CN115537463A - 检测血浆中piR-hsa-120522的试剂在制备肺癌筛查或诊断试剂盒中的用途 - Google Patents

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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Abstract

本发明提供了检测血浆中piR‑hsa‑120522的试剂在制备非小细胞肺癌筛查或诊断试剂盒中的用途。本发明首次发现，与良性结节及健康人群相比，piR‑hsa‑120522在非小细胞肺癌和癌前病变患者血浆中的表达水平明显更高(P＜0.05)，说明通过检测血浆中piR‑hsa‑120522的表达水平能够达到筛查或诊断非小细胞肺癌患者的目的，对于实现非小细胞肺癌的有效筛查或诊断具有重要意义。检测血浆中的piR‑hsa‑120522的试剂能够用来制备非小细胞肺癌筛查或诊断试剂盒，实现非小细胞肺癌的有效筛查或诊断。本发明提供的筛查或诊断试剂盒能够快速、高效、准确的对肺癌(特别是非小细胞肺癌)患者进行筛查或诊断，为肺癌(特别是非小细胞肺癌)筛查或诊断试剂盒提供了一种新的选择。

Description

检测血浆中piR-hsa-120522的试剂在制备肺癌筛查或诊断试 剂盒中的用途
技术领域
本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及检测血浆中piR-hsa-120522的试剂在制备肺癌和/或其癌前病变筛查或诊断试剂盒中的用途。
背景技术
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内肺癌死亡率都属恶性肿瘤之首。肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的发病机制至今尚未完全阐明，大量的研究资料表明吸烟、空气污染、肺部慢性炎症以及长期接触石棉、粉尘、镍、铬等金属物质都可能促进肺癌的发生。同时，肺癌也与遗传因素、机体自身免疫状态以及代谢相关。
从临床特征的角度看，目前国际上将肺癌分为小细胞肺癌Small cell lungcancer(SCLC)和非小细胞肺癌
Non small cell lung cancer(NSCLC)。非小细胞肺癌占肺癌的85％以上，而非小细胞肺癌中85％以上都属中晚期肺癌。因此对肺癌的诊断，尤其是对非小细胞肺癌的诊断具有十分重要的临床意义。
临床上非小细胞肺癌的检查包含：X射线检查、支气管镜检查、癌抗血液指标筛查、灌洗液/痰液细胞学检查以及近几年大量使用的低剂量螺旋CT(LDCT)筛查。但这些筛查或诊断方法往往存在很多的问题，包含不高的特异性和灵敏度，有创侵入式的筛查或诊断，一定的辐射伤害以及不高的诊断依从性。因此，需要开发一种高效、准确、无创的方式对大规模的高危人群进行大范围的非小细胞肺癌筛查或诊断，帮助降低非小细胞肺癌的发病率，提高非小细胞肺癌早期筛出比例。
近年来，基于分子诊断的液体活检技术在肿瘤诊断中受到广泛关注，一些肿瘤特异的分子标志物如癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC-Ag)及循环微小RNA(microRNA)等的检测加上辅助的影像学检查，能提高诊断的灵敏度。这些分子标志物可在血液等体液中直接检测，具有简便、快捷、无创、廉价、可重复检测等优点，容易为病人接受，对肿瘤的临床诊断具有重要意义，有很好的临床应用前景。尽管研究已报道一些可用于肺癌诊断的分子标志物，但总体而言，这些标志物的特异性较差，可靠性较低。因此，仍需探索高效、特异的新肺癌分子标志物，用于非小细胞肺癌的早期诊断。
目前，还未见通过检测血浆中的piR-hsa-120522水平来筛查或诊断肺癌的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供检测血浆中piR-hsa-120522的试剂在制备肺癌和/或其癌前病变筛查或诊断试剂盒中的用途。
本发明提供了一种检测血浆中piR-hsa-120522的试剂在制备肺癌和/或其癌前病变筛查或诊断试剂盒中的用途。
进一步地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
进一步地，所述试剂为PCR试剂、核酸恒温扩增反应试剂、核酸印迹检测试剂、胶体金检测试剂、核酸测序试剂或基因芯片检测试剂。
进一步地，所述PCR试剂为荧光定量PCR试剂。
进一步地，所述PCR试剂中包括对piR-hsa-120522进行PCR扩增的引物，该引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述PCR试剂中还包括对piR-hsa-120522进行反转录的引物，该引物序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种肺癌和/或其癌前病变筛查或诊断试剂盒，它包括用于检测血浆中piR-hsa-120522的试剂。
进一步地，所述试剂为PCR试剂、核酸恒温扩增反应试剂、核酸印迹检测试剂、胶体金检测试剂、核酸测序试剂或基因芯片检测试剂；优选的，所述PCR试剂为荧光定量PCR试剂。
进一步地，所述PCR试剂中包括对piR-hsa-120522进行PCR扩增的引物，该引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述PCR试剂中还包括对piR-hsa-120522进行反转录的引物，该引物序列如SEQ ID NO.4所示。
piR-hsa-120522，序列号：
GGCGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTGTGGGAAC(SEQ ID NO.1)。
本发明首次发现，与良性结节及健康人群相比，piR-hsa-120522在非小细胞肺癌及癌前病变患者血浆中的表达水平明显更高(P＝0.032)，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平能够达到筛查或诊断非小细胞肺癌及癌前病变患者的目的，有利于非小细胞肺癌的早期发现。
本发明首次发现，与良性结节人群相比，piR-hsa-120522在非小细胞肺癌及癌前病变患者血浆中的表达水平明显更高(P＝0.017)，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平能够达到筛查或诊断非小细胞肺癌及前病变患者的目的，能够有效区分良性结节和恶性肿瘤结节。
本发明首次发现，与良性结节及健康人群相比，piR-hsa-120522在非小细胞肺癌患者血浆中的表达水平明显更高(P＝0.048)，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平能够达到筛查或诊断非小细胞肺癌患者的目的，对于实现非小细胞肺癌的有效筛查或诊断具有重要意义。
本发明提供的筛查或诊断试剂盒能够快速、高效、准确的对肺癌(特别是非小细胞肺癌)患者进行筛查或诊断，为肺癌(特别是非小细胞肺癌)筛查或诊断试剂盒提供了一种新的选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为检测非小细胞肺癌及癌前病变患者与良性结节及健康人群血浆中piR-hsa-120522表达水平的ROC曲线。
图2为检测非小细胞肺癌及癌前病变患者与良性结节人群血浆中piR-hsa-120522表达水平的ROC曲线。
图3为检测非小细胞肺癌患者与良性结节及健康人群血浆中piR-hsa-120522表达水平的ROC曲线。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1：非小细胞肺癌筛查或诊断试剂盒的组成
本发明提供的非小细胞肺癌筛查或诊断试剂盒由检测人血浆中的piR-hsa-120522的荧光定量PCR试剂组成。该荧光定量PCR试剂中包括对piR-hsa-120522进行PCR扩增的引物，该引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；还包括对piR-hsa-120522进行反转录的引物，该引物序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2：piR-hsa-120522在非小细胞肺癌患者血浆中的表达测试1、临床资料
选取非小细胞肺癌患者73例，非小细胞肺癌癌前病变患者19例，健康人群49例，肺部良性结节人群29例。
2、仪器与试剂
主要仪器：analytikjena-qTOWER2.2型荧光定量PCR仪(德国)、SCILOGEX D3024R离心机(美国)、普通PCR仪analytikjena-Easycycler(德国)；超微量核酸蛋白测定仪scandrop100(德国)；移液器(美国bio-rad)。
主要试剂耗材：反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)(艾德来)；
Figure BDA0003139596530000031
Green预混液(中国DF)。10μL枪头(美国GCS)，200μL枪头(美国GCS)，1ml枪头(美国GCS),200μL无RNA酶PCR反应管(AXGEN)；1.5Ml无RNA酶EP管(GCS)，低位白色PCR反应管(bio-rad)，光学封膜(bio-rad)；(枪头及EP管在使用前都进行灭菌处理并烘干备用)。
3、检测方法
分别取非小细胞肺癌患者、非小细胞肺癌癌前病变患者、健康人群、肺部良性结节人群的血浆样品，以U6为内参基因，检测目的基因(引物信息详见表1)，采用SYBR GREEN I检测送检168个血浆样品中目的基因的表达量。具体步骤如下：
(1)样本中总RNA的提取
(2)RNA检测结果
本实验用超微量核酸蛋白测定仪(scandrop100)检测RNA OD值，使用的是A260/A280比值。
(3)cDNA第一条链的合成
采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)进行反转录操作，采用20uL反应体系(根据检测基因多少而使用不同的反应体系，基因越多反应体系就越大)：
目的基因反转录(采用10uL反应体系)：
Figure BDA0003139596530000041
反转录反应条件如下：
25℃ 10min
42℃ 50min
65℃ 15min
反应结束后，得到cDNA，-80℃保存。
内参基因反转录(采取10ul体系)：
Figure BDA0003139596530000042
反转录反应条件如下：
42℃ 45min
65℃ 15min
反应结束后，得到cDNA，-80℃保存。
(4)引物合成信息
表1.引物信息
Figure BDA0003139596530000043
(5)实时定量PCR(QPCR)反应
按照表2所示成分配置QPCR反应液，在PCR板离心机上4℃6000rpm离心30s。再置于定量PCR仪按照以下程序进行扩增。
荧光定量PCR程序：
步骤1、95℃-3分钟，
步骤2、95℃-10分钟，
步骤3、60℃-30s+读板，
转到步骤2，进行39个循环，
熔体曲线分析(60℃～95℃，+1℃/循环，保持时间4s)。
表2.QPCR反应液成分
Figure BDA0003139596530000051
(6)目的基因相对表达量的计算
各个样品中目的基因相对表达量的计算公式如下：
Figure BDA0003139596530000052
(7)数据处理
采用SPSS 20.0版软件进行处理。数据采用均数±标准差表示，两组较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
4、实验结果
以U6为内参，利用2^-△△CT法计算各组人群血浆样品中的目标基因的表达量，结果如表3所示。
表3不同人群血浆中piR-hsa-120522表达水平测定结果
Figure BDA0003139596530000053
进一步分析非小细胞肺癌及癌前病变患者与良性结节及健康人群之间血浆样品中的目标基因的表达量，结果如表4所示。
表4非小细胞肺癌及癌前病变患者与良性结节及健康人群血浆中piR-hsa-120522表达水平测定结果
Figure BDA0003139596530000061
根据表4可以看出，与良性结节及健康人群相比，piR-hsa-120522在非小细胞肺癌及癌前病变患者血浆中的表达水平明显更高(P＝0.032)，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平能够达到筛查或诊断非小细胞肺癌及癌前病变患者的目的，有利于非小细胞肺癌的早期发现。
根据ROC曲线(图1)可以看出，ROC曲线下面积为0.619，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平来筛查或诊断非小细胞肺癌及癌前病变患者的方法具有优良的准确度、敏感度和特异性。
进一步分析非小细胞肺癌及癌前病变患者与良性结节人群之间血浆样品中的目标基因的表达量，结果如表5所示。
表5非小细胞肺癌及癌前病变患者与良性结节人群血浆中piR-hsa-120522表达水平测定结果
Figure BDA0003139596530000062
根据表5可以看出，与良性结节人群相比，piR-hsa-120522在非小细胞肺癌及癌前病变患者血浆中的表达水平明显更高(P＝0.017)，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平能够达到筛查或诊断非小细胞肺癌及前病变患者的目的，能够有效区分良性结节和恶性肿瘤结节。
根据ROC曲线(图2)可以看出，ROC曲线下面积为0.705，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平来筛查或诊断非小细胞肺癌及癌前病变患者的方法具有优良的准确度、敏感度和特异性。
进一步分析非小细胞肺癌患者与良性结节及健康人群之间血浆样品中的目标基因的表达量，结果如表6所示。
表6非小细胞肺癌患者与良性结节及健康人群血浆中piR-hsa-120522表达水平测定结果
Figure BDA0003139596530000071
根据表6可以看出，与良性结节及健康人群相比，piR-hsa-120522在非小细胞肺癌患者血浆中的表达水平明显更高(P＝0.048)，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平能够达到筛查或诊断非小细胞肺癌患者的目的，对于非小细胞肺癌的诊断具有重要意义。
根据ROC曲线(图3)可以看出，ROC曲线下面积为0.608，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平来筛查或诊断非小细胞肺癌患者的方法具有优良的准确度、敏感度和特异性。
综上，本发明提供了检测血浆中piR-hsa-120522的试剂在制备非小细胞肺癌筛查或诊断试剂盒中的用途。本发明首次发现，与良性结节及健康人群相比，piR-hsa-120522在非小细胞肺癌患者和癌前病变患者血浆中的表达水平明显更高(P<0.05)，说明通过检测血浆中piR-hsa-120522的表达水平能够达到筛查或诊断非小细胞肺癌患者的目的，对于实现非小细胞肺癌的有效筛查或诊断具有重要意义。检测血浆中的piR-hsa-120522的试剂能够用来制备非小细胞肺癌筛查或诊断试剂盒，实现非小细胞肺癌的有效筛查或诊断。本发明提供的筛查或诊断试剂盒能够快速、高效、准确的对肺癌(特别是非小细胞肺癌)患者进行筛查或诊断，为肺癌(特别是非小细胞肺癌)筛查或诊断试剂盒提供了一种新的选择。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 检测血浆中piR-hsa-120522的试剂在制备肺癌筛查或诊断试剂盒中的用途
<130> GYKH1846-2020P0112472CC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcggcccgg gttcgactcc cggtgtggga ac 32
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgcttcgg cagcacatat act 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgcttcacg aatttgcgtg tc 22
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgttccc 50
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgactcccg gtgtggg 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagtgcaggg tccgaggtat 20

Claims (10)

1.检测血浆中piR-hsa-120522的试剂在制备肺癌和/或其癌前病变筛查或诊断试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述肺癌为非小细胞肺癌。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述试剂为PCR试剂、核酸恒温扩增反应试剂、核酸印迹检测试剂、胶体金检测试剂、核酸测序试剂或基因芯片检测试剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述PCR试剂为荧光定量PCR试剂。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述PCR试剂中包括对piR-hsa-120522进行PCR扩增的引物，该引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述PCR试剂中还包括对piR-hsa-120522进行反转录的引物，该引物序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种肺癌和/或其癌前病变筛查或诊断试剂盒，其特征在于：它包括用于检测血浆中piR-hsa-120522的试剂。
8.根据权利要求7所述的筛查或诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂为PCR试剂、核酸恒温扩增反应试剂、核酸印迹检测试剂、胶体金检测试剂、核酸测序试剂或基因芯片检测试剂；优选的，所述PCR试剂为荧光定量PCR试剂。
9.根据权利要求8所述的筛查或诊断试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂中包括对piR-hsa-120522进行PCR扩增的引物，该引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
10.根据权利要求9所述的筛查或诊断试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂中还包括对piR-hsa-120522进行反转录的引物，该引物序列如SEQ ID NO.4所示。
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