WO2001082977A1 - Liposomes contenant un compose iodo hydrophobe - Google Patents

Liposomes contenant un compose iodo hydrophobe Download PDF

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ribosome
vascular smooth
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Kazuhiro Aikawa
Hiroshi Kitaguchi
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Fuji Photo Film Co., Ltd.
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    • A61K49/0466—Liposomes, lipoprotein vesicles, e.g. HDL or LDL lipoproteins, phospholipidic or polymeric micelles

Definitions

  • the present invention relates to ribosomes, and more specifically, to ribosomes that can be used in a method of selectively accumulating a hydrophobic oxidized compound at a diseased site and contrasting the non-disease site with an image.
  • Background technology ''
  • Diagnosis methods for arteriosclerosis are broadly classified into non-invasive methods and invasive methods in which a catheter or the like is inserted into an artery.
  • the main non-invasive methods are X-ray angiography and ultrasound, but early stage arteriosclerosis, especially stenosis of the coronary arteries that causes myocardial infarction and angina at an early stage. Is almost impossible to detect.
  • Other non-invasive methods, such as CT and MRI may also be used, but these methods were developed primarily for tumor detection and not only have problems with the resolution of atherosclerotic lesions, The number of hospitals that can be implemented is limited due to the need for expensive and large-scale equipment, and they are not generally used.
  • a method using a radioisotope is also being studied, but it has not gone out of the experiment.
  • X-ray angiography is the most widely used to identify arterial stenosis.
  • a blood flow is contrasted by administering a water-soluble contrast medium, and a portion where the flow is blocked is found.
  • this method usually only detects lesions with stenosis of 50% or more, and it is difficult to detect lesions before the onset of ischemic disease attacks.
  • J. Pharm. Sci. 72 (8), 898 (1983) discloses an example of X-ray imaging of the liver and spleen by injection of an oil droplet dispersion of Cholesteryl Iopanoate.
  • US Patent No. 4567034 reports a method of encapsulating an ester of dia rizoic acid in ribosomes and selectively imaging liver and spleen.
  • International Publications W096 / 28414 and W096 / 00089 disclose contrast agents for imaging the vascular pool / lymphatic system. However, these preparation methods are not efficient or selective for the purpose of selectively imaging vascular disease, and are not suitable for X-ray irradiation. There have been no reports of imaging vascular disease.
  • An object of the present invention is to provide a means for selectively accumulating an eodo compound at a vascular disease site caused by abnormal proliferation of vascular smooth muscle such as arteriosclerosis and restenosis after PTCA. It is another object of the present invention to image the in-vivo environment such as a vascular disease by X-ray contrast by using the means.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, it has been found that ribosomes containing a hydrophobic odo compound as one of the membrane components include vascular smooth muscle and foam which are the main components of atherosclerotic lesion Was found to accumulate in macrophages.
  • Another object of the present invention is to provide a cell culture system that reproduces the state of a lesion such as arteriosclerosis and restenosis, and a method for producing the same. It is also an object of the present invention to provide a method for evaluating a drug for arterial disease by using this means.
  • the present inventors have conducted studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, by simultaneously culturing two or more types of cells that form a lesion in a mammal in the same cell incubator, an arteriosclerotic lesion or restenosis has been obtained. It has been found that it is possible to provide a cell culture system that reproduces the state of a lesion such as the above.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention provides a ribosome containing a hydrophobic odo compound as a membrane component.
  • a hydrophobic ode compound a ribosome which is a 1,3,5-triodobenzen derivative having at least one substituent having 18 or more carbon atoms, the ribosome; phosphatidylcholine and phosphatidylserine
  • the ribosome containing a selected lipid as a membrane component; the ribosome containing a dialkyl phosphate, which is an alkyl diester having 6 or more carbon atoms, as a membrane component; and a cholesterol derivative having a substituent having 18 or more carbon atoms.
  • an X-ray contrast agent containing the ribosome is provided.
  • the above-mentioned X-ray for use in imaging vascular disease preferably vascular smooth muscle cells abnormally proliferating under the influence of foamed macrophages, such as atherosclerotic lesions and restenosis after PTCA
  • a contrast agent is provided.
  • the present invention provides a method for imaging a vascular disease, the method including a step of X-ray imaging using the ribosome, and the use of the ribosome for producing the X-ray contrast agent.
  • the present invention provides a method for creating a culture system including a step of simultaneously culturing two or more cell types involved in the formation of a lesion of a mammalian disease in the same cell incubator.
  • the above-mentioned method wherein the cell type is a primary cultured cell isolated from a living body or an established passage cell; the above-mentioned method, wherein the cell type is a primary cultured cell of a mammalian animal;
  • a method as described above wherein the mammalian disease is a human disease is provided.
  • the above method wherein at least one of the cell types is a cell involved in atherosclerotic lesion formation; the cell type is selected from the group consisting of macrophages, vascular smooth muscle cells, and vascular endothelial cysts
  • the above-mentioned method selected; the above-mentioned method comprising the step of culturing two cell types in the same cell incubator with a cell filter therebetween; and the above-mentioned method wherein the two cell types are macrophages and vascular smooth muscle cells.
  • a method in which two types of primary cultured mammalian cells to be provided are cultured in the same incubator while being separated by a cell filter, and a culture system that reproduces the state of an atherosclerotic lesion is provided.
  • the present invention provides a cell culture system obtainable by the above-described method for producing a culture system.
  • the present invention also provides a method for screening a drug using a cell culture system obtainable by the above-described method for preparing a culture system.
  • the method comprises the step of measuring the effect of a drug on vascular smooth muscle cells grown by culturing foamed macrophages and vascular smooth muscle cells through a cell filter.
  • a method for determining the efficacy of a drug and a step of measuring the effect of the drug on vascular smooth muscle cells grown by culturing foamed macrophages and vascular smooth muscle cells through a cell filter.
  • the present invention provides a method for evaluating the transferability of a drug to a vascular disease lesion.
  • FIG. 1 shows the results of induction of mouse vascular smooth muscle cell proliferation in the presence of mouse foamed macrophages. ' ⁇
  • FIG. 2 shows a growth curve of mouse vascular smooth muscle cells when mouse foamed macrophages were not added.
  • FIG. 3 shows the results of induction of proliferation of rat vascular smooth muscle cells in the presence of rat foamed macrophages.
  • FIG. 4 shows the results of induction of the proliferation of egos vascular smooth muscle cells in the presence of egos foamed macrophages.
  • FIG. 5 shows ribosome uptake by mouse vascular smooth muscle cells.
  • (1) shows the results obtained by adding a ribosome preparation 3 days later and culturing for 1 day in the culture system without mouse foamed macrophages shown in Fig. 2;
  • the results obtained by adding the ribosome preparation after 5 days and culturing for 1 day are shown;
  • 3 shows the culture system adding the mouse foamed macrophage shown in Fig. 1 and culturing for 1 day after adding the ribosome preparation after 7 days.
  • the results are shown below.
  • FIG. 6 shows the results when an oil droplet suspension was used in place of the ribosome of the present invention.
  • FIG. 7 shows the uptake of liposomes by rat vascular smooth muscle cells cultured under the culture conditions of FIG. (1), (2) and (3) are the same as in Fig. 5.
  • FIG. 8 shows the uptake of liposomes by the egret vascular smooth muscle cells cultured under the culture conditions of FIG. (1), (2) and (3) are the same as in Fig. 5.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of radiographic imaging of atherosclerotic lesions using the liposome of the present invention.
  • “before administration” indicates the results before ribosome administration
  • “immediately after administration” indicates the results immediately after ribosome administration.
  • FIG. 10 is a photograph showing the result of imaging an arteriosclerotic lesion by X-ray photography using the ribosome of the present invention.
  • “15 minutes after administration” indicates the results 15 minutes after ribosome administration
  • “30 minutes after administration” indicates the results 30 minutes after ribosome administration.
  • the type of the hydrophobic chloride compound is not particularly limited.
  • a chloride benzene derivative is preferable, and is a 1,3,5-triodebenzene derivative having at least one substituent having 18 or more carbon atoms. Is more preferable.
  • the substituent having 18 or more carbon atoms is a hydrophobic group that enables the 1,3,5-triodobenzene residue, which is a part of the pseudo-imaging, to be stably present in the lipid bilayer of the liposome.
  • the number of carbon atoms is 20 or more and the total number of oxygen atoms and nitrogen atoms is 10 or less.
  • the hydrophobic substituent has a structure similar to that of a constituent component of a biological membrane lipid.
  • Preferred examples of hydrophobic odor compounds satisfying these conditions include, for example, J. Med. Chem. 25 (12), 1500 (1982); Steroids 49 (6), 531 (1987); Pharm. Res. 6 (12 ), 1011 (1989); International Publication TO95 / 19186; and 1,3,5-triiodobenzene derivatives having a residue of a cholesterol derivative disclosed in WO096 / 28414 and the like as a substituent.
  • cholesterol derivative those disclosed in the above publications are preferable, Particularly preferred is cholesterol.
  • a hydrophobic odo compound for example 1,3,5-triodobenzene.
  • 1,3,5-triodebenzene for example, an ester bond, an ether bond, a urethane bond, a carbonate bond, or the like may be used. Yes, but ester bonds are preferred.
  • Cholesterol and a hydrophobic chloride compound may be directly bonded via the above bond, or may be bonded via an appropriate linking group. Les ,.
  • suitable linking groups include linear or branched alkylene groups having 5 or less carbon atoms.
  • the hydrophobic chloride compound preferably 1,3,5-triodebenzene compound, may have one or more substituents in addition to the above-mentioned substituent having 18 carbon atoms. ,.
  • the type and position of the substituent are not particularly limited. Is preferred. Preferred substituents are a substituted or unsubstituted amino group or a substituted or unsubstituted acylamino group.
  • Examples of the case where the amino group has a substituent include a monoalkylamino group and a dialkylamino group. Examples of the case where the amino group has a substituent include a trifluoroacetylamino group and a p-chloroamino group. And an azoylamino group.
  • hydrophobic odor compound Preferred examples of the hydrophobic odor compound are shown below, but the ribosome of the present invention is not limited to those containing these.
  • Hydrophobic Yodo compounds contained as a membrane component of the ribosome, 1 0-9 about 0% by weight relative to the total weight of the membrane components, preferably preferably 1 0 to 8 0 wt 0/0, and et al 20 to 80% by mass.
  • the hydrophobic chloride compound is a component of the membrane. One type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • any lipid compound commonly used in the production of liposomes can be used.
  • Biochim. Biophys. Acta 150 (4), 44 (1982) Adv. In Lipid. Res. 16 (1) 1 (1978), "RESEARCH IN LIPOSOMES” (P. Machy, L. Leserman, John Libbey EUROTEXT), "Liposom” (Nojima, Sunamoto, Inoue, Nankodo), etc.
  • Phospholipids are preferred as lipid compounds, and phosphatidylcholine (PC) is particularly preferred.
  • Preferred examples of phosphatidylcholines include, but are not limited to, eggPC, dimyristril PC (DMPC), dipalmitoyl PC (DPPC), distearoyl PC (DSPC), and dioleyl PC (D0PC). .
  • DMPC dimyristril PC
  • DPPC dipalmitoyl PC
  • DSPC distearoyl PC
  • D0PC dioleyl PC
  • phosphatidylcholine and phosphatidylserine can be used in combination as ribosome membrane components.
  • the phosphatidylserine include compounds having a lipid moiety similar to the phospholipids mentioned as preferred examples of the phosphatidylcholine.
  • a ribosome containing phosphatidylcholine and phosphatidylserine, and further containing a dialkyl phosphate is mentioned as a membrane component.
  • the two alkyl groups constituting the dialkyl ester of the dialkyl phosphate are preferably the same, and each alkyl group has 6 or more carbon atoms, preferably 10 or more, and more preferably 12 or more.
  • Ma Examples of preferred dialkyl phosphates include, but are not limited to, dilauryl phosphate, dimyristyl phosphate, dicetyl phosphate, and the like.
  • the preferred use amount of the dialkyl phosphate is 1 to 50% by mass relative to the total mass of phosphatidylcholine and phosphatidylserine. / 0 , preferably 1 to 30% by mass. Preferably from 1 to 20 mass. / 0 .
  • the preferable mass ratio of the above components is PC: PS: dialkyl phosphate: hydrophobic odo compound: 5 to 4 0% by mass: 5 to 40% by mass: 1 to 10% by mass: can be selected from 15 to 80% by mass.
  • the components of the ribosome of the present invention are not limited to the above four, and other components can be added.
  • examples thereof include cholesterol, cholesterol monoester, sphingomyelin, FEBS Lett. 223, 42 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 6949 (1988) and the like. Derivatives, Chem. Lett., 2145 (1989); Glucuronic acid derivatives described in Biochim. Biophys. Acta, 1148, 77 (1992), etc., Biochim. Biophys. Acta, 1029, 91 (1990); FEBS Lett., 268, 235 (1990), etc., but not limited thereto.
  • the ribosomes of the present invention can be made by any method known in the art.
  • preparation method include, in addition to the above-mentioned review documents on liposomes, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980), "Liopsomes” (edited by MJ Ostro, MARCELL DEKKER, INC.), Etc. It is described in. Specific examples include an ultrasonic treatment method, an ethanol injection method, a french press method, an ether injection method, a cholic acid method, a calcium fusion method, a freeze-thaw method, a reverse phase evaporation method, and the like. Absent.
  • the size of the liposome of the present invention may be the size or deviation of the size that can be produced by the above method, but usually the average is 400 nm or less, preferably 200 nm or less.
  • the structure of the liposome is not particularly limited, and may be, for example, either lamella or multilamella. It is also possible to mix one or more appropriate drugs or other contrast agents inside the liposome.
  • the ribosome of the present invention when used as a contrast agent, it can be preferably administered parenterally, more preferably intravenously.
  • injection Preparations in the form of lyophilized solutions or infusions are provided as a powdered composition in lyophilized form, which can be dissolved or reconstituted in water or other suitable medium (eg, saline, dextrose infusion, buffer, etc.) before use. It can be used in suspension.
  • the dose can be appropriately determined so that the eode content of the ribosome is almost the same as the eode content of the conventional aqueous aquatic contrast agent.
  • vascular smooth muscle cells that form the lining of the blood vessels cause abnormal proliferation and It is known to migrate and narrow blood channels.
  • the trigger for normal vascular smooth muscle cells to initiate abnormal proliferation has not been fully elucidated, but it is known that migration and foaming of macrophages to the intima are important factors, It has been reported that smooth cells undergo phenotype conversion (contracted to synthetic).
  • the contrast agent of the present invention can be suitably used particularly for X-ray imaging of vascular diseases, and for example, can perform imaging of arteriosclerotic lesions and restenosis after PTCA.
  • the imaging method is not particularly limited. Examples include, but are not limited to, a method by X-ray irradiation, or a nuclear medicine method using an eodo radiolabel.
  • the method for preparing a culture system is characterized by including a step of culturing two or more cell types involved in the formation of a lesion of a mammalian disease in the same cell incubator.
  • the cell type is preferably a primary cell culture or a subcultured cell line of the strain I, and a primary culture of mammalian cells is particularly preferred.
  • Preferred mammals include, but are not limited to, humans, dogs, cats, pigs, minipigs, egrets, hamsters, rats, mice, and the like.
  • the type of the cell incubator is not particularly limited, but, for example, a culture flask, a culture test tube, a petri dish, a microplate, and the like can be suitably used.
  • the two or more different cell types to be cultured in the same incubator may be either of the same animal-derived or different animal-derived cell types, but are preferably of the same type.
  • the term "participating in the formation of a lesion" must be interpreted in the broadest sense, including the case where a plurality of cells form a lesion while regulating the growth of each other, and is limited in any sense. Should not be interpreted.
  • the different cell types it is preferable to select different cells from the viewpoint of cell biology or cell taxonomy, but two types that coexist in a lesion and form a lesion while regulating the growth of each other are used. More preferably, the cells are selected. For example, it is preferable to select macrophages and vascular smooth muscle cells coexisting in atherosclerotic lesions as two cell types.
  • two cell types can be cultured in the same well while being separated by a cell filter.
  • the two cell types used are preferably cells forming an arteriosclerotic lesion.
  • Preferred cell types include macrophages, vascular smooth muscle cells, vascular endothelial cells, T cells, mast cells and the like.
  • macrophages, vascular smooth muscle cells, and vascular endothelial cells are foamed in advance.
  • the present invention provides a method for measuring the action of a drug on vascular smooth muscle cells grown by culturing foamed macrophages and vascular smooth muscle cells through a cell filter. It provides a method for assessing portability.
  • drug action as used herein should be interpreted in the broadest sense, including therapeutic or diagnostic effects.
  • the type of cell filter is not particularly limited as long as it has a pore size that does not allow foamed macrophages and vascular smooth muscle cells to pass through.
  • a cell filter having a pore size of 0.4 ⁇ or less can be used as a pore size that does not allow cells to pass through, but a foamed macrophage can be used depending on the type of cells used. Can be easily selected.
  • foamed macrophage-derived proliferative active substances can be converted into vascular smooth muscle cells. It acts on cells to induce proliferation and can reproduce in vitro the abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells in vascular diseases such as arteriosclerosis and restenosis after PTCA.
  • vascular diseases such as arteriosclerosis and restenosis after PTCA.
  • Example 1 Creation of a vascular smooth muscle culture system that activates proliferation by foamed macrophages (1) Isolate vascular smooth muscle cells from mouse aortic endothelium (Tissue Culture Method Revised Large 10th Edition, Kodansha, 1998, Japan Edited by the Society of Tissue Culture). The separated vascular smooth muscle cells were suspended in 10% FBS single MEM medium (GIBC0, No. 11095-080) and seeded on a 12-well microplate (FALCON, No. 3503). At this time, the number of cells in each well was adjusted to 10,000 cells. The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 days.
  • FBS single MEM medium GIBC0, No. 11095-080
  • FIG. 1 shows the number of vascular smooth muscle cells in the above experiment. The growth at the beginning of the culture was slow, but after 3 days after addition of foamed macrophage, the cells showed a vigorous growth through an induction period of about 1 day.
  • FIG. 2 shows the growth curve of vascular smooth muscle cells when macrophages were not added. Comparison with Fig. 1 Example 2: Confirmation of scavenger receptor expression on vascular smooth muscle
  • vascular smooth muscle cells in atherosclerotic lesions take up oxidized LDL by expressing a scavenger receptor on the surface (Biochem. Pharmacol. 1999, 15; 57 (4) 383-6: Exp. Mol. Pathol. 1997 64 (3) 127-45).
  • Immunostaining was performed on the vascular smooth muscle cells in the culture system shown in Fig. 1 using a mouse scavenger receptor antibody. As a result, no expression was observed in the vascular smooth muscle cells on day 3 after seeding. On the sixth day after sowing, clear staining was confirmed. In addition, the immunostaining of the foamed macrophages on the cell filter was carried out in the same manner, and clear staining was also observed.
  • Example 3 Uptake of acid LDL by vascular smooth muscle cells
  • vascular smooth muscle cells cultured by the cell culture system of the present invention have properties similar to those of focal smooth muscle cells such as arteriosclerosis or restenosis.
  • Example 4 Creation of a vascular smooth muscle culture system that activates proliferation by foamed macrophages (2)
  • rat and egret macrophages and vascular smooth muscle A culture system consisting of cells was prepared.
  • Fig. 3 and Fig. 4 show the number of vascular smooth muscle cells. In each case, the same results as in the mouse of FIG. 1 were obtained.
  • the vascular smooth muscle cells cultured in the culture system shown in Fig. 1 have healthy vascular properties up to 3 days after seeding, and have the properties of smooth muscle cells in atherosclerotic lesions from 7 days after seeding. Therefore, by comparing the effects on both, it is possible to perform selective drug screening for the lesion. In particular, it can be used for searching for a drug delivery system that is selective for a lesion, for searching for a drug that exhibits selective toxicity for a lesion cell, and for developing a drug that selectively arrests the cell cycle of a lesion cell. Specific examples are shown below, but the present invention is not limited to these.
  • Example 5 Ribosome preparation
  • egg PC Fertoshi, No. 1 2 01- 41- 0 2 14
  • egg PS Fna stiffness Co., No. 1201-42-02266
  • DCP dicetyl phosphate
  • the hydrophobic chloride compounds (3) synthesized by the method described in Funakoshi Co., No. 1354- 14-8165) and J. Med. Chem., 25 (12), 1500 (1982) are each placed in an eggplant-shaped flask. After dissolving in methylene chloride to obtain a homogeneous solution, the solvent was distilled off under reduced pressure to form a thin film on the bottom of the flask. After drying the thin film in a vacuum, 1.5 ml of 0.9% physiological saline (No.
  • Ribosome PC PS DCP compound (3) Formulation 1 50 nmol 50 nmol 10 nmol 40 nmol Formulation 2 50 nmol 50 nmol 10 nmol 75 nmol Formulation 3 50 nmol 50 nmol 10 nmol 150 nmol
  • Example 6 Selective uptake of ribosome preparations by vascular smooth muscle cells (1)
  • Example 5 The three types of ribosomes prepared in Example 5 were added to the smooth muscle cell culture system shown in FIG. 1 or 2 of Example 1 at the following times (2), (3), or (3), and the culture was continued.
  • Example 9 In the vascular smooth muscle culture system using rat (Fig. 3) and) heron (Fig. 4) cells created in Example 4, the three types of ribosomes prepared in Example 5 were subjected to the timing of (1), (2), or (3) above. And culture was continued. The amount of compound (3) taken up into the cells was quantified by HPLC. The results are shown in FIGS. 7 and 8, and in all cases, the same results as in FIG. 5 for the mouse cells were obtained.
  • Example 9 Example 9
  • the ribosome of the present invention can accumulate an eodo compound on vascular smooth muscle cells that abnormally grow under the influence of foamed macrophages, and selectively image a lesion of a vascular disease caused by abnormal growth of vascular smooth muscle.
  • Angled as an X-ray contrast agent for Further, the culture system provided by the method for producing a culture system of the present invention can be used for in vitro screening of pharmaceuticals and the like as a cell culture system that reproduces the state of a lesion such as an atherosclerotic lesion or restenosis.

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Description

明細書 疎水性ョ一ド化合物を含むリボソーム 技術分野
本発明はリボソームに関するものであり、 より具体的には、 疎水性ョード化合 物を疾患部位に選択的に集積させ、 非疾患部位とコントラストをつけて造影する 方法に利用可能なリボソームに関するものである。 背景技術 '
現代社会、 特に先進国社会においては、 高カロリー ·高脂肪の食事を取る機会 が増大している。 そのために、 動脈硬化症が原因となる虚血性疾患 （心筋梗塞， 狭心症等の心疾患、脳梗塞 ·脳出血等の脳血管疾患）の死亡者数が増加しており、 この症状を初期の段階で診断し適切な治療を行うことが求められている。し力 し、 上記疾患が発症する以前に動脈硬化の進行を初期の段階で診断する満足できる方 法は存在しない。
動脈硬化症の診断方法としては、 非侵襲的な方法と、 動脈にカテーテル等を挿 入する侵襲的な方法に大別される。 このうち非侵襲的方法の主なものは X線血管 造影と超音波であるが、 初期の動脈硬化、 特に心筋梗塞や狭心症の原因となる冠 状動脈の狭窄を初期の段階で発症前に検出することはほとんど不可能である。 非侵襲的な方法としては他に CT、 MRIなども用いられることがあるが、 これら は主として腫瘍の発見のために開発された方法であり、 動脈硬化病巣の解像度に 問題があるばかりでなく、 高値で大かがりな装置を必要とするため、 実施できる 病院数も限られ一般には利用されていない。 またラジオァイソトープを用いる方 法も検討されているが、 実験の枠を出ていない。
一方侵襲的な方法としては、 血管内エコー、 血管内視鏡等が用いられている。 これらの方法によると動脈硬化の病巣を 0. 1 mmの厚さまで測定することが可能と 言われている。 しかし、 これらの方法は、 カテーテルの先に装着した超音波発振 器、 内視鏡を動脈内に挿入する必要がある。 これは患者に大きな肉体的精神的な 負担を強いると共に、 危険も伴う。 従って、 心筋梗塞等の発作をおこした患者の 治療や二次予防のために実施されてはいるものの、 発症以前の人に動脈硬化の有 無もしくは進行を診断する目的には使用できない。.
これらのうち、 動脈の狭窄部位の特定に最も広く用いられているのは X線血管 造影である。 これは、 水溶性のョード造影剤を投与することにより血液の流れを 造影し、 その流れが滞っている箇所をみつける方法である。 しカゝし、 この方法で は、 通常狭窄が 5 0 %以上進んだ病巣しか検出することができず、 虚血性疾患の 発作が発症する前に病巣を検出することは困難である。
これとは別に、 疎水性ョ一ド造影剤もしくは親水性造影剤を製剤化し、 目的と する疾患部位に選択的に集積させる試みが報告されている（国際公開 W095/19186、 同 W095/21631、 同 W089/00812、 英国特許第 867650号、 国際公開 W096/00089、 同 W094/19025, 同 W096/40615, 同 W095/2295、 同 8/41239、 同 W098/23297, 同 TO99/02193、同 TO97/06132、米国特許第 4192859号明細書、同 4567034号明細書、 同 4925649号明細書、 Pharm. Res.， 16 (3)， 420 (1999) , J. Pharm. Sci. , 72 (8)， 898 (1983) , Invest. Radiol. , 18 (3)， 275 (1983) )。 例えば Pharm. Res. , 16 (3)， 420 (1999)には、疎水性化合物である Cholesteryl Iopanoateの油滴分散液を注 射することにより、 該ョード化合物が実験動物の動脈硬化部位に集積することが 開示されている。
また、 J. Pharm. Sci. 72 (8) , 898 (1983)には、 Cholesteryl Iopanoateの油 滴分散液を注射することによる肝臓や脾臓の X線造影の例が開示されている。 米 国特許第 4567034号明細書には、 dia rizoic acid のエステル体をリボソームに 封入し、 肝臓や脾臓の選択的造影を行う方法が報告されている。 国際公開 W096/28414、同 W096/00089には血管プールゃリンパ系をイメージ化するための造 影剤が開示されている。 しかしながら、 これらの製剤方法は、 血管疾患を選択的 に造影する目的のためには、 効率および選択性ともに十分でなく、 X線照射によ り血管疾患を画像化した例も報告されていない。
一方、 近年動脈疾患の発症機構について遺伝子、 タンパク質、 細胞の各レベル で解明が進んできた (J. Biol. Chem. 1996， 271 (44) 27346-52； Nature 386 (6662) 292-6)。動脈硬化に関して言えば、複数の細胞が互いの増殖を調節しながら病巣 を形成することが明らかにされてきた （Arterioscler. Throm. Vase. Biol. 1999 (3) 461-71； Lab Invest 1998 78 (4) 423-34) 。 こうした複数の細胞が関与する 病巣の状態を細胞培養器内で再現した例はなく、 動脈硬化や再狭窄の薬剤の評価 はこれまで主としてモデル動物を通して行われてきた。
し力 し、 こうした動物を用いる方法はいずれも時間、 コストがかかり、 さらに 動物愛護の観点からも必要最小限にすることが求められている。 従って、 多数の 化合物を短時間でスクリーニングするために、 動脈硬化病巣の状態を再現した in vitro評価法が待ち望まれていた。
発明の開示
本発明の課題は、動脈硬化や PTCA後の再狭窄等の血管平滑筋の異常増殖に起因 する血管疾患部位に対して選択的にョード化合物を集積させるための手段を提供 することにある。 その手段を用いることにより、 血管疾患などの生体内環境を X 線造影により画像化することも本発明の別の課題である。 本発明者らは上記の課 題を解決すべく鋭意研究を行った結果、 疎水性ョード化合物を膜構成成分の一つ として含むリボソームが、 動脈硬化巣の主構成成分である血管平滑筋及び泡沫化 マクロファージに集積することを見出した。 また、 本発明の別の課題は、 動脈硬化や再狭窄等の病巣の状態を再現した細胞 培養系及ぴその作成方法を提供することである。 この手段を用いることにより、 動脈疾患に対する薬剤の評価法を提供することも本発明の課題である。 本発明者 らは上記の課題を解決すぺく研究を行った結果、 同一細胞培養器内で哺乳類動物 の病巣を形成する 2種類以上の細胞種を同時に培養することにより、 動脈硬化巣 や再狭窄などの病巣の状態を再現した細胞培養系を提供できることを見出した。 本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、 本発明は、 疎水性ョード化合物を膜構成成分として含むリボソーム を提供するものである。 この発明の好ましい態様によれば、 疎水性ョード化合物 、 炭素数 1 8以上の置換基を少なくとも 1個有する 1， 3， 5 _トリョードベ ンゼン誘導体である上記リボソーム；ホスファチジルコリン及ぴホスファチジル セリンからなる群から選ばれる脂質を膜構成成分として含む上記リボソーム；炭 素数 6以上のアルキルのジエステルであるリン酸ジアルキルエステルを膜構成成 分として含む上記リボソーム；及ぴ炭素数 1 8以上の置換基がコレステロール誘 導体の残基である上記リボソームが提供される。
別の観点からは、 上記リボソームを含む X線造影剤が提供される。 この発明の 好ましい態様によれば、 血管疾患の造影、 好ましくは泡沫化マクロファージの影 響で異常増殖した血管平滑筋細胞、例えば動脈硬化巣や PTCA後の再狭窄の造影に 用いるための上記 X線造影剤が提供される。また、血管疾患の造影方法であって、 上記リボソームを用いて X線造影する工程を含む方法、 及び上記 X線造影剤の製 造のための上記リボソームの使用が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、 本発明により、 同一細胞培養器内で哺乳類動物疾患の 病巣形成に関与する 2種類以上の細胞種を同時に培養する工程を含む培養系の作 成方法が提供される。 この発明の好ましい態様によれば、 細胞種が生体から分離 した初代培養細胞又は株化された継代細胞である上記の方法；細胞種が哺乳類動 物の初代培養細胞である上記の方法；及び哺乳類動物疾患がヒトの疾患である上 記の方法が提供される。
上記発明のさらに好ましい態様によれば、 細胞種の少なくとも 1つが動脈硬化 病巣形成に関与する細胞である上記の方法；細胞種がマクロファージ、 血管平滑 筋細胞、 及ぴ血管内皮钾胞からなる群から選ばれる上記の方法； 2種類の細胞種 を同一細胞培養器内でセル · フィルターを隔てて培養する工程を含む上記の方 法；及び 2種類の細胞種がマクロファージ及び血管平滑筋細胞である上記の方法 が提供される。 この発明の特に好ましい態様によれば、 動脈硬化病巣の形成に関 与する哺乳類初代培養細胞 2種類をセル ·フィルターで隔てながら同一培養器内 で培養し、 動脈硬化病巣の状態を再現した培養系を作成する方法が提供される。 さらに、 本発明により、 上記の培養系の作成方法により得ることができる細胞 培養系が提供される。 また、 上記の培養系の作成方法により得ることができる細 胞培養系を用いて薬剤をスクリーニングする方法も本発明により提供される。 好 ましい態様として、 泡沫化させたマクロファージ及ぴ血管平滑筋細胞をセル ·フ ィルターを隔てて培養することにより増殖させた血管平滑筋細胞に対する薬剤の 作用を測定する工程を含む、 血管疾患に対する薬剤の有効性の判定方法；及ぴ泡 沫化させたマクロファージ及ぴ血管平滑筋細胞をセル · フィルターを隔てて培養 することにより増殖させた血管平滑筋細胞に対する薬剤の作用を測定する工程を 含む、 薬剤の血管疾患病巣への移行性の評価方法が本発明により提供される。 図面の簡単な説明 ，
第 1図は、 マウス泡沫化マクロファージの存在下でマウス血管平滑筋細胞の増 殖が誘導される結果を示す。 ' ·
第 2図は、 マウス泡沫化マクロファージを加えなレ、場合のマゥス血管平滑筋細 胞の増殖曲線を示す。
第 3図は、 ラット泡沫化マクロファージの存在下でラット血管平滑筋細胞の増 殖が誘導される結果を示す。
第 4図は、 ゥサギ泡沫化マクロファージの存在下でゥサギ血管平滑筋細胞の増 殖が誘導される結果を示す。
第 5図は、 マウス血管平滑筋細胞によるリボソームの取り込みを示す。 ①は第 2図に示されるマウス泡沫化マクロファージを加えない培養系において、 3日後 にリボソーム製剤を加えて 1日間培養した結果を示し；②は第 1図に示されるマ ウス泡沫化マクロファージを加える培養系において、 5日後にリボソーム製剤を 加えて 1日間培養した結果を示し；③は第 1図に示されるマウス泡沫化マクロフ ァージを加える培養系において、 7日後にリボソーム製剤を加えて 1日間培養し た結果を示す。
第 6図は、本発明のリボソームに替えて油滴懸濁剤を用いた場合の結果を示す。 第 7図は、 第 3図の培養条件培養されたラット血管平滑筋細胞によるリポソ一 ムの取り込みを示す。 ①、 ②、 ③は第 5図と同義である。
第 8図は、 第 4図の培養条件培養されたゥサギ血管平滑筋細胞によるリポソ一 ムの取り込みを示す。 ①、 ②、 ③は第 5図と同義である。
第 9図は、 本発明のリポソームを用いて動脈硬化巣を X線撮影により造影した 結果を示す写真である。図中、 「投与前」はリボソーム投与前の結果を示し、 「投 与直後」 はリボソームの投与直 の結果を示す。
第 1 0図は、 本発明のリボソームを用いて動脈硬化巣を X線撮影により造影し た結果を示す写真である。 図中、 「投与 1 5分後」 はリボソーム投与 1 5分後の 結果を示し、 「投与 3 0分後」 はリボソーム投与 3 0分後の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
疎水性ョ一ド化合物の種類は特に限定されないが、 例えばョ一ドべンゼン誘導 体が好ましく、 炭素数 1 8以上の置換基を少なくとも一個有する 1， 3， 5—ト リョードベンゼン誘導体であることがより好ましい。 炭素数 1 8以上の置換基と しては、 ョード造影部位である 1 , 3， 5—トリョードベンゼン残基をリポソ一 ムの脂質二重層に安定に存在させるための疎水性基であることが好ましく、 例え ば、 炭素数が 2 0以上で、 酸素原子数と窒素原子数の合計が 1 0以下であるもの がより好ましい。 該疎水性置換基は生体膜脂質構成成分と類似構造であることが さらに好ましい。 こうした条件を満たす疎水性ョード化合物の好ましい例として は、 例えば、 J. Med. Chem. 25 (12) , 1500 (1982) ; Steroids 49 (6) , 531 (1987) ; Pharm. Res. 6 (12) , 1011 (1989)； 国際公開 TO95/19186 ; 同 W096/28414等に開 示されているコレステロール誘導体の残基を置換基として有する 1 , 3 , 5—ト リヨ一ドベンゼン誘導体が挙げられる。
コレステロール誘導体としては、上記の刊行物に開示されたものが好ましいが、 特に好ましいのはコレステロールである。 コレステロールが 3位水酸基を介して 疎水性ョード化合物、 例えば 1 , 3 , 5—トリョードベンゼンと連結した化合物 が好ましい。 コレステロールの水酸基と疎水性ョード化合物、 例えば 1 , 3， 5 一トリョードベンゼンとを結合する方法としては、 例えば、 エステル結合、 エー テル結合、 ウレタン結合、 炭酸エステル結合等の手段を用いることができるが、 エステル結合が好ましい。コレステロールと疎水性ョ一ド化合物、例えば 1 , 3 , 5—トリヨ一ドベンゼンとは、 上記の結合を介して直接結合していてもよいし、 適当な連結基を介して結合していてもよレ、。 適当な連結基の例としては、 炭素数 が 5以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキレン基が挙げられる。 ， 疎水性ョ一ド化合物、 好ましくは 1， 3， 5 _トリョードベンゼン化合物は、 上記した炭素数 1 8の置換基以外に、 1又は 2以上の置換基を有していてもよレ、。 置換基の種類及び置換位置は特に限定されないが、 例えば、 置換若しくは無置換 のァミノ基、 置換若しくは無置換のァシルァミノ基、 水酸基、 カルボキシル基等 が疎水性ョード化合物のベンゼン環上に置換していることが好ましい。 好ましい 置換基は置換若しくは無置換のアミノ基、 又は置換若しくは無置換のァシルアミ ノ基である。 ァミノ基が置換基を有する場合として、 モノアルキルアミノ基、 ジ アルキルアミノ基などを挙げることができ、 ァシルァミノ基が置換基を有する場 合として、 トリフルォロアセチルァミノ基、 p—クロ口べンゾィルァミノ基など を例示することができる。
以下に疎水性ョード化合物として好ましい例を挙げるが、 本発明のリボソーム はこれらを含むものに限定されることはない。
化合物 (1) 化合物 (2)
化合物 (3)
化合物 (4)
化合物 (5)
Figure imgf000009_0001
化合物 (6)
化合物 (7) 化合物 (8) 化合物 (9)
Figure imgf000010_0001
疎水性ョード化合物はリボソームの膜構成成分として含まれるが、 膜構成成分 の全質量に対して 1 0から 9 0質量％程度、 好ましくは 1 0から 8 0質量0 /0、 さ らに好ましくは 2 0から 8 0質量％である。 疎水性ョ一ド化合物は膜構成成分と して 1種類を用いてもよいが、' 2種類以上を組み合わせて用いてもよい。
リポソームの他の膜構成成分としては、 リポソームの製造に通常用いられてい る脂質化合物をいずれも用いることが可能である。 例えば、 Biochim. Biophys. Acta 150 (4) , 44 (1982)、 Adv. in Lipid. Res. 16 (1) 1 (1978)、 "RESEARCH IN LIPOSOMES" (P. Machy, L. Leserman著、 John Libbey EUROTEXT社） 、 「リポソ一 ム」 （野島、 砂本、 井上編、 南江堂） 等に記載されている。 脂質化合物としては リン脂質が好ましく、 特に好ましいのはホスファチルジルコリン (PC)類である。 ホスファチジルコリン類の好ましい例としては、 eggPC,ジミリス トリル PC (DMPC)、 ジパルミ トイル PC (DPPC) 、 ジステアロイル PC (DSPC) 、 ジォレイル PC (D0PC) 等が挙げられるが、 これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい態様では、 リボソームの膜構成成分として、 ホスファチジル コリンとホスファチジルセリン（PS)を組み合わせて用いることができる。 ホスフ ァチジルセリンとしては、 ホスファチジルコリンの好ましい例として挙げたリン 脂質と同様の脂質部位を有する化合物が挙げられる。 ホスファチジルコリンとホ スファチジルセリンを組み合わせて用いる場合、 PC と PS の好ましい使用モル比 は PC： PS= 9 0 : 1 0から 1 0 : 9 0の間であり、 さらに好ましくは、 3 0 : 7 0から 7 0 ： 3 0の間である。
本発明のリボソームの別の好ましい態様によると、 膜構成成分として、 ホスフ ァチジルコリンとホスファチジルセリンを含み、 さらにリン酸ジアルキルエステ ルを含むリボソームが挙げられる。 リン酸ジアルキルエステルのジアルキルエス テルを構成する 2個のアルキル基は同一であることが好ましく、 それぞれのアル キル基の炭素数は 6以上であり、 1 0以上が好ましく、 1 2以上がさらに好まし レ、。 好ましいリン酸ジアルキルエステルの例としては、 ジラウリルフォスフエ一 ト、 ジミ リスチルフォスフェート、 ジセチルフォスフェート等が挙げられるが、 これに限定されることはない。 この態様において、 ホスファチジルコリン及びホ スファチジルセリンの合計質量に対するリン酸ジアルキルエステルの好ましい使 用量は 1から 5 0質量。 /0までであり、 好ましくは 1から 3 0質量％であり、 さら に好ましくは 1から 2 0質量。 /0である。
ホスファチジルコリン、 ホスファチジルセリン、 リン酸ジアルキルエステル、 及ぴ疎水性ョード化合物を膜構成成分として含むリボソームにおいて、 上記成分 の好ましい質量比は P C： P S ： リン酸ジアルキルエステル：疎水性ョード化合 物が 5〜 4 0質量％： 5〜 4 0質量％ : 1 - 1 0質量％： 1 5 - 8 0質量％の間 で選択することができる。
本発明のリボソームの構成成分は上記 4者に限定されず、 他の成分を加えるこ とができる。 その例としては、 コレステロール、 コレステロ一ノレエステル、 スフ インゴミエリン、 FEBS Lett. 223, 42 (1987) ; Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 85, 6949 (1988)等に記載のモノシアルガングリオシド GM1誘導体、 Chem. Lett.， 2145 (1989)； Biochim. Biophys. Acta, 1148, 77 (1992)等に記載のグルクロン酸誘導 体、 Biochim. Biophys. Acta, 1029, 91 (1990)； FEBS Lett. , 268, 235 (1990) 等に記載のポリエチレングリコ一ノレ誘導体が挙げられるが、 これに限られるもの ではない。
本発明のリボソームは、当該分野で公知のいかなる方法でもっても作成できる。 作成法の例としては、先に挙げたリポソームの総説成書類の他、 Ann. Rev. Biophys. Bioeng.， 9， 467 (1980) 、 "Liopsomes" (M. J. Ostro編、 MARCELL DEKKER, INC. ) 等に記載されている。 具体例としては、 超音波処理法、 エタノール注入法、 フレ ンチプレス法、 エーテル注入法、 コール酸法、 カルシウム融合法、 凍結融解法、 逆相蒸発法等が挙げられるが、 これに限られるものではない。 本発明のリポソ一 ムのサイズは、 上記の方法で作成できるサイズのレ、ずれであっても構わないが、 通常は平均が 400 nm以下であり、 200 nm以下が好ましい。 リポソームの構造は 特に限定されず、 例えばュ-ラメラ又はマルチラメラのいずれでもよい。 また、 リポソームの内部に適宜の薬物や他の造影剤の 1種又は 2種以上を配合すること も可能である。
本発明のリボソームを造影剤として用いる場合には、 好ましくは非経口的に投 与することができ、 より好ましくは静脈内投与することができる。 例えば、 注射 剤や点滴剤などの形態の製剤を凍結乾燥形態の粉末状組成物として提供し、 用時 に水又は他の適当な媒体 （例えば生理食塩水、 ブドウ糖輸液、 緩衝液など） に溶 解ないし再懸濁して用いることができる。 本発明のリボソームを造影剤として用 いる場合、 投与量はリボソームのョード含有量が、 従来の睐水性ョード造影剤の ョード含有量と同程度になるように適宜決定することが可能である。
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、動脈硬化、 もしくは PTCA後の 再狭窄等の血管疾患においては、 血管の中膜を形成する血管平滑筋細胞が異常増 殖をおこすと同時に内膜に遊走し、 血流路を狭くすることが知られている。 正常 の血管平滑筋細胞が異常増殖を始めるトリガーはまだ完全に明らかにされていな いが、 マクロファージの内膜への遊走と泡沫化が重要な要因であることが知られ ており、 その後に血管平滑細胞がフエノタイプ変換 （収縮型から合成型） をおこ すことが報告されている。
本発明のリボソームを用いると、 泡沫化マクロファージの影響で異常増殖した 血管平滑筋に対して疎水性ョード化合物を選択的に取りこませることができる。 その結果、 病巣と非疾患部位とをコントラストをつけて造影することが可能であ る。 従って、 本発明の造影剤は、 特に血管疾患の X線造影に好適に使用でき、 例 えば、動脈硬化巣や PTCA後の再狭窄等の造影を行うことができる。造影の方法は 特に限定されない。 例えば、 X線照射による方法、 又はョードの放射線ラベル体 を用いる核医学的方法などが挙げられるが、 これらに限定されることはない。 本発明により提供される培養系の作成方法は、 哺乳類動物疾患の病巣の形成に 関与する 2種類以上の細胞種を同一細胞培養器内で培養する工程を含むことを特 徴としている。 細胞種としては初代細胞培養又は株ィヒ継代培養細胞が好ましく、 哺乳類細胞の初代培養細胞が特に好ましい。 好ましい哺乳動物としては、 ヒト、 ィヌ、 ネコ、 ブタ、 ミニブタ、 ゥサギ、 ハムスター、 ラット、 マウス等が挙げら れるがこれに限定されるものではない。細胞培養器の種類は特に限定されなレ、が、 例えば培養フラスコ、 培養試験管、 シャーレ、 マイクロプレートなどを好適に用 いることができる。 同一培養器内で培養する 2種類以上の異なる細胞種は、 同種の動物由来又は異 種の動物由来の細胞種のいずれであっても構わないが、 同種であることが好まし レ、。 本明細書において 「病巣の形成に関与する」 という用語は複数の細胞が互い の増殖を調節しながら病巣を形成する場合などを含めて最も広義に解釈する必要 があり、 いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 異なる細胞種と しては、 細胞生物学又は細胞分類学上の観点から異なる細胞を選択することが好 ましいが、 ある病巣において共存し、 互いの増殖を調節しながら病巣を形成する 2種類の細胞を選択することがさらに好ましい。 例えば、 動脈硬化巣において共 存するマクロファージと血管平滑筋細胞を 2種類の細胞種として選択することが 好ましい。
本発明の培養系の作成方法の好ましい態様では、 2種類の細胞種をセル ·フィ ルターで隔てらながら同一ゥエル内で培養することができる。 本発明の別の好ま しい態様によれば、 用いる 2種類の細胞種は動脈硬化病巣を形成する細胞である ことが好ましレ、。 好ましい細胞種としては、 マクロファージ、 血管平滑筋細胞、 血管内皮細胞、 T細胞、 肥満細胞等が挙げられる。 この中でも好ましいのは、 マ クロファージ、 血管平滑筋細胞、 血管内皮細胞であり、 特に好ましいのは、 マク 口ファージ及ぴ血管平滑筋細胞の組み合わせである。 この場合、 マクロファージ はあらかじめ泡沫化させておく'ことが好ましい。
本発明により、 泡沫化させたマクロファージ及び血管平滑筋細胞をセル · フィ ルターを隔てて培養することにより増殖させた血管平滑筋細胞に対する薬剤の作 用を測定する工程を含む、 薬剤の血管疾患病巣への移行性の評価方法が提供され る。 本明細書において用いられる 「薬剤の作用」 という語は、 治療効果又は診断 効果などを含めて最も広義に解釈する必要がある。 セル ' フィルタ一は泡沫化し たマクロファージ及び血管平滑筋細胞を通過させなレ、程度の孔径のものであれば、 その種類は特に限定されない。例えば、細胞を通過させないポアサイズとして 0. 4 μ πι以下のポアサイズのセルフィルターを用いることができるが、 泡沫化したマ クロファージゃ用いる細胞の種類に応じて、 適宜のポアサイズのセルフィルター を容易に選択することができる。
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、 泡沫化させたマクロファージ 及ぴ血管平滑筋細胞をセル · フィルターを隔てて培養することにより、 泡沫化し たマクロファージ由来の増殖活性ィヒ物質が血管平滑筋細胞に作用して増殖を誘起 し、動脈硬化や PTCA後の再狭窄などの血管疾患における血管平滑筋細胞の異常増 殖をイン ·ビトロで再現することができる。 増殖した血管平滑筋細胞に対する薬 剤の取り込みを調べることによって、動脈硬化や PTCA後の再狭窄などの血管疾患 に有効性の高い薬剤をスクリ一ユングすることが可能である。 実施例
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることは¾い。 例 1：泡沫化マクロファージにより増殖活性化する血管平滑筋培養系の作成 ( 1 ) マウス大動脈内皮より、血管平滑筋細胞を分離した （組織培養法改定大 10版、講 談社、 1998年、 日本組織培養学会編集） 。 分離した血管平滑筋細胞を 10%FBSィ 一グル MEM培地 （GIBC0社製 No. 11095-080) に懸濁し、 12穴マイクロプレート (FALCON社製、 No. 3503) に播種した。 この時の各 wellの細胞数は 10， 000個に 調整した。 37°C、 5%C02の条件で 3日間培養した。
次に、 Biochimica Biophysica Acta誌、 1213卷、 127- 134頁（1994)記載の方法 により、 泡沫ィ匕したマウス腹腔マクロファージを調製した。 この泡沫化マクロフ ァージ 200, 000個を分離し、 上記底面に血管平滑筋細胞を培養したマイクロプレ 一トの各 wellの上部にインサートセル（FALCON社製、 No. 3180)に播種した。 37°C、 5%C02の条件で 5日間培養した。 第 1図に上記実験における血管平滑筋細胞の細 胞数を示す。 培養開始当初の増殖は緩やかであるが、 3日後に泡沫化マクロファ ージを加えた後、 約 1 日の誘導期を経て活発な増殖を示した。 マクロファージを 加えない場合の血管平滑筋細胞の増殖曲線を第 2図に示す。 第 1図との比較によ り泡沫マクロファージによる増殖活'1~生化効果は明らかである 例 2 ：血管平滑筋上のスカベンジャーレセプター発現の確認
動脈硬化病巣における血管平滑筋細胞は、 表面にスカベンジャーレセプターを発 現して酸化 LDLを取りこむことが知られている （Biochem. Pharmacol. 1999, 15； 57 (4) 383-6： Exp. Mol. Pathol. 1997 64 (3) 127-45) 。 第 1図の培養系におけ る血管平滑筋細胞に対して、 マウススカベンジャーレセプター抗体を使用して免 疫染色を行った結果、 播種 3日目の血管平滑筋細胞には発現を認めなかったが、 播種 6日目では明瞭な染色が確認された。 なお、 セル ·フィルター上の泡沫ィ匕さ せたマクロファージを同様に免疫染色したところ、 やはり明瞭な染色が認められ た。 例 3 ：血管平滑筋細胞による酸ィヒ LDLの取りこみ
第 1図の培養系において、 播種 3日目おょぴ 6日目において血管平滑筋細胞の 培地に125 1で標識した酸ィヒ L D Lを添加し、 2 4時間後に細胞に取り込まれた125 Iをカウントした結果を表 1に示す。 3日目と 6日目では、 明らかな取りこみ量 の差が認められた。 以上の結果より、 本発明の細胞培養系により培養された血管 平滑筋細胞が、 動脈硬化または再狭窄等の病巣の平滑筋細胞と同様の性質を有し ていることが示された。
Figure imgf000016_0001
X 10, 000 cpm 例 4：泡沫化マクロファージにより増殖活性化する血管平滑筋培養系の作成（2 ) 例 1と同様の方法で、 ラットおよびゥサギのマクロファージおよび血管平滑筋 細胞からなる培養系を作成した。 第 3図おょぴ第 4図に血管平滑筋細胞の細胞数 を示す。 いずれの場合も第 1図のマウスの場合と同様の結果が得られた。
第 1図の培養系で培養された血管平滑筋細胞は、 播種 3日目までは健康な血管 の性質を有し、 播種 7日目以降は動脈硬化病巣の平滑筋細胞の性質を有している ため、 この両者に対する影響を比較することで、 病巣に選択的な薬剤のスクリー ユングを行うことができる。 特に、 病巣に選択的な薬剤送達系の探索、 病巣細胞 に選択的毒性を示す薬剤の探索、 病巣細胞の細胞周期を選択的に停止させる薬剤 の開発、 等に使用できる。 以下に具体例を示すが、 本発明はこれに限られるもの ではない。 例 5 ： リボソームの調製
下記に示した割合で egg PC (フナコシ社製、 No. 1201- 41- 0214)、 egg PS (フナ コシ社製、 No. 1201-42-0226)、 ジセチルフォスフェート (DCP、 フナコシ社製、 No. 1354- 14- 8165)、 J. Med. Chem. , 25 (12) , 1500 (1982)記載の方法で合成した 疎水性ョ一ド化合物（3)をそれぞれナス型フラスコ内で塩化メチレンに溶解して 均一溶液とした後、 溶媒を減圧で留去してフラスコ底面に薄膜を形成した。 この 薄膜を真空で乾燥後、 0. 9%生理食塩水 （光製薬社製、 No. 512)を 1. 5 ml加え、 超 音波照射 （Branson社製、 No. 3542プローブ型発振器、 0. 1 mW) を氷冷下 5分実施 することにより、 均一なリボソーム分散液を得た。 得られた分散液の粒径を WBC アナライザー （日本光電社製、 A-1042) で測定した結果、 粒子径は 40から 65 nm であった。 リボソーム PC PS DCP 化合物 (3) 製剤 1 50 nmol 50 nmol 10 nmol 40 nmol 製剤 2 50 nmol 50 nmol 10 nmol 75 nmol 製剤 3 50 nmol 50 nmol 10 nmol 150 nmol 例 6 ：血管平滑筋細胞によるリボソーム製剤の選択的取り込み （1 )
例 5で調整した 3種類のリボソームを例 1の第 1図または第 2図で示される平 滑筋細胞培養系に下記①、 ②、 又は③のタイミングで添加し、 培養を継続した。
①第 2図に示される泡沫化マクロファージを加えない培養系において、 3日後に リポソ一ム製剤を加えて 1日間培養した。
②第 1図に示される泡沫化マクロファージを加える培養系において、 5日後にリ ポソ一ム製剤を加えて 1日間培養した。
③第 1図に示される泡沫化マクロファージを加える培養系において、 7日後にリ ポソ一ム製剤を加えて 1日間培養した。
①から③の条件でリポソームの添加と後培養が終了後、 上清を除きハ： ッファー液 （日水製薬社製、 code05906, pH7. 2) で 3回洗浄した後、 1. 5%SDS溶 液 （和光純薬社製、 199-07141) を加えて、 37°Cで 30分インキュベートして細胞 を溶解し、 細胞内に取りこまれた化合物（3)の量を HPLCで定量した。 その結果を 第 5図に示す。 この結果から、 本発明のリボソームにより血管平滑筋細胞に取り こまれるョード化合物の量は、 泡沫化マクロファージの影響により増殖を開始す る前と後では明瞭な差が認められる。 例 7 ：比較例
Pharm. Res. , 16 (3) 420 (1999) に記載の方法に従い、 化合物（3)の油滴懸濁液 を調製した。化合物（3)の含有量を同じにして例 6と同様の条件（①、②、及ぴ③） で細胞培養系に加え、 血管平滑筋に取りこまれた化合物（3)の量を HPLCで定量し た。 その結果を第 6図に示す。 第 5図と第 6図を比較すると、 本発明のリポソ一 ムを用いた場合には、 公知の油滴懸濁剤と比べて、 泡沫化マクロファージの影響 により異常増殖する血管平滑筋細胞に対して高効率かつ高選択的にョード造影剤 を集積させることができることが明らかである。 例 8 ：血管平滑筋細胞によるリボソーム製剤の選択的取り込み （2 )
例 4で作成したラット （第 3図） およびゥサギ （第 4図） の細胞を使った血管平 滑筋培養系において、 例 5で調製した 3種類のリボソームを上記①、 ②、 又は③ のタイミングで添加し、培養を継続した。細胞内に取りこまれた化合物（3)の量を HPLCで定量した。 その結果を第 7図及ぴ第 8図に示すが、 いずれもマウス細胞の 第 5図と同様の結果が得られた。 例 9
Invest. Radiol. 18， 275 (1983)の方法に従い、 ラット大動脈に動脈硬化巣を 形成させた。 動脈硬化巣を形成したラットに例 2で調製したリボソーム製剤 3を 化合物 (3)に換算した MTD量である 200 mg/kgを頸静脈より慎重に投与した。投与 30分後、 X線撮影により明瞭な動脈硬化巣の造影写真が得られた。 その結果を第 9図及ぴ第 1 0図に示す。 産業上の利用可能性
本発明のリボソームは、 泡沫化マクロファージの影響により異常増殖する血管 平滑筋細胞に対してョード化合物を集積することができ、 血管平滑筋の異常増殖 に起因する血管疾患の病巣を選択的に造影するための X線造影剤として有角であ る。 また、 本凳明の培養系の作成方法により提供される培養系は、 動脈硬化巣や 再狭窄などの病巣の状態を再現した細胞培養系として医薬の in vitroスクリ一二 ングなどに利用できる。

Claims

請求の 範囲
1 . 疎水性ョード化合物を膜構成成分として含むリボソーム。
2 .疎水性ョード化合物が、炭素数 1 8以上の置換基を少なくとも 1個有する 1 ,
3 . 5—トリョードベンゼン誘導体である請求項 1に記載のリボソーム。
3 . ホスファチジルコリン及ぴホスファチジルセリンからなる群から選ばれる脂 質を膜構成成分として含む請求の範囲第 1項又は第 2項に記載のリボソーム。
4 . 炭素数 6以上のアルキルのジエステルであるリン酸ジアルキルエステルを膜 構成成分として含む請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載のリポ ソーム。
5 . 炭素数 1 8以上の置換基がコレステロール誘導体の残基である請求の範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記載のリボソーム。
6 . 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載のリボソームを含む X
7 . 血管疾患の造影に用いるための請求の範囲第 6項に記載の X線造影剤。
8 . 泡沫化マクロファージの影響で異常増殖した血管平滑筋細胞の造影に用いる 請求の範囲第 6項に記載の X線造影剤。
第 1図 血管平滑筋細胞増殖曲線
Figure imgf000021_0001
0 2 4 6 8 播種からの日数（日） 第 2図 血管平滑筋細胞数
Figure imgf000021_0002
0 2 4 6 8 播種からの日数（曰）
1/8
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