JP6867639B2

JP6867639B2 - 非イオン性ヨード造影剤の結合体

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Publication number: JP6867639B2
Application number: JP2016200419A
Authority: JP
Inventors: 伸行松本; 尚彦安西
Original assignee: DOKKYO MEDICAL UNIVERSITY; St Marianna University School of Medicine
Current assignee: DOKKYO MEDICAL UNIVERSITY; St Marianna University School of Medicine
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2021-05-12
Anticipated expiration: 2036-10-11
Also published as: JP2018062475A

Description

本発明は、非イオン性ヨード造影剤の結合体に関する。

ヨード造影剤を用いた造影Ｘ線検査は、Ｘ線画像の診断能を大きく高め、多くの診療科で重要な位置を占める診断方法となっている。
しかしながら、ヨード造影剤は、その副作用として造影剤腎症が存在しており、近年大きな問題となっている。
加えて、肝細胞癌のＸ線診断においては、癌そのものの診断ではなく、血流の変化に依拠しているため、早期肝細胞癌の診断では感度が低いという問題もあった。

特許文献１には、ＭＲＩ造影剤であるＧｄ−ＤＴＰＡにエトキシベンジル（ＥＯＢ）基を導入したＧｄ−ＥＯＢ−ＤＴＰＡが記載されている。

特開２００７−１０６６７３号公報

本発明が解決しようとする課題は、腎毒性軽減を図ることのできる新規ヨード造影剤を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、非イオン性ヨード造影剤に肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基を結合させた結合体が、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）
非イオン性ヨード造影剤と肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基との結合体。
（２）
非イオン性ヨード造影剤が、イオヘキソール、イオパミドール、イオブロミド、イオペントール、イオビトリオール、イオベルソール、イオキシラン、及びイオメプロールからなる群から選択される、（１）に記載の結合体。
（３）
肝細胞特異的トランスポーターが、OATP又はMRPである、（１）又は（２）に記載の結合体。
（４）
肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基が、エトキシベンジル基又はウルソデオキシコール酸に由来する基である、（１）から（３）のいずれかに記載の結合体。
（５）
下記いずれかの式で表される、（１）から（４）のいずれかに記載の結合体。

（６）
下記いずれかの式で表される、（１）から（４）のいずれかに記載の結合体。

（７）
（１）から（６）のいずれかに記載の結合体を含む、造影剤。

本発明によれば、腎毒性軽減を図ることのできる新規ヨード造影剤を提供することができる。

ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２の逆相クロマトグラフィーの測定結果を示す。クロマト条件は、流速１．０ｍＬ、アセトニトリル／水＝２５／７５、カラム温度４０℃にて、ＵＶ２５４ｎｍで検出した。ｉｓｏｍｅｒ１の４００ＭＨｚ（Ｄ₂Ｏ）の測定結果を示す。ｉｓｏｍｅｒ２の４００ＭＨｚ（Ｄ₂Ｏ）の測定結果を示す。ｉｓｏｍｅｒ１のＴＯＦ−ＭＳの測定結果を示す。ｉｓｏｍｅｒ２のＴＯＦ−ＭＳの測定結果を示す。イオヘキソール−ＵＤＣＡ（７）の４００ＭＨｚ（Ｄ₂Ｏ）の測定結果を示す。イオヘキソール−ＵＤＣＡ（７）のＴＯＦ−ＭＳの測定結果を示す。（Ａ）ＯＡＴＰ１Ｂ１に対するコントロール、ＥＯＢ−ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ、イオヘキソール、ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２を用いたＥＳの取り込み阻害結果を示す。（Ｂ）ＯＡＴＰ１Ｂ１に対するコントロール、ＥＯＢ−ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ、イオヘキソール、ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２を用いたＥ₂１７βＧの取り込み阻害結果を示す。（Ｃ）ＯＡＴＰ１Ｂ３に対するコントロール、ＥＯＢ−ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ、イオヘキソール、ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２を用いたＥ₂１７βＧの取り込み阻害結果を示す。（Ｄ）ＯＡＴＰ２Ｂ１に対するコントロール、ＥＯＢ−ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ、イオヘキソール、ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２を用いたＥ₂１７βＧの取り込み阻害結果を示す。各結果は、Ｎ＝５であり、コントロールに対して、＊は、Ｐ＜０．０５を、＊＊は、Ｐ＜０．０１を意味する。ｉｓｏｍｅｒ１を用いたＥ₂１７βＧの取り込み阻害実験におけるＩＣ₅₀を示す。ｉｓｏｍｅｒ２を用いたＥ₂１７βＧの取り込み阻害実験におけるＩＣ₅₀を示す。（Ａ）ＯＡＴＰ１Ｂ１に対するコントロール、ＥＯＢ−ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ、イオヘキソール及び結合体（７）を用いたＥＳの取り込み阻害結果を示す。（Ｂ）ＯＡＴＰ１Ｂ１に対するコントロール、ＥＯＢ−ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ、イオヘキソール及び結合体（７）を用いたＥ₂１７βＧの取り込み阻害結果を示す。（Ｃ）ＯＡＴＰ１Ｂ３に対するコントロール、ＥＯＢ−ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ、イオヘキソール及び結合体（７）を用いたＥ₂１７βＧの取り込み阻害結果を示す。（Ｄ）ＯＡＴＰ２Ｂ１に対するコントロール、ＥＯＢ−ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ、イオヘキソール及び結合体（７）を用いたＥ₂１７βＧの取り込み阻害結果を示す。各結果は、Ｎ＝５であり、コントロールに対して、＊＊は、Ｐ＜０．０１を、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を意味する。結合体（７）を用いた取り込み阻害実験におけるＩＣ₅₀を示す。ＳＴＡＭマウスにイオヘキソールを投与した造影結果を示す。ＳＴＡＭマウスにｉｓｏｍｅｒ１を投与した造影結果を示す。肝腫瘍での造影結果を示す。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本発明の結合体は、非イオン性ヨード造影剤と肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基とが結合した構造を有する。
本発明において、造影剤とは、画像診断において、撮像する画像にコントラストをつけたり特定の組織を強調するために患者に投与される医薬品を意味する。
非イオン性ヨード造影剤とは、造影剤の中でも、その化学構造中に、ヨード（Ｉ）を含有し、イオン性造影剤におけるカルボキシル基が親水性の置換基に代わっている造影剤であって、水溶液中でイオンに解離しない。
一般に、非イオン性ヨード造影剤は、以下の構造を有する。

上記構造において、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃はそれぞれ独立して、水溶液中でイオンに解離しない親水性の基を意味する。

非イオン性ヨード造影剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、イオヘキソール、イオパミドール、イオブロミド、イオペントール、イオビトリオール、イオベルソール、イオキシラン、及びイオメプロール等が挙げられる。
中では、イオヘキソールが好ましく用いられる。

本発明の結合体においては、非イオン性ヨード造影剤のＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃における親水性の基に対して、肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基が結合している。
非イオン性ヨード造影剤と肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基との結合は好適には共有結合である。
非イオン性ヨード造影剤のＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃における親水性の基中の水酸基に対して、肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基が共有結合していることが好適である。

肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基における肝細胞特異的トランスポーターとは、肝細胞に特異的に発現しているトランスポーターを意味する。
肝細胞特的トランスポーターにより認識される基を結合体が有していることにより、結合体が肝細胞にトランスポーターの基質となり取り込まれたり、肝細胞からトランスポーターの基質となり排泄される。
結合体が、トランスポーターの基質となることにより、結合体は、肝細胞に取り込まれていくため、あるいは、肝細胞から排泄されていくため、腎排泄の一部が胆汁排泄されることとなり、腎毒性軽減を図ることができる。

肝細胞特異的トランスポーターとしては、特に限定されるものではないが、例えば、有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）等が挙げられる。
ＯＡＴＰとしては、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３及びＯＡＴＰ２Ｂ１等が挙げられる。
ＭＲＰとしては、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４及びＭＲＰ６等が挙げられる。

肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基としては、特に限定されるものではないが、例えば、エトキシベンジル基又はウルソデオキシコール酸に由来する基等が挙げられる。

エトキシベンジル基とは、以下の構造を有する基である。

具体的には、エトキシベンジル基とは、ｐ−エトキシベンジル基が挙げられる。

上記構造で示すエトキシベンジル基における、波線部分は、非イオン性ヨード造影剤との結合手を意味しており、非イオン性ヨード造影剤の水酸基が、エトキシベンジル基で置換されている構造であることが好適である。

ウルソデオキシコール酸に由来する基とは、下記構造を有するウルソデオキシコール酸が非イオン性ヨード造影剤と結合することにより生じる基を意味する。

例えば、ウルソデオキシコール酸のカルボキシル基において、非イオン性ヨード造影剤と結合する場合には、下記構造がウルソデオキシコール酸に由来する基となる。

上記構造で示すウルソデオキシコール酸に由来する基における、波線部分は、非イオン性ヨード造影剤との結合手を意味しており、非イオン性ヨード造影剤の水酸基が、ウルソデオキシコール酸に由来する基で置換されている構造であることが好適である。

本発明の結合体としては、下記いずれかの式で表される化合物であることが好適である。

本発明の結合体としては、上記Ａ又はＢで表される化合物であることがより好適である。

また、本発明の結合体としては、下記いずれかの式で表される化合物であることが好適である。

本発明の結合体としては、上記Ｆ又はＧで表される化合物であることがより好適である。

本発明の結合体は、造影剤として用いることができる。
本発明の結合体は、非イオン性ヨード造影剤に、肝細胞特異的トランスポーターにより認識される基が結合していることにより、肝細胞特異的トランスポーターから細胞内に取り込まれ、胆汁からも排泄される機能を付与されるため、二系統の排泄経路を有することとなり腎毒性を軽減することができる。
また、肝細胞特異的トランスポーターにより取り込まれることにより、肝細胞造影を可能とする。
ヨ―ド造影剤を用いたダイナミックＣＴによる肝細胞癌（ＨＣＣ）診断はＨＣＣ特異的な血流支配を明らかにすることによってなされる。しかし早期ＨＣＣでは血流の変化は認められず、ＣＴでの診断が難しいことが知られている。また、肝細胞特異的トランスポーターＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３の発現はＨＣＣで低下していることが知られている。そこで、本発明においては、肝細胞特異的トランスポーターにより結合体が取り込まれることにより、動脈と門脈の肝臓における血流支配を画像化することができ、肝細胞癌（ＨＣＣ）診断に用いることができる。

本発明の結合体は、造影剤として公知の医薬組成物の形態で使用することができる。医薬組成物は、造影剤として従来公知の方法により製造することができる。
本発明の結合体は、一種で用いてもよく、二種以上の混合物として用いてもよい。
医薬組成物として、特に限定されるものではなく、安定化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、矯味剤、着色剤、香料その他の薬剤学的に許容される添加剤を含有させることができる。

医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入等も含む）、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化されるが、好適には静脈内注射される。

本発明の結合剤の投与量は、投与される患者の状態、投与方法等により適宜決定される。

以下、実施例により本実施形態を詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。実施例において示される測定方法は以下のとおりである。

（製造例１）ヨウ化p-エトキシベンジル（３）の合成
化合物２の合成

アルゴン気流下、ｐ−エトキシベンジルアルコール（１）（６．５０９，４２．７ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（９０ｍＬ），無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７０Ｌ）混合溶液を氷冷し、塩化チオニル（４．０ｍＬ，５５．７ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹枠した。反応液を濃縮したのちテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）に溶かし、氷水（１５０ｍＬ）に滴下した。
塩化メチレン（５０ｍＬ）で２回抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下濃縮することにより、化合物２（７．６６ｇ）を淡い黄色液体として得た。

ヨウ化p-エトキシベンジル（３）の合成

化合物２（２．０６ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（２０ｍＬ）にヨウ化ナトリウム（５．３０ｇ，３５．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹枠した。
反応液を減圧下濃縮したのち塩化メチレンに溶かし、セライトろ過した。ろ液を減圧下濃縮することにより、化合物３（３．０８ｇ）を褐色液体として得た。

（実施例１）結合体５の合成

イオヘキソール（４）（２．０１ｇ，２．４４ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）を氷冷し、ヨウ化ｐ−エトキシベンジル（１．００ｇ，３．８５ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５ｍＬ）を加えた。さらに、へキサメチルジシラザンリチウム（１．３Ｍテトラヒドロフラン溶液，３．０ｍＬ，３．９０ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹枠した。再び反応液を氷冷し、ヨウ化ｐ−エトキシベンジル（１．００ｇ，３．８５ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（４．０ｍＬ）を加え、室温で１時間半撹枠した。反応終了後、反応液を氷冷し、水（２０ｍＬ）を加えたのち、１Ｍ塩酸（２ｍＬ）を加えて中和し、酢酸エチルで洗浄した。水相を減圧下濃縮することで榿色オイルを得た。
得られた榿色オイルをＯＤＳパックドカラム（ｍＲＩＡＮ社製，Ｃ１８，１０ｇ）を用いて精製することにより結合体５を無色オイル（６００ｍｇ）として得た。得られた結合体５を逆相カラムクロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔｂ，移動相：水／アセトニトリル＝８／２）にて精製することで、白色アモルファス（ｉｓｏｍｅｒ１：１３６ｍｇ）及び白色アモルファス（ｉｓｏｍｅｒ２：１９０ｍｇ）を得た（図１）。得られたｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２を併せた収率は１４％であった。
図２及び図３に、ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２の４００ＭＨｚ（Ｄ₂Ｏ）の測定結果を示す。また、図４及び図５に、ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２のＴＯＦ−ＭＳの測定結果を示す。
ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２の構造として、以下の５種の異性体が考えられるが、ｉｓｏｍｅｒ１及びｉｓｏｍｅｒ２の構造は、構造Ａ及び構造Ｂであると推察している。

（実施例２）結合体７の合成

ウルソデオキシコール酸（６）（１．９９ｇ，５．０７ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）を氷冷し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（５５９ｍｇ，２．９２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（６０１ｍｇ，４．８７ｍｍｏｌ）、イオヘキソール（４）（１．９９ｇ，２．４４ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で３時間加熱撹枠した。続いてウルソデオキシコール酸（１．００ｇ，２．５５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（３００ｍｇ，２．４６ｍｍｏｌ）を加え、再び５０℃で２時間加熱を行った。
反応終了後、反応液を氷冷し、水を加え、酢酸エチルで洗浄したのち水相を減圧下濃縮することで粗製品を得た。得られた粗製品を少量のメタノールに溶かし、酢酸エチル（２００ｍＬ）に滴下した。析出した固体を濾取し、再びメタノールに溶かしたのち減圧留去することにより白色固体（３．７３ｇ）を得た。得られた白色固体（３．７３ｇ）を液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔｂ，移動相：水／アセトニトリル＝６／４）にて精製することで、白色固体としてイオヘキソール−ＵＤＣＡ（７）（４６０ｍｇ）を得た。
図６に、イオヘキソール−ＵＤＣＡ（７）の４００ＭＨｚ（Ｄ₂Ｏ）の測定結果を示す。また、図７に、イオヘキソール−ＵＤＣＡ（７）のＴＯＦ−ＭＳの測定結果を示す。
イオヘキソール−ＵＤＣＡ（７）の構造として、以下の５種の異性体が考えられるが、イオヘキソール−ＵＤＣＡ（７）は、構造Ｆ及び構造Ｇの混合物であると推察される。

（試験例１）ＯＡＴＰトランスポーターによる結合体の細胞内輸送実験
J Pharmacol Exp Ther. 2005 Nov;315(2):534-44を参考にして、ＯＡＴＰトランスポーターによる結合体の細胞内輸送実験を行った。
ＯＡＴＰ１Ｂ１又はＯＡＴＰ１Ｂ３を安定発現させたヒト胎児腎細胞由来ＨＥＫ２９３細胞（１ｘ１０⁵ ｃｅｌｌｓ）を、２４穴プレートで２日間培養した。その後、培養液を除去し、細胞の単層を５．５ｍＭＤ−グルコースで富栄養化したダルベッコ修飾リン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ，１３７ｍＭＮａＣｌ，３ｍＭＫＣｌ，８ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄，１ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄，１ｍＭＣａＣｌ₂，０．５ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ７．４）で２度洗浄し、次いで、１０分間の前培養をした。
細胞の単層を、ＯＡＴＰトランスポーターの輸送基質として、［³Ｈ］Ｅｓｔｒｏｎｅ−Ｓｕｌｆａｔｅ（ＥＳ）又は［³Ｈ］Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−Ｄ−１７β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（Ｅ₂１７βＧ）を含む５００μＬのＤ−ＰＢＳを用いて、室温で６０分間培養した。
細胞を３度氷冷したＤ−ＰＢＳで洗浄した後、０．１ＮＮａＯＨ水溶液（０．５ｍＬ）に溶解した。細胞内に蓄積した基質の量を、放射性同位体のカウントとして測定することにより、ＯＡＴＰトランスポーターにより取り込まれた基質の量を測定して、結合体によるＯＡＴＰトランスポーターの基質取り込み阻害活性を測定した。
結果を図８〜図１２に示す。

（試験例２）造影実験
ＮＡＳＨモデルである、ＳＴＡＭマウスは、Med Mol Morphol. 2013 Sep; 46(3):141-52.に記載の方法により作成した。得られたＳＴＡＭマウスをペントバルビタールで麻酔し、イオヘキソール（４）又は結合体（５）をゆっくりと尾静脈から注射投与した。イオヘキソール（４）の投与量は876mg/animalとし、結合体（５）の投与量は150mg/animalとした。
ＣＴ画像を、投与前、投与中、投与２０分後に撮影した。胸から下腹部までの画像データは、９６×９６ボクセルとして得、得られたデータを用いてＤＩＣＯＭファイルを産生させ、分析した。
癌性と非癌性の領域中に３つスポットを無作為に選択し、各ポイントのＨｏｕｎｓｆｉｅｌｄＵｎｉｔの測定を、画像分析（Ｏｎｉｓ，ＤｉｇｉｔａｌＣｏｒｅ．Ｃｏ．Ｌｔｄ）により行った。
結果を図１３〜図１５に示す。
図１３〜図１５の結果から、肝細胞に取り込まれることのないイオヘキソールで造影を行った場合、肝臓の腫瘍部と非腫瘍部で造影効果には違いが全く観察されなかった。一方、結合体（５）のｉｓｏｍｅｒ１で造影を行うと、腫瘍部の造影効果は非腫瘍部において低下していた。肝細胞癌では血流の変化が認められるよりも前からＯＡＴＰの発現低下を来すことが知られており、本造影剤が血流異常のない早期肝細胞癌の陰性造影剤として使用できる可能性を示した。

本発明のイオヘキソールの結合剤は、イオヘキソールの肝細胞特異的トランスポーターからの細胞取り込みを可能とした。また、本結果を踏まえると、これまでの血流情報に加え、肝細胞機能を指標とした肝細胞癌（ＨＣＣ）診断の新たなＸ線造影診断が可能となると考えられる。

本発明によれば、非イオン性ヨード造影剤の新規結合体は、新規画像診断において産業上の利用可能性を有する。

Claims

非イオン性ヨード造影剤と、エトキシベンジル基又はウルソデオキシコール酸に由来する基と、の結合体であって、
非イオン性ヨード造影剤が、イオヘキソール、イオパミドール、イオブロミド、イオペントール、イオビトリオール、イオベルソール、イオキシラン、及びイオメプロールからなる群から選択される、結合体。
非イオン性ヨード造影剤と、エトキシベンジル基と、の結合体であって、
非イオン性ヨード造影剤が、イオヘキソール、イオパミドール、イオブロミド、イオペントール、イオビトリオール、イオベルソール、イオキシラン、及びイオメプロールからなる群から選択される、結合体。
非イオン性ヨード造影剤と、ウルソデオキシコール酸に由来する基と、の結合体であって、
非イオン性ヨード造影剤が、イオヘキソール、イオパミドール、イオブロミド、イオペントール、イオビトリオール、イオベルソール、イオキシラン、及びイオメプロールからなる群から選択される、結合体。
非イオン性ヨード造影剤が、イオヘキソールである、請求項１から３のいずれか１項に記載の結合体。
下記いずれかの式で表される結合体。
下記いずれかの式で表される結合体。
請求項１から６のいずれか１項に記載の結合体を含む、造影剤。