CN104107432A - 用于预防、诊断、和治疗动脉粥样硬化的以氧化磷脂为靶向配体的基于纳米粒子的传输系统 - Google Patents

用于预防、诊断、和治疗动脉粥样硬化的以氧化磷脂为靶向配体的基于纳米粒子的传输系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于纳米颗粒的医药/营养输送系统，所述输送系统被涂覆了或整合了作为靶向配体的氧化磷脂。该类输送系统能靶向特异性地导向巨噬细胞，该等巨噬细胞在血管壁中动脉粥样硬化病变的发展中是决定性细胞，以显著增加该输送系统在动脉粥样硬化的预防、诊断和治疗方面的生物利用度和特异性。

Description

用于预防、诊断、和治疗动脉粥样硬化的以氧化磷脂为靶向配体的基于纳米粒子的传输系统
相关申请
本专利申请的优先权为美国临时专利。
该美国临时专利申请号61/775,420，申请日2013年3月8日，本申请通过引述将该美国临时专利申请全部内容并入本申请。
发明领域
本发明所公开的内容一般而言与使用氧化磷脂作为靶向配体涂覆在基于纳米颗粒的药物/营养输送系统的领域。所述输送系统可将巨噬细胞作为特定靶向——该等巨噬细胞在血管壁中动脉粥样硬化病变的发展中是决定性细胞，以显著增加该输送系统在动脉粥样硬化的预防、诊断和治疗方面的生物利用度和特异性。
发明背景
动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病因，导致了超过一半以上的因心血管病死亡的病例。胆固醇在血管壁的累积被称为斑块，这是在动脉粥样硬化的发展的标志事件。动脉粥样硬化是一种渐进性疾病，以在动脉中的脂质斑块形成作为特征。巨噬细胞通过促进胆固醇的积累，在主动脉壁增加炎症反应起到动脉粥样硬化病变的进展中起重要作用（Kunjathoor etal.,2002;Ludewig and Laman,2004）。在单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1，趋化因子）及其受体引导单核细胞迁移进入血管内膜之后，这些单核细胞在动脉壁的内膜层分化为巨噬细胞。这些巨噬细胞接收富含胆固醇的低密度脂蛋白（LDL），导致承载胆固醇的巨噬细胞（泡沫细胞）形成，这是动脉粥样硬化病灶形成的早期特征。早在1979年，诺贝尔奖得主Brown和Goldstein发现氧化LDL（氧化低密度脂蛋白）的摄取和降解率与常住小鼠腹腔巨噬细胞的原生低密度脂蛋白相比高20倍（Brown et al.,1979;Goldstein et al.,1979。他们将氧化低密度脂蛋白结合位点命名为巨噬细胞清道夫受体，以体现这些氧化低密度脂蛋白结合位点在清除修饰低密度脂蛋白的作用。从那时起，清道夫受体已引起了巨大的研究关注。巨噬细胞清道夫受体AI、AII和CD36是参与富含胆固醇氧化低密度脂蛋白的摄取过程的主要膜蛋白(de Winther et al.,2000;Kunjathoor et al.,2002)。在缺乏CD36的小鼠中进行的研究显示在主动脉病变的尺寸有非常显著的降低（76.5％），以及从这些小鼠中分离的腹腔巨噬细胞显示在oxLDL的结合和氧化低密度脂蛋白的摄取两方面减少60％-80％(Febbraio etal.,1999)。这表明CD36介导的氧化低密度脂蛋白的摄取在动脉粥样硬化过程中泡沫细胞的形成和病灶发展是必需的(Febbraio et al.,2000;Moore and Freeman,2006)。CD36以及与病变严重程度相关性很好(Curtiss,2009;Febbraio et al.,2000;Moore and Freeman,2006)。心血管疾病因为缺乏以便及早发现和有针对性进行预防和治疗的技术而被称为无声杀手。靶向CD36是对动脉粥样硬化进行诊断和有针对性的预防和治疗一种很有前途的途径(Berliner et al.,2009;Harb et al.,2009;Lipinski etal.,2009;Silverstein,2009)。
目前，尚无专门针对对动脉粥样硬化病变的技术和方法。因此，目前不能对动脉粥样硬化和相关疾病进行有效率的和早期诊断、预防和治疗。
因此，目前需要能改善动脉粥样硬化和相关疾病的预防、诊断和治疗的方法和组合物。
发明综述
在一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含多个纳米颗粒，这些纳米颗粒包含一种或多种氧化磷脂，这些氧化磷脂被封包于所述纳米颗粒之内，附着在所述纳米颗粒的表面上，或整合到所述纳米颗粒的结构中。
在一些实施方案中，这些纳米颗粒选自脂质体，polymersomes，微球，微结构化脂质的载体，纳米结构化脂质的载体，或其中组合。
在一些实施方案中，所述一种或多种氧化磷脂选自1-棕榈酰-2–壬二酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–壬二酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰基-2-戊二酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（PGPC），1-棕榈酰-2-（5–氧代戊酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰-2-（9-氧代壬酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–乙酰-SN甘油-3-磷酸胆碱，1-十八烷基-2–乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-丁酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十八烷基-2-丁酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰-2–乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-2-十八烯基-乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-（homogamma亚麻酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3磷酸胆碱，1-十八烷基-2-甲基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-丁烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱磷脂，溶血PAF C16，溶菌酶是PAF C18，1-O-1'-Z）-十六碳烯-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1-（Z）-2-十六碳烯-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1'-（Z）十六碳烯-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1-（Z）-十六碳烯-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，1-O-1'-（Z）的十六碳烯-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，和1-O-1'-（Z）-2-十六碳烯二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，以及其中一种组合。
在一些实施方案中，所述一种或多种氧化磷脂选自2-lyso-PC的9-羟基-10-十二碳烯双酸酯（HDdiA-PC），2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOdiA-PC），2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯双酸酯(HODA-PC)，2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOOA-PC）；2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯酸酯（KODA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-8-氧代-6-辛烯酸酯（KOOA-PC），2-lyso-PC的9-酮基-10-十二碳烯酸酯（KDdiA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-6-辛烯酸酯（KOdiA-PC），2-lyso-PC的5-氧代戊酸酯（OV-PC），2-lyso-PC的9-氧代-壬酸酯（ON-PC,），1-棕榈酰-2-（5-氧代戊酰）-磷脂酰胆碱（POVPC），以及它们的组合。在一些实施方案中，所述一种或多种氧化磷脂包括KOdiA-PC或KDdiA-PC。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒仅包括一种或多种氧化的磷脂。所述一种或多种氧化磷脂选自所述一种或多种氧化磷脂选自2-lyso-PC的9-羟基-10-十二碳烯双酸酯（HDdiA-PC），2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOdiA-PC），2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯双酸酯(HODA-PC)，2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOOA-PC）；2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯酸酯（KODA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-8-氧代-6-辛烯酸酯（KOOA-PC），2-lyso-PC的9-酮基-10-十二碳烯酸酯（KDdiA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-6-辛烯酸酯（KOdiA-PC），2-lyso-PC的5-氧代戊酸酯（OV-PC），2-lyso-PC的9-氧代-壬酸酯（ON-PC,），1-棕榈酰-2-（5-氧代戊酰）-磷脂酰胆碱（POVPC），以及它们的组合。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒具有约10纳米至约2500纳米的平均线性尺寸。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含一种或多种分子，选自白蛋白，葡聚糖，明胶，聚乙二醇（PEG）（PEG），聚（乙烯基吡咯烷酮），透明质酸，肝素，硫酸肝素，唾液酸，聚（N-乙酰葡糖胺）（几丁质），脱乙酰壳多糖，聚（3-羟基戊酸酯），聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯），聚（1-丙交酯-共-乙交酯），聚（3-羟基丁酸酯），聚（4-羟基丁酸酯），聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯），聚原酸酯，聚酐，聚（乙醇酸），聚（乙交酯），聚（L-乳酸），聚（L-丙交酯），聚（D，L-乳酸），聚（D，L-丙交酯），聚（L-丙交酯-共-D，L-丙交酯），聚（己内酯），聚（L-丙交酯-共-己内酯），聚（D，L-丙交酯-共-己内酯），聚（乙交酯-共-己内酯），聚（三亚甲基碳酸酯），聚酯酰胺，聚（乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯），共-聚（醚-酯）（例如PEO/PLA），聚磷腈，纤维蛋白，纤维蛋白胶，纤维蛋白原，纤维素，淀粉，胶原蛋白和透明质酸，弹性蛋白和透明质酸，聚氨酯，有机硅，聚酯，聚烯烃，聚异丁烯和乙烯-α-烯烃共聚物，丙烯酸聚合物和共聚物以外的聚丙烯酸酯，乙烯基卤化物聚合物和共聚物，聚氯乙烯，聚乙烯醚，聚乙烯基甲基醚，聚偏二卤乙烯，聚偏二氯乙烯，聚（偏二膦酸），聚（偏二氟乙烯-共-六氟丙烯），聚丙烯腈，聚乙烯醇缩酮，聚乙烯基芳族化合物，聚苯乙烯，聚乙烯基酯，聚乙酸乙烯酯，苯乙烯-丙烯腈共聚物，ABS树脂，聚酰胺，尼龙66，聚己内酰胺，聚碳酸酯--包括基于酪氨酸的聚碳酸酯，聚甲醛，聚酰亚胺，聚醚，聚氨酯，人造丝，人造丝-三乙酸酯，纤维素，乙酸纤维素，丁酸纤维素，乙酸丁酸纤维素，玻璃纸，硝酸纤维素，丙酸纤维素，纤维素醚，羧甲基纤维素富勒烯，脂质，载脂蛋白A1，载脂蛋白A2，其他载脂蛋白或其组合。请注意，在本发明中，丙交酯与乳酸交酯相同；乙交酯与甘醇酸交酯相同。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含一种或多种分子，选自明胶，白蛋白，右旋糖，葡聚糖，一种高分子量的聚（乙二醇）或高分子量的聚（乙烯基吡咯烷酮），透明质酸，肝素，硫酸肝素，唾液酸，壳聚糖，以及其中一种组合。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含一种或多种生物可降解聚合物，所述聚合物包括PLGA，聚（D，L-乳酸交酯-共-甘醇酸交酯），聚（D，L-乳酸交酯），聚（D，L-乳酸交酯-共-乳乳酸交酯），聚（L-乳酸交酯），聚（甘醇酸交酯），聚（L-乳酸交酯-共-甘醇酸交酯），聚（己内酯），聚（甘醇酸交酯-共-三亚甲基碳酸酯），聚（3-羟基丁酸酯），聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯），聚（4-羟基丁），聚（酯酰胺），聚（酯-磺基酯酰胺），聚（原酸酯）或聚（酸酐），以及其中一种组合。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒是脂质体，所述脂质体含有磷脂，胆固醇，鞘脂，神经酰胺，或半抗原共轭脂质。
在一个方面，所述纳米颗粒进一步包含一个额外的靶向配体，所述靶向配体颗粒被封包于所述纳米颗粒之内，附着在所述纳米颗粒的表面上，或整合到所述纳米颗粒的结构中。所述额外的靶向配体还导向一个动脉粥样硬化的病变部位。在一些实施例中，每个纳米颗粒均包括一个或多个氧化磷脂和额外的靶向配体。在一些实施例中，所述额外靶向配体是能识别在或接近一个动脉粥样硬化的病变部位的标的（例如，一种蛋白质）的抗体。例如，所述额外靶向配体为一种抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段对下述物质有反应性，选自氧化LDL，清道夫受体A（第一个被表征和克隆的OxLDL受体），CD36，CD68，类凝集素氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1），SR-A1，SR-B1，和其中的一种组合。
在一个方面，本发明提供的组合物进一步包含一种或多种生物活性剂，所述生物活性剂被封包于所述纳米颗粒之内，附着在所述纳米颗粒的表面上，或整合到所述纳米颗粒的结构中。所述一种或多种生物活性剂被传递到或接近动脉粥样硬化的病变部位。
在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂包括第一生物活性剂，所述第一生物活性剂提供了一个动脉粥样硬化的病变部位存在的标识。在一些实施方案中，所述标识为一荧光信号，该荧光信号在所述第一生物活性剂结合到或接近动脉粥样硬化的病变部位时候发出。在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂进一步包括：一个第二生物活性剂，所述第二生物活性剂对动脉粥样硬化的病变部位显示治疗效果。在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂进一步包括第一生物活性剂和第二活性剂。
在一个方面，本发明提供的组合物进一步包含：一种助剂或药学上相容的载体。
在一个方面，本发明提供一种用以预防、诊断和/或治疗患者的动脉粥样硬化的方法。该方法包括在或接近已知或可疑的动脉粥样硬化的病变部位施用一种组合物的有效量。该组合物包含多个纳米颗粒，所述纳米颗粒包含一个或多个氧化磷脂，所述氧化磷脂被封包于所述纳米颗粒之内，附着在所述纳米颗粒的表面上，或整合到所述纳米颗粒的结构中。所述一个或多个氧化磷脂导向动脉粥样硬化的病变部位。
在一些实施方案中，所述施用步骤包括动脉内或静脉内递送纳米颗粒。在一些实施例中，动脉内或静脉内递送包括使用导管。在一些实施例中，动脉内或静脉内递送包括直接注射。
在一个方面，本发明提供一种制备本发明所公开的组合物的方法，所述方法包含将本发明中的组合物中的纳米颗粒通过一种相转化步骤制备。
本领域技术人员将理解，本发明所公开的氧化磷脂的不同实施方案和纳米颗粒的不同实施方案可以与本发明所描述的任何方面结合使用。
附图说明
本领域的技术人员将理解，下面所描述的附图旨在阐明本发明。附图不意以任何方式限制本发明的范围。
本发明公开了方法和组合物，所述方法和组合物集合纳米颗粒，所述纳米颗粒有诊断性的或者抗动脉粥样硬化药剂封包其内，有氧化磷脂涂覆在其表面作为靶向配体以增加其稳定性的水平、细胞生物利用度，和导向主动脉内膜的巨噬细胞，以达成诊断、防止和逆转动脉粥样硬化病变发展的目标。参考图示及其说明可能有助于更好地理解本发明的原理和操作。
应当理解的是，本发明并不限于在下面的描述或实施例的细节的应用，_本文使用的措辞和术语仅为了说明和解释本发明，不应被视为为限制性的。
图1说明含疏水性抗动脉粥样硬化剂的纳米颗粒组合物和结构。
图2说明一个示例性实施例：A）一个含磷脂酰胆碱，胆固醇，壳聚糖，_EGCG的1XPBS溶液的混合物，B）壳聚糖涂覆的EGCG所封包的脂质体（CSLIPO-EGCG）在1×PBS溶液;C）CSLIPO-EGCG的扫描电子显微镜图像；和D）使用布鲁克海文BI-MAS粒度分析仪测得的CSLIPO-EGCG的尺寸。
图3说明一种示范性的稳定性分析结果，显示在4℃（A）和25℃（B）条件下，0.5mm原生EGCG和等量的封包在脂质体的EGCG（LIPO）和CSLIP，在1×PBS溶液中的稳定性（pH值7.2。平均值在没有共同上标时不同，P<0.05;
图4说明一种示范性分析的结果：细胞摄取1×PBS溶液的荧光图像作为对照组（A），NBD-标记的LIPO（B），和NBD-标记的CSLIPO（C），使用MCF7人乳腺癌细胞。MCF7细胞在经以上处理在在37℃培养1小时、2小时和4小时。细胞核被DAPI染成蓝色(λex=358nm,λem=461nm)，与NBD标记的脂质体(λex=460nm,λem=535nm)的绿色荧光信号合并。
图5说明一示范性分析的结果：MCF7细胞中的EGCG含量经50μM和100μM的LIPO-EGCG和CSLIPO-EGCG在37℃处理4小时。所示值是四个独立实验值的平均值，以竖线表示标准偏差。所示杆在没有共同上标时不同，P<0.01。
图6说明一种示范性分析的结果：经过2％醋酸双氧铀染色的脂质纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像。
图7说明一示范性分析的结果：纳米封包的和原生EGCG（纳米结构化脂质载体，NLC；壳聚糖涂覆的NLC，CSNLC）在1XPBS溶液，pH值为1，3，5和7.4的的稳定性分别显示在图中A，B，C和D，（N=3）。
图8说明一种示范性分析的结果：原生EGCG（NLC和CSNLC）在1X PBS溶液、pH7.4在4℃，22℃和37℃下的稳定性分别显示在图A，B和C。
图9说明一示范性分析的结果：纳米封包的和原生EGCG（NLC和CSNLC）在RPMI1640培养基，37℃下的稳定性,(A)RPMI1640培养基，不含SOD;(B)RPMI1640培养基，含SOD5U/ml(n=3)。
图10说明一示范性分析的结果：纳米封包的和原生EGCG（NLC和CSNLC）在RPMI1640介质在4℃或37℃下和包含或不包含SOD，与THP-1巨噬细胞一起培养的稳定性,(A)细胞RPMI1640培养基，4℃，无SOD，(B)细胞RPMI1640培养基，4℃，有SOD5U/ml；C)细胞RPMI1640培养基，37℃，无SOD；D）细胞RPMI1640培养基，37℃，有SOD5U/ml(n=3)。
图11说明一示范性分析的结果：在经100μM原生的EGCG处理的THP-1源性巨噬细胞的细胞EGCG含量，和EGCG涂覆的NLC（NLCE）和EGCG封包的CSNLC（CSNLCE）在完全培养基中，包括SOD（5U/ml），在4℃或37℃，并培养2小时或4小时。与原生EGCG相比，CS增加了EGCG含量*：P<0.05，**：P<0.01。与NLCE相比，CSNLCE提高EGCG含量：P<0.01（N=3）。
图12说明一示范性分析的结果：THP-1源性巨噬细胞经5,10,和20μM的VNLC,VCSNLC,NLCE,CSNLCE,EGCG和1XPBS处理后的存活性。数据为平均值±标准差（n=3）。
图13说明一示范性分析的结果：NLCE，CSNLCE，VNLC，VCSNLC，原生EGCG和1X PBS对中从THP-1细胞分化来的巨噬细胞的胆固醇水平的影响。（A），该巨噬细胞，用上述6种处理不使用oxLDL处理18小时，（B），该巨噬细胞首先饥饿8小时，然后与40毫克蛋白质/毫升最低限度修饰的低密度脂蛋白（oxLDL）一起培养以及上述相同的6个处理18小时。数据为平均数±标准差，n=3。*符号在图板上表示与控制1XPBS，EGCG，VNLC和VCSNLC相比，以P<0.05作为标准，有显著不同；;符号**表示P<0.01。
图14说明一示范性分析的结果：在37℃下，经2-，4-，6-，18-，24小时培养后，NBD-标记的NLC和NBD-标记的CSNLC被细胞摄取的荧光显微镜图像。（A）NCL（B）CSNLC上部面板：NBD标记的纳米颗粒（绿色），下部面板：DAPI染色细胞核（蓝色）。所有图片均为10×光学放大倍率。
图15说明一示范性分析的结果：脂质体结合THP-1源性巨噬细胞的结合测试。（A）配体-脂质体（30mol％KDdiA-PC机组成），（B）控制-脂质体（无KDdiA-PC），（C）1XPBS。脂质体以7-硝基-2-1，3-苯并恶二唑-4-基（NBD）-PE标记（相对于总脂质的1.0mol％）作为荧光染料（λ激发波长是460纳米，λ发射的波长是535纳米）（绿色）。细胞核被DAPI染色（λ激发的波长是358纳米，λ发射的波长是461纳米）（蓝色）。
图16说明一示范性分析的结果：KDdiA-PC-脂质体在LDL受体缺失小鼠（一个著名动脉粥样硬化的动物模型）中导向动脉粥样硬化。所述含有KDdiA-PC的脂质体囊和控制组脂质体囊，用1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR）近红外（NIR）荧光染料（λ激发的为730nm，发射的λ为790纳米）标记，通过尾静脉静脉注射。20小时后，获得NIR图像结合X射线图像从左侧（A）和右侧（B），或者通过切开腹部暴露主动脉（C）以及从每只小鼠得到离体主动脉（D），使用LuminaXR成像系统。左侧的小鼠用含有KDdiA-PC的脂质体注射，右侧的小鼠用对照脂质体注射，不含KDdiA-PC。
图17说明一示范性分析的结果：KOdiA-PC增加脂质体对巨噬细胞的结合亲和力。人单核细胞THP-1细胞在补充有10％胎牛血清和0.05毫米的2-巯基乙醇的RPMI1640培养基中进行培养。所述细胞在37℃，95％湿度和5％的气氛中培养。所述细胞通过在50ng/毫升的PMA培养72小时后分化成巨噬细胞。细胞通过培养它们与50毫微克/毫升的PMA72小时分化成巨噬细胞。THP-1细胞源性巨噬细胞用7-硝基-2-1，3-苯并恶二唑-4-基（NBD）-PC-标记的含靶向配体KOdiA-PC的脂质体或NBD-标记的不含KOdiA-PC的脂质体处理2小时，在4℃的温度下。NBD标记的脂质体是绿色的（λ激发的波长是460纳米，λ发射的哦长是535纳米）。细胞核用DAPI染色（λ激发的波长358纳米，λ发射的波长是461纳米）（蓝色）。与不含KOdiA-PC的脂质体相比，含KOdiA-PC的脂质体对巨噬细胞的结合亲和力有显著提高，巨噬细胞对脂质体的摄取也更高。
图18A-18D说明一示范性分析的结果：THP-1细胞源性巨噬细胞分别用带有或不带有靶向配体（KOdiA-PC）的NBD标记的脂质体处理，并接受配体，DAPI，和CD36染色。18A)显示用不含KOdiA-PC的脂质体处理的细胞的相对荧光染色结果；18B)显示用含KOdiA-PC的脂质体处理的细胞的相对荧光染色结果；18C)显示用不含KOdiA-PC的脂质体在抗体-CD36的存在下处理的细胞的相对荧光染色结果；18D)显示用含KOdiA-PC的脂质体在抗体-CD36的存在下处理的细胞的相对荧光染色结果。
图19A和19B说明一示范性分析的结果：A）就CD36和DAPI染色的存在与控制组巨噬细胞和CD36敲除巨噬细胞进行了比较；B)用KOdiA-PC NBD标记的脂质体对控制组巨噬细胞和CD36敲除巨噬细胞的进行结合亲和性的结合分析。
图20A-20F说明一示范性分析的结果：20A-20C表明，配体并没有增加脂质体对3T3-L1前脂肪细胞（CD36的表达水平低的细胞）的细胞结合亲和力。A）以无配体脂质体处理过的3T3-L1细胞；B）以携带KOdiA PC的脂质体处理的3T3-L1细胞；和C）CD36在3T3-L1前脂肪细胞的表达，经由抗CD36抗体标示。20D-20F显示KOdiA-PC增加脂质体对3T3-L1脂肪细胞（CD36的表达水平高的细胞）的结合亲和力。D）以非靶向囊泡处理的3T3-L1脂肪细胞；E）经过以靶向囊泡处理的3T3-L1脂肪细胞；和F)CD36在3T3-L1脂肪细胞的表达，经由抗CD36抗体标示。
图21说明一示范性分析的结果：显示以Brookhaven BI-90颗粒尺寸分析仪测量的NLC-EGCG的颗粒尺寸和分布。所述颗粒的直径尺寸为约60纳米。
图22说明一示范性分析的结果：显示携带KOdiaA-PC的NLC-EGCG提高了细胞内EGCG含量。
图23说明一示范性分析的结果，显示KOdiA-PC提高了NLC-EGCG对巨噬细胞的结合亲合力。THP-1细胞源性巨噬细胞以NBD标示的携带或不携带KOdiA-PC的NLC-EGCG在PRMI1640培养基中在37℃处理2小时。含KOdiA-PC的NLC-EGCG对巨噬细胞具有显著更高的结合亲和力，并且，与不含KOdiA-PC的NLC-EGCG相比，导致了NLC-EGCG被巨噬细胞更多摄取。
图24说明了一示范性分析的结果，显示在在LDL受体缺失小鼠中，KOdiA-PC增加了纳米载体对动脉粥样硬化病灶的靶向特异性。雄性低密度脂蛋白受体缺陷（LDLr-/-）小鼠（C57BL6背景）饲喂Harlan Teklad–一种导致动脉粥样硬化的高脂饮食（TD.88137），含有饱和脂肪21％（w/w）和0.15％胆固醇–从6周龄开始喂养24周。喂养这个高脂饮食24周后，小鼠诱发在主动脉弓和腹动脉的动脉粥样硬化病变。小鼠饲养在22～24℃，相对湿度45％，每日10/14光/暗周期，光周期从06:00到16:00。食物和水随意喂养。小鼠体重在实验的时候为40-45克。
图25说明一示范性分析的结果，显示在LDL受体缺失小鼠中，相对于对照组无靶向配体脂质体（A），含KOdiA-PC的脂质体纳米载体导向动脉粥样硬化病灶（白色斑块）（B）。
图26说明一示范性分析的结果，显示在除LDLr-/-小鼠中纳米载体对动脉粥样硬化病灶的靶向特异性。这些是是横截面的主动脉弓的有代表性的图像，其中Cy7以蓝色显示，自体荧光以绿色显示，红色的油滴表示动脉粥样硬化病变（斑）。
实施例详细描述
定义
非另有说明，本发明术语将根据相关领域的普通技术人员的对这些术语的常规用法来理解。
本发明所用术语中，术语“纳米颗粒”、“纳米载体”或“纳米脂质体”包括，但不限于，脂质体、聚合物囊泡、微球体、纳米或微结构化脂质的载体，和高密度脂蛋白颗粒。纳米颗粒可通过本领域中已知的任何方法来制造，包括但不限于常规的混合，制锭法，溅射法，乳化，超声处理，包埋，包囊，冻干，和基于相转化的流程。在一些实施方案中，该纳米颗粒包括用于导向动脉粥样硬化病变的氧化磷脂。在本文中，导向和靶向可以互用。“尺寸”、“粒径”及“大小”可以互用。“病区”、“病变”、“病灶”，可以互用。“封包”、“封装”、“包裹”，可以互用。“附着”、“粘附”可以互用。“整合到纳米颗粒的结构中”与“整入到纳米颗粒的结构中”，可以互用。“靶向”、“导向”、“靶向导向”可以互用。“标识”、“标记”可以互用。
在本发明中，术语“生物活性剂”包括任何可包含在含有氧化磷脂的纳米粒子的任何诊断，治疗，预防和养分分子。在一些实施方案中，术语“生物活性剂”和“诊断和抗动脉粥样硬化剂”可互换使用，并且包括可用于动脉粥样硬化的诊断，预防和治疗的任何试剂。例如，抗动脉粥样硬化剂包括但不限于，胆固醇药，抗血小板药，β-阻断剂的药物，血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂，水丸剂（利尿剂）和用于为治疗动脉粥样硬化的目的控制特定风险因素如糖尿病的药物。诊断检查包括但不限于验血，心电图，胸部X光，踝/肱指数，超声心动图，超声，计算机断层扫描（CT）扫描，正电子发射断层扫描和计算机断层扫描（PET/CT），磁共振成像（MRI），压力测试，或血管造影。在一些实施例中，动脉粥样硬化的诊断试剂包括荧光染料。在一些实施方案中，抗动脉粥样硬化剂包括儿茶素类。
本发明所用术语中，术语“氧化磷脂”包括任何磷脂的氧化形式。已知合成的磷脂的代表性例子包括但不限于，1-棕榈酰-2-azelaoyl-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-azelaoyl-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰基-2-戊二酰基-sn-甘油基基-3-磷酸胆碱（PGPC），1-棕榈酰-2-（5-oxovaleroyl）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（POVPC）和1-棕榈酰-2-（9-oxononanoyl）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。在有些实施例中，所述氧化磷脂含KDdiA-PC或HOdiA-PC。在有些实施例中，所述氧化磷脂含KDdiA-PC。在有些实施例中，所述氧化磷脂含KDdiA-PC和HOdiA-PC的混合物。
在本发明所用术语中，术语“清道夫受体”包括任何能识别通过氧化或乙酰化改性的低密度脂蛋白（LDL）的受体。它们被分为类A，B和C，包括但不限于--例如，那些位于内膜的巨噬细胞。示例性的清道夫受体包括但不限于清道夫受体A（第一个被表征和克隆的氧化脂蛋白受体），CD36，CD68，类凝集素氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1），SR-A1，SR-B1和等。
动脉粥样硬化心血管疾病和氧化磷脂
动脉粥样硬化心血管疾病在美国和其他发达国家是第一杀手。由于该疾病不能在早期阶段被检测到，它也是一种无声杀手。目前迫切需要开发一种方法或技术以在早期阶段对它进行检测，并使用靶向输送方法防治该疾病。
动脉粥样硬化性血管疾病的发生是血清脂蛋白在动脉壁沉积和保留的结果。在病灶的巨噬细胞已经被展示表达超过6种在结构上不同的清道夫受体，以摄取促进胆固醇的细胞摄取积累的低密度脂蛋白的修饰形式（低密度脂蛋白）。因为承载胆固醇的巨噬细胞泡沫细胞是脂肪纹--最早的粥样硬化病变--的主要成分，通过这些途径的脂质摄取长期以来被认为是在动脉粥样硬化的发病机制的一必要的性的、始发性的事件。目前已知清道夫受体在无菌炎症和感染中发挥重要作用。其调节和信号转导以及这些途径对在调节动脉壁上的脂质积聚平衡和炎症方面的潜在影响，对该疾病的诊断和治疗的目的很重要。
巨噬细胞在动脉粥样硬化的发展起到重要的作用。在摄取富含胆固醇的oxLDL后，更多胆固醇将在巨噬细胞累积，这是所谓的泡沫细胞。在泡沫细胞死亡之后，在动脉壁上的胆固醇和其他脂质体的沉积形成斑块。这些泡沫细胞还可以释放许多炎症因子以放大局部炎症反应和招募更巨噬细胞进入血管壁，这可能导致更多的泡沫细胞，以及更多、更大的粥样硬化病变。巨噬细胞使用清道夫受体摄取oxLDL。巨噬细胞清道夫受体CD36是参与摄取富含胆固醇的修饰脂蛋白--如oxLDL--的主要膜蛋白。CD36与病灶的严重程度相关性很好。
氧化磷脂具有对CD36的oxLDL结合位点高结合亲和力，并参与由CD36介导的内膜巨噬细胞对颗粒的认知及摄取。因此，氧化磷脂可提高纳米颗粒靶向特异性。氧化磷脂包含HDdiA-PC和HOdiA-PC，即2-溶血磷脂酰胆碱（2-lyso-PC）的9-羟基-10-十二碳烯双酸和5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯；HODA-PC和HOOA-PC,即2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯酸和5-羟基-8-氧代-6-辛烯酸酯；KODA-PC和KOOA-PC，即2-lyso-PC的9-酮基-12-氧代-10-十二碳烯酸和5-酮基-8-氧代-6-辛烯酸酯；KDdiA-PC和KOdiA-PC,，即2-lyso-PC的9-酮基-10-十二碳烯双酸和5-酮基-6-辛烯二酸酯；OV-PC和ON-PC,即2-lyso-PC的5-氧代戊酸和9-氧代-壬酸酯；POVPC，即1-棕榈酰-2-（5-oxovaleroyl）-磷脂酰胆碱，等等。
动脉粥样硬化心血管疾病的一些非限制性实例是冠状动脉心脏疾病，心肌梗死，急性冠脉综合征，心绞痛，心肌缺血，中风，脑血管炎，脑出血。
动脉粥样硬化的诊断、预防和治疗
在一个方面，本发明提供了一种纳米颗粒，这些纳米颗粒包含一种或多种氧化磷脂，这些氧化磷脂被封包于所述纳米颗粒之内，附着在所述纳米颗粒的表面上，或整合到所述纳米颗粒的结构中。所述氧化磷脂通过结合巨噬细胞内清道夫受体，导向动脉粥样硬化病变部位。
在一个方面，涂覆了氧化磷脂或其变体（如KDdiA-PC）的纳米颗粒被用于在动脉粥样硬化的诊断、预防和治疗方面的，针对动脉粥样硬化病变的诊断性的、预防性的、治疗性的和养分等生物活性及的靶向输送。
在一些实施例中，所述氧化磷脂和变体形成纳米颗粒。
纳米粒子技术在动脉粥样硬化心血管疾病的诊断和治疗方面，具备优势，因为大多数生物过程，包括动脉粥样硬化，都发生在纳米层面。基于纳米颗粒的输送系统已被用于有效地保护和递送难溶性药物。较小的纳米颗粒被有效地导入组织并延长循环时间。这些纳米颗粒可以有不同的形状和组成。但它们必须具有磷脂表面，或类似的结构，从而可以使氧化磷脂合并到纳米颗粒的表面磷脂层。亲水和疏水的治疗性化合物都可以被封包或整合到纳米颗粒中。纳米颗粒可提高诊断性或者抗动脉粥样硬化化合物的吸收，保护化合物以使其不会过早降解，延长化合物的循环时间，显示出在靶细胞（或器官）相对于正常细胞（或器官）的高差分摄取效率，较低的毒性--通过防止化合物与生物环境过早相互作用，提高细胞内渗透，并提高治疗效果。
在一些实施例中，所述纳米颗粒包括脂质体，聚合物囊泡，微球体，微结构化脂质的载体，纳米结构化的脂质载体，或它们的组合。
任何合适的分子，例如水溶性聚合物，可生物降解的聚合物，共聚物，都可用于形成本发明所述的纳米颗粒。任何本领域已知的方法都可以用来形成、封包、整合、和/或以本发明所描述的氧化磷脂修改纳米粒子。
在一些实施例中，形成本发明所述纳米颗粒的一种或多种分子包含白蛋白，葡聚糖，明胶，聚乙二醇（PEG）（PEG），聚（乙烯基吡咯烷酮），透明质酸，肝素，硫酸肝素，唾液酸，聚（N-乙酰葡糖胺）（几丁质），脱乙酰壳多糖，聚（3-羟基戊酸酯），聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯），聚（1-丙交酯-共-乙交酯），聚（3-羟基丁酸酯），聚（4-羟基丁酸酯），聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯），聚原酸酯，聚酐，聚（乙醇酸），聚（乙交酯），聚（L-乳酸），聚（L-丙交酯），聚（D，L-乳酸），聚（D，L-丙交酯），聚（L-丙交酯-共-D，L-丙交酯），聚（己内酯），聚（L-丙交酯-共-己内酯），聚（D，L-丙交酯-共-己内酯），聚（乙交酯-共-己内酯），聚（三亚甲基碳酸酯），聚酯酰胺，聚（乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯），共-聚（醚-酯）（例如PEO/PLA），聚磷腈，纤维蛋白，纤维蛋白胶，纤维蛋白原，纤维素，淀粉，胶原蛋白和透明质酸，弹性蛋白和透明质酸，聚氨酯，有机硅，聚酯，聚烯烃，聚异丁烯和乙烯-α-烯烃共聚物，丙烯酸聚合物和共聚物以外的聚丙烯酸酯，乙烯基卤化物聚合物和共聚物，聚氯乙烯，聚乙烯醚，聚乙烯基甲基醚，聚偏二卤乙烯，聚偏二氯乙烯，聚（偏二膦酸），聚（偏二氟乙烯-共-六氟丙烯），聚丙烯腈，聚乙烯醇缩酮，聚乙烯基芳族化合物，聚苯乙烯，聚乙烯基酯，聚乙酸乙烯酯，苯乙烯-丙烯腈共聚物，ABS树脂，聚酰胺，尼龙66，聚己内酰胺，聚碳酸酯--包括基于酪氨酸的聚碳酸酯，聚甲醛，聚酰亚胺，聚醚，聚氨酯，人造丝，人造丝-三乙酸酯，纤维素，乙酸纤维素，丁酸纤维素，乙酸丁酸纤维素，玻璃纸，硝酸纤维素，丙酸纤维素，纤维素醚，羧甲基纤维素富勒烯，脂质，载脂蛋白A1，载脂蛋白A2，其他载脂蛋白或其组合。请注意，在本发明中，丙交酯与乳酸交酯相同；乙交酯与甘醇酸交酯相同。
在有些实施例中，形成本发明所述纳米颗粒的一种或多种分子包含可生物降解聚合物，比如PLGA，聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯），聚（D，L-丙交酯），聚（D，L-丙交酯-共-丙交酯），聚（L-丙交酯），聚（乙交酯），聚（L-丙交酯-共-乙交酯），聚（己内酯），聚（乙交酯-共-三亚甲基碳酸酯），聚（3-羟基丁酸酯），聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯），聚（4-羟基丁），聚（酯酰胺），聚（酯–多硫酸酯酰胺），聚（原酸酯）或聚（酸酐酐）。
本发明所述纳米颗粒可以有任何尺寸和构型。例如，所述纳米颗粒具有约5纳米至约5000纳米的平均线性尺寸。在有些实施例中，该纳米颗粒的平均线性尺寸为10纳米或更小，20纳米或更小，30纳米或更小，40纳米或更小，50纳米或更小，60纳米或更小，70纳米或更小，80纳米或更小，90纳米或更小，100纳米或更小，110纳米或更小，120纳米或更小，130纳米或更小，140纳米或更小，150纳米或更小，160纳米或更小，170纳米或更小，180纳米或更小，200纳米或更小，210纳米或更小，220纳米或更小，230纳米或更小，240纳米或更小，250纳米或更小，300纳米或更小，350纳米或更小，400纳米或更小，450纳米或更小，500纳米或更小，550纳米或更小，600纳米或更小，650纳米或更小，700纳米或更小，800纳米或更小，900纳米或更小，1000纳米或更小，1100纳米或更小，1200纳米或更小，1400纳米或更小，1600纳米或更小，1800纳米或更小，2000纳米或更小，2500纳米或更小，3000纳米或更小，3500纳米或更小，4000纳米或更小，或5000纳米或更小。
在有些实施例中，一个更大的纳米颗粒在其中包含一个或多个更小的纳米颗粒。例如，所述小纳米颗粒由一种或多种生物活性剂（比如药物）形成。作为替代，所述一个或多个生物活性剂被封包在所述小纳米颗粒之内、附着在所述小纳米颗粒的表面上、或者整合到所述小纳米颗粒的结构中。
在一个方面，本发明的包含氧化磷脂的纳米颗粒进一步包含一种或多种额外的、针对动脉粥样硬化病变区的靶向配体。这些额外的靶向配体包含但不仅限于，例如，氧化低密度脂蛋白的抗体（第一个被表征和克隆的OxLDL受体），CD36，CD68，类凝集素氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1），SR-A1，SR-B1，和其中的一种组合。
在一个方面，本发明的包含氧化磷脂的纳米颗粒是多功能纳米输送系统，可同时封包和/或整合诊断性的、预防性的和治疗的制剂在其中一个纳米颗粒输送系统或多个纳米颗粒输送系统，以达成对动脉粥样硬化更有效的预防、诊断和治疗。
在有些实施例中，所述纳米颗粒包含一种标识剂，单独或与其他活性剂组合。该标识试剂可以是任何可以提供一个标识以表明动脉粥样硬化病变部位的存在的试剂。在有些实施例中，所述标识是光信号，比如具有某特定波长的光，或者发出某特定颜色的光。这类标识剂包含但不仅限于，荧光染料，荧光蛋白（例如，绿色，黄色或红色荧光蛋白），放射性标记物，生物标记物，一种可与在或接近动脉粥样硬化病变部位的生物标记物结合的试剂，抗体，一种第二抗体，以及成像试剂。
在有些实施例中，所述成像试剂可在一个病人或动物在进行实时成像分析之前用本发明所述纳米颗粒输送到一个病人或动物体内的动脉粥样硬化病变部位。
在一些实施例中，所描述的氧化磷脂可直接与上述额外的靶向配体和/或标记试剂缀合；请见，例如，本发明所描述的荧光氧化磷脂。
纳米颗粒，用于输送生物活性剂的时候，具备许多优势。纳米粒子可以提高现有的诊断和抗动脉粥样硬化剂的靶标特异性。许多诊断和抗动脉粥样硬化剂仅具低水平的靶向特异性。正常组织有一个正常、完整的血管系统；然而，病变组织有渗漏性血管。纳米颗粒的小尺寸使他们能够进入病变组织，如动脉粥样硬化病变。将靶向配体（例如，KDdiA-PC）整合到纳米颗粒的表面上，还极大地提高了纳米颗粒对内膜巨噬细胞的靶特异性。许多诊断和抗动脉粥样硬化剂具有低水平的溶解性、稳定性和生物利用度。还有一个有利方面是，纳米粒子有一个疏水性核心，以容纳更多的疏水剂，以增加它们在生理溶液包括血液和淋巴中的溶解度。当不稳定的药物被封包入纳米颗粒之内，其稳定性也得到改善。这些被封包的试剂似乎某种程度上密封到所述纳米颗粒中，不可降解或通过外部的代谢酶代谢。进一步而言，所述纳米颗粒涂覆了一层壳聚糖，以提高他们的细胞内生物利用度。另外，增加的稳定性、溶解度和循环时间可以增加生物利用度。
在有些实施例中，所述纳米颗粒包含，所有的或一部分下述组分：脂类（如甘油三酸酯），磷脂，α-生育酚乙酸酯，多糖（如脱乙酰壳多糖），聚（乙二醇）（PEG），表面活性剂和助表面活性剂（如聚乙二醇15-羟基硬脂酸），盐（如氯化钠）和水。诊断性的和抗动脉粥样硬化剂、以及任何其它化合物，都可以被封包或整合到纳米颗粒之中。
在有些实施例中，多层面封包也有可能，可以延长生物活性剂的活性。例如，一中治疗剂可以首先封包入更小的纳米颗粒中，之后他们被进一步封包入更大的纳米颗粒。外层/较大的纳米颗粒的降解使药物从内部/较小的纳米颗粒中释放；从而使药物在延长的时间期间被递送。一个本领域技术人员可以理解、也能够操纵纳米颗粒的两个群体的大小、厚度、和分子组分，使得延长的输送的时间长度可得以控制和改性。
在有些实施例中，本发明所公开的组合物包含涂覆壳聚糖–一种细胞摄取增强剂--的纳米颗粒，以增加细胞生物利用度；在其表面整合PEG，以维持颗粒的整体性和稳定性及延长这些纳米载体的循环，和使用KDdiA-PC作为靶向配体，以增加针对主动脉内膜巨噬细胞的靶向特异性。
在一个方面，所述包含氧化磷脂的纳米颗粒被用于作为靶向纳米输送系统，以诊断动脉粥样硬化。诊断染料/试剂被封包或并入纳米颗粒之上/之内，以在任何阶段检测动脉粥样硬化，该诊断关联到染料/试剂在动脉壁上的强度。
在一个方面，所述包含氧化磷脂的纳米颗粒被用于作为靶向纳米输送系统，以防治和治疗动脉粥样硬化。预防剂和治疗剂被封包或并入纳米颗粒之上/之内。纳米颗粒的稳定性，溶解性，生物利用度，靶向特异性，以及功能效率，都得到改善。他们可防止胆固醇在巨噬细胞内累积，以及阻止泡沫细胞形成。
在一个方面，所述包含氧化磷脂的纳米颗粒被用于作为靶向纳米输送系统，以防治和治疗一种炎性疾病、一种自身免疫性疾病，和其它免疫介导的疾病。
在一个方面，所述包含氧化磷脂的纳米颗粒可被用于法医分析。
组合物输送
在一些实施例中，包含涂覆氧化磷脂（如KDdiA-PC）的纳米颗粒被用于作为靶向配体，涂覆于基于纳米颗粒的药物/养分载体上，以达成诊断、治疗、和/或养分针对动脉粥样硬化病变的靶向递送，用以诊断、防止、和治疗动脉粥样硬化。
在一些实施例中，包含纳米颗粒的组合物通过动脉或静脉输送被输送到患有或怀疑有动脉粥样硬化病变的病人体内。
在一些实施例中，本发明的组合物以一单次剂量的方式输送（到病人体内）。在有些实施例中，本发明的组合物以一种多次剂量的方式在一段延长的时间输送（到病人体内）。
在一些实施例中，本发明的组合物进一步一种辅助剂和/或药学上相容的载体。
氧化磷脂
在一个方面，本发明提供了整合入纳米颗粒的氧化磷脂及其变体。氧化磷脂在动物的动脉粥样硬化病变中富集（Podrez et al.,2002a;Podrezet al.,2002b）。他们是将oxLDL结合到内膜巨噬细胞上的CD36的主要配体。
在一些实施例中，本发明所公开的氧化磷脂包含溶血磷脂酰胆碱的一种酯，比如1-溶血磷脂酰胆碱（1-lyso PC）的一种酯或者2-溶血磷脂酰胆碱（2-lyso PC）的一种酯。
在一些实施例中，本发明公开的氧化磷脂包含2-lyso-PC的9-羟基-10-十二碳烯双酸酯（HDdiA-PC），2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOdiA-PC），2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯双酸酯(HODA-PC)，2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOOA-PC）；2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯酸酯（KODA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-8-氧代-6-辛烯酸酯（KOOA-PC），2-lyso-PC的9-酮基-10-十二碳烯酸酯（KDdiA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-6-辛烯酸酯（KOdiA-PC），2-lyso-PC的5-氧代戊酸酯（OV-PC），2-lyso-PC的9-氧代-壬酸酯（ON-PC,），1-棕榈酰-2-（5-氧代戊酰）-磷脂酰胆碱（POVPC），以及它们的组合等等。
在一些实施例中，本发明公开的氧化磷脂包含但不仅限于，1-棕榈酰-2–壬二酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–壬二酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰基-2-戊二酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（PGPC），1-棕榈酰-2-（5–氧代戊酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰-2-（9-氧代壬酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–乙酰-SN甘油-3-磷酸胆碱，1-十八烷基-2–乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-丁酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十八烷基-2-丁酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰-2–乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-2-十八烯基-乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-（homogamma亚麻酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3磷酸胆碱，1-十八烷基-2-甲基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-丁烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱磷脂，溶血PAF C16，溶菌酶是PAF C18，1-O-1'-Z）-十六碳烯-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1-（Z）-2-十六碳烯-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1'-（Z）十六碳烯-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1-（Z）-十六碳烯-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，1-O-1'-（Z）的十六碳烯-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，和1-O-1'-（Z）-2-十六碳烯基二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。一个本领域技术人员可理解到，磷酸胆碱是磷脂酰胆碱合成中的中间体。在一些实施方案中，术语磷酸胆碱和术语磷脂酰胆碱可互换使用。
在一些实施方案中，本发明使用氧化磷脂的截短形。氧化磷脂的截短形也可以有与完好氧化磷脂一样对巨噬细胞的CD36受体相同的高结合亲和力。KDdiA-PC已从oxLDL中分离出、并被鉴定(Boullier et al.,2001;Boullier et al.,2000;Podrez et al.,2002a;Podrez et al.,2002b;Watson et al.,1997)。KDdiA-PC赋予CD36的结合亲和力比任何过氧化氢的磷脂类都更强有力，也可能是oxLDL的更重要的结构性和功能性的决定因素(Berliner et al.,1997;Boullier et al.,2000;Leitinger etal.,1999;Watson et al.,1997)。
在一些实施例中，本发明公开的氧化磷脂包含荧光氧化磷脂。在一些实施例中，所述氧化磷脂包含1-棕榈酰-2-sn-甘油基戊二酰基-3-磷酸-N-（3-[4,4-二氟-4-硼烷-3α-a-二氮杂-s-茚]-丙酰基）-乙醇胺（BODIPY-PGPE），1-棕榈酰-2-（5–氧代戊酰）-sn-甘油基-3-磷酸-N-（3-[4,4-二氟-4-嵌段-ORA-3α，4α-二氮杂-均苯并二茚]-丙酰基）-乙醇胺（BODIPY-POVPE），1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-N-（3-[4,4-二氟-4-硼-3α，4α-二氮杂-s-茚]-丙酰基）-乙醇胺（BODIPY-POPE），或它们的组合。
氧化磷脂的其他例子可参加，例如，美国专利号7,973,023（Harats等），美国专利号7,906,674（Hermetter等），在此每一专利都以引述的方式，全文引入本专利申请。
氧化磷脂的合成
在一方面，本发明公开了合成氧化磷脂及其变体的方法。所述氧化磷脂及变体被整合入纳米颗粒中。
此前，KDdiA-PC从2-Lyso-PC和8-(2-呋喃基）辛酸合成，8-(2-呋喃基）辛酸可以很方便地从可从1，8-辛二醇以5个步骤合成。经过缩合和2阶段氧化，再经过简单的硅胶色谱纯化，即可得到纯的KDdiA-PC（Sunet al,2003）。
在一些实施例中，所述氧化磷脂及其变体（如KDdiA-PC）按照少许改进的文献方法合成。例如，以1，8-辛二醇为原料，经过8步骤，再经过制备性薄层色谱纯化，得到纯的KDdiA-PC。所有的分析数据和文献报道均吻合（例一）。
由于大量的抗动脉粥样硬化剂和诊断剂仅具低水平的生物利用度和靶向特异性，目前有一关键性的需求，即设计改造载体以提高这些抗动脉粥样硬化剂和诊断剂的细胞生物利用度和靶向特异性，以预防、诊断和治疗疾病。
本发明的细节已经在上描述，在不脱离在所附权利要求所限定的本发明的范围对本发明进行修改、变化和等同实施例等，将是显而易见的。
实例
下述非限制性实施例用来进一步说明在此公开的本发明的实施例。那些本领域技术人员应能理解这些下述实例中所公开的技术代表那些已被发现在本发明的实践中可良好操作，并因此可被认为构成本发明的实践模式的例子。但是，本领域技术人员应能根据本发明所公开的信息，认知到本发明公开的具体实施例可有许多变更，并获得相似或类似结果，而不背离本发明的范围。
实例一
KDdiA-PC的合成
KDdiA-PC的一个示范性的整体反应方案如下所示。
合成过程描述
8-(1,1,2,2-四甲基-1–硅丙氧基）辛-1-醇经由下列步骤合成：
氢化钠（900mg，37.5mmol），经己烷洗涤，并悬浮在THF（50mL）溶剂中。1，8-辛二醇（5g，34.2mmoL）被加至上述悬浮液，搅拌24小时。(TBDMS)-Cl(5.2g,34.5mmol)被加入到反应体系，并搅拌4小时。将粗反应混合物过滤，以旋转蒸发器除去溶剂。粗反应混合物用乙酸乙酯和己烷快速层析法纯化，以非常低的产率得到标题所示单甲硅烷基醚(1.5g,17%)。TLC（乙酸乙酯/己烷03:17，Rf值=0.3）用KMnO4染色。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.57(q,J=6.8Hz,4H),1.92(s,1H),1.56-1.44(m,4H),1.27(s,8H),0.86(s,9H),0.01(s,6H);13C NMR(100MHz,CDCl3)63.26,62.83,32.77,32.69,29.36,29.34,25.92,25.67,25.65,25.61,18.31,-5.32.
8-溴-1-（1,1,2,2-四甲基-1–硅丙氧基）辛烷经由下列步骤合成：
向8-(1,1,2,2-四甲基-1–硅丙氧基）辛-1-醇（1.58g,6.06mmol）和Ph3P（4.77g,18.19mmol）在THF（76mL）溶剂中的搅拌溶液，在氩气下，缓慢滴加溶解于THF（63mL）的ZnBr2（1.36g,6.06mmol）溶液。ZnBr2吸湿性非常强，它应在干燥、优选在惰性气氛称量。在搅拌反应混合物10分钟后，将溶解于THF（25mL）的偶氮二甲酸二乙酯（DEAD）（4.22g,24.26mmol）溶液缓慢逐滴加入，所得混合物搅拌过夜。该反应应该在没有光的环境中完成，因为DEAD对光敏感。如果圆底烧瓶中覆盖有铝箔，将会更好。将沉淀物过滤并在减压下除去溶剂。用乙酸乙酯和己烷对粗反应混合物进行快速色谱法纯化，得到标题所示的溴化物。TLC（乙酸乙酯/己烷1:24，Rf值=0.30），以高锰酸钾溶液染色。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.56(t,J=6.4Hz,2H),3.36(t,J=6.8Hz,2H),1.82(p,J=6.8Hz,2H),1.52-1.36(m,4H),1.28(s,6H),0.87(s,9H),0.01(s,6H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ63.26,33.90,32.88,29.30,28.83,28.19,26.04,25.78,18.41,-5.19。
8-(2-呋喃基）辛-1-醇经由下列反应合成：
呋喃（1.39毫升mL，19.14mmol）在无水THF（45mL）中的溶液在氩气下搅拌并冷却的乙二醇-干冰浴（-15℃），正丁基锂（(2.41M,7.22mL,17.41mmol）通过注射器泵（1.5毫升/分钟）的方式缓慢地加入。加完之后，将溶液在-15℃下再搅拌30分钟，乙二醇-干冰浴替换为冰浴，将溶液在0℃下搅拌1.5小时，生成呋喃基锂。将溶解于2.5毫升THF中的8-溴-1-（1,1,2,2-四甲基-1–硅丙氧基）辛烷（(619mg,1.91mmol）溶液加入到该溶液。该溶液在0℃下搅拌1小时，然后升温至室温。7小时后，反应用饱和NH4Cl（10mL）终止，反应混合物用己烷萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。无需纯化粗品混合物，在THF（6mL）和TBAF（1M，THF溶剂，7.65mL，7.65mmol）依次加入并在室温下搅拌。5小时后，将反应混合物用饱和的NH4Cl（12mL）中止，将所得混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。使用乙酸乙酯和己烷对粗产物进行快速色谱法纯化，得到得到呋喃辛醇（256mg，68％）。TLC（25％乙酸乙酯/己烷，Rf值=0.24）用KMnO4染色。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27(s,1H),6.25(s,1H),5.94(s,1H),3.60(t,J=5.4Hz,2H),2.59(t,J=7.3Hz,2H),1.76(s,1H),1.68-1.44(m,4H),1.31(s,8H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ156.55,140.67,110.08,104.61,62.71,32.74,29.43,29.19,28.09,28.02,25.83.
8-(2-呋喃基）辛酸经由下列反应合成：
向8-(2-呋喃基）辛-1-醇（246mg，1.25mmol）在DMF（4mL）中的溶液中加入PDC（2.83克，7.51mmol），在氩气下将所得反应混合物搅拌18小时室温。将所得混合物用饱和NH4Cl溶液（35mL）中止，并用乙酸乙酯萃取。将有机萃取液用水洗涤一次，并用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。使用高真空除去过量DMF。所得粗产品本身已很纯，直接使用到下一个步骤（199毫克，75％）。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27(s,1H),6.25(s,1H),5.95(s,1H),2.60(t,J=7.3Hz,2H),2.42-2.24(m,2H),1.62(s,4H),1.33(s,6H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ180.51,156.50,140.74,110.11,104.68,34.22,29.02,28.04,28.00,24.70。
1-棕榈酰-2-（8-(2-呋喃基）辛酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱经由下列反应合成：
呋喃基辛酸（42毫克，0.2毫摩尔）和1-棕榈酰-2-溶血-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱（50毫克，0.1毫摩尔）的混合物在高真空下、在室温下干燥6小时，并溶解在干燥的氯仿（2毫升，经P2O5搅拌过夜，再蒸馏）。二环己基碳二亚胺（DCC，120毫克，1.2毫摩尔）和N，N-二甲基氨基吡啶（12毫克，0.2毫摩尔）依次加入并搅拌，在室温下96小时。将粗反应混合物在减压下浓缩，并使用CHCl3/MeOH/H2O（16/9/1）进行制备性薄层色谱法纯化，产生1-棕榈酰-2-（8-(2-呋喃基）辛酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱（40毫克，58％）。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.26(s,1H),6.24(m,1H),5.94(d,J=3.2Hz,1H),5.17(m,1H),4.43-4.22(m,2H),4.16-4.04(m,1H),4.00-3.85(m,2H),3.79(s,3H),3.34(s,9H),2.58(t,J=7.7Hz,2H),2.34-2.18(m,4H),1.67-1.47(m,6H),1.39-1.13(m,30H),0.85(t,J=6.8Hz,3H);13CNMR(100MHz,CDCl3)δ173.76,173.23,156.47,140.72,110.12,104.67,70.65,66.51,63.50,63.03,59.37,54.57,34.35,34.21,32.00,29.79,29.62,29.45,29.25,29.06,28.06,28.00,24.96,22.77,14.21。
1-棕榈酰基-2-（9-氧代-12-氧代十二碳-10-烯酰基）-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱（KODA-PC）经由下列反应合成：
在氩气气氛下，在-20℃下，将NBS（4.2毫克，0.024毫摩尔）和吡啶（4.4毫克，0.056毫摩尔）依次加入到呋喃基磷脂酰胆碱的溶液（16毫克，0.023毫摩尔）在THF/丙酮/水（3毫升，5/4/2）。将所得混合物搅拌1小时，在此温度下，然后在室温下保持5小时。然后将溶剂通过旋转蒸发很快去除，并且将粗KODA-PC混合物用于下一步，不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ9.76(d,J=7.3Hz,1H),6.88(d,J=15.9Hz,1H),6.75(dd,J=16.0,7.4Hz,1H),5.19(bm,1H),4.43(bs,2H),4.31–4.34(m,1H),4.11(dd,J=11.4,7.2Hz,1H),3.92–4.07(m,4H),3.41(bs,9H),2.68(t,J=7.3Hz,2H),2.24–2.31(m,4H),1.54–1.69(m,6H),1.21–1.29(m,30H),0.84(t,J=6.9Hz,3H)。
1-棕榈酰基-2-（11-羧基-9–氧代十一碳-10-烯酰基）-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱（KDdiA-PC）的合成如下：
向由磁力搅拌的KODA-PC（上述最后一步的粗产物，0.023毫摩尔）的叔丁醇-水（5:1，体积/体积，1.0毫升）溶液中加入磷酸二氢钠（4.6毫克，0.038毫摩尔），2-甲基-2-丁烯（0.23毫升，0.46，以THF为溶剂的2M溶液），和NaClO2（0.7毫克，0.008毫摩尔，0.35当量）。将所得的混合物搅拌在氩气下室温搅拌2小时。除去溶剂。将残余物用4:1CHCl3/MeOH萃取。所得粗产物通过硅胶制备薄层色谱（CHCl3/MeOH/H2O，11:9:1；Rf值=0.3）进行纯化，得到KDdiA-PC（8.0毫克，两步48％）。1H NMR(CD3OD,400MHz):δ6.67(d,J=16.0Hz,1H),6.59(d,J=16.0Hz,1H),5.11(m,1H),4.30(dd,J=12.4,3.7Hz,1H),4.16(m,2H),4.06(dd,J=11.9,6.9Hz,1H),3.87–3.99(m,2H),3.52–3.54(m,2H),3.11(s,9H),2.55(t,J=7.4Hz,2H),2.19–2.25(m,4H),1.50(m,6H),1.17-1.23(30H),0.78(t,J=6.9Hz,3H)。
实例二
脂质体提高稳定性，细胞生物利用度和绿茶儿茶素功能
由绿茶施加的化学预防能力被认为是源于其主要的多酚，（-）-没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）。然而，稳定性和生物利用度在体内的水平低使得在化学预防剂量施用EGCG不切实际。EGCG封包的壳多糖涂覆的纳米脂质体（CSLIPO-EGCG）被合成，他们针对MCF7乳腺癌细胞的抗增殖和促凋亡作用被观察到。CSLIPO-EGCG显著地、并极大提高EGCG的稳定性，增加了在MCF7细胞内的EGCG含量，诱导MCF7细胞的凋亡，较之于原生EGCG和中空CSLIPO，抑制了MCF7细胞增殖。该CSLIPO-EGCG在10uM或更低浓度下，在原生EGCG不具有任何有益的效果的情况下，保留了它的抗增殖和促凋亡效果。这项研究表明，使用生物相容的和可生物降解的CSLIPO-EGCG可以显著提高儿茶素的稳定性，细胞生物利用度和EGCG的抗疾病功能，仅有极小的免疫原性和副作用
纳米脂质体的特征概括于表1和表2中，如下所示。
表1、纳米脂质体的特征
表2、LIPO-EGCG和CSLIPO-EGCG，溶解在1X PBS，在pH7.2，在4℃和25℃存放后的颗粒大小、zeta电位、和多重分布指数
实例三
纳米结构脂质载体提高稳定性，细胞生物利用度和绿茶儿茶素 功能
绿茶是从茶树植物的干叶制成。绿茶中的儿茶素约占总干茶重量的33%(Wang et al.,2006)。EGCG是最丰富的儿茶素，包括儿茶素总量的48-55％(Basu and Lucas,2007)。1个2克的绿茶袋含约330毫克的EGCG。体外研究表明，儿茶素诱导巨噬细胞和巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡，抑制源自那些细胞的炎症因子的表达和生产(Hashimoto and Sakagami,2008;Hayakawa et al.,2001;Ichikawa et al.,2004)。当载脂蛋白E缺失的小鼠接受每日腹腔注射EGCG治疗，剂量10毫克/千克体重，血管套诱导的不断发展的动脉粥样硬化病变的大小，经过21天的治疗，减少55％(Chyuet al.,2004)。人体研究表明，EGCG能维持心血管健康，但对于心血管疾病的预防或治疗有效性的证据不确定(Arab et al.,2009;Wolfram,2007)。主要的问题在于它的低稳定性、低生物利用度和在人体或研究动物的低靶向特异性(Chen et al.,1997;Lee et al.,2002;Warden et al.,2001)。绿茶儿茶素类的血浓度峰值出现在口服给药后2至4小时。在饮用含儿茶素10毫克/公斤体重后，EGCG在人体和研究动物的绝对口服生物利用度为约0.1％(Lambert and Yang,2003;Warden et al.,2001)。在饮用2杯绿茶后，EGCG血药峰浓度的是0.15微摩尔(Lee et al.,2002)。此外，儿茶素在水和体外生理液体中都不稳定(Barras et al.,2009;Lambert et al.,2003)。各种代谢转化过程，包括甲基化、葡糖醛酸化、硫化和体内的氧化降解，均导致EGCG稳定性降低(Dou,2009;Lu et al.,2003a;Lu et al.,2003b;Vaidyanathan and Walle,2002)。EGCG不能导向特定的细胞或组织。因此，使用生物相容的和可生物降解的纳米载体，以提高儿茶素的稳定性，细胞的生物利用度和靶特异性，是一个关键性需求。
详细的实验方法如下所述。
细胞培养：人单核细胞THP-1细胞系从American Type Tissue CultureCollection(ATCC,Rockville,MD)购买，并根据ATCC指示在一个完全培养基中生长。所述完全培养基由补充有10％胎牛血清和0.05毫摩尔的2-巯基乙醇的RPMI培养基组成。所述细胞在37℃、在5％CO2气氛中培育。所述THP-1细胞经过用含有50纳克/毫升的PMA的完全培养基培养72小时，分化成巨噬细胞。
载有EGCG的NLC和CSNLC的制备：封包在纳米结构脂质载体（NLCE）和中空纳米结构脂质载体（VNLC）的EGCG，经过一种新颖的、基于相转化的工艺制备。简单而言，将大豆卵磷脂（70毫克）溶解在氯仿中，在氮气蒸发器干燥，和使用一个真空冷冻干燥系统冷冻干燥超过24小时。之后将甘油三棕榈酸酯（50毫克）、tricaprate（300毫克）、SOLUTOL HS15（330毫克）和EGCG（20毫克）加入到冷冻干燥的卵磷脂，他们形成一个液体混合物。制备一种含水混合物，组成为NaCl和去离子水。首先，将油相和水相加热至85℃并混合在一起。然后，将混合物在磁力搅拌下进行3次从70到85℃温度循环处理。在最后一次循环中，当混合物冷却至79℃（比相位反转区的起点低1到3℃），将冷去离子水（0℃）溶液加入到混合物中。此快速冷却-稀释过程导致NLCE形成。之后，将缓慢磁力搅拌施加到悬浮液，搅拌45分钟。VNLC的合成使用相同的方法，但不添加EGCG。VNLC和NLCE的制备的所有步骤均在氮气氛下进行，以防止EGCG降解。
NLC形态、粒径和zeta电位的确认：将NLCE和CSNLCE再悬浮于1×磷酸盐缓冲盐水（1XPBS），用2%醋酸铀着色（染色）。它们的大小和形貌通过使用200KV日立H-8100分析透射电子显微镜（TEM）测定。粒度、粒度分布、和zeta电势通过使用Brookhaven BI-MAS和ZetaPALS分析仪，分别测定。
EGCG的HPLC分析：EGCG用高效液相色谱（HPLC）系统（WatersCorporation,Milford,MA）检测，使用一个UV检测器和一个ZORBAX SB-C185μm,150*4.6mm(Agilent)。流动相的组成为86％的水，12％乙腈，2％的乙酸乙酯和0.043％的硫酸，且流速为1毫升/分钟。EGCG在254纳米波长被检测。
EGCG的封包效率和EGCG的加载内容由下列方法决定：
封包效率（%）=（所加EGCG的重量–自由EGCG的重量）/所加EGCG的重量x100%。
加载内容（%）=EGCG重量/纳米颗粒重量
加载EGCG的NLC、CSNLC和原生EGCG在不同条件下的稳定性研究：为研究NLC、CSNLC和原生EGCG在pH范围1-7.4的稳定性，将盐酸加入到200mM的磷酸缓冲生理盐水，得到四个不同的pH值溶液（pH=1，3，5，7.4）。之后将所有的样品溶解在这些溶液中，获得EGCG的最终浓度100μM。将溶液储存于密闭小瓶中，并在37℃水浴中孵育。EGCG浓度在下述时间点测定：0小时，0.5小时，1小时，1.5小时，2小时，2.5小时和3小时。
为确定在不同温度下的稳定性，将含100μM EGCG的NLC、CSNLC和原生EGCG溶解在1XPBS溶液（pH7.4），在4℃、22℃和37℃下分别孵育14天、19小时和3小时。为了模拟细胞生长，稳定性通过使用细胞培养基RPMI1640--在37℃下，有或无细胞，和有或没有有超氧化物歧化酶（SOD，5U/ml）--进行评价。
经过100μM原生EGCG，NLCE和CSNLCE不同条件下处理的巨噬细胞中 的EGCG含量:THP-1细胞源生的巨噬细胞在有或无SOD（5U/ml）的完全培养基中，用100μM的NLCE，CSNLCE和原生EGCG处理。在4℃或37℃下培养2或4小时后，将细胞用冰冷的1XPBS洗涤3次。贴壁细胞用200μl的2％抗坏血酸（pH为3）刮下，每一个孔都用200μl甲醇洗涤，所用甲醇与2％的抗坏血酸结合，作为一混合物。混合物的体积被测定，内标表儿茶素被加入到混合物中。经一个冷冻-解冻周期后，将混合物在冰冷浴用超声波仪（Branson,Inc）超声处理2分钟。将混合物在4℃下以10,000×g离心分离处理20分钟。将上层清液收集，并注入HPLC系统。沉淀物用0.5毫升去离子水洗涤以除酸，并在化学通风橱中干燥过夜。将干燥后的细胞用0.5N NaOH进行消化。细胞蛋白总含量用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒测定(Pierce,Cramlington)。总细胞摄取表示为EGCG微克量每毫克蛋白质。
体外释放研究：从纳米载体的EGCG释放用透析法在1XPBS在pH值5的条件下操作。
细胞存活力测定：对于细胞存活力研究，将悬浮于150μl培养基的3×104细胞接种到96孔板的每个孔中，分化72小时。然后将细胞用1X PBS（处理1），原生EGCG（处理2），VCSNLC（处理3），CSNLCE（处理4），VNLC（处理5），NLCE（处理6），处理18小时。用三种EGCG浓度（5μM,10μM和20μM）在各处理间进行了测试。18小时后，细胞用3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-2，5-二苯基溴化（MTT）试剂（0.5毫克/毫升，1XPBS）在37℃下培养4小时。然后将MTT试剂抽吸，加入二甲亚砜（DMSO），以溶解甲臜产物。培养10分钟后，各孔中的吸光度在562nm和690nm波长通过BioTek ELx800TM吸收酶标仪（BioTek,Winooski,VT）测定。背景吸光度（690nm）被从562nm测量值中减去。
最低限度修饰低密度脂蛋白的制备和胆固醇测量：LDL用一种连续超速离心法从人血浆中分离出。最低限度修饰LDL用先前已描述的方法改造方法制备。简单而言，将human LDL与2mM的硫酸铜接触5小时，(对LDL的)氧化经过测定硫代巴比妥酸反应性物质的确认。巨噬细胞与以下处理，含10μMEGCG，在有或无40毫克蛋白质/mL最低限度修饰LDL：1XPBS（处理1），原生EGCG（处理2），VCSNLC（处理3），CSNLCE（处理4），VNLC（处理5），NLCE（处理6）处理18小时。经细胞内脂质的提取之后，非酯化/流离胆固醇（non-esterified/freecholesterol）（FC）和总胆固醇（TC）使用HPLC系统测定。
示范性结果如下所述。
纳米颗粒的物理特性：纳米颗粒的一些选定物理特性总结在表3和表4。
表3纳米颗粒的特性1
1数值为平均值±SD,n=3.
表4纳米载体，溶于1X PBS，pH7.4，分别在4℃和37℃下的颗粒尺寸、zeta电位、多重分布指数2
2数值为平均值±SD,n=3.
CSNLCE的粒径大于VNLC和NLCE。VCSNLC和CSNLCE都带正电荷，但VNLC和NLCE带负电荷。EGCG在NLC和CSNLC的封包效率为约90%。EGCG在NLC的加载含量分别约为3%。使用透射电子显微镜（TEM）观测到，NLCE和CSNLCE都是球形（图6）。
NLCE,CSNLCE和原生EGCG的稳定性：100μM原生EGCG、纳米封包的EGCG（NLCE和CSNLCE）的稳定性在分别不同的pH值和温度，进行了测定。总结在图2-5中的数据表明，原生EGCG和纳米颗粒中的EGCG的降解主要是取决于溶液的pH和温度。在所有条件下，EGCG的稳定性在相同pH值具备以下顺序：CSNLCE>NLCE>原生EGCG。100μM浓度的NLCE,CSNLCE和原生EGCG，在酸性pH从1.0到5.0的范围内，在37℃下，在3小时内，是稳定的。他们之中，在该pH范围内，稳定性没有显著差异。在中性pH值7.4时，原生EGCG（100μM）并不稳定，在37℃下3小时后，不能被检测到。NLCE和CSNLCE的降解速率，在pH7.4在37℃下，与天然EGCG相比，要慢得多。经过2小时培养之后，含有100μMEGCG的NLCE和CSNLCE，比原生的EGCG，稳定性分别为7倍和12倍以上（图7）。
随着温度的降低，EGCG的稳定性增加。与纯EGCG相比，在4,22,37℃之间，纳米颗粒的稳定性显著增加。在37℃下，100μM的原生EGCG在3小时后完全降解，但是，NLCE则有33.28%未降解（与EGCG相比较P<0.01），CSNLCE有64.18%未降解（与compared with NLCE P<0.01）。在4℃，原生的EGCG，其中91％在19小时后降解，而在相同的初始浓度时，NLCE和CSNLCE中的EGCG的降解率则低于4％。在23℃下，培育8小时后，CSNLCE浓度（89％剩留）比原生的EGCG高出58倍（1.52％剩留）（图8）。此外，纳米颗粒的高浓度可以在4℃下保持很长一段时间，而没有明显的降解。如果将3000μM NLCE和CSNLCE在4℃下保持50天，还保有、并检测到92％NLCE和82％CSNLCE。
纳米颗粒也可延长在细胞培养基RPMI1640的EGCG在37℃下的稳定性，无论有无THP-1源性巨噬细胞的存在或不存在。在细胞培养基RPMI1640在37℃下，纳米颗粒和EGCG的稳定性比在1XPBS溶液中下降得更快，但纳米颗粒与EGCG相比要稳定得多。培养1小时后，剩留31％CSNLCE和27％NLCE，相比之下，只剩下3.7％左右的EGCG。SOD（5U/ml）在37℃下，与在RPMI1640中的纳米颗粒相比，可显著提高EGCG的稳定性。在巨噬细胞存在的情况下，巨噬细胞可以轻微提高纳米粒子和EGCG的稳定性。此外，SOD（5U/ml）可以显著提高纳米粒子和原生EGCG在RPMI、37℃、和巨噬细胞存在下的稳定性（图9，10）。
THP-1巨噬细胞摄取的EGCG含量：经过2小时、在37℃下的培养，经过100μM在无SOD完全培养基中的原生EGCG，NLCE和CSNLCE处理的THP-1源性巨噬细胞中的EGCG含量，分别为0.031，0.096，0.14微克/毫克蛋白。所述两种纳米载体，与原生EGCG相比较，在相同处理浓度下显著增加了细胞EGCG含量。
将SOD加入培养基在所有的处理中都显著增加了细胞EGCG含量，且这种改善依赖于时间。在37℃下，经过2小时培养之后，经过100μM在含有SOD（5U/ml）的完全培养基中的原生EGCG，NLCE和CSNLCE处理的巨噬细胞中EGCG含量，分别为0098，0176，0307微克/毫克蛋白质。4小时后，在经原生EGCG、NLCE和CSNLCE处理的巨噬细胞在中SOD存在下，其EGCG含量分别为0.109，0.458，0.853微克/毫克蛋白质（图11）。在37℃下经2小时培养，在经过CSNLCE处理的巨噬细胞中，细胞EGCG含量显著高于原生EGCG（P<0.01）和（p<0.05）。在4℃和37℃，在SOD的存在下培养4小时后，在经过CSNLCE处理的巨噬细胞中的细胞EGCG含量显著高于原生EGCG（P<0.05）。
细胞存活力测定：在用5、10、和20μM原生或纳米封包的EGCG（NLCE和CSNLCE）及响应性中空纳米载体（VNLC和VCSNLC）分别处理THP-1源性巨噬细胞18小时，在所有的处理中，细胞存活力为90％以上（图12）。
NLCE和CSNLE对胆固醇累积的影响：在没有在培养液中加入oxLDL的条件下，纳米封包的EGCG，与对照组--1XPBS，原生EGCG和中空纳米颗粒—相比，能显著减少巨噬细胞中的细胞酯化胆固醇（EC）含量。
与1XPBS处理相比较，CSNLCE和NLCE分别降低了细胞EC含量10倍和2.8倍。与EGCG相对照，CSNLCE和NLCE降低了细胞EC含量9.4倍和2.7倍（图13A）。
在加入40毫克蛋白质/ml最低限度修饰-LDL到培养液中之后，NLCE和CSNLCE，相比与原生EGCG，分别减少了巨噬细胞中的EC含量5倍和4倍（图13B）。
通过荧光显微镜测定纳米颗粒的摄取和分布：在细胞与NLC和CSBLC制剂接触的情况下，在整个细胞内基质内，可清楚地观察到高度扩散的荧光。从荧光显微镜图像（图14）可以看到，NLC，CSNLC脂质载体已经被显著摄取，而且在18小时的时间点，信号最高，因此其摄取量应该最高。
实例四
KDdiA-PC增加纳米脂质体对巨噬细胞的结合亲和力
图15A-C说明了脂质体对THP-1源性巨噬细胞结合试验的结果。（人单核细胞THP-1细胞系在由补充有10％胎牛血清和0.05毫米的2-巯基乙醇的RPMI培养基组成的一个完整的培养基中生长。将细胞在37℃，95％湿度和5％的气氛的条件下培养。将3×104个THP-1细胞接种到96孔无菌平底平板的每个孔中，并通过用含有50纳克/毫升的PMA的完全培养基中培养72小时，使之分化成巨噬细胞）。
从THP-1细胞衍生的巨噬细胞与荧光标记的脂质体泡囊（5μg/ml的脂质浓度，的平均囊泡粒子大小为120nm）在含有2％无酯血清的PRMI1640中在37℃处理4时（参见图15）。图15A表明，配体脂质体（由30mol％KDdiA-PC组成）表现出对巨噬细胞非常强的结合。图15B表明，控制-无KDdiA PC的脂质体对巨噬细胞，表现出更弱的结合，仅比1XPBS控制（图15C）稍微好一点。
有KDdiA-PC的脂质体对巨噬细胞有显著更高的结合亲和力，并且，与无KDdiA-PC的脂质体相比，导致自身被巨噬细胞更多的摄取。
实例五
提高脂质体对低密度脂蛋白受体缺失的小鼠中动脉粥样硬化病 变的靶向特异性
图16A-D显示KDdiA-PC-脂质体在LDL受体缺失小鼠（一个著名动脉粥样硬化的动物模型）中导向动脉粥样硬。）。雄性低密度脂蛋白受体缺陷（LDLr-/-）小鼠（C57BL6背景）饲喂Harlan Teklad–一种导致动脉粥样硬化的高脂饮食（TD.88137），含有饱和脂肪21％（w/w）和0.15％胆固醇–从6周龄开始喂养24周。喂养这个高脂饮食24周后，小鼠诱发在主动脉弓和腹动脉的动脉粥样硬化病变。小鼠饲养在22～24℃，相对湿度45％，每日10/14光/暗周期，光周期从06:00到16:00。
向动脉粥样硬化模型小鼠，所述含有KDdiA-PC的脂质体囊和控制组脂质体囊，且用1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR）近红外（NIR）荧光染料（λ激发的为730nm，发射的λ为790纳米）标记，通过尾静脉静脉注射。20小时后，获得NIR图像结合X射线图像从左侧（A）和右侧（B），或者通过切开腹部暴露主动脉（C）以及从每只小鼠得到离体主动脉（D），使用Lumina XR成像系统（请看图16）。KDdiA-PC显著并极大增加了脂质体对动脉粥样硬化病变的结合亲和力和靶向特异性。
实例六
提高了脂质体对低密度脂蛋白受体缺失的小鼠中动脉粥样硬化病变的靶向 特异性的脂质体的制备
在大豆磷脂酰胆碱（>95％）在氮气下干燥并在1XPBS（pH7.4）中在悬浮后，将悬浮液通过0.2μm的聚碳酸酯过滤器，随后通过0.08μm的聚碳酸酯过滤器（每个过滤器10次），使用一个Avanti Mini挤出机组（Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL）以合成小单层脂质体。所述靶向脂质体通过用KOdiA-PC取代30mol％的大豆卵磷脂来准备。为体外结合实验制备脂质体时，将2mol％的荧光染料7-硝基-2-1，3-苯并恶二唑-4-基-磷脂酰胆碱（NBD-PC），加入到大豆磷脂酰胆碱。为体内成像实验制备脂质体时，用于体内成像的实验中，将2mol％的近红外荧光染料1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DIR），加入到大豆磷脂酰胆碱。
维生素E纳米载体（NLC）的制备
大豆磷脂酰胆碱（>95％），乙氧基化的硬脂酸和油酸酯，维生素乙酸酯，EGCG和乙酸溶解于乙醇中并在氮气下干燥下来。将热去离子水（80℃）加入到干燥的混合物。将悬浮液匀化1分钟，随后通过超声处理8分钟。EGCG封包的脂质纳米载体（NLC-EGCG）的粒径和分布通过Brookhaven BI-90颗粒尺寸分析仪进行测量。为体外结合实验制备脂质体时，将2mol％的荧光染料7-硝基-2-1，3-苯并恶二唑-4-基-磷脂酰胆碱（NBD-PC），加入混合物。为体内成像实验制备脂质体时，用于体内成像的实验中，将2mol％的近红外荧光染料1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DIR），加入混合物。THP-1细胞衍生的巨噬细胞在PRMI1640中在37℃分别用NBD-标记的NLC-EGCG，带或不带KOdiA-PC，处理2小时。结合亲和力使用荧光测定，细胞EGCG含量使用HPLC系统测定。细胞蛋白总含量用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒测定(Pierce,Rockford,IL)。总细胞摄取表示为EGCG微克量每毫克蛋白质。
诱发的腹腔巨噬细胞隔离
给C57BL6J小鼠腹腔注射1.0毫升巯基乙酸培养基（4.05g/100mL）。三天后，诱发的腹腔细胞通过用10ml冷的无Ca2+、无Mg2+的Hanks'平衡盐溶液进行腹膜灌洗4次，从腹膜腔收集。腹膜液被收集到无菌试管中，并立即在600克在4℃下进行离心15分钟。细胞沉淀再悬浮于补充了10mMHEPES，100单位/mL青霉素和100微克/毫升链霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培养基。将细胞接种于24孔组织培养板（1.25x105每孔），并使其在37℃下在CO2培养箱中附着2小时。通过用无菌1XPBS洗涤除去非粘附细胞。附着细胞在含有10％FBS，100单位/mL青霉素和100微克/毫升链霉素，在37℃的RPMI1640培养基中维持。
体外结合分析
人单核细胞THP-1细胞系从American Type Tissue CultureCollection(ATCC,Manassas,VA)购买，并根据ATCC指示在RPMI1640培养基中生长。所述THP-1细胞经过与50纳克/毫升的PMA培养72小时，分化成巨噬细胞。对THP-1源性巨噬细胞用1×PBS，NBD标记的脂质体（或纳米载体）不含靶向配体（氧化磷脂），NBD标记的脂质体（或纳米载体）含靶向配体（氧化磷脂），溶解在1XPBS（pH7.4）中，在4℃下处理2小时。靶向和和无靶向脂质体（或纳米载体）的细胞结合在荧光显微镜下被观察到。显微镜的设置对所有的测量都是相同，以允许使图像的等同比较。荧光强度均采用美国国立卫生研究院的ImageJ软件量化。
竞争性结合分析
在竞争性研究中，小鼠腹腔巨噬细胞以如下步骤培养：1）无靶向配体（氧化磷脂）的NBD标记的脂质体；2）有靶向配体（氧化磷脂）的NBD标记的脂质体；3）无靶向配体的NBD标记的脂质体和RPE标记的抗CD36抗体；4）有靶向配体的NBD-标记的脂质体和RPE标记的抗CD36抗体。所有细胞均在4℃下培养2小时。经过培养后，将巨噬细胞用用冰冷的1XPBS（pH7.4）漂洗三次，并用3.7％甲醛在1xPBS（pH7.4）中在室温下固定10分钟。在用冰冷的1XPBS（pH7.4）中洗涤三次后，细胞核在室温下于暗处用DAPI溶液（IHC World）着色10分钟。细胞用冰冷的1XPBS（pH7.4）中再次洗涤，并在荧光显微镜下进行视觉化观察。
在敲除分析中，CD36siRNA（Life Technologies）被按照生产商的说明，用来敲除在采用上述方法分离的小鼠腹腔巨噬细胞中的CD36的表达。也使用到一种CD36阴性对照siRNA（Life Technologies）。经48小时转染之后，将巨噬细胞用无靶向配体（氧化磷脂）NBD-标记的脂质体或有靶向配体（氧化磷脂）的NBD-标记的脂质体脂质体在4℃下处理2小时。经过培养后，将细胞用用冰冷的1XPBS（pH7.4）漂洗三次，并用3.7％甲醛在1xPBS（pH7.4）中在室温下固定10分钟。在用冰冷的1XPBS（pH7.4）中洗涤三次后，细胞核在室温下于暗处用DAPI溶液（IHC World）着色10分钟。巨噬细胞用冷的1XPBS（pH7.4）中再次洗涤，并在荧光显微镜下进行视觉化观察。在CD36敲除巨噬细胞中CD36的表达，也用CD36抗体测量。简言之，将巨噬细胞用1×PBS洗涤，在用冷甲醇固定10分钟。用1％BSA在室温下培养1小时后，将细胞在4℃下在黑暗中用的RPE-标记的大鼠抗小鼠CD36抗体（1:200）染色过夜。经CD36染色后，细胞核在室温下于暗处用DAPI溶液（IHC World）着色。巨噬细胞在荧光显微镜下进行视觉化观察。
所有实验都用不同的细胞制剂重复三次。显微镜的设置对不同的培育（也称培养或孵化）是相同的，以对结果进行比较。
体内配体对动脉粥样硬化斑块的导向
动物方案经美国德州理工大学的动物护理和使用委员会的批准。雄性低密度脂蛋白受体缺陷（LDLr-/-）小鼠（C57BL6背景）饲喂Harlan Teklad–一种导致动脉粥样硬化的高脂饮食（TD.88137），含有饱和脂肪21％（w/w）和0.15％胆固醇–喂养20到30周。小鼠饲养在22～24℃，相对湿度45％，每日10/14光/暗周期，光周期从06:00到16:00。食物和水随意喂养。小鼠根据他们的体重配对。在每一配对组中，将一只老鼠用有靶向配体（氧化磷脂）的脂质体处理，将另一只老鼠用无靶向配体的脂质体处理。
为了测定携带配体（KOdiA-PC）的脂质体对动脉硬化模型小鼠的靶特异性，将靶向和非靶向脂质体以1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DIR），一种近红外（NIR）荧光染料（λ激发波长730纳米，λ发射波长790纳米）。将DIR-标记的脂质体静脉经尾静脉注射入小鼠。注射20小时后，将小鼠处死，然后将心脏用PBS从左心室老鼠经尾静脉灌流。主动脉的原位和分离后的荧光反射图像在Lumina XR成像系统(Caliper Life Science,USA)的成像室中获取。随后，已剖开的心脏和主动脉被嵌入Tissue-Tek O.C.T.(Sakura)中，在液氮中急速冷冻，并使用低温恒温器（5μm厚）切片。主动脉的横截面的DiR信号以荧光显微镜用Cy7的滤光器观察。相邻的主动脉截面以油红O着色，以识别动脉粥样硬化病变。截面在显微镜下观察。
实验结果
将THP-1细胞衍生的巨噬细胞，用有或无靶向配体（KOdiA-PC）的NBD-标记的脂质体，在4℃下处理2小时（图17）。NBD标记的纳米载体是绿色的。细胞核被DAPI染色（蓝色）。靶向配体增加脂质体对THP-1源性巨噬细胞的结合亲和力。携有KOdiA-PC的脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞，与没有携带KOdiA-PC的脂质体相比，有更高的结合亲和力（图18）。CD36的免疫染色显示在CD36小鼠巨噬细胞中高水平表达。荧光的靶向囊泡与巨噬细胞强力结合，而非靶向的囊泡则没有。将抗CD36抗体加入，荧光的靶向囊泡与细胞的结合被极大地阻断。将携带KOdiA-PC的脂质体和CD36抗体一起培养，抑制了脂质体结合巨噬细胞（图18）。从巨噬细胞中敲除CD36以后，携带配体的NBD-标记的脂质体的结合亲和力显著下降，表明靶向纳米载体通过CD36结合到巨噬细胞（图19）。阴性对照siRNA没有影响巨噬细胞中CD36的表达，也没有影响靶向囊泡与细胞的结合。携有KOdiA-PC的脂质体对3T3-L1脂肪细胞（CD36高表达），比3T3-L1前脂肪细胞（CD36低表达），具有更高的结合亲和力（图20）。
NLC-EGCG的直径大小为约60nm（图21）。携带KOdiA-PC的NLC-EGCG与无配体的NLC-EGCG和自由的EGCG相比，提高了巨噬细胞的EGCG含量（图22）。KOdiA-PC提高了NLC-EGCG对巨噬细胞的结合亲和力。携带KOdiA-PC的NLC-EGCG与不携带KOdiA-PC的NLC-EGCG相比，具有对巨噬细胞显著更高的结合亲和力，并导致巨噬细胞更多摄取NLC-EGCG，从而导致更高的巨噬细胞EGCG含量（图23）。
体内靶向实验结果：
携带KOdiA-PC的脂质体靶向导向主动脉粥样硬化病变（图24）。KOdiA-PC比POVPC更好地靶向导向动脉粥样硬化病变（图24）。含KOdiA-PC、POVPC，或无配体的纳米载体经尾静脉注射注入小鼠。所有纳米载体用1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR）近红外（NIR）荧光染料（λ激发的为730nm，发射的λ为790纳米）标记。22小时后，处死小鼠，主动脉均使用IVIS Lumina的XR的成像系统成像。DiR的强度越高，纳米载体对主动脉的结合亲和力更高。相同的纳米载体也被注入到对照小鼠（无动脉粥样硬化病变），含KOdiA-PC的纳米载体并未靶向到主动脉（数据未显示）。KOdiA-PC显著地并极大增加了纳米载体对动脉粥样硬化病变的结合亲和力和靶向特异性。
携带KOdiA-PC的脂质体可以靶向导向主动脉表面和主动脉横截面的动脉粥样硬化病变（图25）。关于图25的分析，主动脉从每个处理组中分离。病灶使用相衬和Cy7过滤器成像。黑色区域代表主动脉瓣病变。紫色光谱颜色代表纳米载体的累积。图26显示主动脉弓的横截面的代表性图像。
参考：
Arab,L.,et al.,2009.Stroke.40,1786-1792;Barras,A.,etal.,2009.Int J Pharm.379,270-277;
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尽管本发明已经在上下文中通过某些实施例和实例公开，本领域技术人员可以理解，本发明的实施例以外的具体公开的实施方式扩展到其它替代实施例和/或应用和变型和等同物。
在一些实施方案中，术语“一”和“该”和类似的参考在本发明的特定实施例的上下文中（特别是在某些以下的权利要求的上下文中）可以被解释为既包括单数和复数。本发明叙述的数值的范围仅在用作单独提及落在该范围内的每一个单独值的简捷方法。除非本发明另有说明，每个单独的值被结合到说明书中，如同其在本文中单独列举。本文中所描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或以其它方式清楚地与上下文相矛盾。在此公开的相对于特定实施例使用任何和所有实例或示例性语言（例如“诸如”）在此仅仅是为了更好地说明本发明，并不构成对本发明范围的限制。在本说明书中的任何语言都不应被解释为标示对本发明的实施具关键性的任何未要求保护的元素。

Claims (15)

1.一种组合物，包含：多个纳米颗粒，所述纳米颗粒包含一种或多种氧化磷脂，所述氧化磷脂封包于所述纳米颗粒之内，附着在所述纳米颗粒的表面上，或整合到所述纳米颗粒的结构中，其中所述一个或多个氧化磷脂靶向导向靶动脉粥样硬化病灶部位。
2.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒选自脂质体，聚合物囊泡，微球体，微结构化脂质的载体，纳米结构的脂质载体，高密度脂蛋白和它们的一种组合。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述一种或多种氧化磷脂选自1-棕榈酰-2–壬二酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–壬二酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰基-2-戊二酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（PGPC），1-棕榈酰-2-（5–氧代戊酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰-2-（9-氧代壬酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–乙酰-SN甘油-3-磷酸胆碱，1-十八烷基-2–乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-丁酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十八烷基-2-丁酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-棕榈酰-2–乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-2-十八烯基-乙酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-（homogamma亚麻酰）-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2–棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3磷酸胆碱，1-十八烷基-2-甲基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，1-十六烷基-2-丁烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱磷脂，溶血PAF C16，溶菌酶是PAF C18，1-O-1'-Z）-十六碳烯-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1-（Z）-2-十六碳烯-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1'-（Z）十六碳烯-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1-O-1-（Z）-十六碳烯-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，1-O-1'-（Z）的十六碳烯-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，和1-O-1'-（Z）-2-十六碳烯二十二碳六烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，以及其中一种组合。
4.权利1-3中任一组合物，其中所述一种或多种氧化磷脂选自2-lyso-PC的9-羟基-10-十二碳烯双酸酯（HDdiA-PC），2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOdiA-PC），2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯双酸酯(HODA-PC)，2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOOA-PC）；2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯酸酯（KODA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-8-氧代-6-辛烯酸酯（KOOA-PC），2-lyso-PC的9-酮基-10-十二碳烯酸酯（KDdiA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-6-辛烯酸酯（KOdiA-PC），2-lyso-PC的5-氧代戊酸酯（OV-PC），2-lyso-PC的9-氧代-壬酸酯（ON-PC,），1-棕榈酰-2-（5-氧代戊酰）-磷脂酰胆碱（POVPC），以及它们的组合。
5.权利要求1-4中任一组合物，其中所述一种或多种氧化磷脂包含KDdiA-PC。
6.权利要求1-5中任一组合物，其中所述一纳米颗粒由一种或多种氧化磷脂构成，其中所述一种或多种氧化磷脂选自2-lyso-PC的9-羟基-10-十二碳烯双酸酯（HDdiA-PC），2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOdiA-PC），2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯双酸酯(HODA-PC)，2-lyso-PC的5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酸酯（HOOA-PC）；2-lyso-PC的9-羟基-12-氧代-10-十二碳烯酸酯（KODA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-8-氧代-6-辛烯酸酯（KOOA-PC），2-lyso-PC的9-酮基-10-十二碳烯酸酯（KDdiA-PC），2-lyso-PC的5-酮基-6-辛烯酸酯（KOdiA-PC），2-lyso-PC的5-氧代戊酸酯（OV-PC），2-lyso-PC的9-氧代-壬酸酯（ON-PC,），1-棕榈酰-2-（5-氧代戊酰）-磷脂酰胆碱（POVPC），以及它们的组合。
7.权利要求1-8中任一组合物，其中所述纳米颗粒包含一种或多种分子，选自白蛋白，葡聚糖，明胶，聚乙二醇（PEG），聚（乙烯基吡咯烷酮），透明质酸，肝素，硫酸肝素，唾液酸，聚（N-乙酰葡糖胺）（几丁质），脱乙酰壳多糖，聚（3-羟基戊酸酯），聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯），聚（1-丙交酯-共-乙交酯），聚（3-羟基丁酸酯），聚（4-羟基丁酸酯），聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯），聚原酸酯，聚酐，聚（乙醇酸），聚（乙交酯），聚（L-乳酸），聚（L-丙交酯），聚（D，L-乳酸），聚（D，L-丙交酯），聚（L-丙交酯-共-D，L-丙交酯），聚（己内酯），聚（L-丙交酯-共-己内酯），聚（D，L-丙交酯-共-己内酯），聚（乙交酯-共-己内酯），聚（三亚甲基碳酸酯），聚酯酰胺，聚（乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯），共-聚（醚-酯）（例如PEO/PLA），聚磷腈，纤维蛋白，纤维蛋白胶，纤维蛋白原，纤维素，淀粉，胶原蛋白和透明质酸，弹性蛋白和透明质酸，聚氨酯，有机硅，聚酯，聚烯烃，聚异丁烯和乙烯-α-烯烃共聚物，丙烯酸聚合物和共聚物以外的聚丙烯酸酯，乙烯基卤化物聚合物和共聚物，聚氯乙烯，聚乙烯醚，聚乙烯基甲基醚，聚偏二卤乙烯，聚偏二氯乙烯，聚（偏二膦酸），聚（偏二氟乙烯-共-六氟丙烯），聚丙烯腈，聚乙烯醇缩酮，聚乙烯基芳族化合物，聚苯乙烯，聚乙烯基酯，聚乙酸乙烯酯，苯乙烯-丙烯腈共聚物，ABS树脂，聚酰胺，尼龙66，聚己内酰胺，聚碳酸酯--包括基于酪氨酸的聚碳酸酯，聚甲醛，聚酰亚胺，聚醚，聚氨酯，人造丝，人造丝-三乙酸酯，纤维素，乙酸纤维素，丁酸纤维素，乙酸丁酸纤维素，玻璃纸，硝酸纤维素，丙酸纤维素，纤维素醚，羧甲基纤维素富勒烯，脂质，载脂蛋白A1，载脂蛋白A2，其他载脂蛋白或其组合。
8.权利要求1-7中任一组合物，其中所述纳米颗粒包含:
一种或多种分子，选自选自明胶，白蛋白，右旋糖，葡聚糖，一种高分子量的聚（乙二醇）或高分子量的聚（乙烯基吡咯烷酮），透明质酸，肝素，硫酸肝素，唾液酸，壳聚糖，以及其中一种组合;
一种或多种分子，选自PLGA，聚（D，L-乳酸交酯-共-甘醇酸交酯），聚（D，L-乳酸交酯），聚（D，L-乳酸交酯-共-乳乳酸交酯），聚（L-乳酸交酯），聚（甘醇酸交酯），聚（L-乳酸交酯-共-甘醇酸交酯），聚（己内酯），聚（甘醇酸交酯-共-三亚甲基碳酸酯），聚（3-羟基丁酸酯），聚（3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯），聚（4-羟基丁），聚（酯酰胺），聚（酯-磺基酯酰胺），聚（原酸酯）或聚（酸酐），以及其中一种组合;或者其中所述纳米颗粒为脂质体，包含磷脂，胆固醇，鞘脂，神经酰胺，植物固醇，胆固醇或半抗原共轭脂质。
9.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒进一步包含：一种额外的靶向配体，所述靶向配体被封包于所述纳米颗粒之内，附着在所述纳米颗粒的表面上，或整合到所述纳米颗粒的结构中，其中所述一种靶向配体也靶向导向动脉粥样硬化病灶部位。
10.权利要求8的组合物，其中每一个所述纳米颗粒同时包含所述一种或多种氧化磷脂和所述额外靶向配体，其中所述额外的靶向配体是一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段识别一种位于或接近动脉粥样硬化病变部位的蛋白质，其中所述抗体或抗体片段下述分子具反应性，所述分子选自氧化LDL，清道夫受体A（第一个被表征和克隆的OxLDL受体），CD36，CD68，类凝集素氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1），SR-A1，SR-B1，和其中的一种组合。
11.权利要求1的组合物，进一步包含一种或多中生物活性剂，所述生物活性剂被封包于所述纳米颗粒之内，附着在所述纳米颗粒的表面上，或整合到所述纳米颗粒的结构中，其中所述一种或多种生物活性剂被被靶向导向一动脉粥样硬化病灶部位或其附近。
12.权利要求11的组合物，其中所述一种或多种生物活性剂包含：一种第一生物活性剂，所述第一生物活性剂为动脉粥样硬化病变部位的存在提供了一种标识。
13.权利要求11或12的组合物，其中所述一种或多种生物活性剂进一步包含：一种第二生物活性剂，所述第二生物活性剂对所述动脉粥样硬化病变部位的显示一种医疗效果。
14.权利要求12或13的组合物，其中所述标识为在第一生物活性剂结合到或接近动脉粥样硬化病变部位时发射的一种荧光信号。
15.一种制备权利要求1-14中任一组物的方法，所述组合物的纳米颗粒经过一种相转化步骤合成。
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