KR20150047658A - 돌연변이 ｐ５３ 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 돌연변이 p53^R248 단백질이 발현되는 난소암 세포주가 중피세포 Met5A에 대해 부착성이 높게 나타났으며, p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통해 p53^R248 의 발현을 감소시킨 결과, p53^R248 에 의하여 증가한 부착성이 유의적으로 감소하였고, p53^R248이 Integrin β4를 포함한 부착관련 유전자들과 Akt/PI3K를 포함하고 있는 신호경로를 조절하는 것을 확인함으로써, 상기 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돌연변이 ｐ５３ 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물{Composition comprising expression or activity inhibitors of p53 protein for the prevention of cancer metastasis and treatment of cancer}

본 발명은 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 또는 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

p53 종양 억제자를 암호화하는 TP53 유전자는 인간 암에서 가장 자주 일어나는 돌연변이 이다(Petitjean et al., 2007). 대부분의 암관련 p53 돌연변이는 미센스돌연변이(missense mutation)와 관련이 있으며, 대부분 단일 아미노산 치환과 함께 단백질 전체 길이의 과발현에서 나타나는 결과이다. 따라서, 유전자내의 돌연변이 또는 삭제에 의해 정상적인 p53 기능의 손실, 기능의 이득으로 인한 돌연변이의 종류가 존재한다. 또한, 암호화되는 단백질은 종양형성 특징인 종양진행(tumor progression )에 기여하는 것으로 보고되고 있다(Dittmer et al., 1993). 또한, 돌연변이 p53은 약제 내성(drug resistance), 게놈 불안정성(genomic instability), 비정상적 세포주기(aberrant cell cycle), 침윤(invasion) 및 전이(metastasis)에 관련되어 있음이 보고되고 있다(Solomon et al., 2011). 따라서, p53 돌연변이는 잠재적으로 예후(prognostic)/예측 마커 및 치료용 타겟으로 사용할 수 있음이 보고되어 있다(Oren and Rotter, 2010).

난소암은 선진국에서 가장 치명적인 산부인과 악성 종양이다. 난소암은 전 세계적으로 일 년에 약 204,000 여성에게 영향을 미치며, 약 125,000명의 여성이 난소암으로 인해 사망한 것으로 보고되고 있다(Parkin et al., 2005). 난소암 질병을 겪고 있는 여성의 다수(80%)는 난소에 암이 퍼져 있거나, 대부분 늦은 단계에서 진단을 받고 있는 상황이다. 골반 깊숙한 곳에 위치하기 때문에 난소암은 크고 넓게 퍼지기 전까지 전혀 증상이 나타나지 않는다. 그러므로, 난소암은 일반적으로 진행 단계에서 발견되며 진단받은 환자들에 있어서 5년 생존율은 적극적인 외과수술과 화학요법 치료에도 불구하고 30% 미만에 불과하다.

TP53 유전자의 체세포 변이는 모든 산발성암(SPORADIC CANCER) 중 난소암에서 47.8% 발생한다고 보고되고 있다(Olivier et al., 2010). TP53 유전자의 변화는 난소암에서 흔하게 일어나는 유전(genetic)적 현상이다. p53 International Agency for Research on Cancer (IARC) 데이타 베이스(http://www-p53.iarc.fr/)에 따르면, 난소암에서 대부분의 p53 돌연변이는, 다른 암에서 나타나는 현상과 비슷하며, 미스센스 돌연변이이며, 이것은 코돈 175, 248, 273에 핫 스팟은 같은 DNA 결합 도메인이 클러스터되는 것으로 보고되고 있으나, 난소암 전이 중 핵심적인 과정인 복망 부착 과정에서 돌연변이 p53 단백질이 어떠한 영향을 미치는지는 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 p53 돌연변이의 암전이 예방 및 억제 효과에 대하여 규명하고자 노력한 결과, 돌연변이 p53^R248 단백질이 발현되는 난소암 세포주가 복강중피세포주인 Met5A에 대해 부착성이 높게 나타났으며, p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통해 p53^R248 의 발현을 감소시킨 결과, p53^R248 에 의하여 증가한 부착성이 유의적으로 감소하였고, p53^R248이 Integrin β4를 포함한 부착관련 유전자들과 Akt/PI3K를 포함하고 있는 신호경로를 조절하는 것을 확인함으로써, 상기 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 또는 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 p53^R248 단백질 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 p53^R248 단백질 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 전이 예방 및 억제용 건강식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 실험군으로 암 세포에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 처리된 세포에서 p53^R248 단백질 또는 integrin β4의 발현정도를 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 p53^R248 단백질 또는 integrin β4의 발현량이 대조군과 비교하여 감소 된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 조성물에 관한 것으로, 돌연변이 p53^R248 단백질이 발현되는 난소암 세포주가 복강중피세포주인 Met5A에 대해 부착성이 높게 나타났으며, p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통해 p53^R248 의 발현을 감소시킨 결과, p53^R248 에 의하여 증가한 부착성이 유의적으로 감소하였고, p53^R248이 Integrin β4를 포함한 부착관련 유전자들과 Akt/PI3K를 포함하고 있는 신호경로를 조절하는 것을 확인함으로써, 상기 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1 B는 난소암에서 p53 돌연변이의 복강중피세포주 Met5A에 대한 부착력을 나타낸 도이다.
도 1 C는 돌연변이 p53 녹다운(knockdown)을 통한 세포 부착 억제 효과를 확인
도 2 A는 돌연변이 p53^R248로 안정적으로 형질감염된 SKOV-3 세포에서 Met5A에 대한 부착력을 나타낸 도이다.
도 2B는 단기적으로 형질감염된 SKOV-3^R248 세포와 야생형 p53을 발현하는 SKOV-3^WT 세포에서 부착력을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 난소암 세포 부착력에 있어서 돌연변이 p53^R248의 역할 확인한 도이다.
도 4는 돌연변이 p53^R248 에 의해 조절되는 접착력 관련 유전자 분석을 나타낸 도이다.
도 5는 SKOV-3^R248 세포와 SKOV-3^BB 세포에서 CD9, L1CAM, S1PR1, PKR2, ICAM2, THBS-1 및 Integrin β4 유전자 발현을 비교하여 나타낸 도이다.
도 6은 돌연변이 p53^R248 매개 난소암세포 부착력이 중피 세포에 있어서 Integrin β4 관련성 확인을 나타낸 도이다.
도 7은 p53^{R248 -} 매개 난소암-중시세포 부착력에 있어서 integrin β4 항-ITGB4(anti-ITGB4)의 효과를 확인한 도이다.
도 8 A는 p53^R248의 이소성 발현이 유발되어 FAK 및 PI3K 인산화 증가를 나타낸 도이다.
도 8 B는 PI3K/Ark 억제제인 월스맨닌(worthmannin, phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor) 및 LY294002의 p53^R248에 의해 유도된 Met5A에 대한 부착력을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 돌연변이 p53^R248 단백질은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 p53^R248 단백질 발현 억제제는 p53 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(Short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 p53 유전자의 siRNA는 서열번호 6(표 2)으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 p53^R248 단백질의 활성 억제제는 p53^R248 단백질에 상보적으로 결합하는 화합을, 펩티드, 펩티드 미멕틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 암은 난소암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 결핵 암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 intergrin β4 유전자 활성을 억제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암세포주에서 p53 단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 돌연변이 p53을 가진 Hec1A, OVCAR-3 및 HT-29 세포에서 p53 단백질 발현을 확인하였다(도 1A 참조).

또한, 난소암에서 p53 돌연변이를 갖는 세포주의 복강중피세포주인 Met5A에 대한 부착력을 확인하기 위하여, 형광 마이크로 포토그라피(올림푸스) 및 Scion Image 소프트웨어(Scion Corp, Frederick, MD, USA)를 사용하였으며, 암과 관련이 있는 미센스 돌연변이(missense mutant)의 핫 스팟(HOT SPOT)인 248번 코돈(codon)에서 p53 발현에 의하여 복강중피세포주에 대한 난소암 부착력을 확인하였고, 인간 복강중피세포주인 Met5A에 대한 OVCAR-3 세포의 부착력이 A2780 세포보다 약 24배 높은 것을 확인하였다(도 1B 참조).

또한, p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통한 세포 부착 억제 효과를 확인하기 위하여, p53 siRNA를 사용하여 p53 돌연변이가 녹다운된 A2780 및 OVCAR-3 세포를 제조하고 형질감염을 시킨 결과, p53 돌연변이를 갖는 OVCAR-3 세포에서만 유의적으로 부착력이 억제되는 것을 확인하였다(도 1C 참조).

또한, 돌연변이 p53^R248의 이소성(ectopic) 발현의 세포부착력 증가 효과를 확인하기 위하여, 안정적으로 형질감염된 SKOV-3^R248 및 SKOV-3^BB 세포를 사용하여 복강중피세포주 Met5A에 대한 부착력을 확인한 결과, 돌연변이 p53^R248로 안정적으로 형질감염된 SKOV-3 세포에서 복강중피세포 Met5A에 대한 부착력이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 2A 참조). 또한, 단기적으로 형질감염된 SKOV-3^R248 세포와 야생형 p53을 발현하는 SKOV-3^WT 세포에서 부착력을 비교하였을 때, 단기적으로 형질감염된 SKOV-3^R248 세포에서 세포 부착력이 증가하는 것을 확인하였다(도 2B 참조).

또한, 난소암 세포 부착력에 있어서 돌연변이 p53^R248의 역할을 확인하기 위하여, p53 siRNA를 이용하여 p53 돌연변이를 녹다운 시킨 후, 세포 부착력을 확인한 결과, 복강중피세포 Met5A에 대한 p53^R248-매개 암세포 부착력은 p53 돌연변이의 하향조절(dwon-regulated)에 의해 완전히 억제되는 것을 확인하였다. 그 반면, p53 siRNA를 사용하여 형질감염된 SKOV-3^BB 및 SKOV-3^WT 세포에서 세포 부착력에 대한 어떠한 변화도 일어나지 않는 것을 확인하였다(도 3 A 및 도 3 B 참조).

또한, 돌연변이 p53^R248 에 의해 조절되는 접착력 관련 유전자 분석을 하기 위하여, Ingenuity Pathway Analysis system을 수행하여 확인하였고, CD9, L1CAM, S1PR1, PKR2, ICAM2, THBS-1 및 Integrin β4를 포함한 암세포 부착력과 관련이 있는 7개의 유전자는 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 수행한 결과, Akt 및 integrin을 포함한 분자 허브(molecular hub)를 네트워크에서 확인하였다(도 4 참조).

또한, 암세포 부착력에 있어서 인테그린(Integrin) 관련성 확인을 하기 위하여, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 수행한 결과, SKOV-3^R248 세포와 SKOV-3^BB 세포에서 CD9, L1CAM, S1PR1, PKR2, ICAM2, THBS-1 및 Integrin β4 유전자를 비교하였을 때, SKOV-3^R248 세포에서 상기 7개의 세포 부착력 분자 모두 유의적으로 상향-조절(up-regulation)하는 것을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 돌연변이 p53^R248 매개 난소암세포 부착력이 복강중피세포에 있어서 Integrin β4 관련성 확인을 하기 위하여, RT-PCR을 사용하여 형질감염된 SKOV-3 세포에서 Integrin β4의 mRNA 수치를 확인한 결과, p53^R248 의 이외성 발현이 Integrin β4 발현을 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 내재적으로 p53^R248이 발현된 OVCAR-3 세포와 야생형 p53이 발현된 A2780 세포에서 integrin β4의 발현 수치를 비교하였을 때, 내재적으로 p53^R248이 발현된 OVCAR-3 세포에서 integrin β4의 발현 수치가 더 높게 나타나는 것을 확인하였다. 아울러, p53 siRNA를 사용하여 돌연변이를 녹다운 시켰을 때, OVCAR-3 세포에서 integrin β4 발현의 수치가 억제되는 것을 확인하였다.

또한, p53^{R248 -} 매개 난소암-중시세포 부착력에 있어서 integrin β4 항-ITGB4(anti-ITGB4, blockage antibody)의 효과를 확인하기 위하여, 형광 마이크로 포토그라피(올림푸스) 및 Scion Image 소프트웨어(Scion Corp, Frederick, MD, USA)를 사용하여 수행한 결과, 항-ITGB4(anti-ITGB4, blockage antibody)는 Met5A 세포에 대한 SKOV-3^R248 세포 및 OVCAR-3 세포의 부착력이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였고, p53-매개 난소암-복강중피세포 부착력에서 integrin β4 발현이 잠재적으로 관련되어 있음을 확인하였다(도 7 참조).

또한, p53^R248이 유도된 난소암-복강중피 세포 부착에 대한 PI3K/Akt 경로(pathway)를 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏을 수행한 결과, p53^R248의 이소성 발현이 유발되어 FAK 및 PI3K 의 인산화가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 8A 참조). 또한, PI3K/Ark 억제제인 월스맨닌( worthmannin, phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor) 및 LY294002는 p53^R248에 의해 유도된 복강중피세포 Met5A에 대한 부착력을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 8 B 참조). 아울러, SKOV-3^R248 세포와 SKOV-3^BB 세포 부착력에서 FAK 억제를 비교하였을 때, SKOV-3^R248 세포와 SKOV-3^BB 세포 부착력에서 FAK 억제가 비슷한 것을 확인하였다. 이에 따른 결과는 PI3K/Ark 분자만 p53^R248이 유도된 난소암-복강중피세포 부착에 관련이 있는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 돌연변이 p53^R248 단백질이 발현되는 난소암 세포주가 복강중피세포 Met5A에 대해 부착성이 높게 나타났으며, p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통해 p53^R248 의 발현을 감소시킨 결과, p53^R248 에 의하여 증가한 부착성이 유의적으로 감소하였고, p53^R248이 Integrin β4를 포함한 부착관련 유전자들과 Akt/PI3K를 포함하고 있는 신호경로를 조절하는 것을 확인함으로써, 상기 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

안티센스 뉴클레오티드

안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

펩티드 미메틱스( Peptide Minetics )

상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 VGLL1 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서 VGLL1 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. J Med Chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al. in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al. Biochem Biophys Res Commun 126:419 1985) 및 치환 감마락탐환(Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.

siRNA 분자

센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 VGLL1 mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 siRNA 분자는VGLL1 유전자의 염기서열 내에서 선택되는 10개 내지 30개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, VGLL1 유전자의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.

항체

상기 항 VGLL1 항체는 항 VGLL1의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 다클론 항체는 상기 VGLL1를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984). 또한, 상기 VGLL1에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989). 상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.

앱타머( Aptamer )

앱타머 (Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 압타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346:818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히화학 항체라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다.

상기 조성물은 p53^R248 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 p53^R248 단백질 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

상기 p53^R248 단백질을 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 돌연변이 p53^R248 단백질이 발현되는 난소암 세포주가 복강중피세포 Met5A에 대해 부착성이 높게 나타났으며, p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통해 p53^R248 의 발현을 감소시킨 결과, p53^R248 에 의하여 증가한 부착성이 유의적으로 감소하였고, p53^R248이 Integrin β4를 포함한 부착관련 유전자들과 Akt/PI3K를 포함하고 있는 신호경로를 조절하는 것을 확인함으로써, 상기 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 항암 보조제 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 p53^R248 단백질 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 전이 예방 및 억제용 건강식품을 제공한다.

따라서, 본 발명의 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 돌연변이 p53^R248 단백질이 발현되는 난소암 세포주가 복강중피세포 Met5A에 대해 부착성이 높게 나타났으며, p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통해 p53^R248 의 발현을 감소시킨 결과, p53^R248 에 의하여 증가한 부착성이 유의적으로 감소하였고, p53^R248이 Integrin β4를 포함한 부착관련 유전자들과 Akt/PI3K를 포함하고 있는 신호경로를 조절하는 것을 확인함으로써, 상기 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 암 전이 예방 및 억제용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) 실험군으로 암 세포에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 처리된 세포에서 p53^R248 단백질 또는 integrin β4의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 p53^R248 단백질 또는 integrin β4의 발현량이 대조군과 비교하여 감소 된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 2)의 p53^R248 단백질 또는 integrin β4의 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerases Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 돌연변이 p53^R248 단백질이 발현되는 난소암 세포주가 복강중피세포 Met5A에 대해 부착성이 높게 나타났으며, p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통해 p53^R248의 발현을 감소시킨 결과, p53^R248 에 의하여 증가한 부착성이 유의적으로 감소하였고, p53^R248이 Integrin β4를 포함한 부착관련 유전자들과 Akt/PI3K를 포함하고 있는 신호경로를 조절하는 것을 확인함으로써, 상기 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포배양

인간 난소암 세포(human ovarian cancer cell) SKOV-3, A2780, OVCAR-3, 인간 유방암 세포(human breast cancer cell) MCF-7, 인간 자궁내막암 세포(human endometrial cancer cell) Hec1A, 인간 췌장암 세포(human colon cancer cell) HT29 및 인간 복강중피세포(human mesothelial cell) Met5A를 American Type Culture Collection에서 입수하였다. 상기 세포는 5% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 ug/mL 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)가 포함된 RPMI-1640에서 배양하였다.

< 실시예 2> 돌연변이 p53 ^R248 단백질의 세포 부착력 증가 효과 확인

<2-1> p53 단백질을 발현하는 암 세포주 제작

248번 코돈(codon)의 점돌연변이 p53(p53^R248) 서열번호 5(표 2)(http://www.addgene.org)에서 pCMV-Neo-Bam p53^R248 플라스미드, pCMV-Neo-Bam p53 야생형(wild-type) 플라스미드를 구입하였다. 그런 다음, 제조사의 방법에 따라 리포펙타민(Invitrogen, CA)를 이용하여 100 nmol/L의 최종 농도에서 상기 플라스미드를 <실시예 1>에서 배양한 세포에 형질전환 하였다. 또한, 대조군으로는 빈벡터를 이용하여 형질전환하였다. 아울러, 1 ug/ml 네오마이신 존재하에서, 안정적으로 형질전환된 SKOV-3^BB(P53 야생형으로 형질전환된 인간 난소암 세포), 및 SKOV^R248(p53^R248이 형질전환된 인간 난소암 세포)를 제작하였다. 또한, p53 야생형이 형질전환된 암세포주(A2780 및 MCF-7)^, 및P53 돌연변이가 형질전환된(Hec1A, OVCAR-3, HT29) 세포를(Petitjean et al., 2007; Yaginuma and Westphal, 1992)에 기재된 방법으로 제작하였다.

<2-2> 암세포주에서 p53 단백질의 발현 여부 확인

상기 <2-2>에서 제조된 암세포 주에서 p53 단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 배양한 세포를 차가운 PBS로 세척하였으며, 단백질 완충용액(lysis buffer, intron Biotechnology, 대한민국)을 사용하여 세포에서 단백질을 추출하였고, 추출된 상기 단백질의 농도는 브래드포드 분석(Bradford Assay) 방법을 이용하여 측정하였다. 세포 용해물(cell lysate)의 단백질 샘플을 동량의 5 × SDS 샘플 버퍼와 혼합하였고, 4분 동안 가열하였다. 상기 정량된 단백질을 10% 내지 12% SDS-폴리아미드 겔에 전기영동(SDS-polyamide gel electrophoresis)하여 분리한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Polyvinyliden difluoride Membrane,PVDF)에 전기적으로 이동시킨 후, 5% 탈지 유(skim milk)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)을 시켰다. 그 뒤, 0.1% Tween-20을 함유한 트리스완충용액(Tris-buffered saline, TBS)에 특정 1차 항체(Santacruz)를 포함하여 4℃에서 반응시켰다. 사용한 특정 1차 항체를 제거하기 위하여 트리스완충용액(TBS-T)으로 3번 세척하였고, 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase, HRP)가 결합된 2차 항체(Jackson lab)를 1:1000 내지 1:2000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 증강 화학발광법(enhanced chemiluminescence) 및 image quant LAS-4000(Fujifilm Life Science, Japan)을 사용하여 면역 포지티브 밴드(immunopositive bands)를 시각화하였다.

그 결과, 도 1 A에 나타낸 바와 같이, 돌연변이 p53을 가진 Hec1A, OVCAR-3 및 HT-29 세포에서 야생형 P53 단백질이 형질전환된 A2780 및 MCF-7 세포와 비교하여, p53 단백질의 발현을 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1A).

<2-3> 난소암에서 p53 돌연변이의 복강중피세포주 Met5A 에 부착력 증가 효과 확인

난소암에서 p53 돌연변이의 복강중피세포(Met5A)에 대한 부착력 증가 효과를 확인하기 위하여, 형광 마이크로 포토그라피(올림푸스) 및 Scion Image 소프트웨어(Scion Corp, Frederick, MD, USA)를 사용하여 수행하였다.

구체적으로, 인간 중피(human mesothelial cell) Met5A 세포를 96-웰 플레이트에 8 X 10⁴ 세포/웰 농도로 분주하여 배양하였다. 난소암 세포는 상기 세포에 트립신을 처리하여 분리하였고, 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)를 사용하여 상기 세포를 세척하였으며, 10 mol/L CellTracker^TM을 사용하여 45분 동안 37℃에서 반응시켰다. CellTracker^TM을 사용하여 염색시킨 상기 세포를 0.1% FBS가 포함된 RPMI-1640을 사용하여 세척하였고, 인간 중피 세포 위에 2 X 10⁴ 세포/웰 농도로 첨가한 후 60분 동안 37℃에서 배양시켰다. 부착되지 않은 세포는 세척하여 제거하였고, 각 웰 당 총 형광은 형광 마이크로 포토그라피(올림푸스)를 사용하여 시각화하였다. Scion Image 소프트웨어(Scion Corp, Frederick, MD, USA)를 사용하여 픽셀에서 형광의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 248번 코돈(codon)의 점 돌연변이 p53^R248를 가진 난소암 세포주인 OVCAR-3이 야행성 P53을 가진 난소암 세포주인 A2780 보다 복강중피세포주인 Met5A에 대해 약 24배 이상의 부착성을 갖는것을 확인하였다(도 1B).

<2-4> p53 돌연변이 녹다운( knockdown )을 통한 세포 부착 억제 효과 확인

p53 돌연변이 녹다운(knockdown)을 통한 세포 부착 억제 효과를 확인하기 위하여, p53 siRNA를 사용하여 p53 돌연변이를 녹다운 한 후, 세포 부착 억제효과를 확인하였다.

구체적으로, p53 siRNA(small interfering RNA)는 Bioneer technology(Republic of Korea)를 사용하여 합성하였다. 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 OVCAR-3 및 A2780 세포에 제조사에서 제공된 프로토콜에 따라 리포펙타민(invitrogen) 및 100 nM p53 특이적인 siRNA 또는 100 nM 대조군(control siRNA) 서열번호 7(표 2)로 형질감염(transfection) 시킨 후, 상기 동일한 방법으로 세포 부착효과를 확인하였다.

그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이, OVCAR-3 세포에서만 유의적으로 부착력이 억제되는 것을 확인하였다(도 1C).

따라서, 돌연변이 p53^R248은 난소암의 복막접착에 관련성을 나타냄을 확인하였다.

< 실시예 3> 돌연변이 p53 ^R248 의 이소성( ectopic ) 발현의 세포부착력 증가 효과 확인

돌연변이 p53^R248의 이소성(ectopic) 발현의 세포부착력 증가 효과를 확인 하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 제조한 안정적으로 형질감염된 SKOV-3^R248 및 SKOV-3^BB 세포를 사용하여 상기 실시예 <2-3>에 기재된 방법으로 복강중피세포주인 Met5A에 대한 부착력을 확인하였다.

그 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 돌연변이 p53^R248로 안정적으로 형질감염된 SKOV-3 세포에서 복강중피세포주인 Met5A에 대한 부착력이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 2A).

또한, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 단기적으로 형질감염된 SKOV-3^R248 세포와 야생형 p53을 발현하는 SKOV-3^WT 세포에서 부착력을 비교하였을 때, 단기적으로 형질감염된 SKOV-3^R248 세포에서 세포 부착력이 증가하는 것을 확인하였다(도 2B).

< 실시예 4> 난소암 세포 부착력에 있어서 돌연변이 p53 ^R248 의 역할 확인

난소암 세포 부착력에 있어서 돌연변이 p53^R248의 역할을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 p53 siRNA를 이용하여 p53 돌연변이를 녹다운한 후, 세포 부착력을 확인하였다.

그 결과, 도 3A 및 도 3B에 나타낸 바와 같이, 복강중피세포주인 Met5A에 대한 p53^R248-매개 암세포 부착력은 p53 돌연변이의 하향조절(dwon-regulated)에 의해 완전히 억제되는 것을 확인하였다. 그 반면, p53 siRNA를 사용하여 형질감염된 SKOV-3^BB 및 SKOV-3^WT 세포에서 세포 부착력에 대한 어떠한 변화도 일어나지 않는 것을 확인하였다(도 3A 및 도 3B).

< 실시예 5> 돌연변이 p53 ^R248 에 의해 세포 부착력과 관련된 유전자 및 경로( pathway )조절 확인

실시예 <5-1> microarray 분석

돌연변이 p53^R248에 의해 세포 부착력과 관련된 유전자를 확인하기 위하여, Agilent WHole Human Genome Microarray(G4112F, Agilent, Foster City, CA) 및 David(http://david.abcc.ncifcrf.gov/) 분석을 수행하여 확인하였다.

구체적으로, SKOV-3^R248 세포 및 SKOV-3^BB 세포에서 각각 다르게 발현되는 유전자를 선별하는 분석을 하기 위하여, Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery(Huang da et al, 2009; Huang da et al, 2007) 프로그램을 사용하였다. 그런 다음, 디폴트 파라미터(default parameters), 유전자 어휘분류체계-분자 기능(Gene Ontology-Molecular Function) 및 유전자-어휘분류체계-생물학적(Gene-Ontology-Biological) 방법을 이용하여 functional Annotation Tool(http://david.abcc.ncifcrf.gov/) 을 수행하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 어휘분류체계(ontology) 군에서 p53^R248의 이소성 발현 후, 유의적으로 변화하는 것을 확인하였다. 아울러, 어휘분류체계 군에서 세포 부착력(cell adhesion), 생물부착력(biological adhesion), 세포증식(cell proliferation)의 조절 및 세포-세포 부착력(cell-cell adhesion)이 최대 점수로 나타나는 것을 확인하였다.

<5-2> 돌연변이 p53 ^R248 에 의해 조절되는 접착력 관련 유전자 분석

돌연변이 p53^R248 에 의해 조절되는 접착력 관련 유전자의 관계를 확인하기 위하여, Ingenuity Pathway Analysis system을 이용하여 네트워크 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, Akt 및 integrin을 포함한 분자 허브(molecular hub)를 네트워크에서 확인하였다(도 4).

< 실시예 6> p53 ^R248 유도된 난소암- 복강중피세포 부착력에 있어서 Integrin β4 관련성 확인

<6-1> 암세포 부착력에 있어서 인테그린 ( Integrin ) 관련성 확인

암세포 부착력에 있어서 인테그린(Integrin) 관련성 확인을 하기 위하여, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 수행하였다.

구체적으로, SKOV-3^R248, SKOV-3^BB, SKOV-3 ^WT, A2780 및 OVCAR-3 세포에서 TRIzol(Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada)을 사용하여 당업계에 알려진 방법으로 총 RNA를 추출하여, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하여 first-strand cDNA로 역전사 하였다. PCR로 증폭한 상기 합성된 firststrand cDNA를 주형으로 하여, Thermal Cycler Dice Real Time PCR System(Takara, Japan)을 이용하였다. 상기 SYBR Green real-time PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같으며, 모든 mRNA의 해리곡선(dissociation curve) 분석은 단일 피크로 나타내었다. 실시간 PCR(qPCR)은 검출을 위하여 PCR은 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(Bioneer, Daejeon, Korea)과 SYBR Green dye (Takara Bio, Japan)을 이용하여 수행하였다. qPCR 조건은 95℃에서 30초, 뒤이어 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 및 72℃에서 30초로 45 사이클을 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 수행하였다. 모든 유전자의 mRNA 양은 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 내부 대조군의 Ct 값에 의해 표준화하였다. 한편, CD9의 하향조절(dwon regulation)은 인간 난소암 세포에서 세포 부착력을 감소시킬 수 있으며, 복막(peritoneal) 투여(dissemination)에 관여할 수 있는 유전자로 보고되어있다(Furuya et al., 2005). L1 세포 부착 분자(L1 cell adhesion molecule. L1CAM)는 세포 사이에서 부착하는 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Kiefel et al). S1P₁는 의존적 수용체(dependent receptor)로 세포-표면에 수송하고 세포-세포 부착 분자 N-cadherin의 활성을 나타내며, 세포-세포 간의 상호작용을 하는 것으로 보고되어 있다(Paik et al., 2004). Plakophilin-2(PKP2)는 세포-세포의 싸이토플라스믹 플레이크(cytoplasmic plaque)에서 중요한 조절 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Rickelt). ICAM-2를 사용하여 형질전환시킨 위 암세포의 부착력을 증가시키는 것으로 보고되어 있으며(Tanaka et al., 2004), 종양 세포에서 생성되는 thrombospondin-1(THBS-1)은 암 세포 부착력의 조절에 관련되어 있는 것으로 보고 되고 있다(Albo et al., 2000).

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, SKOV-3^R248 세포와 SKOV-3^BB 세포에서 CD9, L1CAM, S1PR1, PKR2, ICAM2, THBS-1 및 Integrin β4 유전자를 비교하였을 때, SKOV-3^R248 세포에서 상기 7개의 세포 부착력 분자 모두 유의적으로 상향-조절(up-regulation)하는 것을 확인하였다(도 5).

서열번호	서열
ITGB4, sense primer(서열번호 1)	5'-cat gag gcc tga gaa gct ga-3'
ITGB4, antisense primer(서열번호 2)	5'- atc cag gtt gcc tga gat cc-3'
GAPDH, sense primer(서열번호 3)	5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3'
GAPDH, antisense primer(서열번호 4)	5'-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3'
R248W(서열번호 5)	meepqsdpsv epplsqetfs dlwkllpenn vlsplpsqam ddlmlspddi eqwftedpgp deaprmpeaa prvapapaap tpaapapaps wplsssvpsq ktyqgsygfr lgflhsgtak svtctyspal nkmfcqlakt cpvqlwvdst pppgtrvram aiykqsqhmt evvrrcphhe rcsdsdglap pqhlirvegn lrveylddrn tfrhsvvvpy eppevgsdct tihynymcns scmggmnwrp iltiitleds sgnllgrnsf evhvcacpgr drrteeenlr kkgephhelp pgstkralsn ntssspqpkk kpldgeyftl qirgrerfem frelnealel kdaqagkepg gsrahsshlk skkgqstsrh kklmfktegp dsd
TP53 siRNA(서열번호 6)	CACUACAACUACAUGUGUA(dTdT) UACACAUGUAGUUGUAGUG (dTdT)
Control siRNA(서열번호 7)	CCUACGCCACCAAUUUCGU (dTdT) ACGAAAUUGGUGGCGUAGG (dTdT)

<6-2> 돌연변이 p53 ^R248 매개 난소암세포 부착력이 복강중피세포에 있어서 Integrin β4 관련성 확인

돌연변이 p53^R248 매개 난소암세포 부착력이 복강중피세포에 있어서 Integrin β4 관련성 확인을하기 위하여, 실시예 <6-1>에 기재된 RT-PCR 방법을 사용하여 실시예 <2-1>에서 제조한 SKOV-3 세포에서 Integrin β4의 mRNA 수치를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, p53^R248의 이외성 발현이 Integrin β4 발현을 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였다(도 6). 또한, 내재적으로 p53^R248이 발현된 OVCAR-3 세포와 야생형 p53이 발현된 A2780 세포에서 integrin β4의 발현 수치를 비교하였을 때, 내재적으로 p53^R248이 발현된 OVCAR-3 세포에서 integrin β4의 발현 수치가 더 높게 나타나는 것을 확인하였다. 아울러, p53 siRNA를 사용하여 돌연변이를 녹다운 시켰을 때, OVCAR-3 세포에서 integrin β4 발현의 수치가 억제되는 것을 확인하였다.

<6-3> p53 ^{R248 -} 매개 난소암- 중피세포 부착력에 있어서 integrin β4 항-ITGB4(anti-ITGB4)의 효과 확인

p53^{R248 -} 매개 난소암-중피세포 부착력에 있어서 integrin β4 항-ITGB4(anti-ITGB4, blockage antibody)의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <2-3>에 기재된 방법으로 수행하여 확인하였다.

구체적으로, 형질 감염된 SKOV-3^BB 세포 및 A2780 세포에 integrin β4 항-ITGB4(anti-ITGB4, blockage antibody) 및 대조군 항체를 30 분 동안 첨가하여 반응 시킨 후, 상기 실시예 <2-3>에 기재된 방법으로 부착력을 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 항-ITGB4(anti-ITGB4, blockage antibody)는 Met5A 세포에 대한 SKOV-3^R248 세포 및 OVCAR-3 세포의 부착력을 유의적으로 억제시키는 것을 확인하였고. 따라서, 돌연변이 p53-매개 난소암-복강중피 세포 부착력에서 integrin β4 발현이 잠재적으로 관련되어 있음을 확인하였다(도 7).

< 실시예 7> p53 ^R248 이 유도된 난소암- 복강중피 세포 부착에 대한 PI3K / Akt 경로( pathway ) 확인

p53^R248이 유도된 난소암-복강중피 세포 부착에 대한 PI3K/Akt 경로(pathway)를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 수행하여 확인하였다. 국소 부착 키나제(focal adhesion kinase, FAK)는 integrin의 다운스트림(downstream) 신호 분자로 알려져 있으며(Mitra and Schlaepfer, 2006; van Nimwegen and van de Water, 2007), 상기 FAK는 Akt 및 PI3K와 같은 인산화 다운스트림 타겟에 의해 세포 부착력 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 또한, Ingenuity 경로 분석을 통해 p53^R248-조절 유전자에 대한 분자 허브(molecular hub)로 Akt를 확인하였다.

그 결과, 도 8A에 나타낸 바와 같이, p53^R248의 이소성 발현이 유발되어 FAK 및 PI3K 의 인산화가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 8A).

또한, 도 8B에 나타낸 바와 같이, PI3K/Ark 억제제인 월스맨닌( worthmannin, phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor) 및 LY294002는 p53^R248에 의해 유도된 중피 Met5A 세포에 대한 부착력을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 8 B). 아울러, SKOV-3^R248 세포와 SKOV-3^BB 세포 부착력에서 FAK 억제를 비교하였을 때, SKOV-3^BB 세포 부착력에서 FAK 억제가 비슷한 것을 확인하였다. 이에 따른 결과는 PI3K/Ark 분자만 p53^R248이 유도된 난소암-복강중피 세포 부착에 관련이 있는 것을 확인하였다.

따라서, 돌연변이 P53인 P53^R248이 난소암의 복강중피세포에 대한 부착성을 증가시킬 수 있으며, 이러한 부착성의 증가는 integrin β4와 Akt signaling과 연관이 있음을 확인하였다.

< 실시예 9> 통계 분석

통계적 유의성을 평가하기 위하여 모든 결과는 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, One-Way ANOVA를 수행한 후, 듀네트 테스트(Dunnett's test) 를 수행하고 P-값을 획득하였다. 상기 획득한 P-값은 0.05 이하 수준으로 유의성을 결정하였다.

<110> University-Industry Cooperation Croup of Kyung Hee University <120> Composition comprising expression or activity inhibitors of p53R248 protein for the prevention of cancer metastasis and treatment of cancer <130> 13P-09-21 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGB4SENSE <400> 1 Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Cys Thr Gly Ala 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGB4ANTISENSE <400> 2 Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Thr Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Thr Cys Cys 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDHSENSE <400> 3 Gly Ala Gly Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly 1 5 10 15 Thr Cys Gly Thr 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDHANTISESNE <400> 4 Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Thr 1 5 10 15 Cys Thr Cys Gly 20 <210> 5 <211> 393 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Trp Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 His Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Ser Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 6 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53siRNA <400> 6 cacuacaacu acauguguau acacauguag uuguagug 38 <210> 7 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ControlsiRNA <400> 7 ccuacgccac caauuucgua cgaaauuggu ggcguagg 38

Claims (12)

1. 돌연변이 p53^R248 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 돌연변이 p53^R248 단백질은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, p53^R248 단백질 발현 억제제는 p53^R248 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(Short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서, p53^R248 유전자의 siRNA는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, p53^R248 단백질의 활성 억제제는 p53^R248 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미멕틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 전이 예방 또는 억제용 약학적 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 암은 난소암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 결핵암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 intergrin β4 유전자 활성을 억제하는 것을 특징으로하는 암 전이 예방 및 억제용 약학적 조성물.
   
8. p53^R248 단백질 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조제.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 p53^R248 단백질을 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
   
10. p53^R248 단백질 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 전이 예방 및억제용 건강식품.
    
11. 1) 실험군으로 암 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 처리된 세포에서 p53^R248 단백질 또는 integrin β4의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 p53^R248 단백질 또는 integrin β4의 발현량이 대조군과 비교하여 감소 된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법.
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 단계 2)의 p53^R248 단백질 또는 integrin β4의 발현정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerases Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법.

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