KR100824068B1

KR100824068B1 - 소수성 요오드 화합물을 함유하는 리포솜

Info

Publication number: KR100824068B1
Application number: KR1020027014403A
Authority: KR
Inventors: 아이카와카주히로; 키타구치히로시
Original assignee: 후지필름 홀딩스 가부시끼가이샤
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2008-04-21
Also published as: CA2407654C; ATE363920T1; AU2001252603B2; AU5260301A; EP1284146A1; EP1284146B1; CA2407654A1; WO2001082977A1; DE60128800D1; NZ522457A; DE60128800T2; KR20020093957A; US20030180220A1; US7101532B2; EP1284146A4

Abstract

탄소수 18이상의 치환기를 적어도 1개 가지는 1,3,5-트리 요오드 벤젠 유도체 등의 소수성 요오드 화합물을 막 구성 성분으로서 함유하는 리포솜 및 혈관 질환의 조영 등에 사용하기 위한 상기 리포솜을 함유하는 X선 조영제.

Description

소수성 요오드 화합물을 함유하는 리포솜{LIPOSOME CONTAINING HYDROPHOBIC IODINE COMPOUND}

본 발명은 리포솜에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 소수성 요오드 화합물을 질환부위에 선택적으로 집적시켜 비질환부위와 콘트라스트를 붙여서 조영하는 방법에 이용 가능한 리포솜 관한 것이다.

현대사회, 특히 선진국 사회에서는 고 칼로리·고 지방의 식사를 섭취하는 기회가 증대되고 있다. 그 때문에 동맥경화증이 원인이 되는 허혈성 질환(심근경색·협심증 등의 심질환, 뇌경색·뇌출혈 등의 뇌혈관 질환)의 사망자 수가 증가되고 있고, 이 증상을 초기단계에서 진단하여 적절한 치료를 행하는 것이 요망되고 있다. 그러나, 상기 질환이 발증하기 이전에 동맥경화 진행을 초기단계에서 진단하는 만족할 수 있는 방법은 존재하지 않는다.

동맥경화증의 진단방법으로서는 비침습적인 방법과 동맥에 카테터(catheter) 등을 삽입하는 침습적인 방법으로 대별된다. 이 중에서 비침습적 방법의 주요한 것은 X선 혈관조영과 초음파이지만, 초기의 동맥경화, 특히 심근경색이나 협심증의 원인이 되는 관상동맥의 협착(수축)을 초기단계에서 발증전에 검출하는 것은 거의 불가능하다.

비침습적인 방법으로서는 CT, MRI 등도 사용할 수 있으나, 이들은 주로 종양의 발견을 위하여 개발된 방법이며, 동맥경화 병소의 해상도에 문제가 있을 뿐만 아니라, 비싸고 대형의 장치를 필요로 하기 때문에 실시할 수 있는 병원 수도 한정되어 일반적으로는 이용되고 있지 않는다. 또 라디오 아이소토프를 사용하는 방법도 검토되고 있으나, 실험의 프레임이 나오지 않는다.

한편, 침습적인 방법으로서는 혈관내 에코, 혈관 내시경 등이 사용되고 있다. 이들 방법에 의하면 동맥경화의 병소를 0.1mm두께까지 측정하는 것이 가능하다고 전해지고 있다. 그러나, 이들 방법은 카테터(catheter)의 선단에 장착된 초음파 발진기, 내시경을 동맥내에 삽입할 필요가 있다. 이것은 환자에게 큰 육체적 정신적인 부담을 강요함과 동시에, 위험도 따른다. 따라서, 심근경색 등의 발작을 일으킨 환자의 치료나 2차 예방을 위하여 실시되고는 있으나 발증이전의 사람에게 동맥경화의 유무 혹은 진행을 진단하는 목적에는 사용할 수 없다.

이들 중, 동맥 협착부위의 특정에 가장 널리 사용되고 있는 것은 X선 혈관조영이다. 이것은 수용성의 요오드 조영제를 투여함으로서 혈액의 흐름을 조영하여 그 흐름이 정체되어 있는 부위를 관찰하는 방법이다. 그러나, 이 방법에서는 통상적으로 수축이 50%이상 진전된 병소 밖에 검출할 수 없어 허혈성 질환의 발작이 발증하기전에 병소를 검출하는 것은 곤란하다.

이와는 별개로 소수성 요오드 조영제 혹은 친수성 조영제를 제제화(製劑化)하여 목적으로 하는 질환부위에 선택적으로 집적시키는 시도가 보고되어 있다(국제공개 WO95/19186, 동 W095/21631, 동 W089/00812, 영국특허 제867650호, 국제공개 W096/00089, 동 W094/19025, 동 W096/40615, 동 W095/2295, 동 W098/41239, 동 W098/23297, 동 W099/02193, 동 W097/06132, 미국특허 제4192859호 명세서, 동 제4567034호 명세서, 동 제4925649호 명세서, Pharm. Res., 16(3), 420(1999), J.Pharm. Sci., 72(8), 898(1983), InVest. Radiol., 18(3), 275(1983). 예를 들면 Pharm. Res. 16(3), 420(1999)에는 소수성 화합물인 Cholesteryl Iopanoate의 유적(油滴)분산액을 주사함으로서 상기 요오드 화합물이 실험동물의 동맥경화부위에 집적하는 것이 개시되어 있다.

또, J. Pharm. Sci., 72(8), 898(1983)에는 Cholesteryl Iopanoate의 유적분산액을 주사하는 것에 의한 간장이나 비장의 X선 조영 예가 개시되어 있다. 미국특허 제4567034호 명세서에는 diatrizoic acid의 에스테르체를 리포솜에 봉입하여 간장이나 비장의 선택적 조영을 행하는 방법이 보고되어 있다. 국제공개 W096/28414, 동 W096/00089에는 혈관 푸울이나 림프계(lymphatic systems)를 이미지화하기 위한 조영제가 개시되어 있다. 그러나, 이들 제조방법은 혈관질환을 선택적으로 조영하는 목적을 위해서는 효율 및 선택성 모두에 충분하지 않고, X선 조사에 의해 혈관질환을 화상화한 예도 보고되어 있지 않다.

한편, 근년 동맥질환의 발증기구에 대해서 유전자, 단백질, 세포의 각 레벨에 의해 해명이 진행되어 왔다(J. Biol. chem. 1996, 271(44) 27346-52 ; Nature 386(6662) 292-6). 동맥경화에 관해서 말하면 복수의 세포가 서로 증식을 조절하면 서 병소를 형성하는 것이 분명히 밝혀져 왔다(Arterioscler. Throm. Vasc. Biol. 1999(3) 461-71 ; Lab Invest 1998 78(4) 423-34). 이러한 복수의 세포가 관여하는 병소상태를 세포배양기내에서 재현한 예는 없고, 동맥경화나 재수축의 약제 평가는 지금까지 주로 모델 동물을 통해서 행해져 왔다.

그러나, 이러한 동물을 사용하는 방법은 모두 시간, 코스트가 많이 소요되고, 또한 동물 애호의 관점에서도 필요 최소한으로 하는 것이 요망되고 있다. 따라서, 다수의 화합물을 단시간에 스크리닝(screening)하기 위하여 동맥경화 병소의 상태를 재현한 in vitro 평가법이 지닌 것이 요망되고 있다.

본 발명의 과제는 동맥경화나 PTCA후 재수축 등의 혈관 평활근의 이상 증식에 기인하는 혈관 질환부위에 대해서 선택적으로 요오드 화합물을 집적시키기 위한 수단을 제공하는데 있다. 그 수단을 사용함으로서 혈관질환 등의 생체내 환경을 X선 조영에 의해 화상화하는 것도 본 발명의 다른 과제이다. 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 행한 결과, 소수성 요오드 화합물을 막 구성 성분의 하나로 포함하는 리포솜이 동맥경화소의 주 구성 성분인 혈관 평활근 및 포말화 매크로 페이지(macrophage)에 집적하는 것을 발견해 내었다.

또, 본 발명의 다른 과제는 동맥경화나 재수축 등 병소 상태를 재현한 세포 배양계 및 그 제조방법을 제공하는데 있다. 이 수단을 이용함으로서 동맥질환에 대한 약제의 평가법을 제공하는 것도 본 발명의 과제이다. 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 연구를 행한 결과 동일한 세포 배양기내에서 포유류 동물의 병소를 형성하는 2종류 이상의 세포종을 동시에 배양함으로서 동맥경화소나 재수축 등의 병소 상태를 재현한 세포배양계를 제공할 수 있는 것을 발견해 냈다.

본 발명은 상기 식견을 기초로 해서 완성한 것이다.

즉, 본 발명은 소수성 요오드 화합물을 막 구성 성분으로서 함유하는 리포솜을 제공하는 것이다. 본 발명의 바람직한 태양에 의하면 소수성 요오드 화합물이 탄소수 18이상의 치환기를 적어도 1개 가지는 1, 3, 5-트리 요오드 벤젠유도체인 상기 리포솜; 포스파티딜 콜린 및 포스파티딜 세린으로 이루어진 군에서 선택되는 지질(脂質)을 막 구성 성분으로서 함유하는 상기 리포솜; 탄소수 6이상의 알킬의 디에스테르인 인산디알킬 에스테르를 막 구성 성분으로서 함유하는 상기 리포솜; 및 탄소수 18이상의 치환기가 콜레스테롤 유도체의 잔기인 상기 리포솜이 제공된다.

다른 관점에서는 상기 리포솜을 함유하는 X선 조영제가 제공된다. 본 발명의 바람직한 태양에 의하면 혈관질환의 조영, 바람직하게는 포말화 매크로 페이지의 영향에 의해 이상 증식한 혈관 평활근 세포, 예를 들면 동맥경화소나 PTCA후 재수축의 조영에 이용하기 위한 상기 X선 조영제가 제공된다. 또, 혈관질환의 조영방법에 있어서 상기 리포솜을 이용해서 X선 조영하는 공정을 포함하는 방법 및 상기 x선 조영제의 제조를 위한 상기 리포솜의 사용이 본 발명에 의해 제공된다.

또한, 다른 관점에서는 본 발명에 의해 동일한 세포 배양기 내에서 포유류 동물질환의 병소형성에 관여하는 2종류 이상의 세포종을 동시에 배양하는 공정을 포함하는 배양계의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 세포종이 생체로부터 분리한 초대 배양세포 또는 주화된 계대세포인 상기 방법; 세포종이 포유류 동물의 초대 배양세포인 상기 방법; 및 포유류 동물질환이 인간의 질병인 상기 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양에 의하면, 세포종의 적어도 하나가 동맥경화 병소 형성에 관여하는 세포인 상기 방법; 세포종이 매크로 페이지, 혈관 평활근 세포 및 혈관 내피세포로 이루어진 군에서 선택되는 상기 방법; 2종류 이상의 세포종을 동일한 세포 배양기 내에서 셀·필터를 사이에 두고 배양하는 공정을 포함하는 상기 방법; 및 2종류의 세포종이 매크로 페이지 및 혈관 평활근 세포인 상기 방법이 제공된다. 본 발명의 특히 바람직한 태양에 의하면 동맥경화 병소의 형성에 관여하는 포유류 초대 배양세포 2종류를 셀·필터에 의해 가로 막으면서 동일한 배양기 내에서 배양하고, 동맥경화 병소의 상태를 재현한 배양계를 제조하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 의해 상기 배양계의 제조방법에 의해 얻을 수 있는 세포배양계가 제공된다. 또, 상기 배양계의 제조방법에 의해 얻을 수 있는 세포배양계를 이용해서 약제를 스크리닝하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다. 바람직한 태양으로서 포말화시킨 매크로 페이지 및 혈관 평활근 세포를 셀·필터를 사이에 두고 배양함으로서 증식시킨 혈관 평활근 세포에 대한 약제의 작용을 측정하는 공정을 포함하고, 혈관질환에 대한 약제의 유효성 판정방법; 및 포말화시킨 매크로 페이지 및 혈관 평활근 세포를 셀·필터를 사이에 두고 배양함으로서 증식시킨 혈관 평활 근 세포에 대한 약제의 작용을 측정하는 공정을 포함하고, 약제의 혈관질환 병소에의 이행성의 평가방법이 본 발명에 의해 제공된다.

도 1은 마우스 포말화 매크로페이지의 존재 하에서 마우스혈관 평활근 세포의 증식이 유도되는 결과를 나타낸다.

도 2는 마우스 포말화 마이크로 페이지를 첨가하지 않은 경우의 마우스혈관 평활근 세포의 증식곡선을 나타낸다.

도 3은 래트 포말화 매크로 페이지의 존재 하에서 래트(rat) 혈관 평활근 세포의 증식이 유도되는 결과를 나타낸다.

도 4는 토끼 포말화 매크로 페이지의 존재 하에서 토끼 혈관 평활근 세포의 증식이 유도되는 결과를 나타낸다.

도 5는 마우스 혈관 평활근 세포에 의한 리포솜의 흡수를 나타낸다. ①은 도 2에 나타낸 마우스 포말화 매크로 페이지를 첨가하지 않은 배양시스템에서 3일후에 리포솜 제제를 첨가하여 1일간 배양한 결과를 나타내고; ②는 도 1에 나타낸 마우스 포말화 매크로 페이지를 첨가한 배양계에서 5일 후에 리포솜제제를 첨가해서 1일간 배양한 결과를 나타내고; ③은 도 1에 나타낸 마우스 포말화 매크로 페이지를 첨가한 배양계에서 7일 후에 리포솜 제제를 첨가해서 1일간 배양한 결과를 나타낸다.

도 6은 본 발명의 리포솜 대신에 유적 현탁제를 사용한 경우의 결과를 나타낸다.

도 7은 도 3의 배양조건으로 배양된 래트 혈관 평활근 세포에 의한 리포솜의 흡수를 나타낸다. ①②③은 도 5와 같은 의미를 나타낸다.

도 8은 도 4의 배양조건으로 배양된 토끼 혈관 평활근 세포에 의한 리포솜의 흡수를 나타낸다. ①②③은 도 5와 같은 뜻을 나타낸다.

도 9는 본 발명의 리포솜을 이용해서 동맥경화소를 X선 촬영에 의해 조영한 결과를 나타낸 사진이다. 도면에서 「투여전」은 리포솜 투여전의 결과를 나타내고, 「투여직후」는 리포솜의 투여직후의 결과를 나타낸다.

도 10은 본 발명의 리포솜을 이용해서 동맥경화소를 X선촬영에 의해 조영한 결과를 나타낸 사진이다. 도면에서 「투여 15분후」는 리포솜 투여 15분 후의 결과를 나타내고, 「투여 30분후」는 리포솜 투여 30분 후의 결과를 나타낸다.

소수성 요오드 화합물의 종류는 특히 한정되지 않으나, 예를 들면 요오드 벤젠 유도체가 바람직하고, 탄소수 18이상의 치환기를 적어도 1개 가지는 1,3,5-트리 요오드벤젠 유도체인 것이 더욱 바람직하다. 탄소수 18이상의 치환기로서는 요오드 조영 부위인 1,3,5-트리요오드 벤젠잔기를 리포솜의 지질 2중층에 안정하게 존재시키기 위한 소수성기인 것이 바람직하고, 예를 들면 탄소수가 20이상이고, 탄소원자수와 질소원자수의 합계가 10이하인 것이 더욱 바람직하다. 이 소수성 치환기는 생체막 지질 구성 성분과 유사구조인 것이 더욱 바람직하다. 이러한 조건을 만족하는 소수성 요오드 화합물의 바람직한 예로서는 예를 들면 J. Med. Chem. 25(12), 1500(1982); Steroids 49(6), 531(1987); Pharm. Res. 6(12), 1011(1989); 국제공개 W095/19186; 동 W096/28414 등에 개시되어 있는 콜레스테롤 유도체의 잔기를 치 환기로서 가지는 1, 3, 5-트리 요오드 벤젠유도체를 들 수 있다.

콜레스테롤 유도체로서는 상기 간행물에 개시된 것이 바람직하나, 특히 바람직한 것은 콜레스테롤이다. 콜레스테롤이 3위 수산기를 개재해서 소수성 요오드화합물, 예를 들면 1,3,5-트리 요오드 벤젠과 연결된 화합물이 바람직하다. 콜레스테롤의 수산기와 소수성 요오드 화합물, 예를 들면 1,3,5-트리 요오드 벤젠을 결합하는 방법으로서는 예를 들면 에스테르결합, 우레탄결합, 탄산에스테르결합 등의 수단을 사용할 수 있으나, 에스테르 결합이 바람직하다. 콜레스테롤과 소수성 요오드 화합물, 예를 들면 1,3,5-트리 요오드 벤젠으로는 상기 결합을 개재해서 직접 결합되어 있어도 되고, 적당한 연결기를 개재해서 결합되어 있어도 된다. 적당한 연결기의 예로서는 탄소수가 5이하인 직쇄상 또는 분기쇄상의 알킬렌기를 들 수 있다.

소수성 요오드 화합물, 바람직하게는 1,3,5-트리 요오드 벤젠 화합물은 상기한 탄소수 18의 치환기 이외에, 1 또는 2 이상의 치환기를 가지고 있어도 된다. 치환기의 종류 및 치환위치는 특히 한정되지 않으나, 예를 들면 치환 혹은 무치환의 아미노기, 치환 혹은 무치환의 아실아미노기, 수산기, 카르복실기 등이 소수성 요오드 화합물의 벤젠환상에 치환되어 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는 치환기는 치환 혹은 무치환의 아미노기, 또는 치환 혹은 무치환의 아실아미노기이다. 아미노기가 치환기를 가진 경우로서 모노알킬아미노기, 디알킬아미노기 등을 들 수 있으며, 아실아미노기가 치환기를 가진 경우로서 트리플루오로 아세틸 아미노기, P-클로로 벤조일 아미노기 등을 예시할 수 있다.

이하의 소수성 요오드 화합물로서 바람직한 예를 열거하지만, 본 발명의 리포솜은 이들을 함유하는 것에 한정되는 것은 아니다.

소수성 요오드 화합물은 리포솜의 막 구성 성분으로서 함유되지만, 막 구성 성분의 전체질량에 대해서 10 내지 90질량%정도, 바람직하게는 10 내지 80질량%, 더욱 바람직하게는 20 내지 80질량%이다. 소수성 요오드 화합물은 막 구성 성분으로서 1종류를 사용해도 되나, 2종류 이상을 조합시켜서 사용해도 된다.

리포솜의 다른 막 구성 성분으로서는 리포솜의 제조에 통상적으로 사용되고 있는 지질화합물을 어느 것이나 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면 Biochim. Biophys. Acta 150(4), 44(1982), Adv. in Lipid. Res. 16(1) 1(1978), "RESEARCH IN LIPOSOMES"(P.Machy, L.Leserman저, John Libbey EUROTEXT사), 「리포솜」(노지마, 스나모토, 이노우에 편, 난코도오) 등에 기재되어 있다. 지질화합물로서는 인지질이 바람직하고, 특히 바람직한 것은 포스파티딜 콜린(PC)류이다. 포스파티딜 콜린류의 바람직한 예로서는 eggPC, 디밀리스토릴PC(DMPC), 디팔미트일PC(DPPC), 디스테아로일PC(DSPC), 디올레일PC(DOPC) 등을 열거할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 태양에서는 리포솜의 막 구성 성분으로서 포스파티딜 콜린과 포스파티딜 세린(PS)을 조합시켜서 사용할 수 있다. 포스파티딜 세린으로서는 포스파티딜 콜린의 바람직한 예로서 열거한 인지질과 같은 지질부위를 가진 화합물을 들 수 있다. 포스파티딜 콜린과 포스파티딜 세린을 조합시켜서 사용할 경우, PC와 PS의 바람직한 사용몰비는 PC:PS=90:10으로부터 10:90 사이이며, 더욱 바람직하게는 30:70 내지 70:30 사이이다.

본 발명의 리포솜의 다른 바람직한 태양에 의하면, 막 구성 성분으로서 포스파티딜 콜린과 포스파티딜 세린을 함유하고, 또한 인산 디알킬 에스테르를 함유하는 리포솜을 들 수 있다. 인산 디알킬 에스테르의 디알킬 에스테르를 구성하는 2개의 알킬기는 동일한 것이 바람직하고, 각각의 알킬기의 탄소수는 6 이상이며, 10 이상이 바람직하고, 12이상이 더욱 바람직하다. 바람직한 인산 디알킬 에스테르의 예로서는 디라우릴 포스페이트, 디미리스틸 포스페이트, 디세틸 포스페이트 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 태양에 있어서, 포스파티딜 콜린 및 포스파티딜 세린의 합계질량에 대한 인산 디알킬 에스테르의 바람직한 사용량은 1 내지 50질량%까지이고, 바람직하게는 1 내지 30질량%이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 20 질량%이다.

포스파티딜 콜린, 포스파티딜 세린, 인산 디알킬 에스테르 및 소수성 요오드 화합물을 막 구성 성분으로서 함유하는 리포솜에 있어서 상기 성분의 바람직한 질량비는 PC:PS:인산 디알킬 에스테르:소수성 요오드 화합물이 5~40질량%:5~40질량%:1~10질량%:15~80질량% 사이에서 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 리포솜의 구성성분은 상기 4자에 한정되지 않으며, 다른 성분을 첨가할 수 있다. 그 예로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 스핀고미엘린, FEBS Lett. 223, 42(1987); Proc. natl. Acad. Sci., USA, 85, 6949(1988) 등에 기재한 모노시알 강그리오시드 GMI 유도체, Chem. Lett., 2145(1989); Biochim Biophys. Acta, 1148, 77(1992) 등에 기재한 글루쿠론산 유도체, Biochim. Biophys. Acta, 1029, 91(1990); FEBS Lett., 268, 235(1990) 등에 기재된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 리포솜은 당해 분야에서 공지의 어떠한 방법으로도 제조할 수 있다. 제조법의 예로서는 앞에서 열거한 리포솜의 총설 성서류외, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467(1980), "Liopsomes"(M.J.Ostro편, MARCELL DEKKER, INC.)등에 기재되어 있다. 구체적으로는 초음파 처리법, 에탄올주입법, 프렌치프레 스법, 에테르 주입법, 코올산법, 칼슘융합법, 동결융해법, 역상증발법 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 리포솜의 사이즈는 상기 방법에 의해 제조할 수 있는 사이즈의 어느 것이어도 상관없으나, 통상은 평균이 400nm이하이고, 200nm이하가 바람직하다. 리포솜의 구조는 특히 한정되지 않으며, 예를 들면 유니 라메라 또는 멀티라메라의 어느 것이어도 좋다. 또, 리포솜의 내부에 적절한 약물이나 다른 조영제의 1종 또는 2종 이상을 배합하는 것도 가능하다.

본 발명의 리포솜을 조영제로서 사용할 경우에는 바람직하게는 비경구적으로 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 정맥내에 투여할 수 있다. 예를 들면 주사제나 점적제 등의 형태의 제제를 동결건조형태의 분말상 조성물로서 제공하고, 사용시에 물 또는 다른 적당한 매체(예를 들면 생리 식염수, 포도당 수액, 완충액 등)에 용해 내지 다시 현탁해서 사용할 수 있다. 본 발명의 리포솜을 조영제로서 사용하고 있을 경우 투여량은 리포솜의 요오드 함유량이 종래의 소수성 요오드 조영제의 요오드 함유량과 같은 정도가 되도록 적절히 결정하는 것이 가능하다.

어떠한 특정 이론에 구애받지는 않으나, 동맥경화 혹은 PTCA 후의 재수축성 등의 혈관질환에 있어서는 혈관의 중간막을 형성하는 혈관 평활근 세포가 이상 증식을 일으킴과 동시에, 내막으로 이주하여 혈관로를 좁게 하는 것이 알려져 있다. 정상의 혈관 평활근 세포가 이상 증식을 시작하는 트리거는 아직 완전히 밝혀지지 않았으나, 매크로 페이지의 내막으로의 이주와 포말화가 중요한 요인인 것이 알려져 있고, 그 후에 혈관 평활근 세포가 페노타입 변환(수축형으로 부터 합성형)을 일으키는 것이 보고되어 있다.

본 발명의 리포솜을 사용하면 포말화 매크로 페이지의 영향에 의해 이상 증식한 혈관 평활근에 대해서 소수성 요오드 화합물을 선택적으로 흡수할 수 있다. 그 결과, 병소와 비질환 부위를 콘트라스트를 붙여서 조영하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 조영제는 특히 혈관질환의 X선 조영에 호적하게 사용할 수 있으며, 예를 들면 동맥경화소나 PTCA 후의 재수축 등의 조영을 행할 수 있다. 조영의 방법은 특히 한정하지 않는다. 예를 들면 X선 조사에 의한 방법 또는 요오드의 방사선 라벨체를 사용하는 핵 의학적 방법 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의해 제공되는 배양계의 제조방법은 포유류 동물질환의 병소의 형성에 관여하는 2종류 이상의 세포종을 동일한 세포배양기 내에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다. 세포종으로서는 초대 세포배양 또는 주화 계대 배양세포가 바람직하고, 포유류 세포의 초대 배양세포가 특히 바람직하다. 바람직한 포유동물로서는 사람, 개, 고양이, 돼지, 작은 돼지, 토끼, 햄스터, 래트, 쥐 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포 배양기의 종류는 특히 한정하지 않으나, 예를 들면 배양 플라스크, 배양시험관, 접시, 마이크로 플레이트 등을 호적하게 사용할 수 있다.

동일한 배양기 내에서 배양하는 2종류 이상의 서로 다른 세포종은 동종의 동물 유래 또는 이종의 동물 유래의 세포종의 어느 것이어도 상관없으나, 동종인 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 「병소의 형성에 관여한다」라는 용어는 복수의 세포가 서로 증식을 조절하면서 병소를 형성하는 경우 등을 포함해서 가장 넓게 해석할 필요가 있으며, 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안된다. 서로 다른 세포종으로서는 세포 생물학 또는 세포 분류학 상의 관점에서 서로 다른 세포를 선택하는 것이 바람직하나, 어떤 병소에 있어서 공존하고, 서로 증식을 조절하면서 병소를 형성하는 2종류의 세포를 선택하는 것이 더욱 바람직하다. 예를 들면 동맥경화소에 있어서 공존하는 매크로 페이지와 혈관 평활근 세포를 2종류의 세포종으로서 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 배양계의 제조방법의 바람직한 태양에서는 2종류의 세포종을 셀·필터에 의해 사이를 두면서 동일한 웰내에서 배양할 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 태양에 의하면, 사용되는 2종류의 세포종은 동맥경화 병소를 형성하는 세포인 것이 바람직하다. 바람직한 세포종으로서는 매크로 페이지, 혈관 평활근 세포, 혈관 내피세포, T세포, 비만세포 등을 들 수 있다. 이 중에서도 바람직한 것은 매크로 페이지, 혈관 평활근 세포, 혈관 내피 세포이며, 특히 바람직한 것은 매크로 페이지 및 혈관 평활근 세포의 조합이다. 이 경우, 매크로 페이지는 미리 포말화시켜 두는 것이 바람직하다.

본 발명에 의해 포말화시킨 매크로 페이지 및 혈관 평활근 세포를 셀·필터를 사이로 두고 배양함으로서 증식시킨 혈관 평활근 세포에 대한 약제의 작용을 측정하는 공정을 포함하고, 약제의 혈관질환 병소에의 이행성의 평가 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 「약제의 작용」이라는 용어는 치료효과 또는 진단효과 등을 포함해서 가장 광의로 해석할 필요가 있다. 셀·필터는 포말화한 매크로 페이지 및 혈관 평활근 세포를 통과시키지 않는 정도의 구멍직경의 것이면, 그 종 류는 특히 한정하지 않는다. 예를 들면 세포를 통과시키지 않는 구멍 사이즈로서 0.4㎛ 이하의 구멍 사이즈의 셀·필터를 사용할 수 있으나, 포말화한 매크로 페이지나 사용되고 있는 세포의 종류에 따라서 적절한 구멍 사이즈의 셀 필터를 용이하게 선택할 수 있다.

어떤 특정 이론에 구애받지는 않으나, 포말화시킨 매크로 페이지 및 혈관 평활근 세포를 셀·필터를 사이에 두고 배양함으로서 포말화된 매크로 페이지 유래의 증식 활성화물질이 혈관 평활근 세포에 작용해서 증식을 유기하여 동맥경화나 PTCA 후의 재수축 등의 혈관질환에 있어서의 혈관 평활근 세포의 이상증식을 인·비트로에 의해 재현할 수 있다. 증식한 혈관 평활근 세포에 대한 약제의 흡수를 조사함으로서 동맥경화나 PTCA 후의 재수축 등의 혈관 질환에 유효성이 높은 약제를 스크리닝하는 것이 가능하다.

　　이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

예 1 : 포말화 매크로 페이지에 의해 증식 활성화하는 혈관 평활근 배양계의 제조(1)

마우스 대동맥 내피로부터 혈관 평활근 세포를 분리하였다(조직배양법 개정대 10판, 코덴사, 1998년, 일본조직 배양학회 편집). 분리한 혈관 평활근 세포를 10%FBS 이글 MEM배지(GIBCO사 제품, No. 11095-080)에 현탁하고, 12구멍 마이크로 플레이트(FALCON사 제품, No. 3503)에 파종하였다. 이때의 각 웰(Well)의 세포수는 10,000개로 조정하였다, 37℃, 5%CO₂의 조건에서 3일간 배양하였다.

다음에, Biochimica Biophysica Acta지, 1213권, 127-134쪽(1994) 기재의 방법에 의해 포말화한 마우스 복강 매크로 페이지를 조제하였다. 이 포말화 매크로 페이지 200,000개를 분리하고, 상기 저면에 혈관 평활근 세포를 배양한 마이크로 플레이트의 각 웰(Well)의 상부에 인서트 셀(FALCON사 제품, No.3180)에 파종하였다. 37℃, 5%CO₂의 조건에서 5일간 배양하였다. 도 1에 상기 실험에 있어서의 혈관 평활근 세포의 세포수를 나타내었다. 배양개시당초의 증식은 완만하나, 3일 후에 포말화 매크로 페이지를 첨가한 후, 약 1일의 유도기를 경과해서 활발한 증식을 나타내었다. 매크로 페이지를 첨가하지 않은 경우의 혈관 평활근 세포의 증식곡선을 도 2에 나타낸다. 도 1과의 비교에 의해 포말화 매크로 페이지에 의한 증식활성화 효과는 분명하다.

예 2 : 혈관 평활근 상의 스카벤저 리셉터(scavenger receptor) 발현의 확인

동맥경화병소에 있어서의 혈관 평활근 세포는 표면에 스카벤저 리셉터를 발현해서 산화 LDL을 흡수하는 것이 알려져 있다(Biochem. Parmacol. 1999, 15; 57(4) 383-6: Exp. Mol. Pathol. 1997 64(3) 127-45). 도 1의 배양계에 있어서의 혈관 평활근 세포에 대해서 마우스 스카벤저 리셉터 항체를 사용해서 면역염색을 행한 결과, 파종 3일째의 혈관 평활근 세포에는 발현을 확인할 수 없었으나, 파종 6일째에는 명료한 염색이 확인되었다. 또한, 셀·필터 상의 포말화 시킨 매크로 페 이지를 마찬가지로 면역 염색하였더니, 역시 명료하게 염색이 확인되었다.

예 3 : 혈관 평활근 세포에 의한 산화 LDL의 흡수

도 1의 배양계에 있어서 파종 3일째 및 6일째에 있어서 혈관 평활근 세포의 배지에 ¹²⁵I로 표시한 산화 LDL을 첨가하고, 24시간 후에 세포에 흡수된 ¹²⁵I를 카운트한 결과를 표 1에 나타낸다. 3일째와 6일째에는 명백하게 흡수된 양의 차가 확인되었다. 이상의 결과로부터 본 발명의 세포 배양계에 의해 배양된 혈관 평활근 세포가 동맥경화 또는 재수축 등의 병소의 평활근 세포와 같은 성질을 가지고 있는 것이 나타났다.

표 1

일 수	¹²⁵I-_oxLDL 흡수
파종 3일째	0.52±0.11
파종 6일째	2.2±0.4

X 10,000 cpm

예 4 : 포말화 마이크로 페이지에 의해 증식활성화하는 혈관 평활근 배양계 의 제조(2)

예1과 같은 방법에 의해 래트 및 토끼의 매크로 페이지 및 혈관 평활근 세포로 이루어진 배양계를 제조하였다. 도 3 및 도 4에 혈관 평활근 세포의 세포수를 나타낸다. 어느 경우도 도 1의 마우스의 경우와 같은 결과가 얻어졌다.

도 1의 배양계에서 배양된 혈관 평활근 세포는 파종 3일째까지에는 건강한 혈관의 성질을 가지고, 파종 7일째 이후는 동맥경화 병소의 평활근 세포의 성질을 가지고 있기 때문에 이 양자에 대한 영향을 비교함으로서 병소에 선택적인 약제의 스크리닝을 행할 수 있다. 특히, 병소에 선택적인 약제 송달계의 탐색, 병소 세포에 선택적 독성을 나타내는 약제의 탐색, 병소 세포의 세포주기를 선택적으로 정지시키는 약제의 개발 등에 사용할 수 있다. 이하에 구체예를 나타내나 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

예 5 : 리포솜의 조제

하기에 나타낸 비율로 eggPC(후나코시사 제품, No.1201-41-0214), eggPS(후나코시사 제품, No.1201-42-0226), 디세틸 포스페이트(DCP, 후나코사 제품, No.1354-14-8165), J.Med.Chem., 25(12), 1500(1982) 기재의 방법에 의해 합성한 소수성 요오드 화합물(3)을 각각 나스형 플라스크 내에서 염화메틸렌에 용해해서 균일 용액으로 한 후, 용매를 감압하에서 증발시켜 플라스크 저면에 박막을 형성하였다. 이 박막을 진공에서 건조한 후, 0.9% 생리 식염수(히카리 세이야쿠사 제품, No.512)를 1.5㎖첨가하고, 초음파조사(Branson사 제품, No.3542 프로브형 발진기, 0.1mW)를 얼음냉각하에 5분 실시함으로서 균일한 리포솜 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액의 입자직경을 WBC 어낼라이저(닛퐁 코덴샤 제품, A-1042)에 의해 측정한 결과, 입자직경은 40 내지 65nm였다.

리포솜	PC	PS	DCP	화합물(3)
제제 1	50 nmol	50 nmol	10 nmol	40 nmol
제제 2	50 nmol	50 nmol	10 nmol	75 nmol
제제 3	50 nmol	50 nmol	10 nmol	150 nmol

예 6 : 혈관 평활근 세포에 의한 리포솜 제제의 선택적 흡수(1)

예 5에서 조정한 3종류의 리포솜을 예1의 도 1 또는 도 2에 나타낸 평활근 세포 배양계에 하기 ①② 또는 ③의 타이밍으로 첨가하고 배양을 계속하였다.

① 도 2에 나타낸 포말화 매크로 페이지를 첨가하지 않은 배양계에 있어서 3일 후에 리포솜 제제를 첨가해서 1일간 배양하였다.

② 도 1에 나타낸 포말화 매크로 페이지를 첨가하는 배양계에 있어서, 5일 후에 리포솜 제제를 첨가해서 1일간 배양하였다.

③ 도 1에 나타낸 포말화 매크로 페이지를 첨가하는 배양계에 있어서, 7일 후에 리포솜 제제를 첨가해서 1일간 배양하였다.

① 내지 ③의 조건에서 리포솜의 첨가와 후배양이 종료한 후, 상청액을 제거한 행크스 버퍼액(닛스이세이야쿠사 제품, code05906, pH7.2)으로 3회 세정한 후, 1.5%SDS용액(와코쥰야쿠사 제품, 199-07141)을 첨가하고, 37℃에서 30분 인큐베이트해서 세포를 용해하고, 세포내에 흡수된 화합물(3)의 양을 HPLC에 의해 정량하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. 이 결과로부터 본 발명의 리포솜에 의해 혈관 평활근 세포에 흡수된 요오드 화합물의 양은 포말화 매크로 페이지의 영향에 의해 증식을 개시하기 전과 후에서는 명확한 차이가 확인되었다.

예 7 : 비교예

Pharm.Res., 16(3) 420(1999)에 기재한 방법에 따라 화합물(3)의 유적 현탁액을 조제하였다. 화합물(3)의 함유량을 같게 해서 예6과 같은 조건(①,② 또는 ③)에서 세포배양계에 첨가하고, 혈관 평활근에 흡수된 화합물(3)의 양을 HPLC에 의해 정량하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다. 도 5와 도 6을 비교하면 본 발명의 리포솜을 사용한 경우에는 공지의 유적 현탁제와 비교하여 포말화 마이크로 페이지의 영향에 의해 이상 증식하는 혈관 평활근 세포에 대해서 고효율 또한 고선택적으 로 요오드 조영제를 집적시킬 수 있는 것이 명백하다.

예 8 : 혈관 평활근 세포에 의한 리포솜 제제의 선택적 흡수(2)

예 4에서 제조한 래트(도 3) 및 토끼(도 4)의 세포를 사용한 혈관 평활근 배양계에 있어서 예 5에서 조제한 3종류의 리포솜을 상기 ①,② 또는 ③의 타이밍으로 첨가하고, 배양을 계속하였다. 세포내에 흡수된 화합물(3)의 양을 HPLC로 정량하였다. 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내나, 모두 마우스 세포의 도 5와 같은 결과가 얻어졌다.

예 9

Invest. Radiol. 18, 275(1983)의 방법에 따라 래트의 대동맥에 동맥경화소를 형성하였다. 동맥경화소를 형성한 래트에 예 2에서 조제한 리포솜 제제 3을 화합물(3)에 환산한 MTD량인 200㎎/㎏을 경정맥(목정맥)으로부터 신중히 투여하였다. 투여 30분후, X선 촬영에 의해 명료한 동맥경화소의 조영사진이 얻어졌다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타낸다.

본 발명의 리포솜은 포말화 매크로 페이지의 영향에 의해 이상 증식하는 혈관 평활근 세포에 대해서 요오드 화합물을 집적할 수 있고, 혈관 평활근의 이상 증식에 기인하는 혈관 질환의 병소를 선택적으로 조영하기 위한 X선 조영제로서 유용하다. 또, 본 발명의 배양계의 제조방법에 의해 제공되는 배양계는 동맥경화소나 재수축 등의 병소의 상태를 재현한 세포 배양계로서 의약의 In vitro 스크리닝 등 에 이용할 수 있다.

Claims

소수성 요오드 화합물을 막 구성 성분으로서 함유하는 리포솜에 있어서, 상기 소수성 요오드 화합물이 탄소수 18 이상인 콜레스테롤 유도체의 나머지 기를 적어도 1개 가지는 1,3,5-트리 요오드 벤젠 유도체인 것을 특징으로 하는 소수성 요오드 화합물을 함유하는 리포솜.
제 1 항에 있어서, 포스파티딜 콜린 및 포스파티딜 세린으로 이루어진 군에서 선택되는 지질을 막구성 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 리포솜 소수성 요오드 화합물을 함유하는 리포솜.
삭제
제 1항에 있어서, 탄소수 6이상의 알킬의 디에스테르인 인산 디알킬 에스테르를 막 구성 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 소수성 요오드 화합물을 함유하는 리포솜.
삭제
제 1 항에 기재한 리포솜을 함유하는 것을 특징으로 하는 X선 조영제.
제 6 항에 있어서, 상기 조영제를 혈관 질환의 조영에 사용하는 것을 특징으로 하는 X선 조영제.
제 6 항에 있어서, 상기 조영제를 포말화 매크로 페이지의 영향에 의해 이상 증식한 혈관 평활근 세포의 조영에 사용하는 것을 특징으로 하는 X선 조영제.