비-제한적 예는 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 프로드럭, 및 이의 조합을 포함한다. 항대사물질은 폴레이트 길항제, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 프레메트렉세드, 퓨린 길항제, 예를 들면, 6-머캅토퓨린, 다카르바진, 및 플루다라빈, 및 피리미딘 길항제, 예를 들면, 5-플루오로우라실, 아라비노실시토신, 카페시타빈, 겜시타빈, 데시타빈, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 프로드럭, 및 이의 조합을 포함한다. 항-미세관 제제는 제한없이 빈카 알칼로이드, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere®), 및 익사베필론 (Ixempra®)을 포함한다. 항생제는 제한없이 악티노마이신, 안트라사이클린, 발루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 플리카마이신, 미토마이신, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 프로드럭, 및 이의 조합을 포함한다.
본 발명에 따른 세포독성 제제는 또한 PI3K/Akt 경로의 억제제를 포함한다. PI3K/Akt 경로의 억제제의 비-제한적 예는 A-674563 (CAS # 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks, CA), AS-041164 (5-벤조[1,3]디옥솔-5-일메틸렌-티아졸리딘-2,4-디온), AS-604850 (5-(2,2-디플루오로-벤조[1,3]디옥솔-5-일메틸렌)-티아졸리딘-2,4-디온), AS-605240 (5-퀴녹실린-6-메틸렌-1,3-티아졸리딘-2,4-디온), AT7867 (CAS # 857531-00-1), 벤즈이미다졸 시리즈, 게네테크(Genentech) (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (CAS # 32387-96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), CAL-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), CAS # 612847-09-3, CAS # 681281-88-9, CAS # 75747-14-7, CAS # 925681-41-0, CAS # 98510-80-6, CCT128930 (CAS # 885499-61-6), CH5132799 (CAS # 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, UK), FPA 124 (CAS # 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (CAS # 937174-76-0), H-89 (CAS # 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, UK), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), KT 5720 (CAS # 108068-98-0), 밀테포신(Miltefosine), MK-2206 디하이드로클로라이드 (CAS # 1032350-13-2), ML-9 (CAS # 105637-50-1), 날트린돌 하이드로클로라이드, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), 페리포신, PHT-427 (CAS # 1191951-57-1), PI3 키나아제 델타 억제제, Merck KGaA (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ), PI3 키나아제 델타 억제제, 게네테크 (Roche Holdings Inc.), PI3 키나아제 델타 억제제, 인코젠(Incozen) (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), PI3 키나아제 델타 억제제-2, 인코젠 (Incozen Therapeutics), PI3 키나아제 억제제, 로쉐(Roche)-4 (Roche Holdings Inc.), PI3 키나아제 억제제, 로쉐(Roche) (Roche Holdings Inc.), PI3 키나아제 억제제, 로쉐-5 (Roche Holdings Inc.), PI3-알파/델타 억제제, 패스웨이 테라퓨틱스(Pathway Therapeutics) (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), PI3-델타 억제제, 셀좀 (Cellzome) (Cellzome AG, Heidelberg, Germany), PI3-델타 억제제, 인텔리킨(Intellikine) (Intellikine Inc., La Jolla, CA), PI3-델타 억제제, 패스웨이 테라퓨틱스-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), PI3-델타 억제제, 패스웨이 테라퓨틱스-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), PI3-델타/감마 억제제, 셀좀 (Cellzome AG), PI3-델타/감마 억제제, 셀좀 (Cellzome AG), PI3-델타/감마 억제제, 인텔리킨 (Intellikine Inc.), PI3-델타/감마 억제제, 인텔리킨 (Intellikine Inc.), PI3-델타/감마 억제제, 패스웨이 테라퓨틱스 (Pathway Therapeutics Ltd.), PI3-델타/감마 억제제, 패스웨이 테라퓨틱스 (Pathway Therapeutics Ltd.), PI3-감마 억제제 에보테크 (Evotec), PI3-감마 억제제, 셀좀 (Cellzome AG), PI3-감마 억제제, 패스웨이 테라퓨틱스 (Pathway Therapeutics Ltd.), PI3K 델타/감마 억제제, 인텔리킨-1 (Intellikine Inc.), PI3K 델타/감마 억제제, 인텔리킨-1 (Intellikine Inc.), 픽틸리시브 (Roche Holdings Inc.), PIK-90 (CAS # 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, New York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianapolis, IN), SH-5, SH-6, 테트라하이드로 쿠르쿠민, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), 트리시리빈, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburg, Germany), 약제학적으로 허용되는 이의 염, 및 이의 조합을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "독소"는 식물 또는 동물 기원의 항원 독(poison) 또는 독(venom)을 의미한다. 예는 디프테리아 독소 또는 이의 단편이다.
본 발명에서, 용어 "방사성핵종"은 환자에게, 예를 들면, 정맥내 또는 경구 투여된 후, 환자의 정상 대사를 통해 표적 기관 또는 조직 내로 침투되고 국소 방사선을 단시간 동안 전달하는 방사성활성 물질을 의미한다. 방사성핵종의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, I-125, At-211, Lu-177, Cu-67, I-131, Sm-153, Re-186, P-32, Re-188, In-114m, 및 Y 90을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "면역조절제"는 이의 생성을 개시한 항원을 인지하고 반응하여 항체 또는 민감화된 세포를 생성하는 면역계의 능력을 증강 또는 감소시켜 면역 반응을 변경시키는 물질을 의미한다. 면역조절제는 재조합, 합성, 또는 천연 제제일 수 있고, 시토킨, 코르티코스테로이드, 세포독성 제제, 티모신, 및 면역글로불린을 포함한다. 일부 면역조절제는 신체에 천연으로 존재하고, 이들 중 일부는 약리학적 제제로 이용가능하다. 면역조절제의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 인터페론, 이미퀴모드 및 박테리아의 세포 막 부분, IL-2, IL-7, IL-12, CCL3, CCL26, CXCL7, 및 합성 시토신 포스페이트-구아노신 (CpG)을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "광활성 치료학적 제제"는 광(light)에 노출시 활성이 되는 화합물 및 조성물을 의미한다. 광활성 치료학적 제제의 특정 예는, 예를 들면, 미국 특허 출원 연속 제2011/0152230 A1호에, "Photoactive Metal Nitrosyls For Blood Pressure Regulation And Cancer Therapy" 표제로 개지되어 있다.
본 발명에서, 용어 "방사선민감성 제제"는 방사선 치료법에 대해 종양 세포를 더 민감성으로 만드는 화합물을 의미한다. 방사선민감성 제제의 예는 미소니다졸, 메트로니다졸, 티라파자민, 및 트랜스 나트륨 크로세티네이트를 포함한다.
본 발명에서, 용어 "호르몬"은 또다른 신체 부분에 영향을 미치는 신체 일부에서 세포에 의해 방출된 물질을 의미한다. 호르몬의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 프로스타사이클린, 트롬복산, 아밀린, 안티물레리안(antimullerian) 호르몬, 아디포넥틴, 부신피질자극 호르몬, 안지오텐시노겐, 안지오텐신, 바소프레신, 아트리오펩틴, 뇌 나트륨이뇨 펩타이드, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 엔세팔린, 엔도텔린, 에리트로포이에틴, 여포-자극 호르몬, 갈라닌, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 고나도트로핀-방출 호르몬, 성장 호르몬-방출 호르몬, 사람 융모막 고나도트로핀, 사람 태반 락토겐, 성장 호르몬, 인히빈, 인슐린, 소마토메딘, 렙틴, 립트로핀, 황체형성 호르몬, 멜라닌세포 자극 호르몬, 모틸린, 오렉신, 옥시토신, 췌장 폴리펩타이드, 부갑상선 호르몬, 프롤락틴, 프롤락틴 방출 호르몬, 렐락신, 레닌, 세크레틴, 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선-자극 호르몬, 테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 안드로스테네디온, 디하이드로테스토스테론, 알도스테론, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 코르티솔, 프로게스테론, 칼시트리올, 및 칼시디올을 포함한다.
일부 화합물은 특정 호르몬의 활성을 간섭하거나, 특정 호르몬의 생성을 정지시킨다. 이들 호르몬-간섭 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 타목시펜 (Nolvadex®), 아나스트로졸 (Arimidex®), 레트로졸 (Femara®), 및 풀베스트란트 (Faslodex®)를 포함한다. 이러한 화합물은 또한 본 발명의 호르몬의 의미 내에 있다.
본원에 사용된 "항-혈관 신생" 제제는 신규 혈관의 성장을 감소 또는 억제하는 물질을 의미하고, 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제제 및 내피 세포 이주의 억제제이다. 항-혈관 신생 제제는 제한없이 2-메톡시에스트라디올, 안지오스타틴, 베바시주맙, 연골-유도 혈관 신생 억제 인자, 엔도스타틴, IFN-α, IL-12, 이트라코나졸, 리노미드, 혈소판 인자-4, 프롤락틴, SU5416, 수라민, 타스퀴니모드, 테코갈란, 테트라티오몰리브데이트, 탈리도미드, 트롬보스폰딘, 트롬보스폰딘, TNP-470, ziv-아플리베르셉트, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 프로드럭, 및 이의 조합을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시형태는 대상체에서 암의 작용의 치료 또는 개선 방법이다. 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) BRAF 억제제 치료법, MEK 억제제 치료법, 또는 BRAF 및 MEK 억제제 치료법에 대해 저항성이거나 내성이 된 암을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
(b) 상기 저항성 또는 내성 암을 갖는 대상체에게 BVD-523인 ERK 억제제 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 유효량을 투여하는 단계.
적합하고 바람직한 대상체는 본원에 개시된 바와 같다. 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 상기 개시된 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서, 암은 MAPK 활성을 가질 수 있다.
이러한 실시형태의 하나의 양상에서, BRAF 및/또는 MEK 억제제 치료법에 대해 저항성이거나 내성인 암을 갖는 대상체를 확인하는 단계는 다음을 포함한다:
(a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 입수하고;
(b) 대상체가 BRAF 억제제 치료법, MEK 억제제 치료법, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 억제제 치료법에 내성이 되었는지 결정하기 위해 샘플을 스크리닝한다.
본 발명에서, 생물학적 샘플은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 혈액, 혈장, 소변, 피부, 타액, 및 생검을 포함한다. 생물학적 샘플은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 일상적 절차 및 방법에 의해 대상체로부터 입수한다.
바람직하게는, BRAF 억제제 치료법에 대해 저항성이거나 내성인 암을 스크리닝하는 것은, 예를 들면, (i) RAF 이소형 간의 전환, (ii) RTK 또는 NRAS 신호전달의 상향조절, (iii) 미토겐 활성화된 단백질 키나아제 (MAPK) 신호전달의 재활성화, (iv) MEK 활성화 돌연변이의 존재, 및 이의 조합을 확인하는 것을 포함할 수 있다.
RAF 이소형 간의 전환은 BRAF 억제제 치료법에 획득된 내성을 갖는 대상체에서 일어날 수 있다. 이러한 전환을 검출하기 위해, BRAF 억제제-내성 종양 세포는 환자로부터 회수(retrieve)될 수 있고, 웨스턴 블롯팅을 통해 BRAF 억제제의 존재하에 ERK 및 포스포-ERK 수준에 대해 분석할 수 있다. BRAF 억제제로 치료된 BRAF 억제제-민감성 세포와의 비교는 BRAF 억제제-내성 종양 세포에서 더 높은 수준의 포스포-ERK를 나타낼 수 있고, 이는 RAF 이소형이 BRAF 대신에 ERK를 인산화시키는 전환이 일어남을 암시한다. RAF 이소형이 대체되었는지 확인은 BRAF 억제제에 노출된 BRAF 억제제-내성 세포에서 개별적으로 ARAF 및 CRAF의 sh/siRNA-매개된 녹다운(knockdown), 이어서, 후속적인 ERK 및 포스포-ERK 수준을 위한 웨스턴 블롯팅을 포함할 수 있다. 예를 들면, BRAF 억제제에 노출된 BRAF 억제제-내성 세포에서 ARAF 녹다운이 높은 수준의 포스포-ERK를 여전히 야기하는 경우, CRAF가 인산화 ERK를 대체하였음을 나타낸다. 마찬가지로, CRAF가 BRAF 억제제에 노출된 BRAF 억제제-내성 세포에서 녹다운되고, ERK가 여전히 고도로 인산화된 경우, ARAF가 ERK 인산화를 대체함을 의미한다. RAF 이소형 전환은 또한 BRAF 억제제의 존재하에 BRAF 억제제-내성 세포에서 동시에 일어나는 ARAF 및 CRAF의 녹다운을 포함할 수 있고, 효과적으로 모든 RAF-매개된 인산화를 차단한다. 결과적인 ERK 인산화의 감소는, BRAF 억제제-내성 세포가 ERK를 인산화시키기 위한 RAF 이소형 간의 전환 능력을 갖는다는 것을 나타낸다 [참조: Villanueva, et al., 2010].
RTK 또는 NRAS 신호전달의 상향조절은 또한 BRAF 억제제 내성의 원인일 수 있다. 검출은, 예를 들면, 먼저 다운스트림 RAF 이펙터 MEK1/2 및 ERK1/2의 활성화를 분석하기 위해 포스포-특이적 항체로 웨스턴 블롯팅 프로토콜을 사용함을 포함할 수 있다. BRAF 억제제-내성 세포가 BRAF 억제제의 존재하에 이들 단백질의 높은 활성화 수준을 나타내는 경우, RTK 또는 NRAS 상향조절이 원인일 수 있다. BRAF 억제제의 존재하에 BRAF 억제제-내성 세포의 유전자 발현 프로파일링 (또는 다른 관련 방법)은 BRAF 억제제-민감성 세포와 비교하여 더 높은 발현 수준의 KIT, MET, EGFR, 및 PDGFRβ RTKs를 나타낼 수 있다. 실시간 정량적 폴리머라제 쇄 반응 실험, 또는 이들 유전자 중 어느 것에 초점을 맞추는 다른 유사한 절차는, 더 높은 발현 수준을 확인할 수 있고, 동시에 포스포-RTK 어레이 (R&D Systems, Minneapolis, MN)는 상승된 활성화-관련 티로신 인산화를 나타낼 수 있다. 대안적으로, NRAS 활성화는 다양한 유전자 서열분석 프로토콜에 의해 검출할 수 있다. NRAS 중 활성화 돌연변이, 특히 Q61K는, B-RAF 신호전달이 바이패스(bypass)되었음을 나타낼 수 있다. 흑색종 세포에서, 활성화된 NRAS는 C-RAF를 사용하여 MEK-ERK로 신호화한다. 따라서, 활성화된 NRAS는 BRAF 억제제에 노출된 BRAF 억제제-내성 세포에서 유사한 바이패스 경로를 가능하게 한다. 제공된 BRAF 억제제-내성 샘플에서 이들 기전의 추가 확인이, 예를 들면, BRAF 억제제의 존재하에 상향조절된 RTKs 또는 활성화된 NRAS의 sh/siRNA-매개된 녹다운을 사용하여 수행될 수 있다. 성장 억제의 임의의 유의한 수준은 RTK 또는 NRAS 신호전달의 상향조절이 이러한 특정 샘플에서 BRAF 억제의 원인임을 나타낼 수 있다[참조: Nazarian, et al., 2010].
BRAF 억제제-내성 세포에서 MAPK 신호전달의 재활성화 검출은 BRAF 억제제 내성에 대한 또다른 바이패스 기전을 나타낼 수 있다. COT 및 C-RAF는 BRAF 억제제에 노출된 BRAF V600E 배경에서 상향조절됨을 나타내었다. 정량적 실시간 RT-PCR은, 예를 들면, BRAF 억제제의 존재하에 BRAF 억제제-내성 세포에서 증가된 COT 발현을 나타낼 수 있다. 추가로, BRAF 억제제의 존재하에 BRAF 억제제-내성 세포에서 COT의 sh/siRNA-매개된 녹다운은 BRAF 억제제-내성 세포의 생존력을 감소시킬 수 있고, 이는 이들 특정 세포가 COT 억제 및/또는 병용 BRAF 억제제/MEK 억제제 치료에 대해 민감성일 수 있음을 나타낸다 [참조: Johannessen, et al., 2010].
MAPK 신호전달의 재활성화는 또한 MEK1에서 돌연변이를 활성화시킴에 의해 BRAF 억제제-내성 배경에서 수행될 수 있다. BRAF 억제제-내성 종양으로부터 표적화된, 유전체 DNA의 대량 병렬 서열분석은 MEK1, 예를 들면, 다른 것들 중에서 C121S, G128D, N122D, 및 Y130에서 돌연변이 활성화를 나타낼 수 있다. MEK1에서 다른, 문서화되지 않은 돌연변이는 예를 들면, A375와 같은 BRAF 억제제-민감성 세포주에서 특정 돌연변이 발현에 의해 분석될 수 있다. BRAF 억제제에 노출시 이들 세포에서 성장 억제 수준의 측정은, MEK1 돌연변이가 BRAF 억제 치료법에 대해 내성을 야기하는 경우 나타날 수 있다. 이러한 발견을 확인하기 위해, MEK1 돌연변이를 이소성 발현하는 세포에서 상승된 수준의 포스포-ERK1/2를 위한 웨스턴 블롯팅은 MEK1 돌연변이가, BRAF 억제제-내성 종양이 BRAF를 바이패스하고 MEK1을 통한 ERK의 인산화를 촉진할 수 있게 함을 나타낼 수 있다[참조: Wagle, et al., 2011].
본 발명에 따라서, MEK 억제제 치료법에 대해 저항성이거나 내성인 암의 스크리닝은, 예를 들면, (i) 돌연변이 BRAF의 증폭, (ii) STAT3 상향조절, (iii) 억제제의 MEK로의 결합을 직접적으로 차단시키거나 구성적 MEK 활성을 야기하는 MEK의 알로스테리 포켓에서 돌연변이, 및 이의 조합을 확인함을 포함할 수 있다.
돌연변이 BRAF의 증폭은 MEK 억제제 내성을 야기할 수 있다. MEK 억제제 내성은 전형적으로 MEK 억제제의 존재하에 높은 수준의 인산화된 ERK 및 MEK에 관련되고, 이는 예를 들면, 웨스턴 블롯팅으로 검정될 수 있다. MEK 억제제-내성 세포주에서 돌연변이 BRAF의 증폭은, 예를 들면, 형광성 동일계내 하이브리드화 (FISH) 또는 내성 세포주의 유전체 DNA로부터 정량적 PCR에 의해 검출될 수 있다. BRAF 증폭이 MEK 억제제 내성의 1차 원인인지의 확인은 내성 세포에서 BRAF-표적화된 sh/siRNAs를 사용하여 수반될 수 있다. MEK 또는 ERK 인산화에서 유의한 감소가 관찰되는 경우, BRAF 증폭은 추가 치료학적 접근을 위한 적합한 표적일 수 있다. [참조: Corcoran, et al., 2010].
STAT3 상향조절을 확인하는 것은 특정 종양 샘플이 MEK 억제제 치료법에 저항성임을 나타낼 수 있다. 전장-유전체(Genome-wide) 발현 프로파일링은 STAT3 경로가 종양에서 상향조절됨을 나타낼 수 있다. 다른 기술, 예를 들면, 포스포-STAT3을 위한 웨스턴 블롯팅 및 STAT 경로-관련 유전자 JAK1 및 IL6ST를 위한 실시간 qPCR은 상향조절된 STAT3을 나타낼 수 있다. STAT3 상향조절이 특정 샘플에서 MEK 억제제 내성을 야기하는지의 추가 확인은 샘플에서 STAT3에 대한 sh/siRNAs의 사용, 이어서, MEK 및 ERK 활성화 뿐만 아니라 포스포-STAT3 및 전체 STAT3을 위한 적합한 웨스턴 블롯팅을 포함할 수 있다. 성장 억제 연구는 STAT3 녹다운이 MEK 억제에 대해 이전 MEK 억제제-내성 세포를 민감화시킴을 나타낼 수 있다. 유사한 결과는 샘플이 JSI-124와 같은 STAT3 억제제에 노출되는 경우 나타날 수 있다. STAT3 상향조절이 특정 종양에서 MEK 억제제 내성의 원인인지의 추가 확인은 BIM-EL, BIM-L, 및 BIM-SL을 포함하는 BIM 발현을 위한 웨스턴 블롯팅으로부터 일어날 수 있다. BIM 발현은 MEK 억제제-유도 아폽토시스를 야기하고, 이에 따라, STAT3 상향조절은 BIM 수준을 낮출 수 있다. STAT3은 miR 17-92의 발현을 조절하는 것으로 공지되어 있고, 이는 BIM 발현을 억압한다. 상향조절된 STAT3은 더 높은 수준의 miR 17-92을 야기할 수 있고, 이는 BIM 수준을 낮출 것이고, MEK 억제에 대한 저항을 촉진할 것이다. 따라서, miR 17-92 수준의 실시간 qPCR은 또한 STAT3 상향조절이 특정 샘플에서 MEK 억제 저항을 야기하는지의 검정을 지원할 수 있다. [참조: Dai, et al., 2011].
억제제의 MEK로의 결합을 직접적으로 차단할 수 있고 구성적 MEK 활성을 야기할 수 있는 MEK의 알로스테리 포켓에서 돌연변이는 하기 개시된 방법에 의해 검출할 수 있다. 이러한 돌연변이는 에머리(Emery) 및 동료들[참조: Emery, et al., 2009] 뿐만 아니라 왕(Wang) 및 동료들[참조: Wang et al., 2011]에 의해 이전에 확인되었다. 다른 돌연변이는 N-말단 네가티브 조절 나선, 예를 들면, P124L 및 Q56P. (Id.)에 내부에 또는 맞닿게 위치한 MEK1 코돈에 영향을 줄 수 있다.
핵산, 예를 들면, 상기 확인된 MEK 유전자에서 돌연변이를 확인하는 방법은, 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 핵산은 생물학적 샘플로부터 입수할 수 있다.본 발명에서, 생물학적 샘플은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 혈액, 혈장, 소변, 피부, 타액, 및 생검을 포함한다. 생물학적 샘플은 당해 기술 분야에 공지된 일상적 절차 및 방법에 의해 대상체로부터 입수된다.
돌연변이를 확인하는 방법의 비-제한적 예는 PCR, 서열분석, 하이브리드 포획, 용액-내 포획, 분자 역전 프로브, 형광성 동일계내 하이브리드화 (FISH) 검정, 및 이의 조합을 포함한다.
다양한 서열분석 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, Sanger 서열분석 (또한 디데옥시 서열분석으로 언급됨) 및, 예를 들면, 문헌[참조: Metzker 2005]에 개시된 다양한 합성에 의한 서열분석(SBS) 방법, 하이브리드화, 결찰(예를 들면, WO 2005021786), 분해(예를 들면, 미국 특허 제5,622,824호 및 제6,140,053호)에 의한 서열분석 및 나노포어 서열분석 (제조원: Oxford Nanopore Technologies, UK)을 포함한다. 심층 서열분석 기술에서, 서열에서 제공된 뉴클레이타이드는 서열분석 프로세스 동안 1회 초과로 판독된다. 심층 서열분석 기술은 예를 들면, 미국 특허 공보 제20120264632호 및 국제 특허 공보 제WO2012125848호에 개시된다.
돌연변이 검출을 위한 PCR-기반 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, PCR 증폭을 이용하고, 여기서, 샘플에서 각각의 표적 서열은 상응하는 쌍의 독특한, 서열-특이적 프라이머를 갖는다. 예를 들면, 폴리머라제 쇄 반응-제한 단편 길이 다형성 (PCR-RFLP) 방법은 유전체 서열이 PCR에 의해 증폭된 후 돌연변이의 신속한 검출을 가능하게 한다. 돌연변이는 특이적 제한 엔도뉴클레아제로의 소화에 의해 구별되고, 전기 영동에 의해 확인된다. 예를 들면, 문헌을 참조한다[참조: Ota et al., 2007]. 돌연변이는 또한 실시간 PCR을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 국제 출원 공보 제WO2012046981호를 참조한다.
하이브리드 포획 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 공보 제20130203632호 및 미국 특허 제8,389,219호 및 제8,288,520호에 개시된다. 이들 방법은 사용자-설계된 올리고뉴클레오타이드로의 표적 유전체 영역의 선택적 하이브리드화를 기초로 한다. 하이브리드화는 높은 또는 낮은 밀도 미세어레이 상 부동화된 올리고뉴클레오타이드 (온-에레이 포획)에 대한 것일 수 있거나, 리간드 (예를 들면, 비오틴)로 개질된 올리고뉴클레오타이드에 대한 용액-상 하이브리드화일 수 있고, 이는 후속적으로 고체 표면, 예를 들면, 비드에 부동화될 수 있다 (용액-내 포획).
분자 역전 프로브 (MIP) 기술은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Absalan et al., 2008]에 개시되어 있다. 이 방법은 MIP 분자를 사용하고, 이는 유전자형에 대한 특정한 "자물쇠" 프로브이다[참조: Nilsson et al, 1994]. MIP 분자는, 특이적 영역, 범용 서열, 제한 위치 및 Tag (index) 서열 (16-22 bp)을 포함하는 선형 올리고뉴클레오타이드이다. MIP는 관심 대상 유전적 마커/SNP 주위에 직접적으로 하이브리드화한다. MIP 방법은 또한, 유전체 DNA에 대해 병행하여(in parallel) 하이브리드화되는 다수의 "자물쇠" 프로브 세트를 사용할 수 있다 [참조: Hardenbol et al., 2003]. 완벽한 일치의 경우, 유전체 상동성 영역은 배치에서 역전을 겪고(기술의 이름으로 제안된 바와 같이) 원형 분자를 만들어서 결찰된다. 첫번째 제한 후, 모든 분자는 범용 프라이머로 증폭된다. 앰플리콘은 미세어레이 상에서 하이브리드화를 위한 짧은 단편을 보장하기 위해 다시 제한된다. 생성된 짧은 단편은 표지화되고, Tag 서열을 통해, 어레이 상에서 cTag (인덱스를 위한 상보적 스트랜드)로 하이브리드화된다. Tag-cTag 듀플렉스 형성 후, 신호가 검출된다.
하기 표 1, 2, 및 3은 서열 목록에서 다양한 동물로부터의 야생형 BRAF, N-RAS, 및 MEK1의 대표적인 핵산 및 아미노 산 서열의 서열 번호를 나타낸다. 이들 서열은 돌연변이 BRAF, N-RAS, 및 MEK1 유전자형을 갖는 대상체를 확인하기 위한 방법에서 사용될 수 있다.
표 1 - BRAF 서열
Figure pat00031
Figure pat00032
표 2 - N-RAS 서열
Figure pat00033
표 3 - MEK1 서열
Figure pat00034
이러한 실시형태의 또다른 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 하나의 추가 치료학적 제제, 바람직하게는 PI3K/Akt 경로의 억제제를, 본원에 개시된 바와 같이, 투여함을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시형태는, 암이 BRAF 억제제 치료법, MEK 억제제 치료법, 또는 둘 다에 대해 저항성이거나 내성인 대상체에서 암의 작용의 치료 또는 개선 방법이다. 상기 방법은 대상체에게 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 유효량을 투여함을 포함한다.
적합하고 바람직한 대상체는 본원에 개시된 바와 같다. 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 돌연변이 배경, 내성 프로파일, 및 상기 확인된 MAPK 활성을 갖는 암을 포함하는 상기 포함하는 개시된 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 돌연변이의 확인 방법은 또한 상기 열거된 바와 같다.
이러한 실시형태의 추가의 양상에서, 상기 방법은 추가로 대상체에게 적어도 하나의 추가 치료학적 제제, 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 PI3K/Akt 경로의 억제제를 투여함을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시형태는 ERK 억제제를 사용한 치료법으로 이득을 볼 수 있는 암을 갖는 대상체의 확인 방법이다. 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 입수하고;
(b) 대상체가 하기 마커 중 하나 이상을 갖는지를 결정하기 위해 샘플을 스크리닝하고:
(i) RAF 이소형 간의 전환,
(ii) RTK 또는 NRAS 신호전달의 상향조절,
(iii) 미토겐 활성화된 단백질 키나아제 (MAPK) 신호전달의 재활성화,
(iv) MEK 활성화 돌연변이의 존재,
(v) 돌연변이 BRAF의 증폭,
(vi) STAT3 상향조절,
(vii) 억제제의 MEK로의 결합을 직접적으로 차단하거나 구성적 MEK 활성을 야기하는 MEK의 알로스테리 포켓에서 돌연변이,
여기서, 마커 중 하나 이상의 존재는 대상체의 암이 BRAF 및/또는 MEK 억제제 치료법에 대해 저항성 또는 내성이고 대상체가 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염인 ERK 억제제를 사용하는 치료법으로부터 이득을 얻을 수 있음을 확실하게 한다.
적합하고 바람직한 대상체는 본원에 개시된 바와 같다. 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 돌연변이 배경, 내성 프로파일, 및 상기 확인된 MAPK 활성을 갖는 암을 포함하는 상기 개시된 암을 갖는 대상체를 확인하는데 사용할 수 있다. 이러한 돌연변이의 확인 방법은 또한 상기 열거된 바와 같다.
이러한 실시형태의 하나의 양상에서, 상기 방법은 추가로 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 상기 마커 중 하나 이상을 갖는 대상체에게 투여함을 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 추가로 마커 중 하나 이상을 갖는 대상체에게 적어도 하나의 추가 치료학적 제제, 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 PI3K/Akt 경로의 억제제를 투여함을 포함한다.
본 발명의 추가 실시형태는 암이 비-ERK MAPK 경로 치료법에 대해 저항성이거나 내성인 대상체에서 암의 작용을 치료 또는 개선하기 위한 약제학적 조성물이다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 및 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 유효량을 포함한다.
적합하고 바람직한 대상체 및 비-ERK MAPK 경로 억제제 치료법의 유형은 본원에 개시된 바와 같다. 이러한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 돌연변이 배경, 내성 프로파일, 및 상기 확인된 MAPK 활성을 갖는 암을 포함하는 상기 개시된 암의 치료를 위해 사용될 수 있다. 이러한 돌연변이의 확인 방법은 또한 상기 열거된 바와 같다.
이러한 실시형태의 하나의 양상에서, 약제학적 조성물은 추가로 적어도 하나의 추가 치료학적 제제, 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 PI3K/Akt 경로의 억제제를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시형태는 대상체에서 비-ERK MAPK 경로 치료법에 대해 저항성 또는 내성인 암의 작용을 치료 또는 개선을 위한 키트이다. 이들 키트는 이의 사용을 위한 지침서와 함께 패키징된 본 발명에 따른 임의의 약제학적 조성물을 포함한다.
키트는 또한 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는데 사용하기 위한 각각의 약제학적 조성물 및 다른 시약, 예를 들면, 완충제, 밸런싱된 염 용액 등을 위해 적합한 저장 컨테이너, 예를 들면, 앰풀, 바이알, 관 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 및 다른 시약은 용액 또는 분말 형태와 같은 임의의 용이한 형태로키트에 존재할 수 있다. 키트는 추가로 약제학적 조성물 및 다른 임의의 시약을 하우징하기 위한 하나 이상의 칸막이를 임의로 갖는 패키징 컨테이너를 포함할 수 있다.
적합하고 바람직한 대상체 및 비-ERK MAPK 경로 억제제 치료법의 유형은 본원에 개시된 바와 같다. 이러한 실시형태에서, 키트는 돌연변이 배경, 내성 프로파일, 및 본원에서 확인된 MAPK 활성을 갖는 이들 암을 포함하는 상기 개시된 암을 치료하는데 사용할 수 있다. 이러한 돌연변이의 확인 방법은 상기 열거된 바와 같다.
이러한 실시형태의 하나의 양상에서, 키트는 추가로 적어도 하나의 추가 치료학적 제제, 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 PI3K/Akt 경로의 억제제를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시형태는 비-ERK MAPK 경로 억제제에 대해 저항성이거나 내성인 암 세포에서 RSK의 인산화의 억제 방법이다. 상기 방법은 억제될 암 세포에서 암 세포를 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 유효량과 RSK의 인산화를 위해 충분한 기간 동안 접촉시킴을 포함한다. 이러한 실시형태에서, "접촉"은 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 임의의 하나 이상의 추가 치료학적 제제를 암 세포에 근접시킴을 의미한다. 이는 포유동물로의 약물 전달의 종래의 기술을 사용하여, 또는 시험관내 상황에서, 예를 들면, BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 임의의 다른 치료학적 제제를 암 세포가 위치하는 배양 배지에 제공하여 수행할 수 있다. 생체외 상황에서, 접촉은, 예를 들면, BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 임의의 다른 치료학적 제제를 암성 조직에 제공하여 수행할 수 있다.
비-ERK MAPK 경로 억제제의 적합하고 바람직한 유형은 본원에 개시된 바와 같다. 이러한 실시형태에서, 암 세포 사멸의 수행은 다양한 돌연변이 배경, 내성 프로파일, 및 상기 개시된 MAPK 활성을 갖는 암 세포에서 수행할 수 있다. 이러한 돌연변이의 확인 방법은 또한 상기 열거된 바와 같다.
시험관내, 생체외, 또는 생체내 수행될 수 있는 이러한 실시형태의 방법을, 예를 들면, 본원에 기재된 암 유형의 세포에서 암 세포를 사멸시켜 암 세포 사멸을 수행하는데 사용될 수 있다.
이러한 실시형태의 하나의 양상에서, 50% 초과의 RSK 인산화가 억제된다. 이러한 실시형태의 또다른 양상에서, 75% 초과의 RSK 인산화가 억제된다. 이러한 실시형태의 추가 양상에서, 90% 초과의 RSK 인산화가 억제된다. 이러한 실시형태의 추가의 양상에서, 95% 초과의 RSK 인산화가 억제된다. 이러한 실시형태의 또다른 양상에서, 99% 초과의 RSK 인산화가 억제된다. 이러한 실시형태의 추가 양상에서, 100%의 RSK 인산화가 억제된다.
이러한 실시형태의 추가의 양상에서, 암 세포는 포유동물 암 세포이다. 바람직하게는, 포유동물 암 세포는 사람, 영장류, 농장 동물, 및 가축 동물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물로부터 입수된다. 보다 바람직하게는, 포유동물 암 세포는 사람 암 세포이다.
이러한 실시형태의 추가의 양상에서, 접촉 단계는 BVD-523 또는 약제학적으로 허용되는 염을 암 세포가 입수된 대상체에게 투여함을 포함한다.
본 발명에서, 본원에 개시된 화합물 또는 조성물의 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 대상체에게 투여되는 경우 유익하거나 목적하는 결과를 가져오는데 충분한 이러한 화합물 또는 조성물의 양이다. 효과적인 용량 형태(dosage forms), 투여 방식, 및 용량의 양은 경험적으로 결정할 수 있고, 이러한 결정은 당해 기술분야의 숙련가의 재량 내이다. 용량의 양은 투여 경로, 배설 속도, 치료 기간, 투여된 임의의 다른 약물의 확인, 연령, 사이즈, 및 포유동물의 종, 예를 들면, 사람 환자 등 의학 및 수의학 기술 분야에 잘 공지된 인자에 따라 가변적인 것은 당해 기술 분야의 숙련가가 이해할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물의 적합한 투약(dose)은 목적하는 효과를 제공하는데 효과적인 최저 투약인 조성물의 양일 것이다. 본 발명의 화합물 또는 조성물의 효과적인 투약은 2, 3, 4, 5, 6 이상의 서브-투약으로 투여될 수 있고, 하루 동안 적합한 간격으로 개별적으로 투여될 수 있다.
본원에 개시된 BVD-523 및 다른 항-암 제제의 용량의 적합한, 비-제한적 예는 1일 약 1 mg/kg 내지 약 2400 mg/kg, 예를 들면, 1일 약 1 mg/kg 내지 약 1200 mg/kg, 1일 75 mg/kg 내지 1일 약 300 mg/kg이고, 1일 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 포함한다. 이러한 제제의 다른 대표적인 용량은 1일 약 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, 2000 mg/kg, 2100 mg/kg, 2200 mg/kg, 및 2300 mg/kg을 포함한다. 본원에 기재된 BVD-523 및 다른 항-암 제제의 효과적인 투약은, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 서브-투약으로 투여될 수 있고, 하루 동안 적합한 간격으로 개별적으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 BVD-523, 다른 억제제, 및 다양한 다른 항-암 제제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 목적하고 효과적인 방식으로 경구 섭취, 또는 눈으로 국소 투여를 위한 연고 또는 점적제로서, 또는 비경구 또는 복강내, 피하, 국부, 피내, 흡입, 폐내, 직장, 질내, 설하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 척수강내, 또는 림프내와 같은 임의의 적합한 방식으로 다른 투여를 위해 투여될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 BVD-523, 다른 억제제, 및 다양한 다른 항-암 제제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 본원에 기재된 BVD-523, 다른 억제제, 및 다양한 다른 항-암 제제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 캡슐화되거나 그렇지 않으면 목적하는 경우 위 또는 기타 분비물에 대해 보호될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 활성 성분을 하나 이상의 약제학적으로-허용되는 희석제 또는 담체 및, 임의의, 하나 이상의 다른 화합물, 약물, 성분 및/또는 물질과 혼합하여 포함한다. 선택된 투여 경로에 상관없이, 본 발명의 제제/화합물은 당해 기술 분야의 숙련가들에게 공지된 종래의 방법에 의해 약제학적으로-허용되는 용량 형태(dosage forms)로 제형화된다. 예를 들면, 문헌[참조: Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA.)]을 참조한다.
약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있고[참조: 예를 들면, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA.) and The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.)], 당 (예를 들면, 락토스, 수크로스, 만니톨, 및 소르비톨), 전분, 셀룰로오스 제제, 칼슘 포스페이트 (예를 들면, 디칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트 및 칼슘 산소 포스페이트), 나트륨 시트레이트, 물, 수성 용액 (예를 들면, 염수, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 락테이트화 링거 주사), 알코올 (예를 들면, 에틸 알코올, 프로필 알코올, 및 벤질 알코올), 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜), 유기 에스테르 (예를 들면, 에틸 올레에이트 및 트리글리세라이드), 생분해성 중합체 (예를 들면, 폴리락타이드-폴리글리라이드, 폴리(오르토에스테르), 및 다가(무수물)), 엘라스토머성 매트리스, 리포좀, 미세구, 오일 (예를 들면, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 참기름, 면실유, 및 땅콩유), 코코아 버터, 왁스 (예를 들면, 좌제 왁스), 파라핀, 실리콘, 탈크, 실리실레이트 등을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체 각각은 제형의 다른 성분과 적합성의 관점에서 "허용"되어야 하고, 대상체에게 해롭지 않아야 한다. 선택된 용량 형태 및 의도된 투여 경로를 위해 적합한 희석제 또는 담체는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있고, 선택된 용량 형태 및 투여 방법을 위해 허용되는 희석제 또는 담체는 당해 기술분야의 일반적인 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 임의로, 약제학적 조성물에서 통상 사용되는 성분 및/또는 물질을 포함할 수 있다. 이들 성분 및 물질은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있고, 다음을 포함한다: (1) 필러 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토스, 수크로스, 글루코오스, 만니톨, 및 규산; (2) 결합제, 예를 들면, 카복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 수크로스 및 아카시아; (3) 보습제, 예를 들면, 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들면, 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 가교결합된 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예를 들면, 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예를 들면, 4급 암모늄 화합물; (7) 습윤 제제, 예를 들면, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예를 들면, 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예를 들면, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 및 나트륨 라우릴 설페이트; (10) 현탁 제제, 예를 들면, 에톡시화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트; (11) 완충 제제; (12) 부형제, 예를 들면, 락토스, 유당, 폴리에틸렌 글리콜, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 코코아 버터, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크, 살리실레이트, 아연 옥사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트, 및 폴리아미드 분말; (13) 불활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 다른 용매; (14) 보존제; (15) 표면-활성 제제; (16) 분산 제제; (17) 제어-방출 또는 흡수-지연 제제, 예를 들면, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 다른 중합체 매트리스, 생분해성 중합체, 리포좀, 미세구, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴, 및 왁스; (18) 불투명화 제제; (19) 보조제; (20) 습윤 제제; (21) 유화 및 현탁 제제; (22) 가용화 제제 및 유화제, 예를 들면, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르; (23) 추진체, 예를 들면, 클로로플루오로탄화수소 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예를 들면, 부탄 및 프로판; (24) 항산화제; (25) 제형을 의도된 수령자의 혈액과 등장성이 되게 하는 제제, 예를 들면, 당 및 염화나트륨; (26) 농후화 제제; (27) 코팅 물질, 예를 들면, 레시틴; 및 (28) 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제. 이러한 성분 또는 물질 각각은 제형의 다른 성분과 적합성의 관점에서 "허용"되어야 하고, 대상체에게 해롭지 않아야 한다. 선택된 용량 형태 및 의도된 투여 경로를 위해 적합한 성분 및 물질은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있고, 선택된 용량 형태 및 투여 방법을 위해 허용되는 성분 및 물질은 당해 기술분야의 일반적인 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
경구 투여를 위해 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 캡슐, 샤쉐, 알약, 정제, 분말제, 과립제, 수성 또는 비-수성 액체의 용액 또는 현탁액, 수중유(oil-in-water) 또는 유중수(water-in-oil) 액체 에멀젼, 엘릭서제 또는 시럽, 파스틸, 볼루스(bolus), 연약 또는 페이스트의 형태일 수 있다. 이들 제형은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 예를 들면, 종래의 팬-코팅, 혼합, 과립화 또는 동결건조 공정를 통해 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 용량 형태(캡슐, 정제, 알약, 드라제, 분말제, 과립제 등)를, 예를 들면, 활성 성분(들)을 하나 이상의 약제학적으로-허용되는 희석제 또는 담체 및, 임의의, 하나 이상의 필러, 증량제, 결합제, 보습제, 붕해제, 용해 지연제, 흡수 촉진제, 습윤제, 흡수제, 윤활제, 및/또는 착색제와 함께 혼합하여 제조할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물이 적합한 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐 내에 필러로서 사용될 수 있다. 정제는 임의의 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형으로 제조될 수 있다. 압축 정제는 적합한 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제, 표면-활성 또는 분산제를 사용하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 적합한 기계에서 성형에 의해 제조될 수 있다. 정제, 및 드라제, 캡슐, 알약 및 과립제와 같은 다른 고체 용량 형태가 임의로 약제학적-제형 기술에서 잘 공지된 장용 코팅 및 다른 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 등급화 또는 제조될 수 있다. 이들은 또한 본원의 활성 성분의 서방출 또는 제어 방출을 제공하기 위해 제형화될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 박테리아-보유 필터를 통해 여과하여 살균될 수 있다. 이들 조성물은 또한 임의로 불투명화 제제를 포함할 수 있고, 이들이 활성 성분을 단독으로 또는, 우선적으로, 위장관의 특정 부분에, 임의로, 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 활성 성분은 또한 미세캡슐화 형태일 수 있다.
경구 투여용 액체 용량 형태는 약제학적으로-허용되는 에멀젼, 미세에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서제를 포함한다. 액체 용량 형태는 당해 기술에 통상 사용되는 적합한 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 현탁액은 현탁 제제를 포함할 수 있다.
직장 또는 질내 투여를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 좌제로 존재할 수 있고, 이는 하나 이상의 활성 성분(들)을, 실온에서 고체이지만 체온에서 액체이고, 따라서, 직장 또는 질 강 내에서 용융되고 활성 화합물을 방출할 수 있는 하나 이상의 적합한 비자극 희석제 또는 담체와 혼합하여 제조할 수 있다. 질내 투여에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 적합한 것으로 당해 기술 분야에 공지된 이러한 약제학적으로-허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움 또는 스프레이 제형을 포함한다.
국부 또는 경피 투여를 위한 용량 형태는 분말제, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치, 점적제 및 흡입제를 포함한다. 활성 제제(들)/화합물(들)은 멸균 상태하에 적합한 약제학적으로-허용되는 희석제 또는 담체와 혼합할 수 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔은 부형제를 포함할 수 있다. 분말제 및 시럽은 부형제 및 추진체를 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 제제(들)/화합물(들)을 사용 직전에 멸균 주사 가능 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 하나 이상의 약제학적으로-허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 멸균 분말과 함께 포함할 수 있고, 이는 적합한 항산화제, 완충제, 제형을 의도된 수령자의 혈액에 등장성이 되게 하는 용질, 또는 현탁 또는 농후화 제제를 포함할 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들면, 코팅 물질을 사용함에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 적합한 보조제를 포함할 수 있다. 또한 등장성 제제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 주사 가능 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제를 포함하여 수행될 수 있다.
일부 경우, 약물(예를 들면, 약제학적 제형)의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 이의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 열악한 수용해도를 갖는 결정성 또는 무정형 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 수행될 수 있다.
활성 제제/약물의 흡수 속도는 이에 이의 용해 속도를 좌우하고, 이는 차례로, 결정 크기 및 결정 형태를 좌우할 수 있다. 대안적으로, 비경구-투여된 제제/약물의 지연된 흡수는 활성 제제/약물을 오일 비히클 중에 용해 또는 현탁시켜 수행할 수 있다. 주사 가능 데포(depot) 형태는 생분해성 중합체 중 활성 성분의 미세캡슐 매트리스를 형성하여 제조할 수 있다. 활성 성분 대 중합체의 비, 및 사용된 특정 중합체의 성질에 좌우되어, 활성 성분 방출 속도가 제어될 수 있다. 데포 주사 가능 제형은 또한 약물을 체 조직에 적합성인 리포좀 또는 미세에멀젼 중에 포획하여 제조한다. 주사 가능 물질을 예를 들면, 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해 살균할 수 있다.
제형은 유닛-투약 또는 다중-투약 밀봉된 컨테이너, 예를 들면, 앰풀 및 바이알로 존재할 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 희석제 또는 담체, 예를 들면, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결건조된 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액을 상기한 유형의 멸균 분말제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.
본 발명은 비-ERK MAPK 경로 억제제 요법에 대해 저항성 또는 내성인 암의 치료를 제공하고, ERK 억제제의 효과를 증진시키기 위해 나타낸 조합을 개시한다. 본원에서, 본 출원인은 또한 상이한 ERK 억제제의 조합이 마찬가지로 상승 효과가 있음을 보여주었다. 따라서, 본원에 기술된 조합의 효과가 하나 이상의 추가의 ERK 억제제의 사용에 의해 추가로 개선될 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태는 하나 이상의 추가의 ERK 억제제를 포함한다.
본 발명은 또한 BVD-523 600 ㎎ BID 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 절제불가능하거나 전이성인 BRAF600 돌연변이 양성 흑색종을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 돌연변이는 BRAFV600E 돌연변이이다.
본 발명은 또한 BVD-523 600 ㎎ 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 비히클을 포함하는, 절제불가능하거나 전이성인 BRAF600 돌연변이 양성 흑색종을 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 방법을 추가로 설명하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시적인 것이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
재료 및 방법
암 세포주를 표준 배지 및 혈청 조건 하의 세포 배양에서 유지시켰다. 용량 증가 연구(dose escalation study)를 위해, A375 세포를 분할하고, 약 40-60%의 컨플루언스(confluence)로 성장시킨 후 특정 약물의 초기 용량으로 처리하였다. 표 4는 증가된 약물 처리의 요약을 나타낸다.
표 4- 증가된 치료의 요약
Figure pat00035
단일 제제 용량 증가는 문헌[참조: Little et al., 2011]에 기초하여 수행하였으며, 도 20에 개략적으로 설명되어 있다. 이어서, 세포를 70-90%의 컨플루언스가 될 때까지 성장시키고 분할시켰다. 분할 비율은 가능한 한 "정상"으로 유지되었고 치료들 간에 합리적으로 일치시켰다(예: 부모의 정상 분할 비율의 최소 50%). 배지는 3-4일 마다 새로 교체하였다. 세포가 다시 약 40-60% 컨플루언스에 도달했을 때, 용량을 증가시켰다. 40-60% 창(window)를 놓친 경우, 세포를 다시 분할시키고 이들이 40-60% 컨플루언스에 도달하면 투여하였다. 다시, 배지는 3-4일 마다 새로 교체하였다. 이 과정을 필요에 따라 반복하였다(도 20).
단일 제제 처리의 경우, 시작 농도 및 용량 증가는 대략 IC50으로 시작하여 작은 증분(increment)으로 상승시키거나, 또는 초기 4-5회 용량에 대해, 완만하게 용량을 두 배로 증가시키고, 다음 4회 용량에 대해 동일 증분만큼 증가시킨 후, 이후 용량의 농도를 1.5배 증가시킴으로써 수행하였다.
병용 치료의 경우, 시작 농도 및 용량 증가는 각 화합물의 대략 IC50의 절반으로 시작하여(병용 검정은 이것이 약 40-70% 억제 범위를 초래할 것이라고 시사한다), 단일 제제에 따라 증가(즉, 처음 두배로 증가시킨 후 다음 4회 용량에 대해 동일 증분만큼 증가시킨 다음, 농도를 1.5배로 증가시킴)시킴으로써 수행하였다. 표 5는 이러한 계획을 사용한 계획된 용량 증가를 나타낸다.
표 5 - 계획된 용량 증가 - 1개월
Figure pat00036
클론 내성 세포 집단은 한계 희석(limiting dilution)에 의해 내성 세포 풀로부터 유도되었다.
증식 분석은 적절한 시간 간격(예컨대 매 달, 그러나 타이밍은 이용가능한 적절한 세포 수에 의존적임)으로 증가된 약제에 대한 민감도의 변화를 추적하는데 사용되었다. 증식 분석을 위해, 세포가 10% FBS를 함유하는 약물이 없는 DMEM 배지에서 웰 당 3000 세포로 96-웰 플레이트에 씨딩(seed)하였고, 화합물 또는 비히클 대조군을 첨가하기 전에 밤새도록 부착(adhere)시켰다. 화합물을 DMSO 스톡으로부터 제조하여 도 2a 내지 도 2h에 나타낸 최종 농도 범위를 얻었다. 최종 DMSO 농도는 0.1%로 일정하였다. 시험 화합물을 가습 대기에서 37℃ 및 5% CO2에서 96 시간 동안 세포와 함께 인큐베이팅하였다. 그 후, 알라머 블루(Alamar Blue) 10%(v/v)를 첨가하고 4 시간 동안 인큐베이팅하고, BMG FLUOstar 플레이트 판독기를 사용하여 형광 물질을 검출하였다. 평균 배지 전용 배경 값(average media only background value)을 빼고 GraphPad Prism에서 4-파라미터 로지스틱 방정식(4-parameter logistic equation)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 파클리탁셀을 양성 대조군으로 사용하였다.
표 6에 나타낸 각 제제의 농도로 성장하는 세포를 사용하여 28 일째에 1 개월째의 증식 분석을 개시하였다.
표 6 - 증식 분석에서 사용된 약물의 초기 농도 - 1 개월 째
Figure pat00037
표 7에 나타낸 각 제제의 농도로 성장하는 세포를 사용하여 56 일째에 2 개월 째의 증식 분석을 개시하였다.
표 7 - 증식 분석에서 사용된 약물의 초기 농도 - 2 개월 째
Figure pat00038
3 개월의 증가 기간의 말에, 증식 분석의 최종 라운드 및 잠재적 단일 세포 복제 전에 2 주 동안 배양물을 최고 농도에서 유지시켰다. 증식 분석/단일 세포 복제는 활발하게 증식하는 세포를 필요로 함에 따라, 세포가 최고 농도에서 매우 천천히 증식하거나 단지 최근에 증가된 처리의 경우, 백업 배양물 또한 낮은 농도에서 유지시켰다(표 8). 세포가 거의 완전히 성장을 멈추고 최고 농도(1.8μM)에서 특히 취약해 보인 BVD-523 치료의 경우, 배양물을 2 주의 기간 동안 더 낮은 농도에서 유지시켰다.
표 8 - 고정 농도에서 2주 동안 배양된 처리의 상세 사항
Figure pat00039
3개월 째의 증식 분석은 표 9에 나타낸 각 약제의 농도에서 성장한 세포를 사용하였다.
표 9 - 증식 분석에서 사용된 약물의 초기 농도 - 3 개월 째
Figure pat00040
병용 연구를 위해, A375 세포(ATCC)를 DMEM + 10% FBS에서 3000 세포/웰의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 삼중으로 씨딩하고, 시험 화합물 또는 비히클 대조군을 첨가하기 전에 밤새도록 부착시켰다. 최종 DMSO의 농도가 0.2 %인 10 x 8 용량 매트릭스를 사용하여 병용을 테스트하였다. 96 시간 분석 배양에 이어 형광 플레이트 판독기에서 판독하기 전에 알라머 블루 10 % (v/v)의 후속적인 첨가 및 4 시간의 배양이 이어졌다. 알라머 블루를 판독한 후, 배지/알라머 블루 혼합물을 털어내고(flick off), 100 μl의 CellTiter-Glo/PBS (1:1)을 첨가하고, 플레이트를 제조사 지침 (Promega)에 따라 처리하였다. 데이터를 분석하기 전에 배지 전용 배경 값을 뺐다. 그 후 블리스 가산성(Bliss additivity) 모델을 적용하였다.
요약하면, 조합 억제에 대해 예측된 분획 억제 값(fractional inhibition values)은 방정식 Cbliss = A + B - (A x B)를 사용하여 계산하였고, 여기서 A 및 B는 특정 농도에서 약물 A 단독 또는 약물 B 단독으로 수득된 분획 억제이다. Cbliss는 두 약물의 조합이 정확히 가산적인(additive) 경우 예상되는 분획 억제이다. 실험적으로 관찰된 분획 억제 값에서 Cbliss 값을 빼서 "Bliss 초과(excess over bliss)" 값을 얻는다. 0 보다 큰 블리스 초과 값은 상승작용 효과를 나타내지만, 0 보다 작은 값은 길항작용을 나타낸다. 블리스 초과 값은 히트 맵 ± SD로 플롯팅(plot)하였다.
단일 및 조합 데이터는 또한 GraphPad Prism에서 생성된 용량-반응 곡선으로 표시된다 (DMSO만 처리한 대조군과 비교하여 % 생존능을 사용하여 플롯팅됨).
집중적인 조합 연구를 위해, 알라머 블루 생존능 분석을 조합 연구에 대해 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 추가적으로, Caspase-Glo 3/7 분석을 수행하였다. 요약하면, HCT116 세포를 McCoy's 5A + 10% FBS에서 5000 세포/웰의 세포 밀도로 백색 96-웰 플레이트에서 삼중으로 씨딩하였다. A375 세포를 DMEM + 10% FBS에서 5000 세포/웰의 밀도로 씨딩하였다. 시험 화합물 또는 비히클 대조군을 첨가하기 전에 세포를 밤새도록 부착시켰다. DMSO의 최종 농도는 0.2 %이고, 800 nM 스타우로스포린(staurosporine)을 양성 대조군으로 포함시켰다. 24 시간 및 48 시간의 분석 배양 기간을 사용하였다. 그 다음, Caspase-Glo® 3/7 50 % (v/v)를 첨가하고, 플레이트를 오비탈 쉐이커에서 5 분간 혼합시키고, 형광 플레이트 판독기에서 판독하기 전에 실온에서 1 시간 동안 배양시켰다. 데이터를 분석하기 전에 배지 전용 배경 값을 뺐다.
시차 주사 형광측정법(Differential Scanning Fluorimetry)에 대해, SYPRO Orange(5,000 x 용액, Invitrogen)를 완충 용액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5)에서 희석(1:1,000)시켰다. HisX6 태그된 단백질은 1μM의 최종 농도에서 비활성 ERK2, 활성 ERK2 (ppERK2), 또는 p38α를 포함하였다. 단백질/염료 용액 및 100% DMSO 중의 화합물을 원하는 최종 농도를 달성하도록 웰 (2 % v/v 최종 DMSO 농도)에 첨가하고, 혼합하고, RT-PCR 기기에 넣었다. 다음으로, 용융 곡선을 1 분당 1 ℃의 속도로 25-95 ℃에서 작동시키고, 화합물의 부재 또는 존재 하에서 각 단백질에 대해 용융 온도(Tm)를 측정하였다. 다양한 약물 농도의 존재 하에서 Tm의 변화(ΔTm)가 제시된다.
ERK1의 Ki 측정을 위해, 활성화된 ERK1(10 nM)을 0.1 M HEPES 완충액(pH 7.5), 10　mM MgCl2, 2.5　mM 포스포에놀피루베이트, 200 μM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH), 150 μg/mL 피루베이트 키나아제, 50 μg/mL 락테이트 데하이드로게나제, 및 200 μM 에르크티드(Erktide) 펩타이드에서 30 ℃에서 10 분 동안 2.5% (v/v) DMSO 중의 다양한 농도의 화합물과 함께 배양하였다. 65 μM의 ATP를 첨가하여 반응을 개시하였다. 감소된 흡광도(340nm)를 모니터링하고, IC50을 억제제 농도의 함수로서 측정하였다.
ERK2의 Ki 측정을 위해, 방사성 분석을 사용하여 BVD-523의 ERK2에 대한 억제 활성을 측정하였고, 성분들의 최종 농도는 100　mM HEPES (pH　7.5), 10　mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨(DTT), 0.12　nM ERK2, 10　μM 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 및 50　μM 33P-γ-ATP이었다. ATP 및 MBP를 제외한 모든 반응 성분들을 미리 혼합하고, 96-웰 플레이트에 분액 (33　μL)하였다. DMSO 중의 화합물의 스톡 용액을 사용하여 500 배까지 희석시켰다; DMSO의 1.5　μL 분액 또는 DMSO 중의 억제제를 각각의 웰에 첨가하였다. 반응은 기질 33P-γ-ATP 및 MBP (33 μL)를 첨가함으로써 개시하였다. 20분 후, 반응을 4 mM ATP를 함유하는 20% (w/v) 트라이클로로아세트산 (TCA) (55 μL)으로 급냉시키고, GF/B 필터 플레이트로 옮기고, 5% (w/v) TCA로 3번 세척하였다. Ultimate Gold ™ 신틸란트 (50 μL)를 첨가한 후, 샘플을 Packard TopCount에서 계수하였다. 활성 대 농도 적정 곡선으로부터, Prism software, version 3.0을 사용하여 경쟁적 밀접 결합 억제 반응속도(competitive tight binding inhibition kinetics)를 위한 방정식에 데이터를 피팅시켜 Ki 값을 측정하였다.
ERK2의 IC50 측정을 위해, 표준 결합 효소 분석법으로 활성을 분석하였다. 최종 농도는 다음과 같았다: 0.1　M HEPES (pH　7.5), 10　mM MgCl2, 1　mM DTT, 2.5　mM 포스포에놀피루베이트, 200　μM NADH, 50　μg/mL 피루베이트 키나아제, 10　μg/mL 락테이트 데하이드로게나제, 65　μM ATP, 및 800　μM 펩타이드(ATGPLSPGPFGRR). ATP를 제외한 모든 반응 성분들을 ERK와 미리 혼합하여 분석 플레이트 웰에 분액하였다. 웰 당 DMSO의 농도를 일정하게 유지하면서, DMSO 중의 BVD-523을 각 웰에 넣었다. BVD-523 농도는 각각의 적정에 대해 500 배 범위에 걸쳐 있다. ATP를 첨가하여 반응을 개시하기 전에 분석 플레이트를 분광 광도계(분자 장치(molecular devices))의 플레이트 판독기 구획에서 30 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 340 nm에서의 흡광도 변화를 시간의 함수로서 모니터링하였다; 초기 기울기는 반응 속도에 상응한다. BVD-523 적정 곡선의 속도 대 농도를, Prism software, version 3.0을 사용하여 경쟁적 밀접 결합 억제 반응 속도를 위한 방정식에 피팅하여 Ki의 값을 측정하거나 3-파라미터 피트(3-parameter fit)에 피팅하여 IC50을 측정하였다.
세포 사멸 분석을 위해, 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 2 Х 104 세포로 도말하고 밤새도록 부착시키거나 50% 컨플루언스로 성장시켰다. 세포를 배지(최종 부피 200 μL, 농도 범위 4-0.25 μM)에서 BVD-523의 연속 희석액으로 처리하고, 37 ℃ CO2 배양기에서 48 시간 동안 배양하였다. 세포를 100 μL의 PBS로 세척하고, 60　μL 의 방사면역침강 분석(radioimmunoprecipitation assay) 완충액 (50　mM Tris-HCl, pH 8.0, 150　mM NaCl, 1.0% [w/v] NP-40, 0.5% [w/v] 나트륨 디옥시콜레이트, 1% [w/v] SDS)을 첨가한 다음, 4 ℃에서 10 분간 배양하여 세포를 용해시켰다. 30 μL 용해물(lysate)의 분액을 100 μL의 카스파제 분석 완충액 (120　mM HEPES, 12　mM EDTA, 20　mM 디티오트레이톨, 12.5　μg/mL AC-DEVD-AMC 카스파제 기질)에 첨가하고, 실온에서 4 시간 내지 밤새 배양하였다. 플레이트를 형광측정기 (여기 파장(excitation wavelength) 360 nm, 방출 파장 460 mm)에서 판독하였다. 나머지 30 μL의 용해물은 BioRad 단백질 분석 키트(시료 대 작업시약 비 1:8)를 사용하여 총 단백질 함량을 분석하였다. 최종 정규화된 카스파제 활성은 μg 단백질 당 형광 단위로 유도하였고, DMSO 대조군과 비교할 때 카스파제 활성의 배수 증가로 전환하였다.
A375 이종이식편(xenografts)에서의 항종양 활성의 측정을 위해, 암컷 흉선 누드 마우스에서 연속 피하 이식에 의해 유지된 A375 세포로 이종이식을 개시하였다. 각 시험 마우스는 오른쪽 옆구리에 피하로 이식된 A375 종양 단편(1　mm3)을 투여받았다. 일단 종양이 목표 크기 (80-120　mm3)에 도달하면, 동물을 처리군과 대조군으로 무작위 추출하여 약물 치료를 시작하였다.
BVD-523 단일요법을 평가하기 위해, 1% (w/v) 카복시메틸셀룰로오스 (CMC) 중의 BVD-523을 5, 25, 50, 100, 또는 150 mg/kg의 용량으로 BID 경구 투여하였다. 경구용 테모졸로마이드는 양성 기준 화합물로서 1 일 1 회 (QD) 75 또는 175 mg/kg을 총 5 회 처리 (QD × 5) 동안 투여하였다.
다브라페닙과 병용한 BVD-523의 효능을 15 그룹 중 9 그룹 및 10 그룹 중 1그룹(그룹 10)으로 무작위한 마우스에서 평가하였다. 다브라페닙은 50 또는 100 mg/kg QD로 p.o. 투여하였고, BVD-523은 50 또는 100 mg/kg BID 단독 및 병용하여 연구 종료시까지 p.o. 투여하였다; 비히클 처리 및 테모졸로마이드 처리(150 mg/kg QD × 5)된 대조군도 포함시켰다. 20 일 째에 병용 투여를 중지하여 종양의 재성장을 관찰하였다. 동물들을 개별적으로 모니터링하고, 각 종양이 2000　mm3의 종말점 부피, 또는 최종일(45 일) 중 먼저 오는 시점에 도달했을 때, 동물들을 안락사시키고, 종말점까지의 중앙값 시간 (TTE)을 계산하였다. 이 병용 요법은 또한 228-1008　mm3 범위의 큰 종양이 평가되는 병기 상향(upstaged)된 A375 모델에서 평가하였다. 여기에서, 마우스를 14 그룹 중 1 그룹 (그룹 1) 및 20 그룹 중 4 그룹 (그룹 2-5)으로 무작위 추출하였다. 투약은 1 일 째에 다브라페닙 + BVD-523 (25　mg/kg 다브라페닙 + 50　mg/kg BVD-523 또는 50　mg/kg 다브라페닙 + 100　mg/kg BVD-523)으로 시작하였고, 각 약제는 연구가 끝날 때까지 p.o. BID 투여되었다. 이 연구에는 비히클 처리된 대조군 뿐만 아니라 50 mg/kg 다브라페닙과 100 mg/kg BVD-523 단일요법 군도 포함되었다. 종양은 매주 2 회 측정하였다. 42 일 째에 병용 투여를 중단하여 연구 종료 (60 일 째)에 걸쳐 종양 재성장을 모니터링하였다. 치료 결과는 로그 순위(long rank) 생존 분석을 통해 분석된 그룹 간의 차이를 갖는, 치료된 마우스 대 대조 마우스에 대한 중앙(median) TTE의 백분율 증가로 정의되는 % TGD로부터 결정되었다. TGI 분석을 위해, 공식 % TGI=1-Tf-Ti/Cf-C에 기초하여 초기(i) 및 최종(f) 종양 측정치를 사용하여 각 처리군(T) 대 대조군(C)에 대해 % TGI 값을 계산하고 보고하였다. 또한, CR 및 PR 반응에 대해 마우스를 모니터링하였다. 연구 종료 시에 CR이 있는 동물을 TFS로 분류하였다.
Colo205 이종이식편에서의 BVD-523 활성의 측정을 위해, 인간 Colo205 세포를 10% (v/v) 태아 소 혈청 (FBS), 100　유닛/mL 페니실린, 100　μg/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen), 및 2　mM L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다. 세포를 이식하기 전에 4 회 미만의 계대로 배양하였다. 0 일 째에, 암컷 흉선 누드 마우스 (19-23 g)에게 2 Х 106 Colo205 세포를 우측 등 액축 부위(dorsal axillary region)에 피하주사하였다.
대략 200 mm3의 종양 부피를 가진 마우스를 6 개의 실험군으로 무작위 추출 하였다. 1% CMC (w/v)의 비히클 대조군을 매주 제조하였다. BVD-523을 목적하는 농도에서 1% (w/v) CMC에 현탁시키고, 얼음 상에서 6,500 rpm으로 50 분 동안 균질화시켰다. BVD-523 현탁액을 매주 제조하고, 13 일 동안 8 시간 또는 16 시간 투약 일정으로 50, 100, 150 및 200 mg/kg (n = 12/그룹)의 총 일일 투여량을 BID p.o. 투여하였다. 비히클 대조군 (n = 12)을 동일한 투여 요법을 사용하여 투여하였다. CPT-11을 양성 기준 화합물 (n = 12)로 투여하였다. CPT-11 주사의 각 1 mL는 20 mg의 이리노테칸, 45 mg의 소르비톨 및 0.9 mg의 젖산을 함유하였다. CPT-11은 100 mg/kg/day로 4 일마다 2 회 연속 복강 투여하였다.
Colo205 이종이식편에서 ERK1/2 동위원소-태그된 내부 표준 (ITIS) 질량분광법의 측정을 위해, 냉동된 종양을 빙냉(ice cold) 용해 완충액 (10　mM TRIS-HCl, pH 8.0, 10　mM MgCl2, 1% (v/v) Triton X-100, CompleteTM 프로테아제 억제제 칵테일 [Roche, cat. No. 1836170], 포스파타제 억제제 칵테일 I [Sigma, cat. No. P-2850], 포스파타제 억제제 칵테일 II [Sigma cat. No. 5726], 및 벤조나제 [Novagen cat. No. 70664]) 10 부피에서 용해시켰다. 용해물을 원심분리 (4 ℃에서 60 분 동안 100,000 × g)하여 정제하고, 상청액을 용해 완충액으로 2 mg/mL로 조정하였다. ERK1은 아가로스-커플링된 pan-anti-ERK1 (Santa Cruz Biotechnology 카탈로그 번호 sc-93ac) 항체를 사용하여 면역침강시켰다. 면역침강된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고, SYPRO Ruby (Invitrogen)로 염색하고, ERK 밴드를 면도기로 절제하였다. 겔 슬라이스를 300 μL의 20 mM NH4HCO3로 세척하고, 작은 조각으로 절단하고, Page Eraser Tip (The Nest Group cat no. SEM0007)에 넣었다. 겔 조각은 트립신 소화 전에 환원되고 알킬화되었다. 트립신 조각은 75 μL의 50% (v/v) 아세토니트릴, 0.2 % (v/v) 트리플루오로아세트산에서 분리시키고, 결과 샘플은 SpeedVac에서 0-10 μL로 농축시켰다.
ITIS 분석을 위해, 소화된 시료에 중(heavy)-원자 표지된 펩타이드 표준 물질을 첨가하고, 분획 인산화를 커플링된 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 (MS)에 의해 정량화하였다. 나노모세관(Nanocapillary) 크로마토그래피는 1:750 분할(splitting) 후 나노스케일 유동을 전달하는 Flux Instruments의 Rheos 2000 바이너리 펌프, 전자방출 이온화 (ESI) 에미터 역할도 하는 LC Packings Inertsil 나노 프레칼럼 (C18, 5　mm, 100Å, 30　mm ID Х 1 mm), 및 New Objective PicoFrit AQUASIL 분해 칼럼 (C18, 5　mm, 75/15　mm ID Х 10　cm)을 사용하여 수행하였다. 나노-ESI 소스와 결합된 Applied Biosystem API 3000 질량 분석기를 MS 분석에 사용하였다. 분무 가스 공급원에 연결된 사내(in-house-made) 가스 노즐은 안정적인 나노 흐름 스프레이를 돕기 위해 사용되었다. 데이터는 다중 반응 모니터링 (MRM) 모드에서 획득되었다: 분무 가스(nebulizing gas) 3; 커튼 가스(curtain gas) 7; 콜리전 가스(collision gas) 5; 이온 스프레이 전압(ion spray voltage) 2150 볼트, 출구 전위(exit potential) 10 볼트; Q1/Q3 해상도 Low/Unit; 및 모든 MRM 채널에 대한 체류 시간 65 msec. 모든 로우 MS 데이터는 Applied Biosystem의 Analyst 소프트웨어 스위트와 맞춤형 도구(custom tool)의 조합을 사용하여 처리하였다.
획득된 내성의 세포주 모델에서 약물 감응성(drug sensitivity)을 평가하기 위해, 용량 증가된 A375 세포 및 동질유전자(isogenic) RKO 세포의 약물 감응성을 96 시간 증식 분석에서 평가하였다. RKO 동질유전자 세포 (10% [v/v] FBS 함유 McCoy's 5A) 또는 용량 증가된 A375 세포 (10 % FBS 함유 DMEM)를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 화합물 또는 비히클 대조군을 첨가하기 전에 밤새도록 부착시켰다. 용량 증가된 A375 세포는 억제제가 없을때 씨딩함에 주목한다. 화합물을 0.1 % (v/v) DMSO 스톡에서 제조하여 표시된 바와 같은 최종 농도를 얻었다. 시험 화합물을 5 % CO2 가습 대기에서 37 ℃에서 96 시간 동안 세포와 함께 배양하였다. RKO 세포의 경우, CellTiter-Glo® 시약 (Promega)을 제조업체의 지침에 따라 첨가하고, BMG FLUOstar 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 검출하였다. A375 분석을 위해, 알라머블루 (ThermoFisher) 10 % (v/v)를 첨가하고 4 시간 동안 배양한 후, 형광 물질을 BMG FLUOstar를 사용하여 검출하였다. 평균 배지 전용 배경 값을 빼고 GraphPad Prism에서 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 데이터를 분석하였다.
ERK1의 IC50 측정은 25 μL의 최종 반응 부피에서 측정되었다. ERK1 (인간) (5-10　mU)를 25 mM Tris (pH 7.5), 0.02 mM 에틸렌글리콜테트라아세트산, 250　μM 펩타이드, 10　mM Mg 아세테이트 및 γ-33P-ATP(대략 500　cpm/pmol의 특이적 활성, 농도는 필요에 따라)와 함께 배양하였다. Mg ATP 첨가는 반응을 개시시켰다. 실온 (RT)에서 40 분 동안 배양한 후, 5 μL의 3 % (w/v) 인산 용액을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 반응물 10 μL를 P30 필터매트 상에 스폿팅하고, 건조 및 신틸레이션 계수 전에 75 mM 인산에서 5 분 동안 3 회 세척 한 후 메탄올에서 1 회 세척하였다.
RKO MEK1 Q56P 동질유전자 세포는 재조합 AAV-매개 유전자 타겟팅 전략을 사용하여 Horizon Discovery (Cambridge, UK; #HD 106-019)에 의해 생산하였다. 간략하게, rAAV 바이러스는 HEK293T 세포에서 적절한 표적 벡터 및 헬퍼 벡터의 형질감염 후 생성되고, AAV 정제 키트 (Virapur, San Diego, USA)를 사용하여 정제되고, qPCR을 사용하여 적정된다. 그 후, 부모 동형접합성(homozygous) RKO 세포 (MEK1의 동형접합성 야생형)를 rAAV 바이러스로 감염시키고, 스크리닝 카세트를 통합 한 클론을 G418 스크리닝에 의해 확인하고 확장시켰다. 단일 대립유전자로의 MEK1 Q56P 점 돌연변이의 녹-인(knock-in)에 대해 이형접합성(heterozygous)인 올바르게 표적화된 클론을 PCR 및 서열분석으로 확인하였다.
돌연변이체 KRAS (De Roock et al 2010, JAMA, 304, 1812-1820)의 녹-인에 대해 이형접합성인 동질유전자 SW48 세포주는 Horizon Discovery (카탈로그 넘버 HD 103-002, HD 103-006 HD 103-007, HD 103-009, HD 103-010, HD 103-011, HD 103-013)에서 수득하였다. 증식 분석을 위해, 세포를 10 % FBS를 함유하는 McCoy's 5A 배지에서 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 화합물 또는 비히클 대조군을 첨가하기 전에 밤새도록 부착시켰다. 시험 화합물을 5% CO2 대기에서 37 ℃에서 96 시간 동안 세포와 함께 배양하였다. 그 후, 알라머 블루를 사용하여 생존능을 평가하였다.
전매 KinaseProfiler 분석은 Upstate Discovery에서 수행하였고, 데이비스(Davies) 등이 사용한 것과 유사한 방사성 검출을 사용하여 70개의 키나아제 패널에 대한 BVD-523의 선택성을 분석하였다.
약물 감응성 분석은 이전에 기술된 바와 같이 (Yang et al., 2013), 고 처리량 스크리닝을 사용하는 암 프로젝트에서 약물 감응성의 유전체학 (The Genomics of Drug Sensitivity in Cancer Project)의 일부로서 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, A375 세포를 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) + 10 % (v/v) FBS의 10cm 접시 위에 씨딩하였다. 시험 화합물 또는 비히클을 첨가하기 전에 세포를 밤새도록 부착시켰다. RKO 세포 실험을 위해, 이들 세포를 McCoy's 5A + 10 % (v/v) FBS의 6-웰 플레이트 또는 10cm 접시에 씨딩하였다. 이어서, 세포를 원하는 농도 및 기간으로 처리하였다. 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 펠렛화하고, 동결시켰다. 용해물은 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Roche)을 함유하는 RIPA 완충액으로 제조하고, 11,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 정제시키고, 비신코닌산 분석법으로 정량하였다. 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 블로팅하고, 지시된 표적에 대한 항체 (즉, pRB [Ser780], 카탈로그 넘버 9307; CCND1, 카탈로그 넘버 ab6152; BCL-xL, 카탈로그 넘버 2762; PARP, 카탈로그 넘버 9542; DUSP6, 카탈로그 넘버 3058S)를 사용하여 프로빙하였다.
역상 단백질 분석(RPPA)의 경우, A375, MIAPaCa-2, HCT116, Colo205, HT-29 및 AN3Ca 세포 (ATCC)를 80 % 컨플루언스로 도말하여 밤새 회복시킨 후 (MIAPaCa-2 세포는 30 % 컨플루언스로 도말하고, 3 일 동안 회복시켰다), 37 ℃에서 6 시간 동안 10 μM의 각 화합물 (즉, BVD-523, SCH722984, GDC-0994 또는 Vx-11e)로 처리하였다. 대조군 웰을 세포 용해물 생성 전에 6 시간 동안 0.1 % (v/v) DMSO로 처리하였다. 샘플은 그 후 역상 단백질 마이크로어레이 기술 (Theranostics Health)을 사용하여 분석하였다.
Colo205 이종이식편에서의 pERK IHC의 분석을 위해, 이종이식 종양을 70 % 에서 100 %의 단계적 에탄올에서 밤새 처리하고, 크실렌의 2 변화에서 제거하고, 파라핀으로 침투시키고, 파라핀 블록에 봉매시켰다. 그 다음, 5-μm 단면을 잘라 내고 양으로 하전된 유리 슬라이드 위에 놓고, 60 ℃에서 30 분 이상 1 시간 이하로 구웠다. 각 동물 및 투여군의 단일 섹션을 항-포스포 p42/p44 MAPK 항체 (pERK [1:100], CST; Cat no. 9101; Lot no. 16)로 프로빙하고, 헤마톡실린으로 대조염색 한 다음, Zeiss Axioplan 2 현미경을 사용하여 미시적으로(microscopically) 분석하였다. 이소타입 대조군 (토끼, Zymed laboratories, catalog no. 08-6199, lot no. 40186458)을 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS 분석을 위해, 세포를 긁어내어 1,500 rpm으로 5 분간 펠렛화 한 다음 1 mL의 완충액에 재현탁시키고 -70 ℃에서 냉동시켰다. 냉동된 세포를 해동하고 다시 원심분리 한 후, 0.25 mL의 완충액 A (스페르민 테트라하이드로클로라이드 세제 완충액의 트립신)에서 10 분간 재현탁시켜 세포 덩어리를 분해하고 세포막과 세포 골격을 분해하였다. 완충액 B (완충제 중 트립신 저해제 및 리보뉴클레아제 I, 0.2 mL)를 암부(dark)에서 10 분 동안 첨가하였다. 생성된 DNA 염색된 핵을 여과시키고 FACS로 분석하였다. 히스토그램을 분석하여, n 및 2n DNA (또는 그 이상) 함량의 존재에 기초하여 세포 주기의 G1, S 및 G2/M 단계에서의 세포의 비율을 확정하였다.
시험관내 조합 활성의 측정을 위해, 5,000 개의 G-361 세포를 10 % (v/v) FBS를 함유한 McCoy's 5A를 함유하는 96-웰 플레이트에 삼중으로 씨딩하고 밤새도록 부착시켰다. 베무라페닙/BVD-523 조합은 10 x 8 용량 매트릭스를 사용하여 테스트하였다. 화합물을 5 % CO2 가습 대기에서 37 ℃에서 72 시간 동안 세포와 함께 배양하였다. CellTiter-Glo 시약을 제조업체의 지시에 따라 첨가하고, MBG FLUOstar 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 검출하였다. 용량 매트릭스에 걸친 상호 작용은 Horizon의 Chalice 조합 분석 소프트웨어(Horizon's Chalice Combination Analysis Software)를 사용하여 로오베 가산성 및 블리스 독립성 모델(Loewe Additivity and Bliss independence model)에 의해 결정하였다.
시험관내에서 용량 증가에 의한 화합물 내성을 생성하기 위해, A375 부모 세포 (ATCC CRL-1619)를 10% 열-불활성화된 FBS와 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 ~40-60 % 컨플루언스로 성장시킨 후, BVD-523, 트라메티닙, 또는 다브라페닙의 초기 용량을 단독으로 또는 조합하여 각 화합물의 IC50 이하에서 처리하였다; 조합 연구에서 초기 투여량은 각 화합물의 IC50의 절반이었다. 세포를 ~70-90 %의 컨플루언스까지 성장시키고 분열시켰다; 배지를 3-4 일마다 새로 교체하였다. 세포가 다시 ~40-60 %의 컨플루언스에 도달하면, 동일 증분 (초기 농도와 동등)으로 용량을 증가시킨 다음 농도를 1.5 배 증가시킨 후, 세포가 계속 빠르게 적응하는 경우, 2 배로 추가 증가시킨다(예를 들어, 다브라페닙 증가의 첫 6 회 투여량은: 5, 10, 15, 20, 25, 및 37.5 nM). 이 과정은 필요에 따라 반복하였다.
고 포도당 조건 하에서 완전 혈청에서 약물 5 일 후 Resazurin (Alamar Blue) 대사 분석에 의해 세포 생존능 분석을 수행하였다. 세포를 10 % FBS 및 페니실린/스트렙타비딘 + 고 포도당 (18-25 mM)을 함유하는 배지에서 ~15%-50% 컨플루언스로 384-웰 마이크로플레이트에 씨딩하였다. 각 세포주에 대한 최적 세포수를 결정하여 약물 복용 중 성장을 최적화하였다. 부착성 세포주의 경우, 밤새 배양 한 후, 액체 처리 로봇을 사용하여 각 화합물 9 배 농도 (2 배 희석 계단)로 세포를 처리하고, 96 시간 시점에서 분석을 위해 배양기로 되돌려놓았다. 현탁 세포주의 경우, 세포를 도말 직후에 화합물로 처리하고, 96 시간 시점에 배양기로 되돌려 놓았다. 그 후, 세포를 글루타티온이 없는(glutathione-free) 배지에서 제조된 55 μg/ml Resazurin (Sigma)으로 4 시간 동안 염색시켰다. 형광 신호 강도의 정량은 Resazurin에 대해 535/595 nm의 여기 파장 및 방출 파장에서 형광 플레이트 판독기를 사용하여 수행하였다. 모든 스크리닝 플레이트는 엄격한 품질 관리 조치를 받았다. 세포 생존능에 대한 효과를 측정하고, 곡선 피팅(curve-fitting) 알고리즘을 로우 데이터 세트에 적용하여 반 최고치(half maximal) 억제 농도 (IC50)를 포함한, 약물 반응의 다중 매개변수 기재를 유도하였다. IC50은 μM 단위의 IC50의 자연 로그로 표시된다 (LN_IC50, EXP는 IC50을 μM으로 표시). IC50의 외삽법(Extrapolation)은 매우 높은 값을 산출하는 곳에서 허용된다. 원하는 경우, 시험된 최대 농도 (및 낮은 값에 대해서는 시험된 최소 농도)에서 IC50 값을 캡핑(capping)하여 시험된 농도 범위로 데이터를 제한시켰다.
베무라페닙에 임상적으로 저항성이었던 BRAFV600E 환자로부터의 흑색종을 나타내는 환자 유래 이종이식편 (AT052C)에서 BVD-523의 효능 시험을 위해, 종양 단편을 숙주 동물로부터 수확하고, 면역-결핍 마우스에 이식하였다. 이 연구는 대략 170　mm3의 평균 종양 부피에서 시작되었으며, 이 시점에서 동물들은 대조군 (1% [v/v] CMC p.o., BIDХ31)과 3 개의 처리군 (BVD-523 [100　mg/kg], 다브라페닙 [50　mg/kg], 또는 BVD-523/다브라페닙 [100/50　mg/kg], n = 10/그룹)을 포함한 4 개의 그룹으로 무작위 추출되었다; 모든 치료 약물은 BID × 31 일정으로 p.o. 투여되었다.
인간 전혈 샘플에서 BVD-523에 의한 PMA-자극된 RSK1 인산화의 억제에 대한 IC50 측정을 위해, BVD-523에 의한 PMA 자극된 RSK1 인산화의 억제에 대한 IC50 값을 10 명의 건강한 공여자 (22-61 세)에 대해 BVD-523 10μM 내지 5nM 범위에 이르는 8 포인트 농도 곡선을 사용하여 측정하였다. 대조군은 각각의 공여자에 대해 3 개의 자극받지 않은 샘플 및 3 개의 PMA-자극된 샘플로 구성되었다. 발광-RSK (pRSK) 및 총 RSK 수준 모두를 측정하고, 데이터를 각 샘플에 대해 pRSK/RSK 수준을 사용하여 계산하였다.
각 공여자로부터의 30 밀리리터의 혈액을 나트륨 헤파린 베큐테이너(vacutainers)에 넣었다. 공여자 당 22 개의 2 mL 마이크로튜브 각각에 1 mL의 전혈을 첨가하였다. 마이크로튜브는 공여자 번호 (1 내지 10) 및 후속 처리 지정(subsequent treatment designation)으로 표시되었다: 오직 PMA 자극에 대한 "A" (최대), PMA 자극을 받은 BVD-523 함유 샘플에 대한 "B"; 및 자극되지 않은 샘플에 대한 "C" (최소). 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 A 군 및 C 군의 모든 튜브에 0.1 %의 최종 농도로 첨가하였다. 그 후, 샘플을 실온에서 부드럽게 흔들었다.
BVD-523 (100 % DMSO 중 10 mM)을 100 % DMSO로 3 배 희석하여 연속 희석하였다. 100 % DMSO에서 연속적으로 희석된 BVD-523 샘플을 10 % 태아 소 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신/글루타민을 함유한 둘베코 변형 이글 배지에서 10 배로 희석하고, 이들 각각의 작업 용액 10 μL를 각각 지정된 BVD-523 농도에 대해 혈액 1mL당 첨가하였다. BVD-523의 각 농도는 2 개의 1 mL 혈액 샘플로 각각 2 회 실시하여 8 포인트 농도 곡선 전체에 대해 16 개의 총 샘플을 얻었다. 그 후 샘플을 실온에서 최소 2 시간 내지 최대 3 시간 동안 부드럽게 흔들었다.
모든 공여자에 대한 A 군 및 B 군에서의 인간 전혈 샘플을 실온에서 20 분 동안 100 nM의 최종 농도에서 PMA로 자극시켰다. C 군의 샘플은 PMA로 처리하지 않았지만 다른 모든 샘플과 마찬가지로 흔들어 처리하였다.
각 샘플에 대한 PMA 처리가 완료되면, 인간의 전혈로부터 말초 혈액 단핵 세포를 분리하였다. 각 샘플에서 1 mL의 혈액을 2 mL 미세원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에서 0.75 mL의 실온 Histopaque 1077 위에 조심스럽게 덮어씌웠다. 샘플을 에펜도르프 (Eppendorf) 미세 원심분리기에서 16,000 x g에서 2 분간 원심분리 하였다. 계면 및 상층부를 제거하고, 차가운 둘베코(Dulbecco's) 인산 완충된 생리식염수 (DPBS) 1 mL를 함유하는 튜브에 첨가하였다. 이후, 이 샘플을 16,000 x g에서 30 초 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 완충액 상청액을 흡인 제거하고, 펠렛을 1 mL의 차가운 DPBS에 재현탁시켰다. 각 샘플로부터의 펠렛을 상기와 같이 재-펠렛화하였다. 완충액을 흡인 제거하고, 펠렛을 하기에 나타낸 바와 같이 용해시켰다.
완전한 용해 완충액은 Meso Scale Discovery Tris 용해 완충액, 1X Halt 프로테아제 억제제 칵테일, 1X 포스파타제 억제제 칵테일 2, 1X 포스파타제 억제제 칵테일 3, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드, 및 0.1 % 나트륨 도데실 설페이트로 구성되었다. 용해 완충액을 얼음 상에 유지시켜, 각 샘플 그룹에 대해 신선한 상태를 만들었다. 최종 세포 펠렛은 120 μL의 완전한 용해 완충액을 첨가하여 용해시켰다. 세포 펠렛이 사라질 때까지 샘플을 섞은 후(vortexed) 드라이아이스로 동결시켰다. 샘플은 ELISA에 의한 pRSK 및 총 RSK의 측정 전에 -20 ℃에서 보관하였다.
pRSK ELISA (PathScan)의 경우, 해동된 용해물을 시료 희석액 (ELISA 키트에서 제공됨)과 1:1로 조합시켰다: 120 μL의 용해물을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 120 μL의 시료 희석액에 첨가하였다. 그 후, 조합물을 pRSK 마이크로웰에 웰 당 100 μL로 옮겼다. 총 RSK ELISA (PathScan)의 경우, 샘플 희석액에서 이미 1:1로 희석된 용해물 20 μL를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 200 μL의 샘플 희석액으로 추가 희석시켰다. 그 후, 조합물을 웰 당 100 μL로 총 RSK 마이크로웰에 옮겼다. 플레이트를 플레이트 씰로 밀봉하고, 4 ℃에서 표적 단백질을 가장 잘 검출하는 것으로 나타난 시간인 16 내지 18 시간 동안 배양하였다. 두 ELISA는 키트 지침에 따라 개발되었습니다.
18 세 이상의 환자는 만약 이들이 치유불가능한(noncurable), 조직학적으로 확인된 전이성 또는 진행성 악성 종양; ECOG 성능 상태 0 또는 1; 적절한 신장, 간, 골수 및 심장 기능; 및 3 개월 이상의 평균 수명을 갖는 경우, 참여 자격이 있었다. 환자들은 전이성 질환에 대해 화학 요법의 2개 이하의 선험 라인(prior line)을 받을 수 있다. 제외 기준은 공지된 제어되지 않는 뇌 전이; 연구 약제의 흡수를 저해 할 수 있는 위장 장애; 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion) 또는 중심장액망막병(central serous retinopathy)의 과거 또는 현재의 징후(evidence)/위험; 및 CYP1A2, CYP2D6 및 CYP3A4의 강력한 억제제 또는 CYP3A4의 강력한 유도제로 알려진 약제의 병용 요법이었다. 모든 참가자는 연구 절차 시작 전에 사전 동의를 제공하였다.
BVD-523을 1 회 이상 투여받은 환자는 SAS (버전 9.3) 소프트웨어를 사용하는 분석에 포함시켰다. 데이터 컷오프는 2016 년 12 월 1 일이었다. 이 연구는 ClinicalTrials.gov, number NCT01781429에 등록되어 있다.
본 발명은 진행성 악성 종양 환자에서 BVD-523의 용량을 증가시키는 것에 대한 안전성, 약동학 및 약력학을 평가하기 위해 공개형(open-label), 다기관(multicenter) 제1 상 연구로부터의 데이터를 제시한다. 투약 요법은 진행성 고형 종양을 갖는 환자에서 BVD-523의 MTD 및 RP2D를 확인하기 위해 공동으로 사용 되는 가속화된 적정(accelerated titration) 및 표준 코호트 3 + 3 용량 증가 계획을 모두를 결합하였다. 치료 코호트 당 1 내지 6 명의 환자가 10mg BID의 용량으로 시작하여, 21 일 주기로 BID 일정 (12 시간 간격)으로 BVD-523의 순차적으로 더 높은 경구 용량을 할당받았다. BVD-523을 다음과 같은 용량으로 21 일 주기로 연속적으로 BID 투여하였다 : 10 mg (n = 1); 20 mg (n = 1); 40 mg (n = 1); 75 mg (n = 1); 150 mg (n = 1); 300 mg (n = 4); 600 mg (n = 7); 750 mg (n = 4); 및 900 mg (n = 7).
환자는 질병의 진행, 허용 불가능한 독성, 또는 다른 철회 기준을 만족시키는 임상적 관찰에 이르기까지 BID 경구 용량을 투여받았다. 용량 증가는 한 환자가 2 등급 이상의 독성 (탈모 또는 설사 제외)을 경험할 때까지 단일 환자 코호트에서 최대 100 % 증분되었다. 그 후 코호트를 각각 적어도 3 명의 환자로 확대시키고, 이후의 용량 증가 증분을 최대 100 %에서 최대 50 %까지 감소시켰다. 3 환자 코호트에서 적어도 1 명의 환자가 DLT를 경험했을 때, 최대 3 명의 추가 환자가 이러한 용량 수준으로 치료되었다. 6 명 이하의 환자에서 DLT가 1 건 이상 발생했을 때, 이러한 용량 수준을 용인되지 않는(nontolerated) 용량으로 정의하고 용량 증가를 중단하였다. 가장 높은 현재 용량을 투여 받은 환자를 최소 3 주 동안 관찰하고, 용량-제한 부작용이 주어진 용량을 할당받은 6 명 중 2 명 미만에서 보고되었다면, 환자내 용량 증가를 허용하였다. DLT 또는 허용되지 않는 독성을 겪고 있는 환자는 독성이 1 등급 이하로 회복될 때까지 치료를 중단하였다. BVD-523 치료의 재개는 시험되었던 수준의 다음의 더 낮은 용량 수준에서 또는 20 % 내지 30 % 용량 감소에서 시작되어, 캡슐 용량과 일치시켰다.
제1 상 연구의 주된 목표는 용량 제한 독성, MTD 및 RP2D를 결정하여 BVD-523의 안전성과 내약성을 정의하는 것이다. 부차적인 목표는 진행성 악성 종양 환자에서 BVD-523의 약동학 프로파일의 결정 및 RECIST v1.1을 사용한 물리적 또는 방사선 검사로 평가한 종양 반응에 대한 임의의 예비 임상 효과에 대한 조사를 포함하였다. 탐색적 목표는 약력학 마커 (biomarker) 측정법의 평가와 표시된 대로 18F-FDG-PET에 의해 평가된 종양 반응에 대한 예비 임상 효과의 조사를 포함하였다.
MTD, DLT 및 RP2D를 측정하기 위해, MTD를 치료의 첫 21 일 동안 환자 중 33 % 이하가 BVD-523 관련 DLT를 경험한 최고 용량 코호트로 정의하였다. DLT는 치료의 첫 21 일 중의 1 일 초과 동안 4 등급 이상의 혈액 독성: 합병증(예: 출혈이 있는 혈소판 감소증)을 동반한 3 등급의 혈액 독성; 메스꺼움, 구토, 변비, 통증 및 발진(적절한 치료에도 불구하고 AE가 지속되면 이들도 DLT가 된다)을 제외한 3 등급 이상의 비-혈액학적 독성; 또는 BVD-523 관련 독성으로 인한 사이클 1에서 3일을 초과하는 치료 중단(또는 사이클 2가 7 일 넘게 지속될 수 없는 경우)을 초래하는 BVD 관련 독성으로 정의하였다.
RP2D는 MTD 만큼 높을 수 있으며, 임상 연구자, 의료용 모니터 및 스폰서의 의견을 토대로 결정되었다. 약동학, 약력학 및 다중 사이클 후에 관찰된 누적된 독성과 관련된 관찰이 RP2D를 뒷받침하는 근거에 포함되었다.
안전성 평가와 관련하여, AE는 반드시 BVD-523과 인과관계를 갖는 것은 아닌 의약품을 투여받은 환자에서의 임의의 바람직하지 않은 의료 사건(untoward medical occurrence)으로 정의되고, MedDRA 코딩 사전을 사용하여 코딩되었다. SAE는 사망을 초래하거나, 생명을 위협하거나, 입원 환자의 병원 입원(inpatient hospitalization) 또는 기존 입원 기간의 연장을 요구하거나; 지속적 또는 현저한 장애/무능력 또는 선천적인 기형/출생 결함을 초래한 모든 용량에서 발생하는 바람직하지 않은 의료 사건이다. AE의 중증도는 the National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events, Grading Scale, version 4에 따라 등급이 매겨졌다.
안전성 평가는 3주 마다 또는 그후로 임상적으로 지시된 경우, 치료를 계속한 환자에서 8, 15, 22, 29, 36, 43 일째에 기준선에서 수행되었다. 각 평가에는 신체 검사와 임상 검사가 포함되었다. 임상 적으로 의미가 있고 조사자의 재량에 따라 심전도를 반복하였다. 조사관은 AE가 연구 약물과 관련이 있는지 여부를 판단하고, 해결 또는 안정화될 때까지 추적 조사를 실시하거나, AE가 더 이상 임상적으로 중요하지 않다고 판단하였다.
약동학 분석에서, 약동학 집단은 BVD-523을 1 회 이상 투여받고, 혈장 및/또는 소변에 대한 평가 가능한 약동학 데이터를 갖는 환자들로 구성되었다. 혈액 샘플은 투약하기 전, 그리고 나서 1일 째 (방문 2, 치료의 기준선/개시) 및 15일 째 (방문 4; 안정 상태)에 아침 투약 이후 0.5 (± 5 분), 1 (± 5 분), 2 (± 10 분), 4 (± 10 분), 6 (± 10 분), 8 (± 10 분), 및 12 (± 2 시간) 시간에 수집하였다. 22 일째, 투약 전, 최종 혈액 샘플을 약동학 분석을 위해 수집하였다. 소변 샘플은 예비 투여(predose)시 및 1 일 및 15 일 째에 투약 후 1 내지 6 시간 및 6 내지 12 시간 ± 2 시간 간격으로 수집하였다. 검증된 LC/MS/MS 방법을 사용하여 BVD-523 및 대사 산물에 대한 혈장 및 소변 샘플을 분석하였다. 비구획적 방법(noncompartmental method)으로 Phoenix WinNonlin (Pharsight)을 사용하여 표준 약동학 파라미터를 얻었다. 용량 및 노출량(exposure) 사이의 관계는 표준 최소 자승 회귀 분석을 사용하여 계산하였다.
BVD-523에 의한 표적 억제의 약동학적 확인을 위해, BVD-523에 의한 표적화 된 ERK 억제를, 제1 상 연구 동안에 상이한 용량의 BVD-523 (10-900 mg BID)를 투여받은 진행성 고형 종양 (N = 27)을 갖는 환자로부터 수득한 인간 전혈 샘플에서 표적 바이오마커로서 pRSK를 검사하여 측정하였다. 4개 시점 (예비 투여 기준선 (baseline predose), 투여 후 4 시간 기준선 (baseline 4 hours postdose), 15일 째 예비 투여 (Day 15 predose); 및 15일 째 투여 후 4 시간 (Day 15 4 hours postdose))으로부터의 BVD-523 활성은 BVD-523으로 배양된 PMA-자극된 혈액의 백분율 활성 (pRSK)으로 표현하였다.
항 종양 반응의 측정을 위해, 종양 측정은 기준선에서 발생한 신체 검사 및 각 치료 사이클의 첫 날에 근거하였다. CT 및 기타 평가는 2 내지 3 사이클마다 이루어졌다. 결과는 RECIST v1.1에 따라 평가되었다: CR은 모든 표적 병변의 소실로 정의되었다; PR은 기준선 측정을 참조로 하여, 표적 병변의 가장 긴 직경의 합계가 30 % 이상 감소한 것으로 정의되었다; 안정된 질환은 기준선 측정을 참조로 하여, PR에 대한 자격을 갖추기에 충분한 수축이 아니고, 진행성 질환에 대한 자격을 갖추기에 충분한 증가가 아닌 것으로 정의되었다. 대사 반응은 BVD-523의 첫 번째 용량을 투여하기 전 및 15일 째 (방문 4)에 18F-FDG-PET 스캐닝을 통해 18F-포도당의 종양 흡수를 시각화하여 평가되었다.
실시예 2
용량 증가 및 증식 분석 - 1 개월 째
용량 증가 진행 - 1 개월 째
A375 세포는 BVD-523, 다브라페닙 및 트라메티닙을 단일 약제로 사용하거나 또는 조합하여 사용하여 용량을 증가시켰다. 첫 달 동안 용량은 작은 증분(small increment)으로 증가시켰다. 성장률에서의 현저한 감소 외에, 세포는 일반적으로 용량 증가를 잘 견뎠고, 용량은 2 개월 째에 보다 큰 증분을 사용하여 보다 적극적으로 증가시키기로 계획되었다. 도 1a - 도 1c는 용량 증가 연구에 대한 1 개월 째의 진행을 보여준다.
증식 분석 결과 - 1 개월 째
BVD-523, 다브라페닙 및 트라메티닙 치료에 대한 증가된 세포주 대 부모 세포주의 반응을 평가하기 위해 증식 분석을 수행하였다.
도 2a - 도 2h는 연구 1 개월 째의 정규화된(nomalized) 및 로우 증식 분석 결과를 나타낸다. 상이한 치료 (도 2d, 도 2f 및 도 2h) 간의 DMSO 대조군에서의 최대 신호의 차이는 치료 간의 상이한 성장 속도를 시사함에 주목한다. 이러한 차이는 증식 분석에서 억제제에 대한 세포주의 반응에 영향을 줄 수 있다
표 10은 연구의 1 개월 째의 IC50 데이터를 보여준다.
표 10 - IC50 데이터 - 1개월 째
Figure pat00041
* Par= 부모 세포주
다브라페닙 또는 트라메티닙 단일 약제 또는 병용의 용량 증가 존재 하에서 성장한 세포가 증식 분석에서 이들 두 약제에 대한 감소된 반응을 나타낸다는 초기 암시가 있었다.
2 개월 째의 초기 단계에서, 다브라페닙 단독 치료에서의 세포 성장률이 1 개월 째의 초기 단계에 비해 현저히 증가하였다. 이는 진행 속도의 증가를 가능하게 했고, 내성이 분명해짐을 시사하였다.
실시예 3
용량 단계적 상승(escalation) 및 증식 검정 - 2개월째
용량 단계적 상승 진행 - 2개월째
연구 2개월째에 대부분의 치료가 초기의 완만한 단계적 상승 페이즈와 비교하여 용량이 더 큰 증분(increment)(1.5배)으로 증가된 페이즈(phase)로 이동하는 것을 알았다. 다브라페닙 및 트라메티닙의 단일 제제 단계적 상승은 100x 모 세포 IC50과 동등한 농도로 성장하는 세포가 가장 빨랐다(도 3a 및 도 3b). BVD-523의 단일 제제 단계적 상승은 다브라페닙 및 트라메티닙과 비교하여 더 서서히 진행되었다(도 3c). 단일 제제 단계적 상승의 비교에 관해서는 도 3d를 참조한다. BVD-523 단계적 상승된 세포는 보다 "취약한" 외형을 가졌고 다브라페닙 및 트라메티닙 단계적 상승된 집단과 비교하여 더 많은 수의 부유(floating) 세포가 존재하였다.
조합된 제제 단계적 상승은 단일 제제 처리보다 더 서서히 진행되었다. BVD-523/트라베티닙 조합은 세포가 진행되는 것을 예방하는데 특히 효과적이었다.
증식 검정 결과 - 2개월째
단일 제제 단계적 상승된 다브라페닙 및 트라메티닙 세포 집단에 대한 증식 검정은 용량 반응 곡선에서 완만한 변화(shift)를 나타냈고, 이는 추가적 기간의 단계적 상승은 내성 세포를 더 농축시키는데 유익할 것임을 시사한다. 흥미롭게도, 증식 검정에서, BVD-523에 노출된 세포는 억제제 중단(withdrawal)시 잘 성장하지 않고, 이는 중독 수준을 나타낼 수도 있음을 시사하는 증거가 있었다.
도 4a 내지 도 4h는 연구 2개월째로부터의 정규화된 로우(raw) 증식 검정 결과를 보여준다. 상이한 치료제들(도 4d, 도 4f 및 도 4h) 사이에 DMSO 대조군에서의 최대 신호 차이가 치료제들 사이의 상이한 성장 속도를 시사함에 주목한다. 이들 차이는 증식 검정에서 억제제에 대한 세포주의 반응에 영향을 미칠 수 있다.
도 5a 내지 도 5h는 모세포주 및 BVD-523 세포주 데이터에만 초점을 맞춘 연구 2개월째로부터의 정규화된 로우 증식 검정 결과를 보여준다.
표 11은 연구 2개월째에 관한 IC50 데이터를 보여준다. 상대적 IC50은 프리즘(Prism)에서의 4-매개변수 곡선 맞춤으로부터 결정되었다.
표 11 IC50 데이터 - 2개월째
Figure pat00042
실시예 4
용량 단계적 상승 및 증식 검정 - 3개월째
용량 단계적 상승 진행 - 3개월째
도 6a 내지 도 6c는 연구 3개월째에 관한 단일 및 조합 제제 단계적 상승을 보여준다. 도 6d는 단일 제제 단계적 상승의 비교를 보여준다.
증식 검정 결과 - 3개월째
도 7은 DMSO 대조군 웰에서의 증식 검정 동안의 성장의 평가를 보여준다. 도 8a 내지 도 8d는 연구 3개월째로부터의 결과를 보여준다. 도 9a 내지 도 9d는 단일 치료 세포주에 초점을 맞춘 연구 3개월째로부터의 결과를 보여준다.
표 12는 연구 3개월째에 관한 IC50 데이터를 보여준다. 상대적 IC50은 프리즘에서의 4-매개변수 곡선 맞춤으로부터 결정되었다. 트라메티닙이 단계적 상승된 세포주에 대해서는 검정 동안 성장의 결여로 인하여 IC50 값이 측정되지 않았다(ND: 실행되지 않음).
표 12 IC50 데이터 - 3개월째
Figure pat00043
도 19는 연구 3개월째에 관한 단일 및 조합 제제 단계적 상승을 보여준다. 모 A375 세포에서 이들 제제의 IC50의 100배 초과의 농도로의 다브라페닙 또는 트라베티닙의 존재 하에 성장할 수 있는 세포주 변이체가 수득되었다. 대조적으로, BVD-523에 대해 내성인 세포주는 모세포 IC50 농도의 10X 미만에서만 유지될 수 있다. 민감성 시험은 다브라페닙 및 트라메티닙-내성 세포주가 BVD-523에 대해 상대적으로 민감성을 유지하였고; 내성 세포주에서 BVD-523에 대한 증가된 IC50 "변화"는 다브라페닙 또는 트라메티닙 치료에 따른 이들 상응하는 IC50 증가보다 더 완만하였음을 시사하였다. 유사하게, 다브라페닙 또는 트라메티닙 치료와 비교하여, 내성 세포주가 모 A375 세포주에서 이의 IC50의 10배 초과의 농도로의 BVD-523으로 치료된 경우에 세포 성장의 보다 완전한 억제가 관찰되었다. 전체적으로, 내성 및 교차-민감성의 패턴은 BVD-523이 획득된 내성의 설정에서 효과적임을 유지할 수 있음을 시사한다.
실시예 5
조합 연구 결과
예상한 바와 같이, BRAF(V600E) 돌연변이를 지닌 A375 세포는 다브라페닙에 대해 민감성이었다. 알라마 블루(Alamar Blue)를 이용하여 계산된 단일 제제 IC50 값(도 10a 내지 도 10e, 도 12a 내지 도 12e 및 도 14a 내지 도 14e)은 일반적으로 CellTiter-Glo를 이용하여 유도된 값(도 11a 내지 도 11e, 도 13a 내지 도 13e 및 도 15a 내지 도 15e)들과 비교하여 다브라페닙 및 BVD-523에 대해 약간 더 낮았다. 72시간 CellTiter-Glo 검정에서 다브라페닙 및 트라메티닙에 관한 공개된 IC50 값은 각각 28 ± 16nM 및 5 ± 3nM이었다(Greger et al., 2012; King et al., 2013) - 여기에 보고된 단일 제제 결과는 이들 값과 일치한다. 모든 치료에서 상승작용(synergy)의 윈도우(window)에 대한 몇몇의 증거가 존재하였다. 삼중 실험 사이의 편차는 낮았지만, 무 약물 대조군에 비해 일부 치료에서 관찰된 분명한(예를 들면, 트라메티닙/BVD-523 조합에서 특히 분명한) 향상된 성장을 설명할 가능성이 있는 에지(edge) 효과의 몇몇의 증거가 존재하였다. 이는 일부 치료에서 상승작용의 수준의 인공적인 향상을 초래할 수 있었으므로 블리스(Bliss) 분석의 해석을 더 힘들게 한다.
A375 세포에 대해 조합 검정을 반복하였다. 단일 제제 BVD-523, 트라메티닙 및 다브라페닙 효력은 본원에 개시된 이전 연구에서 보고된 효력과 일치하였다.
요약하면, 종합하여 데이터는 MEK 및 BRAF 내성 세포가 ERK 억제제인 BVD-523을 이용한 치료에 의해 극복될 수 있음을 보여준다.
실시예 6
MAPK 키나제 활성 및 이펙터 기능의 BVD-523 변경된 마커
웨스턴 블롯 연구를 위해, HCT116 세포(5 x 106)를 McCoy's 5A + 10% FBS의 10cm 디쉬에 씨딩하였다. A375 세포(2.5 x 106)를 DMEM + 10% FBS의 10cm 디쉬에 씨딩하였다. 명시된 양의 시험 화합물(BVD-523) 또는 비히클 대조군을 부가하기 전에 세포를 밤새 부착되도록 하였다. 하기에 구체화되는 바와 같이 전체 세포 단백질 용해물을 단리하기 전에 세포를 4시간 또는 24시간 동안 처리하였다. 세포를 트립신처리(trypsinisation)에 의해 수확하였고, 펠렛화(pelleted)하고, 스냅 동결시켰다(snap frozen). 용해물은 RIPA(Radio-Immunoprecipitation Assay: 방사선-면역침전 검정) 완충액을 이용하여 조제하였고, 원심분리에 의해 청징화하였고, 바이신코닉산 검정(BCA: bicinchoninic acid assay)에 의해 정량하였다. 20 내지 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 해상하였고, PVDF 멤브레인에 블롯팅하였고, 하기 표 13(4시간 처리) 및 표 14(24시간 처리)에 상술한 항체를 이용하여 프로빙하였다.
표 13 항체 상세설명
Figure pat00044
표 14 항체 상세설명
Figure pat00045
도 16a 내지 도 16d, 도 17a 내지 도 17d, 및 도 18a 내지 도 18d는 하기에 대한 각종 농도의 BVD-523을 이용하여 치료한 세포의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다: 1) 4시간 후 A375 세포 내의 MAPK 신호전달 구성원; 2) 각종 양의 BVD-523을 이용한 A375 24시간 치료에서의 세포 주기 및 아폽토시스 신호전달; 및 3) 4시간 동안 치료한 HCT-116 세포에서의 MAPK 신호전달. 그 결과는 시험관내에서 RAF 및 RAS 돌연변이체 암 세포에서 BVD-523을 이용한 급성 및 연장된 치료가 기질 인산화 및 ERK 키나제의 이펙터 표적 둘 다에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 이들 변화를 유도하는데 요구되는 BVD-523의 농도는 전형적으로 저 마이크로몰(μM) 범위 내이다.
몇몇의 비활성(specific activity) 마커의 변화는 주목할 만하다. 우선, BVD-523 치료 후 서서히 이동하는 ERK 키나제의 이소형의 존재도(abundance)가 증가하고; 완만한 변화가 급성으로 관찰될 수 있고, 연장된 치료 후에도 증가한다. 이는 효소적으로 활성인 인산화된 형태의 ERK의 증가를 나타낼 수 있지만, ERK에 의한 직접적 및 간접적 조절 둘 다를 행한 다수의 단백질이 BVD-523 치료 후에 "오프(off)"로 남아 있다는 것은 여전히 주목할 만하다. 첫째, RSK1/2 단백질은 단백질 변형을 위해 ERK에 엄격하게 의존하는 잔기에서 감소된 인산화를 나타낸다(T359/S363). 둘째, BVD-523 치료는 MAPK 피드백 포스파타제, DUSP6에서의 복잡한 변화를 유도한다: 급성 치료 후에 서서히 이동하는 단백질 이소형은 감소되지만, 총 단백질 수준은 연장된 BVD-523 치료 후에 크게 감소된다. 이들 발견 둘 다는 ERK 키나제의 감소된 활성과 일치하고, 이는 번역-후 및 전사 메커니즘 둘 다를 통해 DUSP6 기능을 제어한다. 전반적으로, 전형적으로 활성인 것으로 생각되는 세포 형태의 ERK의 증가에도 불구하고, 세포 ERK 효소 활성은 BVD-523을 이용한 급성 또는 연장된 치료 후에 완전히 억제될 가능성이 있는 것으로 밝혀진다.
이들 관찰과 일치하여, MAPK 경로 신호전달을 필요로 하는 이펙터 유전자는 BVD-523을 이용한 치료 후에 변경된다. G1/S 세포-주기 장치는 MAPK 신호전달에 의해 번역-후 및 전사 수준 둘 다에서 조절되고, 사이클린-D1 단백질 수준은 연장된 BVD-523 치료 후에 크게 감소한다. 유사하게, 아폽토시스 이펙터의 단백질 존재도 및 유전자 발현은 흔히 온전한(intact) MAPK 신호전달을 요구하고, Bim-EL의 전체 수준은 연장된 BVD-523 치료 후에 증가한다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, PARP 단백질 절단 및 증가된 아폽토시스는 A375 세포 백그라운드에서 주목되지 않았고; 이는 추가의 인자들이 BVD-523/ERK-의존적 이펙터 신호전달의 변화가 세포 사멸 및 세포 주기 정지와 같은 결정적인 사건으로 번역되는지 여부에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
BVD-523의 세포 활성과 일치하여, 마커 분석은 ERK 억제가 암 세포에서의 각종 분자 신호전달 사건을 변경시켜 이들을 감소된 세포 증식 및 생존 둘 다에 감수성이 되게 함을 시사한다.
요약하면, 도 16a 내지 도 16d, 도 17a 내지 도 17d 및 도 18a 내지 도 18d는 BVD-523이 MAPK 신호전달 경로를 억제하고 이러한 설정에서 RAF 또는 MEK 억제와 비교하여 보다 유리할 수 있음을 보여준다.
마지막으로, BVD-523의 특성은 이를 유사한 활성을 갖는 다른 제제와 비교하여 ERK 억제제로서 사용하기에 바람직한 제제로 만들 수 있다. 키나제 억제제 약물은 이들의 효소 표적과의 고유하고 특이적인 상호작용을 나타내고, 약물 효능은 직접적 억제 방식뿐만 아니라 치료 후에 발생하는 적응성 변화에 대한 감수성 둘 다에 의해 크게 영향을 받는다는 것이 공지되어 있다. 예를 들면, ABL, KIT, EGFR 및 ALK 키나제의 억제제는 이들의 동족(cognate) 표적이 활성 또는 불활성 입체배치(configuration)에서 발견되는 경우에만 효과적이다. 마찬가지로, 소정의 이들 억제제는 단백질 표적의 2차 유전적 돌연변이 또는 번역-후 적응성 변화 중 어느 하나에 고유하게 민감성이다. 마지막으로, RAF 억제제는 소정 단백질 복합체 및/또는 준세포 국재화(subcellular localization)에 존재하는 RAF 키나제에 대해 상이한 효력을 나타낸다. 요약하면, ERK 키나제가 마찬가지로 다양하고 가변성이며 복잡한 생화학적 상태로 존재하는 것으로 공지되어 있으므로, BVD-523은 다른 제제와 별개이고 고도로 바람직한 방식으로 이들 표적과 상호작용하고 이들 표적을 억제할 수 있을 가능성이 있는 것으로 밝혀진다.
실시예 7
생존력 및 MAPK 신호전달에 대한 BVD-523 및 표준(benchmark) ERK BRAF 및 MEK 억제제의 영향
단일 제제 증식 검정
세포를 10% FBS을 함유하는 McCoy's 5A에 표 15에 표시된 밀도로 96웰 플레이트에 씨딩하였고, 화합물 또는 비히클 대조군을 부가하기 전에 세포를 밤새 부착되도록 하였다. 화합물은 DMSO 스톡으로부터 조제하여 원하는 최종 농도로 제공하였다. 최종 DMSO 농도는 0.1%로 일정하였다. 시험 화합물을 습윤화된 분위기에서 37℃, 5% CO2에서 96h 동안 상기 세포와 함께 인큐베이션하였다. CellTiter-Glo® 시약(Promega, Madison, WI)을 제조업자의 지침에 따라 부가하였고, BMG FLUOstar 플레이트 판독기(BMG Labtech, Ortenberg, Germany)를 이용하여 발광성을 검출하였다. 평균 배지 전용 백그라운드 값을 감하고 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA)에서 4-매개변수 로지스틱 방정식(logistic equation)을 이용하여 데이터를 분석하였다.
조합 증식 검정
세포를 10% FBS을 함유하는 McCoy's 5A에 표 15에 표시된 밀도로 96웰 플레이트에 삼중으로 씨딩하였고, 시험 화합물 또는 비히클 대조군을 부가하기 전에 세포를 밤새 부착되도록 하였다. 10x8 용량 매트릭스를 이용하여 조합을 시험하였다. 최종 DMSO 농도는 0.2%에서 일정하였다.
시험 화합물을 습윤화된 분위기에서 37℃, 5% CO2에서 96h 동안 상기 세포와 함께 인큐베이션하였다. 회흐스트(Hoechst) 염색으로 세포를 염색하였고, 상기 기술된 바와 같이 형광성을 검출하였다. 평균 배지 전용 백그라운드 값을 감하고 데이터를 분석하였다.
용량 매트릭스에 걸친 조합 상호작용은 사용자 매뉴얼(chalice.horizondiscovery.com/chalice-portal/documentation/analyzer/home.jsp에서 입수가능함)에 개요되어 있는 바와 같이 Chalice™ 조합 분석 소프트웨어(Horizon Discovery Group, Cambridge, MA)를 이용하여 로에베 가산성(Loewe Additivity) 및 블리스 독립 모델에 의해 측정되었다. 상승작용은 가산성에 대해 예측된 값과 각각의 조합점에서 실험적으로 관찰된 수준의 억제를 비교함으로써 측정되고, 이는 매트릭스의 에지(edge)에 따른 단일-제제 반응으로부터 유도된다. 잠재적인 상승작용적 상호작용은 예측된 것을 초과하는 계산된 과량의 억제를 용량 매트릭스에 걸친 히트 맵으로서 부가제로 표시함으로써 그리고 로에베 모델에 기초하여 정량적 "상승작용 점수'를 보고함으로써 확인되었다. 조합 검정 플레이트로부터 유도된 단일 제제 데이터는 Chalice™에서 생성된 용량-반응 국선으로서 제시되었다.
표 15 세포주 씨딩 밀도
Figure pat00046
웨스턴 블롯팅
세포를 10% FBS을 함유하는 McCoy's 5A에 표 15에 표시된 밀도로 6웰 플레이트(실험 1) 또는 10cm 디쉬(실험 2)에 씨딩하였고, 화합물 또는 비히클 대조군을 부가하기 전에 세포를 밤새 부착되도록 하였다. 시험 화합물을 부가하였고, 습윤화된 분위기에서 37℃, 5% CO2에서 4 또는 24h 동안 상기 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 트립신처리에 의해 수확하였고, 원심분리에 의해 펠렛화하였고, 드라이 아이스 상에서 스냅 동결시켰다.
용해물은 RIPA 완충액(50mM Tris-하이드로클로라이드, pH 8.0; 150mM 나트륨 클로라이드; 1.0% Igepal CA-630(NP-40); 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트; 0.1% ㄴ나나트륨 도데실 설페이트; 1x완전 EDTA-불포함 프로테아제 억제제 칵테일(Roche, Nutley, NJ; cat 05 892 791 001); 1xphosSTOP 포스파타제 억제제 칵테일(Roche, Nutley, NJ; cat. 04 906 837 001))을 이용하여 조제하였고, 벤치-탑(bench-top) 원심분리기에서 10분 동안 11,000rpm으로의 원심분리에 의해 청징화하였다.
용해물 중의 전체 단백질은 제조업자의 지침(Pierce™, BCA 단백질 검정 키트; Thermo Scientific, Waltham, MA; cat/ 23225)에 따라 BCA 검정에 의해 정량하였고 샘플 완충액(NuPAGE LDS 샘플 완충액; (Invitrogen, Carlsbad, CA; cat. NP0007))에서 끓였고 -80℃에서 보관하였다.
등량의 단백질(40μg)을 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA; cat. WG1402BOX) 상에 해상하였고, 제조업자의 지침에 따라 iBlot 겔 전달 장치(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 iBlot 겔 전달 스택(stack)(Invitrogen Carlsbad, CA; cat. IB4010-01)을 사용하여 PVDF 멤브레인 상에 블롯팅하였다.
블롯은 표 16에 상술한 항체 및 차단 조건을 이용하여 프로빙하였다. 웨스턴 블롯은 Pierce™ ECL2 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Scientific, Waltham, MA; cat. 80196)을 이용하여 전개시켰고, FluorChem M 웨스턴 블롯 이미저(imager)(ProteinSimple, San Jose, CA)를 이용하여 촬상하였다.
표 16 항체 및 웨스턴 블롯팅 조건
Figure pat00047
MEK1(Q56P) 돌연변이는 MAPK 경로를 상향-조절하고 BRAF 또는 MEK 억제제에 대한 획득된 내성을 유도하는 것으로 공지되어 있는 임상학적으로 관련된 MEK1/2 활성화 돌연변이의 한 부류를 예시한다.
이러한 연구는 MEK1(Q56P) 활성화 돌연변이의 존재 또는 부재에 대해 동질유전자인 1쌍의 RKO BRAF(V600E) 세포주를 사용하여 활성화 MEK 돌연변이가 신규한 ERK 억제제 BVD-523 대 다른 벤치마크 MAPK 억제제에 반응하여 생기는 영향을 평가하였다.
세포 생존력에 대한 영향은 96h 후에 CellTiter-Glo®를 이용하여 세포 ATP 수준을 정량함으로써 평가하였다. 단일 제제 검정은 이중 돌연변이 BRAF(V600E)::MEK1(Q56P) 세포가 모 BRAF(V600E) 세포에 비하여 벤치마크 임상학적 BRAF(다브라페닙에 의해 예시됨) 또는 MEK(트라메티닙에 의해 예시됨) 억제제를 이용한 억제에 대해 현저히 감소된 민감성을 나타냈음을 입증하였고, 이는 진료소에서 이러한 부류의 돌연변이와 관련된 것으로 공지되어 있는 획득된 내성을 재현하기 위한 이러한 동질유전자 모델의 적합성을 입증한다(표 17).
표 17 단일 제제 IC50 값
Figure pat00048
대조적으로, BVD-523에 대한 반응은 모세포 및 이중 돌연변이 세포 둘 다에서 동일하였고, 이는 BVD-523이 획득된 내성의 이러한 메커니즘에 대해 감수성이 아님을 나타낸다.
이들 결과는 2개의 독립적으로 유도된 이중 돌연변이 BRAF(V600E)::MEK1(Q56P) 세포주 클론에서 동일하였고, 이는 모세포에 대한 이들 반응의 차이는 관련되어 있지 않은 클론 인공물보다 오히려 MEK1 돌연변이의 존재에 구체적으로 관련되어 있음을 확인시켜 준다(도 22a 내지 도 22e). 또한, 제2 기계론적으로 구별되는 벤치마크 ERK 억제제(SCH772984)를 이용하여 유사한 결과가 관찰되었고, 이는 이들 관찰이 특히 ERK의 억제와 관련되어 있고 오프-표적(off-target) 효과로 인한 것이 아니라는 개념을 지지한다.
BVD-523을 BRAF 억제제(다브라페닙에 의해 예시됨)와 조합하는 것의 효과는 또한 Horizon의 Chalice™ 조합 분석 소프트웨어와 함께 로에베 가산성 또는 블리스 독립 모델을 이용하여 농도의 매트릭스에 걸쳐 이들 세포주에서 평가하였다(도 23 내지 도 23o 및 도 24 내지 도 24o). 이어서, 잠재적으로 상승작용적인 상호작용의 존재는 예측된 것을 초과하는 계산된 과량의 억제를 히트 맵으로서 용량 매트릭스에 걸친 부가제로 표시함으로써 그리고 조합에 대한 전체 반응이 상승작용적(양의 값), 길항작용적(음의 값) 또는 부가적(약 0)인지 여부를 나타내는 '용적 점수'로서 계산함으로써 평가하였다.
해당 결과는 BVD-523::다브라페닙 조합이 주로 모세포주 및 돌연변이 세포주에서 부가적이었음을 시사한다. 대조적으로, MEK 억제제(트라메티닙) + 다브라페닙의 조합은 대부분 모세포주에서 부가적이면서 이중 돌연변이체 BRAF(V600E)::MEK1(Q56P) 세포주에서 강한 상승작용을 나타냈다(도 25a 내지 도 25o). 시험된 조합들에 대한 로에베 용적, 블리스 용적 및 상승작용 점수는 각각 표 18 내지 표 20에 나타내고, 도 26a 내지 도 26c에 그래프로 나타낸다.
표 18 로에베 용적
Figure pat00049
표 19 블리스 용적
Figure pat00050
표 20 상승작용 점수
Figure pat00051
MAPK 경로에 대한 신호적 영향을 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다. 기저 ERK 인산화(DMSO 샘플의 수준은 모세포주에 비해 MEK1(Q56P)-발현 세포주에서 현저하게 상향-조절되어 이러한 동질유전자 모델이 MEK 활성화 획득된 내성 돌연변이의 발현에 대해 예측된 표현형을 충실하게 재현함을 추가로 확인하였다.
모 BRAF(V600E) RKO 세포에서, 약리학적 활성 농도의 RAF, MEK 및 ERK 키나제 억제제제를 이용한 급성 치료 후에 RSK1/2 인산화의 감소된 수준이 관찰되었다. 대조적으로 동질유전자 이중 돌연변이체 BRAFV600E::MEK1Q56P 세포는 BRAF 또는 MEK 억제제 치료 후 감소된 RSK 인산화를 나타내지 않고, 한편 BVD-523은 유사한 농도에서 여젼히 효과적이다(도 27a 내지 도 27i). 점선은 트라메티닙-치료된 샘플(+ 매칭된 DMSO 대조군) 및 블롯이 BRAFi 및 BVD-523 치료된 샘플에 대한 별도의 실험으로부터 유도됨을 나타낸다.
세포 성장 억제 패턴과 일치하는 이펙터 유전자 신호전달의 변화는 연장된 억제제 치료 후에 관찰된다. 모 RKO 세포주에서, 인산화된 pRB의 감소된 수준은 연장된 MEK 및 ERK 억제제 치료 후에 관찰된다. pRB 조절 수준에서, MEK1 돌연변이체 세포주는 저농도 MEK 억제제 치료에 대해 비민감성인 것으로 밝혀지고, 한편 보다 높은 농도는 여전히 효과적이다. 결정적으로, pRB 활성에 대한 BVD-523 효력은 MEK 돌연변이에 의해 강하게 영향을 받지 않는 것으로 밝혀진다. 놀랍게도, RAF 억제제 치료는 업스트림 신호전달의 강력한 억제에도 불구하고 모세포 및 MEK 돌연변이체 백그라운드 둘 다에서 pRB 상태에 영향을 미치지 않는다.
요약하면, 이들 결과는 BVD-523이 MEK1(Q56P)과 같은 MEK 활성화 돌연변이에 의해 유도된 획득된 내성에 대해 감수성이 아님을 보여준다. 또한, 이들은 BVD-523과 BRAFi(다브라페닙에 의해 예시됨) 사이의 상호작용과 조합하여 MEK 활성화 돌연변이의 존재와 관계없이 부가적임을 시사한다.
실시예 8
ERK 억제제들 사이의 조합 상호작용
RAF 돌연변이체 흑색종 세포주 A375 세포를 10% FBS를 갖는 DMEM에서 배양하였고, 96-웰 플레이트에 2000개 세포/웰의 초기 밀도로 삼중으로 씨딩하였다. 실시예 4에 상기 기술된 바와 같이 72시간 후에 ERK 억제제 BVD-523과 SCH772984 사이의 조합 상호작용을 분석하였다. 제조업자의 지침에 따라 CellTiter-Glo® 시약(Promega, Madison, WI)을 이용하여 생존력을 측정하였고 BMG FLUOstar 플레이트 판독기(BMG Labtech, Ortenberg, Germany)를 이용하여 발광성을 검출하였다.
로에베 및 블리스 '과량 억제' 히트 맵의 가시화는 BVD-523 및 SCH772984의 조합이 중간-범위 용량에서 잠재적인 상승작용의 윈도우를 이용하여 주로 부가적이었음을 시사하였다(도 28a 내지 도 28e).
요약하면, 이들 결과는 BVD-523과 SCH772984 사이의 상호작용이 적어도 부가적이고 몇몇의 경우에는 상승작용적임을 시사한다.
실시예 9
암에서의 MAPK 신호전달 경로의 표적화: 신규한 선택적 ERK1/2 억제제 BVD-523(울릭세르티닙)을 이용한 유망한 활성
암에 대한 치료 전략은 종양 증식 및 생존에 필수적인 비정상적 신호전달을 유도하는 유전적 병변의 영향에 대응하는 제제에 대한 전형적인 세포독성-기반 접근법으로부터 발전하였다. 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 신호전달 캐스케이드(RAS-RAF-MEK-ERK)(Cargnello and Rouxx 2011)의 ERK 모듈은 RAS 및 BRAF와 같은 경로 구성원의 구성적으로 활성화된 돌연변이 이외에도 몇몇의 수용체 티로신 키나제(예를 들면, EGFR 및 ErbB-2)와 결합될 수 있다(Gollob et al. 2006). ERK 신호전달의 비정상적 활성화를 통해, RAS 또는 BRAF에서의 유전적 변화는 신속한 종양 성장, 증가된 세포 생존 및 아폽토시스에 대한 내성을 초래한다(Poulikakos et al. 2011, Corcoran et al. 2010, Nazarian et al. 2010, Shi et al. 2014, Wagle et al. 2011). RAS 패밀리 구성원 KRAS 및 NRAS의 활성화 돌연변이는 모든 사람 암의 약 30%에서 발견되고, 특히 췌장(Kanda et al. 2012)과 결장직장암((Arrington et al. 2014)에서 높은 발생률로 발견된다. 보통 아미노산 600의 발린을 암호화하는 BRAF 유전자의 구성적 활성화 돌연변이는 흑색종, 갑상선 암종, 결장직장암 및 비-소세포 폐암에서 관찰되었다(Hall et al. 2014). 다운스트림 구성원 ERK 및 MEK의 변화를 초래하는 유전적 돌연변이를 지닌 암도 보고되어 있다(Ojesina et al. 2014, Arcila et al. 2015). MAPK 경로를 활성화시키는 변경은 또한 표적화된 치료법에 대한 내성의 설정에서 일반적이다(Groenendijk et al. 2014). 따라서, MAPK 경로 말단 마스터 키나제(ERK1/2)의 표적화는 이러한 경로 활성화 변경(예를 들면, BRAF, NRAS 및 KRAS)을 갖는 종양에 대한 유망한 전략이다.
BRAF V600 돌연변이를 갖는 절제불가능 또는 전이성 피부 흑색종의 단일-제제 치료를 위한 3종의 MAPK 경로-표적화 약물: BRAF 억제제들 베무라페닙 및 다브라페닙 및 MEK 억제제 트라메티닙이 미국 식약청(FDA: Food and Drug Administration)에 의해 승인되어 있다. 또한, 다브라페닙 및 트라메티닙의 조합도 이러한 징후에서 승인되어 있다(Queirolo et al. 2015 and Massey et al. 2015). 추가의 MEK 억제제 코비메티닙은 이러한 징후에서 BRAF 억제제와의 조합 용법의 일부로서 승인되어 있다. 이들 약물을 이용한 임상학적 경험은 MAPK 경로를 치료학적 표적으로서 입증한다. BRAF V600-돌연변이체 흑색종을 지닌 환자의 페이즈 III 시험에서, 단일 제제 베무라페닙 및 다브라페닙은 세포독성 화학치료법(다카르바진)에 비해 우수한 반응률(대략 50% 대 5 내지 19%) 및 중간값 무진행 생존(PFS, 5.1 내지 5.3개월 대 1.6 내지 2.7개월)을 입증하였다(Chapman et al. 2011 and Hauschild et al. 2012). 또한, 동시발생적(concomitant) BRAF- + MEK-표적화된 치료법의 임상학적 사용은 MAPK 경로에서의 상이한 노드(node)들의 동시 표적화가 반응의 규모(magnitude) 및 지속기간을 향상시킬 수 있음을 입증하였다. BRAF + MEK-표적화된 제제(다브라페닙/트라메티닙 또는 코비메티닙/베무라페닙)의 제1선 사용은 단일 제제 BRAF 억제와 비교하여 중간값 전체 생존을 추가로 개선시켰다(Robert et al. 2015, Long et al. 2015, Larkin et al. 2014). 따라서, 조합된 BRAF-/MEK-표적화된 치료법은 BRAF V600 돌연변이를 갖는 전이성 흑색종을 지닌 환자에게 유용한 치료 옵션이다.
BRAF-/MEK-억제제 조합 치료법으로 보여지는 임상학적 결과에서의 개선에도 불구하고, 지속가능한 이점은 대략 9 내지 11개월의 범위의 중간값 PFS로, 획득된 내성 및 후속적 질환 진행의 궁극적인 발달에 의해 제한된다. (Robert et al. 2015, Long et al. 2015, Larkin et al. 2014, and Flaherty et al. 2012). 단일 제제 BRAF 억제에 대한 획득된 내성의 유전적 메커니즘이 열심히 연구되어 왔고, 내성 메커니즘의 동정으로는 BRAF의 스플라이스 변이체(Poulikakos et al. 2011), BRAF V600E 증폭(Corcoran et al. 2010), MEK 돌연변이(Wagle et al. 2014), NRAS 돌연변이, 및 RTK 활성화(Nazarian et al. 2010 and Shi et al. 2014)가 포함된다. BRAF-/MEK-억제제 조합 치료법의 설정에서 내성 메커니즘이 나타나기 시작하고 BRAF 단일 제제 내성의 메커니즘을 반영한다(Wagle et al. 2014 and Long et al. 2014). 이들 유전적 사건은 모두 공통으로 ERK 신호전달을 재활성화하는 능력을 공유한다. 실제로, ERK 전사 표적에 의해 측정된 바와 같은 재활성화된 MAPK 경로 신호전달은 BRAF 억제제-내성 환자로부터의 종양 생검에서 흔하다(Rizos et al., 2014). 또한, ERK1/2 재활성화는 내성의 유전적 메커니즘의 부재 하에 관찰되었다(Carlino et al. 2015). 따라서, 지속가능한 임상학적 이점을 달성하기 위한 탐구는 연구자들이 다운스트림 MAPK 구성원인 ERK1/2를 표적으로 하는 추가의 제제를 평가하는데 초점을 맞추도록 하였다. ERK의 억제는 BRAF/MEK 억제에 대한 내성을 갖는 환자에게 중요한 임상학적 이점을 제공할 수 있다. ERK 패밀리 키나제는 BRAF 또는 MEK 억제제에 대해 내성인 이들 암을 포함하는 전임상학적 암 모델에서 치료학적 표적으로서의 가능성을 보여주었다(Morris et al. 2013 and Hatzivassiliou et al. 2012). 그러나, 이러한 ERK1/2 억제제의 잠재적 사용은 흑색종에서 획득된 내성을 넘어 확대된다.
ERK1/2의 표적화는 BRAF/MEK 치료법-재발 환자뿐만 아니라 MAPK의 공지의 동인(driver)을 갖는 임의의 종양 유형에서 합리적인 전략이다. ERK1 및 ERK2는 해당 경로의 다운스트림에 존재하므로, 이들은 업스트림 내성 메커니즘을 회피할 수 있는 MAPK 캐스케이드 내에서 특히 매력적인 치료 전략을 나타낸다. 여기서, MAPK 경로-의존적 암의 모델에서 BVD-523(울릭세르티닙)의 전임상학적 특성확인이 약물-나이브(naive) 및 BRAF/MEK 치료법 획득된-내성 모델을 포함하여 보고된다. BVD-523의 페이즈 I 용량-조사 연구의 결과는 본 저널에 동반 공개로서 포함된다. 실시예 17 내지 실시예 24를 참조한다.
본 발명에서, BVD-523은 시험관내 및 생체내 항암 활성을 갖는 ERK1/2의 강력한 고도로 선택적인 가역적 소분자 ATP-경쟁적 억제제인 것으로 밝혀졌다.
BVD-523(울릭세르티닙)은 높은 효력 및 ERK1/2 선택성을 지닌 신규한 가역적 ATP-경쟁적 ERK1/2 억제제로서 동정되었고 특성확인되었다. BVD-523은 MAPK(RAS-RAF-MEK) 경로 돌연변이를 갖는 세포에서 가장 현저하게 감소된 증식 및 향상된 카스파제 활성을 야기하였다. 생체내 BRAF V600E 이종이식 연구에서, BVD-523은 용량-의존적 성장 억제 및 종양 퇴행을 나타내었다. 흥미롭게도, BVD-523은 ERK1/2의 증가된 인산화에도 불구하고 표적 기질의 인산화를 억제하였다. BVD-523은 또한 단일 제제 및 조합 BRAF/MEK 표적화된 치료법에 대한 획득된 내성의 모델에서 항종양 활성을 입증하였다. BRAF V600E-돌연변이체 흑색종 세포주 이종이식 모델에서의 상승작용적 항증식 효과는 또한 BVD-523이 BRAF 억제와 조합으로 사용된 경우에 입증되었다. 이들 연구는 BVD-523이 이의 종양이 MAPK 경로의 업스트림 노드를 표적으로 하는 다른 치료법에 대해 획득된 내성을 갖는 암을 포함하는 ERK-의존성 암에 대한 치료제로서의 가능성이 있음을 시사한다.
실시예 10
신규한 ERK1/2 억제제인 BVD-523(울릭세르티닙)의 발견 및 초기 특성확인
고출력 소분자 스크린을 사용하여 최초로 동정된 리드(lead)의 광범위한 최적화(Aronov et al. 2009)에 따라, 신규한 아데노신 트리포스페이트(ATP)-경쟁적 ERK1/2 억제제인 BVD-523(울릭세르티닙)이 동정되었다(도 29a). BVD-523은 ERK2에 대해 0.04 ± 0.02nM의 Ki를 갖는 강력한 ERK 억제제이다. 이는 ERK2 억제에 대한 IC50 값이 증가하는 ATP 농도에 따라 선형적으로 증가함에 따라, ATP의 가역적인 경쟁적 억제제인 것으로 밝혀졌다(도 29b 및 도 29c). IC50은 10분 이상의 인큐베이션 시간 동안 거의 일정하게 유지되었고, 이는 BVD-523과 ERK2의 신속한 평형 및 결합을 시사한다(도 29d). BVD-523은 또한 0.3nM 미만의 Ki를 나타내는 재조합 ERK1(Rudolph et al. 2015)의 단단히 결합하는 억제제이다.
ERK2에 대한 BVD-523의 결합은 열량측정 연구를 사용하여 입증하였고, ERK 억제제 SCH772984 및 피라졸릴피롤을 사용하여 생성된 데이터와 비교하였다(Arovov et al. 2007). 양성 ΔTm 값(도 29e)에 의해 나타낸 바와 같이, 모든 화합물은 증가하는 농도에 따라 불활성 ERK2에 결합하여 이를 안정화시켰다. BVD-523 및 SCH-772984를 이용하여 관찰된 ΔTm의 10 내지 15도 변화는 저-나노몰 결합 친화성을 갖는 화합물과 일치한다(Fedorov et al. 2012). BVD-523은 인산화된 활성 ERK2(pERK2) 및 불활성 ERK2 둘 다에 대해 강한 결합 친화성을 입증하였다(도 29f). 불활성 ERK2와 비교하여 pERK2에 대해 더 강한 친화성이 관찰되었다. BVD-523은 음성 대조군 단백질 p38α MAP 키나제와 상호작용하지 않았다(도 29f).
BVD-523은 ERK1 및 ERK2 이외에도 75개의 키나제에 대한 생화학적 카운터-스크린(counter-screen)에 기초하여 우수한 ERK1/2 키나제 선택성을 입증하였다. ATP 농도는 모든 검정에서 Km과 거의 동일하였다. 2μM BVD-523에 의해 50% 초과로 억제된 키나제는 Ki 값(또는 겉보기 Ki; 표 21)을 생성하도록 재시험되었다. 14개의 키나제들 중 12개는 1μM 미만의 Ki를 가졌다. ERK2에 대한 BVD-523의 선택성은 0.3nM 미만의 Ki로 억제된(10배) ERK1을 제외한 시험된 모든 키나제에 대해 7000배 초과였다. 따라서, BVD-523은 ERK1/2의 매우 강력하고 선택적인 억제제이다.
표 21 BVD-523은 ERK1 및 ERK2 키나아제에 대한 선택성을 나타낸다.
Figure pat00052
실시예 11
BVD-523은 세포 증식을 우선적으로 억제하고 MAPK 경로-활성화 돌연변이를 갖는 암 세포주에서 시험관내 카스파제-3/7 활성을 향상시킨다
BVD-523 세포 활성은 다양한 계통 및 유전적 배경의 대략 1,000개의 암 세포주의 패널에서 평가되었다(도 30a 및 표 22). 세포주는 RAS 패밀리 구성원과 BRAF에서의 돌연변이 부재 또는 존재에 따라 MAPK 야생형(wt) 또는 돌연변이체로 분류되었다. 일부 MAPK-wt 세포주는 BVD-523에 민감성이었지만, 일반적으로 BVD-523은 MAPK 경로 변경을 갖는 세포에서 우선적으로 증식을 억제하였다.
이어서, 민감성 세포에 대한 BVD-523 치료의 성장 및 생존 영향을 특성확인하였다. 24시간 동안의 500nM 또는 2000nM의 BVD-523을 이용한 치료 후 BRAF V600E-돌연변이 흑색종 세포주 UACC-62에 대해 형광성 활성화 세포 분류(FACS: Fluorescence activated cell sorting) 분석을 수행하였다. 치료된 세포는 농도-의존적 방식으로 세포 주기의 G1 페이즈에 정지되었다(도 30b).
또한, 카스파제-3/7 활성을 다중 사람 암세포주에서의 아폽토시스의 척도로서 분석하였다. 72시간 동안의 BVD-523을 이용한 치료 후, 카스파제 3/7에서 농도- 및 세포주-의존적 증가가 관찰되었다(도 30c). BVD-523 치료는 BRAF V600 돌연변이(A375, WM266 및 LS411N)를 갖는 MAPK-활성화된 세포주의 서브세트에서 확연한 카스파제-3/7 유도를 초래하였다. 이는 MAPK 경로-돌연변이 암 세포주에서의 BVD-523에 의한 증식의 우선적 억제에 대한 초기 관찰과 일치한다(도 30a).
BVD-523에 의해 유발된 신호전달에 대한 효과 및 작용의 메커니즘을 추가로 특성확인하기 위해, 다양한 이펙터 및 MAPK-관련 단백질의 수준을 BVD-523-치료된 BRAF V600E-돌연변이 A375 흑색종 세포에서 평가하였다(도 30d). BVD-523 치료의 4시간 및 24시간 후 포스포(Phospho)-ERK1/2 수준이 농도-의존적 방식으로 증가하였다. 2μM의 BVD-523 치료로 관찰된 pERK1/2의 우세한 농도-의존적 증가에도 불구하고, ERK1/2 표적 RSK1/2의 인산화는 4시간째 및 24시간째 둘 다에서 감소되었고, 이는 지속적 억제와 일치한다. ERK1/2 활성의 원위 마커인 DUSP6의 전체 단백질 수준도 4시간째 및 24시간째에 약화되었다. BVD-523을 이용한 24시간의 치료 후, 아폽토시스성 마커 BIM-EL은 용량-의존적 방식으로 증가하였고, 한편 사이클린 D-1 및 pRB는 2μM에서 약화되었다. 모든 효과는 온-표적(on-target) ERK1/2 억제와 일치한다.
실시예 12
BVD-523은 BRAF V600E -돌연변이 암세포주 이종이식 모델에서의 생체내 항종양 활성을 입증한다
BVD-523이 농도-의존적 방식으로 증식을 감소시켰고 아폽토시스를 유도하였다는 본 발명자들의 시험관내 발견에 기초하여, MAPK/ERK-경로 의존성을 이용한 모델에서 생체내 항-종양 활성을 입증하기 위해 경구 위관영양법(oral gavage)에 의해 BVD-523을 투여하였다. 흑색종(세포주 A375) 및 결장직장암(세포주 Colo205)의 이종이식 모델을 이용하였고, 이의 둘 다는 BRAF V600E 돌연변이를 지닌다.
A375 세포주의 이종이식편에서, BVD-523 효능을 치료 14일 후에 대조군 세포독성 알킬화제인 테모졸로마이드와 비교하였다. BVD-523은 1일 2회 50mg/kg(BID)에서 시작하여 유의한 용량-의존적 항종양 활성을 입증하였다(도 31a). 50 및 100mg/kg BID의 용량은 종양 성장을 유의하게 약화시켰고, 종양 성장 억제(TGI)는 각각 71%(P=0.004) 및 99%(P<0.001)였다. 100mg/kg BID 그룹에서 7개의 부분적 퇴행(PR: partial regression)이 나타났고; 임의의 다른 그룹에서는 퇴행 반응이 나타나지 않았다. 관찰된 효능은 바람직하게는 테모졸로마이드의 효능과 비교하였고, 이는 75mg/kg 및 175mg/kg으로 투여했을 때 각각 34%(P>0.05) 및 78%(P=0.005)의 경미한 용량-의존적 TGI를 초래하였다.
추가로, BVD-523은 Colo205 사람 결장직장암 세포주 이종이식 모델에서 항종양 효능을 입증하였다(도 31b). BVD-523은 50, 75 및 100mg/kg BID의 용량에서 유의한 용량-의존적 종양 퇴행을 재차 나타내었고, -48.2%, -77.2%, 그리고 -92.3%의 평균 종양 퇴행 T/Ti(T = 치료 종료, Ti = 치료 개시)이 수득되었다(모두 P<0.0001). 최소 용량의 BVD-523(25mg/kg BID)에서는 퇴행이 관찰되지 않았지만; 25.2%(P <0.0001)의 T/C(T = 치료, C = 대조군)로 유의한 종양 성장 억제가 관찰되었다. 잘 허용되지는 않지만, 양성 대조군 화학 치료학적 제제 이리노테칸(CPT-11)은 유의한 항종양 활성을 나타내었고, 6.4%의 T/C로 Colo205 종양 성장을 억제하였다(P<0.0001). 그러나 CPT-11은 마우스에서의 이의 최대 허용 용량에서도 50, 75 또는 100mg/kg BID의 용량의 BVD-523만큼 효과적이지 못하였다.
약동학 및 약력학 사이의 관계를 확립하기 위해, 단일 100mg/kg 경구 투약 후 24-시간 기간에 걸친 면역조직화학 및 동위원소-태그된 내부 표준 질량 분광광도법에 의해 BVD-523 혈장 농도를 종양에서 측정된 pERK1/2 수준과 비교하였다(도 31c). ERK1/2의 인산화는 치료되지 않은 종양(0시간째)에서 낮았다. BVD-523을 이용한 치료 후, ERK1/2 인산화는 투약-후 1시간째부터 투약-후 8시간째의 최대 수준까지 꾸준히 증가하였고, 이어서 24시간째까지 투약-전 수준으로 회복되었다. pERK1/2의 이러한 증가는 BVD-523 약물 혈장 농도와 상관관계가 있었다. BVD-523 치료로 증가된 pERK1/2의 생체내 관찰은 초기의 시험관내 발견과 일치한다(도 30d).
실시예 13
BVD-523은 증가된 ERK1/2 인산화에도 불구하고 ERK1/2 기질 억제를 초래한다
다른 공지의 ERK1/2 억제제(SCH772984, GDC-0994 및 Vx-11e)(Morris et al. 2013 및 Liu et al. 2015)에 비교하여 신호전달에 대한 BVD-523의 영향을 조사하기 위해, ERK 억제에 대한 민감성을 갖는 다양한 세포주에서 대략 40개의 단백질의 대규모 역상 단백질 어레이(RPPA: reverse phase protein array)를 사용하였다. BRAF 및 RAS에서 공통적 변경을 갖는 세포주를 검정하였다: BRAF V600E 돌연변이 세포주 A375, Colo205 및 HT29; KRAS G12C-돌연변이 세포주 MIAPACa-2; KRAS G13D-돌연변이 세포주 HCT116; 및 비정형(atypical) HRAS F82L 돌연변이를 갖는 AN3Ca. 단백질 수준의 변화는 디메틸 설폭사이드(DMSO)-처리된 모세포 대조군으로부터의 백분율 변화로서 나타낸다(도 32a 및 표 23). 모든 ERK 억제제는 ERK1/2(pERK1/2[ERK1/2-T202, -Y204])의 인산화를 제외하고는 정성적으로 유사한 단백질 효과를 유발하였고; SCH7722984는 모든 세포주에서 pERK1/2를 억제하였고, 한편 BVD-523, GDC-0994 및 Vx-11e는 pERK1/2를 현저하게 증가시켰다. pERK1/2의 근위 및 원위 표적인 포스포-p90 RSK(pRSK1) 및 사이클린 D1은 ERK1/2 인산화의 정도에 관계없이 시험된 모든 억제제에 의해 유사하게 억제되었다(도 32b). BVD-523에 대한 이들 독립적인 결과는 A375 세포에서의 웨스턴 블롯에 의해 현저하게 상승된 pERK1/2에도 불구하고, pERK1/2 및 불활성 ERK1/2의 BVD-523 결합 및 안정화를 입증하는 단백질-결합 연구(도 29e 및 도 29f) 이외에도 ERK1/2 기질인 RSK1/2의 인산화가 여전히 억제되어 있었음을 보여주는 연구(도 32d)와 일치한다. 따라서 증가된 pERK1/2 수준을 측정하는 것은 BVD-523에 대한 임상학적 약력학적 바이오마커로서 간주될 수 있고, 한편 pRSK1 및 DUSP6와 같은 ERK1/2 표적의 억제를 정량하는 것도 또한 유사한 목적을 제공할 수 있다.
RPPA 데이터세트(도 32a)에서 추가적인 단백질 변화가 주목된다. 감소된 pS6-리보솜 단백질은 모든 화합물을 갖는 모든 세포주에서 입증되는 바와 같이 ERK1/2 억제의 다른 약력학적 마커인 것으로 나타난다(도 32b). 또한, pAKT의 현저한 유도는 각각의 ERK1/2 억제제가 세포주 A375 및 AN3CA 세포에서 pAKT를 유도한 경우 세포주-의존적 관찰인 것으로 나타난다(도 33). 흥미롭게도, 생존 마커 인 pBAD의 억제 정도는 시험된 다른 ERK1/2 억제제와 비교하여 GDC-0994에 의한 pBAD의 적당한 억제만으로 화합물들 사이에 상이한 것으로 나타난다(도 32a).
이어서, BVD-523이 BRAF V600E-돌연변이 RKO 결장직장 세포주(도 32c)에서 ERK1/2 및 다운스트림 표적 pRSK의 세포 국재화에 영향을 미치는 방법을 조사하였다. 나머지 세포에서, ERK1/2는 세포질에 국재하고, 1회 자극된 pERK1/2는 표적 세포소기관, 특히 전사 표적이 활성화된 핵으로 이동한다(Wainstein et al. 2016). DMSO-치료된 대조군 세포에서, pERK1/2는 핵 및 세포질 분획 둘 다에서 분명하고, 이는 이러한 세포주에서 BRAF V600E의 존재로 인하여 MAPK 경로 활성을 반영할 가능성이 있다. BVD-523를 이용한 치료는 핵 및 세포질에서 상승된 pERK1/2를 초래하였고, DMSO-치료된 세포와 비교하여 핵의 총 ERK1/2의 완만한 증가도 초래하였고, 이는 pERK1/2의 화합물-유도된 안정화가 일부 핵 전좌(translocation)를 자극한다는 것을 시사한다. 상기 구획 둘 다에서 pERK1/2가 증가했음에도 불구하고, pRSK 수준은 DMSO 대조군에 비해 세포질 및 핵 구획에서 더 낮다. 비교인자 MAPK 신호전달 억제제(즉, 트라메티닙, SCH7722984, 다브라페닙)는 핵 및 세포질 구획에서의 낮은 수준에 의해 반영되는 바와 같이 ERK1/2 및 RSK의 인산화를 억제하였다. 이들 데이터는 재차 pERK1/2의 BVD-523-관련된 증가가 세포질 및 핵 둘 다에서 분명함을 시사하지만; 이는 표적 기질의 활성화로 해석되지 않는다. 이는 도 30d 및 도 32a에 제시된 데이터와 일치한다.
실시예 14
BVD-523은 BRAF 및 MEK 억제제 내성의 시험관내 모델에서 활성을 나타냈다
BRAF 및 MEK 억제제에 대한 내성의 출현은 이들의 임상학적 효능을 제한한다. 여기서, 실험은 시험관내 BRAF(다브라페닙), MEK(트라메티닙) 및 ERK1/2(BVD-523) 억제에 대한 내성의 발달을 모델링하고 비교하고자 하였다. 수개월에 걸쳐, BRAF V600E-돌연변이 A375 세포를 점차 증가하는 농도의 각각 억제제에서 배양하였다. 약물-내성 A375 세포주는 고농도의 트라메티닙 또는 다브라페닙에서의 성장 후에 용이하게 수득되었고, BVD-523에 대한 내성을 갖는 세포주를 개발하는 것은 어려운 것으로 판명되었다(도 34a). 전반적으로, 이들 시험관내 데이터는 유사한 표적 억제를 수득하는 농도에서 BVD-523에 대한 내성이 다브라페닙 또는 트라메티닙에 비해 지연되고, 진료소에서의 지속가능한 반응으로 해석될 수 있음을 시사한다.
ERK1/2 신호전달에 대한 재활성화 및 의존성은 BRAF/MEK 억제에 대한 획득된 내성의 공통의 특성이고(Morris et al. 2013 및 Hatzivassiliou et al. 2012); 따라서, 획득된 내성의 시험관내 모델에서 BVD-523의 활성을 평가하였다. 우선, 기술된 증가된 농도 방법을 사용하여 다브라페닙 및 트라메티닙 조합-내성 A375 집단을 얻었다. BRAF/MEK 조합-내성 집단에서의 다브라페닙, 트라메티닙 및 BVD-523에 대한 모세포 A375로부터의 IC50 및 IC50-배수 변화를 표 24에 나타낸다. BVD-523 IC50은 완만하게 변화하였고(2.5배), 한편 다브라페닙 및 트라메티닙은 보다 유의하게 변화하였다(각각 8.5배 및 13.5배)(표 24). 세포독성제 파클리탁셀을 대조군으로서 시험하였고, 효력의 완만한 변화만이 관찰되었다. 이들 데이터는 BRAF/MEK 치료법 내성의 설정에서 BVD-523의 조사를 지지하지만, 이 세포 집단에서의 내성의 메커니즘은 여전히 특성확인되어야 한다.
표 24 BRAF/MEK 억제 모델에서의 BVD-523 활성
Figure pat00053
BRAF 억제제 내성의 공지의 메커니즘을 갖는 모델에서 ERK1/2 억제의 취급용이성(tractability)을 추가로 조사하기 위해, AAV-매개된 유전자 표적화를 사용하여 MEK1 Q56P-활성화 돌연변이의 조작된 이형접합성 녹-인(knock-in)의 존재 또는 부재에 대해 동질유전자인 1쌍의 RKO BRAF V600E-돌연변이 세포주를 생성하였다(Trunzer et al. 2013 및 Emery et al. 2009). MEK1 Q56P를 포함하는 MEK1/2 돌연변이는 환자에서 단일 제제 BRAF 및 조합 BRAF/MEK 치료법-획득된 내성 둘 다에 연루되었다(Wagle et al. 2011, Wagle et al. 2014, Emery et al. 2009 및 Johnson et al. 2015). 단일-제제 검정은 모 BRAF V600E::MEK1 wt 세포와 비교하여, 이중-돌연변이 BRAF V600E::MEK1 Q56P 세포가 BRAF 억제제인 베무라페닙 및 다브라페닙 및 MEK 억제제인 트라메티닙에 대해 현저하게 감소된 민감성을 나타내었음을 입증하였다(도 34b). 대조적으로, BVD-523에 대한 반응은 모세포 및 MEKQ56P-돌연변이 세포 둘 다에서 본질적으로 동일하고, 이는 BVD-523이 이러한 획득된 내성의 메커니즘에 감수성이지 않음을 나타낸다. 이들 결과는 2개의 독립적으로 유도된 이중-돌연변이 BRAF V600E::MEK1 Q56P 세포주 클론에서 확인되었고, 이로써 결과는 관련되어 있지 않은 클론 인공물보다는 오히려 MEK1 Q56P 돌연변이의 존재와 구체적으로 관련되어 있음을 확인하였다. 또한, 제2의 기계론적으로 구별되는 ERK1/2 억제제(SCH772984)를 이용하여 유사한 결과가 관찰되었고, 이는 이들 관찰이 특히 ERK1/2의 기계론적 억제와 관련되어 있고 오프-표적 화합물 효과로 인한 것이 아니라는 개념을 지지한다.
BRAF V600E::MEK1 Q56P 세포주에서의 MAPK 경로 신호전달에 대한 BVD-523의 기계론적 영향을 추가로 특성확인하기 위해, 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다(도 34c). 모 BRAF V600E RKO 세포에서 BRAF(베무라페닙), MEK(트라메티닙) 또는 ERK1/2(BVD-523) 억제제를 약리학적 활성 농도로 4시간 치료한 후 감소된 수준의 pRSK1/2가 관찰되었다. 대조적으로, 동질유전자 이중 돌연변이 BRAF V600E::MEK1 Q56P 세포는 BRAF 또는 MEK 억제제 치료 후 감소된 RSK 인산화를 나타내지 않았고, 한편 BVD-523은 모세포 RKO에 필적하는 수준으로 pRSK1/2를 억제하는데 여전히 효과적이었다. 유사하게, 모세포 RKO 및 BRAF V600E::MEK1 Q56P 둘 다에서의 BVD-523 치료 24시간까지 pRB가 감소되어 G0/G1 정지를 나타낸다.
획득된 KRAS 돌연변이는 또한 MAPK 경로 억제제에 대한 내성의 공지의 동인이다. 이러한 내성 메커니즘에 대한 BVD-523의 감수성을 이해하기 위해, 결장직장암 세포주 SW48에서 임상적으로 관련되어 있는 KRAS 돌연변이의 동질유전자 패널을 사용하였다. BVD-523에 대한 민감성을 MEK 억제제 셀루메티닙 및 트라메티닙과 비교하였다(도 34d). 파클리탁셀에 대한 민감성은 변경되지 않았다(도 37a). 몇몇의 돌연변이 KRAS 대립유전자는가 MEK 억제에 대한 강한 수준 내지 중간 정도 수준의 내성을 부여하였지만, BVD-523에 대한 민감성은 대다수의 대립유전자에 따라 변경되지 않았고, 민감성의 변화가 관찰된 경우, 이는 트라메티닙 또는 셀루메티닙을 이용하여 관찰된 정도가 아니었다. 전반적으로, 이들 데이터는 BVD-523이 MEK 억제제보다 이 문맥에서 더 효능성임을 시사한다.
실시예 15
BVD-523은 BRAF 억제제-내성 환자-유도된 흑색종 이종이식 모델에서의 생체내 활성을 입증한다
BRAF-/MEK-획득된 내성의 시험관내 모델에서 관찰된 BVD-523의 항종양 효과를 확인하고 확장시키기 위해, 베무라페닙에 대한 내성을 갖는 환자로부터 유도된 BRAF-내성 이종이식 모델을 이용하였다. BVD-523은 단독으로 그리고 50mg/kg BID의 다브라페닙과의 조합으로 28일 동안 100mg/kg BID의 경구 위관영양법에 의해 투약되었다(도 35). 예측된 바와 같이, 단일 제제 다브라페닙(22% TGI)에 대해 최소 항종양 활성이 입증되었다. BVD-523 활성은 비히클 대조군과 비교하여 유의하였고(P≤0.05), TGI는 78%였다. 이 모델에서, BVD-523을 다브라페닙과 조합하는 것은 76%의 TGI를 초래하였고(P≤0.05); 따라서, BRAF-획득된 내성의 이러한 모델에서 단일 제제 BVD-523와 비교하여 상기 조합에 대해 추가의 이점이 얻어지지 않았다.
실시예 16
BVD-523 및 BRAF 억제제를 이용한 조합 치료법은 유망한 항종양 활성을 제공한다
BRAF-돌연변이 암을 지닌 환자는 조합된 BRAF/MEK 치료법에 대한 내성을 획득할 수 있고(Wagle et al. 2014), 이는 MAPK 경로 내의 다른 조합 접근법의 고려를 보장한다. BRAF V600E-돌연변이 흑색종 세포주 G-361에서 BVD-523을 BRAF 억제제인 베무라페닙과 조합하는 것의 항-증식성 효과를 평가하였다. 예상한 바와 같이, 단일 제제 BVD-523 및 베무라페닙은 둘 다 활성이었고, 조합시 완만한 상승작용이 관찰되었다(도 37b). 이는 BRAF 억제제와 조합된 BVD-523이 BRAF V600E 돌연변이를 갖는 흑색종 세포주에서 적어도 부가적이고 잠재적으로 상승작용적임을 나타낸다. 또한, BRAF 억제제 + BVD-523에서 BRAF V600E 돌연변이 세포주(A375)의 연속 배양 후 시험관내에서 획득된 내성을 생성하는 것은 어려웠다. 대조적으로, 다브라페닙에 대한 내성의 생성만이 상대적으로 신속하게 발생하였다(도 37c). 심지어 다브라페닙 + 트라메티닙 전에 조합된 다브라페닙 및 트라메티닙에 대한 내성이 발생하였다.
조합된 BRAF 및 ERK 억제의 이점은 농도가 내약성에 의해 제한되지 않는 경우 시험관내 조합 연구에서 완전히 실현되지 않을 수 있다. 조합의 이점을 이해하기 위해, BRAF V600E-돌연변이 사람 흑색종 세포주 A375의 이종이식을 이용하여 생체 내에서 효능을 평가하였다. 조합 치료에 대한 주목할만한 반응으로 인하여, 조합 그룹에서의 투약은 종양 재성장을 모니터링하기 위해 20일째에 중단하였고, 42일째에 재개시하였다(도 36a). 45일째에 연구가 종결될 때까지 종양을 매주 2회 측정하였다. 대조군에 대한 종점까지의 중간값 시간(TTE: time to endpoint)은 9.2일이었고, 35.8일의 가능한 최대 종양 성장 지연(TGD)이 100%로서 정의되었다. 테모졸로마이드 치료는 1.3일의 TGD(4 %)를 초래하였고, 퇴행을 초래하지 않았다. 50 및 100mg/kg 다브라페닙 단독 치료법은 각각 6.9일(19%) 및 19.3일(54%)의 TGD, 유의한 생존 이점(P<0.001), 및 100mg/kg 그룹에서의 1 PR을 산출하였다. 100mg/kg BVD 523 단독 치료법은 9.3일(26 %)의 TGD, 유의 한 생존 이점(P<0.001) 및 2개의 지속가능한 완전 반응을 초래하였다. 다브라페닙의 BVD-523과의 조합은 각각 주목할만한 퇴행 반응을 갖는 최대 가능한 100% TGD 및 이들의 상응하는 단독 치료법과 비교하여 통계학적으로 우수한 전반적 생존(P<0.001)을 산출하였다. 최저 용량 조합은 주목할만한 7/15 무-종양 생존자(TFS)를 산출하였고, 3개의 보다 높은-용량 조합은 치유적(curative) 또는 준-치유적(near-curative) 활성과 일치하는 총 43/44 TFS를 산출하였다(도 36b). 요약하면, 다브라페닙의 BVD-523과의 조합은 둘 중 어느 하나의 단일 제제에 비해 더 많은 수의 TFS와 우수한 효능을 산출하였다.
개시 종양 용적이 대략 75 내지 144㎣인 A375 이종이식 모델에서의 BVD-523 + 다브라페닙의 활성에 기초하여, 추적(follow-up) 실험을 수행하여 "단계상향된(upstaged)" A375 이종이식편(평균 종양 개시 용적, 700 내지 800㎣)에서 조합 치료법의 효능을 측정하였다(도 36c). 대조군에 대한 중간값 TTE는 6.2일이었고, 이는 53.8일의 최대 가능한 TGD를 확립하였고, 이는 60일 연구 동안 100% TGD로서 정의되었다. BVD-523 100mg/kg 단독 치료법은 무시할만한 TGD(0.7일, 1%)를 산출하였고, 대조군으로부터의 유의한 생존 차이를 산출하지 않았다(P>0.05). TTE들 및 2개의 PR의 분포는 BVD-523 단독을 이용한 치료에 대한 반응자들의 서브세트가 존재할 수 있었음을 시사하였다. 다브라페닙 50mg/kg 단독 치료법은 효과적이었고, 이는 46.2일(86 %)의 TGD 및 대조군과 비교하여 유의한 생존 이점(P<0.001)을 수득하였다. 이 그룹은 11마리의 평가가능한 마우스들 중에서 3마리의 TFS를 포함하여 5마리의 CR 및 5마리의 PR을 가졌다(도 36d). 다브라페닙의 BVD-523과의 조합 둘 다는 대조군에 비해 최대 100% TGD 및 유의한 생존 이점을 산출하였다(P<0.001). 각각의 조합은 퇴행 활성에 있어서 분석에서 구별이 있었지만 평가가능한 마우스들 중에서 100% 퇴행 반응을 산출하였다. 25mg/kg 다브라페닙 및 50mg/kg BVD-523 조합은 2마리의 PR 및 8마리의 CR, 6/10 TFS를 가졌고, 반면 50mg/kg 다브라페닙 및 100mg/kg BVD-523 조합은 60일째에 11/11TFS를 가졌다(도 36d). 전반적으로, 이들 데이터는 BRAF V600-돌연변이 흑색종에서 BVD-523의 BRAF-표적화 치료법과의 최전선 조합에 대한 이론적 근거를 지지하고, 이러한 변경을 갖는 다른 종양 유형으로 확장될 가능성이 있다.
논의
BVD-523은 생체내 및 시험관내 암 모델에서 활성을 갖는 ERK1/2의 강력한 고도로 선택적인 가역적 소분자 ATP-경쟁적 억제제이다. 시험관내에서, BVD-523은 몇몇의 사람 종양 세포주, 특히 이의 작용 메커니즘과 일치하는 MAPK 신호전달 경로에서 활성화 돌연변를 지닌 종양 세포주들에 대한 강력한 억제를 입증하였다. BVD-523은 ERK1/2, pRSK 및 총 DUSP6 단백질 수준의 직접적 기질의 억제를 포함하는 다운스트림 표적 및 이펙터 단백질의 변화를 유발하였다. 이들 발견은 다른 ERK1/2 억제제에 대한 이전 연구의 발견과 일치하고, 이는 ERK1/2 억제를 이용한 pRSK의 효과적 억압을 입증하였다(Morris et al. 2013 및 Hatzivassiliou et al., 2012). 흥미롭게도, BVD-523 치료는 시험관내에서 그리고 생체내에서 ERK1/2 인산화의 현저한 증가를 초래하였다. 본 발명자들의 발견과 유사하게, pERK1/2의 증가가 ERK1/2 억제제 Vx11e에서 보고되었고; 반대로, SCH772984를 이용하여 pERK1/2 억제가 발생한다(Morris et al. 2013). 시험된 다양한 ERK1/2 억제제들 중에서 pERK1/2 수준의 차이가 관찰되었지만, 다운스트림 이펙터(즉, pRSK1 및 총 DUSP6)는 유사하게 억제되었다. 이들 발견은 pRSK1과 같은 ERK1/2 표적 기질을 정량하는 것이 ERK1/2 활성의 BVD-523-매개된 억제에 대한 신뢰할 수 있는 약동학적 바이오마커로서 작용할 수 있음을 시사한다.
BRAF(다브라페닙, 베무라페닙) 및 MEK(트라메티닙, 코비메티닙) 억제제는 MAPK 경로를 특히 BRAF V600 돌연변이를 갖는 환자에서의 치료 표적으로서 입증하지만, 항종양 반응은 획득된 내성의 출현 및 후속적 질환 진행에 의해 제한된다. 내성은 보상 신호전달 분자의 상향조절 및 활성화(Nazarian et al. 2010, Villanueva et al. 2010, Johannessen et al. 2010 and Wang et al. 2011), 표적 유전자의 증폭(Corcoran et al. 2010) 및 경로 구성원의 활성화 돌연변이(예를 들면, RAS, MEK)에 기인하였다(Wagle et al. 2011, Emery et al. 2009 and Wang et al. 2011). ERK1/2 경로의 재활성화는 획득된 내성 메커니즘의 한 공통의 결과이다. BRAF V600E-돌연변이 흑색종 세포주 A375에 도입되었을 때, MEK Q56P는 MEK 및 BRAF 억제에 대한 내성을 부여하였다(Wagle et al., 2011). 대조적으로, BVD-523은 조작된 MEK Q56P 세포주에서 강력한 저해 활성을 보유하였고, 이는 ERK1/2 억제가 BRAF/MEK 치료에 반응하여 발생할 수 있는 업스트림 활성화 변경의 설정에 효과적임을 나타낸다. 획득된 내성의 맥락에서 BVD-523에 대한 역할의 추가의 증거로서, BVD-523의 효능은 베무라페닙에 대해 질환이 진행된 환자로부터의 종양 샘플로부터 유도된 이종이식 모델에서 분명하였고; BRAF 억제제인 다브라페닙은 이 모델에서 효과적이지 않았다. 이들 데이터는 BRAF/MEK 내성의 설정에서 ERK1/2을 표적화하기 위한 역할을 지지하고, 이전에 발표된 결과를 보완한다(Morris et al. 2013 및 Hatzivassiliou et al. 2012). MAPK 경로의 억제제에 대한 내성을 추가로 특성확인하기 위해, BVD-523에 대한 내성의 출현이 조사되었다. BVD-523을 이용한 암세포의 단일 제제 처리는 지속가능하였고 업스트림 MAPK 신호전달 구성원을 표적으로 하는 다른 제제(즉, 다브라페닙, 트라메티닙)와 비교하여 내성을 발현하는 것이 더 어렵다는 것이 밝혀졌다. 이는 잠재적으로 BVD-523이 ATP 결합 부위의 보다 보존된 활성 확인을 우선적으로 표적으로 한다는 사실로 인하여, ERK1/2-표적화제에 대한 내성을 획득하는 것은 BRAF 또는 MEK 치료법에 대한 내성을 획득하는 것보다 달성하기 어려움을 시사할 수 있다. 그러나, 다른 ERK1/2 억제제에 대한 시험관내 연구는 내성을 유도하는 ERK1/2의 특정 돌연변이체를 확인하였고(Jha et al. 2016 및 Goetz et al. 2014); 이러한 특정 돌연변이는 ERK1/2 억제제-재발 환자로부터의 임상학적 샘플에서 아직 확인되지 않았다.
BVD-523을 이용한 ERK1/2 억제의 잠재적인 임상학적 이점은 BRAF/MEK 치료법-내성 환자의 설정을 넘어 확대된다. ERK1/2는 이러한 MAPK 경로 내에서 다운스트림 마스터 노드이므로, 종양 성장이 MAPK 신호전달에 의존하는 다수의 암 설정에서 이의 억제가 매력적이다. 모든 암의 대략 30%는 RAS 돌연변이를 갖고; 따라서 BVD-523을 이용한 다운스트림 ERK1/2의 표적화는 이들 암에 대한 합리적인 치료법이다. 또한, Hayes et al.에 의한 연구로부터의 결과는 KRAS-돌연변이 췌장암에서 연장된 ERK1/2 억제가 노화-유사 성장 억압과 관련되어 있음을 나타낸다(Hayes et al., 2016). 그러나, RAS 돌연변이의 설정에서 MAPK 신호전달의 최대 및 지속가능한 약화를 위해 조합 접근법이 필요할 수 있다. 예를 들면, KRAS-돌연변이 결장직장암 세포의 MEK 억제는 MEK 억제에 대한 반응을 약화시키는 ErbB 패밀리 활성화의 적응성 반응을 초래한다(Sun et al., 2014). BVD-523을 이용한 ERK1/2 억제 후 유사한 상황-특이적 적응 반응이 발생할 수 있다. 다양한 유전적 프로파일 및 암 조직학을 위한 최적의 치료법 조합이 진행중인 연구의 주제이다. BRAF V600 및 RAS 돌연변이 이외에도, MAPK를 유도하는 다른 변경이 발생하고 있다. 예를 들면, RAF 이량체화를 촉진시키는 신규한 RAF 융합 및 비정형 비-V600 BRAF 돌연변이는 MAPK 경로를 활성화시킨다(Yao et al. 2015). BRAF V600-돌연변이 단량체 단백질을 억제하는 베무라페닙 및 다브라페닙과 같은 BRAF 억제제는 이량체화-의존적 방식으로 MAPK 신호전달을 유도하는 비정형 RAF 변경에서 불활성인 것으로 나타났다(Yao et al. 2015). 그러나, 이들 종양에서 다운스트림 ERK1/2를 표적으로 하는 BVD-523을 이용한 치료는 충족되지 않은 의학적 요구를 해소하는 신규 접근법일 수 있다.
BRAF V600-돌연변이 흑색종 종양의 설정에서, 조합된 BRAF 및 MEK 억제는 동일한 경로의 상이한 노드를 표적으로 하는 제제가 치료 반응 및 지속기간을 향상시킬 수 있는 방법을 예시한다. 사람 흑색종 세포주 A375의 BRAF V600E-돌연변이 이종이식편에서의 본 발명자들의 조합 연구는 BVD-523 및 BRAF 억제제와의 조합 치료법을 지지한다. 상기 조합은 치유 반응과 일치하는 결과를 포함하는 단일 제제 처리에 비해 우수한 이점을 입증하였다. 조합된 BRAF/BVD-523 치료법의 임상학적 효능 및 내약성은 여전히 측정되어야 한다. BRAF/ERK1/2 조합이 적어도 표적화된 BRAF/MEK 조합에 대한 효능에서 비교될 것으로 기대하는 것은 무리일 수 있다. 또한, BVD-523에 대한 획득된 내성이 다른 MAPK 경로 억제제와 비교하여 달성하기가 더 어렵다는 시험관내 관찰은 BRAF/BVD-523 억제제 조합이 보다 지속가능한 반응을 제공할 가능성이 있음을 시사한다.
또한, 흑색종에 대한 면역 치료법을 사용하여 유의한 진전이 이루어졌다. 미국 FDA는 세포독성 T-림프구 항원-4 표적화된 제제 이필리무맙 및 프로그래밍된 사멸-1 억제제 펨브롤리주맙 및 니볼루맙을 포함하는 진행성 흑색종의 치료를 위한 다양한 면역 체크포인트(checkpoint) 억제제를 승인하였다. BVD-523을 이러한 면역 치료법과 조합하는 것은 매력적인 치료학적 옵션이고; 투약 스케쥴을 탐구하기 위해 그리고 상승작용적 반응이 달성될 수 있는지 여부를 평가하기 위해 추가의 조사가 보장된다.
전임상학적 데이터에 기초하여, BVD-523은 환자의 종양이 다른 치료법에 대해 획득된 내성을 갖는 환자들을 포함하는 MAPK 신호전달에 의존하는 악성 종양을 지닌 환자의 치료에 대한 가능성을 가질 수 있다. BVD-523의 임학적 개발은 하기에 설명되어 있다. 실시예 17 내지 실시예 24를 참조한다.
실시예 17
진행성 고형 종양을 지닌 환자에서의 혁신 신약(First-in-Class) 신규한 경구 ERK1/2 키나제 억제제 BVD-523(울릭세르티닙)의 페이즈 I 용량-단계적상승 연구
본 발명은 진행성 고형 종양을 지닌 환자의 치료를 위한 ERK1/2 억제제의 혁신 신약 용량-단계적 상승 연구를 기술한다. BVD-523은 유리한 약동학 및 임상학적 활성의 초기 증거와 함께 허용가능한 안전성 프로필을 갖는다.
RAS-RAF-MEK-ERK 캐스케이드를 통한 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 신호전달은 종양형성에 중요한 역할을 하고; 따라서 치료학적 표적으로서 유의한 관심을 끌고 있다. 이러한 유비쿼터스(ubiquitous) 경로는 단백질 키나제 RAF, MEK1/2 및 ERK1/2의 캐스케이드 업스트림의 RAS로 구성된다. RAS는 GTP 결합에 의해 활성화되고, 결국 순차적으로 각각의 단백질 키나제의 활성화를 초래한다. 이들은 MEK1/2에 대한 유일한 생리학적 기질인 것으로 밝혀지지만, ERK1/2는 전사 인자 Elk1, c-Fos, p53, Ets1/2 및 c-Jun을 포함하여 세포질 및 핵에 다수의 표적을 갖는다(Shaul et al. 2007). ERK1/2 활성화 및 키나제 활성은 리보솜 S6 키나제(RSK) 패밀리 구성원의 활성화를 포함하는 각종 메커니즘을 통해 세포 증식, 분화 및 생존에 영향을 미친다(Romeo et al. 2012).
RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2 신호전달 경로의 구성적이고 비정상적인 활성화가 확인되었고 다수의 암의 발달 또는 유지에 연루되어 있다(Schubbert et al. 2007 및 Gollob et al. 2006). KRAS, NRAS 및 HRAS와 같은 RAS 패밀리 유전자 내의 돌연변이가 가장 흔하며, 사람 암의 30%에서 활성화 RAS 돌연변이가 발생한다(Schubbert et al. 2007). KRAS 돌연변이는 췌장암(>90%)(Kanda et al. 2012), 담관암(3% 내지 50%)(Hezel et al. 2014), 결장직장암(30% 내지 50%)(Arrington et al. 2012), 폐암(27%)(Pennycuick et al. 2012), 난소암(15% 내지 39%)(Dobrzycka et al. 2009), 및 자궁내막양 자궁내막암(18%)(O'Hara and Bell 2012)에서 우세하고; NRAS 돌연변이는 흑색종(20%)(Khattak et al. 2013) 및 골수성 백혈병(8% 내지 13%)(Yohe 2015)에서 우세하고; HRAS 돌연변이는 방광암(12%)(Fernandez-Medarde and Santos 2011)에서 우세하다. 특히 흑색종에서 RAF 패밀리 유전자 내의 돌연변이, 가장 현저하게는 BRAF가 빈번하다. BRAF 돌연변이는 악성 흑색종의 66%에서 그리고 광범위의 다른 암의 약 7%(Davies et al. 2002)에서 확인되었고, 한편 MEK 돌연변이는 흑색종에서 전체 빈도 8%로 드물게 발생한다(Nikolaev et. al. 2012). 대조적으로, 종양형성을 초래하는 ERK 돌연변이는 현재까지 드물게만 보고되어 왔다(Deschenes-Simard et al. 2014).
미국 식약청(FDA)은 BRAF V600-돌연변이 전이성 흑색종을 갖는 환자를 위한 단일 치료법으로서 2개의 선택적 BRAF 억제제인 베무라페닙 및 다브라페닙을 승인하였다(Taflinar[패키지 삽입물] 및 Zelboraf[패키지 삽입물]). 이들 표적화된 치료법에 관한 반응률은 BRAF V600 돌연변이를 갖는 환자에서 50% 만큼 높을 수 있지만, 반응의 지속기간은 보통 수년이 아닌 수개월로 측정된다(Hauschild et al. 2012 and McArthur et al. 2014). MEK1/억제제 트라메티닙은 또한 이러한 설정에서의 단독 치료법으로서 승인되어 있지만(Mekinist[패키지 삽입물]), 보다 흔하게는 BRAF 억제제 다브라페닙과 조합으로 사용된다. 다브라페닙과 조합하여 투여된 트라메티닙의 제1선 사용은 전반적인 독성을 증가시키지 않고 베무라페닙 단독 치료법과 비교하여 전반적인 생존을 훨씬 더 향상시키고(Robert et al. 2015), 이는 이러한 MAPK 신호전달 경로의 다중 단백질을 동시에 표적화하는 것의 잠재적 유용성을 강조한다. 이러한 치료학적 조합은 또한 각각의 단일 제제 단독과 비교하여 MEK 억제제-관련된 발진 및 BRAF 억제제-유도된 과증식성 피부 병변의 보다 낮은 발생률과 관련되어 있었다(Flaherty et al. 2012). 최근, 페이즈 III 시험은 또한 BRAF V600E/K 돌연변이-양성 흑색종을 지닌 환자에서 다브라페닙 + 트라메티닙 대 다브라페닙 단독을 이용하여 전반적 생존의 유의한 향상(25.1 대 18.7개월, 위험비[HR] 0.71, P=0.0107), 무진행 생존(PFS)(11.0 대 8.8개월, HR 0.6, P=0.0004) 및 전반적 반응(69% 대 53%; P=0.0014)을 입증하였다(Long et al. 2015). 유사하게, PFS의 유의한 향상(9.9 대 6.2개월, HR 0.51, P<0.001) 및 완전 반응(CR) 또는 부분 반응(PR)의 비율(68% 대 45%; P<0.001)은 코비메티닙 + 베무라페닙의 조합을 베무라페닙 단독과 함께 이용하여 입증되었다(Larkin et al. 2014). 이를 위해, BRAF V600E/K-돌연변이된 흑색종에 대한 베무라페닙 및 코베메티닙의 조합에 대해 최근에 FDA 승인이 인정되었다. 이들 및 관련 발견에 기초하여, BRAF 억제제 + MEK 억제제의 조합은 BRAF V600E/K 돌연변이를 함유하는 전이성 흑색종을 지닌 환자에 대한 표준 표적화된 치료 옵션이 되었다.
BRAF/MEK-표적화된 조합 치료법은 단일 제제 옵션을 초과하여 유의한 추가의 이점을 제공하는 것으로 입증되었지만, 대부분의 환자들은 궁극적으로는 약 12개월 후에 내성 및 질환 진행을 발달시킨다(Robert et al. 2015, Flaherty et al. 2012 및 Long et al. 2015). BRAF 스플라이싱 변이체의 생성, BRAF 증폭, NRAS 또는 MEK 돌연변이의 발달, 및 우회 경로의 상향조절을 포함하는 단일 제제 또는 조합 치료법 중 어느 하나 후에 획득된 내성의 몇몇의 메커니즘이 확인되었다(Poulikakos et al. 2011, Corcoran et al. 2010, Nazarian et al. 2010, Shi et al. 2014, Johannessen et al. 2010, Wagle et al. 2011, Wagle et al. 2014 및 Ahronian et al.). 이들 내성 메커니즘들 중 다수는 MAPK 경로 신호전달의 신속한 회복 및 단일 제제 BRAF 또는 조합 BRAF/MEK 억제제 치료법으로부터의 종양 세포의 도피를 가능하게 하는 ERK 신호전달의 재활성화가 중요하다(Paraiso et al. 2010). ERK 억제는 이러한 MAPK 신호전달 경로의 가장 원위의 마스터 키나제이므로 업스트림 메커니즘으로부터의 내성을 회피하거나 극복할 기회를 제공할 수 있다. 이는 소분자 억제제에 의한 ERK의 억제가 BRAF 및 MEK 억제제에 대한 내성의 출현을 억제하고 또한 이들 억제제에 대한 획득된 내성을 극복하도록 작용하였다는 전임상학적 증거에 의해 지지된다(Morris et al. 2013 and Hatzivassiliou et al. 2012).
BVD-523은 BRAF 및 RAS 돌연변이체 이종이식 모델에서 종양 성장을 감소시키고 종양 퇴행를 유도하는 것으로 밝혀진, 매우 강력하고 선택적이며 가역적인 ATP-경쟁적 ERK1/2 억제제이다. 또한, 단일 제제 BVD-523은 BRAF 및 MEK 억제제 둘 다에 대해 교차-내성인 사람 이종이식 모델을 억제하였다. 실시예 9 내지 실시예 16을 참조한다. 따라서, 최대 내약 용량 및 추가의 연구를 위한 권장 용량 둘 다를 확인하기 위해 경구 BVD-523의 개방-표지 최초 사람(first-in-human) 연구(Clinicaltrials.gov identifier, NCT01781429)가 수행되었다. 또한 본 연구는 진행성 암을 지닌 환자의 약동학적 특성 및 약력학적 특성 및 예비 효능을 평가하는 것을 목적으로 하였다.
실시예 18
환자 특성
총 27명의 환자가 등록되었고, 2013년 4월 4일부터 2015년 12월 1일까지 적어도 1회 용량의 연구 약물을 투여받았다. 기저선 인구통계 및 질환 특성은 표 25에 나타낸다. 중간값 환자 연령은 61세(범위, 33 내지 86세)였다. 환자들의 52%(14/27)는 남성이었고 63%(17/27)는 ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 수행 상태가 1이었다. 흑색종이 가장 흔한 암이었다(30%; 이들 환자의 7/8에서 BRAF 돌연변이가 나타남). 나머지 환자들은 결장직장암(19%; 5/27), 유두상 갑상선암(15%; 4/27) 또는 비-소세포 폐암(NSCLC)(7%; 2/27)을 가졌고, 8명(30%)은 기타 암(2명 췌장암, 1명 충수암, 1명 비정상피종 생식 세포, 1명 난소암 3명 미지의 원발성 암)으로서 분류되었다. 대다수의 환자들은 2선 또는 보다 이전의 치료선의 전신 치료법을 투여받았고, 41%(11/27)는 2 내지 3선을 투여받았고, 48%(13/27)는 3선 초과의 전신 치료법을 투여받았다.
표 25 환자들의 기저선 인구통계 및 임상학적 특성
Figure pat00054
Figure pat00055
실시예 19
RSK1/2 인산화에 대한 BVD-523의 생체외 영향
임상학적 연구를 지원하기 위해 사용될 수 있는 생체외 바이오마커 검정은 ERK 활성에 대한 BVD-523의 억제 효과를 입증하기 위해 개발되었다. 상기 검정은 BVD-523, 다브라페닙, 트라메티닙 및 베무라페닙과 같은 MAPK 신호전달의 억제제가 BRAF 돌연변이 암 세포주에서 억제제 농도의 함수로서 RSK 인산화를 억제하는 것으로 밝혀진 경우 전임상 세포 데이터를 확장한다. 실시예 9 내지 실시예 16을 참조한다. 구체적으로, 전혈에서 ERK 기질인 RSK1의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate)-자극된 인산화의 ERK 억제제-의존적 억제를 표적 마커로서 사용하였다. BVD-523이 건강한 지원자 유래의 전혈에 직접 부가된 경우, PMA-자극된 RSK 인산화는 증가하는 농도의 BVD-523에 따라 감소하였다(도 38). 누적 데이터에 대한 평균 IC50은 BVD-523의 경우 461±20nM이었고, 10μM BVD-523에서 75.8±2.7%의 최대 억제를 가졌다. 최대 억제는 10μM BVD-523의 존재 하에 측정된 RSK 인산화로서 정의되었다. BVD-523 투약 직전에 또는 BVD-523 투약 후에 정의된 시점에서 수집한 환자-유도된 전혈 샘플을 유사하게 처리하였고 RSK 인산화 수준을 정량하였다.
실시예 20
용량 단계적상승, 용량-제한 독성(DLT), 최대 내약 용량(MTD) 및 권고 페이즈 II 용량(RP2D)
프로토콜에 따라, 5명의 단일 환자 코호트(10 내지 150mg 1일 2회[BID])는 DLT의 증거없이 진행되었다. BVD-523 노출을 보다 완전하게 특성확인하기 위해 300mg BID 코호트를 확장하였다. 600mg BID가 제공된 6명의 환자들 중 1명은 3등급 발진의 DLT를 경험하였다. 900mg BID 용량은 MTD를 초과하였고, 1명의 환자는 3등급 가려움증 및 상승된 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)를 경험하였고, 다른 환자는 3등급 설사, 구토, 탈수 및 상승된 크레아티닌을 경험하였다(표 26). 750mg BID의 후속적 중간 용량도 MTD를 초과하였고, 1명의 환자에서의 3등급 발진 및 다른 환자에서의 2등급 설사의 DLT, 2등급 저혈압, 상승된 크레아티닌 및 빈혈이 있었다. 따라서, MTD와 RP2D는 600mg BID로 결정되었다.
표 26 주기 1(21일)에서의 용량-제한 독성
Figure pat00056
약어: AST, 아스파르테이트 트랜스아미나제, BID, 1일 2회; DLT, 용량-제한 독성; N/A, 이용불가
실시예 21
유해 사건(AE)
임의의 등급의 조사자-평가된 치료-관련 AE는 27명 중 26명(96 %)에서 나타났다. 가장 흔한 치료-관련 AE(30% 초과)는 발진(주로 여드름)(70%), 피로(59%), 설사(52%) 및 구역(52%)이었다(표 27). 치료-관련 AE로 인하여 4등급 또는 5등급의 치료 관련 AE 또는 중단된 치료를 경험한 환자는 없었다. 대부분의 사건은 1등급 내지 2등급이었고, 치료-관련 3등급 사건은 27명 중 13명(48%)에서 나타났다. 환자의 10% 이상에서 나타나는 3등급 치료-관련된 유일한 사건은 설사(15%) 및 증가된 간 기능 검사(11%)였고, 이의 전부는 600mg BID 용량 초과로 발생되었다.
표 27 환자들의 10% 이상에서의 BVD-523에 관련되어 있을 가능성이 있는/BVD-523에 확실히 관련되어 있는 유해 사건
Figure pat00057
14명의 환자는 총 28개의 중증의 AE(SAE)를 경험하였다. 이들 중 9개는 조사자에 의해 BVD-523에 관련되어 있거나 이와 관련되어 있을 가능성이 있는 것으로 간주되었고, 이는 탈수, 설사, 또는 상승된 크레아티닌(각각 2명), 구토, 구역 및 발열(각각 1명)을 포함하였다. 모든 다른 SAE는 BVD-523을 이용한 치료와 관련되어 있지 않은 것으로 간주되었다. 연구 동안 3명의 환자들에서 AE로부터 초래되는 용량 감소가 발생하였다: 1명의 환자는 600mg BID에서 300mg BID로 감소되었고, 2명의 환자는 900mg BID에서 600mg BID로 감소되었다.
실시예 22
약동학
BVD-523의 단일-용량 및 정상-상태 약동학은 도 39a 및 표 28에 요약되어 있다. 일반적으로, 경구 투여된 BVD-523은 진행성 악성 종양을 지닌 환자에서 서서히 흡수되었다. 최대 농도(Cmax)에 도달한 후, 혈장 BVD-523 수준은 약 2 내지 4시간 동안 지속되었다. 후속적으로, 혈장 약물 농도는 서서히 감소하였다. 혈장 약물 농도는 아침 투약 후 최대 12시간째까지만 측정되었으므로, 유효 또는 말단 페이즈 제거율을 계산할 수 없었다. BVD-523 약동학은 600mg BID까지 투여했을 때 Cmax 및 곡선 아래 면적(AUC) 둘 다의 관점에서 선형이었고 용량 비례적이었다. 용량이 600에서 900mg BID로 증가함에 따라 노출의 추가의 증가는 관찰되지 않았다. Cmax는 20mg BID 초과의 모든 용량에 대한 생체외 전혈 검정(약 200ng/mL)에 기초하여 EC50의 수준에 도달하였다. 부가적으로, 정상-상태 노출은 투약 기간에 걸쳐 150mg BID 이상의 용량 수준에 대해 표적 EC50으로 또는 표적 EC50 초과를 유지하였다. BVD-523 및 이의 대사물질의 최소 혈장 축적은 15일째에 보다 낮은 용량 수준(<75mg BID)으로 관찰되었고, 반면 보다 높은 용량 수준에 대한 축적은 대략 1.3-배 내지 4.0-배 범위였다. 22일째의 투약전 농도는 일반적으로 15일째와 유사하였고, 이는 15일째까지 정상 상태가 이미 얻어졌음을 나타낸다(데이터는 표시하지 않음). BVD-523 및 이의 대사물질에 대한 혈장 노출의 환자간 가변성의 정도는 중간정도이고 문제가 없는 것으로 간주되었다.
표 28 정상-상태 BVD-523 약동학 (주기 1, 15일째)
Figure pat00058
BVD-523의 제1 투약 후 및 정상 상태에서의 소변 배설은 투약 후 12시간 이내에 모든 용량 수준에서 무시할만하였고(용량의 0.2% 미만), 이러한 매우 낮은 백분율 범위 내에서 용량-관련되어 있지 않았다. 신장 청소율(clearance)은 용량-독립적인 것으로 밝혀졌다. 개별 신장 청소율 값은 0.128 내지 0.0895L/hr(여기서, n = 1/용량 수준)의 범위였고 평균 값은 0.0149 내지 0.0300L/hr(여기서, n ≥ 3)의 범위였다.
실시예 23
BVD-523에 의한 표적 억제의 약력학적 확인
BVD-523에 의한 온-표적 및 경로 억제를 확인하기 위해, BVD-523을 투여받은 고형 종양을 지닌 환자로부터의 사람 전혈 샘플에서 RSK-1 인산화를 표적 바이오 마커로서 조사하였다. BVD-523-치료된 환자들로부터 투약 15일째 직전에 수집된 정상 상태 전혈 샘플은 10mg BID로의 BVD-523 투약을 이용한 0% ERK 억제 내지 900mg BID로 투약을 이용한 93±8% ERK 억제의 범위인 PMA 자극된 ERK 활성의 농도-의존적 억제를 나타내었다(도 39b). ERK 인산화의 50% 억제를 수득한 BVD-523의 혈장 농도는 BVD-523이 건강한 지원자 혈장에 직접 스파이크(spike)되었거나 환자의 경구 투약 후에 존재하였는지 여부와 유사하였다.
실시예 24
항종양 효과
고형 종양 버전 1.1의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1 (RECIST v1.1))을 사용하여 25명의 평가가능한 환자들에서 BVD-523에 대한 종양 반응을 평가하였고; 2명의 환자는 둘 다 표적 병변의 스캔을 받지 않았고, 따라서 RECIST v1.1을 이용하여 평가하지 않았다. 완전한 반응을 달성한 환자는 없었지만, 3명의 환자(BRAF V600 돌연변이를 갖는 흑색종을 지닌 모든 환자)은 부분 반응을 달성하였다(129일[BRAF/MEK-억제제 나이브], 294일 진행중[이전의 BRAF/MEK 억제제에 불응], 데이터 컷오프 날짜까지 313일 진행중[다른 BRAF/MEK 억제제에 불내성(intolerant)])(도 40a). 흥미롭게도, 3명의 부분 반응자들은 모두 BRAF-돌연변이 흑색종을 가졌다. BVD-523을 450mg BID의 용량으로 투여받았던 1명의 부분 반응자는 기저선으로부터 표적 병변의 총합의 대략 70%의 감소를 가졌고, 한편 다른 부분 반응자들은 47.0% 및 33.6%의 감소를 보였다. 안정한 질환은 18명의 환자에서 입증되었고, 6명은 6개월 초과 동안 안정한 질환을 가졌고, 6명의 부가적 환자들은 3개월 초과 동안 안정한 질환을 가졌다. 이러한 연구에서, 첫번째 평가에서 4명의 환자가 진행성 질환을 나타냈다.
도 40b는 이전의 베무라페닙 및 후속적 다브라페닙/트라메티닙 치료를 진행하였던 3명의 부분 반응자(RECIST v1.1)들 중 1명의 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔을 도시하고; 300일 초과 동안 BVD-523 600mg BID 투약 후에 지속가능한 부분 반응이 관찰되었다. BVD-523은 16명의 평가가능한 환자들 중 5명에서 플루오로데옥시글루코스-양성 방출 단층촬영(18F-FDG-PET)을 사용한 대사 반응과 관련이 있었다.
도 41은 연구 집단에서의 반응까지의 시간 및 반응 지속기간을 도시한다. BVD-523에 대한 반응을 입증한 2명의 환자는 연구를 유지하였고, 연구 컷오프 날짜(500일 초과)로 BVD-523 치료를 계속하였고; 부가적으로 기관지폐포성 NSCLC를 지닌 1명의 환자(분자 프로파일링을 위한 조직이 충분하지 않음)는 안정한 질환으로 700일 초과 동안 치료중이었다. 27명의 환자들 중 24명(90 %)이 진행성 질환(22/27, 82%) 또는 다른 이유(2/27, 7%)로 치료를 중단하였다. 중단 전 BVD-523 치료의 평균 지속기간은 4.7개월이었다.
논의
본 발명은 진행성 고형 종양을 지닌 27명의 환자에서 BVD-523의 안전성, 약동학, 약력학 및 예비 효능을 평가하는 최초 사람 연구로부터의 결과를 제시한다. 이러한 용량-단계적 상승 연구에서, BVD-523을 이용한 경구 치료는 RECIST v1.1에 의한 방사선사진 반응(3명의 부분 반응) 및 몇몇의 환자들에서의 연장된 질환 안정화 둘 다를 초래하였고, 이들의 대다수는 2개 이상의 이전의 전신 치료법으로 치료되었다. 종양에서의 대사 반응의 BVD-523-의존적 억제의 증거는 18F-글루코스의 종양 흡수를 영상화함으로써 환자들의 서브세트에서 확립되었다. 약물 노출은 600mg BID까지 증가하는 용량에 따라 선형으로 증가하였고, 600mg BID로의 노출은 생체외 전혈 검정에서 ERK-의존적 기질(RSK-1) 인산화의 거의 완전한 24/7 억제를 제공하였다. 또한, BVD-523에 대한 내약성은 600mg BID인 것으로 결정되는 이의 MTD 및 RP2D까지 투여할 때 관리가능하였다.
BVD-523은 일반적으로 관리가능하고 가역적인 독성으로 내약성이 우수하였다. 가장 흔한 AE는 발진(일반적으로 여드름 모양), 피로, 및 구역, 구토 및 설사를 포함하는 위장 부작용이었다. BVD-523의 안전성 프로파일은 MAPK 경로의 선택적 억제와 일치하고; AE 프로파일은 MEK 억제제 경험과 상당한 중첩을 보인다. 그러나, 임의의 표적화된 치료법과 관련된 독성은 특정 메커니즘 및 표적 억제 정도 및 임의의 오프-표적 효과 둘 다에 대한 의존성을 포함할 수 있다(Zelboraf[패키지 삽입물] 및 Hauschild et al. 2012). 진행중인 조사 및 장래의 조사는 이러한 용량-단계적 상승 연구에서 입증된 효능 및 안전성 프로파일 둘 다를 확장시킬 것이고, ERK 억제제 BVD-523의 고유한 프로파일이 단일 제제로서 또는 다른 제제와의 조합으로 사용될 수 있는 방법을 안내할 것이다.
RAF와 MEK 억제제에 의한 지속가능한 반응은 흔히 ERK 경로의 재활성화에 관여하는 공통의 특징과 함께 내인적인 그리고 궁극적인 획득된 내성에 의해 제한된다(Poulikakos et al. 2011, Corcoran et al. 2010, Nazarian et al. 2010, Shi et al. 2014, Johannessen et al. 2010, Wagle et al. 2011, Wagle et al. 2014, Ahronian et al. 2015 및 Paraiso et al. 2010). 따라서, BVD-523 단독 또는 다른 MAPK 신호전달 경로 억제제와 조합으로의 ERK 억제는 기존 치료법에 대한 내성의 발달을 지연시키고 광범위한 환자 집단에게 이익을 주는 잠재성을 가질 수 있다. BVD-523을 포함하는 해당 ERK 억제제는 BRAF- 및 MEK-내성 세포주에서의 이들의 효력을 유지하고, 치료 기준(standard of care)(BRAF/MEK 조합 치료법)에 대한 획득된 내성을 갖는 환자에서 ERK 억제제를 사용하기 위한 전임상학적 증거를 제공한다. 예를 들면, 실시예 9 내지 실시예 16을 참조한다. 중요하게도, 이러한 연구에서 처음에는 BRAF 억제제(베무라페닙)로 치료하고 후속적으로 BRAF 및 MEK 억제제(다브라페닙/트라메티닙)의 조합으로 치료한 경우 안정한 질환을 경험한 후 환자의 암이 진행된 환자는 단일 제제 BVD-523을 투여받을 때 부분 반응을 가졌다. 이러한 환자는 본원에 보고된 연구의 컷오프 날짜로 총 708일 동안 연구를 유지하였다. 이 환자에서 관찰된 항종양 효과에 부분적으로 기초하여, FDA는 BRAF 및/또는 MEK 억제제(들)을 이용한 치료 후 이에 대해 불응이거나 이를 진행한 절제불가능한 또는 전이성 BRAF V600 돌연변이-양성 흑색종을 지닌 환자의 치료를 위한 BVD-523의 조사를 패스트 트랙(Fast Track) 개발 프로그램으로서 명명하였다. BVD-523이 환자 치유(예를 들면, 단일 제제로서 또는 다양한 조합으로)를 가장 잘 지원할 수 있는 정확한 방법에 대한 세밀한 정의는 추가의 임상학적 연구를 필요로 한다.
요약하면, 본 실시예는 진행성 암을 지닌 환자에 대한 치료로서 신규한 혁신 신약 ERK 억제제인 BVD-523을 평가하는 페이즈 I 연구의 용량 단계적상승 부분으로부터의 초기 데이터 유래의 데이터를 제시한다. BVD-523을 이용한 1일 2회 경구 치료는 이용가능한 MAPK 경로-표적화된 치료법에 대해 나이브이거나 이를 진행한 환자들을 포함하는 몇몇의 환자들에서 항종양 효과를 초래하였다. BVD-523은 일반적으로 이러한 진행성 암 환자 집단에서 내약성이 우수하였고, 독성은 관리가능하였으며; MTD와 RP2D는 600mg BID였다. BVD-523 노출은 RP2D까지 선형으로 증가하였고 이 용량 수준에서 강력한 약력학 효과가 나타났다. 이러한 페이즈 I 임상학적 연구의 확장은 현재 용량-단계적 상승 페이즈에서 이루어진 관찰을 확인하고 확대하기 위해 진행중이다. 구체적으로, 환자는 다양한 종양 조직학에 걸쳐 분자 분류된 확장 코호트(예를 들면, NRAS, BRAF, MEK 또는 ERK 변경)에 등록되어 있다. 또한, 확장 코호트는 이용가능한 MAPK 경로 치료법에 나이브하거나 또는 이러한 치료에서 질환이 진행된 암을 지닌 환자에서의 BVD-523의 사용을 평가하고 있다.
문헌
Figure pat00059
Figure pat00060
Figure pat00061
Figure pat00062
Figure pat00063
Figure pat00064
Figure pat00065
Figure pat00066
Figure pat00067
Figure pat00068
Figure pat00069
본원에 인용된 모든 문헌은 본원에 전문이 인용된 것과 같이 참조로 본원에 포함된다.
본 발명의 예시적인 실시형태가 본원에 기재되어 있지만, 본 발명은 기재된 것들에 제한되지 않고, 다양한 다른 변경 및 변형이 본 발명의 범위 또는 취지에 벗어나지 않으면서 당해 기술분야의 숙련가에 의해 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOMED VALLEY DISCOVERIES, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING NON-ERK MAPK PATHWAY INHIBITOR-RESISTANT CANCERS <130> C065272/0398850pct <150> US 15/161,137 <151> 2016-05-20 <160> 82 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 2949 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgcctccctt ccccctcccc gcccgacagc ggccgctcgg gccccggctc tcggttataa 60 gatggcggcg ctgagcggtg gcggtggtgg cggcgcggag ccgggccagg ctctgttcaa 120 cggggacatg gagcccgagg ccggcgccgg cgccggcgcc gcggcctctt cggctgcgga 180 ccctgccatt ccggaggagg tgtggaatat caaacaaatg attaagttga cacaggaaca 240 tatagaggcc ctattggaca aatttggtgg ggagcataat ccaccatcaa tatatctgga 300 ggcctatgaa gaatacacca gcaagctaga tgcactccaa caaagagaac aacagttatt 360 ggaatctctg gggaacggaa ctgatttttc tgtttctagc tctgcatcaa tggataccgt 420 tacatcttct tcctcttcta gcctttcagt gctaccttca tctctttcag tttttcaaaa 480 tcccacagat gtggcacgga gcaaccccaa gtcaccacaa aaacctatcg ttagagtctt 540 cctgcccaac aaacagagga cagtggtacc tgcaaggtgt ggagttacag tccgagacag 600 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Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Pro Glu Glu Val Trp Asn 35 40 45 Ile Lys Gln Met Ile Lys Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu Leu 50 55 60 Asp Lys Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu Ala 65 70 75 80 Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg Glu Gln 85 90 95 Gln Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser 115 120 125 Val Leu Pro Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Asn Pro Thr Asp Val Ala 130 135 140 Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe Leu 145 150 155 160 Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr Val 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro Glu 180 185 190 Cys Cys Ala Val Tyr Arg Ile Gln Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile Gly 195 200 205 Trp Asp Thr Asp Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val Glu 210 215 220 Val Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys Thr 225 230 235 240 Phe Phe Thr Leu Ala Phe Cys Asp Phe Cys Arg Lys Leu Leu Phe Gln 245 250 255 Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gln Arg Cys Ser 260 265 270 Thr Glu Val Pro Leu Met Cys Val Asn Tyr Asp Gln Leu Asp Leu Leu 275 280 285 Phe Val Ser Lys Phe Phe Glu His His Pro Ile Pro Gln Glu Glu Ala 290 295 300 Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala Pro 305 310 315 320 Ala Ser Asp Ser Ile Gly Pro Gln Ile Leu Thr Ser Pro Ser Pro Ser 325 330 335 Lys Ser Ile Pro Ile Pro Gln Pro Phe Arg Pro Ala Asp Glu Asp His 340 345 350 Arg Asn Gln Phe Gly Gln Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ala Pro Asn Val 355 360 365 His Ile Asn Thr Ile Glu Pro Val Asn Ile Asp Asp Leu Ile Arg Asp 370 375 380 Gln Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu Ser Ala Thr 385 390 395 400 Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu Gln 405 410 415 Lys Ser Pro Gly Pro Gln Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser Glu 420 425 430 Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Ser Asp Asp 435 440 445 Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gln 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gccttgctca ctgggctccg cctaaccact caggctgctc 3300 agtgctggca cacattgcct tcttttctca ttgggtccag caattgagga gagggttggg 3360 ggattgtttc ctcctcaatg tagcaaattc tcaggaaaat acagtccata tcttcctctc 3420 agctcttcca gtcaccaaat acttacgtgg ctcctttgtc caggacataa aacaccgtgg 3480 acaacaccta attaaaagcc tacaaaactg cttactgaca gttttgaatg tgagacactt 3540 gtgtaattta aatgtaaggt acaggtttta atttctgagt ttcttctatt tttatttaaa 3600 agaagaaaat aattttcagt tttaattgga ataaatgagt acttcccaca agactatata 3660 ccctgaaaat tatatttttg ttaattgtaa acaactttta aagaataatt attatccttt 3720 tctctaccta aaaattatgg ggaatcttag cataatgaca attatttata ctttttaaat 3780 aaatggtact tgctggatcc acactaacat ctttgctaac aatcccattg tttcttccaa 3840 cttaactcct acactacatc ctacatcctc tttctagtct tttatctata atatgcaacc 3900 taaaataaac gtggtggcgt ctccattcat tctccctctt cctgttttcc ccaagcctgg 3960 tcttcaaaag gttgggtaat cggtccctga gctccctagc tggcaatgca actattaggg 4020 acattggagt tgcaggagag caggaagcct gtccccagct gttcttctag aaccctaaat 4080 cttatctttg cacagatcaa 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<400> 26 Met Lys Ile Gln Met Ser Ser Val Lys Val Trp Asn Ile Lys Gln Met 1 5 10 15 Ile Lys Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu Leu Asp Lys Phe Gly 20 25 30 Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu Ala Tyr Glu Glu Tyr 35 40 45 Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg Glu Gln Gln Leu Leu Glu 50 55 60 Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser Ser Ser Ala Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Val Leu Pro Ser 85 90 95 Ser Leu Ser Val Phe Gln Asn Pro Thr Asp Val Ser Arg Ser Asn Pro 100 105 110 Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe Leu Pro Asn Lys Gln 115 120 125 Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr Val Arg Asp Ser Leu 130 135 140 Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro Glu Cys Cys Ala Val 145 150 155 160 Tyr Arg Ile Gln Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile Gly Trp Asp Thr Asp 165 170 175 Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val Glu Val Leu Glu Asn 180 185 190 Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys Thr Phe Phe Thr Leu 195 200 205 Ala Phe Cys 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tcccacagat gtgtcacgga gcaaccccaa gtcaccacaa aaacctatcg 660 ttagagtctt cctgcccaat aaacagagga cagtggtacc tgcacggtgt ggagtcacag 720 tccgggacag cctgaagaag gcactgatga tgagaggtct aatcccagag tgctgtgctg 780 tttacagaat tcaggatggg gagaagaaac caattggctg ggacactgat atttcctggc 840 ttactggaga ggagttgcat gtagaagtgt tggagaatgt tccacttaca acacacaact 900 ttgtacggaa aacttttttc accttagcat tttgtgactt ctgtagaaag ctgcttttcc 960 agggattccg ctgtcaaaca tgtggttata aatttcacca gcgttgtagt acagaggttc 1020 cactgatgtg tgttaattat gaccaactag atttgctgtt tgtctccaag ttctttgaac 1080 accacccaat accacaggag gaggcctcct tagcagagac tacccttcca tgtggctcat 1140 ccccttctgc acccccctcc gattctattg ggcccccaat tctcaccagt ccatctcctt 1200 caaaatccat tccaattcca cagcctttcc gaccagcaga tgaagatcat cgaaatcagt 1260 ttggacaacg agaccggtcc tcatcagctc caaatgtgca tataaacaca atagaacccg 1320 tcaatattga tgacttgatt agagaccaag ggtttcgtag tgatggagga tcaaccacag 1380 gtttatccgc cacaccccct gcctcattac ctggctcact ctctaatgtg aaagcattgc 1440 agaaatctcc aggacctcag cgagaaagaa agtcctcttc atcctcagaa gacaggaatc 1500 gaatgaaaac gcttggtaga cgggattcaa gtgacgattg ggagattcct gatggacaga 1560 tcacagtggg acaaagaatt ggatcagggt catttgggac agtctacaag ggaaagtggc 1620 atggtgatgt ggcagtgaaa atgttgaatg tgacagcacc cacacctcag cagttacagg 1680 ccttcaaaaa tgaagtagga gtactcagga aaacgcgaca tgtgaatatc ctcctcttca 1740 tgggttattc aacaaagcca caactggcta ttgttaccca gtggtgtgag ggctccagtt 1800 tatatcatca tctccacatc attgagacca aattcgagat gatcaaactt atagatattg 1860 cacggcagac tgcacagggc atggattact tacacgccaa gtcaatcatc cacagagacc 1920 tcaagagtaa taatattttt cttcatgaag acctcacagt aaaaataggt gattttggtc 1980 tagccacagt gaaatctcga tggagtgggt cccatcagtt tgaacagttg tctggatcca 2040 ttttgtggat ggcaccagaa gtaatcagaa tgcaagataa aaacccatat agctttcagt 2100 cagatgtata tgcatttggg attgttctgt atgaattgat gaccggacag ttaccttatt 2160 caaatatcaa caacagggac caggtgcttt gtcctccatg ggagtgtaat aaatgctgtg 2220 caagggctta cttcccatga gagaagtgag tgaccaacag aaggtctgtg caaggaaaag 2280 agacaaagcc acggatcaga 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gcttgtgagc ataatcatat ttgctttata tttatagtca 3840 tgaactccta agttggcagc tacaaccaag aaccaaaaaa tggtgcgttc tgcttcttgt 3900 aattcatctc tgctaataaa ttataagaag caaggaaaat tagggaaaat attttatttg 3960 gatggtttct ataaacaagg gactataatt cttgtacatt atttttcatc tttgctgttt 4020 ctttgagcag tctaatgtgc cacacaatta tctaaggtat ttgttttcta taagaattgt 4080 tttaaaagta ttcttgttac cagagtagtt gtattatatt tcaaaacgta agatgatttt 4140 taaaagcctg agtactgacc taagatggaa ttgtatgaac tctgctctgg agggagggga 4200 ggatgtccgt ggaagttgta agacttttat ttttttgtgc catcaaatat aggtaaaaat 4260 aattgtgcaa ttctgctgtt taaacaggaa ctattggcct ccttggccct aaatggaagg 4320 gccgatattt taagttgatt attttattgt aaattaatcc aacctagttc tttttaattt 4380 ggttgaatgt tttttcttgt taaatgatgt ttaaaaaata aaaactggaa gttcttggct 4440 tagtcataat tctt 4454 <210> 46 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile 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3104 <210> 58 <211> 189 <212> PRT <213> Felis catus <400> 58 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp 165 170 175 Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met 180 185 <210> 59 <211> 4283 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 59 ggccgctccc tagtgggggc tgttcatggc ggttccgggg tctcccaaca attttcccgg 60 ttgtggtcgt aatctatccg aagtggaggc agtggagcta gaggttcttg ctggtgtgaa 120 atgactgagt acaaactggt ggtggttgga gcaggtggtg ttgggaaaag tgcactgaca 180 atccagctaa tccagaacca ctttgtagat gaatatgatc ccaccataga ggattcctac 240 cgaaaacagg tggttataga tggtgaaacc tgtctgttgg acatactgga tacagctgga 300 caagaggagt acagtgccat gagagaccaa tacatgagga caggcgaagg cttcctttgt 360 gtgtttgcca tcaataatag caaatcattt gcagatatta acctctacag ggaacagata 420 aagcgtgtaa aggactcgga tgatgtacct atggtgctag taggaaacaa gtgtgatttg 480 ccaacaagga cagttgacac aaaacaagcc catgaactgg ccaaaagtta tgggattcca 540 ttcattgaaa cctcagccaa gaccagacag ggtgttgaag atgcctttta cacactggta 600 agagaaatac gtcagtaccg aatgaaaaag ctcaacagca gtgatgatgg cactcaaggc 660 tgtatggggt tgccgtgtgt ggtgatgtaa caagatactt ttaaagttct cacatcagaa 720 aagagccact gtcaagctgc actgacaccc tggtcctgac ttccctggag gagaagtatt 780 cctgttgcta tcttcagttt caaaaagaag ctcctgctat ttccccaact ctcagtagat 840 caatataata ttctctattt gagaagttct caagaataac tacctcctca cttggttgtc 900 tgaccagaga attgaacctc ttgttactcc cagtattttt ccaccctggg ttctccccca 960 gcacacacaa acgcacctct gccacccagg tttttcatct gaaaagcaat taatactctg 1020 aaacagagaa ccaaactgta gaaacatgaa attctgtaga aaacaatgtc ttgagctcta 1080 aagtagcaac tgctggtgat tttttttttt tttttttcct ttttattgtt gaacttggaa 1140 ctatgttggt ttgtggagaa atgtcataaa ttactgtttt gctgagaata tagttaatgt 1200 tgctctctgg tttgtttgta atgttatcag ctatattcta taaactggca tctactctgt 1260 atttagaaat acaaaaatga atactgacct tttgagtcta ccctcatctt ctcgactttc 1320 ttgtaattaa atgtaacttt cacgatgaag tgccttttgc ctgggagtga ctcgtagact 1380 tcctttaaaa tacttcagtg gaatagatgt ctcagaaact gttatacata agaataaatg 1440 tctgagatat gtctatgacc catctagctt tgagggaaag atataccaat atgatagcag 1500 atgccatttc ttacatctat aacgttgatt ttctggagac ctattttggg gctctccgag 1560 agaaagatga gactataaat gattaggaat aatttcactt aatttttaca taacctccac 1620 tttttgtttt gtagtttact acctgcaaaa catataattt gattcctttt agcttacaga 1680 taatctaatg ttaaatgaac ttccattcat attttaattt ggatcatatc aggaagtcta 1740 catttgcagg tgttcaaaaa ttgtaaaagt gtgatgcagt tttatttaat agctgtgatc 1800 aatgattttc aagcctcaaa tatgttaata gacacatttt cactgtatat catggtatta 1860 ataattattg atgtatataa ttgtccttgg tccccttctc tgttcatcac ctcatggcaa 1920 tggcttgatt aattatttca gctgagtaaa gcatggtgct aatagaccag ggtcacagtg 1980 tcaaaacttc agtgagccag taagcatcac agagaaagaa attctttcac atttgctcac 2040 cattaactcc agctaatagt tttgccagat gtgtgtggtt agtcctgcaa ggaaaggaga 2100 agtcagttaa tacaaattct taaccaggac tggaaaaact tgttttcctg agaagggtca 2160 gcttagaagt ctttatctgg actctatttt tagccacatg gaaatcaaat taagctgatc 2220 ttttttctca agtttttgag agtgaggatg cctcagatca acatttttaa aatattcttt 2280 attcttacgt tcttttaagg gtttaaaaca acgttgagta attagtctgg gcataccagg 2340 taacaagctg ataagtttgt gctgaacaag aagtagcctt tggattgaaa ttgctgtttt 2400 gagaagggat agaaaatata attaataatt atgagacttg acttttctat ttgcagataa 2460 tatcctgata attctgatga aaatagactt ggataatttt tgataaaaga atcgttccaa 2520 aatggccact 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agaatgctac ttggtaatat catactcgtt acagttttca cttcaggagt 3420 gtactaggta gaatgatcct gtgtgtattg tagtgggctc catgtttagt cttttcagca 3480 tcctttaaac tgctgtgaat ttttgtcttg acttgaaagc aaggatagag aaacacttta 3540 aagagatact ttgggttttt ttccattcca gaattggtga gcatagttag attttgcttt 3600 acatttacag tcatgaactc ttaagctggc agctacaacc aagaaccaaa agagggtgca 3660 ttctgcttct tgtaattcat ctttgctaat aaattatgag aagcaaagat aattaattag 3720 agaaactatt ttatttgggt ggtttctata aacaagggac tataattctt aaacattatt 3780 tttcattttt gctgtttctt taagaaacct aatgtgccac aacattattt taaggtgttt 3840 cttaaaagaa ttgtttttaa aagtgttctc attttcagag taattgtaga tatatttcaa 3900 aatataactg ataattttta aaggcctgag tactgaccta agaagcagtt gtatgaattc 3960 tctgggggga agggaggagc tcagtgaaag ttgtatgact tttatatttc tgtgccatca 4020 aataaaggta aaaatgtctt ttgtgcagtt ttgctgttca aacagaaact attggcctcc 4080 ttggccctaa atgaaagggc tggtatttta agttgactat tttattgtaa attaatccat 4140 cttaattttt ttaaatttgg ttgaatgttc tcttgttaaa tgtttaaaaa ataaaaactg 4200 gaagttcttt 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Leu Pro Cys Val Val Met 180 185 <210> 61 <211> 4825 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 61 gcgccgggac cggaagccgg aagctttgca gaagggtgtt ccgcgttcgc ggtgcgggag 60 cggtcagccg gggtggcggg gctggggccg gccggggcag gcggctccgc gctccgcact 120 gggccgctgg gagggcgatg actgaataca agctggtggt ggtgggagct ggcggcgtcg 180 ggaagagcgc gttgaccatc cagctcatcc agaaccactt cgtggacgag tacgacccca 240 ccatcgagga ttcgtacaga aagcaggttg tcatcgatgg agagacgtgc ttgttggaca 300 ttctggacac tgcaggacag gaagaataca gtgctatgcg tgatcagtac atgagaactg 360 gggaaggatt cctttgtgtg tttgccatta acaacagtaa atcattcgct gatattaacc 420 tttacagaga gcaaatcaag agagtgaaag attcagacga tgtgccaatg gtgctggtgg 480 ggaataagtg cgatttgcca acaaggacag tagacaccaa acaggctcaa gagttagcaa 540 aaagctacgg cattcccttc atagagacat cagccaaaac gagacagggt gtggaagatg 600 cgttttacac actggtgagg gagattcggc agtaccggat gaaaaagctc aacagcaacg 660 aagatgggaa tcagggctgt atggggttgt cctgcattgt gatgtgataa gatgccaggt 720 tcagatgtag ctgctggaca agtctcgatg ctactgtatt gtgtctcatg ctgatgccct 780 gcagtatttt ggtgccagcg accagactct tggtaccagt taattagctc aggatccttt 840 cctgtgctcc atctgaagaa aacatctctg gtatctacct ccttgctcag ctcacagagc 900 agtcatatct cttggtgtac tgggattctt ttctagctgt gttgtctggg tttgttcaag 960 aagaaaacca gtcacaagaa aagtgaatta cagagactaa atgctgtgaa aaagatcaca 1020 ctttacctcc agagtaaaag ctagaagtgg cgtttgaccc ctttgcattg gattcagatt 1080 tgcggtgttg tcagaggagt ggcagaagta attttgccat tacaaaggtt tctgtcacca 1140 gtcggattgg tatctgctgt ctgtgcaccc acacagtgta tctgcaacat ctgcattgtg 1200 ccagaagtat cacttaactg atgaactgat cctttatttt tctgtaataa aaaggagata 1260 tctttgctaa cttaagtgcc tgtttgctca gaaggttgga ggttgtatgc tgttcccttg 1320 ggctgaggag aaccccaagg atgaatttct tgggtgctca ttgtcttgag caggcaagtt 1380 ttgtgtgggt gatctctttt catggcagga tattaaaatg ggaatttgta gtctggaaga 1440 tggagcagct gtttgtgaga ctcttgagtt agggagagaa atgtatacca cgtctgttct 1500 cgatccatca gaatggatcc atccacctct ttgtgtgtgg aactgtgtat agtctgtatt 1560 ggttttctac agcacttgga tctctttgga ccaaattagc gagctgttca ttttaacata 1620 actgccagta tttatagaca atttcttacg gacagataat gaatttagaa actggaggtt 1680 actttgggca gctgttcctc agctctgtct gtaacttgca aattattctg agttattttc 1740 tgcagaacct ccttccttat cacgggagga gcctgggagt tgaggttgac tgtaattggg 1800 tcaatggttg tcacagactt aaggtgtcca ggctgattgg aggaggcact gagccctaac 1860 agagcactga gctgacttct aattgcagca tccttgcaaa atgaggaagg gagttcagtg 1920 atgtctgcac tgaagatgta tgatacactg atagcagttc tgggtatgtt gtaacagctt 1980 caaagtagaa ccgcagtact gcgtgagctg tgtgacttct tcctagaaca cagcactgtc 2040 accccatatg gttgggacgt gcaggtgaga ccaacaccta ccaggttccc tggcgtaccg 2100 tggccttctc agttcttgtg ccagtgatac tgggttctgt tctgtggtgt cagacagcgt 2160 cctgtagcaa agctgaattc ccacttagtc tggtgagaga ataaagagcc atcagccaac 2220 agagggagcg ttcattctgc tggagcagtg cgagctgtaa gcattacgag aggcgtagtt 2280 tcagtttgtt gcagtcaggt tcctatattt tcaaagctga aatcagaaat aagtaaatac 2340 ggagaaaata agctgttgct tttaatgctc tttcctccac taattgtact cttaattttc 2400 ttcttgggag gccgaggatc catctgcata actttagctg tgatgctcca gataagtgtt 2460 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aagttgcatc aactttcagg acgctgcaga gctcacttgc acaggtggtg ctccagtcta 3360 tgtgattttt ggggtcaaat cttgagatga tcttacaaaa tcagattttg tacccatcat 3420 gagcatgagg tgagtggttg tgctcggttt ctagctgcat gtatgtatac agacacgtgt 3480 atgcagacat gtctatgtgt gagtagttcg agtcagtcaa ggttactggc agcacctaaa 3540 gcgtatgcac cacataatgc atgcaggcaa aagtcctatc ttaggagcca tctcttcatg 3600 ggtttgggtt tatataggca gtatttttaa acagaatatc cgaagcactt tctggagttc 3660 tgtggtaatg cagtgacacc tatttggatg aaggaagatg tgtctgagga gcacgtaagc 3720 agatttgctg ccctaacaga gaggttttgg taaccgtgga aaaggttttc tcctggatct 3780 gtgtgtgctc ttggtgagct gcaatccatg acagggcaca accagatgag aaggaaaccc 3840 ggccatccca tgcttgagca cagctctgac tcagtagttc caccagatgt gccctttcag 3900 tcaaagtgtt ctgatctctt agagctttct gtagttcaag ttaccactca ctctccagct 3960 tgctcggtta atgtctgttg gcggcgttga gttggacttg ggaaaggtgt gtgtggtagg 4020 aacaagcaga gtgtgatgtg cttctgttat caggacttaa gctagagtgg ttggcagata 4080 ggaaatgcag ctattccttg aaagcaagca gatcatggat ggtcagccaa actgccctgg 4140 ctttggtggg agctgcactg cagaaggacc aaaccccaac aagatttggc acatttgttt 4200 agaagataag cacagatggt tttgcacaag gcagctcctc ataatggtgg ctttgtagat 4260 ttagtccaaa tgttcttatt tagatctagc agcacatcac tgtgtccgtg cccatctaac 4320 ctcgctatcc taagtagagc agaccccaaa caaccttgtt caaaaactac cagtgcaaat 4380 aactgaacta aatatttgtt actgctgact gagaacagct gttcgagtgt agcattgtgg 4440 cttgttaatg tgagtgcccc aactctatgg tcttattaaa gaaacccaaa cattgctcag 4500 attttgttct tattgtcatc ataagacttg aatagtgatg gtaatgctta cgtagacgtg 4560 tcttgtgagt gcacttcagt gatttagaaa gaactggatt tcaagcaact ttggacctgt 4620 ggggggaggg agattaatga aggtttgaat cacattctaa ttctatgtac agtccttcat 4680 tactccacaa gcctaaatcc tatacagcct ccaggatagc tggaaactgt tgagatctgg 4740 actttttttt tttaatccaa gggctaactt gttgtaactt ggtataatta tctgctttcg 4800 gaaatgcatc tctgttggtt tgaaa 4825 <210> 62 <211> 189 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 62 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val 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tggttggttg agagagagag 180 aggaagggaa tcccgggctg ccgaaccgca cgttcagccc gctccgctcc tgcagggcag 240 cctttcggct ctctgcgcgc gaagccgagt cccgggcggg tggggcgggg gtccactgag 300 accgctaccg gcccctcggc gctgacggga ccgcgcgggg cgcacccgct gaaggcagcc 360 ccggggcccg cggcccggac ttggtcctgc gcagcgggcg cggggcagcg cagcgggagg 420 aagcgagagg tgctgccctc cccccggagt tggaagcgcg ttacccgggt ccaaaatgcc 480 caagaagaag ccgacgccca tccagctgaa cccggccccc gacggctctg cagttaacgg 540 gaccagctct gcggagacca acttggaggc cttgcagaag aagctggagg agctagagct 600 tgatgagcag cagcgaaagc gccttgaggc ctttcttacc cagaagcaga aggtgggaga 660 actgaaggat gacgactttg agaagatcag tgagctgggg gctggcaatg gcggtgtggt 720 gttcaaggtc tcccacaagc cttctggcct ggtcatggcc agaaagctaa ttcatctgga 780 gatcaaaccc gcaatccgga accagatcat aagggagctg caggttctgc atgagtgcaa 840 ctctccgtac atcgtgggct tctatggtgc gttctacagc gatggcgaga tcagtatctg 900 catggagcac atggatggag gttctctgga tcaagtcctg aagaaagctg gaagaattcc 960 tgaacaaatt ttaggaaaag ttagcattgc tgtaataaaa ggcctgacat atctgaggga 1020 gaagcacaag atcatgcaca gagatgtcaa gccctccaac atcctagtca actcccgtgg 1080 ggagatcaag ctctgtgact ttggggtcag cgggcagctc atcgactcca tggccaactc 1140 cttcgtgggc acaaggtcct acatgtcgcc agaaagactc caggggactc attactctgt 1200 gcagtcagac atctggagca tgggactgtc tctggtagag atggcggttg ggaggtatcc 1260 catccctcct ccagatgcca aggagctgga gctgatgttt gggtgccagg tggaaggaga 1320 tgcggctgag accccaccca ggccaaggac ccccgggagg ccccttagct catacggaat 1380 ggacagccga cctcccatgg caatttttga gttgttggat tacatagtca acgagcctcc 1440 tccaaaactg cccagtggag tgttcagtct ggaatttcaa gattttgtga ataaatgctt 1500 aataaaaaac cccgcagaga gagcagattt gaagcaactc atggttcatg cttttatcaa 1560 gagatctgat gctgaggaag tggattttgc aggttggctc tgctccacca tcggccttaa 1620 ccagcccagc acaccaaccc atgctgctgg cgtctaagtg tttgggaagc aacaaagagc 1680 gagtcccctg cccggtggtt tgccatgtcg cttttgggcc tccttcccat gcctgtctct 1740 gttcagatgt gcatttcacc tgtgacaaag gatgaagaac acagcatgtg ccaagattct 1800 actcttgtca tttttaatat tactgtcttt attcttatta ctattattgt 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gaagaagctg gaggagctgg 180 agcttgatga gcagcagcgg aagcgccttg aggcctttct cacccagaag cagaaggtcg 240 gggaactgaa ggatgacgac ttcgagaaga tcagtgagct gggtgctggc aacggtggcg 300 tggtgttcaa ggtctcccac aagccgtccg gcctagtcat ggccagaaag ctaattcacc 360 tggagatcaa acctgcaatc cggaaccaga tcataaggga gctacaggtt ctacatgagt 420 gcaactcccc gtacatcgtg ggcttctatg gtgcattcta cagcgatggc gagatcagta 480 tctgcatgga gcacatggat gggggttcct tggatcaagt cctgaagaaa gctggaagaa 540 ttcctgaaca aattctagga aaagttagca tcgctgtaat aaaaggtctg acatacctga 600 gagagaagca caagattatg cacagagatg tcaagccttc caacatcctc gtgaactccc 660 gtggggagat caagctctgt gactttgggg tcagcgggca gctcattgac tccatggcca 720 actccttcgt gggcacaagg tcctacatgt cgccagaaag actccagggg actcattact 780 ccgtgcagtc ggacatctgg agcatggggc tctctctggt ggagatggca gttgggaggt 840 atcccatccc tcctccggat gccaaggagc tggagctgat gtttgggtgc caagtggagg 900 gagacgtggc tgagacccca cccagaccaa ggaccccggg aagacccctt agctcttatg 960 gaatggacag ccgaccgccc atggcaattt ttgagctgtt ggattacata gtcaacgagc 1020 cccctccaaa actgcccagt ggagtattca gtctggaatt tcaagatttt gtgaataaat 1080 gcttaataaa aaacccagca gagagagcag atctgaagca actcatggtt catgccttca 1140 tcaagagatc tgacggtgaa gaagtggatt ttgcaggttg gctctgctcc ccccattggc 1200 cttaaccagc ccagcacgcc gacccacgca gctggcgtct aactcgagtc tagagat 1257 <210> 74 <211> 381 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 74 Met Pro Lys Lys Lys Pro Thr Pro Ile Gln Leu Asn Pro Ala Pro Asp 1 5 10 15 Gly Ser Ala Val Asn Gly Thr Ser Ser Ala Glu Thr Asn Leu Glu Ala 20 25 30 Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Asp Glu Gln Gln Arg Lys 35 40 45 Arg Leu Glu Ala Phe Leu Thr Gln Lys Gln Lys Val Gly Glu Leu Lys 50 55 60 Asp Asp Asp Phe Glu Lys Ile Ser Glu Leu Gly Ala Gly Asn Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Phe Lys Val Ser His Lys Pro Ser Gly Leu Val Met Ala Arg 85 90 95 Lys Leu Ile His Leu Glu Ile Lys Pro Ala Ile Arg Asn Gln Ile Ile 100 105 110 Arg Glu Leu Gln Val Leu His Glu Cys Asn Ser Pro Tyr Ile Val Gly 115 120 125 Phe Tyr Gly Ala Phe Tyr Ser Asp Gly Glu Ile Ser 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ggcttcacca gtctgtctac tgtgatgatt tgtagacttc tggttgtatt 2100 tctgtattta tttttaaatc taccgtgtgg atatttagtg ctatgtctct ttaagtttgg 2160 attagtgttt ctaaaatggt ggagttgctc tgaatgttac aaatggatca aggcattaaa 2220 atgaatgaga tctacctttc accaagtact gatgctattg taaacaacag tgtgtatagt 2280 gcctaacaac tgtatgaaaa tccttttacc attttaatcc agatgtttaa caagcctaat 2340 ctcttactct aataaatata ctatcaaatt caaaggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaa 2405 <210> 78 <211> 393 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 78 Met Pro Lys Lys Lys Pro Thr Pro Ile Gln Leu Asn Pro Ala Pro Asp 1 5 10 15 Gly Ser Ala Val Asn Gly Thr Ser Ser Ala Glu Thr Asn Leu Glu Ala 20 25 30 Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Asp Glu Gln Gln Arg Lys 35 40 45 Arg Leu Glu Ala Phe Leu Thr Gln Lys Gln Lys Val Gly Glu Leu Lys 50 55 60 Asp Asp Asp Phe Glu Lys Ile Ser Glu Leu Gly Ala Gly Asn Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Phe Lys Val Ser His Lys Pro Ser Gly Leu Val Met Ala Arg 85 90 95 Lys Leu Ile His Leu Glu Ile Lys Pro Ala Ile Arg Asn Gln Ile Ile 100 105 110 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gtctttattc ttattactat 1380 tgttattccc ctaagtggat tggctttgtg cttgggacta ttttgtgtat gttgatgatc 1440 aaaacatgcg caatgttgaa ttaccgtgaa actggtgact gtgggtagtc cttcttattg 1500 aaaattgcac tgctcttccc tccctgtcac tggctggctg cctgtatttc tggggttctt 1560 tgacacttgg tggtacttca ttcttgcagg gcatacctcc tattcgagta ggaaggagcc 1620 tttaagatcc ttcacaggca gtgcatgtga agcatgcttt gctgctatga aaatgagcat 1680 cagaaagtgt atatcatgtt attttattat tattatgttt ttgcttttgg tgtagaattc 1740 agcaatttcc atcaagatct agccagagcc cttcactgcc atgatagctg gggcttcacc 1800 agtctgccta ctgtgatgat ttgtagactt ctggttgtat ttctatattt atttttaaat 1860 atactgtgtg ggatatttag tggtatatgt ctctctaagt ttggagtggt gtttctaaaa 1920 tggagttact ttgaatgtta tagatggatc aaggcataaa atgtatgaga tttatttttc 1980 cccaaatcca aatactgatg ctattgtaaa caacaaacag tgtgtatagt gcctaaaaat 2040 tgtatgaaag tccttttaac cattttaatc cagatgttta acaaatctaa tctcttattc 2100 taataaatat actatcaagt taaacggaca aaagatttct actttc 2146 <210> 80 <211> 371 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 80 Met Lys Pro Glu Arg Thr Asn Leu Glu Ala Leu Gln Lys Lys Leu Glu 1 5 10 15 Glu Leu Glu Leu Asp Glu Gln Gln Arg Lys Arg Leu Glu Ala Phe Leu 20 25 30 Thr Gln Lys Gln Lys Val Gly Glu Leu Lys Asp Asp Asp Phe Glu Lys 35 40 45 Ile Ser Glu Leu Gly Ala Gly Asn Gly Gly Val Val Phe Lys Val Ala 50 55 60 His Lys Pro Ser Gly Leu Val Met Ala Arg Lys Leu Ile His Leu Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Ala Ile Arg Asn Gln Ile Ile Arg Glu Leu Gln Val Leu 85 90 95 His Glu Cys Asn Ser Pro Tyr Ile Val Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Tyr 100 105 110 Ser Asp Gly Glu Ile Ser Ile Cys Met Glu His Met Asp Gly Gly Ser 115 120 125 Leu Asp Gln Val Leu Lys Lys Ala Gly Arg Ile Pro Glu Gln Ile Leu 130 135 140 Gly Lys Val Ser Ile Ala Val Ile Lys Gly Leu Thr Tyr Leu Arg Glu 145 150 155 160 Lys His Lys Ile Met His Arg Asp Val Lys Pro Ser Asn Ile Leu Val 165 170 175 Asn Ser Arg Gly Glu Ile Lys Leu Cys Asp Phe Gly Val Ser Gly Gln 180 185 190 Leu Ile Asp Ser Met Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Arg Ser Tyr Met 195 200 205 Ser Pro Glu Arg Leu Gln Gly Thr His Tyr Ser Val Gln Ser Asp Ile 210 215 220 Trp Ser Met Gly Leu Ser Leu Val Glu Met Ala Val Gly Arg Tyr Pro 225 230 235 240 Ile Pro Pro Pro Asp Ala Lys Glu Leu Glu Leu Met Phe Gly Cys Gln 245 250 255 Val Glu Gly Asp Ala Ala Glu Thr Pro Pro Arg Pro Arg Thr Pro Gly 260 265 270 Arg Pro Leu Ser Ser Tyr Gly Met Asp Ser Arg Pro Pro Met Ala Ile 275 280 285 Phe Glu Leu Leu Asp Tyr Ile Val Asn Glu Pro Pro Pro Lys Leu Pro 290 295 300 Ser Gly Val Phe Ser Leu Glu Phe Gln Asp Phe Val Asn Lys Cys Leu 305 310 315 320 Ile Lys Asn Pro Ala Glu Arg Ala Asp Leu Lys Gln Leu Met Val His 325 330 335 Ala Phe Ile Lys Arg Ser Asp Ala Glu Glu Val Asp Phe Ala Gly Trp 340 345 350 Leu Cys Ser Thr Ile Gly Leu Asn Gln Pro Ser Thr Pro Thr His Ala 355 360 365 Ala Gly Val 370 <210> 81 <211> 2274 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 81 ctaaccaggc gggagctgtc ggtgcggagc tcggtgtcgc tccgccgggc aggccgggtc 60 gacggccgcg ctgtgccgga gcggcagcgt cgcgggctcg gctccttctc ggggaggcgg 120 ccgcgcgctg ctccggcgct gaggggcggc cccgaagttt gcttcgcgtc gggaagtccg 180 tcggacctgg ccgaagtggg gccgcggccg ctccgtccgt cacgctctgc gctggccggg 240 gggcaacatg cccaagaaga agccagggcc gatccagctc aaccccgctc cggatggctc 300 cgccgtcaac gggaccagct ctgccgagac aaacttggaa gctcttcaga agaagctgga 360 agagctagag ctggatgaac agcaaaggaa gcgccttgaa gctttcctta cccagaaaca 420 aaaagttggg gagctgaagg atgatgactt cgagaagatc agtgagctgg gagcagggaa 480 tggcggggtg gtgttcaaag tatctcacaa gccttctggc ctcatcatgg caagaaaatt 540 gattcatcta gaaatcaagc cagctattcg aaaccagatc atccgtgagc tgcaggttct 600 acatgagtgc aattcaccat acatagtggg cttttatgga gctttttaca gtgatgggga 660 aatcagcatt tgcatggaac acatggatgg tggctcattg gatcaagtgc tgaaaaaggc 720 tggaagaatt ccagagcaga tactgggcaa agtcagcatt gcagtaataa aaggactcac 780 atatctgaga gaaaagcata aaataatgca cagagatgtt aaaccatcta acatcttggt 840 aaactctaga ggtgagatca agctttgtga ttttggtgtc agtggacaac tgatagattc 900 tatggcaaac tcatttgttg gcacgcgctc ctacatgtct ccggaaagac tgcagggaac 960 tcattattca gtgcagtcag atatatggag tatggggctg tctctggtag aaatggccat 1020 tggcagatac ccgattcctc ctcctgactc taaggagctc gagttgatgt ttggctgccc 1080 ggtagaggga gattctccag tcacagagac ctcacccagg caaagaacac ctggtcgacc 1140 aatgagctcc tatggaccag acagcagacc cccgatggca atctttgaac ttctggatta 1200 catcgtcaat gagccacctc caaaactgcc caatggtgtc tttggttctg aatttcaaga 1260 ttttgttaac aaatgtttaa ttaaaaatcc tgctgagaga gctgatttga agcagctgat 1320 gattcacgct ttcattaaga gatctgaagc agaggaggtg gattttgcag gatggctttg 1380 ctcaaccata ggccttaacc aaccgagtac acccacgcat gctgctggag tctgaatgtg 1440 gaagagcaaa tcctgtcccg tacatctgtt aacagcgcta ctttggtcct atttcctaag 1500 cttgtacctg ttcaaacatg tatttcacct cttaaggaag aatgtcttta tagcatgtgc 1560 caaattgttt tcaattttgt catcaactaa ttggtattgt actgggttac atttgtttgc 1620 tgaccaaaat gtaaaatgtt taagttacag tgcttgctga ttttaagtga ttatggaatt 1680 atggatattc tttcttaatg aaaatatcac tgggggggaa tttacccctg gattgtttga 1740 actttatcaa gactctttgt aaactgttgg tacttcagtc atgcttacct aatctcccat 1800 gcaaaaaaag gggtagggat gctccaaaac tgtatctgtt gagcatgctt ttgctgctgc 1860 caaactgtat cttggaagtt aggcctaatg gttccaattt ggtgttgtgt agagatcact 1920 ctttccaggt aaagaaggta agagctctgc attccttggg atggacaggg cagtatccta 1980 cttgtagact tgttcatatt tctatattta tttttaaaat gtatcatcat acttggattt 2040 agtgatatat gtctttccaa ttgattttta aaggttagct ctcagaagcg tcctacagaa 2100 tcatgacaaa gatctgggct ttcttttaac cttaagattc atgacagctg tgtttggtgt 2160 ctaaaatgta tgaagatcct ctattgtttt attctctcag atgtttagca atggtttctc 2220 ttaataaata tattatcaag taaaaaaaaa aaaaaaataa aaaaaaaaaa aaaa 2274 <210> 82 <211> 395 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 82 Met Pro Lys Lys Lys Pro Gly Pro Ile Gln Leu Asn Pro Ala Pro Asp 1 5 10 15 Gly Ser Ala Val Asn Gly Thr Ser Ser Ala Glu Thr Asn Leu Glu Ala 20 25 30 Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Asp Glu Gln Gln Arg Lys 35 40 45 Arg Leu Glu Ala Phe Leu Thr Gln Lys Gln Lys Val Gly Glu Leu Lys 50 55 60 Asp Asp Asp Phe Glu Lys Ile Ser Glu Leu Gly Ala Gly Asn Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Phe Lys Val Ser His Lys Pro Ser Gly Leu Ile Met Ala Arg 85 90 95 Lys Leu Ile His Leu Glu Ile Lys Pro Ala Ile Arg Asn Gln Ile Ile 100 105 110 Arg Glu Leu Gln Val Leu His Glu Cys Asn Ser Pro Tyr Ile Val Gly 115 120 125 Phe Tyr Gly Ala Phe Tyr Ser Asp Gly Glu Ile Ser Ile Cys Met Glu 130 135 140 His Met Asp Gly Gly Ser Leu Asp Gln Val Leu Lys Lys Ala Gly Arg 145 150 155 160 Ile Pro Glu Gln Ile Leu Gly Lys Val Ser Ile Ala Val Ile Lys Gly 165 170 175 Leu Thr Tyr Leu Arg Glu Lys His Lys Ile Met His Arg Asp Val Lys 180 185 190 Pro Ser Asn Ile Leu Val Asn Ser Arg Gly Glu Ile Lys Leu Cys Asp 195 200 205 Phe Gly Val Ser Gly Gln Leu Ile Asp Ser Met Ala Asn Ser Phe Val 210 215 220 Gly Thr Arg Ser Tyr Met Ser Pro Glu Arg Leu Gln Gly Thr His Tyr 225 230 235 240 Ser Val Gln Ser Asp Ile Trp Ser Met Gly Leu Ser Leu Val Glu Met 245 250 255 Ala Ile Gly Arg Tyr Pro Ile Pro Pro Pro Asp Ser Lys Glu Leu Glu 260 265 270 Leu Met Phe Gly Cys Pro Val Glu Gly Asp Ser Pro Val Thr Glu Thr 275 280 285 Ser Pro Arg Gln Arg Thr Pro Gly Arg Pro Met Ser Ser Tyr Gly Pro 290 295 300 Asp Ser Arg Pro Pro Met Ala Ile Phe Glu Leu Leu Asp Tyr Ile Val 305 310 315 320 Asn Glu Pro Pro Pro Lys Leu Pro Asn Gly Val Phe Gly Ser Glu Phe 325 330 335 Gln Asp Phe Val Asn Lys Cys Leu Ile Lys Asn Pro Ala Glu Arg Ala 340 345 350 Asp Leu Lys Gln Leu Met Ile His Ala Phe Ile Lys Arg Ser Glu Ala 355 360 365 Glu Glu Val Asp Phe Ala Gly Trp Leu Cys Ser Thr Ile Gly Leu Asn 370 375 380 Gln Pro Ser Thr Pro Thr His Ala Ala Gly Val 385 390 395

Claims (19)

  1. (i) BRAF 억제제인 제1 제제, (ii) MEK 억제제인 제2 제제, 및 (iii) BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 제3 제제, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 BRAF 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 트라메티닙, 코비메티닙, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 450 내지 600 mg BID의 용량으로 사람 대상체에게 투여되는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암이 흑색종, 결장직장암, 유두상 갑상선암(papillary thyroid cancer), 및 비-소세포 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 암이 흑색종인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암이 진행된(advanced) 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 암이 비절제성 또는 전이성인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 암이 MAPK 활성을 갖는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 영장류, 농장 동물, 및 가축 동물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 암을 갖는 상기 대상체가 BRAFV600 및/또는 MEKQ56에 돌연변이를 갖는, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 돌연변이가 BRAFV600E, BRAFV600K, MEKQ56P, 또는 BRAFV600E::MEKQ56P로부터 선택되는, 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 BRAF 억제제 치료, MEK 억제제 치료, 또는 병용된 BRAF 및 MEK 억제제 치료에 불응인, 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 프로그래밍된 사멸-1 (PD-1) 억제제, 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 억제제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 제제를 더 포함하는, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 억제제가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 CTLA-4 억제제가 이필리무맙인, 조성물.
  18. (i) BRAF 억제제인 제1 제제, (ii) MEK 억제제인 제2 제제, 및 (iii) BVD-523 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 제3 제제, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하기 위한 키트.
  19. 제18항에 있어서, 프로그래밍된 사멸-1 (PD-1) 억제제, 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 억제제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 제제를 더 포함하는, 키트.
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