WO2019209048A2 - Hmgb1, itpkc, 또는 slc11a1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법 - Google Patents

Hmgb1, itpkc, 또는 slc11a1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법 Download PDF

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남지호
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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting Kawasaki disease symptoms using HMGB1, ITPKC, or SLC11A1 gene polymorphism.
  • Kawasaki disease is an acute febrile rash that occurs mainly in infants under five years of age, although its cause is not known, but systemic vasculitis of the system is a major condition. Korea has the second highest prevalence after Japan, and coronary artery lesions can occur if not treated with IVV. In developed countries, Kawasaki disease is the most common cause of acquired heart disease. However, until now, there is no specific test for diagnosing Kawasaki disease, and only diagnosis is performed according to clinical criteria. The most characteristic clinical symptoms for diagnosis are erythema and sclerosis at the BCG injection site. In addition, intravenous immunoglobulin resistance often occurs in patients with Kawasaki disease, which is difficult to treat.
  • Kawasaki disease The symptoms of Kawasaki disease are similar to those of other infectious diseases, and the progression of the disease is usually limited naturally. For this reason, Kawasaki disease was once considered an infectious disease. However, since infectious organisms are not isolated from patients, and geographic and kinetic ties are high, it has recently been regarded as an expression disease caused by genetic predisposition.
  • SNP single-nucleotide polymorphism
  • the present invention has been made to solve the above conventional technical problems, and relates to a method for predicting Kawasaki disease symptoms using HMGB1, ITPKC, or SLC11A1 gene polymorphism.
  • the method of predicting symptoms of the present invention is expected to be widely used in the medical field because it is possible to predict in advance the possibility of various symptoms including coronary artery lesion formation or intravenous immunoglobulin resistance in patients with Kawasaki disease.
  • the present invention has been made to solve the above conventional technical problems, and relates to a method for predicting Kawasaki disease symptoms using HMGB1, ITPKC, or SLC11A1 gene polymorphism.
  • KD Kawasaki disease
  • Kawasaki's disease often presents with typical clinical symptoms, but often does not show all atypical features. Typical symptoms include high fever above 38.5 ° C, swelling of the extremities, irregular rashes of the skin, redness of the bilateral conjunctiva, redness and cracking of the lips, strawberry tongue, redness of the oral mucosa, non-purulent cervical lymph node swelling, BCG inoculation site There is redness. Fever is usually unresponsive to antibiotics, fever usually lasts for more than one to two weeks, and in some cases for three to four weeks. In the early stages, they are severely ill and sometimes have diarrhea, abdominal pain, digestive problems, and coughing. Myocarditis, mild pericardial effusion, and valve regurgitation are commonly observed due to heart involvement.
  • Subacute phase is characterized by desquamation around the finger, toe tip and anus, increased platelet counts and the highest risk of sudden death from coronary aneurysms. Giant coronary aneurysms are complications at risk of myocardial infarction due to rupture, narrowing, and clot closure.
  • the recovery phase is the time when all these clinical symptoms begin to disappear, and blood test findings are normalized.
  • HMGB1 High mobility group box 1
  • HMGB1 High mobility group box 1
  • the HMGB1 gene is a gene encoding the HMGB1 protein. Recent studies by Hoshina T et al. (Scand J Rheumatol 2008; 37: 445-9.) And Eguchi T et al. (Pediatr Infect Dis J 2009; 28: 339-41.) The relationship between serum HMGB1 levels and Kawasaki disease has been reported in, but there are few studies on specific SNPs affecting Kawasaki disease in HMGB1.
  • “genetic information” is a broad concept that collectively refers to all information that is encoded as a nucleotide sequence of DNA.
  • “genetic information” includes base polymorphism information of an individual. All genetic information including sequences (base sequences), and nucleotide polymorphism information of genes including genes HMGB1, ITPKC, and SLC11A1, used in the present invention, can be found in the National Center for Biotechnology Information (NCBI). , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) can be obtained from a database well known to those skilled in the art.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • SNPs are common mutations that occur in one of several DNA bases in a single region of a chromosome. About 3 million SNPs exist in the human genome, one per 500-1,000 bases, about 20 It is estimated that 10,000 are cSNPs present in the genes that make proteins.
  • SNPs are frequent, stable, and distributed throughout the genome, resulting in genetic diversity of the individual.
  • some people in the DNA chain have adenine (A) while others have cytosine (C).
  • A adenine
  • C cytosine
  • SNPs microscopic differences
  • the ultimate goal of human genome research is to be able to develop drugs that can be used to prevent or treat hepatitis.
  • real-time polymerase chain reaction also called real-time polymerase chain reaction, quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR), target DNA
  • RT-PCR refers to reverse transcription polymerase chain reaction, not real-time PCR. But not all those skilled in the art name this clearly.
  • Real-time polymerase chain reaction can detect the absolute number or relative number of gene copies for one or more specific sequences in a DNA sample.
  • the progress of the experiment follows the general polymerase chain reaction.
  • An important feature is that the amplified DNA is measured in real time. This is the difference from the basic polymerase chain reaction where DNA is observed at the end.
  • Two general methods are used in real time polymerase chain reaction. (1) an unspecified fluorescence stain that can intervene in any DNA double helix, (2) a sequence-specific DNA probe consisting of oligonucleotides, labeled with the reporter, and detected after binding to complementary DNA targets.
  • real-time polymerase chain reactions are performed in combination with reverse transcription polymerase chain reactions to quantify mRNAs of cells or tissues and non-coated RNA (non-coding RNA).
  • gene expression inhibition means inhibiting gene expression with antisense oligonucleotides, siRNAs, shRNAs and microRNAs complementary to the gene sequence.
  • the antisense oligonucleotides are short length DNA synthesis strands (or DNA analogs) that are antisense (or complementary) to specific DNA or RNA targets and are used to achieve gene-specific inhibition both in vivo and ex vivo.
  • Antisense oligonucleotides have been proposed to prevent the expression of a protein encoded by a DNA or RNA target by binding to the target and stopping expression at the stage of transcription, translation or splicing.
  • Antisense oligonucleotides have been successfully used in cell culture and animal models of disease. Other modifications of antisense oligonucleotides to make them more stable and resistant to degradation of oligonucleotides are known and understood by those skilled in the art.
  • Antisense oligonucleotides as used herein include oligonucleotides having double or single stranded DNA, double or single stranded RNA, DNA / RNA hybrids, DNA and RNA analogs and base, sugar or backbone modifications. Oligonucleotides are modified by methods known in the art to increase stability and to increase resistance to nuclease degradation. These modifications include, but are not limited to, modifications to oligonucleotide backbones, modifications of sugar moieties or bases known in the art.
  • the siRNA small interfering RNA
  • the siRNA is a nucleic acid molecule that can mediate RNA interference or gene silencing, and is used as an efficient gene knockdown method or gene therapy method because it can suppress expression of a target gene.
  • the sense strand and the antisense strand may be positioned opposite to each other to have a double-chain structure or a single-chain structure having a self-complementary sense and antisense strand.
  • siRNAs are not limited to the complete pairing of double-stranded RNA pairs that pair with RNA, but include mismatches (corresponding bases are not complementary), expansion / bulge (bases corresponding to one chain). None) and the like may be included.
  • the siRNA terminal structure can be either blunt or cohesive, as long as the expression of the target gene can be suppressed by RNA interference (RNAi) effect.
  • RNAi RNA interference
  • the cohesive end structure is possible for both 3'-end protrusion structures and 5'-end protrusion structures.
  • the siRNA molecule is not limited thereto, but may have a total length of 15 to 30 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • the short hairpin RNA is a single-stranded RNA having a length of 45 to 70 nucleotides, and synthesizes oligo DNA that connects 3-10 base linkers between the sense strand of the target gene siRNA sequence and the complementary antisense strand.
  • microRNAs regulate various biological processes, including development, differentiation, proliferation, conservation and apoptosis.
  • MicroRNAs generally regulate the expression of the gene encoding the target mRNA by destabilizing the target mRNA or disrupting translation.
  • RNAs eg., constitutive promoters, inducible promoters, tissue specific promoters or combinations thereof
  • the expression inhibitor of the gene may be any material that inhibits the expression of the gene in addition to the antisense oligonucleotide, siRNA, shRNA or microRNA.
  • inhibiting protein activity means inhibiting the activity of a target protein with an antibody specific for the protein or antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody means a specific protein molecule directed to an antigenic site as a term known in the art.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods from the obtained proteins by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene.
  • partial peptides that may be made from such proteins, and the partial peptides of the present invention include at least seven amino acids, preferably nine amino acids, more preferably twelve or more amino acids.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included as long as they are polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding.
  • the antibody of this invention also contains special antibodies, such as a humanized antibody.
  • Antibodies of the invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • prevention refers to the association of HMGB1, ITPKC, or SLC11A1 gene with the development of Kawasaki disease symptoms, and based on the analyzed data to predict the risk before the occurrence of Kawasaki disease symptoms, It means to manage.
  • diagnosis means identifying the association between HMGB1, ITPKC, or SLC11A1 gene in Kawasaki disease symptoms, and confirming Kawasaki disease symptoms based on the analyzed data.
  • a method for predicting symptoms for Kawasaki disease comprising the step of identifying the HMGB1 gene polymorphism rs1412125 from a biological sample, and the formation of coronary lesions when the presence of the HMGB1 gene polymorphism rs1412125 is confirmed Kawasaki disease, comprising a method for predicting symptoms of Kawasaki disease comprising the step of predicting that the probability of becoming high, and comprising a step of predicting high intravenous immunoglobulin resistance when the presence of the HMGB1 gene polymorphism rs1412125 is confirmed
  • a method for predicting symptoms comprising the step of identifying the HMGB1 gene polymorphism rs1412125 from a biological sample, and the formation of coronary lesions when the presence of the HMGB1 gene polymorphism rs1412125 is confirmed Kawasaki disease, comprising a method for predicting symptoms of Kawasaki disease comprising the step of predicting that the probability of becoming high, and comprising a step of predicting
  • kits for predicting symptoms for Kawasaki disease comprising a primer for screening the HMGB1 gene polymorphism rs1412125, or a primer for genotyping, wherein the kit predicts the likelihood of a coronary lesion being formed. It provides a kit for predicting symptoms for Kawasaki disease, which provides a kit for predicting symptoms for Kawasaki disease that predicts intravenous immunoglobulin resistance.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating Kawasaki disease comprising an inhibitor of expression of the HMGB1 gene polymorphism rs1412125, or an activity inhibitor of a protein expressing the HMGB1 gene polymorphism rs1412125 as an active ingredient, and the expression inhibitor
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of Kawasaki disease which is any one or more selected from the group consisting of antisense oligonucleotides,? SiRNAs, shRNAs, and microRNAs specific for the HMGB1 gene polymorphism rs1412125, wherein the activity inhibitor of the expressed protein is the HMGB1 gene.
  • It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Kawasaki disease, which comprises an antibody specific for polymorphism rs1412125, or an antigen-binding fragment thereof, wherein the pharmaceutical composition comprises a pharmaceutical composition for preventing or treating Kawasaki disease, which treats coronary artery lesions.
  • the pharmaceutical composition Provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of Kawasaki disease to decrease the intravenous immunoglobulin resistance.
  • a method for predicting the onset of Kawasaki disease comprising identifying the ITPKC gene polymorphism rs2290692 from a biological sample, and wherein the sample is a sample of an individual less than 24 months old, the ITPKC gene polymorphism. further comprising identifying rs28493229, ITPKC gene polymorphism rs10420685, or SLC11A1 gene polymorphism rs2276631, and predicting an increase in the number of leukocytes in said individual when the presence of said ITPKC gene polymorphism rs28493229 is identified.
  • It provides a method for predicting onset comprising, and when the presence of the ITPKC gene polymorphism rs2290692 is confirmed to provide a predictive method comprising the step of predicting the erythrocyte sedimentation rate abnormalities of the individual, the presence of the ITPKC gene polymorphism rs10420685 If lactic acid dehydrogenase of the subject is identified It provides a method for predicting onset comprising the step of predicting the rise of the value, and predicting the onset comprising the step of predicting the aspartate aminotransferase abnormalities of the individual when the presence of the SLC11A1 gene polymorphism rs2276631 is confirmed Provide a method.
  • the present invention also provides a method for predicting the onset of Kawasaki disease, further comprising the step of identifying the ITPKC polymorphism rs28493229 or the SLC11A1 polymorphism rs17235409 when the sample is a sample of an individual for 24 months or more, and the ITPKC gene polymorphism rs28493229
  • a method for predicting onset comprising predicting an increase in platelet levels in the subject when the presence is confirmed, and predicting an increase in the level of lactate dehydrogenase in the subject when the presence of the SLC11A1 polymorphism rs17235409 is confirmed. It provides a method for predicting onset comprising a.
  • identifying the presence of the ITPKC gene polymorphism rs2561531 and SLC11A1 gene polymorphism rs17221959 from a biological sample and (b) when the rs2561531 and rs17221959 is present, providing a method for predicting the risk of expression of Kawasaki disease symptoms comprising the step of determining that the probability of expression of Kawasaki disease symptoms is low, the sample is a sample of individuals less than 24 months Provide a prediction method.
  • identifying the presence of ITPKC polymorphism rs28493229 and SLC11A1 polymorphism rs17235409 from a biological sample and (b) predicting the occurrence of erythema at the BCG injection site in the presence of rs28493229 and rs17235409, wherein the sample is a sample of an individual of 24 months or more.
  • kits for predicting the onset of Kawasaki disease comprising a primer for screening, or genotyping of the ITPKC gene polymorphism rs2290692, the kit is ITPKC polymorphism rs28493229, rs10420685, rs2561531, SLC11A1 gene polymorphism rs2276631, rs17235409, rs17221959, and rs77624405 provides a kit further comprising any one or more screening primers, or genotyping primers selected from the group consisting of.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating Kawasaki disease comprising an inhibitor of expression of the ITPKC gene polymorphism rs2290692, or an activity inhibitor of the protein expressing the ITPKC gene polymorphism rs2290692 as an active ingredient
  • the pharmaceutical composition Is a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient any one or more expression inhibitors selected from the group consisting of ITPKC gene polymorphism rs28493229, rs10420685, rs2561531, SLC11A1 gene polymorphism rs2276631, rs17235409, rs17221959, and rs77624405, or an activity inhibitor of expressed protein.
  • the expression inhibitor provides a pharmaceutical composition of any one or more selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, siRNA, shRNA and microRNA specific to the ITPKC gene polymorphism rs2290692, wherein the activity inhibitor of the expressed protein is the ITPKC gene. All It provides a pharmaceutical composition comprising an antibody specific for formation rs2290692, or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention relates to a method for predicting Kawasaki disease symptoms using the HMGB1 gene polymorphism, and the method for predicting symptoms of the present invention can predict in advance the possibility of coronary artery lesion formation or intravenous immunoglobulin resistance in patients with Kawasaki disease. It is expected to be widely used in medicine.
  • the method of predicting Kawasaki disease onset using the ITPKC and SLC11A1 gene polymorphisms of the present invention is to apply the synergistic effect between the ITPKC gene and the SLC11A1 gene and the Kawasaki disease characteristic, which is characteristic of Koreans. Because it is predictable, it is expected to be widely used in the medical field.
  • Example 1-1 Sequencing of HMGB1 Gene from Samples of Patients with Kawasaki Disease
  • Coronary artery lesions (CAL) in the patient and control children were measured by echocardiography as an aneurysm (Z score> 2.5) according to the American Heart Association (AHA) and the Japanese Ministry of Health.
  • IVIG Intravenous immunoglobulin resistance was defined as the presence of fever (38 ° C. or higher) that persisted or recurred for at least 36 hours after completion of intravenous immunoglobulin treatment.
  • Table 1 shows the results of coronary artery lesion formation and intravenous immunoglobulin resistance in Kawasaki disease patients and controls.
  • Genomic DNA for each whole blood sample obtained from 24 subjects (12 patient groups and 12 controls) was extracted using a QIAmp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), and an Epoch microplate spectrophotometer (BioTek, Winooski) , VT, USA).
  • HMGB1 gene of each sample was sequenced. Genomic sequences for analysis were obtained from the GenBank (http: //www.ncbi/nlm.nih.gov/) database, and PCR primers for amplifying the exon and promoter regions of genes were prepared using Primer3 software (http: //carbon.bineer). .com / primer3plus) was used to design PCR primers that amplified the exon and promoter regions of genes.
  • PCR reactions were designed with a total volume of 30 ⁇ l comprising 2.5 mM MgCl 2 , 10 ⁇ reaction buffer, 2.5 mM of each dNTP, 0.5 ⁇ M of each primer, 0.25 U of Taq DNA Polymerase (SolgTM), and 10 ng of genomic DNA, PCR was performed under the conditions of Table 2.
  • PCR products were purified using MEGA quick-spin total Fragment DNA purification kit (iNtRON Biotechnology, Korea), and BigDye Terminator chemistry on ABI Prism 3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was prepared according to the manufacturer's protocol. Were sequenced. DNA polymorphism was confirmed using the PolyPhred program (http://droog.gs.washington.edu/polyphred/). Tagging SNPs were selected using Haploview software version 4.2 (Availability: http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/).
  • PCR comprises a TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) containing 15 ng of genomic DNA, and 40 nano TaqMan SNP Genotyping Assays using QuantStudio TM 6 Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems). The final volume was 10 ⁇ l, but the temperature conditions were initially denatured at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 15 seconds of denaturation at 95 ° C., and elongation at 60 ° C. for 1 minute in 45 cycles. After PCR, fluorescence was measured and analyzed using QuantStudio TM 6 FlexReal-Time PCR software v1.2 (Applied Biosystems).
  • Example 1-2 Association analysis of HMGB1 gene from samples of patients with Kawasaki disease
  • Example 1 All statistical analyzes on the data of Example 1 were performed using R software (version 3.4.0) on the Windows 10 platform. Statistical differences in genotype and allele frequencies between patients with Kawasaki disease and controls were assessed using the ⁇ 2 test or Fisher's exact test. Statistical differences in genotype and allele frequencies in children with Kawasaki disease with and without coronary lesion formation and patients with intravenous immunoglobulin resistance or susceptibility were evaluated by the ⁇ 2 test, and the Bonferroni test was used to calibrate several test values. . Binary multiple logistic regression analyzes for odds ratio (OR), 95% CI (confidence interval), and corresponding P values were performed by age and gender.
  • OR odds ratio
  • 95% CI confidence interval
  • Table 4 shows the genotype and allele frequency of the HMGB1 gene in Kawasaki disease and normal controls.
  • the subjects consisted of 265 patients with Kawasaki disease and 203 controls. Their mean age was 35.31 months in the patient group and 116.96 months in the control group. As a result, 45 out of 265 patients (17.0%) developed coronary artery lesions and 38 (14.3%) were resistant to initial intravenous immunoglobulin treatment.
  • a total of two SNPs were identified by total HMGB1 gene sequencing for causal SNP discovery. Information about the base sequence of the SNP can be found in the dbSNP database ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp ).
  • SNPs Two tagging SNPs (rs1412125 and rs117077167) were selected for genotyping based on the results of the trait analysis. Polymorphism information of the SNPs is shown in Table 3 below.
  • HMGB1 rs1412125 Base C located at 9,543 th of HMGB1 gene, is replaced by T HMGB1 rs117077167 Base G, located at 9,050th HMGB1 gene, is replaced by T
  • tagging SNPs were not significantly correlated with genotype or allele frequencies in patient and control groups under five genetic models (co-dominant, dominant, recessive, excessive, or log-added models). This is shown in Table 4 below.
  • HMGB1 SNP rs117077167 genotype did not appear to be statistically associated with intravenous immunoglobulin resistance in patients with Kawasaki disease.
  • Kawasaki disease is deeply related to the SNP of the HMGB1 gene. Especially, in the case of the SNP rs1412125 genotype, coronary lesion formation or intravenous immunoglobulin resistance in Kawasaki disease patients is high. Can know.
  • Genomic DNA for each sample obtained was extracted using a QIAmp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) and quantified using Epoch microplate spectrophotometer (BioTek, Winooski, VT, USA). To confirm, SLC11A1 and ITPKC genes of each sample were sequenced. Genomic sequences for analysis were obtained from the GenBank (http: //www.ncbi/nlm.nih.gov/) database, and PCR primers for amplifying the exon and promoter regions of genes (2 kb upstream of exon 1) were prepared using Primer3 software ( Designed using http://frodo.wi.mit.edu/primer3/).
  • PCR fragments were sequenced using BigDye Terminator chemistry on an ABI Prism 3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA) according to the manufacturer's protocol. DNA polymorphism was confirmed using the PolyPhred program (http://droog.gs.washington.edu/polyphred/). Tagging SNPs were selected using Haploview (version 4.2) and TaqMan® fluorogenic 5'- for all SNP samples selected by linkage disequilibrium (LD) analysis for full gene sequencing of SLC11A1 and ITPKC. Gene typing of the tagged SNP was performed using a nuclease assay (Applied Biosystems).
  • Example 1 All statistical analyzes on the data of Example 1 were performed using SAS software (version 9.0) on the Windows 7 platform. To test the association with Kawasaki disease, the Cochran-Armitage trend test (chi-squared test) was used to compare allele and genotype frequencies (nominal variables) in the test and control groups. Statistical significance was treated with Student's t-test, where p values less than 0.05 were considered statistically significant. Continuous variables are expressed as mean ⁇ standard deviation, and categorical variables are expressed as numbers (%).
  • the synergistic effect between SLC11A1 and ITPKC polymorphisms was analyzed using a combination of multiple loci.
  • a search for the best combination pattern of gene polymorphism was performed according to the principle of maximizing cross-validation consistency and test balance accuracy.
  • ESR erythrocyte sedimentation rate
  • CRP C-reactive protein
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Genotypes p -value Alleles p -value ITPKC CC CT TT C T rs2561531 Controls 130 (61.90) 70 (33.33) 10 (4.76) 0.957 330 (78.57) 90 (21.43) 0.856 KD patients 184 (61.54) 99 (33.11) 16 (5.35) 467 (78.09) 131 (21.91) GG GC CC G C rs28493229 Controls 178 (84.76) 32 (15.24) 0 (0.00) 0.045 388 (92.38) 32 (7.62) 0.022 KD patients 231 (77.26) 64 (21.40) 4 (1.34) 526 (87.96) 72 (12.04) AA AG GG A G rs10420685 Controls 114 (54.29) 76 (36.19) 20 (9.52) 0.836 304 (72.38) 116 (27.62) 0.777 KD patients 156 (52.17) 116 (38.80) 27 (9.03) 428 (71.57) 170 (28.43) GG GC CC G C r
  • the rs2290692 polymorphism of the Kawasaki disease group ITPKC was associated with an increase in leukocyte count, platelet count, and lactate dehydrogenase level compared to the control group. Differences were also found when dividing patients into age groups. In the low age group, leukocyte counts were associated with rs28493229 polymorphism, elevated lactate dehydrogenase levels were associated with rs10420685 polymorphism, and erythrocyte sedimentation rate was associated with rs2290692 polymorphism. However, there was no correlation in the whole group of patients who did not divide by age.
  • the increase in leukocyte counts in the older age group was associated with the rs2290692 polymorphism, which was the same in all patients who did not differentiate by age.
  • Increased platelet counts in the older age group were associated with the rs28493229 polymorphism, but not in all the patients who did not differentiate by age.
  • Elevated levels of lactate dehydrogenase in the older age group were associated with rs17235409 polymorphism in SLC111A1, and aspartate aminotransferase (AST) in the lower age group was associated with rs2276631 polymorphism. There was no SNP associated with inflammation in SLC11A1. The results are shown in Table 12.
  • the rs28493229 polymorphism of ITPKC was associated with the development of coronary lesion symptoms, but there was no correlation between ITPKC and SLC11A1 genes. The results are shown in Table 16.
  • Kawasaki disease is not a single disease entity, and the onset age, clinical symptoms, pattern of test data, and the like are deeply related to SNP.
  • the method of predicting Kawasaki disease symptoms using the HMGB1 gene polymorphism of the present invention is to investigate the association between the HMGB1 gene and Kawasaki disease symptoms. As it is predictable in advance, it is expected to be widely used in the medical field.
  • the method of predicting Kawasaki disease onset using the ITPKC and SLC11A1 gene polymorphisms of the present invention is to apply the synergistic effect between the ITPKC gene and the SLC11A1 gene and the Kawasaki disease characteristic, which is characteristic of Koreans. Because it is predictable, it is expected to be widely used in the medical field.

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Abstract

본 발명은 HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것이다. 가와사키병은 주로 5세 미만의 영유아에게서 발생하는 급성 열성 발진증으로, 정맥내 면역글로불린 (IVIG)을 적절히 사용하는 치료를 받지 않으면 관상동맥 병변이 발생할 수 있다. 그러나 가와사키병 환자에게서 정맥내 면역글로불린 저항성이 발생하는 경우가 많아, 치료에 어려움이 있는 실정이다. 본 발명의 HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법은 HMGB1 유전자와 가와사키병 증상에 있어서의 연관성을 규명하는 것으로서, 가와사키병 환자에게서 관상동맥 병변 형성 가능성, 또는 정맥내 면역글루불린 저항성이 발생할 가능성을 사전에 예측 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다. 또한 본 발명은 ITPKC 및 SLC11A1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법에 관한 것이다. 가와사키병은 주로 5세 미만의 영유아에게서 발생하는 급성 열성 발진증으로, 관상동맥 병변이 발생할 수 있으며, 선진국에서는 가와사키병이 후천성 심장병의 가장 흔한 원인으로 지목되었다. 그러나 현재까지 가와사키병 진단을 위한 특정한 검사가 부재하여 임상적 기준에 따라 진단이 이루어지고 있을 뿐이므로, 선 예방이 아닌 후 처치로만 관리가 이루어지고 있는 실정이다. 본 발명의 ITPKC 및 SLC11A1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법은 한국인 특징적으로 ITPKC 유전자와 SLC11A1 유전자의 상호 관련성 및, 가와사키병 발병에 있어서의 상승 효과를 적용하는 것으로서, 가와사키병 발병 이전에 발병 가능성 예측이 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

HMGB1, ITPKC, 또는 SLC11A1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법
본 발명은 HMGB1, ITPKC, 또는 SLC11A1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것이다.
가와사키병(Kawasaki disease; KD)은 주로 5세 미만의 영유아에게서 발생하는 급성 열성 발진증으로, 그 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 전신의 계통적 혈관염이 주된 병태이다. 한국은 일본에 이어 세계 2번째로 높은 유병율을 보이고 있는데, 정맥내 면역글로불린 (IVIG)을 적절히 사용하는 치료를 받지 않으면 관상동맥 병변이 발생할 수 있다. 선진국에서는 가와사키병이 후천성 심장병의 가장 흔한 원인으로 지목되었다. 그러나 현재까지 가와사키병 진단을 위한 특정한 검사가 부재하여 임상적 기준에 따라 진단이 이루어지고 있을 뿐이므로, 선 예방이 아닌 후 처치로만 관리가 이루어지고 있는 실정이다. 진단을 위한 가장 특징적인 임상적 증상은 BCG 주사 부위의 홍반과 경화이다. 또한 가와사키병 환자에게서 정맥내 면역글로불린 저항성이 발생하는 경우가 많아, 치료에 어려움이 있는 실정이다. 가와사키병의 증상은 다른 전염성 질환의 증상과 유사하며, 질병의 진행은 대개 자연적으로 제한된다. 이러한 이유로 한때는 가와사키병이 전염병으로 여겨졌으나, 환자에게서 감염성 원인 유기체가 분리되지 않고, 지리적 · 혈연적 유대성이 높으므로, 최근에는 유전적 소인에 의한 발현 질환으로 여겨지고 있다.
한편, 단일염기다형성(Single-nucleotide polymorphism; SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A,T,G,C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하는 것으로, 단일 염기 다형 현상은 각 개인마다 많은 변이를 보이는 부분이므로 DNA 지문 분석에 주로 이용된다.
최근 SNP를 이용한 연구에서 일본 영유아의 가와사키병과 이노시톨-3-인산화효소 (Inositol-Trisphosphate 3-Kinase C; ITPKC) 유전자가 관련성이 깊다고 보고되었다(Onouchi Y 등, Nat Genet 2008;40:35-42). 또한 자연저항성관련대식세포단백질 (Natural resistance-associated macrophage protein 1; NRAMP1 또는 SLC11A1) 유전자의 다형성도 가와사키병과 관련이 깊다고 보고되었다(Ouchi K 등, J Infect Dis 2003;187:326-9). 그러나 한국 영유아의 가와사키병과 HMGB1, ITPKC, 또는 SLC11A1 유전자 다형성의 연관성은 연구가 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, HMGB1, ITPKC, 또는 SLC11A1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명의 증상 예측 방법은 가와사키병 환자에게서 관상동맥 병변 형성 가능성, 또는 정맥내 면역글루불린 저항성을 포함하는 다양한 증상이 발생할 가능성을 사전에 예측 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, HMGB1, ITPKC, 또는 SLC11A1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 "가와사키병(Kawasaki disease; KD)"이란, 소아에서 발생하는 원인 불명의 급성 열성 혈관염으로, 전신에 다양하게 침범한다. 피부, 점막, 임파절, 심장 및 혈관, 관절, 간 등에 기능 이상을 가져올 수 있고, 위장관 장애, 담낭수종, 드물게 뇌수막 등의 염증이 나타날 수 있다.
가와사키병의 원인은 아직 불명확하지만, 현재까지는 유전학적 요인이 있는 소아가 병원체에 감염되면 과민반응이나 비정상적인 면역학적 반응을 일으켜 가와사키병이 발생한다고 추정하고 있다. 주로 5세 이하의 영유아가 전체 발생의 86%를 차지할 정도로 흔하며, 6개월에서 2세의 연령에서 가장 높은 발생 빈도를 보이고, 재발률은 3% 정도이다.
가와사키병은 전형적인 임상 증상이 나타나는 경우가 많으나, 비전형적으로 특징적인 증상이 모두 나타나지 않는 경우도 흔하다. 전형적인 증상은 38.5℃ 이상의 고열, 사지말단의 부종, 피부의 부정형 발진, 양측 안구 결막의 충혈, 입술의 홍조 및 균열, 딸기 모양의 혀, 구강 점막의 발적, 비화농성 경부 임파절 종창, BCG 접종 부위의 발적이 있다. 발열은 대개 항생제에 반응이 없으며, 열은 치료하지 않으면 대개 1~2주 이상 지속되고, 어떤 경우에는 3~4주 동안 열이 있기도 한다. 초기에는 심하게 보채며, 경우에 따라 설사, 복통, 두통 소화장애, 기침 등을 보인다. 이 때 심장의 침범으로 심근염, 경한 심낭 삼출증, 판막 역류 등이 흔하게 관찰된다. 이러한 급성기를 1~2주 겪은 후 아급성기에 접어들면서 열을 비롯한 급성기 증상들은 거의 사라진다. 아급성기는 특징적으로 손가락, 발가락 끝, 항문 주위의 막양 낙설(desquamation)을 보이고, 혈소판의 수가 증가하며, 관상 동맥류로 인한 급사의 위험이 가장 높은 시기이다. 거대 관상 동맥류는 파열, 협착, 혈전 형성 폐쇄에 의한 심근 경색의 위험이 있는 합병증이다. 회복기는 이러한 모든 임상 증상이 사라지기 시작하는 시기이며, 혈액검사 소견이 정상화된다.
관상동맥 합병증 외의 다른 임상 증상은 대체로 완전히 회복된다. 가와사키병으로 인한 사망률은 약 0.01% 정도로 보고되고 있다. 내경이 8mm 이상의 거대 관상동맥류는 완전히 회복되기 힘들며, 대개 관상동맥 혈전이나 협착이 생기기 쉽다. 그러나 관상동맥 치료 방법인 정맥내 면역글로불린 투여에 대하여 저항성이 발생하는 경우가 많아, 치료에 어려움이 있는 실정이다.
본 발명의 일 구체예에서 "HMGB1(High mobility group box 1)"이란, 활성화된 수지상 세포, 대식세포, 및 사멸 세포로부터 분비되는 단백질로, 세포 구조가 붕괴되는 손상 혹은 괴사된 세포에 의해 방출된다. 염증반응 유발에 중요한 역할을 하고, 지속적으로 유리될 경우 만성 염증반응을 유발하여 만성 질환의 중요 기전으로 활발히 연구되고 있다. HMGB1 유전자는 HMGB1 단백질을 코딩하는 유전자로, 최근 Hoshina T 등의 연구(Scand J Rheumatol 2008;37:445-9.)와 Eguchi T 등의 연구(Pediatr Infect Dis J 2009;28:339-41.)에서 혈청 HMGB1 수준과 가와사키병 사이의 연관성이 보고 되었으나, HMGB1 내에서 가와사키병에 영향을 미치는 구체적 SNP에 대한 연구는 미비한 실정이다.
본 발명의 일 구체예에서 "유전정보(genetic information)이란, DNA의 염기배열로서 부호화되는 모든 정보를 총칭하는 광의의 개념으로서, 본 발명에 있어서 "유전정보"란 개체의 염기 다형성 정보를 포함한다. 본 발명에서 사용된 유전자 HMGB1, ITPKC, 및 SLC11A1를 포함하는 유전자의 시퀀스(염기서열), 및 염기 다형성 정보를 포함하는 일체의 유전정보는 미국국립생물공학정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)와 같이 당 업계의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 데이터베이스로부터 획득 가능하다.
본 발명의 일 구체예에서 "단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)"이란, 유전자 다형성, 유전 다형성, 염기 다형성 등과 동일한 의미를 가지며, SNP로 약기된다. SNP는 염색체의 단일부위에서 여러 가지 DNA 염기들 중의 하나에 나타나는 일반적인 돌연변이로, 인간의 게놈(genome)에는 약 3백만 개의 SNP가 존재하여 약 500 ~1,000염기당 1개꼴로 나타나며, 그 중 약 20만개가 단백질을 만드는 유전자에 존재하는 cSNP일 것으로 추정된다.
SNP는 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고, 이에 의하여 개인의 유전적 다양성이 발생한다. 즉 DNA사슬의 특정부위에 어떤 사람은 아데닌(adenine; A)을 가지고 있는 반면 어떤 사람은 시토신(cytosine; C)을 가지고 있는 것이다. 이런 미세한 차이(SNP)에 의하여 각 유전자의 기능이 달라질 수 있고 이런 것들이 상호 작용하여 서로 다른 모양의 사람을 만들고 서로 다른 질병에 대한 감수성의 차이를 만들어 낸다. 따라서 예를 들어, 간염에 걸리는 사람과 걸리지 않는 사람 간의 유전적 차이를 찾아낼 수 있다면 어떤 이유에서 간염에 대한 감수성이 달라지는지의 기능을 알아낼 수 있게 된다. 이를 이용하여 간염의 예방이나 치료에 사용되는 약품을 개발할 수 있을 것이라는 것이 인간유전체 연구의 궁극적인 목적이다.
본 발명의 일 구체예에서 “리얼타임 PCR(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)” 이란, 실시간 중합효소연쇄반응, 큐 PCR(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)이라고도 하며, 목표 DNA분자의 증폭과 양을 동시에 측정하는 분자생물학 실험 기법이다. 일반적으로 사용되는 RT-PCR은 역전사 중합연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction)을 말하며, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)이 아니다. 그러나 모든 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자들이 이것을 명확하게 구분하여 명명하는 것은 아니다. 실시간 중합효소연쇄반응은 DNA 샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위해 절대적인 유전자 복제 수 또는 상대적인 양을 검출할 수 있다.
실험의 진행은 일반적인 중합효소연쇄반응을 따른다. 중요한 특징은, 증폭된 DNA가 실시간으로 측정된다는 것이다. 이 점이 마지막에서 DNA가 관측이 되는 기본적인 중합효소연쇄반응과의 차이점이다. 두가지의 일반적인 방법이 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용된다. (1) 아무 DNA 이중나선에 끼어들어갈 수 있는 불특정한 형광염색, (2) 올리고뉴클레오티드로 이루어진 서열-특이적 DNA탐침, 형광으로 보고자가 라벨되어있고, 상보적인 DNA목표에 결합한 뒤 검출된다. 종종, 실시간 중합효소연쇄반응은 세포 또는 조직의 mRNA와 코팅되지 않은 RNA(non-coding RNA)를 수량화하기 위해 역전사 중합연쇄반응과 결합되어 행해진다.
본 발명의 일 구체예에서 "유전자 발현 억제"란, 유전자 염기서열에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA 등으로 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상기 siRNA(small interfering RNA)는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(mismatch)(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(bulge)(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 상기 siRNA분자는 이에 제한되지는 않으나, 전체 길이가 15 내지 30 염기, 바람직하게는 19 내지 21 염기일 수 있다.
상기 shRNA(short hairpin RNA)은 45 내지 70 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서, 타겟유전자 siRNA 염기서열의 센스가닥과 상보적인 안티센스가닥 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후, 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노 바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.
상기 마이크로 RNA(microRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다.
본 발명의 일 구체예에서 "단백질 활성 억제"란, 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편으로 타겟 단백질의 활성을 억제하는 것을 의미한다.
상기 항체란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(Light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 "예방"이란, HMGB1, ITPKC, 또는 SLC11A1 유전자와 가와사키병 증상 발생에 있어서의 연관성을 규명하고, 분석된 데이터를 바탕으로 가와사키병 증상 발생 이전에 그 위험도를 예측하여 적절한 관리를 하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서 “진단”이란, HMGB1, ITPKC, 또는 SLC11A1 유전자와 가와사키병 증상에 있어서의 연관성을 규명하고, 분석된 데이터를 바탕으로 가와사키병 증상을 확인하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 생물학적 시료로부터 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125를 확인하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측 방법을 제공하고, 상기 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 의 존재가 확인될 경우에 관상동맥 병변이 형성될 가능성이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측 방법을 제공하며, 상기 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 의 존재가 확인될 경우에 정맥내 면역글로불린저항성이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, HMGB1 유전자 다형성 rs1412125의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트를 제공하고, 상기 키트는 관상동맥 병변이 형성될 가능성을 예측하는 것인 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트를 제공하며, 상기 키트는 정맥내 면역글로불린 저항성을 예측하는 것인 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체에에서, HMGB1 유전자 다형성 rs1412125의 발현 억제제, 또는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 가 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 발현 억제제는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드,　siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 발현된 단백질의 활성 억제제는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 에 특이적인 항체, 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 관상동맥 병변을 치료하는 것인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 정맥내 면역글로불린 저항성을 감소시키는 것인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 를 확인하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측 방법을 제공하고, 상기 시료가 24개월 미만 개체의 시료인 경우에, ITPKC 유전자 다형성 rs28493229, ITPKC 유전자 다형성 rs10420685, 또는 SLC11A1 유전자 다형성 rs2276631 를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 백혈구 수 증가를 예측하는 단계를 포함하는 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 적혈구 침강 속도 이상을 예측하는 단계를 포함하는 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 ITPKC 유전자 다형성 rs10420685 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 젖산 탈수소 효소 수치 상승을 예측하는 단계를 포함하는 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 SLC11A1 유전자 다형성 rs2276631 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 아스파르트산아미노기전달효소(aspartate aminotransferase) 이상을 예측하는 단계를 포함하는 발병 예측 방법을 제공한다.
또한 상기 시료가 24개월 이상 개체의 시료인 경우에, ITPKC 유전자 다형성 rs28493229, 또는 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409 를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 혈소판 수치 상승을 예측하는 단계를 포함하는 발병 예측 방법을 제공하며, 상기 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 젖산 탈수소 효소 수치 상승을 예측하는 단계를 포함하는 발병 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs2561531 와 SLC11A1 유전자 다형성 rs17221959 의 존재를 확인하는 단계; 및 (b) 상기 rs2561531 와 rs17221959 가 존재하는 경우에, 가와사키병 증상 발현 가능성이 낮을 것으로 판단하는 단계를 포함하는 가와사키병 증상 발현 위험도의 예측 방법을 제공하고, 상기 시료는 24개월 미만 개체의 시료인 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs2561531 와 SLC11A1 유전자 다형성 rs77624405 의 존재를 확인하는 단계; 및 (b) 상기 rs2561531 와 rs77624405 가 존재하는 경우에, 가와사키병 증상 발현 가능성이 낮을 것으로 판단하는 단계를 포함하는 가와사키병 증상 발현 위험도의 예측 방법을 제공하고, 상기 시료는 24개월 미만 개체의 시료인 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 생물학적 시료로부터 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409의 존재를 확인하는 단계; 및 (b) 상기 rs17235409가 존재하는 경우에, BCG 주사 부위에 홍반이 발생할 것으로 예측하는 단계를 포함하는 BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법을 제공하고, 상기 시료는 24개월 미만 개체의 시료인 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229 와 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409 의 존재를 확인하는 단계; 및 (b) 상기 rs28493229 와 rs17235409가 존재하는 경우에, BCG 주사 부위에 홍반이 발생할 것으로 예측하는 단계를 포함하는 BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법을 제공하고, 상기 시료는 24개월 이상 개체의 시료인 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs10420685 와 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409 의 존재를 확인하는 단계; 및 (b) 상기 rs10420685 와 rs17235409 가 존재하는 경우에, BCG 주사 부위에 홍반이 발생할 것으로 예측하는 단계를 포함하는 BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법을 제공하고, 상기 시료는 24개월 이상 개체의 시료인 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC의 유전자 다형성 rs28493229의 존재를 확인하는 단계; 및 (b) 상기 rs28493229가 존재하는 경우에, 관상동맥 병변 발생 위험이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 관상동맥 병변 발생 위험도의 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 포함하는 가와사키병에 대한 발병 예측용 키트를 제공하고, 상기 키트는 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229, rs10420685, rs2561531, SLC11A1 유전자 다형성 rs2276631, rs17235409, rs17221959, 및 rs77624405 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 추가로 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 의 발현 억제제, 또는 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 가 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 약학조성물은 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229, rs10420685, rs2561531, SLC11A1 유전자 다형성 rs2276631, rs17235409, rs17221959, 및 rs77624405 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 억제제, 또는 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 제공하며, 상기 발현 억제제는 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드,　siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 약학조성물을 제공하며, 상기 발현된 단백질의 활성 억제제는 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 에 특이적인 항체, 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인 약학조성물을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것으로, 본 발명의 증상 예측 방법은 가와사키병 환자에게서 관상동맥 병변 형성 가능성, 또는 정맥내 면역글루불린 저항성이 발생할 가능성을 사전에 예측 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
또한 본 발명의 ITPKC 및 SLC11A1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법은 한국인 특징적으로 ITPKC 유전자와 SLC11A1 유전자의 상호 관련성 및, 가와사키병 발병에 있어서의 상승 효과를 적용하는 것으로서, 가와사키병 발병 이전에 발병 가능성 예측이 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
본 연구는 2012년부터 2015년까지 서울 세브란스 아동병원 소아과에서 모집된 가와사키병 환자를 대상으로 HMGB1 유전자 다형성과 가와사키병과의 연관성을 규명하였다. 또한 세브란스 아동병원으로부터 가와사키병 환자 229명의 시료를 제공받아 ITPKC 및 SLC11A1 유전자 다형성과 가와사키병과의 연관성을 규명하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. HMGB1 유전자 다형성과 가와사키병과의 연관성 규명
실시예 1-1. 가와사키병 환자의 시료로부터 HMGB1 유전자의 시퀀싱 수행
본 연구는 2012년부터 2015년까지 서울 세브란스 아동병원 소아과에서 모집된 가와사키병 환자를 대상으로 수행하였다. 가와사키병의 판정은 일본 가와사키병 연구위원회 (Kawasaki Disease Research Committee)의 기준에 따라 소아과 의사가 진단하였다. 불완전하거나 비정형인 가와사키병 환자는 제외하였다. 대조군으로는 과거 가와사키병 병력이 없고, 미용상의 이유로 병원을 방문한 건강한 유아를 선정하였다. 모든 실험은 참가자들의 서명 동의를 받아 연세대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며(승인번호 4-2008-0055), 임상 실습에 관한 국가 규정(ICH E6)과 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행하였다. 환자군 및 대조군 아동에 대한 관상동맥 병변(coronary artery lesions; CAL)은 미국 심장 협회(American Heart Association; AHA)와 일본 보건성의 기준에 따른 동맥류(Z 점수> 2.5)로서, 심초음파로 측정하였다. 정맥내 면역글로불린(intravenous immunoglobulin; IVIG) 저항성은 정맥내 면역글로불린 치료 완료 후 36 시간 이상 지속되거나 재발하는 열(38℃ 이상)이 있는 경우로 정의하였다.
가와사키병 환자와 대조군에서 관상동맥 병변 형성과 정맥내 면역글로불린 저항성을 비교한 결과를 표 1에 기재하였다.
Characteristics KD Cases (N = 265) Controls (N = 203)
Male gender 172 (64.9%) 77 (37.9%)
Mean (SD) age (months) 35.31±28.07 116.96±33.77
CAL formation 45 (17.0%)
IVIG resistance 38 (14.3%) 　
24명의 피험자(12명의 환자군 및 12명의 대조군)로부터 수득된 각 전혈 시료에 대한 게놈 DNA는 QIAmp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였고, Epoch 마이크로플레이트 분광광도계(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 정량화하였다.
원인 변이를 확인하기 위해 각 시료의 HMGB1 유전자를 염기서열 분석하였다. 분석을 위한 게놈 서열은 GenBank(http: //www.ncbi/nlm.nih.gov/) 데이터베이스로부터 얻었고, 유전자의 엑손 및 프로모터 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머는 Primer3 소프트웨어(http://carbon.bineer.co.kr/primer3plus)를 사용하여, 유전자의 엑손 및 프로모터 영역을 증폭시킨 PCR 프라이머를 설계 하였다. PCR 반응액은 2.5 mM MgCl2, 10x 반응 완충액, 각 dNTP 2.5 mM, 각 프라이머 0.5 μμM, Taq DNA 중합 효소(SolgTM) 0.25 U, 및 게놈 DNA 10 ng을 포함하는 총 30 ㎕의 볼륨으로 설계하였고, 표 2의 조건으로 PCR 수행하였다.
1 initial denaturation 96C for 5 min
2 35 cycles 96C for 30 s
62C for 30
72C for 60 s
3 final extension cycle 72C for 10 min
PCR 산물은 MEGA quick-spin total Fragment DNA 정제 키트(iNtRON Biotechnology, Korea)로 처리하여 정제하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 ABI Prism 3730xl DNA 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)상의 BigDye Terminator chemistry를 사용하여 시퀀싱하였다. DNA 다형성은 PolyPhred 프로그램 (http://droog.gs.washington.edu/polyphred/)을 사용하여 확인하였다. Haploview 소프트웨어 버전 4.2(Availability: http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)를 사용하여 태깅SNP를 선택하였다.태깅SNP의 유전자 타이핑은 TaqMan® fluorogenic 5'-nuclease assay(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 중복으로 수행하였다. 보다 구체적으로, PCR은 QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 15 ng의 게놈 DNA, 및 40 나노 TaqMan SNP Genotyping Assay가 들어있는 TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 포함하는 10 ㎕의 최종 부피로 하되, 온도 조건은 95 ℃에서 10 분간 초기 변성시킨 후, 95 ℃에서 15 초 변성, 및 60 ℃에서 1 분간 신장을 45 사이클로 반복하였다. PCR 후, 형광을 측정하고 QuantStudio ™ 6 FlexReal-Time PCR 소프트웨어 v1.2 (Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.
실시예 1-2. 가와사키병 환자의 시료로부터 HMGB1 유전자의 연관성 분석
실시예 1의 데이터에 대한 모든 통계 분석은 Windows 10 플랫폼에서 R 소프트웨어 (버전 3.4.0)를 사용하여 수행하였다. 가와사키병 환자와 대조군 사이의 유전자형과 대립 유전자 빈도의 통계적 차이는 χ2 검사 또는 Fisher 's exact test를 사용하여 평가하였다. 관상동맥 병변 형성이 있거나 없는 가와사키병 소아, 및 정맥내 면역글로불린 저항성 또는 감수성이 있는 환자의 유전자형과 대립 유전자 빈도의 통계적 차이를 χ2 검정으로 평가하였고, Bonferroni 테스트는 여러 테스트값의 보정을 위해 사용하였다. odds ratio(OR), 95 % CI(confidence interval), 및 상응하는 P 값에 대한 이원 다중 로지스틱 회귀 분석을 연령과 성별에 따라 실시하였다.
가와사키병과 정상 대조군에서 HMGB1 유전자의 유전자형과 대립 형질 빈도를 표 4에 나타내었다. 연구 대상자는 265명의 가와사키병 환자와 203명의 대조군으로 구성하였다. 이들의 평균 연령은 환자군이 35.31 개월, 대조군은 116.96 개월이었다. 분석 결과, 265명의 환자군 중 45명(17.0 %)에서 관상동맥 병변이 발생했으며, 38명(14.3 %)이 초기 정맥내 면역글로불린 치료에 저항성을 보였다. 원인 SNP 발견을 위한 전체 HMGB1 유전자 시퀀싱에 의해 총 2개의 SNP를 확인하였다. 상기 SNP의 염기서열 등에 대한 정보는 dbSNP 데이터베이스 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)에서 확인 가능하다.
형질 분석의 결과에 기초하여 유전자형 분석을 위해 두 개의 태깅 SNP(rs1412125 및 rs117077167)를 선택하였다. 상기 SNP들의 다형성 정보를 하기 표 3에 나타내었다.
해당 유전자 RS명 다형성정보
HMGB1 rs1412125 HMGB1 유전자의 9,543번째에 위치하는 염기 C가 T로 치환
HMGB1 rs117077167 HMGB1 유전자의 9,050번째에 위치하는 염기 G가 T로 치환
그러나 태깅 SNP는 5 가지 유전 모델(공동 우성, 우성, 열성, 과도한, 또는 로그 첨가 모델) 하에서 환자군 및 대조군의 유전자형 또는 대립 유전자 빈도와 유의한 상관 관계가 없는 것으로 나타났다. 이를 하기 표 4에 나타내었다.
SNP rs1412125 rs117077167
Genotype AA GA GG CC CA
KD (%) (n = 265) 159 (60) 90 (34) 16 (6) 250 (94.3) 15 (5.7)
Control (%)(n = 203) 124 (61.1) 69 (34) 10 (4.9) 194 (95.6) 9 (4.4)
Model Codominant Dominant Recessive Overdominant Log-additive Codominant Log-additive
P value 0.287 0.413 0.288 0.182 0.781 0.796 0.796
Allele A G C A
KD (%)(n = 265) 408 (77) 122 (23) 515 (97.2) 15 (2.8)
Control (%)(n= 203) 317 (78.1) 89 (21.9) 397 (97.8) 9 (2.2)
P value 0.690 0.556
관상동맥 병변이 있거나 없는 가와사키병 환자에서 HMGB1 SNP rs1412125 유전자형과의 연관성을 분석하였다. 분석 결과, 열성 모델에서 SNP rs1412125와 관상동맥 병변 형성은 관련이 있는 것으로 나타났다. 상기 결과를 표 5에 나타내었다. HMGB1(rs1412125)의 GG 유전자형을 지닌 개체의 경우, 관상동맥 병변을 동반하는 가와사키병 환자의 빈도는 15.6%, 관상동맥 병변을 동반하지 않는 가와사키병 환자의 빈도는 4.1% 였다. GG 유전자형을 지닌 개체의 경우에는 관상동맥 병변을 동반한 가와사키병 환자의 빈도가 더 높았다(OR = 4.98, 95 % CI = 1.69-14.66, P = 0.005). HMGB1 SNP rs117077167 유전자형은 가와사키병 환자의 관상동맥 병변 발생과 통계적으로 유의한 연관성이 없는 것으로 나타났다.
SNP rs1412125
Genotype AA GA GG
CAL (%)(n = 45) 26 (57.8) 12 (26.7) 7 (15.6)
Without (%) (n = 220) 133 (60.5) 78 (35.5) 9 (4.1)
Allele A G
CAL (%) (n = 45) 64 (71.1) 26 (28.9)
Without (%) (n = 220) 344 (78.2) 96 (21.8)
Dominant P value 0.722
Recessive P value 0.005*
Allelic P value 0.147
*Significant (P < 0.05) values are in bold.
마지막으로, 정맥내 면역글로불린 저항성이 있거나 없는 가와사키병 환자에서 HMGB1 SNP rs1412125 유전자형과의 연관성을 분석하였다. 상기 결과를 표 6에 나타내었다. 분석 결과, SNP rs1412125는 열성 (OR = 4.11, 95 % CI = 1.38-12.23, P = 0.017), 및 대립 형질(OR = 1.80, 95 % CI = 1.06-3.06, P = 0.027)에서 정맥내 면역글로불린 저항성과 관련이 있었다. HMGB1(rs1412125)의 GG 유전자형을 지닌 개체의 경우, 정맥내 면역글로불린 저항성을 동반하는 가와사키병 환자의 빈도는 15.8%, 정맥내 면역글로불린 저항성을 동반하지 않는 가와사키병 환자의 빈도는 4.4% 였다. GG 유전자형을 가진 가와사키병 소아는 정맥내 면역글로불린 반응이 없는 비율이 더 높았다. rs1412125 G 대립 유전자의 경우는 정맥내 면역글로불린 저항성(32.9%)이 정맥내 면역글로불린 감수성(21.4 %)빈도보다 유의하게 높았다.
HMGB1 SNP rs117077167 유전자형은 가와사키병 환자의 정맥내 면역글로불린 저항성과통계적으로 유의한 연관성이 없는 것으로 나타났다.
SNP rs1412125
Genotype AA GA GG
Resistant (%) (n = 38) 19 (50.0) 13 (34.2) 6 (15.8)
Responsive (%)(n = 227) 140 (61.7) 77 (33.9) 10 (4.4)
Allele A G
Resistant (%) (n = 38) 51 (67.1) 25 (32.9)
Responsive (%) (n = 227) 357 (78.6) 97 (21.4)
Dominant P value 0.164
Recessive P value 0.017*
Allelic P value 0.027*
*Significant (P < 0.05) values are in bold.
상기 결과로부터 가와사키병이 HMGB1 유전자의 SNP와 깊은 연관성이 있다는 것을 알 수 있었고, 특히 SNP rs1412125 유전자형인 경우에, 가와사키병 환자의 관상동맥 병변 형성, 또는 정맥내 면역글로불린 저항성이 발생하는 빈도가 높다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. ITPKC 및 SLC11A1 유전자 다형성과 가와사키병과의 연관성 규명
실시예 2-1. 가와사키병 환자의 시료로부터 ITPKC 및 SLC11A1 유전자의 시퀀싱 수행
세브란스 아동병원으로부터 가와사키병 환자 229명의 시료를 제공받아 ITPKC 및 SLC11A1 유전자의 시퀀싱을 수행하였다. 상기 환자들은 일본 가와사키병 연구위원회의 기준에 따라 진단된 환자로서, 불완전하거나 비정형적인 가와사키병 환자는 제외하였다. 대조군으로는 과거 가와사키병 병력이 없고, 미용상의 이유로 병원을 방문한 건강한 유아를 포함하였다. 가와사키병은 나이와 상관성이 높은 질병이므로, BCG 부위의 홍반이 주로 24개월 미만의 소아에게서 관찰된다는 것을 감안하여 환자를 24개월을 기준으로 분류하여, 24개월 미만을 저연령군, 24개월 이상을 고연령군으로 표시하였다. 모든 실험은 연세대학교 의과대학 윤리위원회의 승인을 받아 수행하였다(승인번호 2008-0055-010).
상기 환자들의 통계 처리된 정보를 표 7에 기재하였다.
KD patients Controls (210) p-value
All (299) < 24 month (114) ≥ 24month (185)
Age (month) 41.81 ± 39.49 11.81 ± 5.88 60.33 ± 40.05 115.97 ± 35.24 <.0001＊
Gender (M:F) 194:105 81(41.8%):33(31.4%) 113(58.2%):72(68.6%) 130:80 <.0001＊
BCG injection site erythema 77 62(80.5%) 15(19.5%) NA <0.001†
WBC 12,900.73 ± 5,315.07 13,594.09 ± 5,195.91 12,432.82 ± 5,359.14 6,910.71 ± 2,01.68 <.0001＊
Platelet 399.97 ± 182.73 425.72 ± 181.55 382.60 ± 182.02 304.70 ± 71.17 <.0001＊
ESR 63.51 ± 32.49 59.93 ± 33.15 65.98 ± 31.90 11.00 ± 9.81 <.0001＊
CRP 57.75 ± 53.02 51.09 ± 47.92 62.33 ± 55.95 9.152 ±14.61 0.069＊
LDH 334.75 ± 145.66 334.06 ± 115.38 335.21 ± 163.21 241.21 ± 41.67 <.0001＊
Coronary complication 55 13(23.6%) 42(76.4%) NA 0.008†
Recur of KD 48 18(37.5%) 30(62.5%) NA 0.296†
수득된 각 시료에 대한 게놈 DNA는 QIAmp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였고, Epoch 마이크로플레이트 분광광도계(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 정량화하였다.원인 변이를 확인하기 위해 각 시료의 SLC11A1과 ITPKC 유전자를 염기서열 분석하였다. 분석을 위한 게놈 서열은 GenBank(http: //www.ncbi/nlm.nih.gov/) 데이터베이스로부터 얻었고, 유전자의 엑손 및 프로모터 영역(엑손 1의 2kb 업스트림)을 증폭하기 위한 PCR 프라이머는 Primer3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)를 사용하여 디자인하였다. PCR 단편은 제조사의 프로토콜에 따라 ABI Prism 3730xl DNA 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)상의 BigDye Terminator chemistry를 사용하여 시퀀싱하였다. DNA 다형성은 PolyPhred 프로그램 (http://droog.gs.washington.edu/polyphred/)을 사용하여 확인하였다. 태깅 SNP(Tagging SNPs)는 Haploview(버전 4.2)를 사용하여 선택하였고, SLC11A1 및 ITPKC의 전체 유전자 시퀀싱에 대해 연관불균형(linkage disequilibrium; LD) 분석을 통해 선택된 모든 SNP 시료에 대하여 TaqMan® fluorogenic 5'-nuclease assay(Applied Biosystems)을 사용하여 태깅SNP의 유전자 타이핑을 수행하였다. ITPKC 유전자의 3'-UTR에 rs2290692 다형성을 추가하였는데, 이는 최근 한족에서 가와사키병과 연관성이 깊은 것으로 보고되었다(Peng Q 등, Pediatr Cardiol 2012;33:1046-53). Real-time PCR은 QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였고, 데이터는 7500 SDS 2.3 software(Applied Biosystems)으로 분석하였다.
상기 선택된 태깅SNP에 대한 위치 정보를 하기 표 8에 나타내었다.
해당 유전자 RS명 다형성정보
ITPKC rs2561531 ITPKC 유전자의 3,912번째에 위치하는 염기 G가 A로 치환
ITPKC rs28493229 ITPKC 유전자의 6,197번째에 위치하는 염기 C가 G로 치환
ITPKC rs7251246 ITPKC 유전자의 9,099번째에 위치하는 염기 C가 T로 치환
ITPKC rs10420685 ITPKC 유전자의 17,113번째에 위치하는 염기 A가 G로 치환
ITPKC rs2290692 ITPKC 유전자의 28,371번째에 위치하는 염기 C가 G로 치환
SLC11A1 rs7573065 SLC11A1 유전자의 4,956번째에 위치하는 염기 C가 T로 치환
SLC11A1 rs227663 SLC11A1 유전자의 7,262번째에 위치하는 염기 T가 C로 치환
SLC11A1 rs17221959 SLC11A1 유전자의 10,879번째에 위치하는 염기 C가 T로 치환
SLC11A1 rs77624405 SLC11A1 유전자의 16,044번째에 위치하는 염기 A가 G로 치환
SLC11A1 rs17235409 SLC11A1 유전자의 17,981번째에 위치하는 염기 A가 G로 치환
실시예 2-2. 가와사키병 환자의 시료로부터 SLC11A1및 ITPKC 유전자의 연관성 분석
실시예 1의 데이터에 대한 모든 통계 분석은 Windows 7 플랫폼에서 SAS 소프트웨어(버전 9.0)를 사용하여 수행하였다. 가와사키병과의 연관성을 시험하기 위해, Cochran-Armitage trend test(chi-squared test)를 사용하여 시험군과 대조군의 대립 유전자와 유전자형 빈도(명목상의 변수)를 비교하였다. 통계적 유의성은 Student 's t-test로 처리하여, 0.05 미만의 p 값을 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 연속 변수는 평균 ± 표준 편차로 나타내었고, 범주형 변수는 수(%)로 표시하였다.
SLC11A1 유전자 다형성과 ITPKC 유전자 다형성 사이의 시너지 효과는 다중 유전자좌의 조합 형태를 사용하여 분석하였다. 가와사키병과 관련하여 두 유전자 사이의 상호 작용을 평가하기 위해, 유전자 다형성의 가장 좋은 조합 패턴에 대한 검색을 교차 검증 일관성과 테스트 밸런스 정확성의 최대화 원칙에 따라 수행하였다.
분석 결과에 대하여, 먼저 대상자의 임상 양상을 표 9에 나타내었다. 299명의 가와사키병환자 중 77명(25.75 %)이 BCG 주사 부위에 홍반을 앓은 것으로 나타났는데, 환자를 연령에 따라 이분화하였을 때, 저연령군의 경우 114명 중 54명으로 54.39% 였고, 고연령군의 경우 185명 중 15명으로 8.11%로 나타나, 연령에 따른 차이가 큰 것을 알 수 있었다.
가와사키병 환자는 대조군과 비교하여 백혈구 수, 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate; ESR), C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP), 및 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase; LDH)가 상승하는 것으로 분석되었다.
관상동맥 병변(coronary artery lesions; CAL)은 299명의 환자 중 55명(18.39%)에서 관찰되었는데, 고연령군(185명 중 42명, 22.70%)에서 저연령군(114명 중 13명, 11.40%)과 비교하여 발생 빈도가 높았다(p=0.008). 48명(16.05 %)의 환자는 임상 증상이 있었는데, 연령에 따른 임상적 증상은 고연령군(185명 중 30명, 16.22%)과 저연령군(114명 중 18명, 15.79%) 사이에 의미있는 차이가 없는 것으로 나타났다.
　 　 Genotypes p-value Alleles p-value
ITPKC 　 CC CT TT 　 C T 　
rs2561531 Controls 130(61.90) 70(33.33) 10(4.76) 0.957 330(78.57) 90(21.43) 0.856
KD patients 184(61.54) 99(33.11) 16(5.35) 467(78.09) 131(21.91)
GG GC CC G C
rs28493229 Controls 178(84.76) 32(15.24) 0(0.00) 0.045 388(92.38) 32(7.62) 0.022
KD patients 231(77.26) 64(21.40) 4(1.34) 526(87.96) 72(12.04)
AA AG GG A G
rs10420685 Controls 114(54.29) 76(36.19) 20(9.52) 0.836 304(72.38) 116(27.62) 0.777
KD patients 156(52.17) 116(38.80) 27(9.03) 428(71.57) 170(28.43)
GG GC CC G C
rs2290692　 Controls 65(30.95) 97(46.19) 48(22.86) 0.933 227(54.05) 193(45.95) 0.908
KD patients 89(29.77) 143(47.83) 67(22.41) 321(53.68) 277(46.32)
SLC11A1 　 CC CT TT 　 C T 　
rs7573065 Controls 194(92.38) 15(7.14) 1(0.48) 0.405 403(95.95) 17(4.05) 0.815
KD patients 273(91.30) 26(8.70) 0(0.00) 572(95.65) 26(4.35)
GG GA AA G A
rs2276631 Controls 143(68.10) 59(28.10) 8(3.81) 0.909 345(82.14) 75(17.86) 0.688
KD patients 209(69.90) 79(26.42) 11(3.68) 497(83.11) 101(16.89)
CC CT TT C T
r17221959 Controls 186(88.57) 24(11.43) 0(0.00) 0.202 396(94.29) 24(5.71) 0.220
KD patients 253(84.62) 46(15.38) 0(0.00) 552(92.31) 46(7.69)
GG GA AA G A
rs77624405 Controls 204(97.14) 6(2.86) 0(0.00) 0.072 414(98.57) 6(1.43) 0.076
KD patients 280(93.65) 19(6.35) 0.(0.00) 579(96.82) 19(3.18)
GG GA AA G A
rs17235409　 Controls 165(78.57) 42(20.00) 3(1.43) 0.886 372(88.57) 48(11.43) 0.780
KD patients 239(79.93) 55(18.39) 5(1.67) 533(89.13) 65(10.87)
본 발명자들의 LD 분석에서, 표 9에 기재된 바와 같이, ITPKC에서 4개의 태깅SNP와 SLC11A1에서 5 개의 태깅SNP가 선택되었다. 상기 SNP들을 이용하여 ITPKC 및 SLC11A1 유전자의 다형성 및 임상 시험 결과와의 관련성을 보면, 가와사키병 환자군과 대조군의 유전자형과 대립 유전자 빈도의 비교 시 ITPKC의 인트론에서 rs28493229에 대해서만 유의한 차이가 나타났다(각각 p=0.045와 p=0.022). ITPKC의 rs28493229에서 C 대립 유전자(C allele)의 과발현이 관찰되었고, 연령에 따라 이분하였을 때 저연령군에서 유사한 결과가 관찰되었다(각각 p=0.039, p=0.031). 상기 ITPKC의 rs28493229빈도 분석 결과를 표 10에 나타내었다.
Genotypes Alleles
GG GC CC p-value G C p-value
All Controls 178 (84.76) 32 (15.24) 0 (0.00) 0.045 388 (92.38) 32 (7.62) 0.022
KD patients 231 (77.26) 64 (21.40) 4 (1.34) 526 (87.96) 72 (12.04)
< 24 months Controls 178 (84.76) 32 (15.24) 0 (0.00) 0.039 388 (92.38) 32 (7.62) 0.031
KD patients 86 (75.44) 27 (23.68) 1 (0.88) 199 (87.28) 29 (12.71)
≥ 24 months Controls 178 (84.76) 32 (15.24) 0 (0.00) 0.065 388 (92.38) 32 (7.62) 0.052
KD patients 145 (78.38) 37 (20.00) 3 (1.62) 327 (88.38) 43 (11.62)
SLC11A1의 엑손 12에서 rs77624405에 대한 환자군과 대조군간에 유의한 차이는 발견되지 않았으나, 환자군을 이분화하였을 때, 저연령군에서 A 대립 유전자(A allele)의 과발현이 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(각각 p=0.008 및 p=0.009). 상기 SLC11A1의 rs77624405빈도 분석 결과를 표 11에 나타내었다.
Genotypes Alleles
GG GA p-value G A p-value
All Controls 204 (97.14) 6 (2.86) 0.072 414 (98.57) 6 (1.43) 0.076
KD patients 280 (93.65) 19 (6.35) 579 (96.82) 19 (3.18)
< 24 months Controls 204 (97.14) 6 (2.86) 0.008 414 (98.57) 6 (1.43) 0.009
KD patients 103 (90.35) 11 (9.65) 217 (95.18) 11 (4.82)
≥ 24 months Controls 204 (97.14) 6 (2.86) 0.425 414 (98.57) 6 (1.43) 0.429
KD patients 177 (95.68) 8 (4.32) 362 (97.84) 8 (2.16)
공지된 SNP와 실험적 데이터 간의 상관도도 분석하였는데, 환자군과 대조군 간에 관련 SNP의 대립 유전자는 상당히 이질적인 차이가 있는 것으로 나타났다.
구체적으로, 가와사키병 환자군 ITPKC의 rs2290692 다형성은 대조군과 비교하여 백혈구 수, 혈소판 수, 및 젖산 탈수소 효소 수치의 상승과 관련이 있었다. 환자군을 연령에 따라 이분하였을 때에도 차이점이 발견되었는데, 저연령군에서 백혈구 수 증가는 rs28493229 다형성과 연관이 있었고, 젖산 탈수소 효소 수치의 상승은 rs10420685 다형성과 관련이 있었으며, 적혈구 침강 속도는 rs2290692 다형성과 연관이 있었으나, 연령에 따라 이분화하지 않은 전체 환자군에서는 상관성이 없는 것으로 나타났다. 고연령군에서의 백혈구 수 증가는 rs2290692 다형성과 연관이 있었는데, 이는 연령에 따라 이분화하지 않은 전체 환자군에서도 같았다. 고연령군에서의 혈소판 수 증가는 rs28493229 다형성과 연관이 있었으나, 연령에 따라 이분화하지 않은 전체 환자군에서는 상관성이 없는 것으로 나타났다. 고연령군에서의 젖산 탈수소 효소 수치의 상승은 SLC111A1의 rs17235409의 다형성과 연관이 있었고, 저연령군에서의 아스파르트산아미노기전달효소(aspartate aminotransferase; AST)는 rs2276631 다형성과 연관이 있었다. SLC11A1 내에서 염증과 관련 있는 SNP는 없는 것으로 조사되었다. 상기 결과를 표 12에 나타내었다.
ITPKC gene SNP Values p-value
KD Vs Control rs2290692_GC Elevation of WBC 0.021
rs2290692_GC Elevation of platelet 0.024
rs2290692_CC Elevation of LDH 0.040
< 24 months vs. Controls rs28493229_CC Elevation of WBC <0.001
rs2290692_GC Elevation of platelet 0.046
rs2290692_GC Elevation of ESR 0.025
rs10420685_AG Elevation of LDH 0.014
≥24 months vs. Controls rs2290692_GC Elevation of WBC 0.033
rs28493229_CC Elevation of platelet 0.008
SLC11A1 gene SNP Values p-value
< 24 months vs. Controls rs2276631_GA Elevation of AST 0.022
≥24 months vs. Controls rs17235409_GA Elevation of LDH 0.050
가와사키병 환자군과 대조군을 비교할 때, ITPKC와 SLC11A1 유전자 사이에 유의한 상호 작용은 관찰되지 않았으나, 가와사키병 환자를 연령에 따라 구분하면 저연령층에서 ITPKC rs2561531CC 와 SLC11A1 rs17221959 CT 사이의 상호작용, 또는 ITPKC rs2561531 CC와 SLC11A1 rs77624405 GA 사이의 상호작용은 가와사키병 증상 발현에 대하여 강한 방어 효과가 있는 것으로 분석되었다. 상기 결과를 표 13에 나타내었다.
All OR (95% CI) p-value
ITPKC rs2561531_CC SLC11A1 rs17221959_CT 0.841 (0.387-1.828) 0.661
ITPKC rs2561531_CC SLC11A1 rs77624405_GA 0.249 (0.047-1.328) 0.104
< 24 months OR (95% CI) p-value
ITPKC rs2561531_CC SLC11A1 rs17221959_CT 0.379 (0.154-0.931) 0.034
ITPKC rs2561531_CC SLC11A1 rs77624405_GA 0.128 (0.025-0.667) 0.015
가와사키병 환자군에서 BCG 주사 부위의 홍반과 관련이 있는 ITPKC SNP는 발견되지 않았다. 그러나 저연령군 가와사키병 환자에서 SLC11A1의 rs17235409 다형성은 BCG 주사 부위의 홍반과 연관성이 있는 것으로 나타났다. 상기 결과를 표 14에 나타내었다.
가와사키병 환자의 BCG 주사 부위 홍반에 대한 ITPKC 와 SLC11A1 유전자의 상호 관련성을 보면, 고연령군 가와사키병 환자에서 ITPKC의 rs28493229와 SLC11A1의 rs17235409(OR=5.1, p=0.017), 또는 ITPKC의 rs10420685와 SLC11A1의 rs17235409 (OR=12.51, p=0.008)간에 유의미한 연관성이 있는 것으로 분석되었다. 상기 결과를 표 15에 나타내었다.
Genotypes BCG (+) Control p-value
All GG 62 (80.52) 155 (78.68) 0.90
GA 14 (18.18) 38 (19.29)
AA 1 (1.30) 4 (2.03)
G 138 (89.61) 348 (88.32) 0.669
A 16 (10.39) 46 (11.68)
< 24 months GG 53 (85.48) 32 (66.67) 0.037
GA 8 (12.90) 15 (31.25)
AA 1 (1.61) 1 (2.08)
G 114 (91.94) 79 (82.29) 0.031
A 10 (8.06) 17 (17.71)
All OR (95% CI) p-value
ITPKC rs28493229_GG SLC11A1 rs17235409_GA 0.031 (0.093-1.031) 0.056
ITPKC rs10420685_GG SLC11A1 rs17235409_AA <0.001 (<0.001 - >999.999) 0.985
≥ 24 months OR (95% CI) p-value
ITPKC rs28493229_GG SLC11A1 rs17235409_GA 5.105 (1.345-19.372) 0.017
ITPKC rs10420685_GG SLC11A1 rs17235409_AA 12.51 (1.927-82.01) 0.008
관상동맥 병변 증상 발현에 대해 ITPKC의 rs28493229 다형성이 연관성이 있는 것으로 나타났으나, ITPKC 와 SLC11A1 유전자 간의 상호 관련성은 없는 것으로 분석되었다. 상기 결과를 표 16에 나타내었다.
Genotypes Alleles
GG GC CC p-value G C p-value
All No CAL patients 181 (78.35) 49 (21.21) 1 (0.43) 0.043 411 (88.96) 51 (11.04) 0.087
CAL patients 40 (72.73) 12 (21.82) 3 (5.45) 92 (83.64) 18 (16.36)
상기 결과로부터 가와사키병이 단일 질병 실체가 아니며, 발병 연령, 임상 증상, 검사 데이터의 패턴 등이 SNP와 깊은 연관성이 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법은 HMGB1 유전자와 가와사키병 증상에 있어서의 연관성을 규명하는 것으로서, 가와사키병 환자에게서 관상동맥 병변 형성 가능성, 또는 정맥내 면역글루불린 저항성이 발생할 가능성을 사전에 예측 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
또한 본 발명의 ITPKC 및 SLC11A1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법은 한국인 특징적으로 ITPKC 유전자와 SLC11A1 유전자의 상호 관련성 및, 가와사키병 발병에 있어서의 상승 효과를 적용하는 것으로서, 가와사키병 발병 이전에 발병 가능성 예측이 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Claims (37)

  1. 생물학적 시료로부터 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125를 확인하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 증상 예측 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 의 존재가 확인될 경우에 관상동맥 병변이 형성될 가능성이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 증상 예측 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 의 존재가 확인될 경우에 정맥내 면역글로불린저항성이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 증상 예측 방법.
  4. HMGB1 유전자 다형성 rs1412125의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 포함하는, 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 키트는 관상동맥 병변이 형성될 가능성을 예측하는 것인, 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 키트는 정맥내 면역글로불린 저항성을 예측하는 것인, 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트.
  7. HMGB1 유전자 다형성 rs1412125의 발현 억제제, 또는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 가 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 발현된 단백질의 활성 억제제는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 에 특이적인 항체, 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 약학조성물은 관상동맥 병변을 치료하는 것인, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 약학조성물은 정맥내 면역글로불린 저항성을 감소시키는 것인, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  12. 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 를 확인하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 시료가 24개월 미만 개체의 시료인 경우에, ITPKC 유전자 다형성 rs28493229, ITPKC 유전자 다형성 rs10420685, 또는 SLC11A1 유전자 다형성 rs2276631 를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 백혈구 수 증가를 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 적혈구 침강 속도 이상을 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 ITPKC 유전자 다형성 rs10420685 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 젖산 탈수소 효소 수치 상승을 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  17. 제 13항에 있어서,
    상기 SLC11A1 유전자 다형성 rs2276631 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 아스파르트산아미노기전달효소(aspartate aminotransferase) 이상을 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  18. 제 12항에 있어서,
    상기 시료가 24개월 이상 개체의 시료인 경우에, ITPKC 유전자 다형성 rs28493229, 또는 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409 를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 혈소판 수치 상승을 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409 의 존재가 확인될 경우에 상기 개체의 젖산 탈수소 효소 수치 상승을 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측 방법.
  21. (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs2561531 와 SLC11A1 유전자 다형성 rs17221959 의 존재를 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 rs2561531 와 rs17221959 가 존재하는 경우에, 가와사키병 증상 발현 가능성이 낮을 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 가와사키병 증상 발현 위험도의 예측 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 시료는 24개월 미만 개체의 시료인, 가와사키병 증상 발현 위험도의 예측 방법.
  23. (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs2561531 와 SLC11A1 유전자 다형성 rs77624405 의 존재를 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 rs2561531 와 rs77624405 가 존재하는 경우에, 가와사키병 증상 발현 가능성이 낮을 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 가와사키병 증상 발현 위험도의 예측 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 시료는 24개월 미만 개체의 시료인, 가와사키병 증상 발현 위험도의 예측 방법.
  25. (a) 생물학적 시료로부터 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409의 존재를 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 rs17235409가 존재하는 경우에, BCG 주사 부위에 홍반이 발생할 것으로 예측하는 단계를 포함하는, BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 시료는 24개월 미만 개체의 시료인, BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법.
  27. (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229 와 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409 의 존재를 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 rs28493229 와 rs17235409가 존재하는 경우에, BCG 주사 부위에 홍반이 발생할 것으로 예측하는 단계를 포함하는, BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 시료는 24개월 이상 개체의 시료인, BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법.
  29. (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC 유전자 다형성 rs10420685 와 SLC11A1 유전자 다형성 rs17235409 의 존재를 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 rs10420685 와 rs17235409 가 존재하는 경우에, BCG 주사 부위에 홍반이 발생할 것으로 예측하는 단계를 포함하는, BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 시료는 24개월 이상 개체의 시료인, BCG 홍반 발생 위험도의 예측 방법.
  31. (a) 생물학적 시료로부터 ITPKC의 유전자 다형성 rs28493229의 존재를 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 rs28493229가 존재하는 경우에, 관상동맥 병변 발생 위험이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 관상동맥 병변 발생 위험도의 예측 방법.
  32. ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측용 키트.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 키트는 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229, rs10420685, rs2561531, SLC11A1 유전자 다형성 rs2276631, rs17235409, rs17221959, 및 rs77624405 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 추가로 포함하는, 가와사키병에 대한 발병 예측용 키트.
  34. ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 의 발현 억제제, 또는 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 가 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  35. 제 34항에 있어서,
    상기 약학조성물은 ITPKC 유전자 다형성 rs28493229, rs10420685, rs2561531, SLC11A1 유전자 다형성 rs2276631, rs17235409, rs17221959, 및 rs77624405 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 억제제, 또는 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  36. 제 34항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드,　siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  37. 제 34항에 있어서,
    상기 발현된 단백질의 활성 억제제는 ITPKC 유전자 다형성 rs2290692 에 특이적인 항체, 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물.
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