JP2022058697A - インビボでの核酸発現のためのシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、対象において（例えば、治療効果を生じるために必要とされる長期の治療レベルで）１つ以上のタンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子の発現を産生するための組成物、システム、キット及び方法を提供する。【解決手段】特定の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体を含む第１の組成物と、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少された、治療有効量の発現ベクター（例えば、リポソームと会合しない非ウイルス発現ベクター）とを含む第２の組成物を含むシステム及びキットであって、発現ベクターが、ｉ）第１の治療用タンパク質（複数可）及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子（複数可）をコードする第１の核酸配列を含む、システム及びキットが提供される。【選択図】図１

Description

本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１５年９月１８日に出願された米国仮出願第６２／２２０，６４６号の優先権を主張する。

発明の分野
本発明は、対象、ヒトまたは非ヒト哺乳動物における１つ以上のタンパク質または生物学的に活性な核酸分子の発現（例えば、治療効果が生じるために必要とされる長期間の治療レベルで）のための組成物、システム、キット、及び方法を提供する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、カチオン性ミセル、カチオン性エマルジョン、またはカチオン性ポリマー）を含む第１の組成物、及びｉ）第１の治療用のタンパク質（複数可）及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子（複数可）を、コードする第１の核酸配列を含む、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少された発現ベクター（例えば、リポソームまたは他のキャリアに関連の無い非ウイルスベクター）を含む第２の組成物を含むシステム及びキットが提供される。他の実施形態において、このような第１及び第２の組成物は、治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子が対象において発現されるように（例えば、疾患または病態が治療されるように、または生理学的もしくは疾患形質が変更されるように、少なくとも５日間または少なくとも５０日間、治療的レベルで）、対象に連続的に（例えば、全身的に）投与される。

背景
最も単純な非ウイルス遺伝子送達システムは、裸の発現ベクターＤＮＡを使用する。特定の組織、特に筋肉への遊離ＤＮＡの直接注入は、高レベルの遺伝子発現を生じさせることが分かっており、このアプローチの単純さは、多数の臨床プロトコールにおいてその採用につながった。特に、このアプローチは、癌ワクチンとして機能するかもしれない腫瘍抗原を発現させるために、ＤＮＡを腫瘍内に直接注入するかまたは筋細胞に注入することが可能な癌の遺伝子治療に適用されてきた。

プラスミドＤＮＡの直接注入は遺伝子発現をもたらすことが分かっているが、全体的な発現レベルはウイルスベクターまたはリポソームベクターよりもはるかに低い。裸のＤＮＡはまた、一般に、血清ヌクレアーゼの存在のために、全身投与には不適当であると考えられている。その結果、プラスミドＤＮＡの直接注入は、皮膚及び筋肉細胞のような直接的注入に利用しやすい組織に関連する用途に限定されるようである。

本発明は、対象におけるタンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）の発現（例えば、宿主において治療効果を生じるために必要とされる長期間の治療レベルで）のための組成物、システム、キット、及び方法を提供する。特定の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）を含む第１の組成物、及びＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少した治療有効量の発現ベクター（複数可）（例えば、リポソームと会合しない非ウイルス発現ベクター）を含む第２の組成物を含み、この発現ベクターが、ｉ）第１の治療用タンパク質（またはマーカータンパク質等の非治療用タンパク質）及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子を、コードする第１の核酸配列を含んでいる、システム及びキットが提供される。特定の実施形態では、発現ベクターは、第２、第３、及び／または第４の治療用または非治療用タンパク質、及び／または第２、第３または第４の生物学的に活性な核酸分子をコードする第２、第３、または第４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、第２、第３、第４、第５及び／または第６の治療用タンパク質及び／または第２、第３、第４、第５及び／または第６の生物学的に活性な核酸分子をさらにコードする。他の実施形態において、このような第１及び第２の組成物は、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）が対象において発現されるように（例えば、疾患（複数可）または病態（複数可）が治療されるか、または生理学的形質（複数可）が変更されるように、治療レベルで、少なくとも５または少なくとも５０日、または少なくとも１００．．．２００．．．または少なくとも４００日）、対象に連続的に投与（例えば、全身的に）される。

いくつかの実施形態では、対象（例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物）において第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）第１の組成物を対象に投与（例えば、全身的に）することであって、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセルまたは空のカチオン性エマルジョン）を含み、第１の組成物は核酸分子を含まないか、実質的に含まず（例えば、核酸が組成物中に検出不能またはほとんど検出できない）；そしてｂ）第２の組成物を対象に投与（例えば、全身的に、経脈管的に、等）する（例えば、第１の組成物を投与する約２．．．１０．．．５０．．．１００．．．２００．．．３００．．．４００分以内に開始する）ことであって、第２の組成物は、ある量の発現ベクター（例えば、リポソームまたは任意の他の任意のキャリアと会合していない非ウイルス発現ベクター）を含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており、各発現ベクターは、ｉ）第１、第２、第３、第４、第５及び／または第６の治療用または非治療用タンパク質（複数可）、及び／またはｉｉ）第１、第２、第３、第４、第５及び／または第６の生物学的に活性な核酸分子（複数可）をコードする核酸配列（複数可）を含む、方法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１の治療用または非治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、対象において発現される（例えば、疾患または病態に関して、少なくとも５．．．５０．．．１００．．．３００日、４００日以上の治療レベルで、または生理学的または疾患形質を変えるのに十分な有効なレベルで）。特定の実施形態において、第１の組成物中に存在するポリカチオン性構造体（例えば、空のリポソーム）は、約２０～８５ｎｍ（例えば、２０．．．２５．．．３０．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５．．．８０．．．８５ｎｍ）のｚ－平均直径を有する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、約７２～７６ｎｍのｚ－平均直径を有する空のリポソームであり、小さな単層状小胞である。

いくつかの実施形態では、対象において第１の治療用または非治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）第１の組成物を対象に投与することであって、対象は、疾患または病態の少なくとも１つの症状を有するか、または少なくとも変化する生理学的形質を有し、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）を含み、及び第１の組成物は核酸分子を含まないかまたは実質的に含まず、及びｂ）第１の組成物の投与の約１００分または約２００分．．．または４００分以内に第２の組成物を対象に投与（または投与を開始）することであって、第２の組成物は治療有効量の発現ベクターを含み、発現ベクターは、それぞれ、ｉ）第１の治療用または非治療用タンパク質、及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の核酸配列を含み、Ｃ）第１及び／または第２の組成物中のいずれかの、または第３の組成物中に存在する、デキサメタゾンパルミテート及び／または中性脂質を、対象に投与（例えば、第１の組成物または第２の組成物の投与の１００または２００．．．または４００分以内）することを含む、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１の組成物の投与、第２の組成物の投与、及びデキサメタゾンパルミテート及び／または中性脂質の投与の結果として、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子が、疾患または病態に関して治療レベルで、または生理学的または疾患形質を変化させるのに十分な有効レベルで対象において発現される。

特定の実施形態において、デキサメタゾンパルミテートは、第１の組成物中にあり、その第１の組成物の２．０％～６．０％（例えば、２．０％．．．２．５％．．．３．０％）がデキサメタゾンパルミテートを含む。特定の実施形態では、デキサメタゾンパルミテートは、第１及び／または第２の組成物の投与前に投与される第３の組成物で投与されるか、または第１及び／または第２の組成物の後で投与されるが、１００～４００分以内に投与される。特定の実施形態では、本方法は、さらに、ｄ）第１及び／または第２及び／または第３の組成物中のいずれかの、または第４の組成物中に存在するデキサメタゾンを対象に投与すること（例えば、第１または第２または第３の組成物の投与前１００または３００分以内に開始、例えばその投与のいずれかの前または他の投与の後）を含む。特定の実施形態において、第１の組成物中に存在するポリカチオン性構造体（例えば、空のリポソーム）は、約２０～８５ｎｍのｚ－平均直径を有する（例えば、２０．．．２５．．．３０．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５．．．８０．．．８５ｎｍ）。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、約７２～７６ｎｍのｚ－平均直径を有する空のリポソームであり、小さな単層状小胞である。いくつかの実施形態では、Ａ）比は１０：１～１８：１であり、Ｂ）第１の組成物の２．０％～６．０％がデキサメタゾンまたはデキサメタゾンパルミテートを含み；及び／またはＣ）発現ベクターは、それぞれ単一の発現カセットのみを含み（すなわち、他の発現カセットは各ベクター中に存在しない）、発現カセットは、第１の治療用タンパク質をコードする第１の核酸配列及び第２の治療用タンパク質をコードする第２の核酸配列を含み、そして発現カセットは、第１及び第２の核酸配列間の自己切断ペプチド配列（または他の切断配列）をコードする。特定の実施形態では、自己切断ペプチドはＦＭＤＶ ２Ａを含む。特定の実施形態では、第１の治療用タンパク質は、モノクローナル抗体の軽鎖を含み、第２の治療用タンパク質は、上記モノクローナル抗体の重鎖を含む（例えば、対象において発現する場合、軽鎖及び重鎖が結合して、モノクローナル抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ）またはモノクローナル抗体を形成する）。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、空のリポソームを含む。特定の実施形態では、上記第１の組成物中に存在する空のリポソームは、約５０～８５ｎｍの平均直径を有する。特定の実施形態において、本方法は、さらに、第１及び／または第２の組成物中の、または第３の組成物中に存在する作用物質または追加の調節発現ベクターを投与することを含み、その際、作用物質は、薬剤が対象に投与されていない場合と比較して、治療レベルまたは有効レベルでの発現及び／または治療レベルまたは有効レベルの発現時間長を増加または減少させる（例えば、特定の限定された時間だけ発現する必要のある治療薬の場合）。特定の実施形態において、作用物質は、コルヒチン、デキサメタゾン、デキサメタゾンパルミテート、中性脂質、バルプロ酸、テオフィリン、シルデナフィル、アンレキサノクス、クロロキン、ＳＡＨＡ、及びＬ－アルギニン＋シルデナフィルから選択される。

いくつかの実施形態では、発現ベクターはそれぞれ調節核酸配列をさらに含み、この調節核酸配列は、その調節核酸配列の非存在下で生じるであろう第１核酸配列の発現期間を短縮する。他の実施形態では、調節核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、第２のタンパク質をコードする第２の核酸配列、及び／または第２の生物学的に活性な核酸分子からなる群より選択される。さらなる実施形態では、第１の組成物中の第１の量のポリカチオン性構造体は、上記第１のタイプのカチオン性リポソームのみまたは上記第２のタイプのカチオン性リポソームのみが上記方法において使用される場合のような発現と比較して、第１の治療用タンパク質及び／または第１の生物学的に活性な核酸分子の発現を減少させる少なくとも第１及び第２の異なるタイプのカチオン性リポソームの混合物を含む。特定の実施形態において、治療用タンパク質は、１ｕｇ／ｍｌ（例えば、１．１～１．５ｕｇ／ｍｌ）を超えるレベルで発現され、上記治療用タンパク質は、少なくとも７日間連続して（例えば、少なくとも７．．．２１．．．５０．．．１００．．．または４００日）対象においてそのレベルで発現される。

特定の実施形態において、対象において第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）第１の組成物を対象に投与（例えば全身的に）することであって、対象は、疾患または病態の少なくとも１つの症状を有するか、または少なくとも変化する生理学的形質（例えば、造血幹細胞のレベル）を有し、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）を含み、第１の組成物は核酸分子を含まないかまたは実質的に含まず、；ｂ）第１の組成物の投与の約２．．．１０．．．２５．．．１００．．．２００または４００分の範囲内で開始（または完了）される、第２の組成物を対象に投与させることであって、第２の組成物は、治療有効量の発現ベクター（例えば、プラスミド）を含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており（例えば、発現ベクターの核酸配列が、ベクター中の配列の野生型バージョンに通常存在するよりも少ないＣｐＧジヌクレオチドを含むように改変されている）、発現ベクターはそれぞれ、ｉ）第１の治療用タンパク質（または第１及び第２の治療用タンパク質、または第１、第２及び第３の治療用タンパク質など）及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子（または第１及び第２またはそれ以上の生物学的に活性な核酸酸分子）をコードする核酸配列（複数可）を含み、そして第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、及び第１及び第２の組成物の投与の結果として、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）は、疾患または病態に関して治療レベルで、または生理学的または疾患形質を変化させるのに十分な有効なレベルで対象において発現される、方法が、本明細書で提供される。

特定の実施形態では、発現ベクターは、第２の組成物中において、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）または他の分子と会合していない（そして第２組成物中に存在する検出可能なポリカチオン構造はない）。他の実施形態では、発現ベクターは、裸の非ウイルス性の発現ベクター（例えば、プラスミド）である。特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルス発現ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターまたは合成ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムまたはｓｈＲＮＡ核酸ベクター）である。特定の実施形態において、第１及び/または第２の組成物は、全身、局所、経皮、皮内、経口、筋肉内、静脈内、消化管内、膀胱内、または肺吸入によって、または髄腔内または脳室内経路によって投与される。

特定の実施形態では、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）が、少なくとも５．．．２０．．．６３．．．１００．．．２００．．．３００日．．．１年以上、連続した日の間で対象において治療レベルまたは有効レベルで発現される。いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、ｃ）第１の組成物及び第２の組成物の投与から少なくとも５．．．２０．．．６３．．．１００．．．２００．．．３００日または１年後に、対象（例えば、体のイメージングまたはスキャニング）または対象からのサンプル（例えば血液、血清、血漿、組織、尿など）を試験すること、及び治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）が、治療レベルまたは有効レベルで対象において発現されていること（例えば、第１及び第２の組成物の１回の治療に起因して対象において治療効果を生じるのに必要な期間、対象において治療レベルが持続されている）を決定することを含んでいる。さらなる実施形態では、本方法は、ｄ）治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子が、治療レベルまたは有効レベル（例えば、一定の時間）で対象において発現されていることを示す報告書及び／または電子報告を作成することを含む。他の実施形態において、報告は、試験を行った研究室から治療臨床医または開業医及び／または患者に送られる。

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ．．．１００．．．５００．．．１０００．．．１５００．．．４０００．．．８０００．．．９５００．．．１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ（１ｕｇ／ｍｌ）．．．１．５ｕｇ／ｍｌ以上のレベルで発現され、そして対象由来の血液、血清または血漿試料（または他の生物学的試料）をアッセイして、治療レベルまたは有効レベルが、第１及び第２の組成物の投与後少なくとも５．．．７．．．１０．．．２５．．．４５．．．６３．．．１５０．．．３００日以上の間に達成されることを見極める。他の実施形態では、治療用タンパク質（複数可）は、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｐｇ／ｍｌまたは少なくも５００、１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ（１ｕｇ／ｍｌ）．．．１．５ｕｇ／ｍｌ以上のレベルで発現され、治療用タンパク質は、対象内のレベルで、少なくとも５．．．７．．．１０．．．２５．．．４５．．．６３．．．１５０．．．３００．．．３５０日間連続して発現される。特定の実施形態において、治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、対象において、第１及び第２の組成物の投与後少なくとも４８時間後に、臨床的に顕著な毒性の上昇（例えば、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）及び／またはＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）によって測定される）なしに発現される。

特定の実施形態では、治療用タンパク質は、ヒトＧ－ＣＳＦ（例えば、配列番号１によってコードされるもの、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する配列）であり、血液、血清、または血漿試料中で測定して少なくとも１００ｐｇ／ｍｌの治療レベルで対象において発現され、そして治療用タンパク質は少なくとも７日間対象において発現され、疾患、病態、または生理学的形質が、以下：化学療法によって引き起こされる好中球減少症、幹細胞ドナーまたはレシピエントの血液中の造血幹細胞のレベルが上昇しない、心臓変性、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、好中球欠損疾患及び放射線曝露からなる群より選択される。特定の実施形態では、Ｇ－ＣＳＦは、少なくとも５、または６または７日間であるが、約１０日を超えないで発現される（例えば、薬剤、プロモーター／エンハンサーの組合せ、核酸ベクター内の追加の発現カセットまたは追加の発現したタンパク質を用いて産生を約１０日間に制限して、約１０日を超える発現による毒性好中球関連副作用を避ける）。他の実施形態では、治療用タンパク質は、リツキシマブまたは類似の抗ＣＤ２０抗体もしくは抗体断片である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、ヒト第ＩＸ因子または類似のタンパク質である。

特定の実施形態では、対象が、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）を対象に提供する他の任意の処置を受けなくても、治療用タンパク質（複数可）及び／または生物学的に活性な核酸分子（複数可）が、少なくとも１つの症状（または全ての症状）を軽減または排除する治療レベルで十分な時間対象において発現される。さらなる実施形態では、十分な時間、対象は、任意の他の特定の治療（例えば、対象に治療用タンパク質または生物学的に活性な核酸分子（複数可）を提供する他の特定の治療処置）を受けない。特定の実施形態では、対象は疾患（複数可）の複数の症状を有し、その場合、十分な時間とは、疾患（複数可）及び／または病態（複数可）の複数の症状の全てまたは実質的に全てが軽減または排除されるような時間（例えば、永久に、または少なくとも２０日間.．．．５０日間．．．２００日間．．．１年以上）である。他の実施形態では、十分な時間、対象は、他の疾患特異的処置を受けない。

いくつかの実施形態では、ポリカチオン性構造体の第１の量（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）は、対象の１キログラム当たり約０．０１～７０、３０～５０、または２０～６０μモル（例えば、１ｋｇ当たり、０．０１．．．１．．．１０．．．２０．．．４０．．．または６０μｍｏｌ）である。他の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）対治療有効量の発現ベクターの比は、０．５：１～２５：１であり、数ｎｍｏｌのポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）対１μｇの発現ベクター（例えば、０．５：１．．．１：１．．．４：１．．．８：１．．．１２：１．．．１７：１．．．２１：１．．．または２５：１）である。特定の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）対治療有効量の発現ベクターの比は、７：１～１３：１であり、数ｎｍｏｌのポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）対１μｇの発現ベクターである。特定の実施形態では、発現ベクターの治療有効量は、対象の１キログラム当たり０．００１～８．０ミリグラムの発現ベクター（例えば、０．００１．．．０．１．．．３．０．．．４．５．．．．５．７．．．７．１．．．８．０ミリグラム／キログラム）である。いくつかの実施形態では、発現ベクターの治療有効量は、対象の１キログラム当たり０．００１～１μｇ（例えば、対象の１キログラム当たり０．００１．．．０．０１．．．０．１．．．１μｇ）である。特定の実施形態では、発現ベクターの治療有効量は、対象の１キログラム当たり約０．０１～４．０ミリグラムの発現ベクターである。

いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、第１または第１及び第２の、または第１、第２及び第３の治療用タンパク質（複数可）をコードする。さらなる実施形態では、第１の核酸配列は、生物学的に活性な核酸分子（複数可）をコードする。他の実施形態では、対象はヒトである。さらなる実施形態では、発現ベクターはＣｐＧを含まない。他の実施形態では、発現ベクターはＣｐＧが減少している。他の実施形態では、治療用タンパク質（複数可）は、ヒトタンパク質（複数可）または動物タンパク質（複数可）である。

いくつかの実施形態において、ポリカチオン性構造体は、コレステロールを含有しない（例えば、コレステロールを含まない空のカチオン性ミセルまたはリポソーム）。特定の実施形態では、カチオン性リポソームはそれぞれ、少なくとも６０％のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ（例えば、６０％．．．７５％．．．８５％．．．９５％．．．９８％．．．１００％のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ）を含む。他の実施形態では、カチオン性リポソームの全てまたは実質的に全てが多層状小胞である。さらなる実施形態では、カチオン性リポソームの全てまたは実質的にすべてが単層状小胞である。さらなる実施形態では、カチオン性リポソームはそれぞれ、少なくとも９９％のＤＯＴＡＰまたは９９％のＤＰＴＡＰを含む。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソームはそれぞれＤＯＴＡＰ及びコレステロールを含む。さらなる実施形態では、カチオン性リポソームはそれぞれ、約１／３のコレステロール及び約２／３のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰを含む。さらなる実施形態において、第１の核酸配列は、ヒトＧ－ＣＳＦをコードする（例えば、配列番号１に示されるように）。

特定の実施形態では、生物学的に活性な核酸分子（複数可）は、ｓｈＲＮＡ配列（複数可）、ｍｉＲＮＡ配列（複数可）、アンチセンス配列（複数可）、リボザイム（複数可）、及び／またはＣＲＩＳＰＲ単一ガイドＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）（複数可）から選択される配列を含む。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡは、ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ－補充配列（ｔｒａｃＲＮＡ）、及びｉｉ）ｓｇＲＮＡ標的部位にハイブリダイズする標的特異的配列（ｃｒＲＮＡ）を含む。特定の実施形態では、生物学的に活性な核酸分子は、ヒトｐ６５（別名、ＮＦ－カッパ－Ｂｐ６５またはＲＥＬＡ）を標的とする。

さらなる実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、ｉ）第２の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第２の生物学的に活性な核酸分子をコードする第２の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、ｉ）第３及び／または第４の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第３及び／または第４の生物学的に活性な核酸分子をコードする第３の核酸配列をさらに含む。さらなる実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、第１の核酸配列に会合する第１のプロモーター、及び第２の核酸配列に会合する第２のプロモーターをさらに含み、第１及び第２のプロモーターは同一でも異なってもよい。他の実施形態では、第１の核酸配列の治療的もしくは有効的な発現レベル、及び／または治療的もしくは有効的な発現レベルの時間長は、第２の核酸が発現ベクターに存在しない及び／または発現しない場合の発現レベルまたは時間長に比べて減縮される。他の実施形態では、第１の核酸配列は、少なくとも５日であるが２１日未満（例えば、５．．．７．．．１３．．．１６．．．２０．．．及び２１日）の治療レベルで発現される。特定の実施形態では、第１の核酸配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質はヒトＧ－ＣＳＦを含む。

他の実施形態では、発現ベクターは、発現ベクターのそれぞれが第１の核酸に会合する第１のプロモーター及び第１のエンハンサーを含む場合に、第１の時間長の治療レベルまたは有効レベルで、及び／または第１の発現レベルで、発現を提供し、発現ベクター上で、第１のプロモーターとは異なる第２のプロモーターが第１のプロモーターと置換し、及び／または第２のエンハンサーとは異なる第２のエンハンサーが第２のプロモーターと置換する場合、第１の時間長及び／または発現レベルが変化する。他の実施形態では、第１の時間長の治療レベルまたは有効レベルでの発現は、少なくとも１０．．．１５．．．４５．．．１００．．．２００．．．３００日間であり、第２のプロモーター及び／または第２のエンハンサーによる置換は、治療レベルまたは有効レベルでの発現を１０．．．１５．．．４５．．．１００．．．２００日未満の第２の時間長まで減縮する。他の実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、第１のプロモーター及び第１のエンハンサーを含み、第１のプロモーター及び第１のエンハンサーは、少なくとも５日間で且つ２１．．．１５．．．または１０日間未満の治療レベルで発現を引き起こす。特定の実施形態では、第１の核酸配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質はヒトＧ－ＣＳＦを含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、第１の組成物及び／または第２の組成物のいずれか、または第３の組成物中で存在する、薬剤（複数可）を投与することをさらに含み、且つ薬剤（複数可）が対象に投与されない場合と比較して、薬剤（複数可）は第１の核酸の発現を増加または減少させる（例えば、治療レベルまたは有効レベルで、及び／または治療レベルまたは有効レベルでの発現の時間長）。特定の実施形態では、薬剤は、第１の核酸の発現レベルを対象において増加させるものであり、コルチシン、免疫抑制剤、デキサメタゾン、デキサメタゾンパルミテート、シルデナフィル、またはＬ－アルギニン＋シルデナフィルから選択される。特定の実施形態では、薬剤（例えば、デキサメタゾンまたはデキサメタゾンパルミテート）は、ポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン脂質組成物）の２．０％と６．０％との間（例えば、２．０％．．．２．５％．．．３．５％．．．４．５％または．．．６．０％）で存在する。他の実施形態において、薬剤（例えば、デキサメタゾンまたはデキサメタゾンパルミテート）は、ポリカチオン性構造体及びベクター組成物が投与される前または後に対象に投与される。特定の実施形態において、第１の組成物中に存在するポリカチオン性構造体（例えば、空のリポソーム）は、約２０～８５ｎｍのｚ－平均直径（例えば、２０．．．２５．．．３０．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５．．．８０．．．８５ｎｍ）を有する。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、約７２～７６ｎｍのｚ－平均直径を有する空のリポソームであり、小さな単層状小胞である。

他の実施形態では、薬剤が対象に投与されていない場合と比較して、薬剤が対象に投与される場合、治療用タンパク質は、少なくとも２倍高い（または少なくとも３または４または５倍高い）レベルで発現する。特定の実施形態では、薬剤は第１の核酸配列の発現レベルを低下させ、この場合薬剤はＬ－アルギニンである。さらなる実施形態では、薬剤が対象に投与されない場合と比較して、薬剤が対象に投与される場合、治療用タンパク質は少なくとも２倍（または少なくとも３倍または４倍）低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗炎症剤を含む。さらなる実施形態において、薬剤は、アンレキサノクス、クロロキン、バルプロ酸、テオフィリン、ＤＨＡ、プロスタグランジン、及びＳＡＨＡからなる群より選択される。

さらなる実施形態では、発現ベクターは、操作可能なマトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列を含まない。特定の実施形態において、発現ベクターは、操作可能なＥＢＮＡ－１及び／またはＥＢＶウイルス配列を含まない。特定の実施形態では、上記第１及び第２の組成物を投与する直前の対象の血圧は変化しない（例えば、第１の核酸配列の発現を増加させるために対象に物理的トランスフェクション補助剤を適用しない）。

特定の実施形態では、治療レベル及び／または有効レベルは、少なくとも１５０．．．１００．．．５００．．．１０００．．．１５００．．．５０００．．．１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ（１ｕｇ／ｍｌ）．．．１．５ｕｇ／ｍｌ以上であり、対象由来の血液、血清または血漿試料（または他の生物学的試料）は、第１及び第２の組成物の投与後少なくとも７．．．１０．．．２５．．．４５．．．６３．．．１５０．．．３００．．．４００日以上の治療レベル及び／または有効レベルであると判定される。特定の実施形態において、対象由来の試料は、発現レベルを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイまたは質量分析によって試験される。

いくつかの実施形態では、本方法は、治療有効量の中性リポソームを対象に投与することをさらに含み、その際、中性リポソームが第１及び／または第２の組成物中に存在し、及び／または第３の組成物で投与され、且つ第２の組成物を投与する前に、治療有効量の中性リポソームを対象に投与する。特定の実施形態では、中性リポソームは、少なくとも、ホスホリポン９０Ｈ、水素化大豆ＰＣ、ステアリン酸及びパルミチン酸から選択される物質を含む。他の実施形態において、治療有効量の中性リポソームは、対象に投与される、第１の組成物中または第３の組成物中に存在する。さらなる実施形態では、中性リポソームは、多重膜小胞であるか、または０．２または０．１ｕｍに押し出される。特定の実施形態では、治療有効な量の中性リポソームを投与することにより、対象における第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子の発現を、中性リポソームが対象に投与されない場合に生じるよりも、少なくとも３．．４．．．２５．．．１００．．．３５０．．．または６００倍高くなる。特定の実施形態において、対象に投与される空のカチオン性リポソームと中性リポソームの比は、約２：１～１：５（例えば、２：１．．．１：１．．．２：５．．．１：５）である。

いくつかの実施形態では、対象において第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）抗炎症剤を含む第１の組成物を対象に投与すること；ｂ）第２の組成物の投与を、第１の組成物の投与の約２分．．．２０分．．．１時間．．．２４時間．．．５日．．．７日．．．９日またはそれ以上の内に対象に投与するか、または投与を開始することを含み、第２の組成物が、治療有効量のポリプレックスを含み、それぞれのポリプレックスが発現ベクター及びポリエチレンイミンを含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており、各発現ベクターが以下：ｉ）第１の治療用タンパク質（及び／または第１及び第２のタンパク質）、及び／またはｉｉ）第１の（及び／または第１及び第２の）生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の核酸配列を含み、第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子が対象において発現される、方法が本明細書で提供される。さらなる実施形態では、対象は、疾患または病態の少なくとも１つの症状を有するか、または変更が望まれる少なくとも１つの生理学的形質を有し、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、疾患、病態、または変更される生理学的形質に関連する治療レベルで発現される。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、アンレキサノクス、クロロキン、及びスベラニルヒドロキサム酸（Ｓｕｂｅｒａｎｉｌｏｈｙ ｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）（ＳＡＨＡ）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、プラスミドまたは他の非ウイルスベクターを含む。さらなる特定の実施形態において、工程ｂ）における投与は、第２の組成物を全身投与することによって達成される。

いくつかの実施形態では、ａ）第１の量のポリカチオン性構造体（例えば空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）を含み、核酸分子を含まないか実質的に含まない第１の組成物、及びｂ）治療有効量の発現ベクター（例えば、非ウイルス性であり、かつリポソームまたは他のキャリア分子と会合していない）を含む第２の組成物を含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており、それぞれの発現ベクターは以下：ｉ）第１の治療用タンパク質または非治療用タンパク質、及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の核酸配列を含む上記第２の組成物を含む、システムまたはキットが本明細書で提供される。他の実施形態では、発現ベクターは、裸の非ウイルス発現ベクター（例えば、プラスミド）である。特定の実施形態では、以下のうちの少なくとも１つが適用される：ｉ）第１の量のポリカチオン性構造体（例えば空のカチオン性リポソーム）と治療有効量の発現ベクターとの比が２：１～２５：１または５：１～２５：１である；ｉｉ）第１の組成物の２．０％～６．０％がデキサメタゾンパルミテートを含み；ｉｉｉ）第１の組成物が中性脂質をさらに含み、そしてｉｖ）ポリカチオン性構造体が空のリポソームを含み、第１の組成物中に存在する空のリポソームが約２０～８５ｎｍのｚ－平均直径（例えば、２０．．．３０．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５．．．８０．．．８５ｎｍ）を有する。特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはアデノウイルスベクター）である。特定の実施形態では、治療用タンパク質はヒトＧ－ＣＳＦ（例えば、配列番号１に示される）である。

特定の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム）は、０．１～７．０ミリモル（例えば、０．１．．．５．０．．．７．０ミリモル）または１．５及び５．０ミリモル（例えば、ヒト対象に対する適当な投与量）である。他の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム）対治療有効量の発現ベクターの比は、０．５：１～２５：１であり、数ｎｍｏｌの空のカチオン性脂質対１μモルの発現ベクター（例えば、０．５：１．．．１：１．．．５：１．．．１０：１．．．１５：１．．．２５：１）である。いくつかの実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性脂質）対治療有効量の発現ベクターの比は、７：１～１３：１の、数ｎｍｏｌのポリカチオン性構造体対１μｇの発現ベクターで、（例えば７：１．．．１０：１．．．または１３：１）である。他の実施形態では、発現ベクターの治療有効量は、０．１～８００ミリグラム（例えば、ベクターがプラスミドである場合などのヒト対象への投与に適した量）である。特定の実施形態において、その量は、１．．．２５．．．４００または８００ミリグラムのヒト投与のための発現ベクターである。

他の実施形態では、第１の核酸配列は、第１の治療用タンパク質をコードする。さらなる実施形態では、第１の核酸配列は、生物学的に活性な核酸分子をコードする。特定の実施形態では、発現ベクターはＣｐＧを含まない。他の実施形態では、発現ベクターはＣｐＧが減少されている。さらなる実施形態では、第１の治療用タンパク質はヒトタンパク質である。他の実施形態では、第１の核酸配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質はヒトＧ－ＣＳＦ、リツキシマブ、モノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体断片（例えばＦａｂ）、またはヒト第ＩＸ因子を含む。

特定の実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルジョンはそれぞれ、少なくとも６０％のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ（例えば、６０％．．．７５％．．．８５％．．．９５％．．．９８％．．．１００％のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ）を含み、コレステロールを含み得ない（例えば、組成物中に検出可能なコレステロールがない）。他の実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルジョンのすべてまたは実質的にすべてが多層状小胞である。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルジョンのすべてまたは実質的にすべてが、単層状、多層状またはオリゴ層状の小胞のいずれかである。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルジョンはそれぞれ少なくとも９９％のＤＯＴＡＰまたは少なくとも９９％のＤＰＴＡＰを含み、コレステロールは含み得ない。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソームはそれぞれＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰ及びコレステロールを含む。さらなる実施形態では、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルジョンはそれぞれ、約１／３のコレステロール及び約２／３のＤＯＴＡＰ及び／またはＤＰＴＡＰを含む。

特定の実施形態では、第１の生物学的に活性な核酸分子は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列、アンチセンス配列、及びＣＲＩＳＰＲ単一ガイドＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）から選択される配列を含む。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡは、ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ－補充配列（ｔｒａｃＲＮＡ）、及びｉｉ）ｓｇＲＮＡ標的部位にハイブリダイズする標的特異的配列（ｃｒＲＮＡ）を含む。

さらなる実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、さらに、ｉ）第２の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第２の生物学的に活性な核酸分子を、コードする第２の核酸配列を含む。さらなる実施形態では、発現ベクターのそれぞれは、さらに、第１の核酸配列に会合する第１のプロモーター、及び第２の核酸配列に会合する第２のプロモーターを含み、第１及び第２のプロモーターは同一でも異なっていてもよい。

いくつかの実施形態では、キット及びシステムは、第１の容器及び第２の容器をさらに含み、第１の組成物は第１の容器に存在し、第２の組成物は第２の容器に存在する。他の実施形態では、キット及びシステムは、さらにパッケージング構成要素（例えば、段ボール箱、プラスチック袋など）を含み、第１の容器及び第２の容器はパッケージング構成要素の内側にある。

特定の実施形態では、キット及びシステムは、さらに薬剤（複数可）を含み、薬剤（複数可）は第１及び／または第２の組成物中に存在するか、または第３の組成物中に存在する。さらなる実施形態では、薬剤は、コルヒチン、免疫抑制剤、デキサメタゾン、シルデナフィル、Ｌ－アルギニン、またはＬ－アルギニン＋シルデナフィルから選択される。さらなる実施形態では、薬剤は、抗炎症剤を含む。さらなる実施形態では、薬剤は、アンレキサノクス、バルプロ酸、テオフィリン、クロロキン、及びＳＡＨＡからなる群から選択される。

特定の実施形態では、発現ベクターは、操作可能なマトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列を含まない。さらなる実施形態では、発現ベクターは、操作可能なＥＢＮＡ－１及び／またはＥＢＶウイルス配列を含まない。

特定の実施形態では、キット及びシステムは、治療有効量の中性リポソームをさらに含み、中性リポソームが第１及び／または第２の組成物中に存在するか、または第３の組成物中に存在する。さらなる実施形態では、治療有効量の中性リポソームが第１の組成物中に存在する。他の実施形態では、中性リポソームは、多層状またはオリゴ層状または単層状の小胞である。さらなる実施形態において、空のカチオン性リポソームまたはミセルと中性リポソームとの比は、約２：１～１：５（例えば、２：１．．．１：１．．．３：５．．．１：５）である。

いくつかの実施形態では、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子のインビボ発現での治療に適している疾患の治療における併用のための第１の組成物及び第２の別個の組成物であって、第１の組成物は第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセルまたは空のカチオン性エマルジョン）を含み、第１の組成物は、核酸分子を含まないか、または実質的に含まず；Ｂ）第２の組成物は治療有効量の発現ベクターを含み、発現ベクターは、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており、発現ベクターのそれぞれが、ｉ）第１の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子を含む、組成物が本明細書において提供される。

特定の実施形態では、対象に第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）対象に第１の組成物を投与することであって、第１の組成物は、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）を含み、第１の組成物は核酸分子を含まないかまたは実質的に含まず；ｂ）第１の組成物の投与の約１００分または２００分以内に第２の組成物を対象に投与することを含み、第２の組成物は治療有効量の非ウイルス発現ベクターを含み、発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており、発現ベクターがそれぞれ、ｉ）第１の治療用タンパク質、及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子を、コードする第１の核酸配列を含み；第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、対象において、上記レベル（例えば、少なくとも１５０．．．３００．．．５７５．．．１０００．．．１５００．．．２０００．．．５０００．．．または１，０００，０００ｐｇ／ｍｌ）（例えば、（例えば、第１及び第２の投与から７．．．２５．．．５０日後の）対象からの血清試料で測定される）で発現される、方法が本明細書において提供される。

特定の実施形態では、治療有効量の非ウイルス発現ベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法であって、非ウイルス発現ベクターは、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており、以下：ｉ）第１の治療用タンパク質、及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の核酸配列を含み：第１及び第２の組成物の投与の結果として、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子は、１００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルで（例えば、少なくとも１５０．．４００．．．１２００．．．２０００．．．５０００．．．または１，０００，０００ｐｇ／ｍｌを超える）（例えば、（例えば、対象から得た血清試料中で測定される（例えば、第１及び第２の投与から７．．．２５．．．５０日後に））対象において発現される、方法が本明細書において提供される。

特定の実施形態において、ポリカチオン性構造体は、空のカチオン性リポソーム、ミセル、またはエマルジョンを含む。他の実施形態では、ポリカチオン性構造体は、以下の、単独またはポリカチオン性構造体と組み合わせた１つ以上：線状または分岐のポリエチレンイミン、デンドリマー（例えば、エチレンジアミン、ポリリシン、ポリアルギニン、及び硫酸プロタミン系第４世代ｐａｍｍａｍデンドリマー）、ポリリジン及び硫酸プロタミンを含む。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体はカチオン性エマルジョンとして提供される。特定の実施形態では、エマルジョン中の界面活性剤は、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムなどから選択される。他の実施形態では、エマルジョンはさらに、トゥイーン、スパン及びトリグリセリドなどの中性構成要素を含む。特定の実施形態では、エマルジョンは、例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、またはＤＤＡＢなどのカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態において、エマルジョンは、自己乳化エマルジョンまたはマイクロエマルジョン（ＳＥＤＤＳ、ＳＭＥＤＤＳ）である。

いくつかの実施形態では、対象において第１及び第２のタンパク質及び／または第１及び第２の生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、ａ）第１の組成物を対象に投与することであって、対象が疾患または病態の少なくとも１つの症状を有するか、または少なくとも変更される生理学的形質を有し、第１の組成物が第１の量のポリカチオン性構造体を含み、そして第１の組成物が核酸分子を含まないかまたは実質的に含まず；及びｂ）第１の組成物を投与して約１００分以内に第２の組成物を対象に投与することを含み、第２の組成物は治療有効量の発現ベクターを含み、発現ベクターは非ウイルス性であり、ＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており、発現ベクターはそれぞれ、ｉ）Ａ）第１のタンパク質及び／またはＢ）第１の生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の発現カセット、及びｉｉ）Ａ）第２のタンパク質及び／またはＢ）第２の生物学的に活性な核酸分子をコードする第２の発現カセットを含む前記工程を含む、方法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、第１の組成物の投与及び第２の組成物の投与の結果として、第１及び第２のタンパク質及び／または第１及び第２の生物学的に活性な核酸分子は、疾患または病態に関して治療レベルで、または生理学的または疾患形質を改変するのに十分な有効レベルで、対象において発現される。

特定の実施形態では、第１のタンパク質はモノクローナル抗体軽鎖を含み、第２のタンパク質はそのモノクローナル抗体の重鎖を含む。他の実施形態では、第１及び第２の発現カセットはともに調節エレメントを含む。さらなる実施形態において、調節エレメントは、上記第１及び第２の発現カセットにおいて同一であるか、または異なっている。

実施例１で使用した様々なＣＰＧを含まないプラスミド構築物の模式図を示す。 ｈ－ＧＣＳＦ（配列番号１）のＣｐＧ非含有改変核酸配列及びｈ－ＧＣＳＦ（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。ＣｐＧジヌクレオチドが除去された位置は、配列番号１に下線で示されている。 連続的に、カチオン性リポソームＩＶ注射、続いてＤＮＡベクターＩＶ注射することによってマウスにおいて産生された血清ヒトＧ－ＣＳＦレベルのグラフを示す。 連続的に、カチオン性リポソームＩＶ注射、その後のＤＮＡベクター注射の２１日後のＷＢＣ及び絶対好中球数のヒストグラムを示す。 単一または二重カセットｈＧ－ＣＳＦ単一プラスミドベクターの連続ＩＶ注射によってマウスにおいて産生された血清ヒトＧ－ＣＳＦレベルを示す。 カチオン性リポソーム、続くｈＧ－ＣＳＦ遺伝子に連結された異なるプロモーター－エンハンサーの組合せを含有するＤＮＡのＩＶ注射の２１日後のマウスにおける血清ｈＧ－ＣＳＦレベを示す。 カチオン性リポソーム、続く単一カセット、ＥＦ１－ルシフェラーゼＤＮＡ単独または特定の薬剤と一緒の連続的ＩＶ注射の７日後のマウス肺ルシフェラーゼレベルを示す。 カチオン性リポソーム、次いで二重カセット、ＥＦ１－ｈＧ－ＣＳＦ－ＥＦ１－ルシフェラーゼＤＮＡの単独または特定の薬剤（複数可）と組み合わせたものの、連続ＩＶ注射の７日後のマウス肺ルシフェラーゼレベルを示す。 カチオン性リポソーム、次いでＭＡＲを含有または非含有のいずれかで、全てがルシフェラーゼ遺伝子に連結された、一連の異なるプロモーター－エンハンサーの組合せの１つを含むＤＮＡベクターの、ＩＶ注射の１０日後のマウス肺ルシフェラーゼレベルを示す。 ＰＥＩ：ＥＦ－１ Ｌｕｃ ＤＮＡ複合体のＩＶ注射、またはカチオン性リポソーム、続く同一のＥＦ－１ Ｌｕｃ ＤＮＡの連続的ＩＶ注射の１または５日後の、マウス肺ルシフェラーゼレベルを示す。 ７つの異なるカチオン性リポソーム製剤のうちの１つ、続く単一のカセット、ＥＦ１－ルシフェラーゼＤＮＡの連続ＩＶ注射の１日後の、マウス肺ルシフェラーゼレベルを示す。 ＰＥＩ：ＥＦ－１ Ｌｕｃ ＤＮＡ複合体単独または４種類の薬剤の１つと混合したもののＩＶ注射の１日後のマウス脾臓ルシフェラーゼレベルを示す。 カチオン性リポソーム、続く一連の二重カセット、ＥＦ－１－Ｌｕｃ－ｈＧ－ＣＳＦ ＤＮＡベクターの１つの連続ＩＶ注射の１または７日後のマウス肺ルシフェラーゼレベルを示す。 中性リポソームの同時注射の含有または非含有の、連続的カチオン性リポソームのＩＶ注射、続く二重カセット、単一プラスミドベクターのＩＶ注射の１日後のマウスで産生された血清ヒトＧ－ＣＳＦレベルを示す。 中性リポソームと一緒のカチオン性リポソームの連続的な同時ＩＶ注射、続く二重カセットプラスミドベクターのＩＶ注射の１または７日後のマウスにおいて産生された血清ヒトＧ－ＣＳＦレベルを示す。 押し出しされたＳＵＶ、０．１μｍまたはＭＬＶカチオン性リポソームと一緒のカチオン性リポソームの連続的ＩＶ注射、続くＥＦ１－ｈＧ－ＣＳＦプラスミドベクターのＩＶ注射の７日後のマウスで産生された血清ヒトＧ－ＣＳＦレベルを示す。 カチオン性リポソーム、続くＣＰＧを含まないヒトＧ－ＣＳＦ ＤＮＡベクターの１回の連続ＩＶ注射が、少なくとも次の４２８日間に、マウスにおいて治療レベルを超えるヒトＧ－ＣＳＦ血清タンパク質レベルを産生する、実施例２の結果を示す。 カチオン性リポソーム、続くＣＰＧを含まないヒトＧ－ＣＳＦ ＤＮＡベクターの１回の連続ＩＶ注射が、ラットの正常なＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）と共に治療レベルを超えるヒトＧ－ＣＳＦ血清タンパク質、ＷＢＣ及びＡＮＣレベルを産生することが示された実施例３の結果を示す。 ＤＰＴＡＰから生成したカチオン性リポソームがインビボトランスフェクションを媒介することを示された実施例３の結果を示す。 アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清レベルにより測定される毒性が、２４時間で２～５倍に上昇し、カチオン性リポソーム、その後のプラスミドＤＮＡの連続注射の４８時間で対照レベルに戻ることを示す。 カチオン性ＤＯＴＡＰリポソームへの２．５モル％デキサメタゾンパルミテート（ＤｅｘＰ）の組込みが、バックグラウンドレベルに近いＡＬＴレベルによって測定されたように、連続的ＩＶ注射後２４時間でのｈＧ－ＣＳＦの発現を増加させる一方で、同時に毒性を減少させることを示す。 ２．５％デキサメタゾンパルミテートを含有するＤＯＴＡＰリポソームのＩＶ注射が、ＡＬＴレベルによってバックグラウンドレベルまでに測定されたように毒性を減少させる一方で、ヒトＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを顕著に増加させることを示す。 デキサメタゾンの注射前後で、ｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを顕著に増加させる一方で、バックグラウンドレベルに近いＡＬＴレベルで測定されたように、毒性を低下させることを示す。 脂質：ＤＮＡ比を操作することにより、ｈＧ－ＣＳＦレベルを増加させる一方で、ＡＬＴレベルによってバックグラウンドレベルまで測定されたように、毒性を減少させることを示す。 デキサメタゾン、続くカチオン性ＤＯＴＡＰリポソーム中の２．５モル％デキサメタゾンパルミテート、その後のリツキシマブをコードする二重カセット、単一プラスミドＤＮＡベクターの前ＩＰ注射が、経時的にマウスにおける血清リツキシマブレベルを顕著に増加させることを示す。 デキサメタゾン前注射、次いでＤｅｘＰカチオン性リポソーム＋中性脂質、その後のリツキシマブをコードする二重カセット単一プラスミドＤＮＡベクターの１回の連続ＩＶ注射は、マウスにおける完全機能性のリツキシマブタンパク質の拡大した血清レベルを産生することを示す。 二重カセット、単一プラスミドリツキシマブＤＮＡベクターの連続ＩＶ注射後６週間で試験したマウス血清は、組換えリツキシマブタンパク質と同様に標的ＣＤ２０＋ヒトＢリンパ腫（Ｒａｊｉ）細胞に結合することを示す。 リツキシマブＤＮＡベクター注射したマウスからの血清中のリツキシマブタンパク質は、組換えリツキシマブと同様のレベルでＲａｊｉ ＣＤ２０＋ヒトＢ細胞の溶解を誘導することを示す。 デキサメタゾン、続くＤＯＴＡＰリポソーム中の中性脂質＋２．５ｍｏｌ％デキサメタゾンパルミテートの前ＩＰ注射は、経時的にラットにおける血清リツキシマブレベルを上昇させることを示す。 リツキシマブ二重カセット、単一プラスミドＤＮＡベクターのコドン最適化が、連続的ＩＶ注射の２４時間後の血清リツキシマブレベルをさらに増加させることを示す。 コドン最適化二重カセット、単一プラスミドリツキシマブＤＮＡベクターの１回の連続的カチオン性リポソームＩＶ注射が、拡大した血清リツキシマブレベルを産生することを示す。 選択された薬剤の前注射が、コドン最適化二重カセット、単一プラスミドリツキシマブＤＮＡベクターの連続的カチオン性リポソームＩＶ注射によって産生される血清リツキシマブレベルを顕著に増加させることを示す。 ２Ａ自己切断ペプチド配列により分離されたリツキシマブ重鎖及び軽鎖をコードする単一のカセットＤＮＡベクターの連続的ＩＶ注射が、顕著な血清リツキシマブタンパク質レベルを産生することを示す。 脂質：ＤＮＡ比を操作することによって、血清リツキシマブレベルを増加させる一方、ＡＬＴレベルによってバックグラウンドレベルに近いレベルまで測定されたように、毒性を減少させることを示す。 バルプロ酸またはテオフィリンのいずれかによる前処置が、ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡをコードするコドン最適化ＥＦ－１駆動プラスミドベクターの連続的カチオン性リポソームＩＶ注射によって産生される血清ヒト第９因子レベルを顕著に増加させることを示す。 実施例で使用したリツキシマブ（抗ＣＤ２０）二重カセットプラスミドの配置を示す。この図では、以下の略語が適用される：Ｍ：Ｍａｒ（Ｍ１：β－Ｇｌｏ、Ｍ２：２１ｑ２１及びＭ３：ＩＦＮβ）；Ｋ：Ｋｏｚａｋ配列（Ｋ１：ＡＡＧＣＴＴＴＣＣ、配列番号３；Ｋ２：ＡＡＧＣＣＡＣＣ、配列番号４）；エンハンサー：ｍＣＭＶまたはｈＣＭＶ；プロモーター：ＣＭＶまたはＥＦ１；５'ＵＴＲ：Ｉ１２６またはｈｔｌｖ；Ｈ：キメラ重鎖ｃＤＮＡ；Ｌ：キメラ軽鎖ｃＤＮＡ；及びｐＡ：ポリＡ。 実施例で使用したリツキシマブ（抗ＣＤ２０）単一（バイシストロン性）プラスミドの配置を示す。この図では、以下の略語が適用される：Ｋ：Ｋｏｚａｋ配列（Ｋ１：ＡＡＧＣＴＴＴＣＣ、配列番号３；ＡＡＧＣＣＡＣＣ、配列番号４）；エンハンサー：ｍＣＭＶまたはｈＣＭＶ；プロモーター：ＣＭＶまたはＥＦ１；５'ＵＴＲ：Ｉ１２６またはｈｔｌｖ；Ｈ：キメラ重鎖ｃＤＮＡ；Ｌ：キメラ軽鎖ｃＤＮＡ；Ｆ：フリン（Ｆ１：ＲＨＱＲ；Ｆ２：ＲＡＫＲ）；２Ａペプチド：Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ；及びｐＡ：ポリＡ。 実施例において使用されるヒト第ＩＸ因子プラスミドの配置を示す。この図には、以下の略語が適用される：Ｍ：Ｍａｒ（Ｍ１：β－Ｇｌｏ、及びＭ３：ＩＦＮβ）；Ｋｏｚａｋ２：Ｋｏｚａｋ配列２（ＡＡＧＣＣＡＣＣ、配列番号４）；エンハンサー：ｍＣＭＶ；プロモーター：ＥＦ１；５'ＵＴＲ：Ｉ１２６；ｈＦＩＸ：ヒト第ＸＩ因子ｃＤＮＡ；及びｐＡ：ポリＡ。 リツキシマブの重鎖及び軽鎖（下線部）を発現する下記の実施例で使用されるバイシストロン性の単一カセットプラスミド構築物（配列番号５）の一例（Ｎｏ．８、Ｇ４）を示す。 リツキシマブの重鎖及び軽鎖（下線部）を発現する下記の実施例で使用される二重カセット非最適化抗ＣＤ２０ ＣｐＧ非含有プラスミド構築物（配列番号６）の一例（Ｎｏ．２）を示す。 リツキシマブの重鎖及び軽鎖（下線部）を発現する以下の実施例で使用される二重カセット非最適化抗ＣＤ２０ ＣｐＧ非含有プラスミド構築物（配列番号７）の一例（Ｎｏ．４）を示す。 リツキシマブの重鎖及び軽鎖（下線部）を発現する以下の実施例において使用される二重カセットＭＡＲの無い最適化抗ＣＤ２０プラスミド構築物（配列番号８）の一例（Ｎｏ．４）を示す。 リツキシマブの重鎖及び軽鎖（下線部）を発現する下記の実施例で使用される二重カセットＭＡＲ含有最適化抗ＣＤ２０プラスミド構築物（配列番号９）の一例（Ｎｏ．６）を示す。 ヒト第ＩＸ因子を発現する以下の実施例において使用されるプラスミド構築物（配列番号１０）の一例（Ｎｏ．４）を示す。

定義
明細書中で使用される場合、「ＣｐＧが減少した」という語句は、配列またはベクターの野生型に存在するよりも少ないＣｐＧジヌクレオチドを有する核酸配列または発現ベクターを指す。「ＣｐＧ非含有」とは、本核酸配列またはベクターが任意のＣｐＧジヌクレオチドを有しないことを意味する。ＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ヒトＧ－ＣＳＦの野生型）を含む初期配列は、核酸配列を変更することによってＣｐＧジヌクレオチドを除去するように改変され得る。このようなＣｐＧジヌクレオチドは、コード配列だけでなく、例えば５'及び３'非翻訳領域（ＵＴＲ）、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ、ＩＴＲ、イントロン、及び核酸分子またはベクター中に存在する任意の他の配列などを含む非コード配列においても、適切に減少または排除することができる。

本明細書で使用される「空のリポソーム」とは、核酸分子を含まないが他の生物活性分子を含み得るリポソーム（例えば、脂質分子それ自体のみで構成されるリポソーム、または脂質分子及び小分子薬剤のみを含むリポソーム）を指す。

本明細書で使用する「空のカチオン性ミセル」とは、核酸分子を含まないが、他の生物活性分子を含み得るカチオン性ミセル（例えば、脂質及び界面活性剤分子のみで構成されるミセル、または脂質及び界面活性剤分子及び小分子薬剤のみで構成されるミセルなど）を指す。

本明細書で使用される「空のカチオン性エマルジョン」は、核酸分子を含まないが他の生物活性分子を含み得るカチオン性エマルジョンまたはマイクロエマルジョンを指す。

詳細な説明
本発明は、対象におけるタンパク質または生物学的に活性な核酸分子の発現を（例えば、長期間の治療レベルで）生成するための組成物、システム、キット及び方法を提供する。特定の実施形態では、第１の量のポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセル、または空のカチオン性エマルジョン）を含む第１の組成物及びＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少した治療有効量の発現ベクター（例えば、リポソームに会合していない非ウイルス発現ベクター）を含む第２の組成物を含み、且つ発現ベクターが、ｉ）第１の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の核酸配列を含む、システム、キット及び方法が提供される。他の実施形態では、このような第１及び第２の組成物は、第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子が対象において発現されるように（例えば、疾患または病態が治療されるように、または生理学的形質が変更するように、少なくとも５日間または少なくとも５０日間の治療レベルで）、対象に連続的に（例えば、全身的に）投与される。

本開示の実施形態の開発中に行われた研究が、カチオン性リポソームの単回注射（例えば、静脈内注射）、その直後に続く治療用タンパク質をコードするＣｐＧを含まないベクターの注射（例えば、静脈内注射）が、長期にわたりタンパク質の治療用血清レベルより多数倍（例えば、１０～２０倍高い）の循環タンパク質レベルを産生することを示した。このような投与はまた、処置の数週間後に循環好中球数を多数倍増加させた。

本開示の実施形態の開発中に行われた研究（例えば、下記の実施例１に示されるように）は、カチオン性リポソームの単回静脈内注射、続く２分後のヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）をコードするＣｐＧを含まないプラスミドベクターの静脈内注射により、少なくとも６３日間、治療用血清ｈＧ－ＣＳＦレベル（１００ｐｇ／ｍｌ以上）より１０～２０倍高い循環ｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを産生することを示した（図３参照）。このような投与はまた、マウスへの静脈内注射の３週間後に、循環好中球数を１０倍増加させた（図４）。対照的に、類似の、しかしＣｐＧを含有するｈＧ－ＣＳＦプラスミドベクターを含むカチオン性リポソーム－ＤＮＡ複合体の１回の全身注射は、注射後３日目でも検出可能な（＞２０ｐｇ／ｍｌ）ｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを産生することができず、注射後いずれの時点でも好中球数を増加させることができなかった（Ｔｕ ｅｔ
ａｌ，ＪＢＣ，２７５（３９）：３０４０８－３０４１６，２０００を参照；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、ヒトＧ－ＣＳＦの治療レベルでの発現を延長するために使用された実施例１に提示されたアプローチは、マウスにおいて著しい毒性を引き起こさないようであった。

従って、本明細書で提供されるインビボでの発現のためのアプローチは、全身性非ウイルス遺伝子送達の成功した治療適用を今まで不可能にしてきた臨界的限界を克服する。すなわち、長期にわたり治療レベルで送達された遺伝子を発現することができないということは、一般的に、重要な治療または生理学的エンドポイントを作成することが必要であることを意味する。実施例１に示されるように、本明細書で提供される方法の実施形態は、非ウイルスベクターを用いて治療用タンパク質のこのような長い持続的発現を達成することができ、ベクターにウイルス遺伝子を組み込む必要はない。これは、少なくとも１つのウイルス遺伝子とそのタンパク質産物が結合するウイルスＤＮＡ配列（反復配列のＥＢＶファミリーと共にＤＮＡベクターに挿入されるＥＢＮＡ－１遺伝子）の挿入に依存する他のアプローチが、この一過性の遺伝子発現の制限を克服するために必要とされてきたことから、重要である（Ｔｕ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。さらに、実施例１（図１）の６３日後に見出された高いｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルに加えて、同様の高レベルの発現が、注射後１４，２１，２８、及び４９日に測定、見出され、これは一度達成されたこれらの高い治療レベルが長期間維持されることを示している。また、実施例２は、図１７において４００日を超える高レベルの発現を示す。この高レベル及び長期発現は、ｈＧ－ＣＳＦについての米国特許第８，７５４，０６２号の図３に示される、単回ＩＶ注射後４日までの治療レベルしか産生しなかったＭＯＤＥＲＮＡによって提供されるｍＲＮＡアプローチよりも、かなり優れている。

さらに、本明細書で提供されるシステム、方法及び組成物は、治療レベルで送達された遺伝子の発現期間をはるかにより正確に制御することができる、多用途（例えば、非ウイルス）遺伝子送達及び発現プラットフォームを提供する。送達された遺伝子の発現の期間を制御するこの能力は、遺伝子治療分野の中で現在まで危機的に満たされていない重要な別のニーズに対処するものであり、タンパク質が治療レベルで発現される期間を制御する能力である。具体的には、ＦＤＡが認可した組換え分泌型ヒトタンパク質療法の広範かつ拡大したスペクトルが現在存在する。効果的かつ安全に患者を治療するためには、承認された異なるタンパク質療法が、極めて様々な期間にわたって治療レベルになければならない。異なるタンパク質療法の推奨治療期間は、２週間未満（ｈＧ－ＣＳＦ）から患者の生存期間（第ＩＸ因子）まで様々である。例えば、組換えヒトＧ－ＣＳＦタンパク質、ニューポジェンは、３週間毎の化学療法サイクルの最初の１０日間だけ毎日与えられる。血清ｈＧ－ＣＳＦレベルは、それぞれ毎日のニューポジェン投与の約１４時間後にベースラインに戻る。この１０日間の治療スケジュールは、その好中球増加効果が、この約１０日間の化学療法誘導性好中球減少の間にのみ示されるので、使用される。患者自身の好中球産生能力が回復するので、１１日目から２１日目までのＧ－ＣＳＦ上昇は一般に有益ではない。１０日を超えてニューポジェンを与えると、有毒な好中球関連の副作用を引き起こす可能性がある。対照的に、抗ＴＮＦ抗体は、数ヶ月または数年間にわたって日常的に投与され、第ＩＸ因子は、患者の生涯にわたって置換される。従って、異なるタンパク質は、２週間未満から患者の生存期間まで、様々な期間の治療レベルで産生されなければならない。それゆえ、患者において産生する治療レベルでの遺伝子発現の期間を制御することができる遺伝子治療アプローチは、現在ＦＤＡが承認するヒト治療用タンパク質の広範なスペクトルに対する有毒な副作用を回避しながら、治療のエンドポイントに達する。本明細書では、この制御を提供するために使用することができる様々な技術が提供される。５つのアプローチの例を以下に説明する。

第１に、特定の実施形態では、第２の発現カセットが単一のプラスミドＤＮＡベクターまたは他のベクターに挿入される。実施例１に示されるように、使用された単一発現カセットｈＧ－ＣＳＦプラスミドベクターは少なくとも６３日間治療用ｈＧ－ＣＳＦレベルを産生すること（図３）とは対照的に、第２カセットに限定して添加すると、治療レベルのｈＧ－ＣＳＦタンパク質の産生はマウスで２週間未満であった（図５）。注目すべきことに、ルシフェラーゼ遺伝子を駆動する第２の発現カセットはまた、ＩＶ注射マウスにおいて高い、制御可能なレベルでも発現される。

第２に、実施例１に示すように、一連の異なるＣＰＧ非含有プロモーター－エンハンサーの組合せを、単一カセットプラスミドベクターにおいて、マウスにおける単回ＩＶ注射後の異なる期間の範囲に治療レベルのｈＧ－ＣＳＦを発現するよう作製した（図６）。注目すべきことに、異なるプロモーターエンハンサーの組合せを組み込んだ異なるカセットを含む多発現カセット単一プラスミドＤＮＡベクターは、単一のＤＮＡベクターと異なる期間に異なるレベルで異なる治療用タンパク質を発現することができる。これにより、単一ＤＮＡベクターが複数の異なる治療用タンパク質（例えば、１、２、３、４、５、６以上の治療用タンパク質）を発現することが可能になる。それぞれの個々のタンパク質は、その後、適切な治療レベルで必要な期間発現される。このようなアプローチは、１人の患者に２つ以上の組換えタンパク質療法を組み合わせることによって現在発生する法外な費用を克服する１つの方法である。

第３に、実施例１に記載されているように、カチオン性リポソームと単独または選択された組み合わせで、現在ＦＤＡ承認の薬剤を同時に注射することにより、マウスにおいて連続ＩＶ注射によって後に送達される遺伝子発現のレベル／期間を選択的に増加または減少させることができる（図７及び８）。

第４に、実施例１で実証されているように、カチオン性リポソームの大きさ及び脂質組成を変化させることにより、連続のカチオン性リポソーム、その後のＤＮＡ注射によって送達される遺伝子の発現レベル及び期間も制御することができる（図１１）。

第５に、実施例１４で実証されているように、中性脂質をデキサメタゾン及びデキサメタゾンパルミテートとともに添加することにより、遺伝子発現の期間を増加させることができる（図２６及び２９）。対照的に、中性脂質単独の投与は、遺伝子発現の期間を減少させることができる（図１４及び１５）。

さらに、いくつかの文献はまた、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）を、それらのＩＶ注射後において長期発現を生じさせるために、ＤＮＡベクターに組み込むべきであると記載している（Ａｒｇｙｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（２０１１）８９：５１５－５２９，参照によりその全体が組み込まれる）。対照的に、本開示の実施形態の開発中に行われた研究は、このようなＭＡＲ要素の存在は、カチオン性リポソームに続くＣＰＧ非含有プラスミドＤＮＡの連続ＩＶ注射によって産生される遺伝子発現の期間を増加させず、一部のベクターでは減少させること示している（図９）。

特定の実施形態では、本開示は、ベクター投与前に対象に投与される、ベクターＤＮＡを含有しないポリカチオン性構造体（例えば、空のカチオン性リポソーム、空のカチオン性ミセルまたは空のカチオン性エマルジョン）を用いる。特定の実施形態では、ポリカチオン性構造体はカチオン性脂質であるか、及び／またはエマルジョンとして提供される。本開示は、使用されるカチオン性脂質に限定されず、いくつかの実施形態において、以下の１つ以上のものから構成することができる：ＤＤＡＢ、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム；ＤＰＴＡＰ（１，２－ジパルミトイル３－トリメチルアンモニウムプロパン）；ＤＨＡ；プロスタグランジン、Ｎ－［１－（２，３－ジオロイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチルサルフェート；１，２－ジアシル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ジオレオイル（ＤＯＴＡＰ）、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジセアロイル（ｄｉｓｅａｒｏｙｌ）を含むが限定されない）；１，２－ジアシル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ジオレオイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジセアロイルを含むが限定されない）、ＤＯＴＭＡ、Ｎ－［１－［２，３－ビス（オレオイルオキシ）］プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニムクロリド；ＤＯＧＳ、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン；ＤＣコレステロール、３．ベータ－［Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール；ＤＯＳＰＡ、２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－（２（スペルミンカルボキサミド）－エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロアセテート；１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ジオレオイル（ＤＯＥＰＣ）、ジラウロイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、パルミトイル－オレオイルを含むが限定されない）；ベータ－アラニルコレステロール；ＣＴＡＢ、セチルトリメチルアンモニウムブロミド；ジＣ１４－アミジン；Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ'－テトラデシル－３－テトラデシルアミノプロピオアミジン；１４Ｄｅａ２，Ｏ，Ｏ'－ジテトラデカノイル－Ｎ－（トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド；ＤＯＳＰＥＲ、１，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシ－スペルミル）－プロピルアミド；Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチル－Ｎ，Ｎ'－ビス（２－ヒドロキシルエチル）－２，３－ジオレオイルオキシ－１，４－ブタン－ジアンモニウムヨージド；１－［２－（９（Ｚ）－オクタデセノイルオキシ）エチル］－２－８（Ｚ）－ヘプタデセニル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）などの１－［２－アシルオキシ］エチル］２－アルキル（アルケニル）－３－（２－ヒドロキシエチル－）イミダゾリニウムクロリド誘導体；１－［２－（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］－２－ペンタデシル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＰＴＩＭ）；１－［２－テトラデカノイルオキシ）エチル］－２－トリデシル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリウムクロリド（ＤＭＴＩＭ）（例えば、Ｓｏｌｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３：１３５３７－１３５４４に記載されており、本明細書中に参考として組み込まれる）；第４級アミン上にヒドロキシアルキル部分を含有する２，３－ジアルキルオキシプロピル第４級アンモニウム化合物誘導体、例えば、１，２－ジオレオイル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩ）；１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ－ＨＰ）；１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ－ＨＢ）；１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシペンチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ－ＨＰｅ）；１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；１，２－ジパルミチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＰＲＩＥ）；１，２－ジステリル（ｄｉｓｔｅｒｙｌ）オキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＳＲＩＥ）（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０－２５６１に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。上記の脂質の多くは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；及びＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている。

特定の実施形態において、本開示は、ＣｐＧ減少またはＣｐＧ非含有の発現ベクターを使用する。ＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ヒトＧ－ＣＳＦの野生型）を含む初期配列は、核酸配列を変更することによってＣｐＧジヌクレオチドを除去するように改変され得る。図２は、ヒトＧ－ＣＳＦのＣｐＧを含まないバージョンを示し、その配列は下線を引いたＣｐＧを除去するように変更されている。このようなＣｐＧジヌクレオチドは、コード配列だけでなく、例えば５'及び３'非翻訳領域（ＵＴＲ）、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ、ＩＴＲ、イントロン、及び核酸分子またはベクター中に存在する任意の他の配列などを含む非コード配列においても、適宜減少または排除され得る。ＣｐＧジヌクレオチドは、選択されたアミノ酸のコドントリプレット内に位置し得る。ＣｐＧジヌクレオチドを含む１つ以上のコドントリプレットを有する５つのアミノ酸（セリン、プロリン、スレオニン、アラニン及びアルギニン）が存在する。これらのアミノ酸の５つはすべて、ＣｐＧは避けるが、以下の表１に示す同じアミノ酸を依然としてコードするように変更することができるＣｐＧジヌクレオチドを含まない代替コドンを有する。それゆえ、選択されたアミノ酸のコドントリプレット内に割り当てられたＣｐＧジヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドを欠く同じアミノ酸のコドントリプレットに変更することができる。

さらに、コーディング領域内では、トリプレット間の接合部分が考慮されるべきである。例えば、アミノ酸トリプレットがＣ－ヌクレオチドで終わった後、Ｇ－ヌクレオチド（例えば、バリン、グリシン、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸）のみで開始することができるアミノ酸トリプレットが続く場合、第１のアミノ酸トリプレットのトリプレットはＣ－ヌクレオチドで終わらないものに変更される。ＣｐＧ配列を作製するための方法は、例えば、米国特許第７，２４４，６０９号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＮＶＩＶＯＧＥＮによって提供される商業サービスは、ＣｐＧ非含有（または減少した）核酸配列及びベクターを産生するためにも利用可能である。

下記の表２に、本明細書に記載のベクターに使用することができるプロモーター及びエンハンサーの例を示す。このようなプロモーター、及び当該技術分野で公知の他のプロモーターは、単独で、または任意のエンハンサーのいずれかまたは当該技術分野で公知のエンハンサーと共に使用され得る。さらに、複数のタンパク質または生物学的に活性な核酸分子（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）を同じベクターから発現させる場合、同一または異なるプロモーターを目的の核酸配列と組み合わせて使用することができる。

本開示は、発現される治療用タンパク質の種類によって制限されない。特定の実施形態では、治療用タンパク質は、抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ'）２）を含む。他の実施形態では、治療用タンパク質は、抗炎症性タンパク質、凝固タンパク質、抗癌タンパク質、抗敗血症タンパク質などからなる群から選択される。

実施例１
カチオン性リポソーム、続くＣＰＧ非含有発現ベクターの連続注射を用いたインビボタンパク質発現
この実施例は、カチオン性リポソーム、これに時間的に密接に続くＣＰＧ非含有発現ベクターの連続注射を使用してインビボタンパク質発現を用いた様々な研究を、記載している。

方法
リポソーム調製。凍結乾燥粉末としての純粋なＤＯＴＡＰ脂質は、Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄから購入した。純粋なＤＯＴＡＰカチオン性リポソームは、凍結乾燥粉末を５％デキストロースの水溶液中に２０ミリモルの脂質濃度で再懸濁させることによって調製した。その後、この溶液を１５分間ボルテックスして、レーザ光散乱によって測定した、平均粒径が３５０ｎｍの多層状小胞（ＭＬＶ）を形成した。その後、ＭＬＶから、バスソニケーター中で超音波処理することによって小さな単層状小胞（ＳＵＶ）、平均粒径７５ｎｍを形成した。

プラスミド構築。使用されるベクターの一般的な図式を図１に示す。一般に、ＣｐＧ非含有ＤＮＡプラスミドベクターは、典型的には、以下のエレメント：ｍＣＭＶ／ＥＦ１／Ｉ１２６（８５１ｂｐ）またはｈＣＭＶ／ｈＣＭＶ／ＨＴＬＶ（８７３ｂｐ）のいずれかのエンハンサー／プロモーター／５'ＵＴＲ（これらは、対象（例えば、ｈ－ＧＣＳＦ（６１５ｂｐ）またはｓｏＬｕｘ（１６５３ｂｐ））の遺伝子に結合している）、最小ポリＡ（６３ｂｐ）、βＧｌｏｂｉｎ（４３４ｂｐ）、２１ｑ２１（１０５５ｂｐ）またはＩＦＮ（８２０ｂｐ）に由来するＭＡＲ、及びＲ６ＫＡ Ｏｒｉ／Ｋａｎ^r（カナマイシン抗生物質耐性）発現カセット（１２０６ｂｐ）から構成される。Ｒ６ＫＯｒｉ／Ｋａｎ^r
ＤＮＡは、３つのエンドヌクレアーゼ制限酵素部位、ＤｒａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩを含むベースベクターとして設計した。これは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＮＥＢ、ＭＡ）を使用して、ｇＢｌｏｃｋの４つのＤＮＡ断片（ＩＤＴ、ＩＡ）から構築した。ＭＡＲ含有プラスミドについては、βＧｌｏｂｉｎ ＭＡＲをＤｒａＩＩＩ－ＥｃｏＲＩ部位で塩基ベクターに挿入した。ｈ－ＧＣＳＦのＣｐＧ非含有核酸配列を図２に示す。

ＥｃｏＲＩとＸｂａＩとの間に各ＤＮＡエレメントを連続挿入することにより、ｐｕｃ１９プラスミド骨格を用いて発現カセットを構築した。５'ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ部位を含むエンハンサー／プロモーターエレメントを、５'ＵＴＲ、遺伝子、ｐＡまたはｐＡ－ＭＡＲに、ならびにＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ部位でそれぞれｐｕｃ１９にライゲートした。次いで、発現カセットをＥｃｏＲＩ－ＸｂａＩで消化し、ＥｃｏＲＩ－ＮｈｅＩで塩基ベクターに挿入し、第２の発現カセット挿入部を挿入するために使用することができる制限部位を含む発現プラスミドを作製した。ｈＧ－ＣＳＦ発現カセットを塩基ベクターにＥｃｏＲＩ－ＮｈｅＩで挿入することにより、二重（Ｌｕｃ－及びＧＣＳＦ）カセット発現プラスミドを構築した。次に、第２のＬｕｃ発現カセットを、ＥｃｏＲＩ－ＮｈｅＩでＧ－ＣＳＦ発現プラスミドに挿入し、二重カセット、Ｌｕｃ及びＧＣＳＦ含有単一プラスミドベクターを作製した。

プラスミド精製。エンドトキシン非含有プラスミドを、以下のように、５'プライムエンドフリーＭａｘｉカラムで精製した。簡潔に言うと、プラスミドを含有する細菌２００ｍｌを３７Ｃで一晩増殖させ、その後回収する。細菌細胞を製造者のプロトコールに従って溶解する。エンドトキシンは、エンドフリーフィルターＣＳを用いて除去される。イソプロパノールを溶解液に添加し、次いでカラムに充填する。連続洗浄後、カラムを遠心分離し、１０分間風乾して残留エタノールを確実に除去する。その後、１ｍｌの乳酸加リンゲル液を用いてＤＮＡをカラムから溶出させる。

マウス。２１ｇの雌のＣＤ－１マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入した。飼育、世話及びすべての手続きは、ＩＡＣＵＣの承認されたガイドラインに従って実施された。

マウスにおけるカチオン性リポソームその後のプラスミドＤＮＡの連続注射。１グループ当たり３～５匹のマウスに注射した。各マウスにカチオン性リポソーム（ＭＬＶまたはＳＵＶ）を１回ＩＶ注射し、２分後にＣＰＧ非含有プラスミドＤＮＡベクターを１回ＩＶ注射した。

ヒトＧ－ＣＳＦレベルのためのマウス血清の入手、その後の分析。各マウスを麻酔し、その後顎下静脈を介して採血した。その後、血清を全血から単離し、ヒトＧ－ＣＳＦレベルを、Ｒ及びＤシステムのヒトＧ－ＣＳＦ ＥＬＩＳＡを用いて、製造業者の仕様書に従って厳密に実施して、ｐｇ／ｍｌで測定した。

ルシフェラーゼ活性のためのマウス組織の入手、その後の分析。肺を５００ｕｌの１×溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）でホモジナイズした。ホモジネートを、３０００×ｇで、４Ｃで１０分間遠心分離し、上清を集めた。ルシフェラーゼ活性は、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）で、２０μｌの上清及び１００μｌのルシフェラーゼ試薬を用いて１０秒間アッセイした。

結果／説明
連続的、カチオン性リポソームＩＶ注射、続くＤＮＡベクター注射によってマウスにおいて産生された血清ヒトＧ－ＣＳＦレベル
１グループ当たり５匹のマウスに注射した。各マウスは、８００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム（ＭＬＶまたはＳＵＶ）、２分後に、８０μｇのｍＣＭＶ－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ、ｈＣＭＶ－ｈＣＭＶ－ｈＧＣＳＦまたはｍＣＭＶ－ＥＦ１－ルシフェラーゼ、ＣＰＧ非含有、プラスミドＤＮＡベクターの単回のＩＶ注射を受けた。血清ｈＧ－ＣＳＦレベルは、ＩＶ注射後７日目から開始し、その後、７日間隔で評価した。

図３に示すように、ｈＧ－ＣＳＦ遺伝子を含む３つのＤＮＡベクターはすべて、注射後７日目に、治療レベルを超えるｈＧ－ＣＳＦレベル（好中球数を増加させるために必要とされる≧１００ｐｇ／ｍｌ）を産生した。その後、ｈＧ－ＣＳＦレベルは２１日目まで漸進的に上昇し、それから分析された最後の時点である６３日目まで安定したままであった。対照的に、ＥＦ１－ルシフェラーゼＤＮＡベクターの同一の連続ＩＶ注射によって産生されたｈＧ－ＣＳＦレベルは、実験の過程を通して検出できなかった。

連続したＩＶ注射カチオン性リポソーム、その後のＤＮＡベクター注射の２１日後にＷＢＣ及び絶対好中球数
ＤＯＴＡＰ ＭＬＶの連続ＩＶ注射、２分後のＥＦ１－ｈＧＣＳＦまたはＥＦ－１ルシフェラーゼ含有ＣＰＧ非含有プラスミドＤＮＡベクターのいずれかの単回ＩＶ注射の後の２１日目に、４匹のマウスのグループから全血を採取した。次いで、各マウスからの血液を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｄａｖｉｓ獣医診断研究所による総ＷＢＣ、及び絶対好中球数について、盲検様式で分析した。

図４に示すように、ＤＯＴＡＰカチオン性リポソームの１回の連続ＩＶ注射とそれに続くＥＦ１－ｈＧ－ＣＳＦ ＤＮＡのＩＶ注射は、ＥＦ１－ルシフェラーゼ、プラスミドＤＮＡベクターの連続注射を受けた偽注射対照マウスと比較して、注射後２１日目に絶対好中球数を約１０倍及び総ＷＢＣを約４倍に増加させた。これらの結果は、ｈＧ－ＣＳＦ遺伝子でコードされたタンパク質産物が、処置されたマウスにおいて完全に機能的であったことを証明している。まとめると、２１日目（図３参照）に産生された治療用ｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルよりも１０～１５倍で結合したＥＦ１－ｈＧ－ＣＳＦ ＤＮＡベクターにより産生された絶対好中球数の高レベルの増加は、カチオン性リポソーム、続くＣＰＧ非含有ＤＮＡベクターの単回の連続ＩＶ注射すると、現在のＦＤＡ承認の組換えヒトタンパク質治療の治療効果を延長することができることを実証している。

単一または二重カセットのｈＧ－ＣＳＦ単一プラスミドベクターの連続ＩＶ注射によるマウス産生血清ヒトＧ－ＣＳＦレベル
８００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶカチオン性リポソームを連続ＩＶ注射し、２分後に４０μｇのＥＦ１－ルシフェラーゼ－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ（２発現カセット）またはＥＦ１－ｈＧＣＳＦ（１発現カセット）、ＣＰＧ非含有、単一プラスミドＤＮＡベクターをＩＶ注射したのち、６日目または１４日目のいずれかにおいて４匹のマウスのグループから血清を採取した。

図５に示されるように、ｈＧ－ＣＳＦ遺伝子を含む単一及び二重カセットＤＮＡベクターはそれぞれ、注射後６日目に治療レベルを超える血清ｈＧ－ＣＳＦレベル（好中球数を増加させるために必要とされる≧１００ｐｇ／ｍｌ）９５１及び４２３ｐｇ／ｍｌを産生した。単一のカセットベクターは１４日目にさらに高い治療レベル、１９４１ｐｇ／ｍｌを産生した。対照的に、二重カセット単一プラスミドＤＮＡベクターにより１４日目に産生されたｈＧ－ＣＳＦレベルは、１００ｐｇ／ｍｌ未満のｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルは治療的ではないように、治療レベル未満（９３ｐｇ／ｍｌ）に低下していた。従って、第２の発現カセットを加えることにより、第１のカセットに含まれる遺伝子の発現期間を制御することができる。

カチオン性リポソーム、その後のｈＧ－ＣＳＦ遺伝子に連結された異なるプロモーター－エンハンサー組合せを含有するＤＮＡのＩＶ注射の２１日後における、マウスの血清ｈＧ－ＣＳＦレベル
８００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶカチオン性リポソームを連続ＩＶ注射し、その２分後に６０μｇのｈＧ－ＣＳＦ遺伝子（これらは以下のエンハンサー－プロモーターの組合せ：ＣＰＧを含まない単一のカセットであるＤＮＡベクター中の、ｍＣＭＶ－ＥＦ１、ｈＣＭＶ－ｈＣＭＶ、ｈＣＭＶ－フェリチン（ｈｆｅｒｒｉｔｉｎ）軽鎖、ｈＣＭＶ－フェリチン重鎖、ｈＣＭＶ－グルコース調節タンパク質７８またはｍＣＭＶ－フェリン（ｈｆｅｒｒｉｔｉｎ）軽鎖それぞれの１つに連結している）をＩＶ注射し、その２１日目後に４匹のマウスのグループから血清を採取した。

図６に示されるように、治療レベルを超えるｈＧ－ＣＳＦ血清レベルの範囲が、ｈＧ－ＣＳＦ遺伝子にそれぞれ連結された、ｍＣＭＶ－ＥＦ－１（２１２０ｐｇ／ｍｌ）、ｈＣＭＶ－ｈＣＭＶ（１５１６ｐｇ／ｍｌ）、ｈＣＭＶ－ＦｅｒＬ（６９９ｐｇ／ｍｌ）、ｈＣＭＶ－Ｇｒｐ７８（３４３ｐｇ／ｍｌ）及びｍＣＭＶ－ＦｅｒＬ（３０３ｐｇ／ｍｌ）－駆動ＤＮＡベクターにより、２１日目に産生された。対照的に、ｈＣＭＶ－ＦｅｒＨ－ｈＧ－ＣＳＦ ＤＮＡベクター（５２ｐｇ／ｍｌ）は、治療量未満のｈＧ－ＣＳＦレベルを産生した。まとめると、これらの結果は、プロモーター－エンハンサーの組合せを変化させることにより、単回注射の２１日後に、治療量の２０倍を超えるレベルから治療量未満の様々な範囲のｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを産生することができることを明らかにしている（好中球数を増加させるには、ｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベル≧１００ｐｇ／ｍｌが必要である）。

カチオン性リポソーム、その後の単一カセット、ＥＦ１－ルシフェラーゼＤＮＡ単独または薬剤との組合せの連続ＩＶ注射の７日後における、マウス肺ルシフェラーゼレベル
８００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶカチオン性リポソーム単独、または２ｍｇ／ｋｇのＬ－アルギニン、０．０１ｍｇ／ｋｇのコルヒチンまたは１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを含む上記カチオン性リポソームを連続ＩＶ注射し、その７日後に、４匹のマウスのグループから肺を採取した。いずれの場合も、カチオン性リポソーム注射の２分後、４０μｇのｍＣＭＶ－ＥＦ１－ルシフェラーゼ、ＣＰＧ非含有、単一カセットＤＮＡベクターのＩＶ注射がなされた。

図７に示すように、ＤＯＴＡＰ ＭＬＶ単独の連続注射を受けたマウス（対照）と比較して、コルヒチンまたはデキサメタゾンのいずれかをリポソームと一緒に投与されたマウスは、肺においてより高いルシフェラーゼ活性を示した。対照的に、リポソームと共にＬ－アルギニンを投与されたマウスは、遺伝子発現レベルを増加させることができなかった。従って、選択された薬剤をリポソームと共に同時注射することにより、連続的なカチオン性リポソーム、その後のＤＮＡ注射によって送達される遺伝子の発現レベル及び期間を増加させることができる。

カチオン性リポソーム、その後の２重カセット、ＥＦ１－ｈＧ－ＣＳＦ－ＥＦ１－ルシフェラーゼＤＮＡ単独または薬剤（複数可）との組合せの連続ＩＶ注射の７日後のマウス肺ルシフェラーゼレベル
８００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶカチオン性リポソーム単独、または２ｍｇ／ｋｇのＬ－アルギニン、１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン、０．０２ｍｇ／ｋｇのシルデナフィル、０．１ｍｇ／ｋｇのバルプロ酸または２ｍｇ／ｋｇのＬ－アルギニン＋０．０２ｍｇ／ｋｇのシルデナフィル（ＶＩＡＧＲＡ）を含有する上記カチオン性リポソームをＩＶ注射し、その７日後に、４匹のマウスのグループから肺を採取した。いずれの場合も、カチオン性リポソーム注射の２分後に、４０μｇのＥＦ１－ルシフェラーゼ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ、２発現カセット、ＣＰＧ非含有単一プラスミドＤＮＡベクターのＩＶ注射がなされた。

図８に示すように、ＤＯＴＡＰ ＭＬＶ単独の連続注射を受けたマウス（対照）と比較して、デキサメタゾン、バルプロ酸またはシルデナフィル単独、またはリポソームと共にＬ－アルギニン＋シルデナフィルを投与されたマウスは、肺においてより高いルシフェラーゼ活性を示した。対照的に、リポソームと共にＬ－アルギニンまたはバルプロ酸のいずれかを投与されたマウスは、対照より低いか、または対照と同等であった。従って、同時注射された薬剤に依存して、送達される遺伝子の発現レベルを増加または減少させることができる。

カチオン性リポソーム、その後の、それぞれがＭＡＲを有するかまたは有することはなく、全てがルシフェラーゼ遺伝子に連結された一連の異なるプロモーター－エンハンサーの組合せの１つを含むＤＮＡベクターの、連続ＩＶ注射の１０日後におけるマウス肺ルシフェラーゼレベル
８００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶカチオン性リポソームの連続ＩＶ注射、その２分後に、以下のエンハンサー－プロモーター：ｈＣＭＶ－ｈＣＭＶ、ｈＣＭＶ－ヒトフェリチン重鎖、ｈＣＭＶ－ＣＢＯＸ（ヒトカルボキシペプチダーゼＢ１）、ｍＣＭＶ－ｈＣＭＶ、ｍＣＭＶ－ＣＢＯＸ及びｍＣＭＶ－ＥＦ１（それぞれＣＰＧを含まない単一カセットＤＮＡベクター中のルシフェラーゼ遺伝子に連結している）の組合せの１つに連結したルシフェラーゼ遺伝子４０μｇをＩＶ注射し、その１０日後に、３匹のマウスのグループから肺を採取した。

図９は、ＭＡＲを欠き、ｈＣＭＶに連結されたｈＣＭＶエンハンサー、フェリチン重鎖またはＣＢＯＸプロモーターを含むＤＮＡベクターが、ＭＡＲエレメントを含む対応するベクターより高い肺ルシフェラーゼレベルを産生することを示している。対照的に、ＭＡＲ、及びｈＣＭＶ、ＥＦ１またはＣＢＯＸプロモーターに連結されたｍＣＭＶエンハンサーの両方を含むＤＮＡベクターは、ＭＡＲエレメントを欠く対応するベクターほど高いレベルの肺ルシフェラーゼを産生することができなかった。従って、ＭＡＲを欠いてＣＰＧを含まないＤＮＡベクターは、ＭＡＲ含有ベクターよりも耐久性のある発現を産生し得る。

ＰＥＩ：ＥＦ－１ Ｌｕｃ ＤＮＡ複合体のＩＶ注射、またはカチオン性リポソーム、その後の、同一のＥＦ－１ Ｌｕｃ ＤＮＡの連続ＩＶ注射の１日後または５日後におけるマウス肺ルシフェラーゼレベル
１：４のＮ：Ｐ比で２２ｋＤａの線状ＰＥＩに複合体化された１２．５μｇのＣＰＧ非含有ＥＦ－１－Ｌｕｃ ＤＮＡベクターをＩＶ注射、または、９００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶカチオン性リポソームの連続ＩＶ注射、その２分後の４０μｇの同じＥＦ－１－Ｌｕｃ ＤＮＡベクターのＩＶ注射の、１日または５日後において３匹のマウスのグループから肺を採取した。

図１０は、カチオン性リポソーム、その１日後のＤＮＡを連続して注射したマウスよりもＰＥＩ：ＤＮＡを注射したマウスが、肺ルシフェラーゼレベルが一貫して高いことを示している。しかしながら、肺ルシフェラーゼレベルは、５日目までにＰＥＩ：ＤＮＡ注射マウスにおいて約１００倍低下していた。直接対比すると、連続的にＩＶ注射したマウス由来の肺ルシフェラーゼレベルは、注射後５日目までに上昇した。ルシフェラーゼレベルは、５日目に屠殺したＰＥＩ：ＤＮＡ注射マウスに存在するレベルよりも、連続注射したマウスでは最大１５０倍高かった。従って、連続カチオン性リポソーム、その後のＤＮＡ注射は、ＰＥＩ：ＤＮＡ複合体として注射された同じＣＰＧ非含有ＤＮＡと比較した場合、後の時点でより高いレベルの遺伝子発現を産生する。

７つの異なるカチオン性リポソーム製剤のうちの１つ、その後の単一のカセットＥＦ１－ルシフェラーゼＤＮＡの連続ＩＶ注射の１日後における、マウス肺ルシフェラーゼレベル
８００ｎｍｏｌの、純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶ、純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、ＤＯＴＡＰ：コレステロール２：１ＭＬＶ、ＤＯＴＡＰ：ジオレリル（ｄｉｏｌｅｌｙｌ）ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）１：１ＭＬＶ、ＤＳＴＡＰ ＭＬＶ、エチルＤＳＰＣ ＭＬＶまたはＤＯＴＡＰ：ＤＯＢＡＱ１：１ＭＬＶのカチオン性リポソームの連続ＩＶ注射の１日後に、４匹のマウスのグループから肺を採取した。それぞれの場合において、カチオン性リポソーム注射の２分後に、８０μｇのｍＣＭＶ－ＥＦ１－ルシフェラーゼ、ＣＰＧ非含有単一カセットＤＮＡベクターのＩＶ注射がなされた。

図１１に示すように、純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶの連続ＩＶ注射を受けたマウスの肺ルシフェラーゼレベルと比較すると、ＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、ＤＯＴＡＰ：コレステロールまたはＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣのカチオン性リポソーム製剤を受けたマウスは、ＤＯＴＡＰ ＭＬＶに近似するかまたはそれ以上の遺伝子発現レベルを産生した。対照的に、ＤＳＴＡＰ、エチルＤＳＰＣまたはＤＯＴＡＰ：ＤＯＢＡＱ ＭＬＶを投与されたマウスは、非常に低いまたはほとんど検出不可能な肺ルシフェラーゼレベルのいずれかを産生した。ＤＯＴＡＰ ＭＬＶは、カチオン性リポソーム：ＤＮＡ複合体として注射された場合のＤＯＴＡＰ ＳＵＶよりも１７００倍高いレベルの遺伝子発現を産生するので、ＤＯＴＡＰ ＳＵＶがＤＯＴＡＰ ＭＬＶに近似する遺伝子発現レベルを産生することは予想外であった（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：１６７－１７３；１９９６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

ＰＥＩ：ＥＦ－１ Ｌｕｃ ＤＮＡ複合体単独または４種の異なる薬剤の１種と混合した上記複合体のＩＶ注射の１日後におけるマウス脾臓ルシフェラーゼレベル
１：４のＮ：Ｐ比で２２ｋＤａの線状ＰＥＩと複合体化した１２．５μｇのＣＰＧ非含有ＥＦ－１－Ｌｕｃ ＤＮＡベクターのＩＶ注射の１日後の３匹のマウスのグループから、脾臓を採取した。マウスは、ＰＥＩ：ＤＮＡ複合体ＩＶ注射を受ける２時間前に、マウス１匹当たり、１ｍｌの５％ＤＭＳＯ単独、または２００μｇのアンレキサノクス、１ｍｇのクロロキン、２００μｇのＳＡＨＡまたは３００μｇのトファシチニブを含む上記１ｍｌの５％ＤＭＳＯのいずれかの腹腔内注射を受けた。

図１２は、ＣＰＧ非含有ＤＮＡを注射する前の抗炎症剤アンレキサノクス、クロロキンまたはＳＡＨＡの前注射は遺伝子発現レベルを増加させたが、トファシチニブは遺伝子発現を増加させなかったことを示している。特に、アンレキサノクスは、ＴＢＫ１誘導性インターフェロン活性化経路の選択的阻害剤であり、遺伝子発現レベルを増加させた。従って、選択された抗炎症剤の前注射は、遺伝子治療のためのＣＰＧ非含有ＤＮＡの有効性をさらに増加させることができる。

カチオン性リポソーム、その後の一連の二重カセットＥＦ－１－Ｌｕｃ－－ｈＧ－ＣＳＦ ＤＮＡベクターの１つの連続ＩＶ注射の１または７日後におけるマウス肺ルシフェラーゼレベル
８００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＭＬＶカチオン性リポソーム、続く２分後の４０μｇのＥＦ１－Ｌｕｃ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ、ＥＦ１－Ｌｕｃ－－ｈＣＭＶ－ｈＣＭＶ－ｈＧＣＳＦ、ＥＦ１－Ｌｕｃ－－ｈＣＭＶ－ｈＣＢＯＸ－ｈＧＣＳＦ、ＥＦ１－Ｌｕｃ－－ｈＣＭＶ－ｈＲＥＧ１－ｈＧＣＳＦまたはＥＦ１－Ｌｕｃ－－ｍＣＭＶ－ｈＣＢＯＸ－ｈＧＣＳＦの２発現カセット、ＣＰＧ非含有単一プラスミドＤＮＡベクターの、連続ＩＶ注射の１または７日後に、４つのマウスのグループから肺を採取した。

図１３は、各カセットにＥＦ１プロモーターを含むＥＦ１－Ｌｕｃ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ二重カセットベクターの連続注射を受けたマウス（対照）と比較した場合、１つのカセット中のＥＦ１プロモーター及び第２のカセット中の別のプロモーターを含む他の４つの二重カセットＤＮＡベクターのそれぞれを受けたマウスは、注射後１日目と７日目の両方において、肺において一貫してより高いルシフェラーゼ活性を示した。各カセット中に異なるプロモーターを含む二重カセットベクターは、両カセット中にＥＦ－１プロモーターを含む二重カセットベクターにより産生されるよりも各時点で最大１０倍まで、またはそれ以上高い肺ルシフェラーゼレベルを産生した。従って、マルチカセットベクターの異なるカセットにおける異なるプロモーターエレメントの使用は、それらが産生する遺伝子発現のレベル及び期間を顕著に増加させることができる。

中性リポソームの同時注射を使用するか、または使用しない、カチオン性リポソーム連続ＩＶ注射、続く二重カセット、単一プラスミドベクターのＩＶ注射の１日後におけるマウスで産生された血清ヒトＧ－ＣＳＦレベル
中性ＭＬＶリポソームは、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０Ｈ、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨから調製された。この製品の脂肪酸含量は１５％のパルミチン酸、８５％のステアリン酸である。リポソームは、ロータリーエバポレーターで有機溶媒中の脂質を乾燥させ、次いで乾燥した脂質膜を５％デキストロース水溶液に５０ミリモルの脂質濃度で再懸濁させるか、または脂質を水和して５％（ｗ／ｖ）デキストロース中の乾燥粉末とすることのいずれかにより調製した。両方とも６０℃で調製した。次いで、溶液を１５分間ボルテックスしてＭＬＶを形成させた。４匹のマウスのグループから、緩衝液のみの（対照）、１０００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶカチオン性リポソーム単独、または１０００ｎｍｏｌの中性ＭＬＶと同時注射の連続ＩＶ注射、その２分後の１２０μｇのＥＦ１－ルシフェラーゼ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ（２発現カセット）、ＣＰＧ非含有単一プラスミドＤＮＡベクターまたは１４００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶカチオン性リポソームを単独または１０００ｎｍｏｌの中性ＭＬＶと同時注射のＩＶ注射、その２分後の１００μｇのＥＦ１－ルシフェラーゼ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ ＤＮＡのＩＶ注射し、その１日後に血清を採取した。

図１４に示すように、純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶを中性ＭＬＶ、その後ＥＦ１－ルシフェラーゼ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ ＤＮＡと共に連続的に同時注射した１日後に産生した血清ｈＧ－ＣＳＦレベルは、中性ＭＬＶのないＤＯＴＡＰ ＳＵＶの連続注射と比較して３倍から６００倍に増加した。従って、中性リポソームをカチオン性リポソームと共に同時注射することにより、産生される遺伝子発現のピークレベルを顕著に増加させることができる。さらに、中性リポソームを同時注射することは、中性リポソームを同時注射することなくカチオン性リポソーム対ＤＮＡの様々な比率を連続注射することによって産生される遺伝子発現レベルの変動を排除するようである。

中性リポソームとカチオン性リポソームの連続静脈ＩＶ注射、続く二重カセットプラスミドベクターのＩＶ注射の１または７日後のマウスで産生された血清ヒトＧ－ＣＳＦレベル
１０００ｎｍｏｌの中性ＭＬＶと同時注射される１０００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ
ＳＵＶカチオン性リポソームを連続ＩＶ注射し、２分後に、１４００ｎｍｏｌと中性ＭＬＶと同時注射される１２０μｇのＣＰＧ非含有ＥＦ１－ルシフェラーゼ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ ＤＮＡまたは１０００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶカチオン性リポソームのＩＶ注射、２分間後に１００μｇのＥＦ１－ルシフェラーゼ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦ ＤＮＡのＩＶ注射の後、７日目に４匹のマウスのグループから血清を採取した。また、緩衝液のみ（対照）、それぞれ、１０００、７５０、５００、２５０または１００ｎｍｏｌの中性ＭＬＶと同時注射される８００ｎｍｏｌの純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶカチオン性リポソームのＩＶ注射、続いて２分後に９０μｇのＥＦ１－ルシフェラーゼ－－ＥＦ１－ｈＧＣＳＦをＩＶ注射の後１日目に４匹のマウスのグループから血清を採取した。

図１５に示すように、純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶを中性ＭＬＶとともに同時注射することによって産生された血清ｈＧ－ＣＳＦレベルは、注射後１日で同じマウスで産生されたｈＧ－ＣＳＦレベルと比較して約１００倍低下した（これらの同じマウスの注射後１日目に産生されたｈＧ－ＣＳＦレベルについては図１４参照）。従って、中性リポソームをカチオン性リポソームと同時注射すると、送達される遺伝子のピーク発現及び長期発現の両方を大きく変えることができる。さらに、同時注射された中性リポソーム対カチオン性リポソームの比は、同時注射された中性リポソームが連続的に送達される遺伝子の発現の増加させる程度を決定する。

異なるカチオン性リポソーム製剤、その後の単一のカセット、ＣＰＧ非含有ＥＦ１－ｈＧ－ＣＳＦ ＤＮＡの連続ＩＶ注射後７日目におけるマウス血清ｈＧ－ＣＳＦレベル
８００または１０００ナノモルの純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶまたはＭＬＶカチオン性リポソームのいずれかの連続ＩＶ注射の後７日目に、４匹のマウスのグループから血清を採取した。３つのカチオン性リポソーム製剤のそれぞれの注射の後、２分後に、１００または１２０μｇのいずれかのｍＣＭＶ－ＥＦ１－ｈ－Ｇ－ＣＳＦ、ＣＰＧ非含有単一カセットＤＮＡベクターのＩＶ注射を行った。０．１μｍの押出カチオン性リポソームは、ＭＬＶから、Ｌｉｐｅｘ押出装置中で高アルゴンガス圧下にてサイズ化ポリカーボネート膜を通して逐次押出しにより作製した。

図１６に示されているように、及びナノモルのカチオン性リポソーム対注射されたμｇのＤＮＡの比に部分的に依存して、純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶ及び作製された０．１μｍ押出カチオン性リポソームは、ＭＬＶカチオン性リポソームによって産生されたものと同様に効率的にｈＧ－ＣＳＦの高レベル発現を拡大した。それゆえ、ＳＵＶ及び０．１μｍの押出（オリゴラメラ）カチオン性リポソームは、カチオン性リポソーム、その後ＣＰＧ非含有ＤＮＡの連続注射に用いた時のＭＬＶほどに有効である。

実施例２
長期発現
この実施例では、１グループ当たり５匹のマウスに、ＤＯＴＡＰ ＭＬＶまたはＳＵＶのいずれか８００ｎｍｏｌ、続いてＥＦ１－またはｈＣＭＶ－駆動ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡを含有するＣＰＧ非含有プラスミドベクター９０ｕｇを連続注射した。ヒトＧ－ＣＳＦタンパク質の血清レベルを、注射後に続く４２８日間において、７日または１４日間隔で評価した。ヒトＧ－ＣＳＦレベルのためのマウス血清の取得及び分析は以下のようにして行った。各マウスを麻酔し、顎下静脈を介して採血した。ＢＤからの血清分離管を用いて全血から血清を単離した。ヒトＧ－ＣＳＦレベルは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのヒトＧ－ＣＳＦ ＥＬＩＳＡを用いて、製造業者の仕様書に従って厳密に実施されたＥＬＩＳＡによってｐｇ／ｍｌで測定された。結果は図１７に示されており、ＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソーム、次いでＥＦ１－ｈｕＧ－ＣＳＦプラスミドＤＮＡベクターの単回ＩＶ注射を受けた後、少なくとも４２８日の間、完全免疫応答性マウスにおいてヒトＧ－ＣＳＦタンパク質の治療レベルを超えるレベルが産生されたことを示している。

実施例３
ラットでのタンパク質発現
この実施例では、２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雌ラット＃２２及び２３に、６０００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、その後ＥＦ１駆動ｈＧ－ＣＳＦ ＤＮＡベクターを含有する３００ｕｇのＣＰＧ非含有プラスミドベクターを連続して注射した。注射後７日間隔で、ヒトＧ－ＣＳＦタンパク質、ＷＢＣ及び絶対好中球数（ＡＮＣ）の血清レベルを評価した。血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルは、１日目のみで評価した。すべてがＵＣ
Ｄａｖｉｓ比較病理研究所で評価された。図１８及び下記の表３に示すように、ＥＦ１－ｈｕＧ－ＣＳＦを注射したラットでは、単回ＩＶ注射後少なくとも２２日間、治療レベルを超えるレベルのｈＧ－ＣＳＦタンパク質及び顕著に上昇したＷＢＣ及びＡＮＣが産生された。注射後１日目に測定したＡＬＴ及びＡＳＴは、注射していないラットのバックグラウンド対照レベルに匹敵した。

実施例４
ＤＰＴＡＰリポソーム
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、９００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、またはＤＰＴＡＰ（１，２－ジパルミトイル３－トリメチルアンモニウムプロパン）ＳＵＶリポソームの単回ＩＶ注射を受け、その２分後にｈＧ－ＣＳＦをコードする７０ｕｇのＥＦ－１プラスミドＤＮＡベクターの単回ＩＶ注射を受けた。ｈＧ－ＣＳＦの血清レベルを、注射後２４時間で、ＥＬＩＳＡによって決定した。図１９は、ＨｕＧ－ＣＳＦタンパク質が、ＤＯＴＡＰまたはＤＰＴＡＰで処置されたがＤＭＴＡＰで処置されていないマウスからの血清中に存在することを示している。これらのデータは、複数のカチオン性脂質がインビボでのトランスフェクションを媒介することができ、タンパク質産生のレベルは脂質キャリアの選択によって制御することができることを示している。

実施例５
毒性は４８時間以内に消散する
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。マウスはＣｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓから購入した。各マウスは、示されたようにＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソームの１０００ナノモル、１２００ナノモル、または１４００ナノモルの単回ＩＶ注射を受け、２分後に１００μｇ、１２０μｇまたは１４０μｇの、ルシフェラーゼをコードするＣＰＧ非含有ＥＦ－１駆動プラスミドＤＮＡベクターの単回ＩＶ注射を受けた。注射後２４時間または４８時間に血清を採取した。ＡＬＴ及びＡＳＴ測定は、ＵＣ Ｄａｖｉｓ比較病理研究所でアッセイした。図２０に示すように、連続注射の２４時間後に、ＡＬＴ及びＡＳＴの血清レベルは、すべての脂質その後のＤＮＡグループにおいて２倍から５倍に上昇した。４８時間後、血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルは対照（バックグラウンド）レベルに戻った（偽注射グループによって示される）。これらのデータは、ＡＬＴ／ＡＳＴによって測定された毒性が急性（注射の２４時間以内に存在する）であり、一過性（４８時間で消失）であることを示している。

実施例６
ＤｅｘＰを含むリポソーム
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソームのいずれか９００ナノモルの単回ＩＶ注射を受けたか、または各マウスは、純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソームまたはリポソーム二重層中に組み込まれたパルミテートに共有結合したデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）の示されたモル％を含むリポソームのいずれかの９００ナノモルの単回ＩＶ注射を受けた。リポソーム二重層への５％コレステリルパルミテート（ＣｈｏｌＰ）の組み込みが対照の役目を担う。この２分後に、ｈＧ－ＣＳＦをコードする９０ｕｇのプラスミドＤＮＡの単回ＩＶ注射を行った。ｈＧ－ＣＳＦの血清レベルを、注射後２４時間においてＥＬＩＳＡによって決定し、ＡＬＴ測定をＵＣ Ｄａｖｉｓ比較病理学研究所でアッセイした。図２１に示すように、連続注射後２４時間で、ＡＬＴレベルで測定した毒性は、乳酸加リンゲル液のみ（ＡＬＴ対照）を偽注射した動物で見られる毒性よりも２～３倍高い。リポソーム二重層中に２．５％デキサメタゾンパルミテート（ＤｅｘＰ）を組み込むことにより、ｈＧ－ＣＳＦのピーク発現を増加させ、且つ２４時間でＡＬＴレベルをバックグラウンド（正常）レベルの１．５倍以内に減少させる二重効果を生じた。

実施例７
ＤｅｘＰは毒性を軽減し、発現を増加させる
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、純粋なＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソーム、またはＤＯＴＡＰリポソームのリポソーム二重層に組み込まれたパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含有するリポソームのいずれかの９００ナノモルの単回ＩＶ注射を受けた。この２分後、ｈＧ－ＣＳＦをコードするＥＦ－１駆動プラスミドＤＮＡベクター１３０ｕｇ（高）または４０μｇ（低）のいずれかの単回ＩＶ注射を行った。２つのグループは、１マイクロモルのデキサメタゾンパルミテートのＩＰ注射で、ＩＶ注射の２時間前に処置した。ｈＧ－ＣＳＦの血清レベルを、注射後２４時間のＥＬＩＳＡによって決定し、ＡＬＴ測定を、ＵＣ Ｄａｖｉｓ比較病理研究所により２４時間でアッセイした。図２２に示すように、１３０ｕｇのＤＮＡの連続注射により、２４時間後に４０ｕｇのＤＮＡより顕著に高いｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを産生した。どちらのＤＮＡ用量でも、２．５モル％のデキサメタゾンパルミテートをリポソームに含めることにより、ｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルがさらに増加した。さらに、デキサメタゾンパルミテートをリポソームに組み込むことにより、ＡＬＴレベルは、はるかに高いＤＮＡ用量であっても、バックグラウンド（正常）レベルの１．５倍以内に低下した。

実施例８
Ｄｅｘ注射の前後
この実施例では、１５ｍｇ／ｋｇのトファシチニブまたは４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンをマウスにＩＰ前注射し、２時間後に９００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶ、その後の７０ｕｇのＣＰＧ非含有ＥＦ－１駆動ｈＧ－ＣＳＦプラスミドベクターを連続ＩＶ注射した。トファシチニブまたはデキサメタゾンの別のＩＰ注射を、ＤＮＡの注射の２時間後に行った。図２３に示すように、連続したカチオン性リポソームその後のＤＮＡ注射の前及び後のデキサメタゾンの投与は、共にＨｕＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを顕著に増加させる一方、バックグラウンド（正常）レベルの１．５倍以内に毒性を同時に減少させた。対照的に、免疫抑制剤トファシチニブの前及び後の注射はどちらも減少させなかった。

実施例９
脂質対ＤＮＡ比
この実施例では、グループ当たり３匹のマウスに、ＤＯＴＡＰリポソームのリポソーム二重層中に組み込まれたパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含有するＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソーム（１回の注射当たり１００ｕＬの最終容量の乳酸加リンゲル液（ＬＲ）に懸濁）９００、１０００、１２００または１５００ナノモルのＩＶ注射を行い、その２分後に４０、６０または７５ｕｇのＣＰＧを非含有ＥＦ－１駆動ｈＧ－ＣＳＦプラスミドベクターで１回の注射当たり１００μＬにてＩＶ注射した。偽注射されたマウスは、脂質またはＤＮＡなしのＬＲのみを受けた。２４時間後、ｈＧ－ＣＳＦタンパク質及びＡＬＴの血清レベルをアッセイした。図２４に示すように、ＤＯＴＡＰ ＳＵＶ脂質対プラスミドＤＮＡ（ナノモル脂質：ｍｇＤＮＡ）比が２６：１未満のものを連続注射したマウスのｈＧ－ＣＳＦタンパク質及びＡＬＴレベルは、毒性を防止しながら顕著に高いｈＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを産生した。一方、脂質またはＤＮＡ注射を受けていない対照マウスにおいて、バックグラウンド（正常）レベルに対して１．５倍以内または等しいのいずれかのＡＬＴレベルを産生することが立証された。

実施例１０
リツキシマブ発現
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、純粋なＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム、またはＤＯＴＡＰリポソームのリポソーム二重層に組み込まれたパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含むリポソームのいずれか１０００ナノモルの単回ＩＶ注射を受けた。この２分後、リツキシマブ重鎖及び軽鎖をコードする二重カセット単一プラスミドＤＮＡベクター１００ｕｇ（図３６、４０、及び４１の構築物を参照）の単回ＩＶ注射が行われた。血清リツキシマブレベルは、注射の２４時間後、その後の７日間隔においてＥＬＩＳＡによって決定された。マウスは採血され、Ｇ－ＣＳＦと同様に血清を単離した。Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られたＩｍｍｕｎｏｇｕｉｄｅ ＥＬＩＳＡを用いてリツキシマブレベルを測定し、指示書に従って実施した。図２５に示すように、ＩＰデキサメタゾン前処置＋ＤＯＴＡＰリポソーム中の２．５モル％デキサメタゾンパルミテートの組込みは、注射後少なくとも３週間で血清リツキシマブレベルを５倍以上増加させる。

実施例１１
リツキシマブ発現
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスを注射した。各マウスは、純粋なＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム、またはＤＯＴＡＰリポソームのリポソーム二重層に組み込まれたパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含むリポソームのいずれか１０００ナノモルの単回ＩＶ注射を受けた。この２分後、リツキシマブをコードするＥＦ－１－駆動２重カセット単一プラスミドＤＮＡベクター（図３６、４０、及び４１の構築物を参照）１００ｕｇの単回ＩＶ注射が行われた。１グループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）及び１０００ナノモルの中性脂質（ＮＬ）、ＤＭＰＣのＩＰ注射で処置した。血清リツキシマブレベルの注射マウスを、注射後２４時間及びその後７日間の間隔でＥＬＩＳＡによって測定した。図２６に示すように、すべてのマウスは、１回の注射後に少なくとも１２週間、顕著なレベルの血清リツキシマブタンパク質を産生した。Ｄｅｘ、ＤｅｘＰ及びＮＬの組合せを受けたマウスは、経時的に著しく高い血清リツキシマブレベルを産生した。これらのデータは、２重カセットリツキシマブプラスミドＤＮＡベクターの１回の連続注射により、９０日を超えて、動物において顕著なレベルの血清リツキシマブタンパク質を産生することができることを示している。

実施例１２
２重カセット、単一プラスミドリツキシマブ発現
この実施例では、Ｒａｊｉ細胞（百万個／サンプル）を、ＥＤＴＡ及び０．５％ＢＳＡを含むＦＡＣＳ結合緩衝液中で、マウス血清サンプルまたは組換えリツキシマブ（５０ｎｇ／ｍｌ）と４Ｃで１時間インキュベートした。洗浄後、試料を蛍光標識二次抗体（抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ）と共に３０分間インキュベートして、洗浄し、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを用いて分析した。各試料について、３５００～５０００の事象が記録された。実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。

図２７は、ＦＡＣＳプロットは４つの実験条件について蛍光強度を表示していることを示す。上のパネルは、対照（ＨｕＧ－ＣＳＦ）ＤＮＡプラスミドベクター注射マウスまたは二次抗体単独からのマウス血清を含有するサンプルを示し、これはＰＥチャネルにおいて低いバックグラウンドレベルの蛍光を示す（約３００）。下の２つのパネルは、組換えリツキシマブタンパク質（左パネル）及びリツキシマブプラスミドＤＮＡベクター投与後のマウス血清（右パネル）を示す。両方の試料とも、以下の表４に示すように、バックグラウンドよりも１０倍以上の蛍光強度を示し、マウス血清中に存在するリツキシマブが、組換えリツキシマブタンパク質と同様の程度まで標的ＣＤ２０発現ヒトＲａｊｉ Ｂ細胞に結合することを実証している。従って、二重カセット、単一プラスミドリツキシマブＤＮＡベクターの注射の６週間後のマウス血清中に存在するリツキシマブは、ＣＤ２０＋標的ヒトＢ細胞に完全に機能的に結合する。

実施例１３
機能性リツキシマブを発現する
この実施例では、Ｒａｊｉ細胞（５×１０⁴細胞／ウェル）をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地を用いて９６ウェルプレートに入れた。翌日、細胞をリツキシマブ（１，１０ｕｇ／ｍｌ）またはマウス血清サンプル（２０μｌ／ウェル）と共に室温で１時間インキュベートした。その後、プールされた正常ヒト血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０ｕｌをすべてのウェルに添加し（リツキシマブ対照条件を除く）、プレートを３７℃でさらに１２時間インキュベートした。細胞生存率は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ試薬を製造者の指示書に従って使用して測定した。図２８では、値は、ｈｕＧ－ＣＳＦ ＤＮＡプラスミドＤＮＡベクターを注射したマウス由来の血清が使用された対照条件からの変化率として示す。個々のマウス血清を、血清収集の８～７８日前に、二重カセット単一プラスミドリツキシマブＤＮＡベクターの単一連続注射を受けた５つの異なるマウスのグループから試験した。

この実施例の結果を図２８に示す。２重カセット単一プラスミドリツキシマブＤＮＡベクターを予め注射したマウスの血清を、まずＥＬＩＳＡによって分析して血清リツキシマブ濃度を定量した。その後、これらのリツキシマブ含有血清を細胞溶解アッセイに添加することにより、組換えリツキシマブ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に相当する方法でＣＤ－２０＋ヒトＲａｊｉ Ｂ細胞を溶解することが示された。さらに、実証された溶解活性を有する機能的血清リツキシマブタンパク質を、１１週間にわたって５回の別々の注射実験を通して動物から単離し、その再現性のある溶解効力を経時的に実証した。

実施例１４
リツキシマブの発現増強
この実施例では、１グループ当たり２５０ｇｍのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雌ラット２匹に、最初に４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを前注射し、次いで４４００ｎｍｏｌの中性ＤＭＰＣ脂質を含むまたは含まないリポソーム二重層に組み込んだパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含む４４００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソーム、その後ＥＦ１駆動リツキシマブｃＤＮＡを含む３６０μｇの二重カセット単一プラスミドＤＮＡベクターを連続注射した（図３６、４０、及び４１の構築物を参照）。ヒトリツキシマブタンパク質の血清レベルを、注射後７日間隔で評価した。図２９は、単一ＩＶ注射後少なくとも１５日間、中性脂質も投与されたラットにおいて、著しく高いレベルの血清リツキシマブタンパク質が産生されたことを示している。

実施例１５
コドン最適化リツキシマブ発現
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、ＤＯＴＡＰリポソームのリポソーム二重層に組み込まれたパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含有する１０００ナノモルのリポソームの単回ＩＶ注射を受けた。この２分後、リツキシマブをコードする２重カセット単一プラスミドＥＦ－１駆動ＤＮＡベクター１００ｕｇの単回ＩＶ注射を行った（図３６、４２及び４３の構築物を参照）。番号のついたプラスミド（図３０）は、コドン最適化リツキシマブＤＮＡ配列ではなくオリジナルのＣｐＧ非含有コドン最適化バージョンであった。リツキシマブの血清レベルを、注射の２４時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。図３０は、連続注射後２４時間で、コドン最適化ＤＭＡベクター６が、非コドン最適化リツキシマブＤＮＡベクターよりも著しく高いレベルの血清リツキシマブタンパク質を産生したことを示している。

実施例１６
コドン最適化リツキシマブ発現
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、リポソーム二重層に組み込まれたパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含有するＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム（示されたように９００ナノモルまたは１０５０ナノモル）の単回ＩＶ注射を受けた。この２分後、リツキシマブをコードする二重カセット、コドン最適化単一プラスミドＤＮＡの７５ｕｇの単回ＩＶ注射を行った（図３６、４２及び４３の構築物を参照）。両方のグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。リツキシマブの血清レベルを、注射の２４時間後及びその後の７日間の間隔でのＥＬＩＳＡによって決定した。図３１は、コドン最適化２重カセット単一プラスミドリツキシマブＤＮＡベクターの１回の連続ＩＶ注射により、少なくとも次の６０日間は拡大した血清リツキシマブレベルを産生することを示している。血清リツキシマブレベルは、単回の連続ＩＶ注射後、経時的に上昇する。

実施例１７
バルプロ酸とテオフィリンはタンパク質発現を増加させる
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、ＤＯＴＡＰリポソームのリポソーム二重層に組み込まれたパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含有する１０５０ｎｍｏｌのリポソームの単回ＩＶ注射を受けた。この２分後、リツキシマブをコードする二重カセットプラスミドＤＮＡ７５ｕｇの単回ＩＶ注射が行われた。全てのグループを、ＩＶ注射の２時間前に、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射により処置した。図３２に示す場合、１５ｍｇ／ｋｇのバルプロ酸（ＶＰＡ）、２ｍｇ／ｋｇのＶＰＡ、３０ｍｇ／ｋｇのテオフィリン（Ｔｈｅｏ）または１５ｍｇ／ｋｇのＴｈｅｏのＩＰ注射によっても動物に前処置した。血清リツキシマブレベルは、注射の２４時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。図３２は、薬剤バルプロ酸またはテオフィリンによる前処置によって産生される血清リツキシマブレベルが顕著に増加したため、脂質またはＤＮＡの用量を変えずにタンパク質レベルをさらに高めるための枠組みを提供することを示している。

実施例１８
２重または単一カセットリツキシマブの発現
この実施例では、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンをマウスのＩＰに前注射した。２時間後、これらに、リポソーム二重層に組み込まれたパルミテートに共有結合した２．５モル％のデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）を含む１０５０または１５００ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ
ＳＵＶリポソーム、続いて６０μｇまたは７５μｇのプラスミドＤＮＡを連続的に注射した。注射されたプラスミドＤＮＡ構築物は、２Ａ自己切断ペプチドＤＮＡ配列によって分離されたリツキシマブ重鎖及び軽鎖の配列を含有する、コドン最適化二重カセット単一プラスミドＤＮＡベクター（図３６、４２及び４３の構築物を参照）、またはコドン最適化単一カセットプラスミド（図３６、３７及び３９の構築物を参照）のいずれかであった。血清リツキシマブレベルは、注射の２４時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。図３３は、連続注射後２４時間で、リツキシマブをコードする単一のカセットベクターを含有する２Ａペプチドを受けたマウスは、４００ｎｇ／ｍｌに近い血清レベルを産生し、これは二重カセットベクターによって産生されるレベルの約３分の１に当たることを示している。従って、顕著なリツキシマブ血清レベルは、二重または単一カセットの２Ａペプチド含有ＤＮＡベクターのいずれかによって産生され得る。

実施例１９
脂質対ＤＮＡ比及びリツキシマブ発現
この実施例では、グループ当たり３匹のマウスに、乳酸加リンゲル液（ＬＲ）に注射当たり１００ｕＬの最終容量で懸濁された、リポソーム二重層に組み込まれたパルミテートに共有結合したデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）２．５モル％を含有するＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソームの９００、１０５０、１２００、１５００または１６５０ｎｍｏｌをＩＶ注射し、その２分後にＣＰＧを含まない二重カセット単一プラスミドリツキシマブベクター７５ｕｇを注射当たり１００μＬでＩＶ注射した。偽注射されたマウスは、脂質またはＤＮＡなしでのみＬＲを受けた。２４時間後、リツキシマブタンパク質及びＡＬＴの血清レベルをアッセイした。図３４は、ＤＯＴＡＰ ＳＵＶ脂質対プラスミドＤＮＡ（ナノモル脂質：ｍｇＤＮＡ）比が１５：１未満のものを連続的に注射されたマウスのリツキシマブタンパク質及びＡＬＴレベルが、脂質もＤＮＡも注射されていないコントロールマウスのバックグラウンド（正常）ＡＬＴレベルの１．５倍以内の血清ＡＬＴレベルを産生しながら著しく高いリツキシマブタンパク質レベルを産生した。

実施例２０
バルプロ酸またはテオフィリンによる第ＩＸ因子の発現
この実施例では、１グループ当たり３匹のマウスに注射した。各マウスは、リポソーム二重層中に組み込まれたパルミテートに共有結合したデキサメタゾン（ＤｅｘＰ）２．５モル％を含有する１５００ナノモルのＤＯＴＡＰ ＳＵＶリポソームの単回ＩＶ注射を受けた。この２分後、ヒト第ＩＸ因子のｃＤＮＡをコードするコドン最適化ＥＦ－１駆動単一カセットＤＮＡベクター（図３８及び４４の構築物を参照）の６０ｕｇの単回ＩＶ注射を行った。ＩＶ注射の２時間前に、全てのグループを、４０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ注射で処置した。示されている場合、動物は、２ｍｇ／ｋｇのバルプロ酸（ＶＰＡ）または３０ｍｇ／ｋｇのテオフィリン（テオ）のＩＰ注射によっても前処置された。血清ヒト第ＩＸ因子レベルを、注射後２４時間でＥＬＩＳＡによって決定した。各マウスはＧ－ＣＳＦと同様に採血した。血液を、凝固を防ぐためにＥＤＴＡカリウムまたはクエン酸ナトリウムを含むチューブに採取し、遠心分離して血漿を得た。ヒト第ＩＸ因子に特異的なＡｓｓａｙＰｒｏ ＥＬＩＳＡを製造者の指示書に従って使用し、第ＩＸ因子発現を測定した。図３５は、２４時間で産生された血清ヒト第ＩＸ因子レベルが、ヒト第ＩＸ因子ＤＮＡベクターを受け、加えてバルプロ酸またはテオフィリンのいずれかを用いた前処置を受けたマウスにおいて、著しく高いことを示している。

実施例２１
リポソームのサイズ決定
この実施例では、種々のリポソームのサイズを決定した。特に、表５のリポソームを５％ｗ／ｗのグルコースで調製し、そのサイズを、準弾性レーザ光散乱を用いて決定した。これらのＤＯＴＡＰリポソームのＺ－平均粒径を表５に示す。

本出願において言及された全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本発明の記載された方法及び組成物の様々な改変及び変形が当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求される本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されるべきである。実際、当該関連分野の当業者には自明である、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内にあると意図されている。

Claims (1)

1. 対象において第１の治療用タンパク質及び／または生物学的に活性な核酸分子を発現させる方法であって、
   ａ）第１の組成物を対象に投与し、
   前記対象は、疾患または病態の少なくとも１つの症状を有するか、または少なくとも変化する生理学的形質を有し、
   前記第１の組成物は第１の量のポリカチオン性構造体を含み、
   前記第１の組成物は核酸分子を含んでいないか、実質的に含んでおらず、
   ｂ）前記第１の組成物を投与して約３００分以内に前記対象に第２の組成物を投与し、
   前記第２の組成物は、治療有効量の発現ベクターを含み、
   前記発現ベクターはＣｐＧ非含有またはＣｐＧが減少されており、
   前記発現ベクターは、それぞれ、ｉ）第１の治療用タンパク質及び／またはｉｉ）第１の生物学的に活性な核酸分子をコードする第１の核酸配列を含み、
   前記第１の量のポリカチオン性構造体と前記治療有効量の発現ベクターとの比が５：１～２５：１であり、
   前記第１の組成物の投与及び前記第２の組成物の投与の結果として、前記第１の治療用タンパク質及び／または前記生物学的に活性な核酸分子は、前記疾患または病態に関して治療レベルで、または前記生理学的または疾患形質を変化させるのに十分な有効レベルで、対象において発現されることを含む、前記方法。

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