JP2008182954A - 多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失の判定方法、並びにそれに基づいた癌に対する医薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】癌細胞特異的に増殖抑制効果を示す２本鎖ＲＮＡ及び医薬を提供する。
【解決手段】抗癌剤標的遺伝子の所定の標的配列に相同であり、ＲＮＡ干渉によって抗癌剤標的遺伝子の発現を抑制可能な２本鎖ＲＮＡであって、前記標的配列が多型部位を含む。前記抗癌剤標的遺伝子は例えばチミジル酸合成酵素遺伝子である。前記多型部位は、特定の塩基配列の３カ所における各々連続する６塩基である。該二本鎖ＲＮＡ又はベクターを含む癌に対する医薬、設計方法。
【選択図】図１
【解決手段】抗癌剤標的遺伝子の所定の標的配列に相同であり、ＲＮＡ干渉によって抗癌剤標的遺伝子の発現を抑制可能な２本鎖ＲＮＡであって、前記標的配列が多型部位を含む。前記抗癌剤標的遺伝子は例えばチミジル酸合成酵素遺伝子である。前記多型部位は、特定の塩基配列の３カ所における各々連続する６塩基である。該二本鎖ＲＮＡ又はベクターを含む癌に対する医薬、設計方法。
【選択図】図１
Description
本発明は、遺伝子多型を利用した新規な治療戦略に用いられる２本鎖ＲＮＡ、それを含む癌に対する医薬、前記医薬を含む癌治療キット、前記２本鎖ＲＮＡの設計方法に関する。また、本発明は、前記医薬に用いられる２本鎖ＲＮＡの設計支援に好適な、多型部位の遺伝子型及びヘテロ接合性の消失の判定方法に関する。
チミジル酸合成酵素（thymidylate synthase）は癌治療の有効な分子標的として知られており、チミジル酸合成酵素阻害剤であるフルオロウラシルやフルオロデオキシウリジン等は、大腸癌、胃癌、肺癌、乳癌等を対象に臨床的にも広く用いられている。チミジル酸合成酵素は細胞分裂に密接にかかわる酵素であり、その阻害剤は細胞分裂が盛んな癌細胞に対して高い増殖抑制効果を示すとされるが、同じく細胞分裂が盛んな骨髄や消化管に対しても毒性を示してしまう。すなわち、チミジル酸合成酵素を標的とする抗癌剤は、癌細胞と正常細胞とで増殖抑制効果の差が小さく、臨床使用時には骨髄毒性や消化管毒性が問題となる。
ところで近年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という現象を利用して特定の遺伝子の発現を抑制するメカニズムが注目を浴びている。これは、標的遺伝子の特定の配列に相同なセンス鎖とアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、標的遺伝子の特定配列の転写産物（ｍＲＮＡ）が特異的に分解され、遺伝子発現が抑制されるという現象である。この応用技術についても各方面で検討が進められており、例えばチミジル酸合成酵素遺伝子を標的とする２本鎖ＲＮＡを癌細胞に導入し、チミジル酸合成酵素阻害を引き起こすことが検討されている（例えば特許文献１等参照）。
特開２００５−２５３３４２号公報
しかしながら、前記特許文献１に記載される２本鎖ＲＮＡは、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現を癌細胞特異的に抑制するものではないため、これを患者に投与した場合、既存のフルオロウラシル等の抗癌剤と同様、正常細胞に対する毒性が問題となる。
本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、癌細胞特異的に増殖抑制効果を示す２本鎖ＲＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、前記２本鎖ＲＮＡを細胞内で発現するベクターを提供することを目的とする。また、本発明は、前記２本鎖ＲＮＡ又は前記ベクターを含む癌に対する医薬及び前記医薬を含む癌治療キットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記２本鎖ＲＮＡの設計方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、例えば前記２本鎖ＲＮＡの設計方法を支援するための、抗癌剤標的遺伝子の多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失の判定方法に関する。
前述の目的を達成するために、本発明に係る２本鎖ＲＮＡは、抗癌剤標的遺伝子の所定の標的配列に相同であり、ＲＮＡ干渉によって抗癌剤標的遺伝子の発現を抑制可能な２本鎖ＲＮＡであって、前記標的配列が多型部位を含むことを特徴とする。また、本発明に係るベクターは、前記２本鎖ＲＮＡを細胞内で発現することを特徴とする。また、本発明に係る癌に対する医薬は、前記２本鎖ＲＮＡを含むことを特徴とする。
例えばチミジル酸合成酵素遺伝子のような抗癌剤標的遺伝子に存在する多型部位のうち、少なくとも１つの多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっており、且つ、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子座にヘテロ接合性の消失が認められる患者の癌細胞に、癌細胞に残る側のアレルの多型部位に対応する遺伝子配列を標的配列として含む２本鎖ＲＮＡが導入されると、ＲＮＡ干渉により癌細胞に残るアレルからの抗癌剤標的遺伝子の発現が特異的に抑制される。これに対して前記２本鎖ＲＮＡが正常細胞に導入されると、一方のアレルからの抗癌剤標的遺伝子の発現はＲＮＡ干渉により抑制されるが、他方のアレルから抗癌剤標的遺伝子の発現は抑制されない。このため、前記２本鎖ＲＮＡによれば、癌細胞特異的に抗癌剤標的遺伝子の発現を抑え、抗癌剤標的遺伝子がチミジル酸合成酵素遺伝子の場合には癌細胞特異的な増殖抑制効果が得られる。したがって、前記２本鎖ＲＮＡは、及び、前記２本鎖ＲＮＡの発現ベクターは、癌細胞に対して特異的に抗癌作用を示す医薬として有効である。
また、本発明に係る癌治療キットは、前記医薬と、前記医薬と異なる種類の抗癌剤とを含むことを特徴とする。
前記癌治療キットによれば、チミジル酸合成酵素阻害剤等の抗癌剤の働きにより癌細胞全体にわたり偏り無く増殖抑制効果等を示す一方、前記２本鎖ＲＮＡ又はベクターを含む医薬の併用により、癌細胞特異的に抗癌剤標的遺伝子の発現を抑制し、癌細胞特異的な増殖抑制効果を高めることができる。
また、本発明に係る２本鎖ＲＮＡの設計方法は、同一個体に由来する正常細胞及び癌細胞について、条件（１）及び条件（２）を満たすか否かを検討する工程と、条件（１）及び条件（２）を満たす場合には、前記条件（１）の検討結果から、遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていると認められた多型部位であって、癌細胞において残存したアレルの多型部位の遺伝子配列を特定する工程と、特定された多型部位の遺伝子配列を標的に含む２本鎖ＲＮＡの配列を設計する工程とを有することを特徴とする。
条件（１）：正常細胞の抗癌剤標的遺伝子の少なくとも１つの多型部位において、多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていること
条件（２）：癌細胞の抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されていること
条件（１）：正常細胞の抗癌剤標的遺伝子の少なくとも１つの多型部位において、多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていること
条件（２）：癌細胞の抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されていること
前記設計方法によれば、正常細胞に対しては作用せず、癌細胞特異的に増殖抑制効果を示すＲＮＡ干渉用２本鎖ＲＮＡの設計が実現される。
さらに、本発明に係る多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失の判定方法は、抗癌剤標的遺伝子の多型部位の一方の遺伝子配列に相補的な塩基配列を含む第１のプライマーと、他方の遺伝子配列に相補的な塩基配列を含む第２のプライマーとを用意するとともに、前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとに互いに異なるシグナルを示す標識を付加し、正常細胞及び癌細胞から抽出されたＤＮＡを鋳型として前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとを用いたアレル特異的ＰＣＲを行い、前記標識由来のシグナルを指標として、正常細胞の抗癌剤標的遺伝子の少なくとも１つの多型部位の遺伝子配列、及び、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子座のヘテロ接合性の消失の有無を判定することを特徴とする。
正常細胞と癌細胞とについて前記アレル特異的ＰＣＲ法を行うことで癌細胞の標的遺伝子座のヘテロ接合性の消失の有無と、正常細胞の多型部位の遺伝子配列とをそれぞれ調べることができる。このため、各検討を個別に行う必要が無く、多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失を迅速に判定することができる。
本発明に係る２本鎖ＲＮＡによれば、正常細胞の抗癌剤標的遺伝子の少なくとも１つの多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっており、且つ、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されている場合、癌細胞の増殖を特異的に抑制することができる。したがって、前記２本鎖ＲＮＡ又は前記２本鎖ＲＮＡの発現ベクターを含む医薬によれば、特定の患者に対して癌細胞に対する特異的増殖抑制効果と正常細胞に対する低毒性とを両立した新規な癌治療を実現することができる。また、本発明に係る癌治療キットによれば、既存の抗癌剤の欠点である癌細胞特異性の低さを改善した治療を実現することができる。さらに、本発明に係る２本鎖ＲＮＡの設計方法によれば、癌細胞特異的に増殖抑制効果を示す２本鎖ＲＮＡを得ることができる。加えて、本発明に係る判定方法によれば、抗癌剤標的遺伝子の多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失を迅速に判定することができ、ＲＮＡ干渉により癌細胞の増殖を特異的に抑制可能な２本鎖ＲＮＡの設計を迅速に行うことができる。
先ず、本発明の概要について説明する。
正常細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子には、例えばＣ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６等と称される、複数の多型部位が存在することが知られている。Ｃ１０５３Ｔは、配列番号１に記載されるチミジル酸合成酵素酵素遺伝子を表す塩基配列中、１０６６番目（Ｔ／Ｃ）に位置する。Ａ１１２２Ｇは、配列番号１に記載される塩基配列中、１１３６番目（Ａ／Ｇ）に位置する。１４９４ｄｅｌ６は、配列番号１に記載される塩基配列中、１４９４番目から連続する６塩基（ＴＴＡＡＡＧ／欠失）に位置する。なお、配列番号１に示すチミジル酸合成酵素遺伝子は、Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６の各多型配列をＴ、Ａ、６＋のハプロタイプで保有している。本願発明者らが解析したところ、これら多型部位のうち少なくとも１つの多型部位の遺伝子型がアレルのそれぞれで異なっている頻度は、約４０％であった。
正常細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子には、例えばＣ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６等と称される、複数の多型部位が存在することが知られている。Ｃ１０５３Ｔは、配列番号１に記載されるチミジル酸合成酵素酵素遺伝子を表す塩基配列中、１０６６番目（Ｔ／Ｃ）に位置する。Ａ１１２２Ｇは、配列番号１に記載される塩基配列中、１１３６番目（Ａ／Ｇ）に位置する。１４９４ｄｅｌ６は、配列番号１に記載される塩基配列中、１４９４番目から連続する６塩基（ＴＴＡＡＡＧ／欠失）に位置する。なお、配列番号１に示すチミジル酸合成酵素遺伝子は、Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６の各多型配列をＴ、Ａ、６＋のハプロタイプで保有している。本願発明者らが解析したところ、これら多型部位のうち少なくとも１つの多型部位の遺伝子型がアレルのそれぞれで異なっている頻度は、約４０％であった。
一方、本願発明者らは長年に亘る研究の結果、癌細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子座にヘテロ接合性の消失が高頻度に認められることを観察してきた。例えば大腸癌の場合、チミジル酸合成酵素遺伝子座にヘテロ接合性の消失が認められる頻度は、約６０％であった。したがって、大腸癌患者において、前述の多型部位のうち少なくとも１つの多型部位の遺伝子型がアレルのそれぞれで異なっており、且つ、チミジル酸合成酵素遺伝子座にヘテロ接合性の消失が認められる頻度は、４０％と６０％とを乗じた値である２４％程度となる。
そして、本願発明者らは、これらの特徴を利用することにより、癌細胞の増殖を特異的に抑制し、さらにはフルオロウラシル等のチミジル酸合成酵素阻害剤の効果を癌細胞特異的に増強可能な、治療の新戦略(tailored molecular modulation)を創案した。前記治療法は、図１に示すように、正常細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子の少なくとも１つの多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっており（配列Ａ／配列Ｂ）、且つ、癌細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子座にヘテロ接合性の消失が生じている（配列Ａ／Ｌｏｓｓ）患者に有効である。前述の大腸癌を例に挙げると、大腸癌患者全体のうち２４％程度の患者が対象となる。このような患者に配列Ａを含むチミジル酸合成酵素遺伝子の発現をＲＮＡ干渉により抑制可能な２本鎖ＲＮＡを投与すると、癌細胞側に１本のみ残るアレルからのチミジル酸合成酵素遺伝子の発現が特異的に抑制されるので、癌細胞はチミジル酸合成酵素を発現できずに死滅する。ところが同一個体の正常細胞では、もう一方のアレル（配列Ｂを含む）からチミジル酸合成酵素が発現するため、生存する。したがって、癌細胞側に１本のみ残るアレルからのチミジル酸合成酵素遺伝子の発現をＲＮＡ干渉により特異的に抑制可能な２本鎖ＲＮＡを患者に投与することで、癌細胞特異的に増殖抑制効果を得ることができる。また、フルオロウラシル等のチミジル酸合成酵素阻害剤と前記２本鎖ＲＮＡとを併用することで、チミジル酸合成酵素阻害剤の効果を癌細胞特異的に増強させ、より高い効果を得ることができる。
以下、前述の治療戦略を実現するための２本鎖ＲＮＡ及びこれを含む医薬について説明する。本発明の医薬に用いられる２本鎖ＲＮＡは、抗癌剤標的遺伝子の所定の標的配列に相同であり、ＲＮＡ干渉によって抗癌剤標的遺伝子の発現を抑制可能な２本鎖ＲＮＡであって、標的配列が多型部位を含むものである。本発明において抗癌剤標的遺伝子とは、抗癌剤による発現抑制又は発現産物の機能抑制の対象となる遺伝子のことをいうが、以下では、発明の理解を容易とするために、抗癌剤標的遺伝子としてチミジル酸合成酵素遺伝子を例に挙げて説明する。
前述したように、本発明の２本鎖ＲＮＡは、正常細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子の少なくとも１つの多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっており、且つ、癌細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されている場合に、癌細胞特異的に増殖抑制効果を示す。正常細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子の多型部位の遺伝子配列が両アレルで同じである場合、又は、癌細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子の発現が両アレルとも同程度に維持されている場合には、癌細胞特異的な増殖抑制効果を得ることができない。
なお、抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されているとは、ヘテロ接合性の消失で観察される抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの物理的欠失により、抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制（低下又は消失）された状態の他、抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が機能的に抑制（低下又は消失）された状態も含むものである。抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が機能的に抑制された状態としては、例えば、片側のアレルの抗癌剤標的遺伝子がメチル化されることにより発現が抑制された場合、片側のアレルの抗癌剤標的遺伝子のプロモーターが突然変異を生じた場合、片側のアレルの抗癌剤標的遺伝子のコーディング部位の突然変異により発現産物であるタンパク質が機能しない場合等があり、これらの場合にも本発明の２本鎖ＲＮＡを含む医薬は有効である。
チミジル酸合成酵素遺伝子にヘテロ接合性の消失が認められる癌種としては、大腸癌、胃癌、肺癌、乳癌等が知られている。したがって、前記２本鎖ＲＮＡを含む医薬は、２本鎖ＲＮＡがチミジル酸合成酵素遺伝子を標的とする場合、大腸癌、胃癌、肺癌、乳癌等を対象とした場合に有効である。中でも大腸癌においてはチミジル酸合成酵素遺伝子のヘテロ接合性の消失が高頻度に認められるため、本発明に係る医薬が有効である確率が高い。
本発明においては、２本鎖ＲＮＡの標的配列が多型部位を含むことが重要である。なお、通常、既知の１塩基多型（ＳＮＰ）等の多型部位は、ＲＮＡ干渉用２本鎖ＲＮＡの標的配列から除外して設計される。標的配列に多型部位を含めると、ＲＮＡ干渉に基づく発現抑制効果が低くなるからである。例えば前記特許文献１に記載される２本鎖ＲＮＡはチミジル酸合成酵素遺伝子のＲＮＡ干渉による発現抑制を目的として設計されたものであるが、その２本鎖ＲＮＡの標的配列に多型部位は含まれていない。
標的配列に含めるチミジル酸合成酵素遺伝子の多型部位は、多型が存在する箇所であれば特に限定されないが、具体的には、チミジル酸合成酵素遺伝子のＣ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ又は１４９４ｄｅｌ６である。中でもＣ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇを標的配列に含む２本鎖ＲＮＡの効果が高い。
前記２本鎖ＲＮＡの作製は、化学的合成、インビトロ転写、細胞内合成等、公知の方法により行うことができる。細胞内合成の場合、前記２本鎖ＲＮＡを細胞内で発現するベクターを構築し、細胞内で発現させればよい。前記２本鎖ＲＮＡを細胞内で発現するベクターは、例えば細胞内で２本鎖ＲＮＡを発現するようにデザインしたＤＮＡをベクターに組み込む等、常法にしたがって構築することができる。
前記２本鎖ＲＮＡの塩基長は、ＲＮＡ干渉効果を得られる塩基長であれば特に限定されないが、１５塩基長〜２７塩基長の２本鎖ＲＮＡでは高い効果が得られる。
本発明の医薬の投与方法は、２本鎖ＲＮＡを含む医薬を患者に投与する場合、２本鎖ＲＮＡの発現ベクターを患者に投与する場合のいずれも、公知の投与方法から適宜選択することができる。投与時に公知のＤＤＳ（Drug Delivery System）を組み合わせることも可能である。医薬の剤型としては特に限定されず、例えば注射剤や、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口剤、外用剤等、公知の剤型とすることができる。また、経口投与、非経口投与のいずれであってもよい。
本発明の医薬は、前記２本鎖ＲＮＡ又は前記ベクターを１種類のみ含むものでもよいが、互いに異なる多型部位を標的配列に含む複数種類の２本鎖ＲＮＡ又は２本鎖ＲＮＡ発現ベクターを含むことが好ましい。例えば、正常細胞においてＣ１０５３Ｔ及びＡ１１２２Ｇの配列がアレルのそれぞれで異なっている場合には、Ｃ１０５３Ｔを標的配列とする２本鎖ＲＮＡ、及び、Ａ１１２２Ｇを標的配列とする２本鎖ＲＮＡの２種類を用いる。チミジル酸合成酵素遺伝子には多型部位が複数存在するが、正常細胞において遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっている多型部位が複数存在する場合には、２本鎖ＲＮＡ又は２本鎖ＲＮＡ発現ベクターを複数種類用いることで、癌細胞のチミジル酸合成酵素遺伝子の発現抑制効果をより確実に得ることができる。
本発明の癌治療キットは、前記医薬とそれ以外の抗癌剤とを含むものである。キットを構成する医薬と抗癌剤とは、同時に投与されても、異なるタイミングで投与されてもよい。キットを構成する抗癌剤としては、ＲＮＡ干渉によって抗癌剤標的遺伝子の発現を抑制可能な２本鎖ＲＮＡ以外であれば特に限定されず、公知の抗癌剤を用いることができる。医薬として用いられる２本鎖ＲＮＡがチミジル酸合成酵素遺伝子を標的とする場合には、例えばチミジル酸合成酵素阻害剤（フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン等）等を用いる。チミジル酸合成酵素阻害剤は単独で用いると癌細胞に対する特異性が低いという欠点があるが、前記医薬（２本鎖ＲＮＡ又は２本鎖ＲＮＡ発現ベクター）と併用することで癌細胞に対する増殖抑制効果を増強することができる。また、チミジル酸合成酵素阻害剤等の既存の抗癌剤は、医薬に含まれる２本鎖ＲＮＡ又は２本鎖ＲＮＡ発現ベクターに比較して効率良く細胞に取り込まれるため、前記医薬と併用することでより高い治療効果が得られる。
以下、前記２本鎖ＲＮＡの設計方法について説明する。先ず、同一個体由来の正常細胞及び癌細胞について、条件（１）及び条件（２）を満たすか否かを検討する。条件（１）及び条件（２）を満たす場合には、前記条件（１）の検討結果より遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていると認められた多型部位であって、癌細胞において残存したアレルの遺伝子型を特定する。次に、特定された多型部位のアレルの遺伝子配列を含む配列を標的配列として、ＲＮＡ干渉によりチミジル酸合成酵素遺伝子の発現を抑制可能な２本鎖ＲＮＡを設計する。
条件（１）：正常細胞の抗癌剤標的遺伝子の少なくとも１つの多型部位において、多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていること
条件（２）：癌細胞の抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されていること
条件（１）：正常細胞の抗癌剤標的遺伝子の少なくとも１つの多型部位において、多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていること
条件（２）：癌細胞の抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されていること
前記条件のうち、条件（２）：癌細胞の抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されていること については、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子座のヘテロ接合性の消失として、簡便に検出することができる。
本発明において２本鎖ＲＮＡを設計するとは、特定された情報に基づいて２本鎖ＲＮＡの配列を新規に決定する他、既知の多型部位を標的配列に含む２本鎖ＲＮＡを予め複数種類準備しておき、その中から最適な配列の２本鎖ＲＮＡを選択することも含む概念である。
条件（１）を満たすか否かを検討する方法は、例えばＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）等、多型を検出可能な公知の方法をいずれも採用することができる。条件（２）を満たすか否かは、ヘテロ接合性の消失を検出可能な公知の方法をいずれも採用することができる。例えばチミジル酸合成酵素遺伝子座のヘテロ接合性の消失を検出するには、チミジル酸合成酵素遺伝子の近傍に位置するマイクロサテライトマーカーを標的としたＰＣＲや、チミジル酸合成酵素遺伝子を標的としたＰＣＲを行い、増幅産物を解析すればよい。
前記条件（１）の検討結果から、正常細胞において遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていると認められた多型部位であって、癌細胞において残存したアレルの遺伝子配列を特定するには、癌細胞について前記条件（１）の検討のための方法を実施すればよい。
条件（１）及び条件（２）は、前述のように個別に検討してもよいが、以下に説明するように、アレル特異的ＰＣＲを利用した判定方法を採用することが好ましい。
以下、条件（１）及び条件（２）を判定可能なアレル特異的ＰＣＲ法の一例について説明する。先ず、調べたい多型部位を含んだアレル特異的なプライマーを用意する。例えばチミジル酸合成酵素遺伝子の多型部位のうちＣ１０５３Ｔの遺伝子型を調べる場合、例えば１０５３番目の多型配列が「Ｃ」である配列に対応した第１のプライマーと、１０５３番目の多型配列が「Ｔ」である配列に対応した第２のプライマーとを用意する。また、これら第１のプライマー及び第２のプライマーに共通の逆向きのプライマーを用意する。
これらプライマーのうち第１のプライマー及び第２のプライマーには、互いに異なるシグナルを示す標識を付加する。例えば第１のプライマーに緑の蛍光マーカーを、第２のプライマーに赤の蛍光マーカーを付加する。
そして、正常細胞及び癌細胞から抽出したＤＮＡを鋳型とし、前述の３種類のプライマーを用いてＰＣＲを行う。得られた増幅産物を解析し、標識由来のシグナルを指標として条件（１）及び条件（２）を満たすか否かを検討する。増幅産物を解析するには、例えば増幅産物を電気泳動等により分離し、バンドの蛍光を観察すればよい。
例えば条件（１）について検討する場合、先ず、正常細胞の結果に着目する。緑のバンドが観察されればＣ／Ｃのホモ接合体、赤のバンドが観察されればＴ／Ｔのホモ接合体、緑と赤との重なりを示す黄色のバンドが観察されればＣ／Ｔのヘテロ接合体である。これにより、チミジル酸合成酵素遺伝子のＣ１０５３Ｔ多型の遺伝子配列を決定する。Ａ１１２２Ｇ多型、１４９４ｄｅｌ６多型等の既知の多型部位についても適切なプライマーを設計し、同様の検討を行う。これにより、条件（１）を満たすか否かを判定することができる。
次に、条件（２）について検討する。少なくとも１つの多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていると判定された正常細胞、すなわち条件（１）を満たすと判定された正常細胞と同一個体に由来する癌細胞の結果に着目する。癌細胞がチミジル酸合成酵素遺伝子についてアレルの両方を持っている場合、チミジル酸合成酵素遺伝子のＣ１０５３Ｔの遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっている（Ｃ／Ｔ）ので、正常細胞と同じ結果である、黄色のバンドが観察される。一方、チミジル酸合成酵素遺伝子座にヘテロ接合性の消失が生じている場合には、赤のバンド又は緑のバンドが観察される。すなわち、チミジル酸合成酵素遺伝子のＣ１０５３Ｔの遺伝子型がＣ／Ｌｏｓｓである場合には緑のバンドが、Ｔ／Ｌｏｓｓである場合には赤のバンドが観察される。これにより、条件（２）を満たすか否かを判定することができる。
以上のように、アレル特異的ＰＣＲを利用することで、条件（１）及び条件（２）の両方を判定することが可能となる。また、条件（１）の検討結果から遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていると認められた多型部位であって、癌細胞において残存したアレルの遺伝子配列を特定することもできる。さらに、前記判定方法により、同一個体に由来する正常細胞と癌細胞について、本発明の２本鎖ＲＮＡ及び医薬の有効性を予測することができる。
なお、前述の説明では、互いに異なるシグナルを示す標識を付加した第１のプライマー及び第２のプライマーを用いているが、未標識の第１のプライマー及び第２のプライマーを用いてアレル特異的ＰＣＲを行っても構わない。未標識の第１のプライマー及び第２のプライマーを用いてアレル特異的ＰＣＲを行い、増幅産物を例えば電気泳動等により分離し、正常細胞と癌細胞とで結果を比較することによっても、条件（１）及び条件（２）を満たすか否か、及び、癌細胞において残存したアレルの遺伝子配列の特定が可能となる。
以上、抗癌剤標的遺伝子としてチミジル酸合成酵素遺伝子を例に挙げて説明してきたが、多型部位が存在し、且つ、癌細胞においてその遺伝子の片側のアレルの発現が所定の頻度で抑制されている、公知の抗癌剤標的遺伝子を標的としたものであっても、本発明の効果を得ることができる。なお、抗癌剤標的遺伝子としては、チミジル酸合成酵素遺伝子の他、ジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofolate reductase）遺伝子、グリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ（glycinamide ribonucleotide formyl transferase）遺伝子、リボヌクレオチド還元酵素（ribonucleotide
reductase）遺伝子、ヒストン脱アセチル化酵素（histone deacetylase）遺伝子、ファルネシルトランスフェラーゼ（farnesyl transferase）遺伝子等が例示されるが、これらに限定されるものでないことは言うまでもない。
reductase）遺伝子、ヒストン脱アセチル化酵素（histone deacetylase）遺伝子、ファルネシルトランスフェラーゼ（farnesyl transferase）遺伝子等が例示されるが、これらに限定されるものでないことは言うまでもない。
（実験１）
癌細胞の増殖を特異的に抑制し、さらにはフルオロウラシル等のチミジル酸合成酵素阻害剤の効果を癌細胞特異的に増強する新戦略(tailored molecular modulation)を実現するために、以下のような実験を行った。先ず、実験手法について説明する。
癌細胞の増殖を特異的に抑制し、さらにはフルオロウラシル等のチミジル酸合成酵素阻害剤の効果を癌細胞特異的に増強する新戦略(tailored molecular modulation)を実現するために、以下のような実験を行った。先ず、実験手法について説明する。
〈レポータープラスミド作成〉
チミジル酸合成酵素の３’ＵＴＲをＴＳ６５：ＴＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＣ（配列番号２）及びＴＳ６６：ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴ（配列番号３）のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ断片をＴＡクローニング法によりクローニングし、Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６の各多型配列をＣ、Ａ、６＋のハプロタイプで保有するプラスミドｐＴＡＴＳ３’／ＣＡ＋と、Ｔ、Ｇ、６−のハプロタイプで保有するｐＴＡＴＳ３’／ＴＧ−を得た。各プラスミドのＴＳ ３’ＵＴＲ配列をシーケンスし、目的の配列が得られていることを確認した後、レポーターベクターｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のルシフェラーゼコード部位の下流にＴＳ ３’ＵＴＲ配列を挿入した。得られたルシフェラーゼ／ＴＳ ３’ＵＴＲキメラ配列をサイトメガロウィルスプロモーターを有する発現ベクターｐＣＩ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）にサブクローニングし、ｐＣＦＬ／ＣＡ＋とｐＣＦＬ／ＴＧ−のレポータープラスミドを構築した。
チミジル酸合成酵素の３’ＵＴＲをＴＳ６５：ＴＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＣ（配列番号２）及びＴＳ６６：ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴ（配列番号３）のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ断片をＴＡクローニング法によりクローニングし、Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６の各多型配列をＣ、Ａ、６＋のハプロタイプで保有するプラスミドｐＴＡＴＳ３’／ＣＡ＋と、Ｔ、Ｇ、６−のハプロタイプで保有するｐＴＡＴＳ３’／ＴＧ−を得た。各プラスミドのＴＳ ３’ＵＴＲ配列をシーケンスし、目的の配列が得られていることを確認した後、レポーターベクターｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のルシフェラーゼコード部位の下流にＴＳ ３’ＵＴＲ配列を挿入した。得られたルシフェラーゼ／ＴＳ ３’ＵＴＲキメラ配列をサイトメガロウィルスプロモーターを有する発現ベクターｐＣＩ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）にサブクローニングし、ｐＣＦＬ／ＣＡ＋とｐＣＦＬ／ＴＧ−のレポータープラスミドを構築した。
〈ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成〉
ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）はＳｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した。合成のｔｅｍｐｌａｔｅとして使用したオリゴヌクレオチド配列（配列番号４〜配列番号７５）を表１に示す。表１中、多型配列部位を囲み字で表す。
ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）はＳｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した。合成のｔｅｍｐｌａｔｅとして使用したオリゴヌクレオチド配列（配列番号４〜配列番号７５）を表１に示す。表１中、多型配列部位を囲み字で表す。
〈レポーターアッセイ〉
上記で合成したｓｉＲＮＡとレポータープラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ｐｈＲＬ−ＳＶ４０を同時にトランスフェクションし、内部コントロールとした。トランスフェクションの１２時間前にＨＥＫ２９３細胞の１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ浮遊液を調整し、０．５ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。１ｗｅｌｌあたりｓｉＲＮＡ １２ｐｍｏｌ（最終濃度２０ｎＭ）、レポータープラスミド４０ｎｇ、ｐｈＲＬ−ＳＶ４０ ４０ｎｇ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｒｏｃｈｅ社） １．７μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（最終全量１００μｌ）に加え、室温にて１５分間反応後ＨＥＫ２９３培養液に混合した。レポーターアッセイにはＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。トランスフェクションの４８時間後に培養上清を吸引し、ＰＢＳにて２回洗浄後、Ｋｉｔに付属のＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒにて細胞を溶解し、プロトコールに従ってルシフェラーゼ活性を測定した。
上記で合成したｓｉＲＮＡとレポータープラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ｐｈＲＬ−ＳＶ４０を同時にトランスフェクションし、内部コントロールとした。トランスフェクションの１２時間前にＨＥＫ２９３細胞の１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ浮遊液を調整し、０．５ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。１ｗｅｌｌあたりｓｉＲＮＡ １２ｐｍｏｌ（最終濃度２０ｎＭ）、レポータープラスミド４０ｎｇ、ｐｈＲＬ−ＳＶ４０ ４０ｎｇ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｒｏｃｈｅ社） １．７μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（最終全量１００μｌ）に加え、室温にて１５分間反応後ＨＥＫ２９３培養液に混合した。レポーターアッセイにはＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。トランスフェクションの４８時間後に培養上清を吸引し、ＰＢＳにて２回洗浄後、Ｋｉｔに付属のＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒにて細胞を溶解し、プロトコールに従ってルシフェラーゼ活性を測定した。
〈ＭＴＴアッセイ〉
ｓｉＲＮＡトランスフェクションとＦｄＵｒｄ（フルオロデオキシウリジン）投与によるＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞の増殖活性への影響は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたＭＴＴアッセイにて評価した。トランスフェクション１２時間前にＨｅＬａ細胞は２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＨＥＫ２９３細胞は５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの浮遊液を調整し、０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。１ｗｅｌｌあたりｓｉＲＮＡ ２．６ｐｍｏｌ（最終濃度２０ｎＭ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ０．３５μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（最終全量３０μｌ）に加え、室温にて１５分間反応後、各細胞培養液に混合した。ＦｄＵｒｄ処理はトランスフェクション１２時間後に４０ｍＭのストック溶液を１８．７５〜６００μＭとなるように調整し、その２０μｌ（最終濃度２．５〜８０μＭ）を培養上清に加えた。トランスフェクションまたはＦｄＵｒｄ処理４８時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μｌ加え、さらに２時間培養し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。なお、コントロール（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＰＣ）として、多型部位を標的配列に含まないｓｉＲＮＡを用いた。
ｓｉＲＮＡトランスフェクションとＦｄＵｒｄ（フルオロデオキシウリジン）投与によるＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞の増殖活性への影響は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたＭＴＴアッセイにて評価した。トランスフェクション１２時間前にＨｅＬａ細胞は２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＨＥＫ２９３細胞は５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの浮遊液を調整し、０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。１ｗｅｌｌあたりｓｉＲＮＡ ２．６ｐｍｏｌ（最終濃度２０ｎＭ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ０．３５μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（最終全量３０μｌ）に加え、室温にて１５分間反応後、各細胞培養液に混合した。ＦｄＵｒｄ処理はトランスフェクション１２時間後に４０ｍＭのストック溶液を１８．７５〜６００μＭとなるように調整し、その２０μｌ（最終濃度２．５〜８０μＭ）を培養上清に加えた。トランスフェクションまたはＦｄＵｒｄ処理４８時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μｌ加え、さらに２時間培養し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。なお、コントロール（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＰＣ）として、多型部位を標的配列に含まないｓｉＲＮＡを用いた。
なお、ＨＥＫ２９３細胞は、Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６の各多型配列をＣ、Ａ、６＋のハプロタイプで保有する細胞である。ＨｅＬａ細胞は、Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６の各多型配列をＴ、Ｇ、６−のハプロタイプで保有する細胞である。ＨＥＫ２９３細胞及びＨｅＬａ細胞のいずれも、各多型配列の遺伝子配列は両アレルで同じである。
〈ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ〉
ｓｉＲＮＡ処理によるチミジル酸合成酵素ｍＲＮＡ量の変化は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００を用いたｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。トランスフェクション１２時間前にＨｅＬａ細胞は５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＨＥＫ２９３細胞は１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの浮遊液を調整し、０．５ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。１ｗｅｌｌあたりｓｉＲＮＡ １８ｐｍｏｌ（最終濃度３０ｎＭ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ １．７μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（最終全量１００μｌ）に加え、室温にて１５分間反応後、各培養液に混合した。トランスフェクション４８時間後に上清を吸引し、ＰＢＳにて２回洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）にてＲＮＡを抽出した。Ｍ−ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いてｃＤＮＡを合成後、ＴＳ−Ｆ：ＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＧＣＧＣＴＴＧＧＡＡＴＣ（配列番号７６）、ＴＳ−Ｒ：ＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＧ（配列番号７７）のプライマーおよびＳＹＢＥＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ （ＴａＫａＲａ社）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、チミジル酸合成酵素ｍＲＮＡ発現量を定量した。ｍＲＮＡの発現量はＡＣＴＢ−Ｆ：ＡＴＴＧＣＣＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡ（配列番号７８）、ＡＣＴＢ−Ｒ：ＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号７９）のプライマーを用いて同時に測定したβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ量で補正した。
ｓｉＲＮＡ処理によるチミジル酸合成酵素ｍＲＮＡ量の変化は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００を用いたｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。トランスフェクション１２時間前にＨｅＬａ細胞は５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＨＥＫ２９３細胞は１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの浮遊液を調整し、０．５ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。１ｗｅｌｌあたりｓｉＲＮＡ １８ｐｍｏｌ（最終濃度３０ｎＭ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ １．７μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（最終全量１００μｌ）に加え、室温にて１５分間反応後、各培養液に混合した。トランスフェクション４８時間後に上清を吸引し、ＰＢＳにて２回洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）にてＲＮＡを抽出した。Ｍ−ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いてｃＤＮＡを合成後、ＴＳ−Ｆ：ＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＧＣＧＣＴＴＧＧＡＡＴＣ（配列番号７６）、ＴＳ−Ｒ：ＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＧ（配列番号７７）のプライマーおよびＳＹＢＥＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ （ＴａＫａＲａ社）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、チミジル酸合成酵素ｍＲＮＡ発現量を定量した。ｍＲＮＡの発現量はＡＣＴＢ−Ｆ：ＡＴＴＧＣＣＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡ（配列番号７８）、ＡＣＴＢ−Ｒ：ＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号７９）のプライマーを用いて同時に測定したβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ量で補正した。
〈初期スクリーニング〉
先ず、初期スクリーニング用ｓｉＲＮＡとして、チミジル酸合成酵素遺伝子（ＴＳ遺伝子）の３’非翻訳領域に存在する３箇所の多型（Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６）を標的として、６セットのｓｉＲＮＡを作製した（図２）。これらｓｉＲＮＡについて、前記レポーターアッセイによりその効果を解析した。すなわち、ＴＳ３’非翻訳領域の多型配列をｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅの下流に挿入したｐｌａｓｍｉｄ：ｐＣＦＬ／ＣＡ＋、ｐＣＦＬ／ＴＧ−（図３）を構築し、前記ｓｉＲＮＡとｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抑制効果を検討した。その結果、Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇの２箇所のＳＮＰをターゲットとしたｓｉＲＮＡで配列特異的なＴＳ抑制を認めた（図４）。そこで、この２箇所のＳＮＰに対し、さらにｓｉＲＮＡの検討を継続した。
先ず、初期スクリーニング用ｓｉＲＮＡとして、チミジル酸合成酵素遺伝子（ＴＳ遺伝子）の３’非翻訳領域に存在する３箇所の多型（Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇ、１４９４ｄｅｌ６）を標的として、６セットのｓｉＲＮＡを作製した（図２）。これらｓｉＲＮＡについて、前記レポーターアッセイによりその効果を解析した。すなわち、ＴＳ３’非翻訳領域の多型配列をｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅの下流に挿入したｐｌａｓｍｉｄ：ｐＣＦＬ／ＣＡ＋、ｐＣＦＬ／ＴＧ−（図３）を構築し、前記ｓｉＲＮＡとｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抑制効果を検討した。その結果、Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇの２箇所のＳＮＰをターゲットとしたｓｉＲＮＡで配列特異的なＴＳ抑制を認めた（図４）。そこで、この２箇所のＳＮＰに対し、さらにｓｉＲＮＡの検討を継続した。
〈Ｃ１０５３Ｔ、Ａ１１２２Ｇを標的としたｓｉＲＮＡの検討〉
それぞれのＳＮＰを標的として７セット、計１４セットのｓｉＲＮＡを作製し、同様にルシフェラーゼレポーターを用いてその効果を解析した（図５、図６）。１４セットのｓｉＲＮＡ中、多型配列間でｓｉＲＮＡの抑制効果に５０％以上の差を認めるｓｉＲＮＡは、６セットであった。すなわち、Ｃ／７及びＴ／７、Ｃ／６及びＴ／６、Ｃ／４及びＴ／４、Ｃ／３及びＴ／３、Ａ／７及びＧ／７、Ａ／６及びＧ／６であった。
これらのｓｉＲＮＡセットを用いて、ＴＳ遺伝子型の異なる培養細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞）におけるＦｄＵｒｄの効果増強作用を解析した。その結果、Ｃ１０５３Ｔを標的として３’側から４番目に多型配列を配置したｓｉＲＮＡセットであるＣ／４、Ｔ／４において（図７）、Ｃ／４はＨＥＫ２９３細胞の増殖をより強く抑制し、一方、Ｔ／４はＨｅＬａ細胞の増殖をより強く抑制した（図８）。さらに、Ｃ／４、Ｔ／４は、各細胞において配列依存的にＴＳｍＲＮＡの発現を抑制した（図９）。
それぞれのＳＮＰを標的として７セット、計１４セットのｓｉＲＮＡを作製し、同様にルシフェラーゼレポーターを用いてその効果を解析した（図５、図６）。１４セットのｓｉＲＮＡ中、多型配列間でｓｉＲＮＡの抑制効果に５０％以上の差を認めるｓｉＲＮＡは、６セットであった。すなわち、Ｃ／７及びＴ／７、Ｃ／６及びＴ／６、Ｃ／４及びＴ／４、Ｃ／３及びＴ／３、Ａ／７及びＧ／７、Ａ／６及びＧ／６であった。
これらのｓｉＲＮＡセットを用いて、ＴＳ遺伝子型の異なる培養細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞）におけるＦｄＵｒｄの効果増強作用を解析した。その結果、Ｃ１０５３Ｔを標的として３’側から４番目に多型配列を配置したｓｉＲＮＡセットであるＣ／４、Ｔ／４において（図７）、Ｃ／４はＨＥＫ２９３細胞の増殖をより強く抑制し、一方、Ｔ／４はＨｅＬａ細胞の増殖をより強く抑制した（図８）。さらに、Ｃ／４、Ｔ／４は、各細胞において配列依存的にＴＳｍＲＮＡの発現を抑制した（図９）。
以上、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果から、チミジル酸合成酵素遺伝子のＣ１０５３Ｔ多型の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっており、癌細胞においてＣ／Ｌｏｓｓ又はＴ／Ｌｏｓｓのヘテロ接合性の消失を認める癌患者に対し、Ｃ／４又はＴ／４のｓｉＲＮＡの投与は治療上有効であると考えられる。また、前記癌患者に対するＣ／４又はＴ／４のｓｉＲＮＡの投与は、ＴＳ阻害剤の癌特異的効果を増強すると考えられる。
（実験２）
以下の実験では、各種セルラインについて、多型部位の遺伝子配列をアレル毎に調べた。
〈アレル特異的ＰＣＲ〉
各種セルライン（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＬＳ１７４Ｔ）から抽出したＤＮＡを鋳型とし、図１０及び表２に示す各アレル特異的プライマー（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）とコモンプライマー（ｃｏｍｍｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）との組み合わせを用いてＰＣＲ増幅を行った（配列番号８０〜配列番号８８）。Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。得られたＰＣＲ産物を３％アガロースゲルにて泳動し、各多型配列の遺伝子型を判定した。ゲル電気泳動の結果写真と各セルラインの多型部位の遺伝子型の判定結果を図１１に示す。図１１の結果より、アレル特異的ＰＣＲ産物を解析することにより、多型部位のアレルのそれぞれの遺伝子配列を特定できることが示された。なお、癌細胞のセルラインでは同一個体に由来する正常細胞を解析不能であるためチミジル酸合成酵素遺伝子座のヘテロ接合性の消失は判定できないが、臨床検体では癌細胞のアレル特異的ＰＣＲの結果と同一個体に由来する正常細胞のアレル特異的ＰＣＲの結果とを比較することにより、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子のヘテロ接合性の消失も判定できることがわかる。
以下の実験では、各種セルラインについて、多型部位の遺伝子配列をアレル毎に調べた。
〈アレル特異的ＰＣＲ〉
各種セルライン（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＬＳ１７４Ｔ）から抽出したＤＮＡを鋳型とし、図１０及び表２に示す各アレル特異的プライマー（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）とコモンプライマー（ｃｏｍｍｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）との組み合わせを用いてＰＣＲ増幅を行った（配列番号８０〜配列番号８８）。Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。得られたＰＣＲ産物を３％アガロースゲルにて泳動し、各多型配列の遺伝子型を判定した。ゲル電気泳動の結果写真と各セルラインの多型部位の遺伝子型の判定結果を図１１に示す。図１１の結果より、アレル特異的ＰＣＲ産物を解析することにより、多型部位のアレルのそれぞれの遺伝子配列を特定できることが示された。なお、癌細胞のセルラインでは同一個体に由来する正常細胞を解析不能であるためチミジル酸合成酵素遺伝子座のヘテロ接合性の消失は判定できないが、臨床検体では癌細胞のアレル特異的ＰＣＲの結果と同一個体に由来する正常細胞のアレル特異的ＰＣＲの結果とを比較することにより、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子のヘテロ接合性の消失も判定できることがわかる。
〈蛍光プライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲ〉
Ｃ１０５３Ｔの遺伝子型判定には蛍光標識プライマーによるＰＣＲを追加した。５’ ＥｎｄＴａｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、Ｃアレル特異的プライマーにはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔアレル特異的プライマーにはＴｅｘａｓ ｒｅｄを標識した。両プライマーとコモンプライマーとを混合してＰＣＲに使用した。得られたＰＣＲ産物は６％ Ｕｒｅａ−ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌにて電気泳動し、蛍光スキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００）にてＣアレル特異的なＰＣＲ産物（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，緑）とＴアレル特異的なＰＣＲ産物（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ，赤）を検出した。各種セルラインの電気泳動結果の写真を図１２に示す。図１２から明らかなように、多型部位の遺伝子型に応じて異なる蛍光色のバンドが観察された。この結果より、蛍光標識プライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲにより、多型部位のアレルのそれぞれの遺伝子配列を特定できることが示された。なお、癌細胞のセルラインでは同一個体に由来する正常細胞を解析不能であるためチミジル酸合成酵素遺伝子座のヘテロ接合性の消失は判定できないが、臨床検体では癌細胞のアレル特異的ＰＣＲの結果と同一個体に由来する正常細胞のアレル特異的ＰＣＲの結果とを比較することにより、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子のヘテロ接合性の消失も判定できることがわかる。
Ｃ１０５３Ｔの遺伝子型判定には蛍光標識プライマーによるＰＣＲを追加した。５’ ＥｎｄＴａｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、Ｃアレル特異的プライマーにはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔアレル特異的プライマーにはＴｅｘａｓ ｒｅｄを標識した。両プライマーとコモンプライマーとを混合してＰＣＲに使用した。得られたＰＣＲ産物は６％ Ｕｒｅａ−ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌにて電気泳動し、蛍光スキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００）にてＣアレル特異的なＰＣＲ産物（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，緑）とＴアレル特異的なＰＣＲ産物（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ，赤）を検出した。各種セルラインの電気泳動結果の写真を図１２に示す。図１２から明らかなように、多型部位の遺伝子型に応じて異なる蛍光色のバンドが観察された。この結果より、蛍光標識プライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲにより、多型部位のアレルのそれぞれの遺伝子配列を特定できることが示された。なお、癌細胞のセルラインでは同一個体に由来する正常細胞を解析不能であるためチミジル酸合成酵素遺伝子座のヘテロ接合性の消失は判定できないが、臨床検体では癌細胞のアレル特異的ＰＣＲの結果と同一個体に由来する正常細胞のアレル特異的ＰＣＲの結果とを比較することにより、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子のヘテロ接合性の消失も判定できることがわかる。
〈多型部位の遺伝子配列がアレルでそれぞれ異なる癌細胞のｓｉＲＮＡｓ処理〉
前述の実験１でのスクリーニングにより選択されたＣ／４のｓｉＲＮＡ、Ｔ／４のｓｉＲＮＡ、及びＣ／４の配列をスクランブルしたコントロールｓｉＲＮＡ（ＳＮＣ）を合成した。Ｃ１０５３Ｔの多型配列がアレルのそれぞれで異なっているセルライン（ＬＳ１４７Ｔ，ＬｏＶｏ，ＣＷ２）に各ｓｉＲＮＡ（ＳＮＣ，Ｃ／４，Ｔ／４）をそれぞれトランスフェクトし、４８時間後にＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いてアレル特異的ＲＴ−ＰＣＲを行った。
前述の実験１でのスクリーニングにより選択されたＣ／４のｓｉＲＮＡ、Ｔ／４のｓｉＲＮＡ、及びＣ／４の配列をスクランブルしたコントロールｓｉＲＮＡ（ＳＮＣ）を合成した。Ｃ１０５３Ｔの多型配列がアレルのそれぞれで異なっているセルライン（ＬＳ１４７Ｔ，ＬｏＶｏ，ＣＷ２）に各ｓｉＲＮＡ（ＳＮＣ，Ｃ／４，Ｔ／４）をそれぞれトランスフェクトし、４８時間後にＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いてアレル特異的ＲＴ−ＰＣＲを行った。
アレル特異的ＲＴ−ＰＣＲは、以下のように行った。先ず、ＲＮＡをＤＮａｓｅ処理した後、ＴＳ２２０：ＡＴＡＧＣＡＡＣＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＣＴＡ（配列番号８９）をプライマーとして逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを鋳型として上記で作成した蛍光標識プライマーミックス（Ｃ１０５３Ｔ判定用Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ標識プライマー、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ標識プライマー、コモンプライマーのミックス）を用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物を６％ Ｕｒｅａ−ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌにて電気泳動し、蛍光スキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００）にてＣアレル特異的なＲＴ−ＰＣＲ産物（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，緑）とＴアレル特異的なＲＴ−ＰＣＲ産物（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ，赤）を検出した。
アレル特異的ＲＴ−ＰＣＲの結果を図１３に示す。図１３より、アレル特異的なＲＮＡ量の減少が観察された。すなわち、Ｃ／４のｓｉＲＮＡ、Ｔ／４のｓｉＲＮＡが、多型部位の遺伝子型がアレルのそれぞれで異なっている癌細胞において、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現をアレル特異的に抑制し得ることが示された。
Claims (13)
- 抗癌剤標的遺伝子の所定の標的配列に相同であり、ＲＮＡ干渉によって抗癌剤標的遺伝子の発現を抑制可能な２本鎖ＲＮＡであって、前記標的配列が多型部位を含むことを特徴とする２本鎖ＲＮＡ。
- 前記抗癌剤標的遺伝子がチミジル酸合成酵素遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の２本鎖ＲＮＡ。
- 前記多型部位が、配列番号１に記載される塩基配列中、１０６６番目の塩基、１１３６番目の塩基、又は、１４９４番目から連続する６塩基であることを特徴とする請求項１又は２記載の２本鎖ＲＮＡ。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の２本鎖ＲＮＡを細胞内で発現することを特徴とするベクター。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の２本鎖ＲＮＡ又は請求項４記載のベクターを含むことを特徴とする、癌に対する医薬。
- 互いに異なる多型部位を標的配列に含む複数種類の２本鎖ＲＮＡ又はベクターを含むことを特徴とする請求項５記載の癌に対する医薬。
- 大腸癌、胃癌、肺癌、又は乳癌を対象とすることを特徴とする請求項５又は６記載の癌に対する医薬。
- 請求項５〜７のいずれか１項記載の医薬と、前記医薬と異なる種類の抗癌剤とを含むことを特徴とする癌治療キット。
- 前記抗癌剤がチミジル酸合成酵素阻害剤であることを特徴とする請求項８記載の癌治療キット。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の２本鎖ＲＮＡの設計方法であって、
同一個体に由来する正常細胞及び癌細胞について、条件（１）及び条件（２）を満たすか否かを検討する工程と、
条件（１）及び条件（２）を満たす場合には、前記条件（１）の検討結果から、遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていると認められた多型部位であって、癌細胞において残存したアレルの多型部位の遺伝子配列を特定する工程と、
特定された多型部位の遺伝子配列を標的に含む２本鎖ＲＮＡの配列を設計する工程とを有することを特徴とする２本鎖ＲＮＡの設計方法。
条件（１）：正常細胞の抗癌剤標的遺伝子の少なくとも１つの多型部位において、多型部位の遺伝子配列がアレルのそれぞれで異なっていること
条件（２）：癌細胞の抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現が抑制されていること - 癌細胞の抗癌剤標的遺伝子の片側のアレルの発現抑制が、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子座のヘテロ接合性の消失として検出されることを特徴とする請求項１０記載の２本鎖ＲＮＡの設計方法。
- 抗癌剤標的遺伝子の多型部位の一方の遺伝子配列に相補的な塩基配列を含む第１のプライマーと他方の遺伝子配列に相補的な塩基配列を含む第２のプライマーとを用意し、正常細胞及び癌細胞から抽出されたＤＮＡを鋳型として前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとを用いたアレル特異的ＰＣＲを行い、正常細胞の結果と癌細胞の結果とを比較することにより、条件（１）及び条件（２）を満たすか否かを検討することを特徴とする請求項１０又は１１記載の２本鎖ＲＮＡの設計方法。
- 抗癌剤標的遺伝子の多型部位の一方の遺伝子配列に相補的な塩基配列を含む第１のプライマーと他方の遺伝子配列に相補的な塩基配列を含む第２のプライマーとを用意し、正常細胞及び癌細胞から抽出されたＤＮＡを鋳型として前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとを用いたアレル特異的ＰＣＲを行い、正常細胞の結果と癌細胞の結果とを比較することにより、正常細胞の抗癌剤標的遺伝子の少なくとも１つの多型部位の遺伝子配列、及び、癌細胞の抗癌剤標的遺伝子座のヘテロ接合性の消失の有無を判定することを特徴とする多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失の判定方法。
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| JP2007019068A JP2008182954A (ja) | 2007-01-30 | 2007-01-30 | 多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失の判定方法、並びにそれに基づいた癌に対する医薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2007019068A JP2008182954A (ja) | 2007-01-30 | 2007-01-30 | 多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失の判定方法、並びにそれに基づいた癌に対する医薬 |
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Family Applications (1)
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| JP2007019068A Pending JP2008182954A (ja) | 2007-01-30 | 2007-01-30 | 多型部位の遺伝子配列及びヘテロ接合性の消失の判定方法、並びにそれに基づいた癌に対する医薬 |
Country Status (1)
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-
2007
- 2007-01-30 JP JP2007019068A patent/JP2008182954A/ja active Pending
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