KR20230122098A - 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(dotap) 지질나노입자에 의한 조직 특이적 핵산 전달 - Google Patents

1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(dotap) 지질나노입자에 의한 조직 특이적 핵산 전달 Download PDF

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오메가 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시는 폐 및 다양한 폐 조직에 우선적으로 국소화되어 관련 카고를 전달하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 갖는 핵산-지질 입자뿐만 아니라, 이러한 입자가 직접적으로 주입되는 조직에 관한 것이다. 본 개시는 선택적으로 치료제(예를 들면, 치료용 mRNA 및/또는 핵산 컨트롤러 시스템)와 관련하여 이러한 지질 입자를 포함하는 조성물뿐만 아니라, 본원에 제공된 지질 입자 조성물을 사용하여, 지질 입자 관련 치료제의 전달 및/또는 피험체에 있어서의 질환 또는 장애, 예를 들면 폐 질환 또는 장애의 치료를 위한 방법 및 키트를 제공한다.

Description

1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 지질 나노입자에 의한 조직 특이적 핵산 전달
(관련 출원에 대한 상호 참조)
본 출원은 2020년 12월 18일에 출원된 "1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 지질 나노입자에 의한 조직 특이적 핵산 전달"이라는 발명의 명칭의 미국 가특허출원번호 63/127,812에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권을 주장하며, 그에 관한 것이다. 상기 특허출원의 전체 내용은 본원에 참조를 위해 포함되어 있다.
본 개시는 핵산 기반 치료법을 투여하는 데 유용한 지질계 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 피험체의 폐 조직을 포함한 피험체의 조직에서의 질환 및 장애를 치료하기 위한 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 지질 조성물에 관한 것이다.
세계보건기구는 폐 질환이 전 세계의 사망 및 장애의 주요 원인인 것으로 보고하고 있다. 폐 질환 및 신생아 호흡곤란 증후군과 같은 기타 호흡 문제는 1세 미만의 영아의 주요 사망 원인 중 하나이다. 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)으로만 약 6,500만 명이 고통받고 있으며, 이것으로 인해 매년 3백만 명이 사망한다(www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/chronic-obstructive-pulmonary-disease-(copd)). 이러한 병태를 위한 일부 치료법이 존재하지만, 결코 완전히 회복되지 않으며, 환자에게 치명적인 손상을 끼치지 않으면서 효과적으로 질환을 치료하는 치료제를 개발하는 것이 의학계의 주요 과제로 남아 있다.
핵산 치료법은 개별 표적화된 유전자의 레벨에서 질환을 치료할 수 있는 엄청난 잠재력을 제공한다. 그러나, 핵산 치료제의 모든 잠재력을 실현하기 위해서는 안전하고 효과적인 전달 시스템이 필수적이다. 모든 장기와 조직에의 핵산 치료제의 비특이적 전달은 종종 오프사이트(off-site)(비표적화된 및/또는 표적외(off-target)) 효과 및 독성을 초래할 수 있다. 특이적 작용이 바람직한 관심 장기 또는 조직에 우선적으로 핵산 치료제를 전달하는 것은 특히 약물 전달 및 핵산계 제제의 전달의 지속적인 목표이다. 신체의 다른 부위는 손상시키지 않고 질환의 원인만을 표적으로 하는 개념은 120년 전 에를리히(ehrlich)에 의해 설명되었다. 그러나, 특이적 조직의 표적화를 리간드 기반 표적화 전략(후자를 활성 표적화라고도 칭함)을 도입하지 않고 행할 수 있는 나노입자 전달 시스템에 대한 옵션은 아직까지 사실상 존재하지 않는다. 따라서, 이러한 전달 방식(리간드 기반 활성 표적화 전략이 아닌)의 구조적 구성요소만을 기반으로 하는 핵산 카고의 장기 특이적 전달을 달성할 수 있는 전달 방식에 대해서는 당업계에 있어서 종래의 충족되지 않은 요구가 있다. 특히, 폐는 유전자 치료의 주요 표적 장기이기 때문에, 당업계에서는 폐에 핵산 카고를 선택적으로 전달할 수 있는 이러한 전달 방식에 대한 특정 요구가 있다.
본 개시는, 적어도 부분적으로는, 리간드 기반 표적화 전략을 필요로 하지 않고, 카고 모이어티(예를 들면, 핵산 카고)를 피험체의 폐 및 폐 조직에 특이적으로 표적화할 수 있는 지질계 나노입자 조성물 및 제형의 식별을 기반으로 한다. 잘 알려진 4급 아미노 지질인 DOTAP는 본 개시의 지질 나노입자(LNP)의 구조적 구성요소로서, 전신 또는 국소 투여 시, LNP 중에 추가적인 활성 표적 성분을 필요로 하지 않고, 폐로 벡터의 트로피즘(tropism)을 특이적으로 이동시키는 것이 본원에서 주목할 만하게 확인되었다. 본 개시는 DOTAP가 폐 조직에 대해 갖는 놀라운 구조적 친화성을 나타내며, 이는 전신 투여(예를 들면 정맥(IV) 주사) 시 치료용 mRNA의 발현을 포함한 핵산 카고의 효과적인 전달을 위해 활용될 수 있다. 본 개시의 형광 라벨링된 DOTAP LNP는 총 LNP의 최대 25~40% 수준으로 간에 축적되는 것으로 본원에서 확인되었지만, 간 및 기타 모든 조직에 비해 폐에서의 현저히 우선적인 LNP-운송 카고 mRNA(활성)의 발현이 관찰되었다. 이러한 관찰된 효과는 테스트된 LNP 제형의 표면 전하의 크기와 무관했다. 폐 조직에 대한 면역조직화학법(IHC) 평가에서도 내피세포, 상피세포, 섬유아세포 및 대식세포에서 본원에 개시된 DOTAP LNP를 사용하여 카고 mRNA의 성공적인 전달 및 발현이 입증되었다. 또한, 폐 전달 DOTAP계 LNP는 제형에 PEG를 포함시키지 않고도 유리하게 제조될 수 있다는 것이 본원에서 확인되었다. 이론에 얽매이고 싶지 않지만, DOTAP의 높은 양전하는 입체 안정화를 필요로 하지 않고 정전기 안정화를 통해 본 개시의 입자를 안정화시키기에 충분한 것으로 보여진다. 본원에 개시된 소정의 높은 활성의 지질 입자 제형으로부터 PEG를 배제하는 능력은 본 개시의 입자의 또 다른 주목할 만한 놀라운 특성이다. 실제로, 이론에 얽매이고 싶지 않지만, PEG 비함유 조성물을 채용함으로써 LNP의 표면의 PEG 분자에 대해 활성화하는 피험체의 면역 체계에 의해 야기된 잘 알려진 현상인 상기 기재된 PEG 함유 LNP에 대한 혈액 청소율 촉진(ABC) 효과를 감소 또는 심지어 완전히 회피할 수 있다고 생각된다. ABC는 반복 투여시 체순환으로부터의 나노입자의 제거율에 책임이 있다. 따라서, 본 개시의 LNP가 포함되었고, DOTAP를 안정화 지질로서 채용하기 때문에, 본 개시는 반복 전신 투여를 위한 특별한 이점을 제공하는 핵산-지질 입자를 유의하게 제공한다.
일 양태에 있어서, 본 개시는 피험체의 폐 조직에 핵산 카고를 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하고, 상기 핵산-지질 입자는 1,2-디오레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼80몰%의 농도로 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 존재하는 총 지질의 0.01∼2%의 농도로 포함한다. 선택적으로, 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 상기 PEG-지질 공액체의 PEG는 550달톤∼3000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 선택적으로, 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이다. 선택적으로, 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함한다. 선택적으로, 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이다. 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 0.5몰%, 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0몰%, 또는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.5몰%의 농도로 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않는다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 PEG를 포함하지 않는다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 멀티도스 요법(multi-dose therapy)의 구성요소이다.
일 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼80몰%의 농도로 하나 이상의 비이온성 지질을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 비양이온성 지질은 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다.
관련 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 다음 농도 범위 중 하나로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다: 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 10몰%∼20몰%; 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 35몰%∼45몰%; 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 총 지질의 60몰%∼70몰%.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함한다. 선택적으로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 5몰%∼20몰%로 존재한다. 선택적으로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%로 존재한다. 선택적으로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및/또는 β-시토스테롤을 포함한다. 선택적으로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)이다.
실시형태에 있어서, 핵산 카고는 합성 또는 자연적으로 발생하는 RNA 또는 DNA, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산 카고는 수식된 RNA이다. 선택적으로, 수식된 RNA는 수식된 mRNA, 수식된 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 수식된 siRNA이다. 선택적으로, 수식된 mRNA는 핵산 조절 컨트롤러(nucleic acid modulating controller)를 인코딩한다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산 카고는 다음 수식 중 하나 이상을 포함한다: 2'-O-메틸 수식 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 수식 뉴클레오티드, 5'-메톡시-수식 뉴클레오티드(예를 들면, 5'-메톡시우리딘), 2'-데옥시-수식 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식 뉴클레오티드, 2'-알킬-수식 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드; 포스포로티오에이트를 포함하는 인터뉴클레오시드 연결 또는 백본, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및/또는 인접한 뉴클레오티드 유닛의 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 반전된 극성을 갖는 것.
실시형태에 있어서, 폐 조직은 상피, 내피, 간질 결합 조직, 혈관, 조혈 조직, 림프 조직 및 흉막 중 하나 이상이다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼49몰%로 DOTAP를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 25몰% 또는 약 45몰%로 DOTAP를 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 50몰% 또는 약 75몰%로 DOTAP를 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 본 개시의 핵산-지질 입자 및 의약적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
실시형태에 있어서, 의약 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다. 선택적으로, 의약 조성물은 정맥 주사용으로 제형화된다.
일부 실시형태에 있어서, 의약 조성물은 흡입용으로 제형화된다.
다른 실시형태에 있어서, 의약 조성물은 폐 조직에의 직접 주입용으로 제형화된다.
소정 실시형태에 있어서, 본 개시의 핵산-지질 입자 또는 의약 조성물을 피험체에 정맥내 투여하면, 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현이 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 2배 더 높은 레벨로 된다. 선택적으로, 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현이 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 3배 더 높다. 선택적으로, 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현이 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 4배 더 높다. 선택적으로, 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현이 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 5배 더 높고, 적어도 6배 더 높고, 적어도 7배 더 높고, 적어도 8배 더 높고, 적어도 9배 더 높고, 적어도 10배 더 높고, 적어도 11배 더 높고, 적어도 12배 더 높고, 적어도 13배 더 높고, 적어도 14배 더 높고, 적어도 15배 더 높고, 또는 적어도 20배 더 높다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 핵산-지질 입자 또는 의약 조성물을 피험체에게 정맥내 투여하면, 피험체의 심장, 비장, 난소 및 췌장 중 하나 이상에서의 핵산-지질 입자의 농도보다 적어도 2배 더 높은 농도로 피험체의 폐 조직에 핵산-지질 입자가 국소화되게 된다. 선택적으로, 심장, 비장, 난소 및 췌장 중 하나 이상과 비교하여, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 6배 더 높은 농도의 핵산-지질 입자가 폐에 위치된다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자 또는 의약 조성물은 폐 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여된다. 선택적으로, 질환 또는 장애는 폐암, 폐렴, 폐섬유증, COPD, 천식, 기관지확장증, 사르코이드증, 폐고혈압, 폐기종, 알파-1 항트립신 결핍증, 아스페르길루스증, 세기관지염, 기관지염, 진폐증, 코로나 바이러스, 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군, 낭포성 섬유증, 레지오넬라증, 인플루엔자, 백일해, 폐색전증 및 결핵 중 하나 이상이다.
본 개시의 추가 양태는 핵산 카고를 피험체의 조직으로 전달하기 위한 폴리에틸렌글리콜(PEG) 비함유 지질-핵산 입자를 제공하며, 상기 PEG 비함유 지질-핵산 입자는 PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼80몰%로 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, PEG 비함유 지질-핵산 입자는 PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼80몰%로 하나 이상의 비이온성 지질을 포함한다. 선택적으로, 입자의 비양이온성 지질 구성요소는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 콜레스테롤 또는 그 유도체는 하기 농도 범위: 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%∼약 20몰%, 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 35몰%∼약 45몰%, 및 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 60몰%∼약 70몰% 중 하나의 농도로 입자 내에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, PEG 비함유 지질-핵산 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비이온성 지질을 포함한다. 선택적으로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비이온성 지질은 PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 5몰%∼약 20몰%로 포함된다. 선택적으로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질 또는 그 유도체는 PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%로 포함된다. 관련 실시형태에 있어서, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 다음 중 하나 이상이다: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 β-시토스테롤. 선택적으로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)이다.
실시형태에 있어서, 피험체의 조직은 폐, 관절, 표피, 진피, 내피, 및 혈액 조직 중 하나 이상이다.
소정 실시형태에 있어서, 본 개시의 입자는 비경구적으로 투여된다. 선택적으로, 입자는 하기 경로: 흡입, 국소 도포 및 주사 중 하나 이상을 통해 투여된다. 선택적으로, 주사는 하기 유형: 정맥 주사, 기관내 주사 또는 점적주입, 관절내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 및 근육내 주사 중 하나 이상이다.
일부 실시형태에 있어서, 입자(지질 나노입자(LNP)에 대해 정상적으로 발생하는 간-매개 혈액 청소율 촉진(ABC)을 억제 또는 감소시키는 이러한 PEG 비함유 입자의 경향을 고려할 때, 특히 PEG 비함유 핵산-지질 입자)는 멀티도스 요법의 구성요소이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본 개시의 PEG 비함유 핵산-지질 입자 및 의약적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
실시형태에 있어서, 의약 조성물은 피험체의 조직으로의 직접 주입용으로 제형화된다.
일부 실시형태에 있어서, 의약 조성물은 폐, 관절, 표피, 진피, 내피 및 혈액 조직 중 하나 이상의 조직에 투여된다.
소정 실시형태에 있어서, 의약 조성물은 폐 질환 또는 장애, 관절 질환 또는 장애, 염증성 질환 또는 장애, 및 표피 질환 또는 장애 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 피험체에게 투여된다.
선택적으로, 폐 질환 또는 장애는 폐암, 폐렴, 폐섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식, 기관지확장증, 사르코이드증, 폐고혈압, 폐기종, 알파-1 항트립신 결핍증, 아스페르길루스증, 세기관지염, 기관지염, 진폐증, 코로나 바이러스(예를 들면 SARS-CoV-2), 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군, 낭포성 섬유증, 레지오넬라증, 인플루엔자, 백일해, 폐색전증 및 결핵 중 하나 이상이다.
선택적으로, 관절 질환 또는 장애는 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및 골관절염 중 하나 이상이다.
선택적으로, 염증성 질환 또는 장애는 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상성 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 감염성 관절염, 감염후 관절염, 임균 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비관절염 류머티즘, 활액낭염, 고초열, 화농성 염증(예를 들면 테니스 엘보우), 신경병성 관절 질환, 혈관절증, 헤노호 쉰라인 자반증, 비후성 골관절염, 다발성 치질, 척추측만증, 혈색소침착증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지-폐 이형성증 및 전신 홍반성 루푸스(SLE) 중 하나 이상이다.
선택적으로, 표피 질환 또는 장애는 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 습진, 주사(rosacea), 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병, 일반 사마귀, 각화극세포종 및 지루각화증 중 하나 이상이다.
본 발명의 또 다른 양태는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 45몰%로 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 갖고, N/P 비율이 약 3인 핵산-지질 입자를 제공한다.
본 개시의 또 다른 양태는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 45몰%로 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 갖고, N/P 비율이 약 6인 핵산-지질 입자를 제공한다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않는다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 PEG를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하며, 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 포함되어 있다. 선택적으로, 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체이거나 또는 이를 포함한다. 선택적으로, PEG-지질 공액체의 PEG는 약 550달톤~약 3000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 선택적으로, PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이다. 선택적으로, PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함한다. 선택적으로, PEG2000-지질 공액체는 1.2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0몰%의 농도로 PEG-지질 공액체를 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 2.0%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, PEG-지질 공액체의 PEG는 약 550달톤∼약 3000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 선택적으로, PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이다. 선택적으로, PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 선택적으로, PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 2.0몰%의 농도로 PEG-지질 공액체를 포함한다.
본 개시의 추가 양태는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 50몰%로 1.2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질, 및 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 38몰%∼약 40몰%로 콜레스테롤 또는 그의 유도체를 갖는 핵산-지질 입자를 제공한다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않는다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 39.75몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2이다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 39.75몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3이다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 39.25몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3이다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 38.75몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3이다. 대안적인 관련 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 38.75몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2이다.
실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 38.25몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 4이다.
본 개시의 또 다른 양태는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 25몰%로 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질, 및 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 63몰%∼약 65몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 갖는 핵산-지질 입자를 제공한다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않고, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 64.75몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3이다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 64.25몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 4이다.
실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 63.75몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 4이다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 63.25몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2이다.
본 개시의 추가 양태는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 75몰%로 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질, 및 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 13몰%∼약 15몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 갖는 핵산-지질 입자를 제공한다.
소정 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않고, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 14.75몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 4이다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 14.25몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2이다.
실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 13.75몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2이다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 PEG-지질 공액체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 13.25몰%로 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다. 선택적으로, 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3이다.
소정 실시형태에 있어서, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비이온성 지질은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 β-시토스테롤. 선택적으로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본 개시의 핵산-지질 입자, 의약 조성물, 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
본 개시의 또 다른 양태는 본 개시의 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG 비함유 지질-핵산 입자, 또는 주사제를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 폐 조직에 핵산 카고를 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 피험체의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 개시의 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG 비함유 지질-핵산 입자, 또는 주사제를 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG 비함유 지질-핵산 입자, 또는 주사제는 정맥 내로 투여되고, 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현은 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및/또는 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 2배 더 높은 레벨로 발생한다. 선택적으로, 피험체의 폐 조직 세포에서의 핵산 카고의 발현은 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 3배 더 높고, 선택적으로 적어도 4배 더 높고, 선택적으로 적어도 5배 더 높고, 선택적으로 적어도 6배 더 높고, 선택적으로 적어도 7배 더 높고, 선택적으로 적어도 8배 더 높고, 선택적으로 적어도 9배 더 높고, 선택적으로 적어도 10배 더 높고, 선택적으로 적어도 11배 더 높고, 선택적으로 적어도 12배 더 높고, 선택적으로 적어도 13배 더 높고, 선택적으로 적어도 14배 더 높고, 선택적으로 적어도 15배 더 높고, 선택적으로 적어도 20배 더 높다.
일부 실시형태에 있어서, 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG 비함유 지질-핵산 입자, 또는 주사제는 정맥 내로 투여되고, 핵산-지질 입자 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자는 피험체의 폐 조직에 피험체의 하기 다른 조직: 심장, 비장, 난소 및 췌장 중 하나 이상에서의 핵산-지질 입자 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자의 농도보다 적어도 2배 더 높은 농도로 국소화된다. 선택적으로, 하기 피험체의 다른 조직: 심장, 비장, 난소 및 췌장 중 하나 이상에서의 핵산-지질 입자 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자의 농도와 비교하여, 적어도 3배, 선택적으로 적어도 4배, 선택적으로 적어도 5배, 선택적으로 적어도 6배 더 높은 농도의 핵산-지질 입자 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자가 폐에 존재한다.
정의
문맥으로부터 구체적으로 명시되거나 명백하지 않은 한, 본원에서 사용된 "약"이라는 용어는 당업자의 통상적인 허용 범위 이내, 예를 들면 평균의 2 표준편차 이내에 있는 것으로 이해된다. "약"은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다.
소정 실시형태에 있어서, "대략" 또는 "약"이라는 용어는 달리 명시되지 않거나 문맥에서 달리 명백하지 않은 한 명시된 기준값의 한쪽 방향으로(초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 이하 이내에 드는 값의 범위(가능한 값의 100%를 초과할 경우 제외)를 지칭한다.
문맥에서 달리 명확하지 않은 한, 여기에 제공된 모든 수치 값은 "약"이라는 용어로 수정된다.
"지질"이라는 용어는 지방산의 에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 유기 화합물의 군을 지칭하며, 물에는 불용성이지만, 다수의 유기 용매에는 가용성인 것을 특징으로 한다. 일반적으로 적어도 3개의 종류: (1) 지방과 오일뿐만 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질", (2) 인지질과 당지질을 포함하는 "복합 지질", (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질"로 분류된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "양이온성 지질"이라는 용어는 생리적 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 띠는 다수의 지질종 중 어느 하나를 지칭한다. 양이온성 지질은 1개, 2개, 3개 이상의 지방산 또는 지방 알킬쇄 및 pH 적정 가능한 아미노 헤드기(예를 들면 알킬아미노 또는 디알킬아미노 헤드기)를 갖는 지질 및 그 염을 포함한다. 양이온성 지질은 일반적으로 양이온성 지질의 pKa보다 낮은 pH에서 프로톤화(즉, 양으로 하전됨)되고, pKa보다 높은 pH에서는 실질적으로 중성이다. 본원의 설명의 양이온성 지질은 적정 가능한 양이온성 지질이라고도 할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 프로톤화 가능한 3차 아민(예를 들면, pH 적정 가능) 헤드기; 각 알킬쇄가 독립적으로 0∼3개(예를 들면, 0, 1, 2 또는 3개)의 이중 결합을 갖는 C18 알킬쇄; 및 헤드기와 알킬쇄 사이의 에테르, 에스테르 또는 케탈 연결을 포함한다. 이러한 양이온성 지질은 DOTAP, 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 1,2-디리놀레일옥시-케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA), 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA)(DLin-C2K-DMA, XTC2 및 C2K라고도 함), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트(DLin-M-C2-DMA)(MC2라고도 함), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-M-C3-DMA)(MC3라고도 함) 및 3-(디리놀레일메톡시)-N,N-디메틸프로판-1-아민(DLin-MP-DMA)(1-B11이라고도 함)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "DOTAP"는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 또는 18:1 TAP, 이중쇄 또는 제미니 양이온성(gemini cationic) 지질을 지칭한다.
DOTAP는 4쇄 구조로 인해 pH와 무관한 양으로 하전된 지질이다. 이것은 DNA, RNA 및 기타 음으로 하전된 분자의 리포솜-트랜스펙션용으로 상업적으로 판매되고 있다. 본 개시의 일부 양태에 있어서, DOTAP 지질 또는 그 변이체는 핵산을 폐에 특이적으로 전달하기 위해 지질 나노입자에 사용된다. 다른 양태에 있어서, DOTAP 지질 또는 그 변이체는 관절, 염증 부위, 표피 및 진피에 핵산을 전달하기 위해 지질 나노입자에 사용된다. DOTAP(C42H80NO4 +)의 구조는 이하와 같다:
본원에 사용되는 바와 같이, "비양이온성 지질"이라는 용어는 모든 음이온성 지질뿐만 아니라 모든 중성 지질을 지칭한다. "중성 지질"은 선택된 pH에서 미하전된 또는 중성의 쌍성이온성 형태로 존재하는 모든 다수의 지질종을 지칭한다. 생리적 pH에서 이러한 지질에는, 예를 들면 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고마이엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드 및 디아실글리세롤이 포함된다. "음이온성 지질"은 생리적 pH에서 음으로 하전된 모든 지질을 지칭한다. 이러한 지질에는 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 결합된 다른 음이온성 수식기가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 본 개시에서 사용되는 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다. 실시형태에 있어서, 비양이온성 지질은 콜레스테롤(CHE) 및/또는 β-시토스테롤이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "지질 나노입자"라는 용어는 나노스케일 입자의 상이한 유형의 조성물을 지칭하고, 여기서 지질을 포함하는 입자는 세포막 및 생물학적 배리어에 걸쳐 캐리어로서 기능하고, 인간 및 기타 유기체의 표적화된 세포 및 조직에 화합물을 전달한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 본 개시의 "지질 나노입자"는 추가적인 지질 및 기타 성분을 더 포함할 수 있다. 기타 지질은 지질 산화를 방지하거나 지질 나노입자 표면에 리간드를 부착하는 것과 같은 다양한 목적을 위해 포함될 수 있다. 본 개시의 지질 나노입자에는 양친매성, 중성, 양이온성 및 음이온성 지질을 포함한 임의의 다수의 지질이 존재할 수 있다. 이러한 지질은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있으며, 또한 폴리아미드 올리고머(예를 들면 미국특허번호 6,320,017 참조), 펩티드, 단백질, 세정제, 지질 유도체, 예를 들면 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG 및 세라미드에 공액된 PEG(예를 들면 미국특허번호 5,885,613 참조) 같은 2층 안정화 성분도 포함할 수도 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 입자의 응집을 억제하는 "PEG" 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체, 폴리아미드(ATTA)-지질 공액체, 및 이들의 혼합물 중 하나 이상을 지칭한다. 일 양태에 있어서, PEG-지질 공액체는 PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-인지질, PEG-세라미드, 및 이들의 혼합물 중 하나 이상이다. 일 양태에 있어서, PEG-DAG 공액체는 PEG-디라우로일글리세롤(C12), PEG-디미리스토일글리세롤(C14), PEG-디팔미토일글리세롤(C16), 및 PEG-디스테아로일글리세롤(C18) 중 하나 이상이다. 일 양태에 있어서, PEG-DAA 공액체는 PEG-디라우릴옥시프로필(C12), PEG-디미리스틸옥시프로필(C14), PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 및 PEG-디스테아릴옥시프로필(C18) 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에 있어서, PEG는 2-디미리스토일-rac-글리세롤-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(PEG-DMG) 및/또는 1,2-디스테아로일-rac-글리세롤-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(PEG-DSG)이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "N/P 비율"은 핵산의 양이온성 아미노지질과 음으로 하전된 포스페이트기 사이의 (N)질소와 (P)포스페이트의 비율을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "다분산성 지수" 또는 "PDI"는 크기에 기반한 샘플의 불균질성의 척도이다. 다분산성은 단리 또는 분석 중 샘플 또는 샘플의 집합체 또는 응집체에서의 크기 분포에 기인하여 발생할 수있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "제타 전위" 또는 "표면 전하"는 분산액에서 인접하고 유사하게 하전된 입자 사이의 정전기적 반발 정도를 지칭한다. 충분히 작은 분자 및 입자의 경우, 제타 전위가 높으면 안정성이 부여되고, 즉 용액 또는 분산액이 응집에 저항한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 핵산 "카고"라는 용어는 세포 또는 조직으로 전달하기 위한 의도된 치료용 핵산이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "핵산-지질 나노입자"라는 용어는 하나 이상의 치료용 핵산 카고를 조직에 전달하기 위해 하나 이상의 핵산과 결합하거나 또는 캡슐화되는 상술한 지질 나노입자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "캡슐화"는 핵산에 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 이온 또는 반데르발스 힘에 의한 결합, 또는 상술한 모든 것을 제공하는 핵산-지질 나노입자 제형을 지칭할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 핵산은 핵산-지질 나노입자 내에 완전히 캡슐화된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "핵산"은 합성 또는 자연적으로 발생하는 RNA 또는 DNA, 또는 이들의 유도체를 지칭한다. 일 실시형태에 있어서, 본원 개시의 카고 및/또는 제제는 이중 가닥 RNA(dsRNA)와 같은 핵산이다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 또는 핵산 카고는 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드이다. 예를 들면, 이중 가닥 DNA는 구조적 유전자, 제어 및 종단 영역을 포함하는 유전자, 또는 바이러스 또는 플라스미드 DNA와 같은 자기 복제 시스템일 수 있다. 이중 가닥 RNA는, 예를 들면 dsRNA 또는 다른 RNA 간섭 시약일 수 있다. 단일 가닥 핵산은, 예를 들면, mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA, 또는 3겹-형성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 소정 실시형태에 있어서, 핵산 또는 핵산 카고는 수식된 RNA를 포함할 수 있으며, 여기서 수식된 RNA는 수식된 mRNA, 수식된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 수식된 siRNA 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 핵산 카고는 핵산 조절 컨트롤러를 인코딩하는 수식된 mRNA를 포함하거나 또는 수식된 mRNA이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "수식된 핵산"이라는 용어는, 이에 제한되지 않지만, 2'-O-메틸 수식 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 수식 뉴클레오티드, 5'-메톡시 수식 뉴클레오티드(예를 들면, 5'-메톡시우리딘), 2'-데옥시-수식 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식 뉴클레오티드, 2'-알킬-수식 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드; 포스포로티오에이트를 포함하는 인터뉴클레오시드 연결 또는 백본, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 인접한 뉴클레오시드 유닛의 쌍이 3'-5'에서 5'-3'으로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전된 극성을 갖는 것을 포함하는 군에서 선택는 것을 포함하는 임의의 비천연 핵산을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "핵산 조절 컨트롤러"라는 용어는 단백질 컨트롤러 구성요소를 인코딩하는 mRNA를 지칭하지만, "핵산 조절 컨트롤러"에 대한 언급은 또한 mRNA 발현 단백질 컨트롤러 구성요소 자체를 지칭할 수도 있다. 소정 실시형태에 있어서, mRNA 인코딩 단백질 컨트롤러 구성요소는 아연-핑거 단백질(ZFP) 또는 하나 이상의 후성유전학적 조절인자 또는 뉴클레아제와 연관된(및 선택적으로 이에 테더링된) 다른 형태의 DNA 또는 RNA 결합 도메인(DBD 또는 RBD)을 포함한다(후성 유전 조절인자 또는 뉴클레아제는 일반적으로 이펙터, 이펙터 도메인 또는 이펙터 모이어티라고 칭해짐). 이론에 얽매이고 싶지 않지만, 본원에 기재된 핵산 조절 컨트롤러의 이점은 (1) 핵산 조절 컨트롤러-인코딩 mRNA가 발현되는 개소, (2) ZFP 또는 다른 핵산 결합 도메인의 핵산 결합이 발생하는 개소, 및 (3) 관련 이펙터 도메인이 활성을 발휘할 수 있는 개소(즉, 이펙터 도메인이 후성유전체(epigenomic) 상태를 변화시킬 수 있는 개소(예를 들면, 후성유전체 컨트롤러의 경우))의 합류점에서만 영속성의 유전자 프로그래밍을 제공한다는 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "이펙터 모이어티" 또는 "이펙터 도메인"이라는 용어는 세포의 적절한 부위, 예를 들면 세포의 핵에 국소화되었을 때 표적 유전자의 발현을 변화시킬 수 있는 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 이펙터 모이어티는 전사 메커니즘의 구성요소를 모집한다. 일부 실시형태에 있어서, 이펙터 모이어티는 전사 인자 또는 발현 억제 인자의 구성요소의 모집을 억제한다. 일부 실시형태에 있어서, 이펙터 모이어티는 후성유전학적 수식 모이어티(예를 들면 표적 DNA 서열을 후성유전적으로 수식함)을 포함한다. 이펙터 모이어티의 구체적 예로는, 제한되지는 않지만, 특히 크루펠 연관 박스(Krueppel-associated box, KRAB) 도메인(KRAB는 진핵생물 크루펠형 C2H2 징크 핑거 단백질(ZFP)의 약 1/3의 N-말단 부분에서 발견되는 약 75 아미노산의 도메인)을 결합할 수 있는 이펙터, 및 조작된 원핵생물 DNA 메틸기전이효소 MQ1을 들 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "후성유전학적 수식 모이어티"는 후성유전학적 수식 모이어티가 핵산에 적절히 국소화되는(예를 들면 표적화 모이어티에 의해) 경우, i) 크로마틴의 구조, 예를 들면 2차원 구조; 및/또는 ii) 후성유전학적 마커(예를 들면, DNA 메틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 아세틸화, 히스톤 수모일화, 히스톤 인산화, 및 RNA 연관 사일런싱 중 하나 이상)을 변경하는 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 후성유전학적 수식 모이어티는 하나 이상의 후성유전학적 마커에 영향을 미치는(예를 들면, 레벨을 증가 또는 감소시키는) 효소 또는 그 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 후성유전학적 수식 모이어티는 DNA 메틸기전이효소, 히스톤 메틸기전이효소, CREB 결합 단백질(CBP) 또는 이들 중 어느 하나의 기능적 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 조절 서열"이라는 용어는 유전자의 전사를 증가 또는 감소시키는 핵산 서열을 지칭하며, 프로모터 및 인핸서를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "인핸싱 서열(enhancing sequence)"은 발현 조절 서열의 하위유형을 지칭하며, 유전자 전사의 가능성을 증가시킨다. "사일런싱 또는 억제자 서열(silencing or repressor sequence)"은 발현 조절 서열의 하위유형을 지칭하며, 유전자 전사의 가능성을 감소시킨다.
본원에 사용되는 바와 같이, "발현 억제자"라는 용어는 세포에서 표적 유전자의 발현을 감소시키고, 또한 DNA 서열(예를 들면 표적 유전자 또는 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 전사 조절 요소와 관련된 DNA 서열)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 기능을 가진 제제 또는 엔티티를 지칭한다. 소정 실시형태에 있어서, 발현 억제자는 적어도 하나의 표적화 모이어티 및 선택적으로 하나의 이펙터 모이어티를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "표적화 모이어티"라는 용어는 게놈 서열 요소(예를 들면 발현 조절 서열 또는 앵커 서열; 프로모터, 인핸서 또는 CTCF 부위)를 특이적으로 표적으로 하는, 예를 들면 결합하는 제제 또는 엔티티를 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 게놈 서열 요소는 표적 유전자(예를 들면 MYC)의 근위부이고 및/또는 표적 유전자(예를 들면 MYC)에 작동 가능하게 연결된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 경우, "폐 조직"은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상피, 내피, 간질 결합 조직, 혈관, 조혈 조직, 림프 조직 및 흉막을 포함하는 군을 포함하는 폐의 기관 내의 임의의 세포를 지칭할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 핵산-지질 나노입자는 폐 조직을 표적으로 한다. 일부 다른 실시형태에 있어서, 핵산-지질 나노입자는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 뇌, 신경, 피부, 눈, 인두, 후두, 심장, 혈관, 조혈(예를 들면 백혈구 또는 적혈구), 유방, 간, 췌장, 비장, 식도, 담낭, 위, 장, 결장, 신장, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 근육, 뼈, 갑상선, 부갑상선, 부신, 및 뇌하수체 세포 또는 조직을 포함하는 다른 세포 또는 조직을 표적으로 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "국소화"는 유기체 및/또는 조직 내에서 지질, 펩티드 또는 본 개시의 지질 입자의 다른 구성요소의 위치를 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 국소화는 개별 세포에서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 라벨은 국소화를 검출하기 위해 사용될 수 있는데, 예를 들면 형광 라벨, 선택적으로 형광 라벨링된 지질, 선택적으로 Cy7이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 지질 나노입자의 라벨은 양자점, 또는 유도 라만 산란(stimulated Raman scattering)에 의해 검출 가능한 지질일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 라벨은 당업자에게 공지된 임의의 형광체, 즉 자외선, 가시광선 또는 적외선 스펙트럼에서 여기 및 방출을 갖는 형광체이다. 일부 실시형태에 있어서, 국소화는 면역조직화학법 또는 면역 형광에 의해 검출되거나 또는 추가로 입증된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "활성"이라는 용어는 본 개시의 구성요소 또는 조성물에 의해 매개되는 임의의 검출 가능한 효과를 지칭한다. 실시형태에 있어서, 본원에 사용되는 바와 같은 "활성"은, 예를 들면 본 개시의 본 지질 입자 카고의 측정 가능한(직접적이든 대리적이든 상관없이) 효과를 지칭할 수 있다. 활성의 예로는, 이에 제한되지 않지만, 예를 들면 선택적으로 세포, 조직, 장기 및/또는 유기체적 레벨로 측정될 수 있는 핵산 카고(예를 들면 mRNA, CRISPR/Cas 시스템, RNAi 제제, 핵산 조절 컨트롤러 등)의 세포 내 발현 및 그에 따른 효과(들)를 들 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "혈액 청소율 촉진" 또는 "ABC"는 LNP의 표면 상의 PEG 분자에 대한 면역 체계 활성화에 의해 유발되는 충분히 잘 알려진 현상을 지칭한다. ABC는 반복 투여에 따른 체순환으로부터 나노입자의 제거에 관여한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 지질 입자는 PEG 비포함 제형을 채용함으로써 지질 입자의 혈액 청소율 촉진을 회피 또는 감소시킬 수 있으며, 이는 또한 이러한 지질 입자의 개선된(예를 들면, 더욱 낮은 독성 및/또는 더욱 효과적인) 반복적인 전신 투여를 제공할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "멀티도우징(multidosing)"은 피험체에 대한 치료 요법의 일부로서, 투여되는 지질 나노입자 제형의 2회 이상의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "폐 질환 또는 장애"라는 용어는, 이에 제한되지 않지만, 폐암, 폐렴, 폐섬유증, COPD, 천식, 기관지확장증, 사르코이드증, 폐고혈압, 폐기종, 알파-1 항트립신 결핍증, 아스페르길루스증, 세기관지염, 기관지염, 진폐증, 코로나 바이러스, 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군, 낭포성 섬유증, 레지오넬라증, 인플루엔자, 백일해, 폐색전증 및 결핵에서 선택되는 질환 또는 장애를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "관절 질환 또는 장애"는, 이에 제한되지 않지만, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및 골관절염에서 선택된 질환 또는 장애를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "염증성 질환 또는 장애"는, 이에 제한되지 않지만, 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상성 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 감염성 관절염, 감염후 관절염, 임균 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비관절염 류머티즘, 활액낭염, 고초열, 화농성 염증(예를 들면 테니스 엘보우), 신경병성 관절 질환, 혈관절증, 헤노호 쉰라인 자반증, 비후성 골관절염, 다발성 치질, 척추측만증, 혈색소침착증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지-폐 이형성증 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)에서 선택된 질환 또는 장애를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "표피 질환 또는 장애"는, 이에 제한되지 않지만, 건선, 아토피성 피부염, 강피증, 습진, 주사, 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병, 일반 사마귀, 각화극 세포종 및 지루각화증에서 선택되는 질환 또는 장애를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "피험체"라는 용어는 인간 및 포유류(예를 들면 마우스, 래트, 돼지, 고양이, 개 및 말)를 포함한다. 다수의 실시형태에 있어서, 피험체는 포유류, 특히 영장류, 특히 인간이다. 일부 실시형태에 있어서, 피험체는 소, 양, 염소, 젖소, 돼지 등과 같은 가축; 닭, 오리, 거위, 칠면조 등과 같은 가금류; 및 개 및 고양이와 같은 가축, 특히 반려동물이다. 일부 실시형태에 있어서(예를 들면, 특히 연구 맥락에서), 피험체 포유류는, 예를 들면 설치류(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류, 또는 근교계 돼지 등과 같은 돼지이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 피험체에 대한 "투여"는 선택적으로 정맥 주사, 흡입, 정맥내, 동맥내, 기관내, 국소를 위한 비경구 투여를 포함하거나, 또는 조직으로의 직접 주사를 포함할 수 있다.
"치료"라는 용어는 질환(예를 들면 종양 형성, 성장 및/또는 전이를 포함한 암)의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 발병을 예방 또는 지연시키고, 증상을 완화하거나 질환, 병태 또는 장애의 추가 진행을 중단 또는 억제하기 위한 조성물의 투여를 포함한다. 치료는 예방적(질환의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 또는 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하기 위한) 또는 질환 발현 후 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "의약 조성물"은 약리학적으로 유효한 양의 지질 입자, 선택적으로 핵산 지질 나노입자(NLNP) 및 의약적으로 허용 가능한 캐리어를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약리학적 유효량", "치료적 유효량" 또는 단순히 "유효량"은 의도한 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 데 유효한 핵산의 양을 지칭한다. 예를 들면, 특정 임상 치료가 질환 또는 장애와 관련된 측정 가능한 매개변수가 적어도 25% 감소할 때 효과적인 것으로 간주되는 경우, 해당 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료적 유효량은 해당 매개변수의적어도 25% 감소를 유도하는 데 필요한 양이다.
"의약적으로 허용 가능한 캐리어"라는 용어는 치료제를 투여하기 위한 캐리어를 지칭한다. 이러한 캐리어에는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
문맥에서 구체적으로 명시되거나 명백하지 않은 한, 본원에서 사용된 "또는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 이해된다. 문맥에서 특별히 명시되거나 명백하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 "a", "an" 및 "the"라는 용어는 단수 또는 복수로 이해된다.
범위는 본 명세서에서 하나의 "약" 특정 값으로부터 및/또는 "약" 다른 특정 값까지와 같이 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 마찬가지로, 값이 근사치로 표현될 때, 선행사 "약"을 사용함으로써, 특정 값이 다른 양태를 형성하는 것으로 이해된다. 또한, 각 범위의 끝점은 다른 끝점과 관련하여 또한 다른 끝점과 독립적으로 모두 유의하다는 것이 이해된다. 또한, 본원에 개시된 다수의 값이 있으며, 또한 각 값은 값 자체에 추가하여 "약" 해당 특정 값으로서 본원에 개시된다는 것은 이해된다. 또한, 본 출원 전반에 걸쳐 데이터가 다수의 상이한 형식으로 제공되며, 또한 이러한 데이터는 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 끝점과 시작점 및 범위를 나타낸다는 것은 이해된다. 예를 들면, 특정 데이터 포인트 "10"과 특정 데이터 포인트 "15"가 개시된 경우, 10과 15 사이뿐만 아니라 10 및 15 초과, 10 및 15 이상, 10 및 15 미만, 10 및 15 이하, 10 및 15와 동등한 것도 개시된 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 또한, 2개의 특정 단위 사이의 각 단위도 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들면, 10과 15가 개시되면, 11, 12, 13, 14도 개시된다.
본원에 제공된 범위는 그 범위 내의 모든 값에 대해 약기로 이해된다. 예를 들면, 1~50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군에서의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위 범위뿐만 아니라, 예를 들면 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9와 같은 상기 정수 사이에 있는 모든 소수값을 포함하는 것으로 이해된다. 하위 범위의 경우, 범위의 끝점 중 하나에서 확장되는 "중첩된 하위 범위"가 특별히 고려된다. 예를 들면, 1∼50의 예시적인 범위의 중첩된 하위 범위는 한 방향으로 1∼10, 1∼20, 1∼30, 및 1∼40, 또는 다른 방향으로 50∼40, 50∼30, 50∼20, 및 50∼10을 포함할 수 있다.
"포함하는(inclucing)", "함유하는(containing), 또는 "~을 특징으로 하는"과 동의어인 과도적 용어 "포함하는(comprising)"는 포괄형 또는 개방형이며, 추가적이고 열거되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하는 것은 아니다. 반면에, "~으로 이루어진"이라는 과도적 표현은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "~로 본질적으로 이루어진"이라는 과도적 표현은 청구범위의 범위를 청구된 발명의 구체적인 재료 또는 단계, 및 "기본적이고 신규한 특징(들)에 중대한 영향을 미치지 않는 것들"을 한정한다.
이하에 기재되고 청구범위에 열거된 실시형태는 상기 정의를 고려하여 이해될 수 있다.
본 개시의 다른 특징 및 장점은 그 바람직한 실시형태의 이하의 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 특별히 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시의 실시 또는 테스트에서 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 재료를 사용할 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 이하에 기재되어 있다. 본원에서 인용하는 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 참조로 본원에 포함된다. 본원에서 인용한 다른 모든 공개된 참조문헌, 문헌, 원고 및 학술문헌은 참조로 본원에 포함된다. 상충이 발생할 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한을 의도하지 않는다.
하기 상세한 설명은 예로서 제공되지만, 본 발명을 기재된 소정 실시형태에만 제한하고자 하는 것은 아니며, 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1a 및 1b는 DOTAP 지질 나노입자(LNP)가 리포터 mRNA 카고를 전달하고, 시험관 내에서 낮은 독성을 나타낸다는 것을 도시한다. 도 1a는 표시된 카고 mRNA mFluc(루시페라아제) 농도 범위에 걸쳐 마우스 세포주(Hepa 1-6)에서 시험한 4개의 DOTAP LNP 제형의 관찰된 루시페라아제 효소 활성을 도시한다. 놀랍게도, 0.625㎍/㎖, 1.25㎍/㎖, 2.5㎍/㎖의 농도에서 PEG 비함유 제형(0% PEG)에서 루시페라아제 활성의 약 600배의 증가가 달성되었다. 카고 mRNA 활성의 용량 의존성은 검사된 모든 LNP 제형에서 관찰되었으며, mFluc(루시페라아제) 카고의 전달 및 발현의 점진적 증가 레벨은 테스트한 PEG 함유 LNP 제형에서도 관찰되었다. 도 1b는 Hepa 1-6 세포 생존율에 대한 테스트한 DOTAP-LNP의 고농도의 영향을 도시하며, PEG 비함유 DOTAP LNP의 경우 강건한 생존율이 관찰되었고, 테스트한 PEG 함유 NP:6PEG:1 LNP 제형의 농도가 증가한 경우 생존율이 약간만 감소했다.
도 2a-2f는 리포터 mRNA를 카고로 사용하여 제형화된 LNP를 정맥 내로 투여했을 때 DOTAP 지질 나노입자(LNP)는 처치된 마우스의 폐에 견고하게 국소화되어 mRNA 카고를 발현했음을 도시한다. 도 2a는 테스트한 2개의 상이한 DOTAP LNP, NP:3PEG:0 및 NP:3PEG:1(표 1에도 나타냄)이 마우스 폐에서 농축된 루시페라아제 활성을 나타냈고, 관찰된 효과가 24시간 동안 지속되었음을 도시한다. 도 2b는 처치된 마우스에서 채취한 주요 장기에 대한 생체외 발광 및 형광 이미징의 결과를 도시한다. Cy7 신호 분포는 LNP의 체내분포를 나타내는 한편, 발광 신호는 리포터 mRNA 카고 발현 및 활성을 나타낸다. 주목할 만한 점은, DOTAP-LNP가 다수의 조직에 잘 분포되어 있어도, 카고 mRNA 발현의 폐 레벨은 특히 견고했다. 도 2c는 채취한 마우스 장기에서 관찰된 Cy7-DOPE 지질 발광 체내분포 신호의 정량화를 도시한다. 도 2d는 마우스 장기에서 mFluc mRNA의 발현으로부터의 발광 신호의 정량화를 도시하고-구체적으로, 장기 내 루시페라아제 활성의 관찰된 백분율 분포를 도시하고, 백분율 값은 모든 장기로부터 나온 신호의 총합계를 사용함으로써 계산한 다음, 총 값에 대응하는 개별 장기의 백분율 신호를 계산한다. 이것에 의해, DOTAP-LNP의 폐에 대한 강한 특이성(활성의 >90%가 폐에 국소화됨)이 입증되었다. 도 2e는 폐로부터 수집한 신호를 직접 활성의 대표적인 판독값으로 표시하기 위해, 폐의 루시페라아제 활성 값을 평균 복사휘도(Average Radiance)로 도시한다. 주목할 만한 점은, 0% PEG를 함유한 DOTAP-LNP가 1% PEG를 함유한 DOTAP-LNP보다 폐에서 약 50배 더 높은 mRNA 발현(루시페라아제 활성)을 나타냈다는 점이다. 도 2f는 DOTAP-LNP가 정맥 주사를 통해 마우스에 투여했을 때, 유의한 체중 변화를 일으키지 않았음을 도시한다. 도 2g는 DOTAP-LNP 투여 후 알칼리성 포스파타아제(ALP), 아스파르테이트 트랜스아미나제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스페라제(AST)에 대한 간 기능 검사가 PBS 대조군-처치 동물과 비교하여 유의한 상승을 나타내지 않았음을 도시한다.
도 3a-3g는 테스트된 모든 PEG-지질 화학적 성질을 가진 DOTAP-LNP의 경우, DOTAP-LNP의 폐 선택적 국소화 및 관련 mRNA 카고 발현이 관찰되었음을 도시한다. 도 3a는 PEG 지질 유형에 관계없이, 24, 48 및 72시간 시점에서 주사한 피험체 마우스의 폐에서 mRNA 카고-지향적 루시페라아제 활성이 우선적으로 발생했음을 도시한다. PEG-DSG 제형과 PEG-DMG 제형 모두 광범위한 LNP의 분포를 나타냈고, 신장은 LNP 축적의 주요 장기였다. 이들 결과는 신장이 LNP의 주요 배설 경로라는 것을 뒷받침한다. 하단에서, 특정 장기로부터의 높은 신호가 다른 장기로부터의 낮지만 여전히 유의한 신호를 마스킹할 수 있기 때문에, 폐는 생체발광 복사휘도의 생체외 평가에서 제거했고, 나머지 장기를 재이미징하여 더 높은 신호 대 바탕비의 루시페라아제 복사휘도를 얻었다. 도 3b는 Cy7 지질 이미징 결과의 정량화를 도시하고, 이는 신장이 LNP 축적의 주요 장기임을 입증했다(신장에서 유의한 mRNA 카고 발현이 관찰되지 않았음에도 불구하고). 도 3c는 DOTAP-LNP의 PEG-DSG 제형 및 PEG-DMG 제형 모두에 대한 mRNA 리포터 mFluc 발광의 정량화를 도시하고, 이것은 두 제형 모두의 경우에 대해 모든 시점에 걸쳐, 폐에서 DOTAP-LNP 전달 매개 mRNA 카고 발현이 거의 100% 발생했음을 입증했다. 도 3d는 PEG-DSG 지질 또는 PEG-DMG 지질과 함께 DOTAP-LNP를 투여한 후 유의한 체중 변화가 관찰되지 않았음을 도시한다. 도 3e는 간 기능 검사로서 알칼리성 포스파타아제(ALP)가 투여 후(24, 48, 72시간 시점) 두 PEG-지질 DOTAP LNP 제형 모두에 대해 안정적으로 유지되었음을 도시한다. 도 3f는 간 기능 검사로서 아스파르테이트 트랜스아미나제 트랜스페라제(ALT)도 투여 후(24시간, 48시간, 72시간 시점) 두 PEG-지질 DOTAP LNP 제형 모두에 대해 안정적으로 유지되었음을 도시한다. 마찬가지로, 도 3g는 간 기능 검사로서 아스파르테이트 아미노트랜스페라제(AST)가 투여 후(24시간, 48시간, 72시간 시점) 두 PEG-지질 DOTAP LNP 제형 모두에 대해 안정적으로 유지되었음을 도시한다.
도 4a-4c는 DOTAP-LNP가 세포에 핵산 카고로서 Cre mRNA 리포터 시스템을 성공적으로 전달했음을 입증한다. 도 4a는 HEK293-loxP-GFP-RFP 세포주와의 테스트된 DOTAP-LNP의 용량 의존적 세포 연관성을 도시한다. 이 세포주는 GFP 신호를 안정적으로 발현했지만, 세포에서 Cre 리콤비나아제의 발현시, loxP 재조합으로 인해 세포가 GFP 대신 RFP를 발현하기 시작했다. 도 4b는 Cre mRNA 리포터 시스템을 하버링하는(harboring) DOTAP-LNP로 HEK293-loxP-GFP-RFP 세포주를 처리한 후, 성공적으로 트랜스펙션된 세포가 GFP 대신에 RFP를 발현했음을 입증하는 이미지를 도시한다. 도 4c는 유세포 분석법으로 mCre 활성이 확인되었으며, 이는 세포에서 GFP 신호가 감소되었음을 입증한다.
도 5a 및 5b는 DOTAP-LNP가 생체 내에서 폐 게놈을 표적으로 하는 핵산 카고를 전달하고 발현했음을 도시한다. 도 5a는 투여 후 48시간 및 72시간 후의 생체 외 장기의 이미징 결과를 도시한다. 두 시점에서의 생체 외 이미징은, 테스트된 DOTAP-LNP는 입자 분포(Cy7)에 관계없이 폐 특이적 활성(tdTomato)을 나타냈음을 입증했다. 도 5b는 이미징 연구로부터의 신호 정량화를 요약한 것이다. 그래프에서 볼 수 있듯이, 간과 폐 사이의 LNP의 분포(Cy7 복사휘도)가 거의 동일함에도 불구하고, mCre 활성(mCre 발현을 반영하는 tdTomato 복사휘도)은 폐에서만 관찰되었다(한 마리의 동물 이상치 제외).
도 6a-6c는 DOTAP-LNP가 염증이 있는 폐 조직을 포함한 폐 조직의 모든 세포 유형에 형질도입되었음을 도시한다. 도 6a는 Ail4 마우스(건강한 마우스)에서 채취한 심장, 폐, 간, 신장, 췌장 및 비장에서 관찰된 tdTomato 신호를 미처리, MC3 LNP 처리 및 DOTAP-LNP 처리 동물과 비교하여 도시한다. 1% PEG-DMG를 갖는 mCre mRNA 카고-로딩 DOTAP-LNP를 정맥 주사로 처치한 Ail4 동물의 폐는 강건한 폐 특이적 tdTomato 발현을 나타냈으며, 그 다음 면역조직화학법(IHC)으로 평가하여 상이한 세포 집단에서 tdTomato 발현 레벨을 평가했다. 도 6b는 건강한 DOTAP-LNP 투여 동물의 폐에서 tdTomato에 대한 조직학적 염색을 도시한다. 폐의 대식세포, 상피세포, 내피세포가 모두 카고 mRNA로 뚜렷하게 형질도입되어, DOTAP-LNP가 IV 투여 후 전구세포와 상피세포 모두에 형질도입되었음을 도시한다. 도 6c는 염증이 있는 폐를 가진 DOTAP-LNP 투여 마우스(NSG-SGM3 마우스)에 대한 면역조직화학법 염색된 조직 절편을 도시하고, 각각 (왼쪽으로부터 오른쪽으로) tdTomato 면역조직화학법(전달용 마커로서 DOTAP-LNP 전달 mCre mRNA 발현), 마우스 CD45와의 tdTomato의 이중 면역조직화학법(화살표로 표시된 상피, 폐포 세포 및 CD45+ 세포(단핵구, 호중구)), 인간 CD45와의 tdTomato의 이중 면역조직화학법(화살표로 표시된 상피, 폐포 세포 및 CD45+ 세포(단핵구, 호중구)), 인간 CD68과의 tdTomato의 이중 면역조직화학법(화살표로 표시된 대식세포 및 폐포 세포), 및 호중구 엘라스타아제와의 tdTomato의 이중 면역조직화학법(화살표로 표시된 대식세포 및 호중구)을 도시한다.
도 7a-7e는 상이한 DOTAP-LNP 제형이 개선된 폐로의 핵산 카고 전달을 나타냈음을 도시한다. 도 7a는 본 개시의 3450 및 4750 제형 모두 폐에서만 활성을 나타냈음을 도시한다. 두 제형 모두 PEG 미함유이다(0몰% PEG 함유). 하단의 요약에 표시된 바와 같이, 3450 제형은 45몰% DOTAP를 갖고, 4750 제형은 75몰% DOTAP를 갖는다. 도 7b는 테스트된 마우스 중에서 폐, 간, 심장 및 비장에서 관찰된 평균 tdTomato 신호 레벨이 테스트된 두 제형 사이에서 크게 다르지 않았음을 도시한다. tdTomato 신호 생성은 용량 의존적이지 않았고, 항상 온 또는 오프(on-or-off)로 기재될 수 있다. 도 7c는 각 마우스에서 폐, 간, 심장 및 비장에서 발견된 tdTomato 신호의 백분율을 도시하고, 두 제형 모두에서 거의 100%의 tdTomato 발현이 폐에서 이루어졌음을 입증한다. 도 7d는 3450 및 4750 제형을 투여한 마우스 사이의 폐, 간, 심장 및 비장에서의 평균 Cy7(LNP 국소화) 신호를 도시한다. 도 7e는 3450 및 4750 제형을 투여한 마우스의 폐, 간, 심장 및 비장에서 Cy7 복사휘도(LNP 국소화)의 평균 백분율 분포를 도시한다. 주목할 만한 점은, 4750 제형이 3450 제형보다 폐 조직으로 더 높은 레벨의 LNP를 전달했다.
도 8은 무릎으로의 핵산 카고의 효율적인 국소 세포내 전달을 위해 관절내 주사를 통해 DOTAP-LNP가 투여될 수도 있음을 도시한다. 처치된 마우스와 래트의 무릎에서의 mFluc 및 mCre 리포터 시스템의 활성을 도시하고, 이는 국소 조직 영역에 주사된 DOTAP-LNP에 의해 전달된 mRNA 카고 리포터 시스템의 성공적인 발현 및 통합을 입증했다.
도 9a와 9b는 카고-로딩 DOTAP-LNP의 기관내(intratracheal) 투여에 의해, 폐 조직으로 핵산 카고가 성공적으로 전달되게 되었음을 도시한다. 도 9a는 기관내(국소) 주입을 통해 투여했을 때 건강한(Ail4 야생형) 마우스에서, DOTAP-LNP의 폐로의 국소적 전달이 관찰되었음을 도시한다. 투여 후 6시간, 24시간, 및 48시간에서의 시간 의존적 이미징은 투여 후 6시간 정도의 초기에 처치된 피험체의 폐 및 기관에서 mCre-로딩 DOTAP-LNP의 국소 투여가 카고 핵산 발현 매개 효과를 나타내기 시작했음을 나타냈다. 또한, 처치된 피험체의 비장 또는 간에서는 표적외(off-target) 효과가 관찰되지 않았다. 도 9b는, 투여 후 6시간 정도의 초기에서도 기관내(국소) 주입을 통해 mCre mRNA 카고-로딩 DOTAP-LNP가 키 세포 유형에 접근했음을 나타내는 면역조직화학법 염색된 폐 조직 절편을 도시한다. 이러한 폐 조직 절편에 있어서, 대식세포, 내피세포 및 상피세포는 화살표로 표시된다. 이러한 결과는, 예를 들면 기도 관련 세포 활성이 필요로 되는 임상 사례에 있어서, 핵산 카고를 폐에 국소 투여하기 위해 PEG 비함유 DOTAP-LNP가 성공적으로 사용될 수 있었음을 입증했다.
본 개시는, 적어도 부분적으로는, 지질 입자 관련 분자 카고를 피험체의 세포에 전달하기 위한 지질 입자 조성물, 제형 및 관련 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 피험체의 폐에 관련 핵산 카고를 우선적으로 국소화하고 전달하여, 피험체의 폐 내의 다양한 유형의 조직으로 전달을 발생시키는 핵산 지질 나노입자가 제공된다. 잘 알려진 4급 아미노 지질인 DOTAP는, 전신 또는 국소 투여 시, 이론에 구속되고 싶지 않지만, 본원에 개시된 LNP 벡터의 트로피즘이 본 개시의 LNP에 추가적인 활성화 표적 구성요소를 필요로 하지 않고 폐로 특이적으로 이동시키는 것으로 보이는 본원에 개시된 지질 나노입자(LNP)의 구조적 구성요소이다. 또한, 전신 투여(IV) 시 핵산 카고의 효과적인 전달, 특히 다양한 리포터 mRNA의 발현을 매개하는 데 있어서 폐 조직에 대한 DOTAP의 놀라운 구조적 친화성이 본원에서 입증되었다.
본 개시의 형광 라벨링된 DOTAP LNP는 주입된 피험체의 폐뿐만 아니라 간에도 전체 LNP의 최대 25~40%까지 축적되는 것으로 관찰되었지만, mRNA 카고의 단백질로의 번역(따라서 세포 내 활성)은 본원에 개시되는 테스트된 DOTAP-LNP의 표면 전하 크기와 무관한 것이 확인된 방법에서는 폐 조직에서만 관찰되었다. 폐 조직의 면역조직화학법(IHC) 평가에서도 본 개시의 DOTAP LNP를 사용한 mRNA 카고의 폐 조직 내에서의 내피세포, 상피세포, 섬유아세포 및 대식세포 전달이 입증되었다. 더욱이, 지질 제형에서 PEG를 완전히 제거하면서, 본 개시의 효과적인 DOTAP계 LNP를 제조할 수 있으며, 이는 LNP 캡슐화 치료제에 대한 소정의 생체 내 이점을 제공한다. 이론에 구속되고 싶지 않지만, DOTAP의 높은 양전하는 입체 안정화 없이 정전기 안정화를 통해 입자를 안정화시키기에 충분한 것으로 확인되었다. 제형에서 PEG를 회피할 수 있는 능력은 본 개시의 지질 입자의 또 다른 주목할 만한 놀라운 효과이고, 즉 PEG 비함유 조성물을 사용하면 신체의 면역계가 LNP 표면의 PEG 분자에 대해 활성화됨으로써 야기되는 잘 알려진 현상인 혈액 청소율 촉진(ABC) 효과를 회피하게 한다. ABC는 반복 투여 시 체순환으로부터 나노입자를 제거하는 것을 담당한다. 따라서, 소정 실시형태에 있어서, 본 개시는 안정화 지질로서 DOTAP를 사용하여 LNP의 반복적인 전신 투여를 유의하게 가능하게 하고/촉진시킨다.
핵산 요법은 유전자 레벨에서 질환을 치료할 수 있는 잘 알려진 엄청난 잠재력을 가지고 있다. 그러나, 핵산 치료제는 안전하고 효과적인 전달 시스템이 필수적이다. 장기와 조직에 대한 비특이적 전달은 종종 오프사이트 효과와 독성을 초래한다. 관심 있는 특정 장기에 치료제를 전달하는 것은 지질 나노입자의 개발뿐만 아니라 일반적으로 약물 개발에서 잘 알려진 요구사항이다. 신체의 다른 부분을 손상시키지 않고 질환의 원인만을 표적화하는 개념은 120년 전에 에를리히에 의해 설명되었다. 그러나, 현존하는 방법은 추가적인 리간드 기반 표적화 전략을 도입하지 않고 특정 조직을 표적화하는 나노입자를 개발하기 위해 규정된 또는 잘 알려진 방법론은 제공하지 않는다. 그러므로, 본원에 개시된 바와 같이, 조직에 대한 지질의 구조적 친화성에 기반한 지질 나노입자의 장기 특이적 표적화는 오프사이트 효과 및 독성을 감소시키는 관점에서 잘 확립된 요구사항을 충족시킨다.
폐는 유전자 치료를 위한 주요 표적 장기 중 하나이다. 호흡기 관련 질환을 효과적으로 치료하기 위해서는 다른 장기에서의 활성을 회피함으로써 폐에만 특이적으로 전달하는 것이 필수적이다. 본 개시는 잘 알려진 4차 아미노 지질인 DOTAP을 포함함으로써, LNP에 활성 표적화 구성요소 없이도 벡터의 트로피즘을 폐로 특이적으로 이동시킨다는 것을 입증한다.
LNP의 페길화(PEGylation)는 증가된 입자 안정성(시험관 내 및 생체 내 모두)을 부여하는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 개시는 핵산 카고의 세포 내 전달 및 활성에 완전히 효과적인, 제형에서 PEG 없이 제조된 DOTAP계 LNP의 예시적인 조성물을 제공한다.
DOTAP는 rm 4차 아미노 구조로 인해 주변 환경의 pH와 무관하게 양으로 하전된 지질이다. 이는 DOTAP를 주성분으로 하여 제조된 LNP의 전체 양전하에 기여한다. 본 기술의 현재 상황은 폐로의 나노입자 전달이 지질 나노입자의 높은 양의 표면 전하에 의존한다고 알려져 있지만, PEG를 도입하면 제형에 따라 표면 전하를 중성 레벨에 가깝게 또는 음의 레벨로까지 낮출 수 있다. 이론에 구속되고 싶지 않지만, DOTAP는, 단지 LNP의 표면 전하에의 그 기여에 의한 것이 아니라, 그 구조적 특성으로 인해 폐 조직에 의해 선택적으로 흡수되는 LNP 구성요소라는 가설이 확립되어 있다.
DOTAP LNP 입자 크기와 표면 전하는 제형의 N/P(N-to-P) 비율 또는 몰 조성을 변경함으로써 미세 조정될 수 있다. 따라서, 특정 물리화학적 특성을 가진 광범위한 입자는 흡입, 정맥내 또는 관절내 전달에 의한 국소 전달을 포함한 복수의 용도를 위해 제조될 수 있다. 마찬가지로, DOTAP는 본 개시의 LNP에서 핵산 캡슐화를 위한 유일한 양이온성 지질로서 사용될 수 있다.
지질 나노입자는 대부분의 혈관 내에 존재하는 연속적인 내피 내층에 걸쳐 일혈할 수 없게 하기 때문에, 혈액 구획 내에 유지되는 경향이 있다. 그러나, 질환 부위에서는 혈관이 누설되어, 지질 나노입자가 간극 공간으로 유출 및 축적되게 할 수 있다. 예를 들면, 종양에서는 미성숙한 신생혈관에 적절한 크기의 지질 나노입자가 혈관 밖으로 빠져나가게 할 수 있는 공극 또는 결손이 나타나는 경향이 있다(Yuan et al., Cancer Research 54: 3352-3356, 1994). 마찬가지로, 감염 부위나 염증 부위에서는, 내피 투과성 배리어가 손상되어, 지질 나노입자가 이들 부위에 축적되게 할 수 있다. 이와는 대조적으로, 대부분의 정상적이고 건강한 조직에 존재하는 혈관은 연속한 내피 내층을 갖는 경향이 있다. 따라서, 지질 나노입자 전달은 이러한 영역에 대한 약물 노출을 줄일 수 있다. 단, 유창 모세혈관이 존재하는 간과 비장과 같은 단핵 식세포계(MPS)의 장기는 예외이다. DOTAP LNP는 폐 조직에 선택적으로 카고를 전달하는 것으로 확인되었지만, 일부 양태에서는 본 개시의 DOTAP LNP 또는 그 변이체를 사용하여 관절, 염증 부위 또는 간과 같은 누설 또는 유창 모세혈관의 부위로 전달하는 것도 고려되고 있다.
본 개시의 특정 조성물 및 방법의 명시적으로 고려되는 다양한 구성요소가 이하에 추가로 상세히 고려된다.
DOTAP계 지질 나노입자 조성물
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판, DOTAP 또는 18:1 TAP는 양이온성 지질이다. DOTAP는 4차 구조로 인해 pH와 무관하게 양이온으로 하전된다. DOTAP(C42H80N04 +)의 구조는 이하와 같다:
본 개시의 지질 나노입자의 소정 실시형태 및 본 개시의 관련 방법에 있어서, 본 개시의 지질 나노입자 중에 존재하는 총 인지질의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 100%(몰 기준)는 DOTAP이다. 본 개시의 지질 나노입자 및 본 개시의 관련 방법의 소정 실시형태에 있어서, 총 지질의 적어도 약 0.1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 80%(몰 기준)는 콜레스테롤이다. 소정 실시형태에 있어서, 총 지질의 적어도 약 0.1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 80%(몰 기준)는 다른 비이온성 지질, 예를 들면 DOPC, DSPC 및/또는 DOPE이다.
본 개시에 따른 임의의 크기의 지질 나노입자가 사용될 수 있다. 본 개시의 소정 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 직경이 약 0.02미크론∼약 0.4미크론, 약 0.05∼약 0.2미크론, 또는 0.07∼0.12미크론 범위의 크기를 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, LNP는 또한, 이에 한정되지 않지만, 프로톤화 가능한 3차 아민(예를 들면, pH 적정 가능) 헤드기; 각 알킬쇄가 독립적으로 0∼3(예를 들면, 0, 1, 2 또는 3) 이중 결합을 갖는 C18 알킬쇄; 및 헤드기와 알킬쇄 사이의 에테르, 에스테르 또는 케탈 연결을 포함하는 다른 양이온성 지질을 포함할 수도 있다. 이러한 양이온성 지질은, 이에 제한되지 않지만, 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아마노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 1,2-디리놀레일옥시-케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA), 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA)(DLin-C2K-DMA, XTC2 및 C2K라고도 알려짐), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트(DLin-M-C2-DMA)(MC2라고도 알려짐), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28, 31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-M-C3-DMA)(MC3라고도 알려짐), 및 3-(디리놀레일메톡시)-N,N-디메틸프로판-l-아민(DLin-MP-DMA)(1-B11이라고도 알려짐)을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, LNP는 중성 지질, 예를 들면 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고마이엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드 및 디아실글리세롤을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, LNP는, 이에 제한되지 않지만, 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 결합된 다른 음이온성 수식기를 포함한 음이온성 지질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 본 개시에서 사용되는 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다. 일부 양태에서, 비이온성 지질은 콜레스테롤(CHE) 및/또는 β-시토스테롤이다.
PEG-공액 지질을 사용하는 일부 실시형태에 있어서, PEG-공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체, 폴리아미드(ATTA)-지질 공액체, 및 이들의 혼합물 중 하나 이상이다. 일 양태에 있어서, PEG-지질 공액체는 PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-인지질, PEG-세라미드, 및 이들의 혼합물 중 하나 이상이다. 일 양태에 있어서, PEG-DAG 공액체는 PEG-디라우로일글리세롤(C12), PEG-디미리스토일글리세롤(C14), PEG-디팔미토일글리세롤(C16), 및 PEG-디스테아로일글리세롤(C18) 중 하나 이상이다. 일 양태에 있어서, PEG-DAA 공액체는 PEG-디라우릴옥시프로필(C12), PEG-디미리스틸옥시프로필(C14), PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 및 PEG-디스테아릴옥시프로필(C18) 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에 있어서, PEG는 2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(PEG-DMG) 및/또는 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(PEG-DSG)이다.
일부 실시형태에 있어서, 양친매성 지질은 본 개시의 LNP에 포함된다. 양친매성 지질은 지질 물질의 소수성 부분이 소수성 상으로 배향하는 한편, 친수성 부분은 수성 상으로 배향하는 임의의 적절한 물질을 지칭할 수 있다. 이러한 화합물은, 이에 제한되지 않지만, 인지질, 아미노지질 및 스핑고지질을 포함한다. 대표적인 인지질은 스핑고마이엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 또는 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함한다. 스핑고지질, 글리코스핑고지질 계열, 디아실글리세롤, β-아실옥시산과 같은 다른 인 결핍 화합물도 사용할 수 있다. 부가적으로, 이러한 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤과 같은 다른 지질과 쉽게 혼합될 수 있다.
또한, 본 개시의 지질 입자에 포함되기에 적합한 것은 프로그램 가능한 융합 지질 제형이다. 이러한 제형은 주어진 신호 이벤트가 발생할 때까지 세포막과 융합하여 카고를 전달하는 경향이 거의 없다. 이것에 의해 지질 제형이 세포와 융합하기 시작하기 전에 유기체 또는 질환 부위에 주입 후에 더욱 균일하게 분포될 수 있다. 신호 이벤트는, 예를 들면 pH, 온도, 이온 환경 또는 시간의 변화일 수 있다. 후자의 경우, 융합 지연 또는 "클로킹(cloaking)" 구성요소(예를 들면 ATTA-지질 공액체 또는 PEG-지질 공액체)는 시간이 지남에 따라 지질 나노입자 막 밖에서 간단히 교환될 수 있다. 제형이 체내에 적절하게 분포될 때까지, 융해성이 되도록 충분한 클로킹제가 상실되어 있다. 다른 신호 이벤트의 경우, 염증 부위의 온도 상승과 같은 질환 부위 또는 표적 세포와 관련된 신호를 선택하는 것이 바람직하다.
소정 실시형태에 있어서, 세포 유형 또는 조직에 특이적인 표적화 모이어티를 사용하여 본 개시의 지질 나노입자를 더욱 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 리간드, 세포 표면 수용체, 당단백질, 비타민(예를 들면, 리보플라빈) 및 단일클론 항체와 같은 다양한 표적화 모이어티를 사용하는 지질 나노입자의 표적화는 이전에 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허출원번호 4,957,773 및 4,603,044 참조). 표적화 모이어티는 전체 단백질 또는 그 단편을 포함할 수 있다.
표적화 메커니즘은 일반적으로 표적화 모이어티어가 표적, 예를 들면 세포 표면 수용체와 상호 작용할 수 있는 방식으로 지질 나노입자의 표면에 표적화 제제가 배치되는 것을 필요로 한다. 예를 들면 Sapra, P. 및 Allen, T M, Prog. 42(5):439-62 (2003); 및 Abra, R M et al., J. Lipid nanoparticle Res. 12:1-3, (2002)에 기재된 것들을 포함하는 다양한 상이한 표적화 제제 및 방법이 공지되어 있으며, 당업계에서 이용 가능하다.
표적 제제를 결합시키는 표준 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 표적 약제의 부착을 위해 활성화될 수 있는 포스파티딜에탄올아민 또는 지질 유도체화 블레오마이신과 같은 유도체화 친유성 화합물이 사용될 수 있다. 항체 표적 지질 나노입자는, 예를 들면 단백질 A를 포함하는 지질 나노입자를 사용하여 구성될 수 있다(Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265: 16337-16342 (1990) 및 Leonetti, et al. Natl. Acad. (USA), 87:2448-2451 (1990) 참조). 항체 접합(antibody conjugation)의 다른 예는 미국특허번호 6,027,726호에 개시되어 있으며, 그 교시는 본원에 참조로 포함되어 있다. 표적 모이어티의 예는 신생물(neoplasm) 또는 종양(tumor)과 관련된 항원을 포함한, 세포 구성요소에 특이적인 다른 단백질도 포함할 수 있다. 표적화 모이어티로 사용되는 단백질은 공유 결합을 통해 지질 나노입자에 부착될 수 있다(Heath, Covalent Attachment of Proteins to Lipid nanoparticles, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987) 참조). 다른 표적화 방법으로는 비오틴-아비딘 시스템을 포함된다.
지질 나노입자를 제조하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들면 Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980); 미국 특허번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 4,946,787; PCT 공개번호 WO 91/17424; Deamer and Banggham, Biochim. Biophys. Acta, 443:629-634 (1976); Fraley, et al. Natl. Acad. Set. USA, 76:3348-3352 (1979); Hope, et al. Biophys. Acta, 812:55-65 (1985); Mayer, et al. Biophys. Acta, 858: 161-168 (1986); Williams, et al. Natl. Acad. Sci., 85:242-246 (1988); Lipid nanoparticles, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1; Hope, et al. Phys. Lip., 40:89 (1986); 및 Lipid nanoparticles: A Practical Approach, Torchilin, V. P. et al., ed., Oxford University Press (2003) 및 여기에 인용된 참고 문헌에 기재된 것들을 들 수 있다. 적합한 방법으로는, 이들에 제한되지 않지만, 초음파 처리, 압출, 고압/균질화, 미세유동화, 세척제 투석법(detergent dialysis), 작은 지질 나노입자 소포의 칼슘 유도 융합(calcium-induced fusion of small lipid nanoparticle vesicles), 및 에테르 주입 방법이 포함되고, 이들 모두는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 개시의 일부 실시형태에 있어서, 미세유체 혼합 공정을 사용하여 DOTAP계 LNP를 제조했다. 간단히 말해서, 20mg/ml 농도의 에탄올에서 DOTAP, DOPC, CHE 및 PEG-DMG의 지질 스톡을 제조했다. 상이한 N/P 비율(2-6), 페길화(0-2%) 및 지질 조성물(지질과 지질 사이의 몰 비율)을 조사했다. 모든 제형에 있어서, DOTAP 몰 비율은 20-80 사이에서 변화했다(예시된 소정의 일련의 제형에서, DOTAP 몰 비율은 45로 유지됨). 최종 지질 농도가 5.8mg/ml인 에탄올에서 주어진 조성물에 대해 지질을 함께 혼합했다. 반딧불이 루시페라아제 mRNA(mFluc)를 0.25-2mg/ml 농도의 수성 상에서 mRNA로서 사용했다. 2상 혼합 및 LNP의 제조는 2:1의 수상과 유기상 부피비를 사용하고, 스태거드 헤링본 구조(staggered herringbone structure)를 갖는 미세유체칩을 사용하여 8 또는 12ml/min의 유속에서 수행했다. 얻어진 LNP에 대해 PBS에 대한 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제 및 완충액 교환을 실시했다. 대안적으로, 얻어진 LNP에 대해 MWCO 범위가 8-300 kDa인 멤브레인을 사용하여 PBS에 대한 투석을 실시했다. 실시예 1 아래의 표 1에 제형의 특성 파라미터가 요약되어 있다. 특성 파라미터를 정밀하게 제어함으로써 188-51nm 크기 범위, 0-26mV의 표면 전하, PDI 0.2 이하의 DOTAP LNP의 제조가 가능해졌다. 모든 제형은 제조사의 프로토콜을 사용하여 리보그린 어세이(Ribogreen assay)에 의해 계산된 캡슐화 효율(EE)이 98% 초과를 나타냈다.
본원에 개시된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조된 지질 나노입자는 소정 실시형태에서 약물을 로딩하고 환자에게 투여하기 전에 상당한 기간 동안 보관할 수 있다. 예를 들면, 지질 나노입자는 투여 전에 탈수되고, 저장되고, 이후에 재수화되고, 하나 이상의 활성제가 로딩될 수 있다. 지질 나노입자는 하나 이상의 활성제가 로딩된 후 탈수될 수도 있다. 탈수는, 예를 들면 미국특허번호 4,880,635, 5,578,320, 5,837,279, 5,922,350, 4,857,319, 5,376,380, 5,817,334, 6,355,267 및 6,475,517에 기재된 탈수 및 동결건조 과정을 포함하여 당업계에서 이용 가능한 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 표준 동결건조 장치를 사용하여 탈수되고, 즉 저압 조건 하에서 탈수된다. 또한, 지질 나노입자는 탈수 전에, 예를 들면 액체 질소 중에서 동결될 수 있다. 당은 탈수 전에, 예를 들면 지질 나노입자를 포함하는 완충액과 같은 LNP 환경에 첨가되어, 탈수 중에 지질 나노입자의 무결성을 촉진시킬 수 있다. 예를 들면, 미국특허번호 5,077,056 또는 5,736,155를 참조한다.
지질 나노입자는, 예를 들면 사이징(sizing) 후 또는 pH 구배 생성 후를 포함한 제조 중 어느 시점에든 통상적인 방법으로 멸균될 수 있다.
카고 로딩 지질 입자 조성물
다양한 실시형태에 있어서, 본 개시의 지질 입자는 세포, 조직, 장기 또는 피험체에로의 활성제의 전달을 포함한 다양한 용도에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 지질 나노입자는 혈류를 통해 치료제를 전신적으로 전달하거나 또는 미용제를 피부에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시의 지질 나노입자 및 하나 이상의 활성제가 카고로서 본 개시에 포함된다.
지질 입자 카고
본 개시는 카고로서 활성제와 조합하여 지질 나노입자(즉, DOTAP를 포함하는 지질 나노입자)에 대해 설명한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 활성제는 세포, 조직, 장기 또는 피험체에 대해 원하는 효과를 발휘할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 포함한다. 이러한 효과는, 예를 들면 생물학적, 생리적 또는 미용적 효과일 수 있다. 활성제는, 예를 들면 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드와 같은 핵산, 플라스미드, 안티센스 RNA, RNA 간섭제, 예를 들면 DNA-DNA 하이브리드, DNA-RNA 하이브리드, RNA-DNA 하이브리드, RNA-RNA 하이브리드, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(mRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA); 예를 들면 다클론 항체, 단일 클론 항체, 항체 단편과 같은 항체를 포함한 펩티드 및 폴리펩티드; 인간화 항체, 재조합 항체, 재조합 인간 항체, Primatized™ 항체, 사이토카인, 성장 인자, 세포 사멸 인자, 분화 유도 인자, 세포 표면 수용체 및 그 리간드; 호르몬; 작은 유기 분자 또는 화합물을 포함한 저분자를 포함한 모든 유형의 분자 또는 화합물일 수 있다.
LNP와 결합 또는 LNP에 의해 캡슐화된 핵산은, 이에 제한되지 않지만, 하기 군에서 선택되는 것들을 포함하는 수식을 포함할 수 있다: 2'-O-메틸 수식 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 수식 뉴클레오티드, 5'-메톡시-수식 뉴클레오티드(예를 들면, 5'-메톡시우리딘), 2'-데옥시-수식 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식 뉴클레오티드, 2'-알킬-수식 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드; 포스포로티오에이트를 포함하는 인터뉴클레오시드 연결 또는 백본, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 인접한 뉴클레오티드 유닛의 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전된 극성을 갖는 것.
특정 실시형태에 있어서, 활성제는 mRNA 또는 세포 내에서 mRNA를 발현할 수 있는 벡터이다.
실시형태에 있어서, 활성제는 CRISPR/Cas 시스템이다. 선택적으로, 본 개시의 LNP는, 예를 들면 가이드 가닥(gRNA) 및 Cas 효소를 카고로서 둘 다 포함하도록 제형화될 수 있음으로써, 표적 세포에서 유전자의 CRISPR-매개 표적화를 수행하고 제어할 수 있는 자급식 전달 비히클(self-contained delivery vehicle)을 제공할 수 있다.
소정의 특징적인 실시형태에 있어서, 활성제는 핵산 조절 컨트롤러(예를 들면, 상술한 바와 같이 단백질 컨트롤러 구성요소를 인코딩하는 mRNA)이다.
일부 실시형태에 있어서, 활성제는 치료제, 또는 그의 염 또는 유도체이다. 치료제 유도체는 그 자체로 치료적으로 활성일 수 있고, 또는 추가 수식시 활성이 되는 전구약물일 수 있다. 따라서, 한 실시형태에 있어서, 치료제 유도체는 비수식 제제와 비교하여 치료 활성의 일부 또는 전부를 유지하는 반면, 또 다른 실시형태에 있어서, 치료제 유도체는 치료 활성이 부족하다.
다양한 실시형태에 있어서, 치료제는 항염증 화합물, 마취제, 진정제, 항우울제, 각성제, 환각제, 진통제, 항생제, 피임약, 해열제, 혈관확장제, 항혈관신생제, 세포혈관제, 신호 전달 억제제, 혈관 수축제, 호르몬 및 스테로이드와 같은 제제 및 약물을 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 활성제는 항종양 약물, 항암 약물, 종양 약물, 항종양제 등으로도 지칭될 수 있는 종양 약물이다. 본 개시에 따라 사용될 수 있는 종양 약물의 예는, 이에 제한되지 않지만, 아드리아마이신, 알케란, 알로푸리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 아라씨, 삼산화비소, 아자티오프린, 벡사로텐, 비시엔유, 블레오마이신, 정맥 부설판, 경구 부설판, 카페시타빈(젤로다), 카보플라틴, 카무스틴, 시시엔유, 셀레콕시브, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 사이클로스포린 A, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 다우노루비신, 사이톡산, 다우노루비신, 덱사메타손, 덱라족산, 도데탁셀, 독소루비신, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토포시드 포스페이트, 에토포시드 및 VP-16, 엑세메스탄, FK506, 플루다라빈, 플루오로우라실, 5-FU, 젬시타빈(젬자), 젬투주맙-오조가미신, 고세렐린 아세테이트, 히드레아, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙 메실레이트, 인터페론, 이리노테칸(캄포스타(Camptostar), CPT-111), 레트로졸, 류코보린, 류스타틴, 류프롤리드, 레바미졸, 리트레티노인, 메가스트롤, 멜팔란, L-PAM, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 질소 머스타드, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페가데마제, 펜토스타틴, 포르피머 나트륨, 프레드니손, 리툭산, 스트렙토조신, STI-571, 타목시펜, 탁소테레, 테모졸라미드, 테니포시드, VM-26, 토포테칸(하이캄틴), 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 벨반, 빈블라스틴, 빈크리스틴, VP16 및 비노렐빈을 포함한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 종양 약물의 다른 예는 엘립티신 및 엘립티신 유사체 또는 유도체, 에포틸론, 세포내 키나제 억제제 및 캄프토테신이다.
본 개시의 LNP 조성물은 일반적으로 단일 활성제를 포함하지만, 소정 실시형태에 있어서, 이들은 하나 초과의 활성제를 포함할 수 있다.
본 개시의 다른 실시형태에 있어서, 본 개시의 지질 나노입자는 적어도 0.5, 0.8, 1.2, 1.5, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 또는 12시간의 혈장 순환 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 적어도 0.5, 0.8, 1.2, 1.5, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 또는 12시간의 혈장 약물 반감기를 갖는다. 순환 및 혈액 또는 혈장 청소율 반감기는, 예를 들면 미국특허공개번호 2004-0071768-A1에 기재된 대로 결정될 수 있다.
또한, 본 개시는 키트 형태의 지질 나노입자 및 그 변이체를 제공한다. 키트는 조제완료(ready-made) 제형 또는 투여 전에 혼합을 필요로 하는 제형을 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 다양한 요소를 유지하기 위해 구획화된 용기를 포함할 것이다. 키트는 본 개시의 지질 나노입자 조성물 또는 그의 구성요소를 수화 또는 탈수된 형태로, 그의 재수화 및 투여에 대한 지침서와 함께 포함할 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 키트는 활성제가 로딩된 본 개시의 지질 나노입자를 함유하는 적어도 하나의 구획을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 키트는 적어도 2개의 구획을 포함하고, 하나는 본 개시의 지질 나노입자를 함유하고, 다른 하나는 활성제를 함유한다. 물론, 임의의 이들 키트는 추가 구획, 예를 들면 미국특허공개번호 2004-0228909-A1에 기재된 것과 같은 완충액을 포함하는 구획을 포함할 수 있다는 것은 이해된다. 또한, DOTAP를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 본 개시의 키트는 미국특허공개번호 2004-0228909 A1에 기재된 키트의 다른 특징을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 한 구획에 약물이 로딩된 지질 나노입자를 함유하고, 두 번째 구획에 빈(empty) 지질 나노입자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 키트는 본 개시의 지질 나노입자, 제 2 구획의 본 개시의 지질 나노입자에 로딩될 활성제, 및 제 3 구획의 빈 지질 나노입자를 함유할 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 키트는 DOTAP를 포함하는 지질 나노입자에 캡슐화된 치료 화합물을 포함하며, 여기서 DOTAP는 빈 지질 나노입자뿐만 아니라, 지질 나노입자에 존재하는 전체 인지질의 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 70%(몰 기준)를 구성한다. 한 실시형태에 있어서, 지질 나노입자 함유 치료 화합물 및 빈 지질 나노입자는 키트의 상이한 구획에 존재한다.
지질 입자 매개 카고 전달의 효능
소정 실시형태에 있어서, 본 개시는 적어도 부분적으로 25-75%(mol/중량)부터 DOTAP계 지질 입자가 활성 핵산 카고를 다른 조직에 비해 폐의 세포로 전달하는 데 매우 효과적이라는 놀라운 결과를 기반으로 한다. 또한, 캡슐화된 활성제(카고)의 리포터 활성, 예를 들면 mRNA는 다른 조직에 비해 폐 조직에서 거의 전적으로 발생했다. 지질 입자의 국소화의 효능은 피험체의 하나 이상의 다른 조직에 대한 피험체의 특정 조직에 대한 핵산-지질 입자의 국소화에서의 배수 차이(증가 또는 감소)로서 기재될 수 있다. 전달을 평가하는 추가 구성요소로서의 활성의 효능은 피험체의 하나 이상의 다른 조직의 세포에서 관찰되는 것과 비하여, 피험체의 특정 조직의 세포 내에서 활성제, 예를 들면 핵산 카고 또는 다른 화합물의 활성의 배수 차이(증가 또는 감소)로서 기재될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 배수 차이는 따라서 세포 레벨에서 검출될 수 있고 또는 세포 레벨에서 발생하는 이벤트에 대한 적절한 프록시에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 영향을 받은 폐 조직의 세포는 상피, 내피, 간질 결합 조직, 혈관, 조혈 조직, 림프 조직 및 흉막 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에 있어서, 효과/활성의 배수 차이는 하위 세포 레벨, 즉 표적화 세포의 핵에서 활성이 검출가능한 경우 검출될 수 있다.
LNP의 국소화 효능을 결정하기 위해, 라벨링된 또는 검출된 관심 분자의 특성에 따라 어세이가 수행될 수 있다. 본 개시의 예시적인 실시형태에 있어서, 형광 라벨링된 지질은 LNP 국소화를 결정하는데 사용되었다. 다른 실시형태에 있어서, 라벨링된 펩티드, 또는 지질 입자의 다른 구성요소가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 국소화는 개별 세포에서 검출 가능하다. 일부 실시형태에 있어서, 라벨은 형광 라벨, 즉 Cy7과 같은 형광 라벨링된 지질이다. 다른 실시형태에 있어서, 지질 나노입자의 라벨은 양자점, 또는 자극 라만 산란(stimulated Raman scattering)에 의해 검출 가능한 지질일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 라벨은 당업계에 공지된 임의의 형광단, 즉 자외선, 가시광선 또는 적외선 스펙트럼에서 여기 및 방출을 갖는 임의의 형광단이다. 일부 실시형태에 있어서, 국소화는 면역조직화학법 또는 면역형광법에 의해 검출되거나 추가로 확증된다.
국소화의 효능은 피험체의 하나 이상의 다른 조직에 비해 피험체의 조직, 즉 폐 조직에 대한 핵산-지질 입자의 국소화의 배수 차이(증가 또는 감소)로 설명될 수 있다. 본 개시의 예시적인 실시형태에 있어서, Cy7 라벨링된 지질은 생체내에서 이미징화되고, 형광 복사휘도를 Cy7-LNP 농도의 지표로서 제공했다(하기 실시예 3 참조). Cy7 라벨링된 DOTAP 핵산 LNP는 다른 조직, 특히 심장, 비장, 난소 및 췌장에 비해 폐에 대한 증가된 국소화의 효능을 나타냈다. 본 개시의 일부 실시형태에 있어서, Cy7 라벨링된 핵산 LNP는 심장, 비장, 난소 또는 췌장에 비해 폐에 대해 적어도 2배의 국소화를 나타냈다. 일부 실시형태에 있어서, Cy7 라벨링된 핵산 LNP는 폐에 대해 적어도 3배 국재화를 나타냈고, 일부 실시형태에 있어서, Cy7 라벨링된 핵산 LNP는 폐에 대해 적어도 4배 국재화를 나타냈고, 일부 실시형태에 있어서, Cy7 라벨링된 핵산 LNP는 폐에 대해 적어도 5배의 국소화를 나타냈고, 일부 실시형태에 있어서, Cy7 라벨링된 핵산 LNP는 심장, 비장, 난소 및 췌장에 비해 폐에 대해 적어도 6배의 국소화를 나타냈다.
LNP에 의해 캡슐화된 활성제의 활성 효능을 결정하기 위해, 활성제의 특성에 따라 어세이가 수행될 수 있다. 소정 실시형태에 있어서, DOTAP LNP에서의 활성제는 핵산이다. 다른 실시형태에 있어서, DOTAP LNP에서의 활성제는 소분자 또는 다른 화합물이다.
일부 실시형태에 있어서, DOTAP계 LNP에서의 활성제는 mRNA이다. 예시적인 실시형태에 있어서, 리포터 mRNA, 즉 루시페라아제의 국소적 발현은 활성제/카고로서 mRNA에 대한 세포내 전달 효능의 지표로서 제공되었다. 다른 실시형태에 있어서, mRNA는 Cre 효소, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 또는 청색 형광 단백질을 인코딩할 수 있다. 또는, 치료적 실시형태에 있어서, 선택적으로 전달된 mRNA 또는 인코딩된 단백질의 세포 내 레벨이 전달되는 치료용 mRNA에 적합한지로 당업자에게 공지된 방법에 의해 검출될 수 있는 경우, mRNA는 피험체의 LNP-표적화 세포에서의 치료적 세포 내 발현을 위한 단백질을 인코딩할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 리포터 mRNA는 Lyt2 세포 표면 마커와 같은 세포 표면 마커를 인코딩한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 리포터는 β-갈락토시다아제, α-락타마아제, 알칼리 포스파타아제 또는 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 리포터 mRNA는 티미딘 키나아제(tk), HRPT 또는 APRT와 같은 음성 선택 마커를 인코딩한다. 일부 실시형태에 있어서, 리포터 mRNA의 활성을 검출하거나 확증하기 위해 면역조직화학법 또는 면역형광법을 사용한다.
소정 실시형태에 있어서, 카고를 전달하는 본 개시의 지질 입자의 유효성은 지질 입자-표적화 조직 내에서 세포내 카고(활성제)에 대해 관찰된 활성 레벨을 기반으로 하여 평가된다. 이러한 효과는 적절한 대조군 제형 및/또는 조직과 비교하여 활성의 배수차로 식별될 수 있으며, 예를 들면 핵산 카고를 갖는 LNP의 전달 효능은 피험체의 하나 이상의 다른 조직에 비해 피험체의 표적화 조직, 즉 폐 조직의 세포에서 핵산 카고의 활성의 배수차(증가 또는 감소)로 기재될 수 있다. 따라서, 소정의 핵산 카고의 경우, LNP 제형의 전달 효능은 핵산 카고를 포함하지 않는 LNP 제형에 비해, 예를 들면 비표적화 조직 세포에서보다 표적화 조직 세포에서 핵산 페이로드의 세포내 활성을 2배 더 크게 달성하는 LNP로 확인될 수 있다. 선택적으로, 핵산 카고의 전달을 위한 효과적인 LNP 제형은 핵산 카고를 포함하지 않는 LNP 제형에 비해, 비표적 조직 세포에서보다 표적화 조직 세포에서 핵산 카고 페이로드의 세포내 활성을 적어도 약 3배 크게, 선택적으로는 약 4배 더 크게, 선택적으로는 약 5배 더 크게, 선택적으로는 약 6배 더 크게, 선택적으로 약 7배 더 크게, 선택적으로 약 8배 더 크게, 선택적으로 약 9배 더 크게, 선택적으로 약 10배 더 크게, 선택적으로 약 50배 더 크게, 선택적으로 약 100배 등 더 크게 달성하는 것으로 기재될 수 있다. 본 개시의 예시적인 실시형태에 있어서, DOTAP LNP는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포보다 상당히 더 높은 레벨로 피험체의 폐 조직의 세포에서 발현된 루시페라아제 mRNA를 전달했다(이하 실시예 3 참조). 루시페린을 피험체에게 정맥주사로 전달하고, 루시페라아제를 발현하는 세포를 생체 내 생체발광 이미징을 통해 검출했다. 일부 실시형태에 있어서, 루시페라아제 mRNA는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서 mRNA의 발현보다 적어도 2배 더 높은 레벨로 피험체의 폐 조직의 세포에서 발현되었다. 일부 실시형태에 있어서, 카고 mRNA는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서 mRNA의 발현보다 적어도 3배 더 높은 레벨로 피험체의 폐 조직의 세포에서 발현되었다. 일부 실시형태에 있어서, 루시페라아제 mRNA는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 카고 mRNA의 발현보다, 폐에서 적어도 4배 더 높게 발현되었고, 일부 실시형태에 있어서, 루시페라아제 mRNA는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 카고 mRNA의 발현보다, 폐에서 적어도 5배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 카고 mRNA의 발현보다, 폐에서 적어도 6배 더 높게. 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 7배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 8배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 9배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 10배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 11배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 12배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 13배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 14배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 15배 더 높게, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 20배 더 높게 발현되었다.
다른 실시형태에 있어서, DOTAP LNP는 조직, 즉 폐 조직에 RNAi 제제(예를 들면, siRNA)를 전달하기 위해 사용될 수 있다. siRNA 또는 다른 RNAi 제제의 경우, 전달 및 활성 효능 측정은, 예를 들면 전사체 수준을 검출하기 위한 표적 특이적 PCR, 표적 단백질 수준을 검출하기 위한 면역흡착제 또는 기타 면역학적 방법 및/또는 유세포 분석법(FACS)을 사용할 수 있다(Testoni et al., Blood 1996, 87:3822.). 일부 실시형태에 있어서, siRNA는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서보다 적어도 2배 더 높은 레벨로 피험체의 폐 조직의 세포에서 활성일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, siRNA는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서보다 적어도 3배 더 높은 레벨로 피험체의 폐 조직 세포에서 활성일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, siRNA는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 siRNA의 활성보다, 폐에서 적어도 4배 더 높은 레벨로 활성일 수 있고, 일부 실시형태에 있어서, siRNA는 폐에서 적어도 5배 더 높은 레벨로 활성일 수 있고, 일부 실시형태에 있어서, siRNA는 폐에서 적어도 6배 더 높은 레벨로 활성일 수 있고, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 7배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 8배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 9배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 10배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 11배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 12배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 적어도 13배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 14배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 15배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 적어도 20배 더 높은 레벨 등으로 활성일 수 있다. 관련된 실시형태에 있어서, RNAi 카고를 폐에 우선적으로 전달하는 LNP는 비표적화 조직의 세포와 비교하여 또는 일부 다른 적절한 대조군(예를 들면, 미처리 폐 조직 세포에서의 표적 전사체의 레벨)과 비교하여, 표적화 폐 조직의 세포에서의 표적 전사체 및/또는 단백질 레벨에 있어서, 예를 들면 20% 초과 감소를 나타낼 수 있다. 선택적으로, RNAi 카고를 우선적으로 폐에 전달하는 LNP는 비표적화 조직의 세포와 비교하여 또는 일부 다른 적절한 대조군(예를 들면, 미처리 폐 조직 세포에서의 표적 전사체의 레벨)과 비교하여, 표적화 폐 조직의 세포에서의 표적 전사체 및/또는 단백질 레벨에 있어서, 예를 들면 30% 초과 감소, 40% 초과 감소, 50% 초과 감소, 60% 초과 감소, 70% 초과 감소, 80% 감소, 90% 초과 감소, 95% 초과 감소, 97% 초과 감소, 97% 초과 감소, 98% 초과 감소 또는 99% 초과 감소를 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 DOTAP계 LNP는 CRISPR-Cas9 시스템을 조직, 즉 폐 조직에 전달하는데 사용될 수 있다. CRISP-Cas9의 전달 및 활성 효능 측정은, 예를 들면 Cas9, 표적화 영역의 게놈 구조 및/또는 표적 전사체 레벨을 검출하기 위한 PCR, Cas9 또는 녹인, 녹아웃, 또는 표적 단백질의 다른 수식을 검출하기 위한 면역흡착제 또는 기타 면역학적 방법, 및/또는 유세포 분석법(FACS)(Testoni et al., Blood 1996, 87:3822)을 필요로 할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, CRISP-Cas9 매개 효과는 피험체의 폐 조직의 세포에서 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서보다 적어도 2배 높은 레벨로 확인될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, CRISP-Cas9 매개 효과는 피험체의 폐 조직의 세포에서 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서보다 적어도 3배 높은 레벨로 확인될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, CRISP-Cas9 매개 효과는 폐에서 적어도 4배 더 높은 레벨로 세포에서 확인될 수 있고, 일부 실시형태에 있어서, CRISP-Cas9 매개 효과는 폐에서 적어도 5배 높은 레벨로 세포에서 확인될 수있고, 일부 실시형태에 있어서, CRISP-Cas9 매개 효과는 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 CRISP-Cas9 매개 효과보다, 폐에서 적어도 6배 높은 레벨로 세포에서 확인될 수 있고, 일부 실시형태에 있어서, CRISP-Cas9 매개 효과는 세포에서 7배 이상 높은 레벨로 확인될 수 있고, 일부 실시형태에 있어서, 적어도 8배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에서는 9배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에서는 10배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에서는 11배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에서는 12배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에서는 13배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에서는 14배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에서는 15배 더 높은 레벨, 일부 실시형태에서는 20배 더 높은 레벨로 확인될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, DOTAP LNP는 mRNA 또는 다른 핵산 카고를 조직, 즉 폐 조직으로 전달할 수 있으며, 여기서 발현 및 가능하면 활성이 핵 내에서 발생한다. 본 개시에 있어서, 일부 실시형태는 활성제의 핵 활성용 리포터로서 Cre 리콤비나아제 효소를 이용했다(하기 실시예 6 참조). Cre 리콤비나아제 효소는 인코딩된 단백질의 핵으로의 전좌(translocation)를 필요로 하므로, 핵 전좌의 리포터로서 역할을 한다. Cre 리콤비나아제는 loxP 부위 사이의 DNA의 부위 특이적 재조합을 촉매한다. Cre 리콤비나아제 활성이 발현되면, loxP 재조합으로 인해, 리포터 형광 단백질이 발현된다. 한 실시형태에 있어서, Ail4 마우스 계통은 Gt(ROSA) 26Sor 유전자좌에 삽입된 CAG 프로모터-구동 적색 형광 단백질 변이체(tdTomato)의 전사를 방지하는 Cre 리포터 loxP 인접 STOP 카세트를 사용했다. Ail4 마우스에 mCre 로딩된 DOTAP-LNP를 정맥내로 주사하고, Cre 효소의 전달 및 발현, Cre 효소의 핵 전좌, 및 이어서 tdTomato 프로모터의 Cre 매개 유전자 재조합 후에 폐 세포의 핵 내에서 강력한 tdTomato 형광이 발현되기 시작했다. 예시적인 실시형태에 있어서, 활성의 효능, 즉 핵에서 검출 가능한 mRNA의 발현은 간, 심장 및 비장에서의 세포의 발현보다 폐 세포의 핵 내에서 적어도 2배 높은 레벨로 관찰 가능했다. 일부 실시형태에 있어서, 핵 내에서 검출 가능한 mRNA의 발현은 간, 심장 및 비장보다 폐 세포의 핵 내에서 적어도 3배 더 높은 레벨로 관찰 가능했다. 일부 실시형태에 있어서, 핵 내에서 검출 가능한 mRNA의 발현은 간, 심장, 비장의 세포의 핵 내에서 검출 가능한 mRNA의 활성보다 폐 세포의 핵 내에서 적어도 4배 더 높은 레벨로 관찰 가능했고, 일부 실시형태에 있어서, 그 레벨은 5배 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 6배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 7배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 8배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 9배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 10배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 11배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 12배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 13배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 14배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 15배 더 높았고, 일부 실시형태에 있어서, 20배 더 높았다.
다른 실시형태에 있어서, DOTAP LNP는 소분자 또는 다른 화합물을 조직, 즉 폐 조직에 전달할 수 있다. 소분자의 국소화 또는 활성의 효능은 많은 생체 내 이미징법(예를 들면 PET/CT), 질량 분석법뿐만 아니라, 표적 효과의 면역조직화학법 및 면역형광법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 소분자의 DOTAP-LNP 매개 국소화 및/또는 활성은 다른 조직의 것보다, 예를 들면 심장, 비장, 난소 및 췌장의 것보다, 선택적으로 간 및/또는 신장의 것보다 2배 더 높을 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 폐에서 소분자의 DOTAP-LNP 매개 국소화 및/또는 활성은 다른 조직보다 3배 더 높을 수 있고, 다른 조직, 예를 들면 심장, 비장, 난소 및 췌장의 것보다, 선택적으로 간 및/또는 신장의 것보다 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배 또는 20배 더 높을 수 있다.
소정 실시형태에 있어서, 폐 전달을 위해 제형화된 지질 입자는 피험체의 하나 이상의 다른 조직의 세포에 비해서, 폐 세포로의 카고의 우선적 국소화 및 세포내 전달(직접 또는 대리에 의한 세포내 활성의 평가에 기반함)를 나타내는 지질 입자를 지칭한다. 예를 들면, 폐 전달을 위한 지질 입자는 피험체의 다른 조직보다 피험체자의 폐 세포에서 카고(예를 들면, 핵산 카고, 예를 들면 mRNA, CRISPR/Cas 시스템, 핵산 조절 컨트롤러 등)의 적어도 2배 더 큰 활성을 유도할 수 있는 것이다. 피험체의 폐 세포에서의 이러한 효과는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 폐의 하나 이상의 세포 유형 내에서 평가될 수 있다. 소정 실시형태에 있어서, 폐 전달을 위한 지질 입자는 피험체의 다른 조직에서보다 피험체의 폐 세포에서 카고(예를 들면 핵산 카고, 예를 들면 mRNA, CRISPR/Cas 시스템, 핵산 조절 컨트롤러 등)의 활성이 적어도 3배 더 크게, 적어도 4배 더 크게, 적어도 5배 더 크게, 적어도 6배 더 크게, 적어도 7배 더 크게, 적어도 8배 더 크게, 적어도 9배 더 크게, 적어도 10배 더 크게, 적어도 15배 더 크게, 적어도 20배 더 크게, 적어도 30배 더 크게, 적어도 40배 더 크게, 적어도 50배 더 크게, 적어도 60배 더 크게, 적어도 70배 더 크게, 적어도 80배 더 크게, 적어도 90배 더 크게, 적어도 100배 더 크게, 적어도 1000배 등 더 크게 유발할 수 있는 것이다.
또 다른 실시형태에 있어서, PEG-수식 지질 없이 제형화된 DOTAP LNP는 면역계가 PEG의 제거를 표적으로 하는 혈액 청소율 촉진(ABC)을 감소 또는 회피할 수 있다. DOTAP는 특히 페길화된 지질이 필요하지 않은 LNP에 대해 충분한 안정화를 제공한다(하기 실시예 1 참조). ABC의 회피는 LNP의 후속 투여 효과를 증대시킴으로써 DOTAP LNP 활성제의 활성 효과를 증대시킨다. PEG 함유 제형과 비교하여, DOTAP LNP의 혈액 청소율 촉진의 회피 효과는 DOTAP PEG 함유 제형(0.5-1.5%)의 ABC, 또는 마찬가지로 다른 PEG 함유 LNP의 ABC에 대한 DOTAP PEG 비함유 제형의 ABC를 측정함으로써 결정할 수 있다. DOTAP PEG 비함유 제형은 2회 이상 투여 시 PEG 함유 LNP 조성물보다 혈액 및/또는 조직에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 또는 적어도 20배 더 큰 수준으로 LNP를 유지할 수 있다.
LNP -매개 카고 전달
본원에 개시된 지질 입자 조성물은 활성제 또는 치료제 또는 화합물을 이를 필요로 하는 피험체 또는 환자에게 전달하는 것을 포함한 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 피험체는 인간과 비인간 동물 모두를 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 피험체는 포유동물이다. 다른 실시형태에 있어서, 피험체는, 예를 들면 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 또는 조류를 포함한 하나 이상의 특정 종 또는 품종이다.
따라서, 본 개시는 또한 다양한 질환 및 장애의 치료 방법뿐만 아니라 미용적 혜택을 제공하기 위한 방법을 제공한다.
치료 방법
본 개시의 LNP 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경계 질환, 종양, 탈수 질환, 소화기계 질환, 내분비계 질환, 생식기 질환, 혈액 및 림프계 질환, 면역 질환, 정신 질환, 근골격 질환, 신경 질환, 신경근 질환, 대사 질환, 성매개질환, 피부 및 결합조직 질환, 비뇨기 질환, 및 감염을 포함하는 다양한 질환 또는 장애 중 어느 하나를 치료하는 데 사용될 수 있다.
소정 실시형태에 있어서, LNP 조성물은,이에 제한되지 않지만, 폐암, 폐렴, 폐섬유증, COPD, 천식, 기관지확장증, 사르코이드증, 폐고혈압, 폐기종, 알파-1 항트립신 결핍증, 아스페르길루스증, 세기관지염, 기관지염, 진폐증, 코로나 바이러스, 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군, 낭포성 섬유증, 레지오넬라증, 인플루엔자, 백일해, 폐색전증 및 결핵에서 선택되는 질환 또는 장애를 포함하는 폐 질환 또는 장태를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 LNP 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및 골관절염에서 선택되는 질환 또는 장애를 포함하는 관절 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 개시의 LNP 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상성 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 감염성 관절염, 감염후 관절염, 임균 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비관절염 류머티즘, 활액낭염, 고초열, 화농성 염증(예를 들면 테니스 엘보우), 신경병성 관절 질환, 혈관절증, 헤노호 쉰라인 자반증, 비후성 골관절염, 다발성 치질, 척추측만증, 혈색소침착증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지-폐 이형성증 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)에서 선택되는 질환 또는 장애를 포함하는 염증성 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 LNP 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 습진, 주사, 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병, 일반 사마귀, 각화극세포종 및 지루각화증을 포함하는 표피 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
한 실시형태에 있어서, 본 발명의 LNP 조성물은 암의 일종을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이들 방법은 림프종, 백혈병, 및 골수종을 포함하는 혈액 및 림프계의 암에 적용될 수 있다. 본 개시에 따라 치료될 수 있는 특정 암의 예는, 이에 제한되지 않지만, 실용 공식(working formulation), 라파포트 분류(Rappaport classificatioon), 및 바람직하게는 리얼 분류(REAL classification)와 같은 다양한 분류 시스템 중 어느 하나에 따라 정의된 임의의 유형의 NHL를 포함하는 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종(NHL)를 포함한다. 이러한 림프종은, 이에 제한되지 않지만, 저악성, 중악성 및 고악성 림프종뿐만 아니라, B세포 림프종 및 T세포 림프종 모두를 포함한다. 이러한 범주에는 다양한 종류의 소세포, 대세포, 절단 세포, 림프구, 여포성 세포, 미만성 세포, 버킷 세포, 맨틀 세포, NK 세포, CNS, 에이즈 관련, 림프아구성, 성인 림프아구성, 무통성, 공격성, 형질전환성, 및 다른 유형의 림프종이 포함된다. 본 개시의 방법은 성인형 또는 소아형 림프종뿐만 아니라 임의의 스테이지, 예를 들면 스테이지 I, II, III 또는 IV의 림프종에 대해 사용될 수 있다. 다양한 유형의 림프종은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 미국 암협회에 의해 기재되어 있다(예를 들면, www3.cancer.org 참조).
또한, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 질환의 성인형 및 소아형을 포함하는 임의의 형태의 백혈병에 적용될 수 있다. 예를 들면, 임의의 급성, 만성, 골수성 및 림프구형의 질환은 본 개시의 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 방법은 급성 림프구성 백혈병(ALL)을 치료하기 위해 사용된다. 다양한 유형의 백혈병에 대한 추가 정보는 특히 미국 백혈병 학회로부터 찾을 수 있다(예를 들면 www.leukemia.org 참조).
또한, 신경아세포종, 골수종, 전립선암, 소세포폐암, 대장암, 난소암, 비소세포폐암, 뇌종양, 유방암 등과 같은 추가적 종양의 유형도 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료될 수 있다.
본 개시의 LNP 조성물은 1차 치료 또는 2차 치료로서 투여될 수 있다. 또한, 이들은 1차 화학요법 치료 또는 보조항암(adjuvant) 또는 선행항암 화학요법(neoadjuvant chemotherapy)으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 재발성, 무통성, 변이형 및 공격형의 비호지킨 림프종의 치료는 화학요법 및/또는 방사선 치료와 같은 1차 항암치료의 적어도 한 코스 후에 시행될 수 있다.
LNP 조성물의 투여
본 개시의 LNP 조성물은 비경구, 정맥내, 전신, 국소, 경구, 종양내, 근육내, 피하, 복강내, 흡입, 또는 임의의 이러한 전달 방법을 포함하는 임의의 다수의 방식으로 투여된다. 한 실시형태에 있어서, 조성물은 비경구적으로, 즉 관절내, 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내로 투여된다. 소정 실시형태에 있어서, LNP 조성물은 정맥내 주입에 의해 또는 볼루스 주사에 의해 복강내로 투여된다. 예를 들면, 한 실시형태에 있어서, 환자에게, 예를 들면 5-10분, 15-20분, 30분, 60분, 90분, 이상에 걸쳐 흐르는 정맥 라인을 통해 지질 나노입자 캡슐화 활헝제를 정맥내 주입한다. 한 실시형태에 있어서, 60분 주입이 사용된다. 다른 실시형태에 있어서, 6-10분 또는 15-20분 범위의 주입이 사용된다. 이러한 주입은 주기적으로, 예를 들면 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 또는 28일 또는 그 이상마다 한 번, 바람직하게는 7-21일마다 한 번, 바람직하게는 7 또는 14일마다 한 번 행해질 수 있다.
본 개시의 LNP 조성물은 피험체에게 전달하기에 적합한 의약 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 종종 하나 이상의 완충제(예를 들면, 중성 완충 식염수 또는 인산염 완충 식염수), 탄수화물(예를 들면, 글루코스, 만노스, 수크로오스, 덱스트로오스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들면 글리신, 산화방지제, 정균제, EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제, 아쥬반트(예를 들면 수산화알루미늄), 수용자의 혈액과 제형을 등장성, 저장성 또는 약고장성으로 하는 용질, 현탁제, 증점제 및/또는 방부제를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
의약 제형에서의 약물 및 지질 나노입자의 농도는 약 0.05% 미만, 일반적으로 적어도 약 2-5%에서 10∼30중량% 정도까지 광범위하게 변화할 수 있고, 사용된 특정 약물, 치료 중인 질환 상태 및 임상의의 판단에 따라 선택될 것이다. 또한, 약물 및 지질 나노입자의 농도는 투여된 액량, 투여되는 용액의 삼투압, 약물 및 지질 나노입자의 내약성도 고려될 것이다. 일부 경우에 있어서, 주입 관련 부작용의 발생률 또는 중증도를 감소시키기 위해 더 낮은 약물 또는 지질 나노입자 농도를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 개시에 사용하기에 적합한 제형은, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 제 17 판(1985)에서 찾을 수 있다. 많은 경우, 정맥내 조성물은 수성 캐리어와 같은 허용 가능한 캐리어에 현탁된 지질 나노입자의 용액을 포함할 수 있다. 임의의 다양한 수성 캐리어, 예를 들면 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.9% 등장 식염수, 0.3% 글리신, 5% 덱스트로오스 등이 사용될 수 있고, 또한 안정성을 증대시키기 위해 알부민, 지단백질, 글로불린 등과 같은 당단백질을 포함할 수 있다. 많은 경우, 일반 완충 식염수(135-150mM NaCl) 또는 5% 덱스트로오스가 사용된다. 이러한 조성물은 여과와 같은 전통적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 얻어진 수용액은 사용하기 위해 포장되거나 또는 무균 조건하에서 여과하고, 동결건조될 수 있으며, 동결 건조된 조제품(preparation)은 투여 전에 무균 수용액과 혼합된다. 또한, 상기 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해 필요로 되는 의약적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들면 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘과 같은 pH 조절제 및 완충제, 긴장 조정제(tonicity adjusting agent) 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 저장시 자유 라디칼 및 지질 과산화 손상으로부터 지질을 보호할 수 있는 지질 보호제를 포함할 수 있다. α-토코페롤과 같은 친유성 자유 라디칼 퀀처 또는 페리옥사민과 같은 수용성 철 특이적 킬레이트제가 적합하다.
용량 당 투여되는 활성제의 양은 최소 치료 용량 이상, 독성 용량 이하로 선택된다. 1회당 용량의 선택은 환자의 병력, 다른 치료법의 사용, 질환의 성질 등 여러 요인에 따라 달라진다. 또한, 투여되는 활성제의 양은 치료에 대한 환자의 반응 및 임의의 치료와 관련된 부작용의 존재 또는 중증도에 따라 치료 전반에 걸쳐 조정될 수 있다. 소정 실시형태에 있어서, LNP 조성물의 용량 또는 투여 빈도는 대응하는 유리 활성제에 의한 치료의 용량 및 일정과 거의 동일하다. 그러나, 특히 LNP 조성물이 감소된 독성을 나타내는 경우, 용량은 유리 약물 치료(free drug treatment)에 비해 더 높거나 더 빈번하게 투여될 수 있다는 것으로 이해된다. 또한, 특히 LNP 조성물이 유리 약물과 비교하여 증가된 효능을 나타내는 경우, 용량은 유리 약물 치료와 비교하여 더 저거나 덜 빈번하게 투여될 수 있다는 것으로 이해된다. 다양한 화학요법 화합물(유리 약물)에 대한 예시적인 용량 및 치료법은 당업자에게 공지되어 있고 이용 가능하며, 예를 들면 Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, E. Chu 및 V. Devita(Jones and Bartlett, 2002년)에 기재되어 있다.
환자는 전형적으로 이러한 치료를 적어도 2 코스 받고, 치료에 대한 환자의 반응에 따라 잠재적으로 더 많은 코스를 받을 수도 있다. 단제 요법에서는 관찰된 반응과 독성에 기반하여 환자와 의사가 전체 치료 과정을 결정한다.
병용 요법
소정 실시형태에 있어서, 본 개시의 LNP 조성물은 하나 이상의 추가 화합물 또는 요법, 예를 들면 수술, 방사선 치료, 화학요법, 또는 상기 기재된 것들 중 어느 하나를 포함하는 다른 활성제와 조합하여 투여될 수 있다. LNP 조성물은 효능을 증가시키거나 또는 바람직하지 않은 부작용을 감소시키는 것을 포함한 다양한 이유로 제 2 활성제와 조합하여 투여될 수 있다. LNP 조성물은 추가 치료 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 본 개시의 LNP 조성물(제 1 활성제를 포함함)이 제 2 활성제와 조합하여 투여되는 경우, 제 2 활성제는 유리 약물로서, 독립적인 LNP 제형으로서, 또는 제 1 약물을 포함하는 LNP 조성물의 성분으로서 투여될 수 있다. 소정 실시형태에 있어서, 복수의 활성제가 동일한 지질 나노입자에 로딩된다. 다른 실시형태에 있어서, 활성제를 포함하는 지질 나노입자는 하나 이상의 유리 약물과 조합하여 사용된다. 소정 실시형태에 있어서, 활성제를 포함하는 LNP 조성물은 개별적으로 형성되고, 이어서 1회 공동 투여를 위해 다른 화합물과 조합된다. 대안적으로, 소정 치료법은 미리결정된 순서로 연속적으로 투여된다. 따라서, 본 개시의 LNP 조성물은 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 다른 병용 요법은 본 개시의 방법과 함께 사용될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 개시에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료가 이하에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 모순이 있는 경우에는, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려는 의도는 아니다.
다음으로, 본 개시의 예시적인 실시형태를 상세히 설명한다. 본 개시는 예시적인 실시예와 함께 설명되지만, 본 개시를 예시적인 실시형태에 한정하려는 의도는 아닌 것은 이해될 수 있다. 오히려, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 개시의 사상과 범위 내에 포함될 수 있는 대안, 수정 및 등가물을 포괄하도록 의도된다. 당업계에 공지된 표준 기술, 또는 이하에 구체적으로 설명하는 기술이 이용되었다.
실시예
실시예 1 : 상이한 파라미터의 DOTAP - LNP 제형의 제조
DOTAP계 LNP는 미세유체 혼합 공정을 사용하여 제조했다. 간단히 말해서, DOTAP, DOPC, CHE 및 PEG-DMG의 지질 스톡을 에탄올 중에서 20mg/ml의 농도로 제조했다. 상이한 N/P 비율(현재 예시된 바와 같이 2, 3, 4 또는 6), 페길화(현재 예시된 바와 같이 0-2%) 및 지질 조성(지질 상호간의 몰비)을 조사했다. 모든 초기 제형에 있어서, DOTAP 몰 백분율은 45%로 유지되었지만, 이후의 제형은 입자 내의 총 지질의 25몰%, 50몰% 및 75몰%의 DOTAP를 포함했다. 하기 표 1에 나타내는 초기 핵산 입자 제형에 대해서는, 최종 지질 농도가 5.8mg/ml가 되도록 지질을 에탄올 중에서 소정의 조성물과 함께 혼합했다. 반딧불이 루시페라아제(firefly luciferase) mRNA(mFluc)를 수상의 mRNA로서 0.25mg/ml의 농도로 사용했다. 2상 혼합 및 LNP의 제조는 2:1의 수상과 유기상 부피비를 사용하고, 스태거드 헤링본 구조(staggered herringbone structure)를 갖는 미세유체칩을 사용하여 8ml/min의 유속에서 수행했다. 얻어진 LNP에 대해 PBS에 대한 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제 및 완충액 교환을 실시했다. 하기 표 1은 처음 제조한 제형의 특성 파라미터를 요약한 것이다. 특성 파라미터를 정밀하게 제어함으로써 51-188nm 크기 범위, 0-26mV의 표면 전하, 0.2 이하의 PDI 값을 갖는 DOTAP LNP의 제조가 가능해졌다. 모든 제형은 제조사의 프로토콜을 사용하여 리보그린 어세이(Ribogreen assay)에 의해 계산된 캡슐화 효율(EE)이 98% 초과를 나타냈다.
특히, DOTAP는 LNP를 충분히 안정화되어서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 공액 지질이 생존 가능한 나노입자를 달성하기 위해 필요하지 않았다. 이론에 구속되지는 않지만, DOTAP의 높은 표면 전하가 입자를 안정화시키기에 충분한 정전 안정성을 제공한 것으로 생각된다. 본원에서 입증된 바와 같이, 핵산 카고의 전달을 위해 고도로 활성인 PEG 비함유 핵산-지질 입자를 제형화하는 능력에 의해, 이에 한정되지 않지만, 감소된 세포 상호작용 및 내재화뿐만 아니라, LNP의 표면 상의 페길화 지질에 대한 신체의 면역반응에 의해 야기된 잘 알려진 현상인 PEG 유도 혈액 청소율 촉진(ABC)을 포함하는 페길화된 제형의 이전에 관찰된 문제점을 완화 또는 완전한 회피를 가능하게 한다. 따라서, 본원에서 발견된 PEG 비함유 LNP의 DOTAP 매개 안정화는 LNP-관련 핵산 카고의 전달에서 중요한 치료적 개선을 제공했다.
실시예 2: DOTAP 지질 나노입자( LNP )는 리포터 mRNA를 전달하고 낮은 독성을 나타냄
카고로서 DOTAP LNP 관련 mRNA 리포터의 세포로의 전달 및 후속하는 세포 내 발현의 초기 입증에 있어서, mRNA 리포터 카고를 갖는 DOTAP LNP를 Hepa 1-6 세포 (마우스 세포주)에 대해 시험관 내 테스트했다. 우선, Hepa 1-6 세포를 96-웰 흑색벽 마이크로플레이트에 20,000세포/웰/100㎕의 플레이팅 밀도로 시딩했다. 세포를 5% CO2 하에서 37℃에서 인큐베이션하여 밤새 부착시켰다. 다음날, 세포를 완전 배지에서 0.313㎍/㎖에서 10㎍/㎖로 변화하는 mRNA 농도를 갖는 본원에 개시된 DOTAP-LNP 제형으로 24시간 연속 처리했다. 도 1a는 테스트된 LNP 제형에 대해 관찰된 루시페라아제 효소 활성을 도시한다. 테스트된 PEG 함유 제형과 비교하여 테스트된 PEG 비함유 제형(0% PEG)을 사용하여 달성된 루시페라아제 활성이 대략 600배 현저하게 증가했고, mFluc(루시페라아제) 활성은 핵산 카고 농도가 증가함에 따라 용량 의존적인 것으로 관찰되었다(용량 의존성은 특히 PEG 함유 제형에서 관찰된 반면, PEG 비함유 LNP에서는 카고 농도가 낮더라도 강력한 활성이 얻어졌다). 고농도의 테스트된 DOTAP-LNP는 현저한 세포독성을 유도하지 않았으며, 이는 현재의 개시된 제형의 독성 프로파일이 낮음을 입증했다(도 1b). 이들 데이터는 본 개시의 DOTAP-LNP 및 관련 카고가 시험관 내에서 효과적으로 내재화되었음을 입증했다. DOTAP-LNP 카고 활성은 세포 내에서도 유지되었고, mRNA 카고는 세포의 세포질에서 활성화되었으며, 낮은 세포독성이 관찰된 바, LNP 제형이 생체내 시험에 대해 안전하다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 폐 조직에 우선적으로 전달되는 테스트된 DOTAP 지질 나노입자(LNP)
mRNA 카고를 하버링하는 본원에 개시된 DOTAP-LNP의 생체내 전신 IV 후 체내분포를 평가했다. 다양한 표면 전하(0-26mV) 및 페길화 값(0-1%)을 갖는 DOTAP-LNP에 대해 정맥 내로 LNP-주사한 C57BL/6 마우스에서 채취한 장기에서의 세포 전달 및 카고 발현의 생체 내 이미징 및 생체 외 검출 둘 다를 통해 구체적으로 검사했다. 45%(몰%)의 DOTAP를 갖는 DOTAP-LNP 제형을 상기 표 1과 같이 PEG-DMG를 포함하게(1%) 및 포함하지 않게(0%) 제조했다. 또한, LNP는 제형에서 Cy7-DOPE (0.5몰%)로 형광 라벨링했다. 간략하게, mFluc mRNA 로딩된 DOTAP-LNP를 3mg/kg의 용량으로 마우스에 정맥 내 투여했다. 투여 6시간 후 및 24시간 후에, PBS 중의 150mg/kg의 루시페린을 복강 내 주사하고, 살아있는 동물의 형광 및 발광 이미징을 위해 마우스를 이소플루란 하에서 마취시켰다. Cy7 신호 분포는 LNP 체내분포를 나타내었지만, 발광 신호는 리포터 mRNA 카고 활성을 나타냈다. 특히, 모든 테스트된 DOTAP-LNP, N/P:3PEG:0 및 N/P:3PEG:1(표 1)은 마우스 폐에서 농축된 루시페라아제 활성(따라서 국소화 및 발현 모두)이 입증되었다(도 2a).
그 다음, 처치된 마우스의 주요 장기를 생체 외에서 검사했다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 테스트된 DOTAP-LNP는 폐 및 다른 장기에 널리 분포되어 있음에도 불구하고, DOTAP-LNP mRNA 발현은 폐에 매우 특이적이었다. 보다 넓은 LNP 분포가 명백하게 발생하였음에도 불구하고, 테스트된 DOTAP-LNP 전달 및 관련 mRNA 카고의 발현은 검출된 전체 발광 신호의 90%를 초과하는 레벨로 폐에서 관찰되었다(도 2d). 또 다른 놀라운 결과는 0% PEG를 갖는 DOTAP-LNP가 1% PEG를 갖는 DOTAP-LNP보다 폐에서 약 50배 더 높은 mRNA 발현(루시페라아제 활성에 의해 입증됨)을 나타냈다는 것이었다(도 2e). 이들 데이터는 테스트된 DOTAP-LNP mRNA 전달 및 발현에 대한 본원에서 관찰된 폐 선택성은 LNP 표면 전하 단독에 의한 것이 아니며, 이론에 구속되지는 않지만, DOTAP 및 폐 상피 사이의 명백한 구조적 친화성에 의해 야기될 가능성이 높다는 것을 입증했다. 또한, 체중 및 간 기능 테스트는 본 개시의 DOTAP-LNP가 IV 투여 후 24시간 이내에 생체내에서 독성이 없다는 것을 나타냈다(도 2f 및 2g).
실시예 4: 테스트된 DOTAP - LNP를 폐 조직에 우선적으로 전달하는 것은 PEG-지질 화학의 영향을 받지 않음
1% 페길화 지질을 포함하는 DOTAP-LNP와 비교하여 페길화 지질을 포함하지 않는 DOTAP-LNP에 대해 mRNA 활성이 더욱 크게 관찰된 것은 PEG가 부착된 지질의 아이덴티티가 DOTAP-LNP에 의한 카고 전달에 영향을 미치는지의 여부에 대한 추가 조사를 촉발했다. 이러한 실험은 테스트된 제형에서 PEG에 공액된 지질의 유형이 장기 표적화에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났음을 입증했다. 간략하게, C57BL/6 마우스에 1몰%의 PEG-DSG 또는 PEG-DMG를 함유하는 DOTAP-LNP를 3mg/kg 투여량으로 정맥 투여로 처리했다. mFluc를 LNP에 존재하는 리포터 mRNA 카고로서 사용하여, 루시페린 투여 시 발광 신호를 측정했다. 제형의 DOTAP는 45몰%로 유지했다. PEG-지질 유형과 상관없이, 폐에 포함된 mRNA계 루시페라아제 활성을 24, 48 및 72시간 시점에서 관찰했다. PEG-DSG 및 PEG-DMG 제형 둘 다 LNP의 넓은 분포를 나타냈지만; 신장은 관찰된 LNP 축적의 주요 장기였다(도 3a-3c). 이러한 결과는 신장이 테스트된 LNP에 대한 배설 경로일 가능성을 확인했다. 또한, 특정 장기(여기서는 폐)로부터의 높은 신호는 더 낮지만 여전히 유의한 다른 기관으로부터 나오는 신호를 가릴 수 있기 때문에, 폐는 초기 이미징으로부터 제거했고, 나머지 장기에 대해서 더 높은 신호 대 바탕비의 루시페라아제 복사휘도를 얻기 위해 재이미징화했다. 나머지 장기의 루시페라아제 신호는 폐의 신호와 비교하여 무시할 정도였다(도 3c). 또한, PEG-DSG 및 PEG-DMG 제형은 모두 체중 또는 간 기능 값에 유의한 변화를 유도하지 않았기 때문에 마우스에서 어떠한 독성의 징후도 나타나지 않았다(도 3d 및 3e).
실시예 5: 테스트된 DOTAP-LNP는 폐 세포 핵에 활성 Cre mRNA 리포터 시스템을 카고로서 전달함
본원에 개시된 DOTAP-LNP가 LNP 입자 크기, LNP 표면 전하 및 사용된 페길화 유형과 무관한 예시된 mRNA 카고에 대해 세포의 세포질에 대한 우선적 폐 표적화를 나타내는 것을 확인한 후, 이러한 LNP가 또한 표적 폐 조직의 Cre mRNA 리포터 시스템의 핵 전달을 달성할 수 있는지의 여부(예를 들면, CRISPR/Cas, 핵산 조절 컨트롤러 등과 같은 다른 시스템의 핵 전달이 본원에 기재된 바와 같은 DOTAP-LNP를 사용하여 달성될 수 있는지 여부의 표시)를 평가했다. 구체적으로, 상기 실시예의 mFluc 리포터 시스템은 형질도입된 장기 및 조직의 세포의 세포질로의 mRNA 전달을 필요로 했다. 그러나, 핵산 조절 컨트롤러 및 치료학적 mRNA의 다른 실시형태는 관심 표적 유전자를 조절하기 위해 발현된 단백질의 핵 내로의 전좌를 필요로 한다. 또한, 핵 전달을 위한 테스트 카고로 사용되는 Cre 리콤비나아제 효소 시스템도 mRNA로 인코딩된 단백질의 핵으로의 전위를 필요로 하므로, 효과적인 핵 전위를 위한 리포터로서 역할을 할 수 있다. loxP 부위(예를 들면 "loxP 옆에 있는" 표적 유전자의 경우 "플록싱된(floxed)")를 갖는 세포의 뉴클레아제에 전달될 때, Cre 리콤비나아제는 loxP 부위 사이에서 DNA의 부위 특이적 재조합을 촉매한다.
Cre 리콤비나아제 mRNA(mCre)를 카고로 캡슐화하는 45몰% DOTAP 및 1몰% PEG-DMG를 갖는 DOTAP-LNP를 재차 제조했다. mCre가 로딩된 DOTAP-LNP의 입자 크기, PDI 및 제타 전위는 각각 58.6±0.6nm, 0.09±0.03 및 1.2±0.6mV로 측정되었다. 98%를 초과하는 mCre가 제형화된 DOTAP-LNP와 관련되어 있다. 본원에 개시된 DOTAP-LNP의 세포 결합은 상이한 mRNA에 영향을 받지 않았다. 도 4a는 HEK293-loxP-GFP-RFP 세포주와의 본원에 개시된 Cre-담지 DOTAP-LNP의 용량 의존적 세포 결합을 도시한다. 이 세포주는 안정적으로 GFP 신호를 발현했지만, Cre-매개 loxP 재조합으로 인해 표적 세포의 핵에서의 Cre 리콤비나아제 발현 및 활성 시, 세포가 GFP 대신 RFP를 발현하기 시작했다(도 4b). 또한, mCre 전달 및 활성은 Cre가 성공적으로 전달되고 발현된 세포에서 GFP 신호의 소실을 측정하는 유세포 분석법의 사용을 통해 확인되었다(도 4c).
또한, 본원에 개시된 바와 같은 DOTAP-LNP는 생체내 폐 세포의 게놈을 표적화한 핵산 카고를 전달했다. Ail4 마우스(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortml4(CAG-tdTomato)Hze /J)에서 본원에 개시된 바와 같은 mCre가 로딩된 DOTAP-LNP의 생체분포를 조사했다. Ail4는 Gt(ROSA)26Sor 유전자좌에 모두 삽입된 CAG 프로모터 구동 적색 형광 단백질 변이체(tdTomato)의 전사를 방지하는 loxP 플랭크된(flanked)("플록싱된(floxed)") STOP 카세트를 갖도록 설계된 Cre 리포터 스트레인이다. Ail4 마우스는 Cre 매개 재조합 후 강력한 tdTomato 형광을 나타냈다. 간략하게, Ail4 마우스에 Cy7-라벨링된 mCre-로딩된 DOTAP-LNP를 3mg/kg 용량으로 정맥 주사했다. LNP 투여 후 48시간 및 72시간 후에, 마우스로부터 선택된 장기를 수집하고, LNP 분포 및 장기 특이적 활성을 모두 평가하기 위해 생체외 장기 이미징을 수행했다. 투여 후 48시간 및 72시간에서의 생체외 이미징은 테스트된 DOTAP-LNP가 개별 유형의 DOTAP-LNP에 대해 관찰된 입자 분포와 상관없이 폐 특이적 활성을 나타내는 것을 보여주었다(도 5a). 이들 결과는 본원에 개시된 바와 같은 DOTAP-LNP가 생체내 핵에서 이러한 mRNA 카고에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 및 활성을 촉진하는 방식으로 mRNA 카고를 전달한다는 것을 입증했다. 더욱이, 테스트된 DOTAP-LNP의 다양한 장기 내에서의 광범위한 분포 및 거의 중성의 전하에도 불구하고, 카고 mRNA 활성은 폐에 국한되어, 효율적인 세포질의 mRNA 전달(및 핵 표적으로 유도된 카고 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 궁극적인 핵 활성)을 위한 폐 조직에 대한 DOTAP의 구조적 친화성을 강화한다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 간과 폐 사이에 테스트된 DOTAP-LNP의 거의 동일한 분포에도 불구하고, mRNA 카고-인코딩된 Cre 효소 활성은, 하나의 동물 이상치를 제외하고는, 폐에서만 관찰되었다. 이들 결과는 본원에 개시된 바와 같은 DOTAP-LNP가 핵-지향적 핵산 조절 컨트롤러(즉, 단백질 컨트롤러 구성요소, 예를 들면 징크-핑거 단백질(ZFP) 또는 후생유전적 조절인자 및/또는 뉴클레아제와 관련된 다른 DNA- 또는 RNA-결합 도메인을 인코딩하는 mRNA) 및 특히 폐에서 게놈에 대한 영향을 나타내는 기타 핵산 카고를 전달할 수 있다는 것을 입증했다.
실시예 6: 테스트된 DOTAP - LNP가 모든 검사된 폐 세포 유형에 형질도입됨
본원에 개시된 바와 같은 DOTAP-LNP가 폐의 모든 세포 유형을 형질도입했는지의 여부를 결정하기 위해, LNP 처리된 Ail4 마우스로부터 채취한 간, 폐 및 비장에서의 tdTomato 신호를 평가했다. 건강한(야생형) 마우스 및 폐에 염증이 있는 마우스(NSG-SGM3 마우스) 둘 다의 상이한 세포 집단에서 tdTomato 발현 레벨을 측정하기 위해 1% PEG-DMG를 갖는 mCre-로딩된 DOTAP-LNP로 정맥주사로 처치된 Ail4 동물의 폐를 면역조직화학법(IHC)을 사용하여 평가했다(도 6a-6c). 대식세포, 상피 및 내피 세포는 검사된 모든 유형의 마우스에 모두 가시적으로 형질도입했으며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 DOTAP-LNP가 IV 투여 후 전구 세포 및 상피 세포 둘 다를 형질도입시켰다는 것을 입증했다. 이들 결과는 본원에 개시된 DOTAP-LNP가 핵산 카고의 폐 특이적 전달을 촉진했고, 핵산 조절 카고를 전달하기 위한 이러한 DOTAP-LNP의 사용이 염증이 있는 폐를 포함한 모든 방식의 폐 조직 유형을 포함한 폐 질환 및 장애의 치료를 위한 성공적인 요법을 제공할 수 있음을 나타내었다.
실시예 7: DOTAP - LNP 특징은 테스트된 제형 파라미터에 따라 달라지며, 결과적으로 개선된 활성을 갖는 LNP 제형을 식별함
제형 설계 파라미터 주변의 실패의 가장자리를 이해하고, DOTAP-LNP 전달을 최적화하기 위해, 통계적 실험 설계(DoE) 기반 제형 개발 프로세스를 수행했다. 인자 및 그 수준은 DOTAP(25-75몰%), PEG(0-1.5몰%) 및 N/P 비율(여기서는 2-4)로 정의되었다. 하기 표 2는 현재 실시예의 제형을 각각에 대한 조성 및 특성화 결과와 함께 요약한 것이다. 예비 LNP 제형 공정 성공 기준은 <200nm 입자 크기 및 <0.25 PDI로 정의되었다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, 50몰% DOTAP를 갖는 2개의 제형(DOE-1 및 DOE-3)은 이러한 예비 성공 기준을 충족하지 못했다. 이러한 결과는 DOTAP-LNP의 입자 크기 및 표면 전하가 제형 파라미터의 조작을 통해 제어될 수 있다는 것을 나타냈다.
*는 표시된 제형 파라미터로 인해 DOE가 선택되지 않았음을 나타낸다.
DoE로 제형 최적화를 수행한 것에 기반하여, 상기 기재된 바와 같이 Ail4 마우스 모델에서 이들의 생체분포의 추가적인 평가를 위해 2개의 제형을 선택했다. 제형 "3450"(0% PEG 및 45% DOTAP를 갖는 DOTAP-LNP) 및 제형 "4750"(0% PEG 및 75% DOTAP를 갖는 최적화된 DOTAP-LNP)을 각각 mCre mRNA 카고로 로딩하고, Ail4 마우스에 3mg/kg 투여량으로 정맥 주사했다. 두 제형 모두 동일한 양의 Cy7을 함유했고, 총 지질 농도는 동일했다. 3450 및 4750 제형 모두 폐에서만 mRNA 활성을 나타냈다(도 7a). 또한, 폐, 간, 심장 및 비장에서의 평균 tdTomato 신호 레벨은 테스트된 2개의 제형 간에 유의한 차이가 없었다(도 7b). 두 제형 모두, 관찰된 tdTomato 발현의 거의 100%가 폐에서 발생했다.
tdTomato 신호 생성은 용량 의존적이지 않았고, 항상 온 또는 오프로 기재될 수 있다. 그러나, Cy7 형광 라벨링된 지질의 이미징으로 도시된 바와 같이, 3450 제형보다 4750 제형이 더 많은 양의 LNP를 명백히 전달했다. 따라서, 4750 제형은 폐 조직에서 LNP 전달이 더 높아지게 되어, 용량 의존적 핵산 카고 전달을 필요로 하는 치료를 위해 선택될 수 있다.
표 3에 나타낸 바와 같이, DOTAP-LNP 제형의 특징화 파라미터는 관련 핵산 조절 컨트롤러와 함께 유지되었다. 평가된 제형은 60-380nm 입자 크기, 중성-양성 표면 전하, 및 바람직한 PDI 값을 나타냈다.
실시예 8: DOTAP - LNP는 또한 직접 주입/국부 투여를 통해 성공적으로 핵산 카고를 전달함
본원에 개시된 바와 같은 DOTAP-LNP의 IV 투여를 통한 활성 핵산 카고의 현저한 폐 세포 지향적 전달에 대해서는 상기에 기재되어 있다. mRNA 카고의 DOTAP-LNP 매개 전달이 국소 조직에 대한 직접 주입을 통해 발생할 수 있는지의 여부를 테스트하기 위해 관련 mRNA 리포터를 가진 DOTAP-LNP를 마우스 및 래트의 무릎에 주입(관절내)했다. 도 8은 테스트된 DOTAP-LNP에 의한 상기 기재된 리포터 시스템 mFluc 및 mCre의 국소 조직 영역으로의 성공적인 통합을 도시하고, 이로써 표적화된 조직 세포에서 카고의 세포질 및 핵 활성을 둘 다를 입증한다.
또한, 관련 mRNA 리포터 카고를 포함하는 DOTAP-LNP의 기관내 투여에 의해 핵산 카고를 폐 조직으로 성공적으로 전달하게 되었다. 구체적으로, Ail4 마우스 및 기관내(국소) 주입을 이용하여 테스트된 DOTAP-LNP의 폐로의 국소 전달이 관찰되었다(도 9a 및 9b). 0% PEG를 갖는 DOTAP-LNP를 15㎍ mCre/동물로 Ail4 마우스에 국소적으로 투여했다. 6, 24 및 48시간에서의 시간-의존성 이미징은 테스트된 mCre-로딩된 DOTAP-LNP의 국소 투여가 투여 후 6시간만큼 빨리 폐 및 기관에서 그 효과를 나타내기 시작했다는 것을 보여주었다(도 9a). 비표적 효과는 비장 또는 간에서 관찰되지 않았다(도 9a). 폐 조직 섹션의 면역조직화학법 염색은 테스트된 mCre mRNA 카고가 로딩된 DOTAP-LNP는 심지어 투여 후 6시간만큼 빨리 기관내(국소) 점적주입을 통해 키(key) 세포 유형(대식세포, 내피 및 상피 세포 포함)에 접근하는 것으로 추가로 나타났다(도 9b). 이들 결과는 본원에 개시된 바와 같은 핵산 카고의 DOTAP-LNP 전달이 효과적이었고, 기도 관련 세포 활성을 필요로 하는 임상 사례에서 폐로의 국소 투여에 적절할 가능성이 있다는 것을 입증했다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 본 개시에서 인용한 모든 참조는 각각의 참조가 개별적으로 그 전체가 참조에 의해 포함된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 포함된다.
당업자는 본 개시가 목적을 수행하고, 언급된 목적 및 이점뿐만 아니라 그 안에 내재된 것들을 얻기에 적합하다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 현재 바람직한 실시형태를 대표하는 것으로서 본원에 기재된 방법 및 조성물은 예시적이며, 본 개시의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 그것에서의 변경 및 다른 용도는 당업자에게 발생할 수 있지만, 그것은 본 개시의 정신 내에 포함되고, 청구범위의 범위에 의해 정의된다.
또한, 본 개시의 특징 또는 양태는 마쿠쉬군 또는 대체물의 다른 그룹화의 관점에서 기재되는 경우, 당업자는 본 개시가 그것에 의해 마쿠쉬군 또는 다른 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 관점에서도 기재됨을 인식할 것이다.
본 개시를 설명하는 맥락에 있어서의(특히 이하의 청구범위의 맥락에 있어서서의) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 참조어의 사용은 본원에 있어서 특별히 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수 모두를 커버하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(contaiing)"은 특별히 명시되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만, 이에 제한되지 않음"을 의미)로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 열거는, 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약기법으로서 역할을 하기 위한 것이며, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것인 것처럼 본 명세서에 포함된다.
본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들면 "~와 같은")의 사용은 단지 본 개시를 더 잘 설명하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한 본 개시의 범위를 제한하는 것은 아니다. 명세서 내의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 본 개시의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시의 실시형태는 개시된 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 형태를 포함하여, 본원에 기재된다. 이들 실시형태의 변형은 상술한 설명을 읽으면 당업자에게 명백해질 수 있다.
본원에 예시적으로 기재된 개시는 적합하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한(들) 없이 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면 본원의 각 경우에 있어서, 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 이루어지는("consisting essentially of") 및 "으로 이루어지는(consisting of)"은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 채용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서, 나타내어 기재된 특성 또는 그 일부의 임의의 등가물을 배재하려는 의도는 없지만, 청구된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 개시가 바람직한 실시형태를 제공하지만, 본원에 개시된 개념의 선택적인 특성, 수정 및 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있고, 또한 이러한 수정 및 변형은 본 설명 및 첨주된 청구범위에 의해 정의되는 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.
당업자에게 있어서, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고, 본원에 개시된 본 발명에 다양한 치환 및 수정이 가해질 수 있다는 것은 명백할 것이다. 따라서, 이러한 추가적인 실시형태는 본 개시 및 이하의 청구범위 내에 있다. 본 개시는 개선된 대조, 진단 및/또는 이미징 활성을 갖는 공액체를 생성하기 위해 본원에 기재된 화학적 수정의 다양한 조합 및/또는 치환을 테스트하는 것을 당업자에게 교시한다. 따라서, 본원에 기재된 특정 실시형태는 제한적이지 않으며, 당업자는 본원에 기재된 수정의 특정 조합이 개선된 대비, 진단 및/또는 이미징 활성을 갖는 공액체를 식별하기 위해 과도한 실험 없이 테스트될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.
본 발명자들은 당업자가 이러한 변형을 적절하게 채용할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본원에 구체적으로 기재된 것 이외의 방법으로도 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시는 적용 법에 의해 허용되는, 본원에 첨부된 청구범위에 기재된 주제의 모든 수정 및 등가물을 포함한다. 또한, 모든 가능한 변형에 있어서의 상술한 요소의 임의의 조합은 본원에서 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 본 개시에 포함된다. 당업자는 본원에 기재된 본 개시의 특정 실시형태에 대한 다수의 등가물을 인식하거나, 또는 일상적인 실험만을 이용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.

Claims (75)

  1. 피험체의 폐 조직에 핵산 카고를 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서,
    핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼80몰%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 포함하는 핵산-지질 입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 0.01∼2%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG는 550달톤∼3000달톤의 평균 분자량을 갖고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 상기 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 0.5몰%, 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0몰%, 및 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.5몰%로 이루어진 군에서 선택되는 농도로 포함하는 핵산-지질 입자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않고, 선택적으로 핵산-지질 입자는 PEG를 포함하지 않는 핵산-지질 입자.
  4. 제 3 항에 있어서,
    핵산-지질 입자는 멀티도스 요법의 구성요소인 핵산-지질 입자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼80몰%를 포함하는 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 비양이온성 지질은 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 핵산-지질 입자.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 10몰%∼20몰%, 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 35몰%∼45몰%, 및 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 60몰%∼70몰%로 이루어진 군에서 선택되는 농도 범위로 포함하는 핵산-지질 입자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 5몰%∼20몰%를 구성하고, 선택적으로 상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%를 구성하는 핵산-지질 입자.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 β-시토스테롤로 이루어진 군에서 선택되는 비양이온성 지질이고, 선택적으로 상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)인 핵산-지질 입자.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 카고는 합성 또는 자연 발생 RNA 또는 DNA, 또는 이들의 유도체를 포함하고, 선택적으로 상기 핵산 카고는 수식된 RNA이고, 선택적으로 상기 수식된 RNA는 수식된 mRNA, 수식된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 수식된 siRNA로 이루어진 군에서 선택되며, 선택적으로 상기 수식된 mRNA는 핵산 조절 컨트롤러를 인코딩하는 핵산-지질 입자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 카고는 2'-O-메틸 수식 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 수식 뉴클레오티드, 5'-메톡시-수식 뉴클레오티드(예를 들면, 5'-메톡시우리딘), 2'-데옥시-수식 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식 뉴클레오티드, 2'-알킬-수식 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드; 포스포로티오에이트를 포함하는 인터뉴클레오시드 연결 또는 백본, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 인접한 뉴클레오티드 유닛의 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 반전된 극성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 수식을 포함하는 핵산-지질 입자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폐 조직은 상피, 내피, 간질 결합 조직, 혈관, 조혈 조직, 림프 조직 및 흉막으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산-지질 입자.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼49몰%를 구성하는 DOTAP를 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자는 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 25몰% 또는 약 45몰%를 구성하는 DOTAP를 포함하는 핵산-지질 입자.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 50몰% 또는 약 75몰%를 구성하는 DOTAP를 포함하는 핵산-지질 입자.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산-지질 입자 및 의약적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 의약 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    비경구 투여, 선택적으로 정맥 주사용으로 제형화되는 의약 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    흡입용으로 제형화되는 의약 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서,
    폐 조직으로의 직접 주사용으로 제형화되는 의약 조성물.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산-지질 입자 또는 의약 조성물을 피험체에게 정맥내 투여하면, 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현이 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 2배 더 높은 레벨로 되고, 선택적으로 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현이 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 3배 더 높고, 선택적으로 적어도 4배 더 높고, 선택적으로 적어도 5배 더 높고, 선택적으로 적어도 6배 더 높고, 선택적으로 적어도 7배 더 높고, 선택적으로 적어도 8배 더 높고, 선택적으로 적어도 9배 더 높고, 선택적으로 적어도 10배 더 높고, 선택적으로 적어도 11배 더 높고, 선택적으로 적어도 12배 더 높고, 선택적으로 적어도 13배 더 높고, 선택적으로 적어도 14배 더 높고, 선택적으로 적어도 15배 더 높고, 선택적으로 적어도 20배 더 높은 핵산-지질 입자 또는 의약 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산-지질 입자 또는 의약 조성물을 피험체에게 정맥내 투여하면, 심장, 비장, 난소 및 췌장으로 이루어진 군에서 선택되는 피험체의 하나 이상의 다른 조직에서의 핵산-지질 입자의 농도보다 적어도 2배 더 높은 농도로 피험체의 폐 조직에 핵산-지질 입자가 국소화되고, 선택적으로 심장, 비장, 난소 및 췌장으로 이루어진 군에서 선택되는 피험체의 하나 이상의 다른 조직과 비교하여 폐에 적어도 3배, 선택적으로 적어도 4배, 선택적으로 적어도 5배, 선택적으로 적어도 6배 더 높은 농도의 핵산-지질 입자가 위치되는 핵산-지질 입자 또는 의약 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산-지질 입자 또는 의약 조성물은 폐 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여되고, 선택적으로 상기 질환 또는 장애는 폐암, 폐렴, 폐섬유증, COPD, 천식, 기관지확장증, 사르코이드증, 폐고혈압, 폐기종, 알파-1 항트립신 결핍증, 아스페르길루스증, 세기관지염, 기관지염, 진폐증, 코로나 바이러스, 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군, 낭포성 섬유증, 레지오넬라증, 인플루엔자, 백일해, 폐색전증 및 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산-지질 입자 또는 의약 조성물.
  21. 피험체의 조직에 핵산 카고를 전달하기 위한 폴리에틸렌글리콜(PEG) 비함유 지질-핵산 입자로서,
    PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼80몰%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 포함하는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 비함유 지질-핵산 입자.
  22. 제 21 항에 있어서,
    PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 20몰%∼80몰%를 구성하는 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 비양이온성 지질은 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 PEG 비함유 지질-핵산 입자.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤 또는 그 유도체를 PEG 비함유 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 10몰%∼20몰%, PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 35몰%∼45몰%, 및 PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 60몰%∼70몰%로 이루어진 군에서 선택되는 농도 범위로 포함하는 PEG 비함유 지질-핵산 입자.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 5몰%∼20몰%를 구성하고, 선택적으로 상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 PEG 비함유 지질-핵산 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%를 구성하는 PEG 비함유 지질-핵산 입자.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 β-시토스테롤로 이루어진 군에서 선택되는 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)인 PEG 비함유 지질-핵산 입자.
  26. 제 21 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 카고는 합성 또는 자연 발생 RNA 또는 DNA, 또는 이들의 유도체를 포함하고, 선택적으로 상기 핵산 카고는 수식된 RNA이고, 선택적으로 상기 RNA는 mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA로 이루어진 군에서 선택되고, 선택적으로 상기 mRNA는 핵산 조절 컨트롤러(즉, 단백질 컨트롤러 구성요소를 인코딩하는 mRNA)를 인코딩하는 PEG 비함유 지질-핵산 입자.
  27. 제 21 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 카고는 2'-O-메틸 수식 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 수식 뉴클레오티드, 5'-메톡시-수식 뉴클레오티드(예를 들면 5'-메톡시우리딘), 2'-데옥시-수식 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식 뉴클레오티드, 2'-알킬-수식 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드; 포스포로티오에이트를 포함하는 인터뉴클레오시드 연결 또는 백본, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 인접한 뉴클레오티드 유닛의 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 반전된 극성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 수식을 포함하는 PEG 비함유 지질-핵산 입자.
  28. 제 21 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조직은 폐, 관절, 표피, 진피, 내피 및 혈액 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 PEG 비함유 지질-핵산 입자.
  29. 제 21 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PEG 비함유 핵산-지질 입자는 비경구적으로 투여되고, 선택적으로 상기 PEG 비함유 핵산-지질 입자는 흡입, 국소 도포 및 주사로 이루어진 군에서 선택되는 경로를 통해 투여되고, 선택적으로 상기 주사는 정맥 주사, 기관내 주사 또는 점적주입, 관절내 주사, 피하 주사, 피내 주사 및 근육내 주사로 이루어진 군에서 선택되는 PEG 비함유 핵산-지질 입자.
  30. 제 21 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG 비함유 핵산-지질 입자는 멀티도스 요법의 구성요소인 PEG 비함유 핵산-지질 입자.
  31. 제 21 항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 기재된 PEG 비함유 핵산-지질 입자 및 의약적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 의약 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    비경구 투여, 선택적으로 정맥 주사용으로 제형화되는 의약 조성물.
  33. 제 31 항에 있어서,
    흡입용으로 제형화되는 의약 조성물.
  34. 제 31 항에 있어서,
    조직으로의 직접 주사용으로 제형화되는 의약 조성물.
  35. 제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐, 관절, 표피, 진피, 내피 및 혈액 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 조직에 투여되는 의약 조성물.
  36. 제 31 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약 조성물은:
    폐 질환 또는 장애로서, 선택적으로 폐암, 폐렴, 폐섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식, 기관지확장증, 사르코이드증, 폐고혈압, 폐기종, 알파-1 항트립신 결핍증, 아스페르길루스증, 세기관지염, 기관지염, 진폐증, 코로나 바이러스(예를 들면 SARS-CoV-2), 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군, 낭포성 섬유증, 레지오넬라증, 인플루엔자, 백일해, 폐색전증 및 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 폐 질환 또는 장애;
    관절 질환 또는 장애로서, 선택적으로 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및 골관절염으로 이루어진 군에서 선택되는 관절 질환 또는 장애;
    염증성 질환 또는 장애로서, 선택적으로 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상성 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 감염성 관절염, 감염후 관절염, 임균 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비관절염 류머티즘, 활액낭염, 고초열, 화농성 염증(예를 들면 테니스 엘보우), 신경병성 관절 질환, 혈관절증, 헤노호 쉰라인 자반증, 비후성 골관절염, 다발성 치질, 척추측만증, 혈색소침착증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지-폐 이형성증 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 질환 또는 장애; 및
    표피 질환 또는 장애로서, 선택적으로 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 습진, 주사, 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병, 일반 사마귀, 각화극세포종 및 지루각화증으로 이루어진 군에서 선택되는 표피 질환 또는 장애로 이루어진 군에서 선택되는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 피험체에게 투여되는 의약 조성물.
  37. 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 45몰%로 포함하고, N/P 비율이 약 3인 핵산-지질 입자.
  38. 제 37 항에 있어서,
    핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않고, 선택적으로 핵산-지질 입자는 PEG를 포함하지 않는 핵산-지질 입자.
  39. 제 37 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0몰% 농도로 포함하는 핵산-지질 입자.
  40. 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 45몰%로 포함하고, N/P 비율이 약 6인 핵산-지질 입자.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0몰% 농도로 포함하는 핵산-지질 입자.
  42. 제 40 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 2.0%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 2.0몰% 농도로 포함하는 핵산-지질 입자.
  43. 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 50몰%로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%로, 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 38몰%∼약 40몰%로 포함하는 핵산-지질 입자.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 39.75몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2인 핵산-지질 입자.
  45. 제 43 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 39.75몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3인 핵산-지질 입자.
  46. 제 43 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 0.5%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 39.25몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3인 핵산-지질 입자.
  47. 제 43 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 38.75몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3인 핵산-지질 입자.
  48. 제 43 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 38.75몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2인 핵산-지질 입자.
  49. 제 43 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.5%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 38.25몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 4인 핵산-지질 입자.
  50. 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 25몰%로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%로, 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 63몰%∼약 65몰%로 포함하는 핵산-지질 입자.
  51. 제 50 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 64.75몰%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3인 핵산-지질 입자.
  52. 제 50 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 0.5%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 64.25몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 4인 핵산-지질 입자.
  53. 제 50 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 63.75몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 4인 핵산-지질 입자.
  54. 제 50 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.5%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 63.25몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2인 핵산-지질 입자.
  55. 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 75몰%로, 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 10몰%로, 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 13몰%∼약 15몰%로 포함하는 핵산-지질 입자.
  56. 제 55 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 포함하지 않고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 14.75몰%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 4인 핵산-지질 입자.
  57. 제 55 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 0.5%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 0.5%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 14.25몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2인 핵산-지질 입자.
  58. 제 55 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.0%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.0%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 13.75몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 2인 핵산-지질 입자.
  59. 제 55 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자는 존재하는 총 지질의 약 1.5%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 공액 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 공액 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 공액체를 포함하고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체의 PEG의 평균 분자량은 550달톤∼3000달톤이고, 선택적으로 상기 PEG-지질 공액체는 PEG2000-지질 공액체이고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 PEG2000-지질 공액체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 공액체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 1.5%로 포함하고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자는 콜레스테롤 또는 그 유도체를 핵산-지질 입자 중에 존재하는 총 지질의 약 13.25몰%로 포함하고, 선택적으로 핵산-지질 입자의 N/P 비율은 약 3인 핵산-지질 입자.
  60. 제 37 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 β-시토스테롤로 이루어진 군에서 선택되는 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로 상기 콜레스테롤 또는 그 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)인 핵산-지질 입자.
  61. 제 37 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산-지질 입자 및 의약적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 의약 조성물.
  62. 제 61 항에 있어서,
    비경구 투여, 선택적으로 정맥 주사용으로 제형화되는 의약 조성물.
  63. 제 61 항에 있어서,
    흡입용으로 제형화되는 의약 조성물.
  64. 제 61 항에 있어서,
    조직으로의 직접 주사용으로 제형화되는 의약 조성물.
  65. 제 61 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐, 관절, 표피, 진피, 내피 및 혈액 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 조직에 투여되는 의약 조성물.
  66. 제 61 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약 조성물은:
    폐 질환 또는 장애로서, 선택적으로 폐암, 폐렴, 폐섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식, 기관지확장증, 사르코이드증, 폐고혈압, 폐기종, 알파-1 항트립신 결핍증, 아스페르길루스증, 세기관지염, 기관지염, 진폐증, 코로나 바이러스(예를 들면 SARS-CoV-2), 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군, 낭포성 섬유증, 레지오넬라증, 인플루엔자, 백일해, 폐색전증 및 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 폐 질환 또는 장애;
    관절 질환 또는 장애로서, 선택적으로 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및 골관절염으로 이루어진 군에서 선택되는 관절 질환 또는 장애;
    염증성 질환 또는 장애로서, 선택적으로 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상성 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 감염성 관절염, 감염후 관절염, 임균 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비관절염 류머티즘, 활액낭염, 고초열, 화농성 염증(예를 들면 테니스 엘보우), 신경병성 관절 질환, 혈관절증, 헤노호 쉰라인 자반증, 비후성 골관절염, 다발성 치질, 척추측만증, 혈색소침착증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지-폐 이형성증 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 질환 또는 장애; 및
    표피 질환 또는 장애로서, 선택적으로 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 습진, 주사, 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병, 일반 사마귀, 각화극세포종 및 지루각화증으로 이루어진 군에서 선택되는 표피 질환 또는 장애로 이루어진 군에서 선택되는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 피험체에게 투여되는 의약 조성물.
  67. 제 1 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산-지질 입자, 의약 조성물 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자를 포함하는 주사액.
  68. 제 1 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG 비함유 지질-핵산 입자 또는 주사액을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 폐 조직에 핵산 카고를 전달하는 방법.
  69. 제 1 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG 비함유 지질-핵산 입자 또는 주사액을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에 있어서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  70. 제 68 항 또는 제 69 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG 비함유 지질-핵산 입자 또는 주사액은 정맥내 투여되고, 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현이 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 2배 더 높은 레벨로 발생하고, 선택적으로 피험체의 폐 조직의 세포에서의 핵산 카고의 발현이 피험체의 간, 심장, 비장, 난소, 췌장 및 신장의 세포에서의 핵산 카고의 발현보다 적어도 3배 더 높고, 선택적으로 적어도 4배 더 높고, 선택적으로 적어도 5배 더 높고, 선택적으로 적어도 6배 더 높고, 선택적으로 적어도 7배 더 높고, 선택적으로 적어도 8배 더 높고, 선택적으로 적어도 9배 더 높고, 선택적으로 적어도 10배 더 높고, 선택적으로 적어도 11배 더 높고, 선택적으로 적어도 12배 더 높고, 선택적으로 적어도 13배 더 높고, 선택적으로 적어도 14배 더 높고, 선택적으로 적어도 15배 더 높고, 선택적으로 적어도 20배 더 높은 방법.
  71. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG 비함유 지질-핵산 입자 또는 주사액은 정맥내 투여되고, 핵산-지질 입자 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자는 심장, 비장, 난소 및 췌장으로 이루어진 군에서 선택되는 피험체의 하나 이상의 다른 조직에서의 핵산-지질 입자 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자의 농도보다 적어도 2배 더 높은 농도로 피험체의 폐 조직에 국소화되고, 선택적으로 심장, 비장, 난소 및 췌장으로 이루어진 군에서 선택되는 피험체의 하나 이상의 다른 조직과 비교하여, 적어도 3배, 선택적으로 적어도 4배, 선택적으로 적어도 5배, 선택적으로 적어도 6배 더 높은 농도의 핵산-지질 입자 또는 PEG 비함유 지질-핵산 입자가 폐에 존재하는 방법.
  72. 제 69 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는:
    폐 질환 또는 장애로서, 선택적으로 폐암, 폐렴, 폐섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식, 기관지확장증, 사르코이드증, 폐고혈압, 폐기종, 알파-1 항트립신 결핍증, 아스페르길루스증, 세기관지염, 기관지염, 진폐증, 코로나 바이러스(예를 들면 SARS-CoV-2), 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군, 낭포성 섬유증, 레지오넬라증, 인플루엔자, 백일해, 폐색전증 및 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 폐 질환 또는 장애;
    관절 질환 또는 장애로서, 선택적으로 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및 골관절염으로 이루어진 군에서 선택되는 관절 질환 또는 장애;
    염증성 질환 또는 장애로서, 선택적으로 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상성 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 감염성 관절염, 감염후 관절염, 임균 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비관절염 류머티즘, 활액낭염, 고초열, 화농성 염증(예를 들면 테니스 엘보우), 신경병성 관절 질환, 혈관절증, 헤노호 쉰라인 자반증, 비후성 골관절염, 다발성 치질, 척추측만증, 혈색소침착증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지-폐 이형성증 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 질환 또는 장애; 및
    표피 질환 또는 장애로서, 선택적으로 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 습진, 주사, 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병, 일반 사마귀, 각화극세포종 및 지루각화증으로 이루어진 군에서 선택되는 표피 질환 또는 장애로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  73. 제 68 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG-비함유 지질-핵산 입자 또는 주사액은 비경구적으로 투여되고, 선택적으로 상기 핵산-지질 입자, 의약 조성물, PEG-비함유 지질-핵산 입자 또는 주사액은 흡입, 국소 도포 및 주사로 이루어진 군에서 선택되는 경로를 통해 투여되고, 선택적으로 상기 주사는 정맥 주사, 기관내 주사 또는 점적주입, 관절내 주사, 피하 주사, 피내 주사 및 근육내 주사로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  74. 제 68 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 카고는 합성 또는 자연 발생 RNA 또는 DNA, 또는 이들의 유도체를 포함하고, 선택적으로 상기 핵산 카고는 수식된 RNA이고, 선택적으로 상기 수식된 RNA는 수식된 mRNA, 수식된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 수식된 siRNA로 이루어진 군에서 선택되며, 선택적으로 상기 수식된 mRNA는 핵산 조절 컨트롤러를 인코딩하는 방법.
  75. 제 68 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 카고는 2'-O-메틸 수식 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 수식 뉴클레오티드, 5'-메톡시-수식 뉴클레오티드(예를 들면, 5'-메톡시우리딘), 2'-데옥시-수식 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식 뉴클레오티드, 2'-알킬-수식 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드; 포스포로티오에이트를 포함하는 인터뉴클레오시드 연결 또는 백본, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 인접한 뉴클레오티드 유닛의 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 반전된 극성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 수식을 포함하는 방법.
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