JP2024500158A - １，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ｄｏｔａｐ）脂質ナノ粒子による組織特異的核酸送達 - Google Patents

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Abstract

本開示は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を有する核酸－脂質粒子に関する。前記核酸－脂質粒子は、結合したカーゴを肺および様々な肺組織ならびにそのような粒子が直接注射される組織に優先的に局在化および送達する。本開示は、任意選択で治療剤（例えば、治療用ｍＲＮＡおよび／または核酸コントローラー系）に結合するそのような脂質粒子を含む組成物、ならびに本明細書で提供される脂質粒子組成物を使用して、脂質粒子結合治療剤を送達するため、および／または対象において疾患もしくは障害、例えば、肺疾患もしくは障害を処置するための方法およびキットを提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１８日に出願された「Ｔｉｓｓｕｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｂｙ １，２－Ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－Ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ） Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」と題する米国仮特許出願第６３／１２７，８１２号に関連し、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下でこの仮出願に基づく優先権を主張する。上記特許出願の内容全体が、参照により本明細書に援用する。
本発明の技術分野
本開示は、核酸ベースの治療を施すのに有用な脂質ベースの組成物および方法に関する。特に、本開示は、対象の肺組織を含む、対象の組織における疾患および障害を治療するための１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）脂質組成物に関する。
世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、肺疾患が世界における死亡および障害の主な原因であると報告する。肺疾患および他の呼吸障害（例えば、新生児呼吸窮迫症候群）は、１歳未満の乳児における主要な死因の１つを構成する。毎年、約６５００万人が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）単独に罹患しており、３００万人がそれによって死亡している（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｎｅｗｓｒｏｏｍ／ｆａｃｔ－ｓｈｅｅｔｓ／ｄｅｔａｉｌ／ｃｈｒｏｎｉｃ－ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ－ｐｕｌｍｏｎａｒｙ－ｄｉｓｅａｓｅ－（ｃｏｐｄ））。これらの状態に対していくつかの治療が存在するが、それらは決して完全に回復させるものではなく、患者に著しく危害を加えることなく疾患を効果的に治療する治療剤を開発することが依然として医学分野における主要な課題となっている。
核酸治療は、個々の標的遺伝子のレベルで疾患の治療に非常に大きな可能性を提供する。しかし、安全かつ有効な送達システムは、核酸治療の完全な見込みを実現するために必須である。全ての器官および組織への核酸治療薬の非特異的送達は、しばしば、オフサイト（非標的化および／またはオフターゲット）効果および毒性をもたらし得る。特定の作用が望ましい目的の器官または組織への核酸治療剤の優先的な送達は、薬物送達および特に核酸ベースの薬剤の送達のための継続的な目標である。身体の他の部分を害することなく疾患の原因のみを標的とする概念は、１２０年前にＥｈｒｌｉｃｈによって記載された。しかしながら、リガンドベースの標的化戦略（後者は能動的標的化とも呼ばれる）を導入することなく特定の組織を標的化することができるナノ粒子送達系の選択肢は、依然として事実上存在しない。したがって、当該技術分野において、（リガンドベースの能動的標的化戦略によるのではなく）そのような送達モダリティの構造的構成要素のみに基づいて核酸カーゴの器官特異的送達を達成することができる送達モダリティに対する以前に満たされていない必要性が存在する。特に、肺は遺伝子治療に関する重要な標的器官であるので、核酸カーゴを肺に選択的に送達することができるそのような送達様式も当技術分野において特に必要とされている。
本開示は、少なくとも部分的に、リガンドベースの標的化戦略を必要とせずに、カーゴ部分（例えば、核酸カーゴ）を対象の肺および肺組織に特異的に標的化することができる脂質ベースのナノ粒子組成物および製剤の同定に基づく。周知の第四級アミノ脂質であるＤＯＴＡＰは、本開示の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の構造成分であり、全身投与または局所投与すると、ＬＮＰ中にさらなる活性標的化成分を必要とすることなく、ベクターの指向性を肺に特異的にシフトさせることが本明細書において顕著に同定されている。本開示は、ＤＯＴＡＰが肺組織に対して有する驚くべき構造親和性を示し、これは、全身投与（例えば、静脈内（ＩＶ）注射による）の際に、例えば、治療用ｍＲＮＡの発現を含む核酸カーゴの有効な送達のために利用することができる。本開示の蛍光標識ＤＯＴＡＰ ＬＮＰは、総ＬＮＰの最大２５～４０％のレベルで肝臓に蓄積することが本明細書で同定されたが、ＬＮＰ媒介カーゴｍＲＮＡ（活性）の有意に優先的な発現が、肝臓および調べた他の全ての組織と比較して、肺で観察された。このような観察された効果は、試験したＬＮＰ製剤の表面電荷の大きさとは無関係であった。肺組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）評価もまた、本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ ＬＮＰを使用して、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞およびマクロファージにおけるカーゴｍＲＮＡの送達および発現の成功を実証した。さらに、肺送達ＤＯＴＡＰベースのＬＮＰは、製剤中にＰＥＧを含まずに有利に調製することができることも本明細書において特定された。理論に束縛されることを望むものではないが、ＤＯＴＡＰの高い正電荷は、立体安定化を必要とせずに静電安定化を介して本開示の粒子を安定化させるのに十分であると思われる。本明細書に開示される特定の高活性脂質粒子製剤からＰＥＧを排除する能力は、本開示の粒子の別の注目すべきかつ驚くべき特徴である。実際、理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＥＧ非含有組成物の使用は、ＬＮＰの表面上のＰＥＧ分子に対して活性化する対象の免疫系によって引き起こされる十分に実証された現象である、ＰＥＧ含有ＬＮＰについて以前に記載された血中クリアランス促進（ＡＢＣ）効果を低減するか、さらには完全に回避することができると考えられる。ＡＢＣは、反復投与時の体循環からのナノ粒子のクリアランスに関与する。したがって、本開示により、本開示のＬＮＰが組み込まれ、安定化脂質としてＤＯＴＡＰを使用するので、反復全身投与に対して特定の利点を提供する核酸－脂質粒子が有意にもたらされる。
一態様では、本開示は、核酸カーゴを対象の肺組織に送達するための核酸－脂質粒子であって、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％の濃度で含む核酸－脂質粒子を提供する。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の０．０１～２％の濃度で存在する粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧは、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有する。任意選択で、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートはＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートである。任意選択で、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含む。任意選択で、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃグリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）である。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０ｍｏｌ％、または核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．５ｍｏｌ％の濃度でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。
一部の実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まない。任意選択で、核酸－脂質粒子はＰＥＧを含まない。任意選択で、核酸－脂質粒子は、複数回投与療法の構成要素である。
一実施形態では、核酸－脂質粒子は、脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％の濃度で１つまたは複数の非カチオン性脂質を含む。任意選択で、１つまたは複数の非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体を含む。
関連する実施形態では、核酸－脂質粒子は、以下の濃度範囲のうちの１つでコレステロールまたはその誘導体を含む：核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の１０ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％；核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の３５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％；および核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の６０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質を含む。任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の５ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％で存在する。任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％で存在する。任意選択で、コレステロールまたはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および／またはβ－シトステロールを含む。任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。
実施形態では、核酸カーゴは、合成もしくは天然に存在するＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの誘導体を含む。任意選択で、核酸カーゴは修飾ＲＮＡである。任意選択で、修飾ＲＮＡは、修飾ｍＲＮＡ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは修飾ｓｉＲＮＡである。任意選択で、修飾ｍＲＮＡは、核酸調節コントローラーをコードする。
ある実施形態では、核酸カーゴは、以下の修飾：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、５’－メトキシ修飾ヌクレオチド（例えば、５’－メトキシウリジン）、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基；ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、ならびに／またはヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’もしくは２’－５’から５’－２’に連結されている逆極性を有するものを含むヌクレオシド間結合または骨格のうちの、１つまたは複数を含む。
実施形態では、肺組織は、上皮、内皮、間質結合組織、血管、造血組織、リンパ系組織および胸膜のうちの１つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～４９ｍｏｌ％でＤＯＴＡＰを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％または約４５ｍｏｌ％でＤＯＴＡＰを含む。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％または約７５ｍｏｌ％でＤＯＴＡＰを含む。
本開示の別の態様は、本開示の核酸－脂質粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
実施形態では、医薬組成物は、非経口投与のために製剤化される。任意選択で、医薬組成物は静脈内注射用に製剤化される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は吸入用に製剤化される。
別の実施形態では、医薬組成物は、肺組織への直接注射のために製剤化される。
ある実施形態では、本開示の核酸－脂質粒子または医薬組成物の対象への静脈内投与は、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における核酸カーゴの発現よりも少なくとも２倍高いレベルでの、対象の肺組織の細胞における核酸カーゴの発現をもたらす。任意選択で、対象の肺組織の細胞における核酸カーゴの発現は、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における核酸カーゴの発現よりも少なくとも３倍高い。任意選択で、対象の肺組織の細胞における核酸カーゴの発現は、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における核酸カーゴの発現よりも少なくとも４倍高い。任意選択で、対象の肺組織の細胞における核酸カーゴの発現は、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における核酸カーゴの発現よりも少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも１１倍高い、少なくとも１２倍高い、少なくとも１３倍高い、少なくとも１４倍高い、少なくとも１５倍高い、または少なくとも２０倍高い。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸－脂質粒子または医薬組成物の対象への静脈内投与は、対象の心臓、脾臓、卵巣および膵臓のうちの１つ以上における核酸－脂質粒子の濃度よりも少なくとも２倍高い濃度で、対象の肺組織への核酸－脂質粒子の局在化をもたらす。任意選択で、対象の心臓、脾臓、卵巣および膵臓のうちの１つ以上と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも６倍高い濃度の核酸－脂質粒子が肺に局在する。
実施形態では、核酸－脂質粒子または医薬組成物は、肺疾患または肺障害を治療するために投与される。任意選択で、疾患または障害は、肺癌、肺炎、肺線維症、ＣＯＰＤ、ぜんそく、気管支拡張、サルコイドーシス、肺高血圧、肺気腫、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アスペルギルス症、細気管支炎、気管支炎、塵肺、コロナウイルス、中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群、嚢胞性繊維症、レジオネラ症、インフルエンザ、百日咳、肺塞栓症、および結核のうちの１つまたは複数である。
本開示のさらなる態様は、核酸カーゴを対象の組織に送達するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）非含有脂質－核酸粒子であって、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子を提供する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子は、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％で１つまたは複数の非カチオン性脂質を含む。任意選択で、粒子の非カチオン性脂質成分は、コレステロールまたはその誘導体を含む。
ある実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、以下の濃度範囲のうちの１つで粒子中に含まれる：粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、粒子中に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、および粒子中に存在する総脂質の約６０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％。
一実施形態では、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子は、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質を含む。任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％で含まれる。任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％で含まれる。関連する実施形態では、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、以下の１つ以上である：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびβ－シトステロール。任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。
実施形態では、対象の組織は、肺、関節、表皮、真皮、内皮、および血液組織のうちの１つまたは複数の組織である。
ある実施形態では、本開示の粒子は、非経口投与される。任意選択で、粒子は、以下の：吸入、局所適用および注射のうちの１つまたは複数を介して投与される。前記注射剤は、静脈注射、気管内注射または点滴、関節内注射、皮下注射、皮内注射及び筋肉注射のうちの１つまたは複数の経路であってもよい。
いくつかの実施形態では、粒子（特に、ＰＥＧ非含有核酸－脂質粒子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）について通常生じる肝臓媒介性血中クリアランス促進（ＡＢＣ）を防止または減少させるそのようなＰＥＧを含まない粒子の傾向を考慮して）は、複数回投与療法の構成要素である。
本開示の別の態様は、本開示のＰＥＧ非含有核酸－脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
実施形態では、医薬組成物は、対象の組織への直接注射のために製剤化される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、以下の組織：肺、関節、表皮、真皮、内皮および血液組織のうちの１つまたは複数の組織に投与される。
特定の実施形態では、医薬組成物は、以下の：肺疾患または肺障害、関節疾患または関節障害、炎症性疾患または炎症性障害、および表皮疾患または表皮障害の１つまたは複数を処置または予防するために対象に投与される。
任意選択で、肺疾患または肺障害は、以下の：肺がん、肺炎、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、気管支拡張症、サルコイドーシス、肺高血圧、肺気腫、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アスペルギルス症、細気管支炎、気管支炎、塵肺、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群、嚢胞性繊維症、在郷軍人病、インフルエンザ、百日咳、肺塞栓症および結核のうちの１つまたは複数の疾患または障害である。
任意選択で、関節疾患または関節障害は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群および変形性関節症のうちの１つまたは複数の疾患または障害である。
任意選択で、炎症性疾患または炎症性障害は、以下の：炎症腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、悪液質、膵臓炎、外傷性ショック（ｔｒａｕｍａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｈｏｃｋ）、気管支ぜんそく、アレルギー鼻炎、嚢胞性繊維症、急性気管支炎、急性激烈気管支炎、骨関節症、リウマチ性関節炎、感染性関節炎、感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、関節炎、骨関節症、痛風、脊椎関節症、強直性脊椎炎、血管炎症候群に関連する関節炎、結節性多発性動脈炎（ｎｏｄｕｌａｒ ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｅｒｖｏｓａ）、過敏性血管炎、ルゲニック（ｒｕｇｅｎｉｃ）肉芽腫症、リウマチ性ポリポーシス筋痛症、関節炎細胞性動脈炎、多嚢胞性カルシウム関節炎、苛性痛風、非関節炎性リウマチ、滑液包炎、枯草熱、化膿性炎症（例えば、テニス肘）、神経因性関節病、関節血症（ｈｅｍａｒｔｈｒｏｓｉｃ）、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、多痔核、脊柱側弯症、ヘモクロマトーシス、高リポタンパク質血症、低ガンマグロブリン症、ＣＯＰＤ、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、気管支肺異形成、および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）のうち１つまたは複数の疾患または障害である。
任意選択で、表皮の疾患または障害は、乾せん、アトピー皮膚炎、硬皮症、湿疹、しゅさ、脂漏性皮膚炎、メラノーマ、日光性角化症、魚鱗癬、グローバー病、尋常性疣贅、ケラトアカントーマおよび脂漏性角化症のうちの１つまたは複数の疾患または障害である。
本開示のさらなる態様は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約４５ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を有し、約３のＮ／Ｐ比を有する核酸－脂質粒子を提供する。
本開示の別の態様は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約４５ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を有し、約６のＮ／Ｐ比を有する核酸－脂質粒子を提供する。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まない。任意選択で、核酸－脂質粒子はＰＥＧを含まない。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約１．０％で含まれる、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートであるか、またはそれを含む。任意選択で、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧは、約５５０ダルトン～約３０００ダルトンの平均分子量を有する。任意選択で、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートはＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートである。任意選択で、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含む。任意選択で、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）である。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０ｍｏｌ％の濃度でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約２．０％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧは、約５５０ダルトン～約３０００ダルトンの平均分子量を有する。任意選択で、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートはＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートである。任意選択で、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含む。任意選択で、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）である。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約２．０ｍｏｌ％の濃度でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。
本開示のさらなる態様は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％のコレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質、および核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３８ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を有する、核酸－脂質粒子を提供する。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まない。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３９．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約２である。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３９．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約３である。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約０．５％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約０．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３９．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約３である。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約１．０％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３８．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約３である。代替の関連する実施形態では、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３８．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約２である。
実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約１．５％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３８．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約４である。
本開示の別の態様は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％のコレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質、および核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６３ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を有する、核酸－脂質粒子を提供する。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まず、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６４．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約３である。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約０．５％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約０．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６４．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約４である。
実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約１．０％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６３．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約４である。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約１．５％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６３．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約２である。
本開示のさらなる態様は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約７５ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質、および核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を有する、核酸－脂質粒子を提供する。
ある実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まず、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１４．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約４である。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約０．５％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約０．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１４．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約２である。
実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約１．０％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１３．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約２である。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、存在する総脂質の約１．５％で粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。任意選択で、核酸－脂質粒子は、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１３．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含む。任意選択で、核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比は約３である。
ある実施形態では、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、以下の：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびβ－シトステロールのうち１つまたは複数を含む。任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。
本開示の別の態様は、本開示の核酸－脂質粒子、医薬組成物またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子を含む注入物を提供する。
本開示のさらなる態様は、核酸カーゴを対象の肺組織に送達するための方法であって、本開示の核酸－脂質粒子、医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子または注入物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本開示のさらなる態様は、対象における疾患または障害を治療または予防するための方法であって、本開示の核酸－脂質粒子、医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子または注入物を対象に投与することを含む方法を提供する。
実施形態では、核酸－脂質粒子、医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子または注入物は静脈内投与され、対象の肺組織の細胞における核酸カーゴの発現は、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および／または腎臓の細胞における核酸カーゴの発現よりも少なくとも２倍高いレベルで生じる。任意選択で、対象の肺組織の細胞における核酸カーゴの発現は、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における核酸カーゴの発現よりも、少なくとも３倍高い、任意選択で少なくとも４倍高い、任意選択で少なくとも５倍高い、任意選択で少なくとも６倍高い、任意選択で少なくとも７倍高い、任意選択で少なくとも８倍高い、任意選択で少なくとも９倍高い、任意選択で少なくとも１０倍高い、任意選択で少なくとも１１倍高い、任意選択で少なくとも１２倍高い、任意選択で少なくとも１３倍高い、任意選択で少なくとも１４倍高い、任意選択で少なくとも１５倍高い、任意選択で少なくとも２０倍高い。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子、医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子または注入物は静脈内投与され、核酸－脂質粒子またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子は、対象の肺組織に、対象の以下の他の組織：心臓、脾臓、卵巣および膵臓のうちの１つまたは複数の組織における核酸－脂質粒子またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子の濃度よりも少なくとも２倍高い濃度で局在する。任意選択で、対象の以下の他の組織：心臓、脾臓、卵巣および膵臓のうちの１つまたは複数の組織における核酸－脂質粒子またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子の濃度と比較して、少なくとも３倍、任意選択で少なくとも４倍、任意選択で少なくとも５倍、任意選択で少なくとも６倍高い濃度の核酸－脂質粒子またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子が肺に存在する。
定義
具体的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内であると理解される。「約」は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解され得る。
ある実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る値の範囲を指す。
文脈から明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、用語「約」によって修飾される。
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれに限定されず、水に不溶性であるが多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。それらは通常、少なくとも３つのクラスに分類される：（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
本明細書中で使用される場合、用語「カチオン性脂質」は、選択されたｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ）で正味の正電荷を保有する多数の脂質種のいずれかをいう。カチオン性脂質は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖およびｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基）を有する脂質およびその塩を含む。カチオン性脂質は、典型的には、カチオン性脂質のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電し）、ｐＫａを超えるｐＨで実質的に中性である。本明細書の記載のカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質とも称され得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）頭部基；各アルキル鎖が独立して０～３個（例えば、０、１、２、または３個）の二重結合を有するＣ１８アルキル鎖；および頭部基とアルキル鎖との間のエーテル、エステル、またはケタール結合を含む。このようなカチオン性脂質としては、ＤＯＴＡＰ、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬeｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－ケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２およびＣ２Ｋとしても知られる）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（γ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（γ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル-3-ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ）（ＭＣ２としても知られる）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ）（ＭＣ３としても知られる）および３－（ジリノレイルメトキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂ１１としても知られる）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ＤＯＴＡＰ」は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、または１８：１ＴＡＰ、二本鎖、またはジェミニ型カチオン性脂質を指す。
ＤＯＴＡＰは、その四次構造に起因して、ｐＨに依存しないカチオン荷電脂質である。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび他の負に荷電した分子のリポソームトランスフェクションのために市販されている。本開示のいくつかの態様では、ＤＯＴＡＰ脂質またはその変形は、核酸を肺に特異的に送達するための脂質ナノ粒子において使用される。他の態様では、ＤＯＴＡＰ脂質またはその変形は、関節、炎症部位、表皮、および真皮に核酸を送達するための脂質ナノ粒子において使用される。ＤＯＴＡＰ（Ｃ４２Ｈ８０ＮＯ４ ＋）の構造を以下に示す。
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の中性脂質、ならびに任意のアニオン性脂質を指す。「中性脂質」は、選択されたｐＨで非荷電形態または中性双性イオン形態のいずれかで存在する多数の脂質種のいずれかを指す。生理学的ｐＨにおいて、このような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールが挙げられる。「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨで負に荷電している任意の脂質を指す。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示で使用される非カチオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、および／または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。実施形態では、非カチオン性脂質は、コレステロール（ＣＨＥ）および／またはβ－シトステロールである。
本明細書で使用される「脂質ナノ粒子」という用語は、ナノスケール粒子の異なるタイプの組成物を指し、脂質を含む粒子は、細胞膜および生物学的障壁を横切る担体として機能し、ヒトおよび他の生物の標的細胞および組織に化合物を送達する。本明細書で使用される場合、本開示の「脂質ナノ粒子」は、追加の脂質および他の成分をさらに含み得る。他の脂質は、脂質酸化を防止するため、またはリガンドを脂質ナノ粒子表面に付着させるためなどの様々な目的のために含まれ得る。両親媒性、中性、カチオン性、およびアニオン性脂質を含む、いくつかの脂質のいずれかが、本開示の脂質ナノ粒子中に存在し得る。このような脂質は、単独でまたは組み合わせて使用され得、そして二重層安定化成分（例えば、ポリアミドオリゴマー（例えば、米国特許第６、３２０，０１７号を参照のこと）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体（例えば、ホスファチジルエタノールアミンに結合されたＰＥＧおよびセラミドに結合体化されたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）））もまた含み得る。
本明細書で使用される場合、粒子の凝集を阻害する「ＰＥＧ」コンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質コンジュゲート、およびそれらの混合物のうちの１つまたは複数を指す。一態様では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド、およびそれらの混合物のうちの１つまたは複数である。一態様では、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（Ｃ１８）のうちの１つまたは複数である。一態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、およびＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ－ＤＭＧ）および／または１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ－ＤＳＧ）である。
用語「Ｎ／Ｐ比」は、本明細書中で使用される場合、カチオン性アミノ脂質と核酸の負に荷電したリン酸基との間の（Ｎ）窒素対（Ｐ）リン酸比を指す。
本明細書で使用される「多分散指数」または「ＰＤＩ」は、サイズに基づく試料の不均一性の尺度である。多分散性は、試料中のサイズ分布、または単離もしくは分析中の試料の集塊もしくは凝集によって生じ得る。
本明細書で使用するとき、「ゼータ電位」または「表面電荷」は、分散液中の隣接する同様に帯電した粒子間の静電反発の程度を指す。十分に小さい分子および粒子については、高いゼータ電位が安定性を与える、すなわち、溶液または分散液が凝集に抵抗する。
本明細書で使用される場合、核酸「カーゴ」という用語は、細胞または組織への送達のための意図される治療用核酸である。
本明細書で使用される場合、「核酸－脂質ナノ粒子」という用語は、１つまたは複数の治療用核酸カーゴを組織に送達するために、１つまたは複数の核酸と会合するか、または１つまたは複数の核酸を封入する上記のような脂質ナノ粒子を指す。
本明細書で使用される場合、「封入された」とは、完全な封入、部分的な封入、イオン力もしくはファンデルワールス力による会合、または前述の全てを核酸に提供する核酸－脂質ナノ粒子製剤化を指すことができる。好ましい実施形態では、核酸は、核酸－脂質ナノ粒子中に完全に封入される。
本明細書中で使用される場合、「核酸」とは、合成もしくは天然に存在するＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの誘導体をいう。一実施形態では、本開示のカーゴおよび／または薬剤は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸である。一実施形態では、核酸または核酸カーゴは、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドである。例えば、二本鎖ＤＮＡは、構造遺伝子、調節領域および終結領域を含む遺伝子、またはウイルスＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡなどの自己複製系であり得る。二本鎖ＲＮＡは、例えば、ｄｓＲＮＡまたは別のＲＮＡ干渉試薬であり得る。一本鎖核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、または三重鎖形成オリゴヌクレオチドであり得る。ある実施形態では、核酸または核酸カーゴは、修飾ＲＮＡを含んでもよく、修飾ＲＮＡは、修飾ｍＲＮＡ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび修飾ｓｉＲＮＡのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、本開示の核酸カーゴは、核酸調節コントローラーをコードする修飾ｍＲＮＡを含むか、またはそれである。
本明細書中で使用される場合、用語「修飾核酸」とは、任意の非天然核酸を指し、これには、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、５’－メトキシ修飾ヌクレオチド（例えば、５’－メトキシウリジン）、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基；ヌクレオシド間結合または骨格（ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合アナログ、ならびに反転した極性を有するもの（ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に連結される）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「核酸調節コントローラー」とは、タンパク質コントローラー成分をコードするｍＲＮＡをいうが、「核酸調節コントローラー」への言及はまた、ｍＲＮＡ発現タンパク質コントローラー成分自体をいい得る。ある実施形態では、ｍＲＮＡコードタンパク質コントローラー成分は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、または１つもしくは複数のエピジェネティック制御因子もしくはヌクレアーゼ（エピジェネティック制御因子またはヌクレアーゼは、一般に、エフェクター、エフェクタードメイン、またはエフェクター部分と呼ばれる）と会合している（および任意選択で連結されている）他の形態のＤＮＡもしくはＲＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤまたはＲＢＤ）を含む。理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載の核酸調節コントローラーの利点は、（１）核酸調節コントローラーをコードするｍＲＮＡが発現される場合、（２）ＺＦＰまたは他の核酸結合ドメインの核酸結合が起こる場合、および（３）その関連するエフェクタードメインが活性を発揮することができる場合（すなわち、エフェクタードメインがエピゲノム状態を変化させることができる場合（例えば、エピゲノムコントローラーの場合））が同時に重なった状態においてのみ、耐久性のある遺伝子プログラミングを提供することである。
本明細書で使用される場合、「エフェクター部分」または「エフェクタードメイン」という用語は、細胞内の適切な部位、例えば、細胞の核内に局在化された場合に標的遺伝子の発現を変化させることができるドメインを指す。いくつかの実施形態では、エフェクター部分は、転写機構の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を動員する。いくつかの態様において、エフェクター部分は、転写因子または発現抑制因子の成分の動員を阻害する。いくつかの実施形態では、エフェクター部分は、エピジェネティック修飾部分を含む（例えば、標的ＤＮＡ配列をエピジェネティックに修飾する）。エフェクター部分の具体例としては、とりわけ、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン（ＫＲＡＢは、真核生物クルッペル型Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）の約３分の１のＮ末端部分に見出される約７５アミノ酸のドメインである）および操作された原核生物ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＭＱ１に結合することができるエフェクターが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「エピジェネティック修飾部分」は、エピジェネティック修飾部分が（例えば、標的化部分によって）核酸に適切に局在化される場合に、ｉ）クロマチンの構造、例えば、二次元構造；および／またはｉｉ）エピジェネティックマーカー（例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンＳＵＭＯ化、ヒストンリン酸化、およびＲＮＡ関連サイレンシングのうちの１つまたは複数）を変化させるドメインを指す。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、１つまたは複数のエピジェネティックマーカーに影響を及ぼす（例えば、そのレベルを増加または減少させる）酵素、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、またはそれらのいずれかの機能的断片を含む。
本明細書で使用される場合、用語「発現制御配列」は、遺伝子の転写を増加または減少させる核酸配列を指し、プロモーターおよびエンハンサーを含む（が、これらに限定されない）。「増強配列」は、発現制御配列のサブタイプを指し、遺伝子転写の可能性を増加させる。「サイレンシングまたはリプレッサー配列」は、発現制御配列のサブタイプを指し、遺伝子転写の可能性を減少させる。
本明細書中で使用される場合、用語「発現リプレッサー」とは、細胞における標的遺伝子の発現を減少させ、そしてＤＮＡ配列（例えば、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列または標的遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント）に特異的に結合する、１つまたは複数の機能性を有する薬剤または実体を指す。特定の実施形態では、発現リプレッサーは、少なくとも１つの標的化部分および任意選択で、１つのエフェクター部分を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「標的化部分」は、ゲノム配列エレメント（例えば、発現制御配列またはアンカー配列；プロモーター、エンハンサーまたはＣＴＣＦ部位）を特異的に標的化する（例えば、結合する）薬剤または実体を意味する。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、標的遺伝子（例えば、ＭＹＣ）の近位にあり、かつ／またはそれに作動可能に連結されている。
本明細書で使用される場合、「肺組織」は、上皮、内皮、間質結合組織、血管、造血組織、リンパ系組織、および胸膜を含む群を含むがこれらに限定されない、肺の器官内の任意の細胞を指し得る。好ましい実施形態では、核酸－脂質ナノ粒子は肺組織を標的とする。一部の他の実施形態では、核酸－脂質ナノ粒子は、脳、神経、皮膚、眼、咽頭、喉頭、心臓、血管、造血（例えば、白血球または赤血球）、乳房、肝臓、膵臓、脾臓、食道、胆嚢、胃、腸、結腸、腎臓、膀胱、卵巣、子宮、子宮頸部、前立腺、筋肉、骨、甲状腺、副甲状腺、副腎、および下垂体の細胞または組織を含むが、これらに限定されない他の細胞または組織を標的とし得る。
本明細書で使用される場合、「局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）」は、生物および／または組織内の、本開示の脂質粒子の脂質、ペプチド、または他の成分の位置を指す。いくつかの実施形態では、局在化は、個々の細胞において検出可能であり得る。一部の実施形態では、局在化を検出するために標識、例えば、蛍光標識、任意選択で蛍光標識された脂質、任意選択でＣｙ７を使用することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の標識は、量子ドット、または誘導ラマン散乱によって検出可能な脂質であってもよい。他の実施形態では、標識は、分野で公知の任意のフルオロフォア（すなわち、紫外スペクトル、可視スペクトル、または赤外スペクトルにおける励起および発光を有する）である。一部の実施形態では、局在化は、免疫組織化学または免疫蛍光によって検出されるか、またはさらに確証される。
本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、本開示の成分または組成物によって媒介される任意の検出可能な効果を指す。実施形態では、本明細書で使用される「活性」は、例えば本開示の本脂質粒子のカーゴの、測定可能な（直接的かまたは代理により）効果を指し得る。活性の例としては、限定されないが、核酸カーゴ（例えば、ｍＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ＲＮＡｉ剤、核酸調節コントローラー等）の細胞内の発現とその結果生じる効果が挙げられ、、これらは任意選択で、細胞、組織、器官および／または生物レベルで測定され得る。
本明細書で使用される場合、「血中クリアランスの促進」または「ＡＢＣ」は、ＬＮＰの表面上のＰＥＧ分子に対する免疫系の活性化によって引き起こされる、十分に実証された現象を指す。ＡＢＣは、反復投与時の体循環からのナノ粒子のクリアランスに関与する。一部の実施形態では、本開示の脂質粒子は、ＰＥＧ非含有の製剤を用いることによって、脂質粒子の血液クリアランスの促進を回避または低減し得、これはまた、そのような脂質粒子の改善された（例えば、毒性がより低いおよび／またはより有効な）反復全身投与も提供することができる。本明細書で使用される場合、「複数回投与」は、治療レジメンの一部として対象に投与される脂質ナノ粒子製剤の２回以上の投与を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「肺疾患または肺障害」は、これらに限定されないが、以下から選択される疾患または障害：肺癌、肺炎、肺線維症、ＣＯＰＤ、ぜんそく、気管支拡張症、サルコイドーシス、肺高血圧、肺気腫、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アスペルギルス症、細気管支炎、気管支炎、塵肺、コロナウイルス、中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群、嚢胞性繊維症、レジオネラ症、インフルエンザ、百日咳、肺塞栓症、および結核、を含み得る。
本明細書で使用される場合、「関節疾患または関節障害」としては、これらに限定されないが、以下から選択される疾患または障害：関節リウマチ、乾癬性関節炎、痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群、および変形性関節症、を含み得る。
本明細書で使用される場合、「炎症性疾患または炎症性障害」は、これらに限定されないが、以下から選択される疾患または障害：炎症性腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、悪液質、膵臓炎、外傷性ショック、気管支ぜんそく、アレルギー鼻炎、嚢胞性繊維症、急性気管支炎、急性激烈気管支炎、骨関節症、リウマチ性関節炎、感染性関節炎、感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、関節炎、骨関節症、痛風、脊椎関節症、強直性脊椎炎、血管炎症候群に関連する関節炎、結節性多発性動脈炎（ｎｏｄｕｌａｒ ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｅｒｖｏｓａ）、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性ポリポーシス筋痛症、関節炎細胞性動脈炎、カルシウム多嚢胞性関節症、苛性痛風、非関節炎性リウマチ、滑液包炎、枯草熱、化膿性炎症（例えば、テニス肘）、神経障害性関節病、関節血症、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、多痔核、脊柱側弯症、ヘモクロマトーシス、高リポ蛋白血症、低ガンマグロブリン症、ＣＯＰＤ、急性呼吸促迫症候群、急性肺損傷、気管支肺異形成および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、を含み得る。
本明細書で使用使用される場合、「表皮の疾患または障害」としては、これらに限定されないが、以下から選択される疾患または障害：乾癬、アトピー皮膚炎、硬皮症、湿疹、しゅさ、脂漏性皮膚炎、メラノーマ、日光性角化症、魚鱗癬、グローバー病、尋常性疣贅、ケラトアカントーマおよび脂漏性角化症、が挙げられ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、ヒトおよび哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、およびウマ）を含む。多くの実施形態では、対象は哺乳動物、特に霊長類、とりわけヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ブタなどの家畜；ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの家禽；ならびに家畜化動物、特にイヌおよびネコなどのペットである。いくつかの実施形態では（例えば、特に研究状況において）、対象哺乳動物は、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、または近交系ブタなどのブタなどである。
本明細書で使用使用される場合、対象への「投与」は、任意選択で、静脈内注射、吸入、静脈内、動脈内、気管内、局所のための非経口投与を含み得るか、または組織への直接注射を含み得る。
用語「治療すること」という用語は、疾患（例えば、癌、例えば、腫瘍形成、成長および／または転移を含む）の症状、合併症または生化学的徴候の発症を予防または遅延させるための組成物の投与を含み、症状の緩和、または疾患、状態もしくは障害のさらなる進行の停止もしくは阻害を含む。治療は、予防的（疾患の発症を予防もしくは遅延させるため、またはその臨床的もしくは準臨床的症状の発現を予防するため）または疾患の発現後の症状の治療的抑制もしくは緩和であり得る。
本明細書で使用使用される場合、「医薬組成物」は、薬理学的に有効な量の脂質粒子、任意選択で、核酸脂質ナノ粒子（ＮＬＮＰ）および薬学的に受容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬理学的に有効な量」、「治療上有効な量」または単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療上のまたは予防上の結果を生じるのに有効な核酸の量を指す。例えば、所与の臨床治療が、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータの少なくとも２５％の減少がある場合に有効であると考えられる場合、その疾患または障害の治療のための薬物の治療上有効な量は、そのパラメータの少なくとも２５％の減少を誘導するのに必要な量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤の投与のための担体を指す。このような担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、包括的であると理解される。特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数または複数であると理解される。
範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」の使用によって近似値として表される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解される。さらに、範囲のそれぞれの終点は、他の終点に関連して、および他の終点から独立しての両方で有意であることが理解される。本明細書に開示される多くの値が存在すること、および各値はまた、その値自体に加えて「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。本出願全体を通して、データはいくつかの異なる形式で提供され、このデータは終点および始点ならびにデータ点の任意の組合せの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示されている場合、１０および１５より大きい、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、ならびに１０および１５の間が開示されているとみなされることが理解される。２つの特定の単位の間の各単位も開示されることも理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、任意の数、数の組み合わせ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの部分範囲、ならびに例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、および１．９などの前述の整数の間の全ての介在１０進値を含むと理解される。部分範囲に関しては、範囲のいずれかの端点から延びる「ネストされた部分範囲」が具体的に企図される。例えば、１～５０の例示的な範囲のネストされたサブ範囲は、１つの方向において１～１０、１～２０、１～３０、および１～４０、または他の方向において５０～４０、５０～３０、５０～２０、および５０～１０を含み得る。
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙ）」と同義である移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。対照的に、移行句「からなる」は、特許請求の範囲に明記されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。移行句「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、特許請求される発明の特定の材料またはステップ「および基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。
以下に記載され、特許請求の範囲に列挙される実施形態は、上記の定義を考慮して理解することができる。
本開示の他の特徴および利点は、その好ましい実施形態の以下の説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に引用される全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される他の全ての公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図しない。
以下の詳細な説明は、例として与えられるが、本開示を説明される特定の実施形態のみに限定することを意図するものではなく、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。
図１Ａおよび１Ｂは、ＤＯＴＡＰ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）がレポーターｍＲＮＡカーゴを送達し、インビトロで低い毒性を示したことを示す。図１Ａは、示されたカーゴｍＲＮＡ ｍＦｌｕｃ（ルシフェラーゼ）濃度範囲にわたる、マウス細胞株（Ｈｅｐａ１－６）において試験された４つのＤＯＴＡＰ ＬＮＰ製剤の観察されたルシフェラーゼ酵素活性を示す。注目すべきことに、ルシフェラーゼ活性のおよそ６００倍の増加が、０．６２５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＧ非含有製剤（０％ＰＥＧ）で達成された。カーゴｍＲＮＡ活性の用量依存性が、試験された全てのＬＮＰ製剤について観察され、ｍＦｌｕｃ（ルシフェラーゼ）カーゴの送達および発現のレベルが次第に増加することも、試験されたＰＥＧ含有ＬＮＰ製剤について観察された。図１Ｂは、Ｈｅｐａ１－６細胞生存率に対する試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの高濃度の効果を示し、ＰＥＧ非含有のＤＯＴＡＰ ＬＮＰについては強い生存率が観察され、試験したＰＥＧ含有ＮＰ：６ＰＥＧ：１ ＬＮＰ製剤の濃度を増加させた場合にはわずかに減少した生存率しか観察されなかった。 図２Ａ～２Ｆは、カーゴとしてレポーターｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰを静脈内投与した場合に、ＤＯＴＡＰ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が処置マウスの肺に強固に局在し、ｍＲＮＡカーゴを発現したことを示す。図２Ａは、２つの異なる試験したＤＯＴＡＰ ＬＮＰ、ＮＰ：３ＰＥＧ：０およびＮＰ：３ＰＥＧ：１（表１にも示される）が、マウス肺において濃縮されたルシフェラーゼ活性を示し、観察された効果が２４時間持続したことを示す。図２Ｂは、処置マウスから採取した主要器官に対してエクスビボで行った発光および蛍光イメージングの結果を示す。Ｃｙ７シグナル分布はＬＮＰ生体内分布を示し、一方、発光シグナルはレポーターｍＲＮＡカーゴ発現および活性を示す。注目すべきことに、肺のカーゴｍＲＮＡ発現レベルは、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが多くの組織によく分布していた場合であっても、特に強かった。図２Ｃは、採取したマウス器官において観察されたＣｙ７－ＤＯＰＥ脂質発光生体内分布シグナルの定量化を示す。図２Ｄは、マウス器官におけるｍＦｌｕｃ ｍＲＮＡの発現からの発光シグナルの定量化を示し、特に、器官内のルシフェラーゼ活性の観察されたパーセント分布が示され、パーセント値は、全ての器官に由来する全合計シグナルを使用し、次いで、合計値に対応する各個別器官についてのパーセントシグナルを計算することによって計算される。肺に対するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの強い特異性（活性の＞９０％が肺に局在した）が、それによって実証された。図２Ｅは、肺から収集されたシグナルを直接活性の代表的な読み取り値として表すために、肺におけるルシフェラーゼ活性値を平均放射輝度として示す。注目すべきことに、０％ＰＥＧを有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰは、肺において、１％ＰＥＧを有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰよりも約５０倍高いｍＲＮＡ発現（ルシフェラーゼ活性）を示した。図２Ｆは、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが静脈内注射を介してマウスに投与された場合に有意な体重変化を引き起こさなかったことを示す。図２Ｇは、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ投与後のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）についての肝機能検査が、ＰＢＳ対照処置動物と比較して有意な上昇を示さなかったことを実証する。 図３Ａ～３Ｇは、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの肺選択的局在化および関連するｍＲＮＡカーゴ発現が、試験した全てのＰＥＧ－脂質化学を有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰについて観察されたことを示す。図３Ａは、ＰＥＧ－脂質タイプとは無関係に、ｍＲＮＡカーゴ指向性ルシフェラーゼ活性が、２４、４８および７２時間の時点で注射された対象マウスの肺において優先的に生じたことを示す。ＰＥＧ－ＤＳＧおよびＰＥＧ－ＤＭＧ製剤の両方が、ＬＮＰの広い分布を示し、腎臓がＬＮＰ蓄積の主要な器官であった。これらの結果は、腎臓がＬＮＰの主な排出経路であることを支持した。下部では、肺を生物発光放射輝度のエクスビボ評価から除去し、特定の器官からの高いシグナルが他の器官からのより低いが依然として有意なシグナルをマスクし得るので、残りの器官を再イメージングして、ルシフェラーゼ放射輝度のより高いシグナル対バックグラウンド比を得た。図３Ｂは、Ｃｙ７脂質イメージング結果の定量化を示し、これは、腎臓がＬＮＰ蓄積のための主要器官であることを実証した（腎臓において有意なｍＲＮＡカーゴ発現が観察されなかったとしても）。図３Ｃは、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰのＰＥＧ－ＤＳＧ製剤およびＰＥＧ－ＤＭＧ製剤の両方についてのｍＲＮＡレポーターｍＦｌｕｃ発光の定量化を示し、これは、両方の製剤について、すべての時点にわたって、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ送達媒介性ｍＲＮＡカーゴ発現が肺においてほぼ１００％起こったことを実証した。図３Ｄは、ＰＥＧ－ＤＳＧまたはＰＥＧ－ＤＭＧ脂質のいずれかによるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ投与後に有意な体重変化が観察されなかったことを示す。図３Ｅは、肝機能の試験としてのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が、投与後（２４、４８、および７２時間の時点）、両方のＰＥＧ－脂質ＤＯＴＡＰ ＬＮＰ製剤について安定なままであったことを示す。図３Ｆは、肝臓機能の試験としてのアスパラギン酸トランスアミナーゼトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もまた、投与後（２４、４８、および７２時間の時点）、両方のＰＥＧ－脂質ＤＯＴＡＰ ＬＮＰ製剤について安定なままであったことを示す。同様に、図３Ｇは、肝臓機能の試験としてのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が、投与後（２４、４８、および７２時間の時点）、両方のＰＥＧ－脂質ＤＯＴＡＰ ＬＮＰ製剤について安定なままであったことを示す。 図４Ａ～４Ｃは、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、Ｃｒｅ ｍＲＮＡレポーター系を核酸カーゴとして細胞に送達するのに成功したことを示す。図４Ａは、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰとＨＥＫ２９３－ｌｏｘＰ－ＧＦＰ－ＲＦＰ細胞株との用量依存的な細胞会合を示す。この細胞株はＧＦＰシグナルを安定に発現したが、細胞中でＣｒｅリコンビナーゼが発現すると、ｌｏｘＰ組換えにより、細胞はＧＦＰの代わりにＲＦＰを発現し始めた。図４Ｂは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡレポーター系を有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰでＨＥＫ２９３－ｌｏｘＰ－ＧＦＰ－ＲＦＰ細胞株を処理した後、トランスフェクトされた細胞がＧＦＰの代わりにＲＦＰを発現したことを実証する画像を示す。図４Ｃは、ｍＣｒｅ活性がフローサイトメトリーによっても確認されたことを示し、これは細胞におけるＧＦＰシグナルの減少を実証した。 図５Ａおよび５Ｂは、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰがインビボで肺ゲノムを標的とする核酸カーゴを送達および発現したことを示す。図５Ａは、投与後４８時間および７２時間のエクスビボでの器官イメージング結果を示す。両方の時点でのエクスビボイメージングは、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、粒子分布（Ｃｙ７）にかかわらず、肺特異的活性（ｔｄＴｏｍａｔｏ）を示すことを実証した。図５Ｂは、画像化研究からのシグナル定量化を要約する。グラフに示されるように、肝臓と肺との間のＬＮＰのほぼ等しい分布（Ｃｙ７放射輝度）にもかかわらず、ｍＣｒｅ活性（ｔｄＴｏｍａｔｏ放射輝度、ｍＣｒｅ発現を反映する）は、肺においてのみ観察された（１匹の動物外れ値を除く）。 図６Ａ～６Ｃは、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、炎症肺組織を含む肺組織中の全ての細胞型に形質導入されたことを示す。図６Ａは、未処置動物、ＭＣ３ ＬＮＰ処置動物およびＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ処置動物を比較した、Ａｉｌ４マウス（健常マウス）から採取した心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓および脾臓において観察されたｔｄＴｏｍａｔｏシグナルを示す。１％ＰＥＧ－ＤＭＧを有するｍＣｒｅ ｍＲＮＡカーゴ担持ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰで静脈内処置されたＡｉ１４動物由来の肺は、頑強な肺特異的ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を示し、次いで、免疫組織化学法（ＩＨＣ）で評価して、異なる細胞集団におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現レベルを評価した。図６Ｂは、健康なＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ投与動物の肺におけるｔｄＴｏｍａｔｏの組織染色を示す。肺のマクロファージ、上皮、および内皮細胞は全て、カーゴｍＲＮＡで目に見えて形質導入され、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰがＩＶ投与後に前駆細胞および上皮細胞の両方を形質導入したことが実証された。図６Ｃは、炎症肺を有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ投与マウス（ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス）についての免疫組織化学染色組織切片を示し、それぞれ（左から右へ）ｔｄＴｏｍａｔｏ免疫組織化学（送達のマーカーとしてのＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ送達ｍＣｒｅ ｍＲＮＡ発現）、マウスＣＤ４５によるｔｄＴｏｍａｔｏの二重免疫組織化学（上皮、肺胞細胞およびＣＤ４５＋細胞（単球、好中球）を矢印で示す）、ヒトＣＤ４５によるｔｄＴｏｍａｔｏの二重免疫組織化学（上皮、肺胞細胞およびＣＤ４５＋細胞（単球、好中球）を矢印で示す）、ヒトＣＤ６８によるｔｄＴｏｍａｔｏの二重免疫組織化学（マクロファージおよび肺胞細胞を矢印で示す）、および好中球エラスターゼによるｔｄＴｏｍａｔｏの二重免疫組織化学（マクロファージおよび好中球を矢印で示す）を示す。 図７Ａ～７Ｅは、異なるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ製剤が肺への改善された核酸カーゴ送達を示したことを示す。図７Ａは、本開示の３４５０製剤および４７５０製剤の両方が肺においてのみ活性を示したことを示す。両方の製剤は、ＰＥＧを含まない（０ｍｏｌ％のＰＥＧ）。下の概要に示されるように、３４５０製剤は４５ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰを有し、４７５０製剤は７５ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰを有する。図７Ｂは、試験したマウスの肺、肝臓、心臓、および脾臓において観察された平均ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルレベルが、試験した２つの製剤間で有意に異ならなかったことを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏシグナル産生は用量依存的ではなく、常時オンまたはオフとして記載することができる。図７Ｃは、肺、肝臓、心臓、および脾臓において見出される各マウスにおけるｔｄＴｏｍａｔｏシグナルのパーセンテージを示し、両方の製剤について、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現のほぼ１００％が肺においてであったことを実証する。図７Ｄは、３４５０および４７５０製剤を投与したマウスの肺、肝臓、心臓、および脾臓における平均Ｃｙ７（ＬＮＰ局在化）シグナルを示す。図７Ｅは、３４５０および４７５０製剤を投与されたマウスの肺、肝臓、心臓、および脾臓におけるＣｙ７放射輝度（ＬＮＰ局在化）の平均パーセント分布を示す。注目すべきことに、４７５０製剤は、３４５０製剤よりも高いレベルのＬＮＰを肺組織に送達した。 図８は、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、膝への核酸カーゴの効率的な局所細胞内送達のために関節内注射を介して投与することもできることを示す。処置されたマウスおよびラットの膝におけるｍＦｌｕｃおよびｍＣｒｅレポーター系の活性が示されており、これは、局所組織領域に注射されたＤＯＴＡＰ－ＬＮＰによって送達されたｍＲＮＡカーゴレポーター系の発現および組込みの成功を実証した。 図９Ａおよび９Ｂは、カーゴを担持したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの気管内投与も、核酸カーゴの肺組織への送達の成功をもたらしたことを示す。図９Ａは、肺へのＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの局所送達が、気管内（局所）点滴注入を介して投与された場合に健康な（Ａ１４野生型）マウスにおいて観察されたことを示す。投与の６、２４、および４８時間後の時間依存的イメージングは、ｍＣｒｅ担持ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの局所投与が、投与の６時間後という早い時期に、処置対象の肺および気管においてカーゴ核酸発現媒介性効果を示し始めたことを示した。さらに、処置した対象の脾臓または肝臓においてオフターゲット効果は観察されなかった。図９Ｂは、ｍＣｒｅ ｍＲＮＡカーゴが担持されたＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが気管内（局所）点滴注入を介して、投与後６時間という早い時期であっても、重要な細胞型にアクセスしたことを示す免疫組織化学染色肺組織切片を示す。これらの肺組織切片において、マクロファージ、内皮細胞および上皮細胞を矢印で示す。これらの結果は、ＰＥＧ非含有ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、例えば気道関連細胞活性を必要とする臨床症例において、核酸カーゴの肺への局所投与にも首尾よく使用され得ることを実証した。
本開示は、少なくとも部分的に、対象の細胞への脂質粒子関連分子カーゴの送達のための、脂質粒子組成物、製剤および関連する方法を提供する。ある特定の態様では、関連する核酸カーゴを対象の肺に優先的に局在化させて送達する核酸脂質ナノ粒子が提供され、送達は、対象の肺内の様々なタイプの組織に対して生じる。周知の第四級アミノ脂質であるＤＯＴＡＰは、本明細書に開示される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の構造成分であり、これは、理論に束縛されることを望むものではないが、全身投与または局所投与すると、本開示のＬＮＰにおけるさらなる活性標的化成分を必要とすることなく、本明細書に開示されるＬＮＰベクターの指向性を肺に特異的にシフトさせるようである。全身投与（ＩＶ）時の核酸カーゴの有効な送達、特に様々なレポーターｍＲＮＡの発現の媒介における肺組織に対するＤＯＴＡＰの驚くべき構造親和性も本明細書において実証される。
本開示の蛍光標識ＤＯＴＡＰ ＬＮＰは、総ＬＮＰの最大２５～４０％で、注射された対象の肺だけでなく肝臓にも蓄積することが観察されたが、ｍＲＮＡカーゴのタンパク質への翻訳（したがって、細胞内活性）は、本明細書に開示される試験されたＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの表面電荷の大きさに依存しないと同定された様式で、肺組織においてのみ観察された。肺組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）評価はまた、本開示のＤＯＴＡＰ ＬＮＰを使用して、肺組織内のｍＲＮＡカーゴの内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞およびマクロファージ細胞送達を実証した。さらに、脂質製剤からＰＥＧを完全に排除しながら、本開示の有効なＤＯＴＡＰベースのＬＮＰを調製することができ、これは、ＬＮＰ封入治療薬に特定のインビボでの利点を提供する。理論に束縛されることを望むものではないが、ＤＯＴＡＰの高い正電荷は、立体安定化を必要とせずに静電安定化を介して粒子を安定化させるのに十分である可能性が高いと特定された。製剤中のＰＥＧを回避する能力は、ＰＥＧ非含有組成物の使用が、ＬＮＰの表面上のＰＥＧ分子に対して活性化する身体の免疫系によって引き起こされる十分に実証された現象である血液クリアランス促進（ＡＢＣ）効果を回避するという点で、本開示の脂質粒子の別の注目すべきかつ驚くべき効果である。ＡＢＣは、反復投与時の体循環からのナノ粒子のクリアランスに関与する。したがって、本開示は、ある実施形態では、安定化脂質としてＤＯＴＡＰを使用したＬＮＰの反復全身投与を有意に可能にするか促進する。
核酸療法は、遺伝子レベルで疾患を治療するための周知の非常に大きな可能性を有する。しかし、安全かつ有効な送達系は、核酸治療に必須である。器官および組織への非特異的送達は、しばしば、オフサイト効果および毒性を生じる。脂質ナノ粒子の開発、ならびに一般的な薬物開発において、目的の特定の器官への治療剤の送達が必要であることは周知のことである。身体の他の部分を害することなく疾患の原因のみを標的とする概念は、１２０年前にＥｈｒｌｉｃｈによって記載された。しかしながら、現存する方法は、さらなるリガンドベースの標的化ストラテジーを導入することなく、特定の組織を標的化するナノ粒子を開発するための規定されたまたは周知の方法論を提供しない。したがって、ここで本明細書に開示されるように、組織に対する脂質の構造的親和性に基づく脂質ナノ粒子の器官特異的標的化は、オフサイト効果および毒性の低減に関して十分に確立された必要性を満たす。
肺は、遺伝子治療の重要な標的器官の１つである。他の器官における活性を回避することによる肺への特異的送達は、呼吸器系関連疾患を効果的に治療するために不可欠である。本開示は、周知の第四級アミノ脂質であるＤＯＴＡＰの組み込みが、ＬＮＰにおける活性標的化成分を必要とすることなく、ベクターの向性を肺に特異的にシフトさせることを実証する。
ＬＮＰのＰＥＧ化は、増加した粒子安定性（インビトロ及びインビボの両方で）を付与すると考えられる。しかしながら、本開示は、核酸カーゴの細胞内送達および活性に完全に有効である、製剤中にＰＥＧを含まずに調製されたＤＯＴＡＰベースのＬＮＰの例示的な組成物を提供する。
ＤＯＴＡＰは、その四級アミノ構造に起因して、それが存在する環境のｐＨに依存しない正に荷電した脂質である。これは、主成分としてＤＯＴＡＰを用いて調製されたＬＮＰの全体的な正電荷に寄与する。現在の技術水準は、肺へのナノ粒子送達が脂質ナノ粒子の高い正の表面電荷に依存することを示しているが、ＰＥＧを導入すると、製剤に応じて、表面電荷を中性またはさらには負のレベル近くまで低減することができる。理論に束縛されるものではないが、ＤＯＴＡＰは、単にＬＮＰの表面電荷への寄与に起因するのではなく、その構造特性に起因して肺組織によって選択的に取り込まれるＬＮＰ成分であると仮定される。
ＤＯＴＡＰ ＬＮＰの粒径および表面電荷は、製剤のＮ／Ｐ（Ｎ対Ｐ）比またはモル組成を修飾することによって微調整することができる。したがって、吸入による局所送達、静脈内または関節内送達を含む複数の適用のために、特定の物理化学的特性を有する広範囲の粒子を調製することができる。同様に、ＤＯＴＡＰは、本開示のＬＮＰにおける核酸封入のための唯一のカチオン性脂質として使用することができる。
脂質ナノ粒子は、ほとんどの血管に存在する連続的な内皮ライニングを横切って血管外遊出することができないので、血液区画内に留まる傾向がある。しかしながら、疾患部位では、血管は漏出性であり得、脂質ナノ粒子の溢出および間質腔への蓄積を可能にする。例えば、腫瘍において、未成熟新生血管系は、適切なサイズの脂質ナノ粒子が血管から出ることを可能にし得る孔または欠陥を示す傾向がある（Ｙｕａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４巻：３３５２～３３５６頁、１９９４年）。同様に、感染または炎症の部位では、内皮透過性バリアが損なわれ得、脂質ナノ粒子がこれらの領域に蓄積することを可能にする。対照的に、ほとんどの正常で健康な組織に存在する血管は、連続的な内皮ライニングを有する傾向がある。したがって、脂質ナノ粒子送達は、これらの領域への薬物曝露を低減することができる。例外は単核食細胞系（ＭＰＳ）のおよび脾臓などの単核食細胞系（ＭＰＳ）の器官である。ＤＯＴＡＰ ＬＮＰは、カーゴを肺組織に選択的に送達することが同定されているが、一部の態様では、本開示のＤＯＴＡＰ ＬＮＰまたはその変形を用いた、関節、炎症部位、または肝臓などの漏出性または有窓性毛細血管の領域への送達も企図される。
本開示の特定の組成物および方法の様々な明示的に企図される成分は、以下でさらに詳細に検討される。
ＤＯＴＡＰベースの脂質ナノ粒子組成物
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、ＤＯＴＡＰ、または１８：１ ＴＡＰは、カチオン性脂質である。ＤＯＴＡＰは、その四次構造に起因して、ｐＨとは無関係にカチオン荷電している。ＤＯＴＡＰ（Ｃ４２Ｈ８０ＮＯ４ ＋）の構造を以下に示す。
本開示の脂質粒子のある実施形態では、および本開示の関連する方法では、本開示の脂質ナノ粒子中に存在する全リン脂質の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％（モル基準）は、ＤＯＴＡＰである。本開示の脂質ナノ粒子および本開示の関連する方法の特定の実施形態では、総脂質の少なくとも約０．１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％（モル基準）がコレステロールである。ある実施形態では、総脂質の少なくとも約０．１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％（モル基準）が、他の非カチオン性脂質、例えば、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＯＰＥである。
任意のサイズの脂質ナノ粒子が、本開示に従って使用され得る。本開示のある実施形態では、脂質ナノ粒子は、直径約０．０２ミクロン～約０．４ミクロン、約０．０５～約０．２ミクロン、または０．０７～０．１２ミクロンの範囲のサイズを有する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）頭部基；各アルキル鎖が独立して０～３個（例えば、０、１、２、または３個）の二重結合を有するＣ１８アルキル鎖；および頭部基とアルキル鎖との間のエーテル、エステル、またはケタール結合を含むものを含むがこれらに限定されない他のカチオン性脂質も含み得る。このようなカチオン性脂質としては、これらに限定されないが、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－ケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２およびＣ２Ｋとしても知られる）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（γ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（γ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（γ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル-3-ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ）（ＭＣ２としても知られる）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ）（ＭＣ３としても知られる）および３－（ジリノレイルメトキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂ１１としても知られる）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールを含んでもよい。他の実施形態では、ＬＮＰは、これに限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基を含む、アニオン性脂質を含み得る。いくつかの態様では、本開示で使用される非カチオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、および／または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。いくつかの態様において、非カチオン性脂質は、コレステロール（ＣＨＥ）および／またはβ－シトステロールである。
ＰＥＧコンジュゲート脂質を用いる一部の実施形態では、ＰＥＧコンジュゲート脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質コンジュゲート、およびそれらの混合物のうちの１つまたは複数である。一態様では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド、およびそれらの混合物のうちの１つまたは複数である。一態様では、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（Ｃ１８）のうちの１つまたは複数である。一態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、およびＰＥＧ－ジ－ステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ－ＤＭＧ）および／または１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ－ＤＳＧ）である。
いくつかの実施形態では、両親媒性脂質は、本開示のＬＮＰに含まれる。両親媒性脂質は、任意の好適な材料を指し得、その脂質材料の疎水性部分が疎水性相に配向すると同時に親水性部分が水相に配向する。このような化合物としては、これに限定されないが、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられる。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ－アシルオキシ酸などの他のリンを欠く化合物も使用し得る。さらに、このような両親媒性脂質は、他の脂質（例えば、トリグリセリドおよびステロール）と容易に混合され得る。
プログラム可能な融合脂質製剤もまた、本開示の脂質粒子に含めるのに好適である。そのような製剤は、細胞膜と融合し、所与のシグナル事象が起こるまでそれらのカーゴを送達する傾向がほとんどない。これにより、生物体または疾患部位への注射後、細胞と融合し始める前に、脂質製剤をより均一に分布させることができる。シグナル事象は、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境、または時間の変化であり得る。後者の場合、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートなどの融合遅延または「覆い隠し（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」成分は、経時的に脂質ナノ粒子膜から簡単に交換し得る。製剤が体内に適切に分配される時までに、融合性になるために十分な覆い隠し剤を失う。他のシグナル事象では、炎症部位での温度上昇など、疾患部位または標的細胞に関連するシグナルを選択することが望ましい。
ある実施形態では、細胞型または組織に特異的である標的化部分をさらに使用して、本開示の脂質ナノ粒子を標的化することが望ましい場合がある。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）およびモノクローナル抗体などの様々な標的化部分を使用する脂質ナノ粒子の標的化は、以前に記載されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照されたい）。標的化部分は、全タンパク質またはそのフラグメントを含み得る。
標的化機構は、一般に、標的部分が標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるような様式で、標的化剤が脂質ナノ粒子の表面上に配置されることを必要とする。種々の異なる標的化剤および標的化方法が、当技術分野で公知であり利用可能であり、例えば、Ｓａｐｒａ，Ｐ．ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，Ｔ Ｍ，Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２（５）：４３９－６２（２００３）；およびＡｂｒａ，Ｒ Ｍら、Ｊ． Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｒｅｓ．１２：１－３，（２００２）等に記載されるものが含まれる。
標的化剤をカップリングするための標準的な方法が使用され得る。例えば、標的化剤の結合のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミン、または脂質誘導体化ブレオマイシン等の誘導体化親油性化合物が使用され得る。抗体－標的化脂質ナノ粒子は、例えば、プロテインＡを組み込む脂質ナノ粒子を使用して構築し得る（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１６３３７～１６３４２頁（１９９０年）およびＬｅｏｎｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８７巻：２４４８～２４５１頁（１９９０年）を参照されたい）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されており、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。標的化部分の例はまた、新生物または腫瘍に関連する抗原を含む、細胞成分に特異的な他のタンパク質を含み得る。標的化部分として使用されるタンパク質は、共有結合を介して脂質ナノ粒子に結合され得る（Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１４９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１１－１１９頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照のこと）。他の標的化方法としては、ビオチン－アビジン系が挙げられる。
脂質ナノ粒子を調製するための様々な方法が当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｚｏｋａら，９：４６７（１９８０）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、第４，９４６，７８７号；ＰＣＴ国際公開第９１／１７４２４号；Ｄｅａｍｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４４３：６２９～６３４頁（１９７６）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６巻：３３４８～３３５２頁（１９７９年）；Ｈｏｐｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８１２：５５～６５頁（１９８５）；Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８５８：１６１～１６８頁（１９８６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４２～２４６頁（１９８８）；Ｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｍａｒｃ Ｊ．Ｏｓｔｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３，Ｃｈａｐｔｅｒ １；Ｈｏｐｅら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．，４０：８９（１９８６）；およびＬｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３）、およびそこに引用されている参考文献等の記載が含まれる。適切な方法としては、これに限定されないが、超音波処理、押出し、高圧／均質化、マイクロ流動化、界面活性剤透析、小脂質ナノ粒子小胞のカルシウム誘導融合、およびエーテル注入法が挙げられ、これらはすべて当技術分野で周知である。
本開示のいくつかの実施形態では、マイクロ流体混合プロセスを使用してＤＯＴＡＰベースのＬＮＰを調製した。簡潔に述べると、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＣＨＥおよびＰＥＧ－ＤＭＧの脂質ストックをエタノール中で２０ｍｇ／ｍｌ濃度で調製した。異なるＮ／Ｐ比（２～６）、ＰＥＧ化（０～２％）、および脂質組成（脂質相互間のモル比）を調べた。全ての製剤において、ＤＯＴＡＰモルパーセントを２０～８０の間で変化させた（ある例示的な一連の製剤において、ＤＯＴＡＰモルパーセントを４５に維持した）。５．８ｍｇ／ｍｌの最終脂質濃度を有するエタノール中の所定の組成物のために、脂質を一緒に混合した。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｍＦｌｕｃ）をｍＲＮＡとして、０．２５～２ｍｇ／ｍｌの濃度で水相中で使用した。２相とＬＮＰ調製物との混合は、スタガ型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ヘリンボーン構造のマイクロ流体チップにて、２：１または３：１の水対有機体積比を用いて、８または１２ｍｌ／分の流量で行った。得られたＬＮＰを、ＰＢＳに対するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による精製および緩衝液交換に供した。あるいは、得られたＬＮＰを、８～３００ｋＤａのＭＷＣＯ範囲を有する膜を使用して、ＰＢＳに対する透析に供した。以下の実施例１の表１は、製剤の特徴付けパラメータを要約する。特徴付けパラメータの正確な制御は、１８８～５１ｎｍのサイズ範囲、０～２６ｍＶの間の表面電荷、および０．２未満のＰＤＩのＤＯＴＡＰ ＬＮＰの調製を可能にした。全ての製剤は、製造業者のプロトコルを使用してＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって計算された９８％を超える封入効率（ＥＥ）を示した。
本明細書に開示される方法および当技術分野で公知の方法に従って調製された脂質ナノ粒子は、ある実施形態では、薬物担持および患者への投与の前にかなりの期間保存することができる。例えば、脂質ナノ粒子は、投与前に、脱水され、貯蔵され、その後、再水和され、１つまたは複数の活性薬剤を担持され得る。脂質ナノ粒子はまた、１つまたは複数の活性薬剤を担持した後に脱水されてもよい。脱水は、当技術分野で利用可能な様々な方法により達成することができ、例えば、米国特許第４，８８０，６３５号、、同第５，５７８，３２０号、同第５，８３７，２７９号、同第５，９２２，３５０号、同第４，８５７，３１９号、同第５，３７６，３８０号、同第５，８１７，３３４号、同第６，３５５，２６７号、および同第６，４７５，５１７号に記載される脱水手順および凍結乾燥手順が挙げられる。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、標準的な凍結乾燥装置を使用して脱水される、すなわち、それらは低圧条件下で脱水される。また、脂質ナノ粒子は、脱水前に、例えば液体窒素中で凍結され得る。糖は、脱水前に、ＬＮＰ環境に、例えば、脂質ナノ粒子を含有する緩衝液に添加することができ、それによって、脱水中の脂質ナノ粒子の完全性を促進する。例えば、米国特許第５，０７７，０５６号または第５，７３６，１５５号を参照されたい。
脂質ナノ粒子は、調製中の、例えばサイジング後またはｐＨ勾配の生成後の、任意の時点（を含む）で、従来法により滅菌され得る。
カーゴ－担持脂質粒子組成物
様々な実施形態では、本開示の脂質粒子は、細胞、組織、器官または対象への活性薬剤の送達を含む、多くの異なる用途に使用され得る。例えば、本開示の脂質ナノ粒子は、血流を介して全身に送達するために、または美容剤を皮膚に送達するために使用され得る。したがって、本開示の脂質ナノ粒子およびカーゴとしての１つまたは複数の活性薬剤は、本開示に含まれる。
脂質粒子カーゴ
本開示は、カーゴとしての活性薬剤と組み合わせた脂質ナノ粒子（すなわち、ＤＯＴＡＰを含む脂質ナノ粒子）を記載する。活性薬剤は、本明細書で使用される場合、細胞、組織、器官、または対象に対して所望の効果を発揮することができる任意の分子または化合物を含む。このような効果は、例えば、生物学的、生理学的、または美容的効果であり得る。活性薬剤は、任意のタイプの分子または化合物であり得、例えば、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、アンチセンスＲＮＡ、例えば、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉剤等の核酸；例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片などの抗体；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体およびＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体、サイトカイン、成長因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそれらのリガンドを含むペプチドおよびポリペプチド；ホルモン；ならびに有機小分子または化合物を含む小分子が挙げられる。
ＬＮＰと会合した、またはＬＮＰによって封入された核酸は、以下の群から選択されるものを含むがこれらに限定されない修飾を含有してもよい：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結した末端ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、５’－メトキシ修飾ヌクレオチド（例えば、５’－メトキシウリジン）、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基；ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に結合している逆極性を有するもの。
特定の実施形態では、活性薬剤は、ｍＲＮＡまたは細胞内でｍＲＮＡを発現することができるベクターである。
実施形態では、活性薬剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。任意選択で、本開示のＬＮＰは、例えば、ガイド鎖（ｇＲＮＡ）及びＣａｓ酵素の両方をカーゴとして含むように製剤化することができ、それによって、標的細胞における遺伝子のＣＲＩＳ ＰＲ媒介性標的化を達成及び制御することができる自己完結型送達ビヒクルが提供される。
特定の特徴的な実施形態では、活性薬剤は、核酸調節コントローラー（例えば、上記のようなタンパク質コントローラー成分をコードするｍＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態では、活性薬剤は、治療剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤誘導体は、それ自体が治療的に活性であってもよく、またはさらなる修飾により活性となるプロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態では、治療剤誘導体は、未修飾薬剤と比較して治療活性の一部または全部を保持するが、別の実施形態では、治療剤誘導体は治療活性を欠く。
種々の実施形態では、治療剤としては、抗炎症性化合物、麻薬、抑制薬、抗うつ薬、刺激薬、幻覚剤、鎮痛剤、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張薬、抗血管新生剤、細胞血管剤、シグナル伝達阻害剤、血管収縮剤、ホルモン、およびステロイドなどの薬剤および薬物が挙げられる。
特定の実施形態形態では、活性薬剤は、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、抗腫瘍薬などとも呼ばれ得る抗腫瘍薬である。本開示に従って使用され得る腫瘍薬の例としては、これに限定されないが、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、ＡｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ＢｉＣＮＵ、ブレオマイシン、静脈内ブスルファン、経口ブスルファン、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドデタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシドおよびＶＰ－１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５－ＦＵ、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ゲムツズマブ－オゾガマイシン、ゴセレリン酢酸塩、ヒドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ、ＣＰＴ－１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミゾール、リトレチノインノレイン（ｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、メガストロール、メルファラン、Ｌ－ＰＡＭ、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトザントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ－５７１、タモキシフェン、タキソテール、テモゾラミド、テニポシド、ＶＭ－２６、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、トレミフェン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、およびビノレルビンが挙げられるが。本開示に従って使用され得る腫瘍学薬物の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシン類似体または誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤およびカンプトテシンである。
本開示のＬＮＰ組成物は、一般に、単一の活性薬剤を含むが、ある実施形態では、２つ以上の活性薬剤を含んでもよい。
本開示の他の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、少なくとも０．５、０．８、１．２、１．５、２．０、４．０、６．０、８．０、または１２時間の血漿循環半減期を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも０．５、０．８、１．２、１．５、２．０、４．０、６．０、８．０、または１２時間の血漿薬物半減期を有する。循環および血液または血漿クリアランス半減期は、例えば、米国特許第２００４－００７１７６８－Ａ１号に記載されているように決定することができる。
本開示はまた、キット形態の脂質ナノ粒子およびその変形を提供する。キットは、既製の製剤または投与前に混合を必要とする製剤を含み得る。キットは、典型的には、キットの様々な要素を保持するために区画化された容器を含む。キットは、本開示の脂質ナノ粒子組成物またはその粒子組成物またはその成分を、それらの再水和および投与のための説明書と共に含有する。特定の実施形態では、キットは、活性薬剤が充填された本開示の脂質ナノ粒子を含有する少なくとも１つの区画を含む。別の実施形態では、キットは少なくとも２つの区画を含み、一方は本開示の脂質ナノ粒子を含有し、他方は活性薬剤を含有する。当然ながら、これらのキットのいずれも、追加の区画、例えば、米国特許公開第２００４－０２２８９０９－Ａ１号に記載されているものなどの緩衝液を含む区画を含み得ることが理解される。ＤＯＴＡＰを含む脂質ナノ粒子を含む本開示のキットは、米国特許出願公開第２００４－０２２８９０９ Ａ１号に記載されているキットの他の特徴も含み得る。さらに、キットは、１つの区画に薬物担持脂質ナノ粒子を含み、第２の区画に空の脂質ナノ粒子を含んでもよい。あるいは、キットは、本開示の脂質ナノ粒子、第２の区画内の本開示の脂質ナノ粒子に充填される活性薬剤、および第３の区画内の空の脂質ナノ粒子を含有してもよい。
特定の実施形態では、本開示のキットは、ＤＯＴＡＰを含む脂質ナノ粒子に封入された治療用化合物を含み、この際、ＤＯＴＡＰは、脂質ナノ粒子中に存在する全リン脂質の少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも７０％（モル基準）を構成し、ならびに空の脂質ナノ粒子を含む。一実施形態では、治療用化合物を含有する脂質ナノ粒子および空の脂質ナノ粒子は、キットの異なる区画に存在する。
脂質粒子媒介カーゴ送達の有効性
ある実施形態では、本開示は、少なくとも部分的に、２５～７５％（ｍｏｌ／重量）のＤＯＴＡＰベースの脂質粒子が、他の組織と比較して、活性核酸カーゴを肺の細胞に送達するのに非常に有効であるという驚くべき結果に基づく。さらに、封入された活性薬剤（カーゴ）、例えばｍＲＮＡのレポーター活性は、他の組織と比較して、肺組織においてほぼ独占的に生じた。脂質粒子の局在化の有効性は、対象の１つまたは複数の他の組織のものと比較した、対象の特定の組織への核酸－脂質粒子の局在化における倍数差（増加または減少）として記載され得る。送達を評価する際のさらなる成分としての活性の有効性は、対象の１つまたは複数の他の組織の細胞において観察される活性と比較した、対象の特定の組織の細胞内の活性薬剤（例えば、核酸カーゴまたは他の化合物）の活性の倍数差（増加または減少）として記載され得る。したがって、いくつかの実施形態では、倍数差は、細胞レベルで検出され得るか、または細胞レベルで生じる事象の適切な代理により検出され得る。いくつかの実施形態では、罹患した肺組織の細胞は、上皮、内皮、間質結合組織、血管、造血組織、リンパ系組織、および胸膜のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、効果／活性の倍数差は、細胞内レベルで、すなわち、活性が標的細胞の核において検出可能である場合に検出され得る。
ＬＮＰの局在化の有効性を決定するために、標識または検出された目的の分子の特徴に従ってアッセイを実施してもよい。本開示の例示的な実施形態では、蛍光標識された脂質が、ＬＮＰの局在化を決定するために使用されている。他の実施形態では、標識されたペプチド、または脂質粒子の他の成分が使用され得る。いくつかの実施形態では、局在化は、個々の細胞において検出可能である。いくつかの態様において、標識は蛍光標識、すなわちＣｙ７などの蛍光標識された脂質である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子の標識は、量子ドット、または誘導ラマン散乱によって検出可能な脂質であってもよい。他の実施形態では、標識は、分野で公知の任意のフルオロフォア（すなわち、紫外スペクトル、可視スペクトル、または赤外スペクトルにおける励起および発光を有する）である。一部の実施形態では、局在化は、免疫組織化学法または免疫蛍光法によって検出されるか、またはさらに確証される。
局在化の有効性は、対象の１つまたは複数の他の組織と比較した、対象の組織、すなわち肺組織への核酸－脂質粒子の局在化における倍数差（増加または減少）として記載され得る。本開示の例示的な実施形態では、Ｃｙ７標識脂質をインビボで画像化し、蛍光放射輝度をＣｙ７－ＬＮＰ濃度の指標として用いた（以下の実施例３を参照）。Ｃｙ７標識ＤＯＴＡＰ核酸ＬＮＰは、他の組織、特に心臓、脾臓、卵巣および膵臓と比較して、肺への局在化の有効性の増加を示した。本開示のいくつかの実施形態では、Ｃｙ７標識核酸ＬＮＰは、心臓、脾臓、卵巣または膵臓と比較して、肺への少なくとも２倍の局在化を示した。いくつかの実施形態では、Ｃｙ７標識核酸ＬＮＰは、心臓、脾臓、卵巣および膵臓のものと比較して、肺への少なくとも３倍の局在化を示し、いくつかの実施形態では、Ｃｙ７標識核酸ＬＮＰは、肺への少なくとも４倍の局在化を示し、いくつかの実施形態では、Ｃｙ７標識核酸ＬＮＰは、肺への少なくとも５倍の局在化を示し、いくつかの実施形態では、Ｃｙ７標識核酸ＬＮＰは、肺への少なくとも６倍の局在化を示した。
ＬＮＰによって封入された活性薬剤の活性の有効性を決定するために、活性薬剤の特性に従ってアッセイを実施してもよい。ある実施形態では、ＤＯＴＡＰ ＬＮＰ中の活性薬剤は核酸である。他の実施形態では、ＤＯＴＡＰ ＬＮＰ中の活性薬剤は、小分子または他の化合物である。
いくつかの実施形態では、ＤＯＴＡＰベースのＬＮＰ中の活性薬剤は、ｍＲＮＡである。例示的な実施形態では、レポーターｍＲＮＡ、すなわちルシフェラーゼの局在化された発現は、活性薬剤／カーゴとしてのｍＲＮＡの細胞内送達有効性の指標として機能した。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｃｒｅ酵素、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または青色蛍光タンパク質をコードし得る。または、治療実施形態では、ｍＲＮＡは、対象のＬＮＰ標的化細胞における治療的細胞内発現のためのタンパク質をコードしてもよく、任意選択で、送達されたｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質の細胞内レベルは、送達される治療的ｍＲＮＡに適切なように、当技術分野で公知の方法によって検出することができる。他の実施形態では、レポーターｍＲＮＡは、Ｌｙｔ２細胞表面マーカーなどの細胞表面マーカーをコードする。さらに他の実施形態では、レポーターは、β－ガラクトシダーゼ、α－ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであり得る。他の実施形態では、レポーターｍＲＮＡは、ネガティブ選択マーカー（例えば、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ＨＲＰＴまたはＡＰＲＴ）をコードする。いくつかの実施形態は、免疫組織化学または免疫蛍光を使用して、レポーターｍＲＮＡの活性を検出または確証する。
特定の実施形態では、カーゴの送達における本開示の脂質粒子の有効性は、脂質粒子標的組織内の細胞内でカーゴ（活性薬剤）について観察される活性のレベルに基づいて評価される。そのような効果は、適切な対照製剤および／または組織と比較した場合の活性の倍数差として同定することができ、例えば、核酸カーゴを有するＬＮＰの送達有効性は、対象の１つまたは複数の他の組織と比較した、対象の標的組織、すなわち肺組織の細胞における核酸カーゴの活性の倍数差（増加または減少）として記載することができる。したがって、特定の核酸カーゴについて、ＬＮＰ製剤の送達有効性は、例えば、非標的組織細胞よりも標的組織細胞において、または核酸カーゴを含まないＬＮＰ製剤と比較して、核酸ペイロードの２倍高い細胞内活性を達成するＬＮＰとして特定することができる。任意選択で、核酸カーゴの送達のための有効なＬＮＰ製剤は、非標的組織細胞においてよりも、または核酸カーゴを含まないＬＮＰ製剤に対し、少なくとも約３倍大きい、任意選択で約４倍大きい、任意選択で約５倍大きい、任意選択で約６倍大きい、任意選択で約７倍大きい、任意選択で約８倍大きい、任意選択で約９倍大きい、任意選択で約１０倍大きい、任意選択で約５０倍大きい、任意選択で約１００倍等大きい核酸ペイロードの細胞内活性を達成するものとして説明することができる。。本開示の例示的な実施形態では、ＤＯＴＡＰ ＬＮＰは、対象の肺組織の細胞において発現されたルシフェラーゼｍＲＮＡを、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞のレベルよりも有意に高いレベルで送達した（以下の実施例３を参照）。ルシフェリンを対象に静脈内送達し、ルシフェラーゼを発現する細胞をインビボ生物発光イメージングによって検出した。いくつかの態様において、ルシフェラーゼｍＲＮＡは、対象の肺組織の細胞において、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞におけるｍＲＮＡの発現よりも少なくとも２倍高いレベルで発現された。いくつかの実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、対象の肺組織の細胞において、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞におけるｍＲＮＡの発現よりも少なくとも３倍高いレベルで発現された。いくつかの態様において、ルシフェラーゼｍＲＮＡは、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓、および腎臓の細胞におけるカーゴｍＲＮＡの発現よりも、肺において少なくとも４倍高く発現され、いくつかの態様において、ルシフェラーゼｍＲＮＡは、肺において少なくとも５倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも６倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも７倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも８倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも９倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも１０倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも１２倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも１３倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも１４倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも１５倍高く、いくつかの態様において、肺において少なくとも２０倍高かった。
他の実施形態では、ＤＯＴＡＰ ＬＮＰは、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）を組織、すなわち肺組織に送達するために使用され得る。ｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤について、送達および活性有効性測定は、例えば、転写レベルを検出するための標的特異的ＰＣＲ、標的タンパク質レベルを検出するための免疫吸着または他の免疫学的方法、および／またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いることができる（Ｔｅｓｔｏｎｉら，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８７：３８２２．）。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、対象の肺組織の細胞において、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞よりも少なくとも２倍高いレベルで活性であり得る。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、対象の肺組織の細胞において、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓、および腎臓の細胞よりも少なくとも３倍高いレベルで活性であり得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞におけるｓｉＲＮＡの活性よりも、肺において少なくとも４倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも５倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも６倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも７倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも８倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも１０倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも１２倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも１３倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも１４倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも１５倍高いレベルで活性であってもよく、いくつかの実施形態では、肺において少なくとも２０倍高いレベルで活性であってもよい。関連する実施形態では、ＲＮＡｉカーゴを肺に優先的に送達するＬＮＰは、例えば、非標的組織の細胞と比較して、またはいくつかの他の適切な対照（例えば、未処理肺組織細胞における標的転写物のレベル）と比較して、標的肺組織の細胞における標的転写物及び／またはタンパク質レベルの２０％超の低減を示し得る。任意選択で、ＲＮＡｉカーゴを肺に優先的に送達するＬＮＰは、例えば、非標的組織の細胞と比較して、またはいくつかの他の適切な対照（例えば、未処置肺組織細胞における標的転写物のレベル）と比較して、標的肺組織の細胞における標的転写物および／またはタンパク質レベルの３０％超の低減、４０％超の低減、５０％超の低減、６０％超の低減、７０％超の低減、８０％超の低減、９０％超の低減、９５％超の低減、９７％超の低減、９７％超の低減、９８％超の低減、または９９％超の低減を示し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＯＴＡＰベースのＬＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を組織、すなわち肺組織に送達するために使用され得る。ＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ９送達及び活性有効性測定は、例えば、Ｃａｓ９を検出するためのＰＣＲ、標的領域のゲノム構造及び／若しくは標的転写レベル、Ｃａｓ９若しくは標的タンパク質のノックイン、ノックアウト若しくは他の修飾を検出するための免疫吸着若しくは他の免疫学的方法、並びに／またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を必要とし得る（Ｔｅｓｔｏｎｉら，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８７：３８２２．）。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ９媒介性効果は、対象の肺組織の細胞において、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞よりも少なくとも２倍高いレベルで同定され得る。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ９媒介性効果は、対象の肺組織の細胞において、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞よりも少なくとも３倍高いレベルで同定され得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ９媒介性効果は、対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および／または腎臓の細胞におけるＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ９媒介性効果よりも、少なくとも７倍高い、いくつかの実施形態では少なくとも８倍高い、いくつかの実施形態では少なくとも９倍高い、いくつかの実施形態では少なくとも１０倍高い、いくつかの実施形態では少なくとも１１倍高い、いくつかの実施形態では少なくとも１３倍高い、いくつかの実施形態では少なくとも１４倍高い、いくつかの実施形態では少なくとも１５倍高い、いくつかの実施形態では少なくとも２０倍高い細胞で同定することができる。
他の実施形態では、ＤＯＴＡＰ ＬＮＰは、ｍＲＮＡまたは他の核酸カーゴを組織、すなわち肺組織に送達することができ、そこで発現およびおそらく活性が核内で生じる。本開示において、いくつかの実施形態は、活性薬剤の核活性のためのレポーターとしてＣｒｅリコンビナーゼ酵素を利用している（以下の実施例６を参照されたい）。Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素は、コードされたタンパク質の核への移行を必要とし、したがって、核移行のレポーターとして働くことができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒する。Ｃｒｅリコンビナーゼ活性が発現すると、ｌｏｘＰ組換えによりレポーター蛍光タンパク質が発現する。一実施形態では、Ａｉ１４マウス系統は、Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６ Ｓｏｒ遺伝子座に挿入された、ＣＡＧプロモーター駆動赤色蛍光タンパク質変異体（ｔｄＴｏｍａｔｏ）の転写を防止する、ＣｒｅレポーターｌｏｘＰ隣接ＳＴＯＰカセットを使用した。Ａｉ１４マウスにｍＣｒｅ担持ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを静脈内注射し、Ｃｒｅ酵素の送達および発現、Ｃｒｅ酵素の核転座、ならびにその後のｔｄＴｏｍａｔｏプロモーターのＣｒｅ媒介性組換えに続いて、肺細胞の核において強いｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を発現し始めた。例示的な実施形態では、活性の有効性、すなわち核において検出可能なｍＲＮＡの発現は、肺細胞の核において、肝臓、心臓、および脾臓における細胞のレベルよりも少なくとも２倍高いレベルで観察可能であった。いくつかの態様において、核において検出可能なｍＲＮＡの発現は、肺細胞の核において、肝臓、心臓、および脾臓における細胞の発現よりも少なくとも３倍高いレベルで観察可能であった。いくつかの態様では、核において検出可能なｍＲＮＡの発現は、肺細胞の核において、肝臓、心臓、および脾臓の細胞における核において検出可能なｍＲＮＡの活性よりも少なくとも４倍高いレベルで観察可能であり、いくつかの態様において、そのレベルは５倍高く、いくつかの態様において６倍高く、いくつかの態様において７倍高く、いくつかの態様において８倍高く、いくつかの態様において９倍高く、いくつかの態様において１０倍高く、いくつかの態様において１１倍高く、いくつかの態様において１２倍高く、いくつかの態様において１３倍高く、いくつかの態様において１４倍高く、いくつかの態様において１５倍高く、いくつかの態様において２０倍高かった。
他の実施形態では、ＤＯＴＡＰ ＬＮＰは、小分子または他の化合物を組織、すなわち肺組織に送達し得る。小分子の局在化または活性の有効性は、いくつかのインビボイメージング法（例えば、ＰＥＴ／ＣＴ）、質量分析、ならびに標的効果の免疫組織化学および免疫蛍光によって決定することができる。一部の実施形態では、肺における小分子のＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ媒介性局在化および／または活性は、他の組織のものより、例えば、心臓、脾臓、卵巣、および膵臓のものより、任意選択で肝臓および／または腎臓のものより２倍高くてもよい。一部の実施形態では、肺における小分子のＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ媒介性局在化および／または活性は、他の組織のものよりも３倍高く、例えば、心臓、脾臓、卵巣、および膵臓のものよりも、任意選択で肝臓および／または腎臓のものよりも４倍高く、５倍高く、６倍高く、７倍高く、８倍高く、９倍高く、１０倍高く、１１倍高く、１２倍高く、１３倍高く、１４倍高く、１５倍高く、または２０倍高くなり得る。
ある実施形態では、肺送達のために製剤化される脂質粒子は、対象の１つまたは複数の他の組織の細胞と比較して、肺細胞へのカーゴの優先的局在化および細胞内送達（直接的または代理による細胞内活性の評価に基づく）を示す脂質粒子を指す。例えば、肺送達のための脂質粒子は、対象の他の組織よりも対象の肺細胞においてカーゴ（例えば、核酸カーゴ、例えば、ｍＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、核酸調節コントローラーなど）の少なくとも２倍高い活性を誘導することができるものである。対象の肺細胞におけるこのような効果は、本明細書中の他の箇所に記載されるように、肺の１つまたは複数の細胞型内で評価され得る。特定の実施形態では、肺送達のための脂質粒子は、対象の胚細胞において、対照の他の組織より少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも１５倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、少なくとも１０００倍等大きいカーゴ（例えば、核酸カーゴ、例えば、ｍＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、核酸調節コントローラーなど）の活性を誘導することができるものである。
さらに他の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質なしで製剤化されたＤＯＴＡＰ ＬＮＰは、免疫系が除去のためにＰＥＧを標的とする血中クリアランス促進効果（ＡＢＣ）を減少または回避することができる。ＤＯＴＡＰは特に、ＰＥＧ化脂質が必要とされないＬＮＰに十分な安定化を提供する（以下の実施例１を参照されたい）。ＡＢＣの回避は、ＬＮＰのその後の用量の効果を増強することによって、ＤＯＴＡＰ ＬＮＰ活性薬剤の活性の有効性を増強する。ＰＥＧ含有製剤と比較した、ＤＯＴＡＰ ＬＮＰによる血液クリアランスの加速の回避の有効性は、ＤＯＴＡＰ ＰＥＧを含まない製剤のＡＢＣを、ＤＯＴＡＰ ＰＥＧを含む製剤のＡＢＣ（０．５～１．５％）と比較して、または同様に他のＰＥＧを含むＬＮＰのＡＢＣと比較して測定することによって決定することができる。ＤＯＴＡＰ ＰＥＧ非含有製剤は、ＰＥＧ含有ＬＮＰ組成物のレベルよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、または少なくとも２０倍高いレベルで、２回目以降の投与時に血液および／または組織中にＬＮＰを保持し得る。
ＬＮＰ媒介カーゴ送達
本明細書に開示される脂質粒子組成物は、活性薬剤または治療剤または化合物の、それを必要とする対象または患者への送達を含む、様々な目的のために使用することができる。対象には、ヒトおよび非ヒト動物の両方が含まれる。特定の実施形態では、対象は哺乳動物である。他の実施形態では、対象は、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはトリを含む、１つまたは複数の特定の種または品種である。
したがって、本開示はまた、様々な疾患および障害の治療方法、ならびに美容上の利益を提供することを意図した方法を提供する。
治療方法
本開示のＬＮＰ組成物は、炎症性疾患、心血管疾患、神経系疾患、腫瘍、脱髄疾患、消化器系疾患、内分泌系疾患、生殖系疾患、血液およびリンパ系疾患、免疫疾患、精神障害、筋骨格疾患、神経疾患、神経筋疾患、代謝疾患、性感染症、皮膚および結合組織疾患、泌尿器疾患、ならびに感染症を含むがこれらに限定されない、多種多様な疾患または障害のいずれかを治療するために使用され得る。
ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、これに限定されないが、以下から選択される疾患または障害：肺癌、肺炎、肺線維症、ＣＯＰＤ、ぜんそく、気管支拡張症、サルコイドーシス、肺高血圧、肺気腫、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アスペルギルス症、細気管支炎、気管支炎、塵肺、コロナウイルス、中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群、嚢胞性繊維症、レジオネラ症、インフルエンザ、百日咳、肺塞栓症、および結核、を含む肺疾患または肺障害を治療または予防するために使用され得る。
他の実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物は、これに限定されないが、以下から選択される疾患または障害：関節リウマチ、乾癬性関節炎、痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群、および変形性関節症、を含む関節疾患または関節障害を治療または予防するために使用され得る。
他の実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物は、これに限定されないが、以下から選択される疾患または障害：炎症性腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、悪液質、膵臓炎、外傷性ショック、気管支ぜんそく、アレルギー鼻炎、嚢胞性繊維症、急性気管支炎、急性激烈気管支炎、骨関節症、リウマチ性関節炎、感染性関節炎、感染性関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、関節炎、骨関節症、痛風、脊椎関節症、強直性脊椎炎、血管炎症候群に関連する関節炎、結節性多発性動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性ポリポーシス筋痛症、非関節炎性リウマチ、滑液包炎、枯草熱、化膿性炎症（例えば、テニス肘）、神経障害性関節病、関節血症、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、多痔核、脊柱側弯症、ヘモクロマトーシス、高リポ蛋白血症、低ガンマグロブリン症、ＣＯＰＤ、急性呼吸促迫症候群、急性肺損傷、気管支肺異形成および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、を含む炎症性疾患または炎症性障害を治療または予防するために使用され得る。
他の実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物は、これらに限定されないが、乾せん、アトピー皮膚炎、硬皮症、湿疹、酒さ、脂漏性皮膚炎、メラノーマ、日光角化症、魚鱗癬、グローバー病、尋常性疣贅、ケラトアカントーマ、および脂漏性角化症を含む表皮の疾患または障害を治療または予防するために使用され得る。
一実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物を使用して、あるタイプの癌を治療または予防するために使用され得る。特に、これらの方法は、リンパ腫、白血病、および骨髄腫を含む血液およびリンパ系の癌に適用され得る。本開示に従って処置され得る特定の癌の例としては、これに限定されないが、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）が挙げられ、これには、ワーキング定式化、ラパポート分類および好ましくはＲＥＡＬ分類などの様々な分類システムのいずれかに従って定義される任意のタイプのＮＨＬが含まれる。このようなリンパ腫としては、低悪性度、中悪性度、および高悪性度リンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の両方が挙げられるが、これらに限定されない。これらのカテゴリーに含まれるのは、様々なタイプの小細胞、大細胞、切断細胞、リンパ球、濾胞、びまん性、バーキットリンパ腫、マントル細胞、ＮＫ細胞、ＣＮＳ、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、成人リンパ芽球性リンパ腫、無痛性リンパ腫、侵襲性リンパ腫、形質転換リンパ腫、および他のタイプのリンパ腫である。本開示の方法は、成人または小児形態のリンパ腫、ならびに任意のステージ、例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのリンパ腫に使用することができる。様々なタイプのリンパ腫が当業者に周知であり、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙによって記載されている（例えば、ｗｗｗ３．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇを参照されたい）。
本明細書中に記載される組成物および方法はまた、任意の形態の白血病（この疾患の成人形態および小児形態を含む）に適用され得る。例えば、疾患の任意の急性、慢性、骨髄性、およびリンパ性形態は、本開示の方法を使用して処置され得る。好ましい実施形態では、本方法は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を治療するために使用される。様々なタイプの白血病についてのさらなる情報は、とりわけ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（例えば、ｗｗｗ．ｌｅｕｋｅｍｉａ．ｏｒｇを参照のこと）から見出され得る。
神経芽細胞腫、骨髄腫、前立腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、脳腫瘍、乳癌などのさらなる種類の腫瘍もまた、本明細書に記載の方法を用いて治療することができる。
本開示のＬＮＰ組成物は、一次治療として、または二次治療として投与されてもよい。さらに、それらは、一次化学療法処置として、またはアジュバントもしくはネオアジュバント化学療法として投与され得る。例えば、再発性、無痛性、形質転換、および侵襲性形態の非ホジキンリンパ腫の治療は、化学療法および／または放射線療法などの一次抗癌治療の少なくとも１つのコースの後に投与され得る。
ＬＮＰ組成物の投与
本開示のＬＮＰ組成物は、非経口、静脈内、全身、局所、経口、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、吸入、または任意のそのような送達方法を含む、いくつかの方法のいずれかで投与される。一実施形態では、組成物は、非経口的に、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与される。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、静脈内注入によって、またはボーラス注射によって腹腔内に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、例えば、５～１０分、１５～２０分、３０分、６０分、９０分、またはそれ以上にわたるランニング静脈ラインを介して、リピドナノ粒子封入活性薬剤の静脈内注入を与えられる。一実施形態では、６０分間の注入が使用される。他の実施形態では、６～１０または１５～２０分の範囲の注入が使用される。このような注入は、定期的に、例えば、１、３、５、７、１０、１４、２１、もしくは２８日またはそれ以上毎に１回、好ましくは７～２１日毎に１回、好ましくは７または１４日毎に１回投与することができる。
本開示のＬＮＰ組成物は、対象への送達に適した医薬組成物として製剤化することができる。本開示の医薬組成物は、多くの場合、１つまたは複数の緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、製剤をレシピエントの血液と等張、低張または弱高張にする溶質、懸濁化剤、増粘剤および／または保存剤をさらに含む。あるいは、本開示の組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
医薬製剤中の薬物および脂質ナノ粒子の濃度は、広く、すなわち、約０．０５重量％未満、通常は約２～５重量％または少なくとも約２～５重量％から、１０～３０重量％程度まで変化することができ、使用される特定の薬物、治療される疾患状態、および服用する臨床医の判断に応じて選択される。さらに、薬物および脂質ナノ粒子の濃度はまた、投与される流体体積、投与される溶液のオスモル濃度、ならびに薬物および脂質ナノ粒子の忍容性を考慮に入れる。場合によっては、注入関連副作用の発生率または重症度を低下させるために、より低い薬物または脂質ナノ粒子濃度を使用することが好ましい場合がある。
本開示における使用に適した製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ ｔｈ Ｅｄ．（１９８５）に見出すことができる。多くの場合、静脈内組成物は、水性担体などの許容される担体中に懸濁された脂質ナノ粒子の溶液を含む。任意の種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．９％等張生理食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロースなど）が使用され得、そして安定性を増強するための糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を含み得る。しばしば、通常の緩衝化生理食塩水（１３５～１５０ｍＭ ＮａＣｌ）または５％デキストロースが使用される。これらの組成物は、濾過などの従来の滅菌技術によって滅菌することができる。得られた水溶液は、使用のために包装され得るか、または無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水溶液と合わせられる。組成物はまた、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど））を含み得る。親油性フリーラジカルクエンチャー（例えば、α－トコフェロール）および水溶性鉄特異的キレート剤（例えば、フェリオキサミン）が適切である。
用量当たりに投与される活性薬剤の量は、最小治療用量を上回るが、毒性用量を下回るように選択される。用量当たりの量の選択は、患者の病歴、他の療法の使用、および疾患の性質などのいくつかの要因に依存する。さらに、投与される活性薬剤の量は、処置に対する患者の応答および任意の処置関連副作用の存在または重症度に依存して、処置を通して調整され得る。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与量または投与頻度は、対応する遊離活性薬剤による治療の投与量およびスケジュールとほぼ同じである。しかしながら、用量は、特にＬＮＰ組成物が低減された毒性を示す場合、遊離薬物処置と比較して、より高く、またはより頻繁に投与され得ることが理解される。用量は、特にＬＮＰ組成物が遊離薬物と比較して増加した有効性を示す場合、遊離薬物処置と比較してより低いか、またはより低頻度で投与され得ることも理解される。種々の化学療法化合物（遊離薬物）についての例示的な投薬量および処置は、当業者に公知であり、利用可能であり、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｒｕｇ Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｃｈｕ ａｎｄ Ｖ．Ｄｅｖｉｔａ（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ，２００２）に記載されている。
患者は、典型的には、治療に対する患者の応答に応じて、そのような治療の少なくとも２つのコース、および潜在的により多くのコースを受ける。単剤レジメンにおいて、処置の全過程は、観察された応答および毒性に基づいて、患者および医師によって決定される。
併用療法
ある実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物は、１つまたは複数の追加の化合物または療法、例えば、手術、放射線治療、化学療法、または上記のもののいずれかを含む他の活性薬剤と組み合わせて投与することができる。ＬＮＰ組成物は、有効性の増加または望ましくない副作用の低減を含む様々な理由のために、第２の活性薬剤と組み合わせて投与されてもよい。ＬＮＰ組成物は、追加の治療の前に、その後に、またはそれと同時に投与してもよい。さらに、本開示のＬＮＰ組成物（第１の活性薬剤を含む）が第２の活性薬剤と組み合わせて投与される場合、第２の活性薬剤は、遊離薬物として、独立したＬＮＰ製剤として、または第１の薬物を含むＬＮＰ組成物の成分として投与されてもよい。ある実施形態では、複数の活性薬剤が、同じ脂質ナノ粒子に充填される。他の実施形態では、活性薬剤を含む脂質ナノ粒子は、１つまたは複数の遊離薬物と組み合わせて使用される。特定の実施形態では、薬剤を含むＬＮＰ組成物は、個別に形成され、その後、単一の同時投与のために他の化合物と組み合わされる。あるいは、特定の治療は、所定の順序で連続的に投与される。したがって、本開示のＬＮＰ組成物は、１つまたは複数の活性薬剤を含み得る。
当業者に公知の他の併用療法を、本開示の方法と併せて使用することができる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図しない。
ここで、本開示の例示的な実施形態を詳細に参照する。本開示は、例示的な実施形態と併せて説明されるが、本開示をこれらの実施形態に限定することは意図されないことが理解されるであろう。逆に、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲内に含まれ得る代替形態、修正形態、および均等物を包含することが意図される。当該分野で周知の標準的な技術または以下に具体的に記載される技術を利用した。
実施例１：異なるパラメータのＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ製剤の調製
マイクロ流体混合プロセスを使用して、ＤＯＴＡＰベースのＬＮＰを調製した。簡潔に述べると、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＣＨＥおよびＰＥＧ－ＤＭＧの脂質ストックをエタノール中で２０ｍｇ／ｍｌ濃度で調製した。異なるＮ／Ｐ比（ここでは例として２、３、４または６）、ＰＥＧ化（ここでは例として０～２％）、および脂質組成（脂質相互間のモル比）を調べた。全ての初期製剤において、ＤＯＴＡＰモルパーセントを４５％に維持したが、後の製剤は、粒子中の総脂質の２５モル％、５０モル％および７５モル％のＤＯＴＡＰを含んだ。以下の表１に示される最初の核酸－粒子製剤について、脂質を、５．８ｍｇ／ｍｌの最終脂質濃度を有するエタノール中の所定の組成物について一緒に混合した。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｍＦｌｕｃ）は、ｍＲＮＡとして水相中で０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。２相とＬＮＰ調製物との混合は、スタガ型ヘリンボーン構造のマイクロ流体チップにて、２：１の水対有機体積比および８ｍｌ／分の流量を使用して実施した。得られたＬＮＰを、ＰＢＳに対するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による精製および緩衝液交換に供した。以下の表１は、最初に調製された製剤の特徴付けパラメータを要約する。特徴付けパラメータの正確な制御は、０～２６ｍＶの間の表面電荷、および０．２以下のＰＤＩ値を有する、５１～１８８ｎｍのサイズ範囲のＤＯＴＡＰ ＬＮＰの調製を可能にした。全ての製剤は、製造業者のプロトコルを使用してＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって計算された９８％を超える封入効率（ＥＥ）を示した。
注目すべきことに、ＤＯＴＡＰは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート脂質が実現可能なナノ粒子を達成するために必要とされないように、ＬＮＰを十分に安定化した。理論に束縛されるものではないが、ＤＯＴＡＰの高い表面電荷は、粒子を安定化させるのに十分な静電安定性を提供した可能性が高い。核酸カーゴの送達に対して高度に活性であるＰＥＧ非含有核酸－脂質粒子を製剤化する本明細書において実証される能力は、ＰＥＧ化製剤の以前に観察された欠点の軽減または完全な回避を可能にし、これには、細胞相互作用および内在化の減少、ならびにＬＮＰの表面上のＰＥＧ化脂質に対する身体の免疫応答によって引き起こされる十分に実証された現象であるＰＥＧ駆動血中クリアランス促進（ＡＢＣ）が含まれるが、これらに限定されない。ＡＢＣは、反復投与時の体循環からのナノ粒子のクリアランスに関与する。したがって、本明細書で発見されたＰＥＧ非含有ＬＮＰのＤＯＴＡＰ媒介性安定化は、ＬＮＰ関連核酸カーゴの送達における重要な治療的改善を提供した。
実施例２：ＤＯＴＡＰ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）はレポーターｍＲＮＡを送達し、低い毒性を示した
カーゴとしてのＤＯＴＡＰ ＬＮＰ関連ｍＲＮＡレポーターの細胞への送達およびその後の細胞における発現の最初の実証において、ｍＲＮＡレポーターカーゴを有するＤＯＴＡＰ ＬＮＰを、Ｈｅｐａ１－６細胞（マウス細胞株）においてインビトロで試験した。Ｈｅｐａ１－６細胞を最初に黒色９６ウェルマイクロプレートに２０，０００細胞／ウェル／１００μｌの播種密度で播種した。細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートし、一晩付着させた。翌日、細胞を、完全培地中、０．３１３μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌで変化するｍＲＮＡ濃度を有する本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ製剤で２４時間連続的に処理した。図１Ａは、試験したＬＮＰ製剤について観察されたルシフェラーゼ酵素活性を示す。試験したＰＥＧ含有製剤と比較して、試験したＰＥＧなし製剤（０％ＰＥＧ）でルシフェラーゼ活性の約６００倍の顕著な増加が達成され、ｍＦｌｕｃ（ルシフェラーゼ）活性は、核酸カーゴ濃度が増加するにつれて用量依存的であることが観察された（用量依存性は特にＰＥＧ含有製剤で観察されたが、ＰＥＧ非含有ＬＮＰでは低カーゴ濃度であっても強い活性を生じた）。高濃度の試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰは、有意な細胞毒性を誘導せず、これは、現在開示されている製剤の低毒性プロファイルを実証した（図１Ｂ）。これらのデータは、本開示のＤＯＴＡＰ－ＬＮＰおよび関連カーゴがインビトロで効果的に内在化されたことを実証した。ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰカーゴ活性も細胞内に保持され、ｍＲＮＡカーゴは細胞の細胞質中で活性であり、低い細胞毒性が観察され、ＬＮＰ製剤がインビボ試験に安全であることを示した。
実施例３：試験したＤＯＴＡＰ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は肺組織に優先的に送達される
ｍＲＮＡカーゴを有する本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰのインビボ全身ＩＶ後の生体内分布を評価した。様々な表面電荷（０～２６ｍＶ）およびＰＥＧ化値（０～１％）を有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを、静脈内にＬＮＰを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、採取した器官での送達およびカーゴ発現の、インビボイメージングおよびエクスビボ検出の両方によって具体的に調べた。４５％（モル基準）のＤＯＴＡＰを有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ製剤を、上記の表１のように、ＰＥＧ－ＤＭＧあり（１％）およびなし（０％）で調製した。ＬＮＰはまた、製剤中のＣｙ７－ＤＯＰＥ（０．５％ｍｏｌ）で蛍光標識した。簡潔に述べると、ｍＦｌｕｃ ｍＲＮＡを担持したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを３ｍｇ／ｋｇ用量でマウスに静脈内投与した。投与後６時間および２４時間で、ＰＢＳ中の１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリンを腹腔内に注射し、生きた動物の蛍光および発光イメージングのためにイソフルラン下でマウスに麻酔をかけた。Ｃｙ７シグナル分布はＬＮＰ生体内分布を示し、一方、発光シグナルはレポーターｍＲＮＡカーゴ活性を示した。注目すべきことに、試験した両方のＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ、Ｎ／Ｐ：３ＰＥＧ：０およびＮ／Ｐ：３ＰＥＧ：１（表１）は、マウス肺において濃縮されたルシフェラーゼ活性（したがって、局在化および発現の両方）を示した（図２Ａ）。
次に、処置したマウスの主要器官をエクスビボで調べた。図２Ｂに示すように、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰは肺および他の器官に広く分布していたが、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰのｍＲＮＡ発現は肺に非常に特異的であった。試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ送達および関連するｍＲＮＡカーゴの発現は、より広いＬＮＰ分布が明らかに生じたにもかかわらず、肺において、検出された全ての発光シグナルの９０％を超えるレベルで観察された（図２Ｄ）。別の驚くべき結果は、０％のＰＥＧのＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、肺において、１％のＰＥＧを有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰよりも約５０倍高いｍＲＮＡ発現（ルシフェラーゼ活性によって証明される）を示したことであった（図２Ｅ）。これらのデータは、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ ｍＲＮＡ送達および発現について本明細書で観察された肺選択性が、ＬＮＰ表面電荷のみによるものではなく、理論に束縛されることを望むものではないが、ＤＯＴＡＰと肺上皮との間の見かけの構造親和性によって引き起こされた可能性が高いことを実証した。体重および肝機能検査もまた、本開示のＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、ＩＶ投与後２４時間以内にインビボで毒性でないことを示した（図２Ｆおよび２Ｇ）。
実施例４：試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの肺組織への優先的送達は、ＰＥＧ－脂質化学によって影響を受けなかった
ＰＥＧ化脂質を含有しないＤＯＴＡＰ－ＬＮＰについてのｍＲＮＡ活性が、１％ＰＥＧ化脂質を含むＤＯＴＡＰ－ＬＮＰと比較して高いことが観察されたことは、、ＰＥＧが結合する脂質の親和性がＤＯＴＡＰ－ＬＮＰによるカーゴ送達に影響を与えるかについてのさらなる調査を促した。そのような実験は、試験した製剤中のＰＥＧにコンジュゲートされた脂質の種類が器官の標的化に影響を与えないようであることを実証した。簡潔には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、３ｍｇ／ｋｇ用量で１ｍｏｌ％のＰＥＧ－ＤＳＧまたはＰＥＧ－ＤＭＧのいずれかを含有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰで静脈内処置した。ｍＦｌｕｃをＬＮＰ中に存在するレポーターｍＲＮＡカーゴとして使用し、発光シグナルをルシフェリンの投与時に測定した。製剤中のＤＯＴＡＰは４５ｍｏｌ％に維持した。ＰＥＧ－脂質タイプとは無関係に、ｍＲＮＡベースのルシフェラーゼ活性が、２４、４８、および７２時間の時点で肺に含まれるように観察された。ＰＥＧ－ＤＳＧ製剤およびＰＥＧ－ＤＭＧ製剤の両方が、ＬＮＰの広い分布を示したが、腎臓が、観察されたＬＮＰ蓄積の主要な器官であった（図３Ａ～３Ｃ）。これらの結果は、試験したＬＮＰについての可能性のある排出経路として腎臓を同定した。特定の器官（ここでは肺）からの高いシグナルが、他の器官から発するより低いが依然として有意なシグナルをマスクし得るので、肺も最初のイメージングから除去し、残りの器官を再イメージングして、ルシフェラーゼ放射輝度のより高いシグナル対バックグラウンド比を得た。残りの器官におけるルシフェラーゼシグナルは、肺のシグナルと比較して無視できる程度であった（図３Ｃ）。さらに、ＰＥＧ－ＤＳＧおよびＰＥＧ－ＤＭＧ製剤は両方とも、体重または肝機能値の有意な変化を誘導しなかったため、マウスにおいて毒性の徴候を示さなかった（図３Ｄおよび３Ｅ）。
実施例５：試験されたＤＯＴＡＰ－ＬＮＰは、カーゴとして活性Ｃｒｅ ｍＲＮＡレポーター系を肺細胞核に送達した
本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、使用されるＬＮＰ粒径、ＬＮＰ表面電荷およびＰＥＧ化タイプとは無関係である、例示されたｍＲＮＡカーゴの細胞質への優先的な肺標的化を示すことを特定したので、次いで、そのようなＬＮＰが標的肺組織におけるＣｒｅ ｍＲＮＡレポーター系の核送達も達成できるかどうかを評価した（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、核酸調節コントローラーなどの他の系の核送達も、本明細書に記載のＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを使用して達成できるかどうかの指標として）。特に、上記実施例のｍＦｌｕｃレポーター系は、器官および組織の形質導入細胞の細胞質内へのｍＲＮＡ送達を必要とした。しかし、核酸調節コントローラー、および治療用ｍＲＮＡの他の実施形態は、目的の標的遺伝子を調節するために、発現されたタンパク質の核内への移行を必要とする。核送達のための試験カーゴとして使用されるＣｒｅリコンビナーゼ酵素系はまた、ｍＲＮＡコードタンパク質の核への移行を必要とし、したがって、有効な核移行のためのレポーターとして役立ち得る。ｌｏｘＰ部位を有する細胞のヌクレアーゼに送達された場合（例えば、「ｌｏｘＰによってフランキングされた」標的遺伝子の「ｆｌｏｘｅｄ」）、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒する。
カーゴとしてＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡ（ｍＣｒｅ）を封入している４５ｍｏｌ％ＤＯＴＡＰおよび１ｍｏｌ％ＰＥＧ－ＤＭＧを有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを再び調製した。ｍＣｒｅを担持したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの粒径、ＰＤＩおよびゼータ電位は、それぞれ５８．６±０．６ｎｍ、０．０９±０．０３および１．２±０．６ｍＶと測定された。９８％を超えるｍＣｒｅが、製剤化されたＤＯＴＡＰ－ＬＮＰにおいて会合していた。本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの細胞会合は、異なるｍＲＮＡによって影響を受けなかった。図４Ａは、本明細書に開示されるＣｒｅ保有ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰとＨＥＫ２９３－ｌｏｘＰ－ＧＦＰ－ＲＦＰ細胞株との用量依存的な細胞会合を示す。この細胞株は、ＧＦＰシグナルを安定に発現したが、標的細胞の核におけるＣｒｅリコンビナーゼ発現および活性の際に、Ｃｒｅ媒介性ｌｏｘＰ組換えに起因して、細胞は、ＧＦＰの代わりにＲＦＰを発現し始めた（図４Ｂ）。ｍＣｒｅ送達および活性は、Ｃｒｅが首尾よく送達され、発現された細胞におけるＧＦＰシグナルの消失を測定するフローサイトメトリーの使用によっても確認された（図４Ｃ）。
本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰはまた、インビボで肺細胞のゲノムを標的とする核酸カーゴを送達した。Ａｉ１４マウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ）における本明細書に開示されるｍＣｒｅ担持ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの生体内分布を調べた。Ａｉ１４は、全てＧｔ（ＲＯＳＡ）２６ Ｓｏｒ遺伝子座に挿入された、ＣＡＧプロモーター駆動赤色蛍光タンパク質変異体（ｔｄＴｏｍａｔｏ）の転写を防止するｌｏｘＰ隣接（「ｆｌｏｘｅｄ」）ＳＴＯＰカセットを有するように設計されたＣｒｅレポーター株である。Ａｉ１４マウスは、Ｃｒｅ媒介性組換え後に強いｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を発現した。簡潔には、Ａｉ１４マウスに、３ｍｇ／ｋｇ用量のＣｙ７標識ｍＣｒｅ担持ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを静脈内注射した。ＬＮＰ投与の４８時間後および７２時間後に、マウスから選択された器官を採取し、エクスビボ器官イメージングを行って、ＬＮＰ分布および器官特異的活性の両方を評価した。投与後４８時間および７２時間でのエクスビボイメージングは、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、個々のタイプのＤＯＴＡＰ－ＬＮＰについて観察された粒子分布にかかわらず、肺特異的活性を示すことを示した（図５Ａ）。これらの結果は、本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、インビボで核内のｍＲＮＡカーゴによってコードされるタンパク質の発現および活性を促進する様式でｍＲＮＡカーゴを送達したことを実証した。さらに、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰのほぼ中性の電荷および異なる器官内での広い分布にもかかわらず、カーゴｍＲＮＡ活性は肺に限定され、効率的な細胞質ｍＲＮＡ送達（および核標的に向けられたカーゴｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の最終的な核活性）のための肺組織に対するＤＯＴＡＰの構造的親和性が強調された。図５Ｂに示すように、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが肝臓と肺との間でほぼ等しい分布であったにもかかわらず、ｍＲＮＡカーゴコードＣｒｅ酵素活性は、１匹の動物の外れ値を除いて、肺においてのみ観察された。これらの結果は、本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、核依存性ＲＮＡ調節コントローラー（すなわち、タンパク質調節コントローラー成分、例えば、ジンクフィンガープロテイン（ＺＦＰ）またはエピジェネティックレギュレーターおよび／もしくはヌクレアーゼに関連する他のＤＮＡ－またはＲＮＡ－結合ドメインをコードするｍＲＮＡ）およびゲノム、特に肺内でそれらの効果を示す他のＲＮＡカーゴを送達できることを実証した。
実施例６：ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを形質導入した全ての試験した肺細胞型
本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが肺における全ての細胞型に形質導入されたかどうかを決定するために、ＬＮＰ処置Ａｉ１４マウスから採取した肝臓、肺および脾臓におけるｔｄＴｏｍａｔｏシグナルを評価した。健常（野生型）マウスおよび炎症肺を有するマウス（ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス）の両方の異なる細胞集団におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現レベルを測定するために、１％ＰＥＧ－ＤＭＧを有するｍＣｒｅ担持ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰで静脈内処置したＡｉ１４動物からの肺を、免疫組織化学法（ＩＨＣ）を使用して評価した（図６Ａ～６Ｃ）。マクロファージ、上皮、および内皮細胞はすべて、調べたすべてのタイプのマウスにおいて目に見えて形質導入され、これは、本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、ＩＶ投与後に前駆細胞および上皮細胞の両方を形質導入したことを実証した。この結果は、本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを使用した核酸調節コントローラーおよび他の核酸カーゴの肺特異的送達が、炎症肺を含むあらゆる種類の肺組織型が関与する肺疾患および障害の治療のための成功した療法を提供し得ることを実証した。
実施例７：ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの特徴は、試験した製剤パラメータにわたって変化し、改善された活性を有するＬＮＰ製剤の同定をもたらした。
製剤設計パラメータをめぐる失敗の縁を理解するために、また、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ送達を最適化するために、統計的実験計画（ＤｏＥ）ベースの製剤開発プロセスを実施した。因子およびそれらのレベルを、ＤＯＴＡＰ（モル％、２５～７５）、ＰＥＧ（モル％、０～１．５）およびＮ／Ｐ比（ここでは２～４）として定義した。以下の表２は、本実施例の配合を、それぞれについての組成および特徴付け結果とともに要約する。予備的なＬＮＰ製剤化プロセスの成功基準は、２００ｎｍより小さい粒径および０．２５より小さい ＰＤＩと定義した。表から分かるように、５０ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰを有する製剤のうちの２つ（ＤＯＥ－１およびＤＯＥ－３）は、これらの予備的成功基準に不合格であった。これらの結果は、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの粒径および表面電荷が、製剤パラメータの操作を介して制御され得ることを示した。
ＤｏＥを用いて製剤最適化を行ったことに基づいて、以前に記載されたようにＡｉ１４マウスモデルにおけるそれらの生体分布のさらなる評価のために２つの製剤を選択した。製剤「３４５０」（０％ＰＥＧおよび４５％ＤＯＴＡＰを有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ）および製剤「４７５０」（０％ＰＥＧおよび７５％ＤＯＴＡＰを有する最適化ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ）にそれぞれｍＣｒｅ ｍＲＮＡカーゴを担持し、３ｍｇ／ｋｇの投与量でＡｉ１４マウスに静脈内注射した。両方の製剤は同量のＣｙ７を含有し、総脂質濃度は同じであった。３４５０および４７５０製剤は両方とも、肺においてのみｍＲＮＡ活性を示した（図７Ａ）。さらに、肺、肝臓、心臓、および脾臓における平均ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルレベルは、試験した２つの製剤間で有意に異ならなかった（図７Ｂ）。両方の製剤について、観察されたｔｄＴｏｍａｔｏ発現のほぼ１００％が肺においてであった。
ｔｄＴｏｍａｔｏシグナル産生は用量依存的ではなく、常時オンまたはオフとして記載することができる。しかしながら、４７５０製剤は、Ｃｙ７蛍光標識脂質のイメージングによって示されるように、３４５０製剤よりも多量のＬＮＰを送達したことが実証された（図７Ｂ～７Ｅ）。したがって、４７５０製剤は、肺組織においてより高いＬＮＰ送達をもたらし、用量依存的な核酸カーゴ送達が必要とされる治療のために選択され得る。
表３に示されるように、ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ製剤の特徴付けパラメータは、関連する核酸調節コントローラーによって維持された。評価された製剤は、６０～３８０ｎｍの粒径、中性から正の表面電荷、および好ましいＰＤＩ値を示した。
実施例８：ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰはまた、直接注射／局所投与を介して核酸カーゴを首尾よく送達した
本明細書に開示されるＤＯＴＡＰ－ＬＮＰのＩＶ投与による活性核酸カーゴの顕著な肺細胞指向性送達は、上に記載されている。ｍＲＮＡカーゴのＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ媒介送達が局所組織への直接注射を介して起こり得るかどうかを試験するために、関連するｍＲＮＡレポーターを有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰをマウスおよびラットの膝に注射した（関節内）。図８は、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰによる上記レポーター系のｍＦｌｕｃおよびｍＣｒｅの局所組織領域への組込みが成功したことを示し、これにより、標的組織細胞におけるカーゴの細胞質活性および核活性の両方を実証する。
会合したｍＲＮＡレポーターカーゴを有するＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの気管内投与もまた、核酸カーゴの肺組織への送達の成功をもたらした。具体的には、Ａｉ１４マウスおよび気管内（局所）点滴注入を使用した、試験したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの肺への局所送達が観察された（図９Ａおよび９Ｂ）。０％ＰＥＧのＤＯＴＡＰ－ＬＮＰを、１動物あたり１５μｇ ｍＣｒｅをＡｉ１４マウスに局所投与した。６、２４、および４８時間での時間依存的イメージングは、試験したｍＣｒｅ担持ＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの局所投与が、投与後６時間という早い時期に肺および気管においてそれらの効果を示し始めたことを示した（図９Ａ）。脾臓または肝臓において、オフターゲット効果は観察されなかった（図９Ａ）。肺組織切片の免疫組織化学染色は、試験したｍＣｒｅ ｍＲＮＡカーゴを担持したＤＯＴＡＰ－ＬＮＰが、気管内（局所）点滴注入を介して、投与後６時間という早い時期であっても、重要な細胞型（マクロファージ、内皮細胞および上皮細胞を含む）にアクセスしたことをさらに示した（図９Ｂ）。これらの結果は、本明細書に開示される核酸カーゴのＤＯＴＡＰ－ＬＮＰ送達が、気道に関連する細胞の活性を必要とする臨床症例における肺への局所投与に有効であり、適切である可能性が高いことを実証した。
本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、本開示が属する当業者の技術レベルを示す。本開示において引用される全ての参考文献は、各参考文献が個々にその全体が参照により組み込まれているのと同程度に、参照により組み込まれる。
当業者は、本開示が、目的を実行し、言及された結果および利点、ならびにその中に固有のものを得るために十分に適合されることを容易に理解するであろう。好ましい実施形態の現在の代表として本明細書に記載される方法および組成物は、例示的なものであり、本開示の範囲に対する限定として意図されない。本開示の趣旨内に包含され、特許請求の範囲によって定義される、その中の変更および他の使用が当業者に思い浮かぶであろう。
さらに、本開示の特徴または態様が、マーカッシュ群または代替物の他のグループ分けの観点から説明される場合、当業者は、本開示が、それによって、マーカッシュ群または他の群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも説明されることを認識するであろう。
本開示を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の記載がない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各個別の値を個々に言及する省略法としての役割を果たすことが単に意図されており、各個別の値は、本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意のおよびすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、別段の主張がない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
開示された発明を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含む、本開示の実施形態が本明細書に記載されている。これらの実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者には明らかになり得る。
本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のいずれも、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用された用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、示され、説明された特徴またはその一部の任意の均等物を除外する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本開示は好ましい実施形態を提供するが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、修正、および変形は、当業者によって再分類されてもよく、そのような修正および変形は、説明および添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲内であると考えられることを理解されたい。
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して様々な置換および修飾を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。したがって、そのような追加の実施形態は、本開示および以下の特許請求の範囲の範囲内である。本開示は、改善されたコントラスト、診断および／またはイメージング活性を有するコンジュゲートを生成するために、本明細書に記載される化学修飾の様々な組み合わせおよび／または置換を試験することを当業者に教示する。従って、本明細書中に記載される特定の実施形態は、限定的なものではなく、当業者は、本明細書中に記載される修飾の特定の組み合わせが、改善されたコントラスト活性、診断活性および／または画像化活性を有する結合体を同定するために過度の実験を行うことなく試験され得ることを容易に理解し得る。
本発明者らは、当業者が任意選択で、そのような変形形態を使用することを予想し、本発明者らは、本開示が本明細書に具体的に記載されているものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本開示は、準拠法によって許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題のすべての修正形態および均等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形形態における上述の要素の任意の組合せは、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、本開示によって包含される。当業者は、本明細書に記載される本開示の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (75)

  1. 核酸カーゴを対象の肺組織に送達するための核酸－脂質粒子であり、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％を構成する１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む、核酸－脂質粒子。
  2. 前記存在する総脂質の０．０１～２％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートがＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０ｍｏｌ％、および核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．５ｍｏｌ％からなる群から選択される濃度でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む、請求項１に記載の核酸－脂質粒子。
  3. 前記核酸－脂質粒子がＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まず、任意選択で前記核酸－脂質粒子がＰＥＧを含まない、請求項１に記載の核酸－脂質粒子。
  4. 前記核酸－脂質粒子が、複数回投与療法の成分である、請求項３に記載の核酸－脂質粒子。
  5. 前記脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％を構成する１つまたは複数の非カチオン性脂質を含み、任意選択で、前記１つまたは複数の非カチオン性脂質が、コレステロールまたはその誘導体を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子。
  6. 前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の１０ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の３５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、および前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の６０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％からなる群から選択される濃度範囲でコレステロールまたはその誘導体を含む、請求項５に記載の核酸－脂質粒子。
  7. 前記コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質を含む請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子であり、任意選択で、前記コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質が、前記脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の５ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％を構成し、任意選択で、前記コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％を構成する、核酸－脂質粒子。
  8. 前記コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびβ－シトステロールからなる群から選択される非カチオン性脂質を含み、任意選択で、前記コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質がジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である、請求項７に記載の核酸－脂質粒子。
  9. 前記核酸カーゴが、合成もしくは天然に存在するＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの誘導体を含み、任意選択で、前記核酸カーゴが、修飾ＲＮＡであり、任意選択で、前記修飾ＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび修飾ｓｉＲＮＡからなる群から選択され、任意選択で、前記修飾ｍＲＮＡが、核酸調節コントローラーをコードする、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子。
  10. 前記核酸カーゴが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、５’－メトキシ修飾ヌクレオチド（例えば、５’－メトキシウリジン）、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基；ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、ならびに前記のヌクレオシド単位の隣接する対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に連結されている逆極性を有するものを含むヌクレオシド間結合または骨格、からなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子。
  11. 前記肺組織が、上皮、内皮、間質結合組織、血管、造血組織、リンパ系組織、および胸膜からなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子。
  12. 前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～４９ｍｏｌ％を構成するＤＯＴＡＰを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％または約４５ｍｏｌ％を構成するＤＯＴＡＰを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子。
  13. 前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％または約７５ｍｏｌ％を構成するＤＯＴＡＰを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子および薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  15. 前記医薬組成物が、非経口投与のために、任意選択で静脈内注射のために製剤化される、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 吸入用に製剤化される、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 肺組織への直接注射のために製剤化される、請求項１４に記載の医薬組成物。
  18. 前記対象への前記核酸－脂質粒子または医薬組成物の静脈内投与が、前記対象の肺組織の細胞において、前記対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における前記核酸カーゴの発現よりも、少なくとも２倍高いレベルで前記核酸カーゴの発現をもたらし、任意選択で、前記対象の肺組織の細胞における前記核酸カーゴの発現が、前記対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における前記核酸カーゴの発現よりも、少なくとも３倍高い、任意選択で少なくとも４倍高い、任意選択で少なくとも５倍高い、任意選択で少なくとも６倍高い、任意選択で少なくとも７倍高い、任意選択で少なくとも８倍高い、任意選択で少なくとも９倍高い、任意選択で少なくとも１０倍高い、任意選択で少なくとも１１倍高い、任意選択で少なくとも１２倍高い、任意選択で少なくとも１３倍高い、任意選択で少なくとも１４倍高い、任意選択で少なくとも１５倍高い、任意選択で少なくとも２０倍高い、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子または医薬組成物。
  19. 前記核酸－脂質粒子または医薬組成物の前記対象への静脈内投与が、心臓、脾臓、卵巣および膵臓からなる群から選択される前記対象の１つまたは複数の他の組織における前記核酸－脂質粒子の濃度よりも、少なくとも２倍高い濃度で、前記核酸－脂質粒子の前記対象の肺組織への局在化をもたらし、任意選択で、心臓、脾臓、卵巣および膵臓からなる群から選択される前記対象の１つまたは複数の他の組織と比較して、少なくとも３倍、任意選択で少なくとも４倍、任意選択で少なくとも５倍、任意選択で少なくとも６倍高い濃度の前記核酸－脂質粒子が肺に局在する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子または医薬組成物。
  20. 前記核酸－脂質粒子または医薬組成物が、肺疾患または肺障害を治療するために投与され、任意選択で、前記肺疾患または肺障害が、肺がん、肺炎、肺線維症、ＣＯＰＤ、ぜんそく、気管支拡張症、サルコイドーシス、肺高血圧、肺気腫、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アスペルギルス症、細気管支炎、気管支炎、塵肺、コロナウイルス、中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群、嚢胞性繊維症、レジオネラ症、インフルエンザ、百日咳、肺塞栓症、および結核からなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子または医薬組成物。
  21. 対象の組織に核酸カーゴを送達するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）非含有脂質－核酸粒子であり、前記ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％を構成する１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子。
  22. 前記ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％を構成する１つまたは複数の非カチオン性脂質を含み、任意選択で、前記非カチオン性脂質がコレステロールまたはその誘導体を含む、請求項２１に記載のＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子。
  23. 前記ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の１０ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、前記ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の３５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、および前記ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の６０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％からなる群から選択される濃度範囲で、コレステロールまたはその誘導体を含む、請求項２１または２２に記載のＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子。
  24. コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質を含み、任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質が、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の５ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％を構成し、任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質が、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％を構成する、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子。
  25. 前記コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびβ－シトステロールからなる群から選択される非カチオン性脂質を含み、任意選択で、前記コレステロールもしくはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質がジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である、請求項２４に記載のＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子。
  26. 前記核酸カーゴが、合成または天然に存在するＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの誘導体を含み、任意選択で、前記核酸カーゴが修飾ＲＮＡであり、任意選択で、前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡからなる群から選択され、任意選択で、前記ｍＲＮＡが、核酸調節コントローラー（すなわち、タンパク質コントローラー成分をコードするｍＲＮＡ）をコードする、請求項２１～２５のいずれか一項に記載のＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子。
  27. 前記核酸カーゴが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、５’－メトキシ修飾ヌクレオチド（例えば、５’－メトキシウリジン）、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基；ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、ならびに前記のヌクレオシド単位の隣接する対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に連結されている逆極性を有するものを含むヌクレオシド間結合または骨格、からなる群から選択される修飾を含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子。
  28. 前記組織が、肺、関節、表皮、真皮、内皮、および血液の組織からなる群から選択される１つまたは複数の組織である、請求項２１～２７のいずれか一項に記載のＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子。
  29. 非経口投与され、任意選択で、吸入、局所適用および注射からなる群から選択される経路を介して投与され、任意選択で、前記注射が、静脈注射、気管内注射または点滴注入、関節内注射、皮下注射、皮内注射および筋内注射からなる群から選択される、請求項２１～２８のいずれか一項に記載のＰＥＧ非含有核酸－脂質粒子。
  30. 前記ＰＥＧ非含有核酸－脂質粒子が、複数回投与療法の成分である、請求項２１～２９のいずれか一項に記載のＰＥＧ非含有核酸－脂質粒子。
  31. 請求項２１～３０のいずれか一項に記載のＰＥＧ非含有核酸－脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  32. 前記医薬組成物が、非経口投与のために、任意選択で静脈内注射のために製剤化される、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 吸入用に製剤化される、請求項３１に記載の医薬組成物。
  34. 前記組織への直接注射のために製剤化される、請求項３１に記載の医薬組成物。
  35. 肺、関節、表皮、真皮、内皮および血液組織からなる群から選択される組織に投与される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  36. 以下からなる群から選択される疾患または障害：
    肺疾患または肺障害、任意選択で、肺がん、肺炎、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、気管支拡張症、サルコイドーシス、肺高血圧、肺気腫、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アスペルギルス症、細気管支炎、気管支炎、塵肺、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群、嚢胞性線維症、レジオネラ症、インフルエンザ、百日咳、肺塞栓症および結核からなる群から選択される肺疾患または肺障害；
    関節疾患または関節障害、任意選択で、関節リウマチ、乾癬性関節炎、痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群および変形性関節症からなる群から選択される関節疾患または関節障害関節疾患または関節障害；
    炎症性疾患または炎症性障害、任意選択で、炎症腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、悪液質、膵臓炎、外傷性ショック、気管支ぜんそく、アレルギー鼻炎、嚢胞性繊維症、急性気管支炎、急性激烈気管支炎、骨関節症、リウマチ性関節炎、感染性関節炎、感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、関節炎、骨関節症、痛風、脊椎関節症、強直性脊髄炎、血管炎症候群を伴う関節炎、結節性多発性動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性ポリポーシス筋痛症、関節炎細胞性動脈炎、カルシウム多嚢胞性関節症、苛性痛風、非関節炎性リウマチ、関節血症、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、複数サイズの痔核、脊柱側弯症、ヘモクロマトーシス、高リポタンパク質血症、低ガンマグロブリン症、ＣＯＰＤ、急性呼吸促迫症候群、急性肺損傷、気管支肺異形成および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）からなる群から選択される炎症性疾患または炎症性障害；および
    表皮の疾患または障害、任意選択で、乾せん、アトピー皮膚炎、硬皮症、湿疹、しゅさ、脂漏性皮膚炎、メラノーマ、日光性角化症、魚鱗癬、グローバー病、尋常性疣贅、ケラトアカントーマおよび脂漏性角化症からなる群から選択される表皮の疾患または障害、
    を治療または予防するために、対象に投与される、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  37. 核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約４５ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含み、約３のＮ／Ｐ比を有する、核酸－脂質粒子。
  38. 前記核酸－脂質粒子がＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まず、任意選択で、前記核酸－脂質粒子がＰＥＧを含まない、請求項３７に記載の核酸－脂質粒子。
  39. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．０％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートがＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０ｍｏｌ％の濃度のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む、請求項３７に記載の核酸－脂質粒子。
  40. 核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約４５ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含み、約６のＮ／Ｐ比を有する、核酸－脂質粒子。
  41. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．０％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートがＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０ｍｏｌ％の濃度のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む、請求項４０に記載の核酸－脂質粒子。
  42. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約２．０％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートがＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約２．０ｍｏｌ％の濃度のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む、請求項４０に記載の核酸－脂質粒子。
  43. 核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％の、コレステロール以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質またはその誘導体、および、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３８ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を含む、核酸－脂質粒子。
  44. 前記核酸－脂質粒子が、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まず、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３９．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約２である、請求項４３に記載の核酸－脂質粒子。
  45. 前記核酸－脂質粒子が、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まず、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３９．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約３である、請求項４３に記載の核酸－脂質粒子。
  46. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約０．５％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約０．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３９．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約３である、請求項４３に記載の核酸－脂質粒子。
  47. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．０％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３８．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約３である、請求項４３に記載の核酸－脂質粒子。
  48. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．０％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３８．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約２である、請求項４３に記載の核酸－脂質粒子。
  49. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．５％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約３８．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約４である、請求項４３に記載の核酸－脂質粒子。
  50. 核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％のコレステロール以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質またはその誘導体、および核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６３ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を含む、核酸－脂質粒子。
  51. 前記核酸－脂質粒子が、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まず、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６４．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約３である、請求項５０に記載の核酸－脂質粒子。
  52. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約０．５％を含む、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約０．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６４．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約４である、請求項５０に記載の核酸－脂質粒子。
  53. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．０％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートがＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６３．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約４である、請求項５０に記載の核酸－脂質粒子。
  54. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．５％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約６３．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約２である、請求項５０に記載の核酸－脂質粒子。
  55. 核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約７５ｍｏｌ％の１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％の、コレステロールまたはその誘導体以外の１つまたは複数の非カチオン性脂質、および、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を含む、核酸－脂質粒子。
  56. 前記核酸－脂質粒子が、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含まず、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１４．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約４である、請求項５５に記載の核酸－脂質粒子。
  57. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約０．５％を含む、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約０．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１４．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約２である、請求項５５に記載の核酸－脂質粒子。
  58. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．０％を含む粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが、５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートがＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．０％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１３．７５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約２である、請求項５５に記載の核酸－脂質粒子。
  59. 前記核酸－脂質粒子が、存在する総脂質の約１．５％を構成する粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含み、任意選択で、前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧが５５０ダルトン～３０００ダルトンの平均分子量を有し、任意選択で、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートがＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートであり、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）および１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ）のうちの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記ＰＥＧ２０００－脂質コンジュゲートが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ）であり、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１．５％でＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子が、前記核酸－脂質粒子中に存在する総脂質の約１３．２５ｍｏｌ％でコレステロールまたはその誘導体を含み、任意選択で、前記核酸－脂質粒子のＮ／Ｐ比が約３である、請求項５５に記載の核酸－脂質粒子。
  60. コレステロールもしくはその誘導体以外の前記１つまたは複数の非カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびβ－シトステロールからなる群から選択される非カチオン性脂質を含み、任意選択で、コレステロールもしくはその誘導体以外の前記１つまたは複数の非カチオン性脂質がジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である、請求項３７～５９のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子。
  61. 請求項３７～６０のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  62. 非経口投与のために、任意選択で、静脈内注射のために製剤化される、請求項６１に記載の医薬組成物。
  63. 吸入用に製剤化される、請求項６１に記載の医薬組成物。
  64. 前記組織への直接注射のために製剤化される、請求項６１に記載の医薬組成物。
  65. 肺、関節、表皮、真皮、内皮および血液組織からなる群から選択される組織に投与される、請求項６１～６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  66. 以下からなる群から選択される疾患または障害：
    肺疾患または肺障害、任意選択で、肺がん、肺炎、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、気管支拡張症、サルコイドーシス、肺高血圧、肺気腫、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アスペルギルス症、細気管支炎、気管支炎、塵肺、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群、嚢胞性線維症、レジオネラ症、インフルエンザ、百日咳、肺塞栓症および結核からなる群から選択される肺疾患または肺障害；
    関節疾患または関節障害、任意選択で、関節リウマチ、乾癬性関節炎、痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群および変形性関節症からなる群から選択される関節疾患または関節障害；
    炎症性疾患または炎症性障害、任意選択で、炎症腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、悪液質、膵臓炎、外傷性ショック、気管支ぜんそく、アレルギー鼻炎、嚢胞性繊維症、急性気管支炎、急性激烈気管支炎、骨関節症、リウマチ性関節炎、感染性関節炎、感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、関節炎、骨関節症、痛風、脊椎関節症、強直性脊髄炎、血管炎症候群を伴う関節炎、結節性多発性動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性ポリポーシス筋痛症、関節炎細胞性動脈炎、カルシウム多嚢胞性関節症、苛性痛風、非関節炎性リウマチ、滑液包炎、枯草熱、化膿性炎症（例えば、テニス肘）、神経因性関節病、関節血症、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、複数サイズの痔核、脊柱側弯症、ヘモクロマトーシス、高リポタンパク質血症、低ガンマグロブリン症、ＣＯＰＤ、急性呼吸促迫症候群、急性肺損傷、気管支肺異形成および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）からなる群から選択される炎症性疾患または炎症性障害；および
    表皮の疾患または障害、任意選択で、乾せん、アトピー皮膚炎、硬皮症、湿疹、しゅさ、脂漏性皮膚炎、メラノーマ、日光性角化症、魚鱗癬、グローバー病、尋常性疣贅、ケラトアカントーマおよび脂漏性角化症からなる群から選択される表皮の疾患または障害、
    を治療または予防するために対象に投与される、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  67. 請求項１～６６のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子、医薬組成物またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子を含む注入物。
  68. 核酸カーゴを対象の肺組織に送達するための方法であり、請求項１～６７のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子、医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子または注入物を前記対象に投与することを含む、方法。
  69. 対象における疾患または障害を治療または予防するための方法であり、請求項１～６７のいずれか一項に記載の核酸－脂質粒子、医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子または注入物を前記対象に投与することを含む、方法。
  70. 前記核酸－脂質粒子、前記医薬組成物、前記ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子または前記注入物が静脈内投与され、前記対象の肺組織の細胞における前記核酸カーゴの発現が、前記対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における前記核酸カーゴの発現よりも少なくとも２倍高いレベルで起こり、任意選択で、前記対象の肺組織の細胞における前記核酸カーゴの発現が、前記対象の肝臓、心臓、脾臓、卵巣、膵臓および腎臓の細胞における前記核酸カーゴの発現よりも、少なくとも３倍高い、任意選択で少なくとも４倍高い、任意選択で少なくとも５倍高い、任意選択で少なくとも６倍高い、任意選択で少なくとも７倍高い、任意選択で少なくとも８倍高い、任意選択で少なくとも９倍高い、任意選択で少なくとも１０倍高い、任意選択で少なくとも１１倍高い、任意選択で少なくとも１３倍高い、任意選択で少なくとも１４倍高い、任意選択で少なくとも１５倍高い、任意選択で少なくとも２０倍高い、請求項６８または請求項６９に記載の方法。
  71. 前記核酸－脂質粒子、医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子または注入物が静脈内投与され、前記核酸－脂質粒子またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子が、心臓、脾臓、卵巣および膵臓からなる群から選択される前記対象の１つまたは複数の他の組織における前記核酸－脂質粒子またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子の濃度よりも少なくとも２倍高い濃度で前記対象の肺組織に局在し、任意選択で、心臓、脾臓、卵巣および膵臓からなる群から選択される前記対象の１つまたは複数の他の組織と比較して、少なくとも３倍、任意選択で少なくとも４倍、任意選択で少なくとも５倍、任意選択で少なくとも６倍高い濃度の前記核酸－脂質粒子またはＰＥＧ非含有脂質－核酸粒子が肺に存在する、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記疾患または障害が、以下からなる群：
    肺疾患または肺障害、任意選択で、肺がん、肺炎、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、気管支拡張症、サルコイドーシス、肺高血圧、肺気腫、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アスペルギルス症、細気管支炎、気管支炎、塵肺、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群、嚢胞性線維症、レジオネラ症、インフルエンザ、百日咳、肺塞栓症および結核からなる群から選択さる肺疾患または肺障害；
    関節疾患または関節障害、任意選択で、関節リウマチ、乾癬性関節炎、痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群および変形性関節症からなる群から選択される関節疾患または関節障害；
    炎症性疾患または炎症性障害、任意選択で、炎症腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、悪液質、膵臓炎、外傷性ショック、気管支ぜんそく、アレルギー鼻炎、嚢胞性繊維症、急性気管支炎、急性激烈気管支炎、骨関節症、リウマチ性関節炎、感染性関節炎、感染後関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、関節炎、骨関節症、痛風、脊椎関節症、強直性脊髄炎、血管炎症候群を伴う関節炎、結節性多発性動脈炎（ｎｏｄｕｌａｒ ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｅｒｖｏｓａ）、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性ポリポーシス筋痛症、関節炎細胞性動脈炎、カルシウム多嚢胞性関節症、苛性痛風、非関節炎性リウマチ、滑液包炎、枯草熱、化膿性炎症（例えば、テニス肘）、神経因性関節病、関節血症、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、肥大性骨関節症、複数サイズの痔核、脊柱側弯症、ヘモクロマトーシス、高リポタンパク質血症、低ガンマグロブリン症、ＣＯＰＤ、急性呼吸促迫症候群、急性肺損傷、気管支肺異形成および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）からなる群から選択される炎症性疾患または炎症性障害；
    表皮の疾患または障害、任意選択で、乾せん、アトピー皮膚炎、硬皮症、湿疹、しゅさ、脂漏性皮膚炎、メラノーマ、日光性角化症、魚鱗癬、グローバー病、尋常性疣贅、ケラトアカントーマおよび脂漏性角化症からなる群から選択される表皮の疾患または障害、
    から選択される、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記核酸－脂質粒子、前記医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸または前記注入物が非経口投与され、任意選択で、前記核酸－脂質粒子、前記医薬組成物、ＰＥＧ非含有脂質－核酸または前記注入物が、吸入、局所適用および注射からなる群から選択される経路を介して投与され、前記注射が、静脈注射、気管内注射または点滴注入、関節内注射、皮下注射、皮内注射および筋内注射からなる群から選択される、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記核酸カーゴが、合成もしくは天然に存在するＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの誘導体を含み、任意選択で、前記核酸カーゴが修飾ＲＮＡであり、任意選択で、前記修飾ＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、および修飾ｓｉＲＮＡからなる群から選択され、任意選択で、前記修飾ｍＲＮＡが、核酸調節コントローラーをコードする、請求項６８～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記核酸カーゴが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、５’－メトキシ修飾ヌクレオチド（例えば、５’－メトキシウリジン）、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基；ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、ならびに前記のヌクレオシド単位の隣接する対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に連結されている逆極性を有するものを含むヌクレオシド間結合または骨格、からなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む、請求項６８～７４のいずれか一項に記載の方法。
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