KR102056405B1

KR102056405B1 - Ebf2 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법

Info

Publication number: KR102056405B1
Application number: KR1020180039676A
Authority: KR
Inventors: 신동직; 배윤선; 남지호; 이혜림; 김동수
Original assignee: (주)메디젠휴먼케어; 연세대학교 산학협력단; 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2018-04-05
Publication date: 2019-12-16
Also published as: WO2019194534A1; KR20190116714A

Abstract

본 발명은 EBF2 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법에 관한 것이다. 가와사키병은 주로 5세 미만의 영유아에게서 발생하는 급성 열성 발진증으로, 관상동맥 병변이 발생할 수 있으며, 선진국에서는 가와사키병이 후천성 심장병의 가장 흔한 원인으로 지목되었다. 그러나 현재까지 가와사키병 진단을 위한 특정한 검사가 부재하여 임상적 기준에 따라 진단이 이루어지고 있을 뿐이므로, 선 예방이 아닌 후 처치로만 관리가 이루어지고 있는 실정이다.
본 발명의 EBF2 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법은 한국인 특징적으로 EBF2 유전자와 가와사키병 발병에 있어서의 연관성을 규명하는 것으로서, 가와사키병 발병 이전에 발병 가능성 예측이 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

EBF2 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법{A method for pathogenesis prediction to kawasaki disease using the EBF2 genes SNP}

본 발명은 EBF2 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법에 관한 것이다.

가와사키병(Kawasaki disease; KD)은 주로 5세 미만의 영유아에게서 발생하는 급성 열성 발진증으로, 그 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 전신의 계통적 혈관염이 주된 병태이다. 한국은 일본에 이어 세계 2번째로 높은 유병율을 보이고 있는데, 정맥 면역 글로불린 (IVIG)을 적절히 사용하는 치료를 받지 않으면 관상동맥 병변이 발생할 수 있다. 선진국에서는 가와사키병이 후천성 심장병의 가장 흔한 원인으로 지목되었다. 그러나 현재까지 가와사키병 진단을 위한 특정한 검사가 부재하여 임상적 기준에 따라 진단이 이루어지고 있을 뿐이므로, 선 예방이 아닌 후 처치로만 관리가 이루어지고 있는 실정이다. 진단을 위한 가장 특징적인 임상적 증상은 BCG 주사 부위의 홍반과 경화이다.

가와사키병의 증상은 다른 전염성 질환의 증상과 유사하며, 질병의 진행은 대개 자연적으로 제한된다. 이러한 이유로 한때는 가와사키병이 전염병으로 여겨졌으나, 환자에게서 감염성 원인 유기체가 분리되지 않고, 지리적·혈연적 유대성이 높으므로, 최근에는 유전적 소인에 의한 발현 질환으로 여겨지고 있다.

한편, 단일염기다형성(Single-nucleotide polymorphism; SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A,T,G,C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하는 것으로, 단일 염기 다형현상은 각 개인마다 많은 변이를 보이는 부분이므로 DNA 지문 분석에 주로 이용된다.

최근 SNP를 이용한 연구에서 가와사키병과 연관된 유전자들이 공지되고 있으나, 가와사키병과 EBF2(early B cell factor 2) 유전자와의 연관성은 연구되지 않은 실정이다. EBF2 유전자는 염색체 8p21.2에 위치하고 있으며, 갈색 지방 세포의 중요한 전사 조절 인자이다. 지금까지는 칼만 증후군(Kallmann's Syndrome; KS)과 관련 있는 것으로만 알려져 왔다(Trarbach EB 등, J Endocrinol. 2005;187:361-8).

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, EBF2 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발병 예측 방법은 가와사키병 발병 이전에 발병 가능성 예측이 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, EBF2 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 "가와사키병(Kawasaki disease; KD)"이란, 소아에서 발생하는 원인 불명의 급성 열성 혈관염으로, 전신에 다양하게 침범한다. 피부, 점막, 임파절, 심장 및 혈관, 관절, 간 등에 기능 이상을 가져올 수 있고, 위장관 장애, 담낭수종, 드물게 뇌수막 등의 염증이 나타날 수 있다.

가와사키병의 원인은 아직 불명확하지만, 현재까지는 유전학적 요인이 있는 소아가 병원체에 감염되면 과민반응이나 비정상적인 면역학적 반응을 일으켜 가와사키병이 발생한다고 추정하고 있다. 주로 5세 이하의 영유아가 전체 발생의 86%를 차지할 정도로 흔하며, 6개월에서 2세의 연령에서 가장 높은 발생 빈도를 보이고, 재발률은 3% 정도이다.

가와사키병은 전형적인 임상 증상이 나타나는 경우가 많으나, 비전형적으로 특징적인 증상이 모두 나타나지 않는 경우도 흔하다. 전형적인 증상은 38.5℃? 이상의 고열, 사지말단의 부종, 피부의 부정형 발진, 양측 안구 결막의 충혈, 입술의 홍조 및 균열, 딸기 모양의 혀, 구강 점막의 발적, 비화농성 경부 임파절 종창, BCG 접종 부위의 발적이 있다. 발열은 대개 항생제에 반응이 없으며, 열은 치료하지 않으면 대개 1~2주 이상 지속되고, 어떤 경우에는 3~4주 동안 열이 있기도 한다. 초기에는 심하게 보채며, 경우에 따라 설사, 복통, 두통 소화장애, 기침 등을 보인다. 이 때 심장의 침범으로 심근염, 경한 심낭 삼출증, 판막 역류 등이 흔하게 관찰된다. 이러한 급성기를 1~2주 겪은 후 아급성기에 접어들면서 열을 비롯한 급성기 증상들은 거의 사라진다. 아급성기는 특징적으로 손가락, 발가락 끝, 항문 주위의 막양 낙설(desquamation)을 보이고, 혈소판의 수가 증가하며, 관상 동맥류로 인한 급사의 위험이 가장 높은 시기이다. 거대 관상 동맥류는 파열, 협착, 혈전 형성 폐쇄에 의한 심근 경색의 위험이 있는 합병증이다. 회복기는 이러한 모든 임상 증상이 사라지기 시작하는 시기이며, 혈액검사 소견이 정상화된다.

관상동맥 합병증 외의 다른 임상 증상은 대체로 완전히 회복된다. 가와사키병으로 인한 사망률은 약 0.01% 정도로 보고되고 있다. 내경이 8mm 이상의 거대 관상동맥류는 완전히 회복되기 힘들며, 대개 관상동맥 혈전이나 협착이 생기기 쉽다.

가와사키병 자체는 원인이 알려져 있지 않아서, 현재로서는 특별한 예방법은 없다. 따라서 가와사키병 발병 예측 및 관리를 위한 기술 개발이 시급한 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서 "단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)"이란, 유전자 다형성, 유전 다형성, 염기 다형성 등과 동일한 의미를 가지며, SNP로 약기된다. SNP는 염색체의 단일부위에서 여러 가지 DNA 염기들 중의 하나에 나타나는 일반적인 돌연변이로, 인간의 게놈(genome)에는 약 3백만 개의 SNP가 존재하여 약 500~1,000염기당 1개꼴로 나타나며, 그 중 약 20만개가 단백질을 만드는 유전자에 존재하는 cSNP일 것으로 추정된다.

SNP는 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고, 이에 의하여 개인의 유전적 다양성이 발생한다. 즉 DNA사슬의 특정부위에 어떤 사람은 아데닌(adenine; A)을 가지고 있는 반면 어떤 사람은 시토신(cytosine; C)을 가지고 있는 것이다. 이런 미세한 차이(SNP)에 의하여 각 유전자의 기능이 달라질 수 있고 이런 것들이 상호 작용하여 서로 다른 모양의 사람을 만들고 서로 다른 질병에 대한 감수성의 차이를 만들어 낸다. 따라서 예를 들어, 간염에 걸리는 사람과 걸리지 않는 사람 간의 유전적 차이를 찾아낼 수 있다면 어떤 이유에서 간염에 대한 감수성이 달라지는지의 기능을 알아낼 수 있게 된다. 이를 이용하여 간염의 예방이나 치료에 사용되는 약품을 개발할 수 있을 것이라는 것이 인간유전체 연구의 궁극적인 목적이다.

본 발명의 일 구체예에서 “리얼타임 PCR(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)” 이란, 실시간 중합효소연쇄반응, 큐 PCR(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)이라고도 하며, 목표 DNA분자의 증폭과 양을 동시에 측정하는 분자생물학 실험 기법이다. 일반적으로 사용되는 RT-PCR은 역전사 중합연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction)을 말하며, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)이 아니다. 그러나 모든 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자들이 이것을 명확하게 구분하여 명명하는 것은 아니다. 실시간 중합효소연쇄반응은 DNA 샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위해 절대적인 유전자 복제 수 또는 상대적인 양을 검출할 수 있다.

실험의 진행은 일반적인 중합효소연쇄반응을 따른다. 중요한 특징은, 증폭된 DNA가 실시간으로 측정된다는 것이다. 이 점이 마지막에서 DNA가 관측이 되는 기본적인 중합효소연쇄반응과의 차이점이다. 두가지의 일반적인 방법이 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용된다. (1) 아무 DNA 이중나선에 끼어들어갈 수 있는 불특정한 형광염색, (2) 올리고뉴클레오티드로 이루어진 서열-특이적 DNA탐침, 형광으로 보고자가 라벨되어있고, 상보적인 DNA목표에 결합한 뒤 검출된다. 종종, 실시간 중합효소연쇄반응은 세포 또는 조직의 mRNA와 코팅되지 않은 RNA(non-coding RNA)를 수량화하기 위해 역전사 중합연쇄반응과 결합되어 행해진다.

본 발명의 일 구체예에서 "유전자 발현 억제"란, 유전자 염기서열에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA 등으로 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

상기 siRNA(small interfering RNA)는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(mismatch)(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(bulge)(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 상기 siRNA분자는 이에 제한되지는 않으나, 전체 길이가 15 내지 30 염기, 바람직하게는 19 내지 21 염기일 수 있다.

상기 shRNA(short hairpin RNA)은 45 내지 70 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서, 타겟유전자 siRNA 염기서열의 센스가닥과 상보적인 안티센스가닥 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후, 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노 바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.

상기 마이크로 RNA(microRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다.

상기 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다.

본 발명의 일 구체예에서 "단백질 활성 억제"란, 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편으로 타겟 단백질의 활성을 억제하는 것을 의미한다.

상기 항체란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(Light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 일 구체예에서 "예방"이란, EBF2 유전자와 가와사키병 발병에 있어서의 연관성을 규명하고, 분석된 데이터를 바탕으로 가와사키병 발병 이전에 발병 위험도를 예측하여 적절한 관리를 하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서 “진단”이란, EBF2 유전자와 가와사키병 발병에 있어서의 연관성을 규명하고, 분석된 데이터를 바탕으로 가와사키병을 확인하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 생물학적 시료로부터 EBF2 유전자 다형성 rs10866845를 확인하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측 방법을 제공하고, 상기 방법은 EBF2 유전자 다형성 rs561367201, rs75171102, rs573622423, 및rs901176으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 다형성을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 EBF2 유전자 다형성 rs561367201 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 백혈구 수 증가, 적혈구 침강 속도 증가, C-반응성 단백질 증가, 젖산 탈수소 효소 증가, 또는 적안 증상을 예측하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 EBF2 유전자 다형성 rs10866845 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 젖산 탈수소 효소 증가를 예측하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 EBF2 유전자 다형성 rs901176 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 적혈구 침강 속도 증가, 또는 C-반응성 단백질 증가를 예측하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 EBF2 유전자 다형성 rs75171102 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 붉은 입술 증상을 예측하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, EBF2 유전자 다형성 rs10866845의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측용 키트를 제공하고, 상기 키트는 EBF2 유전자 다형성 rs561367201, rs75171102, rs573622423, 및rs901176으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 추가로 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, EBF2 유전자 다형성 rs10866845 의 발현 억제제, 또는 EBF2 유전자 다형성 rs10866845 가 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 약학조성물은 EBF2 유전자 다형성 rs561367201, rs75171102, rs573622423, 및rs901176으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 억제제, 또는 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 발현 억제제는 EBF2 유전자 다형성 rs10866845 에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드,　siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 발현된 단백질의 활성 억제제는 EBF2 유전자 다형성 rs10866845 에 특이적인 항체, 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명의 EBF2 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법은 한국인 특징적으로 EBF2 유전자와 가와사키병 발병에 있어서의 연관성을 규명하는 것으로서, 가와사키병 발병 이전에 발병 가능성 및 증상의 예측이 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, EBF2 유전자의 5 가지 태깅SNP의 위치를 나타낸 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 가와사키병 환자의 시료로부터 EBF2 유전자의 시퀀싱 수행

세브란스 아동병원으로부터 가와사키병 환자 295명의 시료를 제공받아 EBF2 유전자의 시퀀싱을 수행하였다. EBF2 유전자를 포함하는 공지된 유전자들의 시퀀스(염기서열), 및 염기 다형성 정보를 포함하는 일체의 유전정보는 NCBI(미국 생물학 정보센터, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)등 으로부터 획득 가능하다.

상기 환자들은 일본 가와사키병 연구위원회의 기준에 따라 진단된 환자로서, 불완전하거나 비정형적인 가와사키병 환자는 제외하였다. 대조군으로는 과거 가와사키병 병력이 없고, 미용상의 이유로 병원을 방문한 건강한 유아 200명을 선정하였다. 모든 실험은 참가자들의 서명 동의를 받아, 연세대학교 의과대학 윤리위원회의 승인을 받아 수행하였다(승인번호 2008-0055-010).

가와사키병 환자와 대조군의 임상적 증상을 비교한 결과를 표 1에 기재하였다.

비교 결과, 가와사키병 환자 295명 중 194명(65.8 %)이 남성이었고, 101명(34.2 %)이 여성이었다. 대조군은 남자가 76명(38.0 %), 여자가 124명(62.0 %)이었다. 가와사키 환자군은 발열 증상(99.3 %)과 백혈구 수(WBCs)가 대조군과 비교하여 유의하게 높았고, 특히 C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP), 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate; ESR), 및 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase; LDH)의 임상 증상은 대조군과 비교하여 현저하게 증가하였다. 적안(red-eye)은 271명 중 216명(79.7 %), 발진(rashes)은 270명 중 204명(75.6 %), BCG 주사 부위의 홍반(BCG injection site erythema)은 268명 중 71명(26.5 %)의 빈도로 가와사키병 환자군에서만 발견되었다.

	KD patients (N=295)	Controls (N=200)	p-value
Gender (male: female)	194(65.8%): 101(34.2%)	76(38.0%): 124(62.0%)	-
Age (months)	42.4 ± 39.8	117.1 ± 33.9	-
WBCs	12,959.7 ± 5,338.7	5,228.1 ± 3,317.4	0.000
Platelets	398.6 ± 183.1	231.9 ± 139.6	0.000
ESR	63.8 ± 32.5	4.0 ± 8.0	0.000
CRP	57.1 ± 53.5	1.4 ± 6.0	0.000
LDH	331.3 ± 143.5	241.1 ± 41.9	0.000

수득된 각 전혈 시료에 대한 게놈 DNA는 QIAmp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였고, Epoch 마이크로플레이트 분광광도계(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 정량화하였다.

원인 변이를 확인하기 위해 각 시료의 EBF2 유전자를 염기서열 분석하였다. 분석을 위한 게놈 서열은 GenBank(http: //www.ncbi/nlm.nih.gov/) 데이터베이스로부터 얻었고, 유전자의 엑손 및 프로모터 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머는 Primer3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)를 사용하여, 총 15쌍의 프라이머를 디자인하였다.

PCR 단편은 제조사의 프로토콜에 따라 ABI Prism 3730xl DNA 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)상의 BigDye Terminator chemistry를 사용하여 시퀀싱하였다. DNA 다형성은 PolyPhred 프로그램 (http://droog.gs.washington.edu/polyphred/)을 사용하여 확인하였다. 1000 Genomes 데이터베이스와 Haploview 소프트웨어(버전 4.2)를 사용하여 태깅SNP를 선택하였고, r2 threshold 0.8 및 minor allele frequency (MAF) threshold 0.01을 기준으로 EBF2 유전자의 5 가지 태깅SNP(rs561367201, rs10866845, rs75171102, rs573622423 및 rs901176)를 선정하였다. 상기 태깅SNP의 유전자 내 위치를 도 1에 나타내었다.

태깅SNP의 유전자 타이핑은 TaqMan®® fluorogenic 5'-nuclease assay(Applied Biosystems)을 사용하여 중복으로 수행하였다. Real-Time PCR은 QuantStudio™™ 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 15 ng의 게놈 DNA, 5 ㎕의 TaqMan®® Universal PCR Master Mix, 및 0.25 ㎕의 40 x TaqMan®® assay를 포함하여 10 ㎕의 최종 부피로 하되, 온도 조건은 95 ℃에서 10 분간 초기 변성, 95 ℃에서 15 초, 및 60 ℃에서 1 분간 45 사이클로 수행하였다. 대립 유전자 감별을 위해 QuantStudio ™ 6 Flex Real-Time PCR 소프트웨어 버전 1.2를 사용해 분석하였다. 상기 선택된 태깅SNP에 대한 위치 정보를 하기 표 2에 나타내었다.

해당 유전자	RS명	다형성정보
EBF2	rs901176	EBF2 유전자의 4,463번째에 위치하는 염기 C가 T로 치환
EBF2	rs75171102	EBF2 유전자의 4,546번째에 위치하는 염기 C가 A로 치환
EBF2	rs561367201	EBF2 유전자의 4,578번째에 위치하는 염기 C가 T로 치환
EBF2	rs573622423	EBF2 유전자의 4,677번째에 위치하는 염기 C가 T로 치환
EBF2	rs10866845	EBF2 유전자의 199,374번째에 위치하는 염기 A가 G로 치환

실시예 2. 가와사키병 환자의 시료로부터 EBF2 유전자의 연관성 분석

실시예 1의 데이터에 대한 모든 통계 분석은 Windows 10 플랫폼에서 R 소프트웨어 (버전 3.4.0)를 사용하여 수행하였다. 가와사키병 환자군과 대조군 다형성의 대립 유전자 및 유전자형 빈도를 카이 제곱 검정을 사용하여 비교하였고, 가와사키병 환자군과 대조군의 특성은 Student 's t-test를 사용하여 비교하였다. 이원 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 유전자 - 유전자 상호 작용을 설명하기 위해 확률비(OR)와 95 % 신뢰 구간(95 % CI)을 계산하였다. p 값은 <0.05 를 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

EBF2 유전자는 염색체 8p21.2 유전자좌에 위치하고 있다. EBF2 유전자 SNP의 유전자형과 대립 유전자 빈도를 표 3에 나타내었다. 분석 결과, EBF2 유전자의 rs10866845에 대해서만 가와사키병 환자군과 대조군 사이의 대립 유전자 빈도에 유의한 차이가 있었고 (p = 0.036), 유전자형 빈도의 차이는 rs901176(p = 0.000)에서 관찰되었다.

SNP	Genotype	KD patients (N=295)	Healthy controls (N=200)	p-value
rs561367201	GG	284 (96.30)	194 (97.00)	0.691
	GA	10 (3.40)	6 (3.00)
	AA	1 (0.30)	0 (0.00)
	G	578 (0.98)	394 (0.99)	0.537
	A	12 (0.02)	6 (0.01)	0.537
rs10866845	TT	188 (63.70)	147 (73.50)	0.066
	TC	92 (31.20)	44 (22.00)
	CC	15 (5.10)	9 (4.50)
	T	468 (0.79)	338 (0.85)	0.040
	C	122 (0.21)	62 (0.15)	0.040
rs75171102	GG	283 (95.90)	192 (96.00)	0.704
	GT	11 (3.70)	8 (4.00)
	TT	1 (0.30)	0 (0.00)
	G	577 (0.98)	392 (0.98)	0.828
	T	13 (0.02)	8 (0.02)	0.828
rs573622423	GG	288 (97.60)	194 (97.00)	0.565
	GA	6 (2.00)	6 (3.00)
	AA	1 (0.30)	0 (0.00)
	G	582 (0.99)	394 (0.99)	0.851
	A	8 (0.01)	6 (0.01)	0.851
rs901176	GG	119 (40.30)	115 (57.50)	0.000
	GA	144 (48.80)	49 (24.50)
	AA	32 (10.80)	36 (18.00)
	G	382 (0.65)	279 (0.70)	0.101
	A	208 (0.35)	121 (0.30)	0.101

가와사키병 환자군과 대조군에서 임상 데이터와 EBF2 유전자 내 선택된 SNP 사이의 관계를 관찰하였다. 그 결과, rs561367201 다형성의 GG 유전자형은 백혈구 수(WBC) 증가(p = 0.000), 적혈구 침강 속도(ESR, p = 0.000), C-반응성 단백질(CRP, p = 0.000), 및 젖산 탈수소 효소(LDH; p = 0.000) 수준과 유의한 관련성이 있는 것으로 나타났다. 또한, rs10866845 다형성은 젖산 탈수소 효소와 관련이 있었고, rs901176 다형성은 적혈구 침강 속도, 및 C-반응성 단백질과 관련이 있었다. 상기 결과를 표 4 내지 표 6에 나타내었다.

Association of the rs10866845 polymorphism in the EBF2 gene with LDH.
Genotype	KD patients	Controls	P- value
TT	334.68 ± 144.41	239.71 ± 45.58	0.000
TC	316.98 ± 140.44	243.37 ± 31.22	0.026
CC	380.38 ± 149.43	246.20 ± 44.70	0.010

Association of the rs901176 polymorphism in the EBF2 gene with ESR.
Genotype	KD patients	Controls	P- value
GG	63.11 ± 33.26	5.33 ± 7.70	0.000
GA	64.63 ± 31.48	3.31 ± 8.65	0.000
AA	62.96 ± 34.78	3.11 ± 8.23	0.000

Association of the rs901176 polymorphism in the EBF2 gene with CRP.
Genotype	KD patients	Controls	P- value
GG	58.90 ± 55.62	0.62 ± 1.14	0.002
GA	59.74 ± 53.82	00.00 ± 00.00	0.000
AA	37.99 ± 39.02	4.00 ± 10.91	0.000

EBF2 유전자의 유전 변이체와 가와사키병의 연관성을 로지스틱 회귀 분석한 결과, rs10866845와 rs901176 다형성이 가와사키병과 유의한 관련이 있는 것으로 나타났다. rs10866845 다형성의 경우, 가와사키병 위험에 대한 C-캐리어(TC + CC)의 교차비 (OR)는 우성 유전 하에서 1.59였다(95 % CI, 1.07-2.36, p = 0.0197). rs901176 다형성은 우성, 열성, 및 공우성 유전 하에서 가와사키병과 연관되었다. 상기 결과를 표 7에 나타내었다.

Polymorphisms	Genetic modes	OR	95%CI	p-value
rs561367201	Dominant (GA+AA/GG)	1.25	0.46-3.44	0.6598
	Recessive (AA/GG+GA)	-	-	-
	Codominant (AA/GA/GG)	1.14	0.41-3.18	1.000
rs10866845	Dominant (TC+CC /TT)	1.58	1.06-2.34	0.0217
	Recessive (CC /TT+TC)	1.14	0.49-2.65	0.7654
	Codominant (CC/TC/TT)	1.63	1.08-2.49	0.0635
rs75171102	Dominant (GT+TT/GG)	1.02	0.41-2.54	0.9700
	Recessive (TT/GG+GT)	-	-	-
	Codominant (TT/GT/TT)	0.93	0.37-2.36	1.0000
rs573622423	Dominant (GA+AA/GG)	0.79	0.26-2.37	0.6705
	Recessive (AA/GG+GA)	-	-	-
	Codominant (AA/GA/GG)	0.67	0.21-2.12	0.7368
rs901176	Dominant (GA+AA/GG)	2.00	1.39-2.88	0.00017
	Recessive (AA/GG+GA)	0.55	0.33-0.93	0.0246
	Codominant (AA/GA/GG)	2.84	1.88-4.29	0.0000

구체적인 임상 증상과의 관련성을 보면, rs561367201 유전자 다형성은 적안(red-eye)증상과 관련이 있었고(OR = 0.25, 95% CI, 0.08-0.80, p = 0.0320), rs75171102 다형성은 붉은 입술(red-lips)과 관련성이 있었다(OR = 1.40, 95% CI, 0.33-5.95, p = 0.0359). 상기 결과를 표 8 내지 표 10에 나타내었다.

Association of rs561367201 in KD patients with clinical symptoms
KD symptom	OR	95%CI	p-value
coronary artery dilatation lesions	1.98	0.63-6.19	0.2071
Red-eye	0.25	0.08-0.8	0.0320
Red-lips	0.55	0.17-1.76	0.3182
cervical LN enlargement	0.62	0.19-1.98	1.000
rash	0.61	0.19-1.93	0.3340
BCG-injection site erythema	0.31	0.04-2.31	0.5974

Association of rs10866845 in KD patients with clinical symptoms
KD symptom	OR	95%CI	p-value
coronary artery dilatation lesions	0.75	0.43-1.29	0.2888
Red-eye	1.30	0.76-2.21	0.3295
Red-lips	1.15	0.7-1.89	0.5814
cervical LN enlargement	1.02	0.68-1.53	0.9323
rash	0.82	0.52-1.29	0.3884
BCG-injection site erythema	1.15	0.73-1.81	0.5451

Association of rs75171102 in KD patients with clinical symptoms
KD symptom	OR	95%CI	p-value
coronary artery dilatation lesions	0.88	0.21-3.69	0.0599
Red-eye	2.58	0.35-18.91	0.7549
Red-lips	1.40	0.33-5.95	0.0359
cervical LN enlargement	0.75	0.25-2.23	1.000
rash	1.54	0.36-6.60	1.000
BCG-injection site erythema	1.34	0.43-4.15	0.3654

상기 결과로부터 가와사키병이 EBF2 유전자의 SNP와 깊은 연관성이 있다는 것을 알 수 있었다.

Claims

개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 EBF2 유전자 다형성 rs10866845를 확인하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
제 1항에 있어서,
상기 방법은 EBF2 유전자 다형성 rs561367201, rs75171102, rs573622423, 및rs901176으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 다형성을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
제 2항에 있어서,
상기 EBF2 유전자 다형성 rs561367201 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 백혈구 수 증가, 적혈구 침강 속도 증가, C-반응성 단백질 증가, 젖산 탈수소 효소 증가, 또는 적안 증상을 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
제 2항에 있어서,
상기 EBF2 유전자 다형성 rs10866845 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 젖산 탈수소 효소 증가를 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
제 2항에 있어서,
상기 EBF2 유전자 다형성 rs901176 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 적혈구 침강 속도 증가, 또는 C-반응성 단백질 증가를 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
제 2항에 있어서,
상기 EBF2 유전자 다형성 rs75171102 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 붉은 입술 증상을 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
EBF2 유전자 다형성 rs10866845의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측용 키트.
제 7항에 있어서,
상기 키트는 EBF2 유전자 다형성 rs561367201, rs75171102, rs573622423, 및rs901176으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 추가로 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측용 키트.
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