WO2022114526A1 - 알츠하이머병 발병 위험도 예측을 위한 단일염기다형성 마커 및 이의 용도 - Google Patents

알츠하이머병 발병 위험도 예측을 위한 단일염기다형성 마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2022114526A1
WO2022114526A1 PCT/KR2021/014469 KR2021014469W WO2022114526A1 WO 2022114526 A1 WO2022114526 A1 WO 2022114526A1 KR 2021014469 W KR2021014469 W KR 2021014469W WO 2022114526 A1 WO2022114526 A1 WO 2022114526A1
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alzheimer
risk
sharpin
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PCT/KR2021/014469
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원성호
박준영
이건호
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서울대학교산학협력단
조선대학교산학협력단
주식회사 뉴로젠
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention provides a method for predicting the risk of Alzheimer's disease by identifying a specific single nucleotide polymorphism (SNP) having a significant correlation with the risk of developing Alzheimer's disease, a polynucleotide, a polypeptide capable of confirming the SNP, It relates to a composition for predicting the risk of Alzheimer's disease, including an antibody or cDNA, and a microarray and kit comprising the same.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Alzheimer's disease is a progressive disorder that causes cognitive impairment and memory loss.
  • Key risk factors for Alzheimer's include age, family history, and lifestyle.
  • GWAS whole genome studies
  • Non-Patent Document 1 Focus on African Americans (Non-Patent Document 1), Hispanic (Non-Patent Documents 2 and 3), Japanese (Non-Patent Documents 4 and 5) and Chinese (Non-Patent Document 6) as well as a transethnic approach (Non-Patent Document 7)
  • Diverse population studies validated by GWAS with Studies of diverse populations can often take advantage of population-specific specific variations and differences in the frequency of alleles that result in variable intensities in the associated signal.
  • the effects of disease susceptibility loci may be modulated by environmental risk factors with different exposures across populations.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • common polymorphism 5% polymorphism
  • rare polymorphism 1 to 5% polymorphism
  • GWAS generally conducts research under the assumption that common diseases are associated with common variants, and it is thought that the problem of 'missing heritability' occurs in these studies.
  • 'Lost heritability' is a phenomenon that occurs because individual genes cannot explain all phenotypes such as disease or behavior, and it is the view that disease is determined by the combination of all genotypes.
  • gene-environment interaction analysis and gene-gene interaction analysis have been widely used to supplement this problem.
  • Non-Patent Document 1 Reitz, C., Jun, G., Naj, A., Rajbhandary, R., Vardarajan, B.N., Wang, L.S., Valladares, O., Lin, C.F., Larson, E.B., Graff-Radford , N.R., et al. (2013).
  • Non-Patent Document 2 Lee, J.H., Cheng, R., Barral, S., Reitz, C., Medrano, M., Lantigua, R., Jimenez-Velazquez, I.Z., Rogaeva, E., St George-Hyslop , P.H., and Mayeux, R. (2011). Identification of novel loci for Alzheimer disease and replication of CLU, PICALM, and BIN1 in Caribbean Hispanic individuals. Arch Neurol 68, 320-328.
  • Non-Patent Document 3 Vardarajan, B.N., Barral, S., Jaworski, J., Beecham, G.W., Blue, E., Tosto, G., Reyes-Dumeyer, D., Medrano, M., Lantigua, R. , Naj, A., et al. (2018). Whole genome sequencing of Caribbean Hispanic families with late-onset Alzheimer's disease. Ann Clin Transl Neurol 5, 406-417.
  • Non-Patent Document 4 Miyashita, A., Koike, A., Jun, G., Wang, L.S., Takahashi, S., Matsubara, E., Kawarabayashi, T., Shoji, M., Tomita, N., Arai, H., et al. (2013).
  • SORL1 is genetically associated with late-onset Alzheimer's disease in Japanese, Koreans and Caucasians.
  • Non-Patent Document 5 Asanomi, Y., Shigemizu, D., Miyashita, A., Mitsumori, R., Mori, T., Hara, N., Ito, K., Niida, S., Ikeuchi, T. , and Ozaki, K. (2019).
  • a rare functional variant of SHARPIN attenuates the inflammatory response and associates with increased risk of late-onset Alzheimer's disease. Mol Med 25, 20.
  • Non-Patent Document 6 Zhou, X., Chen, Y., Mok, K.Y., Zhao, Q., Chen, K., Chen, Y., Hardy, J., Li, Y., Fu, A.K.Y., Guo , Q., et al. (2016). Identification of genetic risk factors in the Chinese population implicates a role of immune system in Alzheimer's disease pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 115, 1697.
  • Non-Patent Document 7 Jun, G.R., Chung, J., Mez, J., Barber, R., Beecham, G.W., Bennett, D.A., Buxbaum, J.D., Byrd, G.S., Carrasquillo, M.M., Crane, P.K., et al. (2017). Transethnic genome-wide scan identifies novel Alzheimer's disease loci. Alzheimers Dement 13, 727-738.
  • An object of the present invention is to provide a method for predicting the risk of Alzheimer's disease by identifying a specific SNP having a significant correlation with the risk of Alzheimer's disease with respect to a genetic sample obtained from a patient.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for predicting the risk of Alzheimer's disease by identifying a specific SNP having a significant correlation with the risk of Alzheimer's disease with respect to a genetic sample obtained from a patient.
  • Another object of the present invention is to provide a microarray for predicting the risk of Alzheimer's disease, comprising a polynucleotide, a polypeptide, an antibody or cDNA thereof capable of identifying a specific SNP marker.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting the risk of Alzheimer's disease, comprising a polynucleotide, a polypeptide, an antibody or cDNA thereof capable of identifying a specific SNP marker.
  • Alzheimer's disease is caused by environmental factors and genetic factors, and prevention by predicting genetic factors in advance is effective prevention of Alzheimer's disease.
  • a robust model for predicting Alzheimer's disease can be presented using gene-gene interaction.
  • the present inventors compared Korean Alzheimer's disease (AD) patients with simple cognitive impairment (MCI) patients and normal people (CN) to find single nucleotide polymorphisms (SNPs) that are specific to the onset of Alzheimer's disease in Koreans.
  • a genome-wide association study (GWAS) was conducted, and association analysis was performed.
  • the present invention was completed by confirming a single nucleotide polymorphism that appears specifically in patients with Alzheimer's disease in Koreans.
  • the present invention relates to a genetic sample obtained from a patient
  • NCBI refSNP ID Provides an information providing method for predicting the risk of Alzheimer's disease, including the step of confirming whether or not the 820th base represented by rs77359862 is substituted.
  • the genetic sample refers to DNA or RNA that can be isolated from all cells such as blood, skin cells, mucosal cells, and hair of a subject (patient).
  • a method for extracting DNA or RNA from the cell is not particularly limited, and a technique known in the art or a commercially available DNA or RNA extraction kit may be used.
  • the subject may include a subject determined or suspected of having Alzheimer's disease.
  • the subject may be a vertebrate, and may be a mammal, an amphibian, a reptile, a bird, or the like, and specifically may be a mammal.
  • the subject may be a human (Homo sapiens).
  • the subject may be a Korean. While this mutation is rarely found in the Western population (allele ratio: 0.01%), the subject can be applied to East Asians, especially Koreans, since about 2% of the population carries the allele in East Asians, especially Koreans. part there is Accordingly, the mutation can be used as an analytic index to predict the risk of developing Alzheimer's disease in Koreans.
  • the term “gene” may be used interchangeably with the terms “polynucleotide” and “nucleic acid”.
  • the gene includes a DNA fragment involved in the production of a polypeptide chain, which includes regions before and after the coding region, for example, a promoter and a 3′-untranslated region, respectively, as well as between individual coding fragments (exons). It may mean including an intervening sequence (intron).
  • the term “gene mutation” refers to a change in a codon designating an amino acid due to a mutation in a part of the DNA sequence of a wild-type gene, and may include any one or more mutations.
  • truncating mutations missense mutations (or missense mutations), nonsense mutations, non-stop mutations, frame shift mutations, in-frame ( It may have one or more mutations selected from the group consisting of in-frame) mutations (or in-frame mutations), splice mutations, and splice_region mutations.
  • said gene mutation is a missense mutation.
  • the notation method of the missense mutation is “(amino acid type) amino acid position (new amino acid type)”, for example, R274W may mean that arginine at position 274 in a specific amino acid sequence is replaced with tryptophan.
  • onset risk or “onset probability” may mean a relative risk of the onset of Alzheimer's disease, and specifically may mean the possibility of progressing to Alzheimer's disease.
  • prediction means not only determining the possibility of Alzheimer's disease through the confirmation of the presence or characteristics of a pathological condition, but also determining whether or not drug reactivity, resistance, etc., after Alzheimer's disease treatment can
  • SHARPIN SHANK associated RH domain interactor
  • W/yKXGFFKR conserved membrane-proximal residues
  • SHARPIN may be derived from a mammal, preferably a human or a SHARPIN of the same strain as a human, and a mutant thereof.
  • human-like lineage refers to other mammals whose gene or mRNA has at least 80% sequence similarity with the human SHARPIN gene or mRNA derived therefrom, and specifically, it may include humans, primates, rodents, etc. .
  • the gene encoding SHARPIN is NCBI Accession No. It may be a sequence known to NM_000008.11, NM_000081.7, NM_005106.4 or NM_041761.1, but is not limited thereto.
  • the protein encoded by the gene is NCBI Accession No. It may be a sequence known to NP_112236.3, NP_079616.2, NP_112415.1 or NP_001267344.1, but is not limited thereto.
  • the 820th base of the SHARPIN gene sequence is a G substituted with A, which may be represented by NCBI refSNP ID: rs77359862.
  • the information providing method predicts that the risk of Alzheimer's disease is higher than when the 820th base is A, that is, when the 820th base of the wild-type SHARPIN gene is substituted from G to A, compared to when the 820th base is G It may further include the step of
  • the 274th amino acid of the SHARPIN protein includes a mutation from arginine (R) to tryptophan (W).
  • the polynucleotide or its complementary polynucleotide according to the present invention may consist of 10 or more, preferably 10 to 100, more preferably 20 to 80, even more preferably 40 to 60 consecutive bases. and is not limited thereto.
  • polynucleotide generally means any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide which may be unmodified RNA or unmodified DNA or modified RNA or modified DNA.
  • polynucleotides as defined herein include, but are not limited to, single- and double-stranded DNA, DNA including single- and double-stranded regions, single- and double-stranded RNA, and single- and double-stranded regions.
  • RNA comprising hybrid molecules comprising DNA and RNA, which may be single-stranded or more typically double-stranded, or may comprise single- and double-stranded regions.
  • DNA or RNA having a backbone that has been modified for stability or other reasons is a “polynucleotide” as the term is intended herein.
  • DNA or RNA comprising an unconventional base such as inosine or a modified base such as a tritiated base may be included in a “polynucleotide” as defined herein.
  • the term “polynucleotide” includes all chemically, enzymatically and/or metabolically modified forms of unmodified polynucleotides.
  • Polynucleotides can be prepared by a variety of methods, including in vitro recombinant DNA-mediated techniques, and by DNA expression in cells and organisms.
  • the fact that the single nucleotide polymorphism marker can be used for predicting the risk of developing Alzheimer's disease is based on the high probability of the presence of a specific base at the single nucleotide polymorphism site as a result of genetic analysis of the group with Alzheimer's disease.
  • the step of determining whether the 820th base represented by NCBI refSNP ID: rs77359862 in the SHARPIN gene is substituted is performed from the step of amplifying the polymorphic site corresponding to the sequence represented by rs77359862 or hybridizing with the probe.
  • the method may be a method obtained by amplifying a target nucleic acid through PCR and purifying it.
  • the method includes ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)), transcription amplification (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)), self-maintaining sequence replication (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874 (1990)) or nucleic acid-based sequence amplification (NASBA).
  • LCR ligase chain reaction
  • the step of determining whether the mutation may be performed from confirming the genotype of the 820th base.
  • the step of confirming whether the mutation is, sequencing analysis, hybridization by microarray, allele specific PCR (allele specific PCR), dynamic allele specific hybridization technique (dynamic allele specific hybridization, DASH), PCR extension analysis, SSCP, PCR-RFLP analysis or TaqMan technique, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (eg Sequenom's MassARRAY system), mini-sequencing method, Bio-Plex system (BioRad), CEQ and SNPstream systems (Beckman), Molecular Inversion Probe array technologies (e.g., Affymetrix GeneChip), and BreadArray technologies (e.g., Illumina GoldenGate and Infinium assays).
  • One or more alleles can be identified in polymorphic markers, including microsatellites, SNPs, or other types of polymorphic markers, by the above methods or other methods available to those skilled in the art. Determination of the base of such a polymorphic site may be preferably performed through a SNP chip.
  • gene sequence analysis may be performed. All methods known in the art may be used for the sequence analysis.
  • the sequence analysis is performed through an automatic sequencing machine, or pyrosequencing, PCR-RELP method (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP method (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO method (specific sequence oligonucleotide), ASO (allele specific oligonucleotide) hybridization method that combines PCR-SSO method and dot hybridization method, TaqMan-PCR method, MALDI-TOF/MS method, RCA method (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting) ) method, primer extension method, Southern blot hybridization method, or dot hybridization method may be performed by any one or more methods selected from known methods.
  • the information providing method can be usefully used to predict the risk of Alzheimer's disease in Koreans.
  • the NCBI refSNP ID: rs77359862 of the SHARPIN gene comprising a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases containing a mutation of the 820th base or a complementary polynucleotide thereof, Alzheimer's disease risk prediction provides a set of SNP genes for
  • polymorphism means a case in which two or more alleles exist at a single locus
  • polymorphic site means a locus in which the allele exists.
  • polymorphic sites those that differ only by a single nucleotide from one person to another are called “single nucleotide polymorphism”, that is, SNP (single nucleotide polymorphism).
  • SNPs have a high frequency of appearance and are distributed almost uniformly throughout the genome, they are judged to be highly reliable genetic polymorphisms for studying the relationship between the risk of onset or hypersensitivity and genes. Therefore, when such SNP changes are effectively analyzed, information related to the association with various diseases related to natural genetic modification can be effectively analyzed, which can greatly contribute to the screening of genetic diseases and personalized treatment.
  • SNPs are usually followed by highly conserved sequences. SNP usually occurs by replacing one base at a specific position with another, but it can also occur by deletion or duplication of nucleotides. In particular, a case in which the frequency of an allele is 5% or less is called a rare SNP, and a case in which the frequency of an allele is 5% or more is called a common SNP. Rare SNPs may differ by ethnicity or race. The range of rare SNPs can change depending on whether the definition of this rare SNP, a defined population, is viewed as a whole or limited to a specific group. It is a self-evident fact that other groups may exhibit the pattern of rare SNPs.
  • alleles refers to several types of a gene that exist at the same locus on a homologous chromosome. Alleles are also used to indicate polymorphism. For example, in the present invention, a single nucleotide polymorphism consisting of only two alleles was used as a marker. The SNP used in the present invention has two types of alleles. .
  • rs_id means rs_id, which is an independent marker given to all SNPs initially registered by the NCBI, which started to accumulate SNP information in 1998.
  • rs_id described in this table means a SNP marker, which is a polymorphic marker of the present invention.
  • the present invention provides a composition for predicting the risk of Alzheimer's disease, comprising a polynucleotide that specifically hybridizes with the polynucleotide.
  • the polynucleotide that specifically hybridizes with the above-described polynucleotide may be a probe or a primer.
  • primer refers to an oligonucleotide, and conditions that induce the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template), that is, the presence of nucleotides and a polymerization agent such as a DNA polymerase; And it can act as a starting point of synthesis under conditions of suitable temperature and pH.
  • the primer is a deoxyribonucleotide, and may be single-stranded.
  • the primer used in the present invention may include naturally occurring dNMP (ie, dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP), modified nucleotides, or non-natural nucleotides.
  • the primer may also include ribonucleotides.
  • the term “probe” refers to a natural or modified monomer or a linear oligomer including deoxyribonucleotides and ribonucleotides capable of hybridizing to a specific nucleotide sequence.
  • the probe may be single stranded for maximum efficiency in hybridization.
  • the probe may preferably be a deoxyribonucleotide.
  • a sequence that is completely complementary to the sequence including the SNP may be used, but a sequence that is substantially complementary within the range that does not interfere with specific hybridization may be used.
  • a probe not used in the present invention comprises a sequence capable of hybridizing to a sequence comprising 10 to 30 contiguous nucleotide residues comprising a SNP of the present invention. More preferably, the 3' end or 5' end of the probe may have a base complementary to the SNP base.
  • the terminal portion of the probe having a base complementary to the SNP base at the 3' end or the 5' end If this does not hybridize, these duplexes can dissociate under stringent conditions.
  • the present invention provides a composition for predicting the risk of Alzheimer's disease, comprising a polypeptide encoded by the polynucleotide or an antibody specific thereto.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site as a term known in the art.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a polypeptide comprising a SNP marker of the present invention.
  • Such an antibody can be prepared by cloning an expression vector for each gene according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene, and from the obtained protein by a conventional method.
  • This includes a partial peptide that can be made from the protein, and the partial peptide of the present invention includes at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and a part thereof is included in the antibody of the present invention as long as it has polyclonal antibody, monoclonal antibody, or antigen-binding property, and all immunoglobulin antibodies may be included.
  • the antibodies of the present invention may include specialized antibodies such as humanized antibodies.
  • the antibody used for the detection of the marker for predicting the risk of Alzheimer's disease of the present invention may include a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and may be Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv.
  • the present invention provides a kit for predicting the risk of Alzheimer's disease, comprising the polynucleotide, a polynucleotide hybridizing therewith, a polypeptide encoded by the polynucleotide, an antibody specific therefor, or cDNA of the polypeptide.
  • the kit may be a DNA chip, an RT-PCR kit, or a protein chip kit, but is not limited thereto.
  • the kit can predict the risk of Alzheimer's disease by amplifying the SNP polymorphic marker, which is a marker for predicting the risk of Alzheimer's disease, or by checking the expression level of the SNP polymorphic marker as the level of DNA or mRNA.
  • the kit for measuring the mRNA expression level of the marker for predicting the risk of Alzheimer's disease may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • the RT-PCR kit contains a test tube, or other suitable container, reaction buffer (with varying pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like.
  • the kit according to the present invention may be a kit for predicting the risk of developing Alzheimer's disease, including essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • a DNA chip kit is a method in which nucleic acid species are attached in a gridd array to a generally flat solid support plate, typically a glass surface no larger than a microscope slide, and the nucleic acids are uniformly arranged on the chip surface, and the DNA chip It is a tool that allows multiple hybridization reactions to occur between the nucleic acids on the chip surface and the complementary nucleic acids contained in the solution treated on the chip surface, enabling massively parallel analysis.
  • the kit according to the present invention may be a protein chip kit.
  • the protein chip kit can measure the expression level of a protein consisting of a mutated amino acid sequence.
  • the protein chip kit may include a substrate for immunological detection of the antibody, a suitable buffer solution, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or a fluorescent material, a chromogenic substrate, and the like.
  • a chromogenic enzyme peroxidase, alkaline phosphatase, or the like may be used.
  • AVTS 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • OPD o-phenyl
  • TMB tetramethyl benzidine
  • kit of the present invention prepared as described above, it is very economical because time and cost are reduced compared to the conventional general gene mutation search method.
  • gene mutation detection methods such as Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP), Protein Truncation Test (PTT), cloning, and direct sequencing, to test all one gene, on average, it takes several days to several months. This takes
  • gene mutations can be precisely tested quickly and simply through next generation sequencing (NGS).
  • SSCP Single Strand Conformational Polymorphism
  • PTT Protein Truncation Test
  • NGS next generation sequencing
  • the present invention provides a microarray for predicting the risk of Alzheimer's disease, comprising the polynucleotide, a polynucleotide hybridizing therewith, a polypeptide encoded thereby, an antibody specific therefor, or cDNA of the polypeptide.
  • the microarray according to the present invention may include DNA or RNA polynucleotides.
  • the microarray may be a conventional microarray except that the polynucleotide of the present invention is included in the probe polynucleotide.
  • Methods for preparing microarrays by immobilizing probe polynucleotides on a substrate are well known in the art.
  • the probe polynucleotide refers to a hybridizable polynucleotide, and refers to an oligonucleotide capable of sequence-specific binding to a complementary strand of a nucleic acid.
  • the probe of the present invention is an allele-specific probe.
  • a polymorphic site exists in nucleic acid fragments derived from two members of the same species, so that it hybridizes to a DNA fragment derived from one member but does not hybridize to a fragment derived from another member.
  • the hybridization conditions should be sufficiently stringent to hybridize to only one of the alleles by showing a significant difference in the intensity of hybridization between alleles. This can lead to good hybridization differences between different allelic forms.
  • the diagnostic methods include detection methods based on hybridization of nucleic acids, such as Southern blot, and may be provided in a form previously bound to a substrate of a DNA chip in a method using a DNA chip.
  • the hybridization may be usually performed under stringent conditions, for example, a salt concentration of 1 M or less and a temperature of 25° C. or higher.
  • the present invention relates to a SNP gene set, composition, information providing method, and kit that can predict the risk of Alzheimer's disease in Koreans, and SNP mutations associated with the risk of Alzheimer's disease were identified through whole genome association analysis (GWAS). Bar, through the SNP mutation, it can be used to diagnose or predict the onset of Alzheimer's disease in Koreans.
  • GWAS whole genome association analysis
  • rs77359862 is a gene closely related to East Asians and Koreans, which are not easily found in Westerners.
  • Figure 2 shows the association between the degree of amyloid-beta accumulation, cognitive function, and cortical atrophy and the rs77359862 A allele,
  • (a) is SHARPIN versus standard uptake value ratio (SUVR) for A ⁇ -PET data. shows the box plot of rs77359862 in
  • (b) shows the box plot of SHARPIN for the Seoul Neuropsychological Test (SNSB) score
  • (c) shows which part of the entire brain region the rs77359862 mutation affects the most.
  • SNSB Seoul Neuropsychological Test
  • Figure 3 shows the effect of the SHARPIN (R274W) mutation on the HOIP-SHARPIN complex using molecular dynamics (MD) simulation
  • (a) is a domain map of SHARPIN and HOIP protein
  • (b) is a wild-type ( The WT crystal structure and manually mutated Trp274 (box) of HIOPUBA-SHARPINUBL (PDB: 5X0W) showing the position of the Arg274 residue in WT) are shown
  • PDB: 5X0W The WT crystal structure and manually mutated Trp274 (box) of HIOPUBA-SHARPINUBL (PDB: 5X0W) showing the position of the Arg274 residue in WT) are shown
  • (c) the overall global deviation of the protein complex for 60 ns in WT and mutant.
  • a root-mean-square (RMSD) plot representing
  • FIG. 4 shows a comparison of WT SHARPIN and SHARPIN (R274W) for interaction with HOIP, in which (a) is a flag-tagged SHARPIN variant (WT and R247W) and 293T transiently co-transfected with Myc-tagged HOIP. The results of using each of the cells for immunoprecipitation are shown, and (b) shows the results of performing immunoprecipitation with an anti-flag antibody using the sample used in (a). In the case of mutations, it can be confirmed that the binding to HOIP is not working properly.
  • Figure 5 shows the overall analysis flow chart of the protocol according to the present invention.
  • FIG. 6 shows an MDS plot with three PC scores ((a) PC1 vs PC2; (b) PC2 vs PC3; and (c) PC1 vs PC3).
  • QQ Quantile-Quantile
  • Figure 10 shows a top SNP region plot for SHARPIN in the results of ADNI (a) and UKB (b), which are Western datasets.
  • FIG 11 shows the interaction on the surface of WT (a), in-silico mutant complex (b) and WT complex (c).
  • Figure 12 shows the interaction on the surface of the WT (a) and the mutant complex (b) after simulation.
  • Figure 14 shows color-coded surface models according to hydrophobicity of (a) WT and (b) mutants.
  • the study sample included 4,563 subjects enrolled in the Gwangju Alzheimer's & Related Dementia (GARD) cohort at Chosun University, Gwangju, and underwent neuropsychological evaluation using clinical dementia grade (CDR) scores and magnetic resonance imaging (MRI). .
  • CDR clinical dementia grade
  • MRI magnetic resonance imaging
  • Clinical diagnosis of the Alzheimer's disease state was made according to the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer Disease and Research Disorders Association (NINCDS-ADRDA) criteria.
  • Cognitively normal (CN) subjects had no evidence of neurological disease or impairment in cognitive function or activities of daily living. Subjects with a history of brain MRI, a history of head trauma, or a history of psychiatric disorders that may affect mental function were excluded.
  • CN cognitively normal
  • MCI mild cognitive impairment
  • AD Alzheimer's disease
  • Genotypes were pre-stepped using SHAPEIT and then replaced using 1000 Genomes Phase 3 reference panel and IMPUTE2. If the INFO score was less than 0.5, the genotype call rate was less than 0.98, or the p-value for HWE was 1x10 -6 , the imputed SNP was removed. Subjects were filtered if the genotype call rate was less than 0.95 or the APOE genotype was missing. As a result, 4,562 subjects and 13,715,061 SNPs remained. A detailed procedure for quality control is shown in FIG. 5 . A major component (PC) analysis of ancestry revealed little evidence of population stratification (Figure 6).
  • PC major component
  • T1-weighted images (Siemens Healtheneers, Erlangen, Germany) were acquired following the procedure described elsewhere and pretreated with FreeSurfer V.5.3.
  • Alzheimer's disease-related traits selected for GWAS included hippocampal volume and cortical thickness measurements in the entorhinal, inferior parietal, middle temporal, and superior frontal regions.
  • MRI traits were available for 209 AD, 1,449 MCI, and 985 CN subjects with genotyping data.
  • GWAS Full-length genetic analysis
  • SNP genotype was analyzed using a dominant model.
  • RFT random field theory
  • Gene-based analyzes including SNPs of Minor Allele Freqeuncy_ (MAF) ⁇ 0.01 (9,784,321 SNPs) for hippocampal volume and entorhinolaryngeal cortex thickness, were performed for characterization of genomic loci, annotation of candidate SNPs, functional gene mapping, and gene-based Analysis was performed using SNP2GENE in FUMA (Functional Mapping and Annotation of Genome-Wide Association Studies), which includes functions such as analysis. Multimarker analysis of the genome annotation (MAGMA) tool was used for gene-based analysis. The genome-wide significance threshold was set to p ⁇ 2.6x10 -6 , and the covariates were the same as those of GWAS.
  • SNPs of Minor Allele Freqeuncy_ (MAF) ⁇ 0.01 (9,784,321 SNPs) for hippocampal volume and entorhinolaryngeal cortex thickness were performed for characterization of genomic loci, annotation of candidate SNPs, functional gene mapping, and gene-based Analysis was
  • SNPs showing significant associations at the genomic level with MRI traits were further evaluated in a sample of 985 CN and 209 AD subjects to determine whether the effect on AD risk was mediated through specific MRI traits.
  • the intervention model was evaluated using linear regression with AD as outcome, SNP as predictor, and MRI characteristic variable as moderator.
  • the model also included gender, age, three PCs and log-corrected total brain volume (ICV) as covariates. Intervention analysis was performed using the PROCESS macro implemented in SPSS by selecting 4 and 10,000 bias-corrected bootstrap samples.
  • Accumulation of amyloid beta (A ⁇ ) in the brain was measured by positron emission tomography (A ⁇ -PET) in 77 AD, 196 MCI and 193 CN subjects. Preprocessing of A ⁇ -PET images (General Electric Medical Systems, Milwaukee, WI, USA) was performed using the method described elsewhere.
  • the standard uptake value ratio (SUVR) for the A ⁇ -PET data was calculated using six predefined anatomically relevant cortical regions of interest (frontal, temporal, parietal, precuneus, anterior, cingulate, and posterior) with the whole cerebellum used as a reference region. cingulate) was defined as the mean activity concentration.
  • An SUVR value less than 1.11 was positive, otherwise it was considered negative.
  • Molecular dynamics (MD) simulations were performed using the crystal structure of the SHARPIN UBL domain bound to the ligand HOIL-1 interacting protein N-terminal UBA domain (HOIP UBA) (PDB ID: 5X0W).
  • the selenomethionine residue in the crystal structure was replaced with methionine using CHARMM-GUI.
  • Mutant variant R274W is a SHARPIN UBL domain (wt) and a SHARPIN UBL domain (R274W) complexed with a HOIP UBA domain to set the Arg274 residue of the SHARPIN UBN domain (in PDB: 5X0W) to Trp using the Pymol v2.3 mutagenesis function. ) was dissolved in TIP3P water in a PBC rectangular box with a minimum of 10 ⁇ box-padding and neutralized with 0.15M NaCl. After annealing for 12,000 steps, both wild-type (WT) and mutant complexes were set to reach a temperature of 310 K for 10,000 steps to minimize energy at 0 K temperature. A 200-ps equilibration step was then run to distribute the heat.
  • the pCMV3flag8SHARPIN (#50014) and HOIP ORF clone (# RC204117) plasmids were purchased from Addgene and Origene, respectively.
  • HOIP was cloned into pcDNA6/myc-His A.
  • the mutant SHARPIN R247W was constructed by site-directed mutagenesis.
  • SHARPIN WT and SHARPIN R247W vectors were transfected into 293T cells with HOIP-myc vector using transfectin (#170-3351; Bio-Rad, CA, USA).
  • IP solution buffer 30 mM Tris-Cl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 10% glycerol and 2 mM EDTA, at 4°C and 1 hour. dissolved.
  • 1 mg cell extract was administered with 1 ⁇ g of anti-c-Myc 9E10 primary antibody (sc-40; Santa Cruz Biotechnology, Tx, USA) or anti-Flag M2 primary antibody (F3165; Sigma-Aldrich, MO, USA). was incubated at 4° C. overnight, and applied to protein A/G agarose beads (P9203; GenDEPOT, TX, USA) for 2 hours. After three washes, the lysates were immunoblotted.
  • the prepared lysate was subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, and then transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (IPVH00010; Millipore, Billerica, Mass.).
  • IPVH00010 Polyvinylidene difluoride membrane
  • the membrane was blocked with 5% skim milk, washed with 0.1% Tween20 in PBS, and incubated with anti-c-Myc 9E10 (sc-40; Santa Cruz) primary antibody.
  • the membranes were then further incubated with horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG (ab131368; Abcam, Cambridge, UK) for 2 h at room temperature.
  • Signals were developed using Clarity Western ECL substrate (1705061; Bio-Rad) and detected with a Fusion Solo S imaging system (VILBER, Collegien, France).
  • SHARPIN missense mutant rs77359862 is associated with Alzheimer's disease and indirectly affects Alzheimer's disease risk through effects on brain changes.
  • the SHARPIN missense mutation rs77359862 is associated with clinical measures and biomarkers in association with Alzheimer's disease.
  • the frequency of the rs77359862 missense variant was consistently greater than 1% in the present study, consistent with cognitively normal Koreans (1.4%), the Ansan-Anseong cohort (1.7%), as well as other East Asians included in the gnomAD database (1.4%). (Fig. 1d).
  • Fig. 1d we observed a higher frequency in Koreans with late-onset Alzheimer's disease (4.3%) and in 78 early-onset Alzheimer's disease (EOAD) patients (3.4%) diagnosed at Seoul National University Bundang Hospital. This variant was more prevalent in a sample of Thai EOAD patients (6.2%).
  • SHARPIN African rs77359862/AD association cannot be assessed in European ancestral populations. Therefore, we hypothesized that other rare functional variations in SHARPIN may be related to AD and MIR traits in non-Asians.
  • the present inventors performed a gene-based analysis to confirm the association of HV with SHARPIN containing 20 kb that crosses gene boundaries using GWAS for the whole genome sequence data of the ADNI cohort and the NeuroMed cohort data.
  • the rs77359862 variant is located in a domain involved in binding of SHARPIN to the ligand HOIL-1 interacting protein (HOIP), which encodes a RING-between-RING (RBR) domain type ⁇ 3 ligase.
  • HOIP ligand HOIL-1 interacting protein
  • RBR RING-between-RING
  • LUBAC linear ubiquitin chain assembly complex
  • the rs77359862 mutation replaces the polar Arg274 with a hydrophobic Trp (NP_112236.3: p.Arg274Trp) and is located in SHARPIN UBL (Fig. 3b).
  • this switch was thought to affect the stability of the bound HOIP UBA -SHARPIN UBL complex (Fig. 3b).
  • molecular dynamics (MD) simulations for the WT complex (PDB: 5X0W) and the in-silico SHARPIN mutant (R274W) complex were performed and structural changes within 60 ns were compared.
  • root mean square deviation (RMSD) analysis showed that both complexes (HOIP UBA -SHARPIN UBL and HOIP UBA -SHARPIN UBL (R274W)) were stable after the initial 10 ns of execution.
  • the global RMSD values of the mutant HOIP UBA -SHARPIN UBL (R274W) were 2-3 ⁇ higher than that of the WT complex over time. This was mainly due to fluctuations in structural elements including ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 4 of the mutant SHARPIN UBL (R274W) complex deduced using the root mean square fluctuation (RSMF) plot (Fig. 3d).
  • Previous GWAS has revealed many genetic risk loci of genomic significance for Alzheimer's disease, but they have not been consistently replicated.
  • the case/control study design has limitations, such as the experimental group susceptible to contamination by other neurodegenerative or cerebrovascular diseases, and the control group, which includes future Alzheimer's disease cases depending on the age. Therefore, clinical diagnosis of Alzheimer's disease and quantitative phenotype using brain imaging should be considered in GWAS, and new findings should also be interpreted as brain dysfunction in Alzheimer's disease.
  • this study investigated GWAS signals for volume and area changes in five MRI brain regions across the clinical spectrum of Alzheimer's (AD), MCI, and controls, after adjusting for APOE effects.
  • rs77359862 of SHARPIN was found to be a genome-wide significant result in the entorhinal cortex and hippocampus (p ⁇ 5.0x10 -8 ).
  • Our whole-brain analysis confirmed that rs77359862 of SHARPIN was strongly associated with brain atrophy in the entorhinal cortex and hippocampal volume, indicating that subjects with the rs77359862 A allele exhibit greater hippocampal atrophy than subjects with the major allele.
  • rs77359862 is critically involved in Alzheimer's disease and affects A ⁇ accumulation, a major constituent of amyloid plaques in PET images, functionally implicated in the frontal lobe and memory. According to Jung et al [Ref. 4], execution and memory, but not language or spatiotemporal impairment, had a higher risk of cognitive decline, and it was found that rs77359862 was significantly associated with executive and memory abilities.
  • CN or MCI patients carrying the rs77359862 A allele were significantly more likely to regress to MCI or AD, respectively.
  • These findings correspond to the pathology of AD, where neurons and connections in memory-related brain regions, such as the entorhinal cortex and hippocampus, are impaired through amyloid accumulation.
  • this mutation may be related to EOAD with duplicates of EOAD patients in other data sets from Korea and Thailand, and may play an important role in the Asian population.
  • SHARPIN is a component of the linear ubiquitination assembly complex (LUBAC) along with HOIP that inhibits NF-kb signaling (PMID: 21811235).
  • LUBAC linear ubiquitination assembly complex
  • R274W mutation of the SHARPIN UBL domain on complex formation with HOIP
  • 60 ns MD simulations at 310 K were performed using crystal structures (PDB: 5X0W) for both WT and mutant variants (R274W).
  • PDB 5X0W
  • Our MD analysis strongly suggested that the mutant complex HOIP UBA domain and SHARPIN UBL domain (R274W) could destabilize the complex on the surface due to the following reasons.
  • the RMSD plot showed that the overall global deviation was higher in mutant variants compared to WT.
  • Atomic fluctuations of ⁇ 1 of the mutant SHARPIN UBL domain (R274W) compared to WT may explain the higher RMSD.
  • Trp274 may have enhanced hydrophobic interactions between the HOIP UBA domain and the SHARPIN UBL domain due to the surface hydrophobic patch and ⁇ - ⁇ interactions and the adjacent Phe509 interactions of HOIP UBA .
  • the physical interaction between HOIP and R274W mutant SHARPIN was significantly reduced compared to the interaction with WT SHARPIN. This labile complex may affect downstream SHARPIN-mediated NF-kB signaling pathways.
  • NF-kB signaling plays a key role in the pathophysiology of Alzheimer's disease, including neuroinflammation, memory enhancement deficits, A ⁇ clearance and neuronal cell death (PMID: 20066105).
  • a rare functional variant of SHARPIN has previously been found in the Japanese population and is associated with an increased risk of late-onset AD. This mutant SHARPIN showed reduced NF-kB activation in HEK293 cells.
  • SHARPIN is abundant at the synaptic site of mature neurons, coexisting with SHANK1 (PMID: 11178875). It is well known that activated NF-kB can migrate from activated synapses to the soma, which is important for long-term memory.
  • SHARPIN mutation inhibits the anni-apoptotic pathway and can induce apoptosis or necrosis in neurons (PMID: 2006615, PMID: 30467385).
  • knockdown of SHARPIN using siRNA inhibited A ⁇ -induced phagocytosis in macrophages, supporting a marked increase in amyloid plaque accumulation in subjects with the R274W mutant SHARPIN.
  • GABRR encodes the gamma-aminobutyric aicd (GABA) receptor subunit rho-2 and is an important gene in the hippocampus.
  • GABA gamma-aminobutyric aicd

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Abstract

본 발명은 한국인에게서 알츠하이머병의 발병 위험도가 높음을 예측할 수 있는 SNP 마커를 제공함으로써 알츠하이머병 발병 위험군을 조기에 진단 및 예측할 수 있는 정보 제공 방법, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 조성물, 및 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다.

Description

알츠하이머병 발병 위험도 예측을 위한 단일염기다형성 마커 및 이의 용도
본 발명은 알츠하이머병 발병 위험도와 유의적 상관관계를 가지는 특정 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)를 확인하여 알츠하이머병의 발병 위험도를 예측하는 방법, 상기 SNP를 확인할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 cDNA를 포함하는 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 조성물, 그리고 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease)은 인지기능 장애 및 기억상실을 유발하는 진행성 장애이다. 알츠하이머병의 주요 위험 요인에는 나이, 가족력 및 생활 방식이 포함된다. 알츠하이머병과 관련하여, 전장 유전체 연구(GWAS)는 30개가 넘는 독립적인 유전자좌를 발견했으나, 표현형 변화의 절반 이상이 여전히 설명되지 않은 채 남아있다. 아프리카계 미국인(비특허문헌 1), 히스패닉계(비특허문헌 2 및 3), 일본인(비특허문헌 4 및 5) 및 중국인(비특허문헌 6)뿐만 아니라 초민족적 접근(비특허문헌 7)에 중점을 둔 GWAS에 의해 입증된 다양한 집단 연구를 통해 추가적인 알츠하이머병 위험 유전자좌의 검출을 향상시킬 수 있다. 다양한 모집단에 대한 연구에서는 종종 모집단에 특화된 특정 변이 및 연관 신호에서 가변 강도를 야기하는 대립 유전자의 빈도 차이를 활용할 수 있다. 또한, 질병 감수성 유전자좌의 영향은 인구에 따라 노출이 다른 환경 위험 요소에 의해 조절될 수 있다.
한편, 인간의 경우 약 1000 염기 당 1회 빈도로 변이가 있는데, 이것을 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 하며, 5% 다형을 common polymorphism, 1 내지 5% 다형을 rare polymorphism이라고 한다. 현재 인간의 전체 염기서열을 분석하기 위해 많은 실험 기법 등이 발달하였고, 그 중 전장 유전체 연구(Genome-wide association study; GWAS)는 현재까지 많은 질환의 연구에 사용되고 있다.
GWAS는 일반적으로 common disease가 common variant와 연관되어 있다는 가정 하에 연구를 진행하는데, 이러한 연구에서 '손실된 유전율(missing heritability)'의 문제가 발생하는 것으로 생각된다. '손실된 유전율'이란 개별 유전자가 질환이나 행동 등의 표현형(phenotype)을 모두 설명할 수 없어 나타나는 현상이며, 질환은 모든 유전자형의 조합에 의해 결정된다는 견해이다. 최근에는 이를 보완하기 위해 유전자-환경 상호작용, 유전자-유전자 상호작용 분석 등이 많이 활용되고 있다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 1)Reitz, C., Jun, G., Naj, A., Rajbhandary, R., Vardarajan, B.N., Wang, L.S., Valladares, O., Lin, C.F., Larson, E.B., Graff-Radford, N.R., et al. (2013). Variants in the ATP-binding cassette transporter (ABCA7), apolipoprotein E 4, and the risk of late-onset Alzheimer disease in African Americans. Jama 309, 1483-1492.
(비특허문헌 2)Lee, J.H., Cheng, R., Barral, S., Reitz, C., Medrano, M., Lantigua, R., Jimenez-Velazquez, I.Z., Rogaeva, E., St George-Hyslop, P.H., and Mayeux, R. (2011). Identification of novel loci for Alzheimer disease and replication of CLU, PICALM, and BIN1 in Caribbean Hispanic individuals. Arch Neurol 68, 320-328.
(비특허문헌 3)Vardarajan, B.N., Barral, S., Jaworski, J., Beecham, G.W., Blue, E., Tosto, G., Reyes-Dumeyer, D., Medrano, M., Lantigua, R., Naj, A., et al. (2018). Whole genome sequencing of Caribbean Hispanic families with late-onset Alzheimer's disease. Ann Clin Transl Neurol 5, 406-417.
(비특허문헌 4)Miyashita, A., Koike, A., Jun, G., Wang, L.S., Takahashi, S., Matsubara, E., Kawarabayashi, T., Shoji, M., Tomita, N., Arai, H., et al. (2013). SORL1 is genetically associated with late-onset Alzheimer's disease in Japanese, Koreans and Caucasians. PLoS One 8, e58618.
(비특허문헌 5)Asanomi, Y., Shigemizu, D., Miyashita, A., Mitsumori, R., Mori, T., Hara, N., Ito, K., Niida, S., Ikeuchi, T., and Ozaki, K. (2019). A rare functional variant of SHARPIN attenuates the inflammatory response and associates with increased risk of late-onset Alzheimer's disease. Mol Med 25, 20.
(비특허문헌 6)Zhou, X., Chen, Y., Mok, K.Y., Zhao, Q., Chen, K., Chen, Y., Hardy, J., Li, Y., Fu, A.K.Y., Guo, Q., et al. (2018). Identification of genetic risk factors in the Chinese population implicates a role of immune system in Alzheimer's disease pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 115, 1697.
(비특허문헌 7)Jun, G.R., Chung, J., Mez, J., Barber, R., Beecham, G.W., Bennett, D.A., Buxbaum, J.D., Byrd, G.S., Carrasquillo, M.M., Crane, P.K., et al. (2017). Transethnic genome-wide scan identifies novel Alzheimer's disease loci. Alzheimers Dement 13, 727-738.
본 발명의 목적은 환자로부터 얻은 유전자 시료에 대하여 알츠하이머병의 위험도와 유의적 상관관계를 갖는 특정 SNP를 확인함으로써, 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 환자로부터 얻은 유전자 시료에 대하여 알츠하이머병의 위험도와 유의적 상관관계를 갖는 특정 SNP를 확인함으로써, 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특정 SNP 마커를 확인할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 이에 대한 항체 또는 이의 cDNA를 포함하는, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 특정 SNP 마커를 확인할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 이에 대한 항체 또는 이의 cDNA를 포함하는, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 키트를 제공하는 것이다.
알츠하이머병은 환경적 요인과 유전적 요인에 기인하는데, 유전적 요인을 미리 예측하여 예방하는 것이 알츠하이머병을 효과적으로 예방하는 것이다. 본 발명에서는 유전자-유전자 상호작용을 이용하여 알츠하이머병을 예측하는 강력한 모형을 제시할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 한국인에 있어서 알츠하이머병의 발병에 특이적으로 나타나는 단일염기다형성(SNP)을 찾아내고자, 한국인 알츠하이머병(AD) 환자와 단순한 인지장애(MCI) 환자 및 정상인(CN)을 비교하여 전체 유전체 연관성 분석 연구(GWAS; Genome-wide association study)를 진행하고, 연관성 분석을 수행하였다. 그 결과, 한국인에서 알츠하이머병 발병 환자에 특이적으로 나타나는 단일염기다형성을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
본 발명은, 환자로부터 얻은 유전자 시료에 대하여,
SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기의 치환 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 유전자 시료는 대상(환자)의 혈액, 피부세포, 점막세포 및 모발 등 모든 세포로부터 분리될 수 있는 DNA 또는 RNA를 의미한다. 해당세포로부터 DNA 또는 RNA를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 DNA 또는 RNA 추출용 키트를 사용할 수 있다.
상기 대상(환자)은 알츠하이머병으로 판정되거나, 의심되는 대상을 포함할 수 있다. 상기 대상은 척추동물일 수 있고, 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 구체적으로 포유동물일 수 있다. 예를 들어, 상기 대상은 인간(Homo sapiens)일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 대상(환자)은 한국인일 수 있다. 해당 변이는 서양인 집단에서는 거의 발견되지 않는 반면 (대립 유전자 비율: 0.01%), 동아시아인, 그 중에서도 한국인에게서는 인구의 2% 정도가 대립 유전자를 가지고 있기 때문에 상기 대상은 동아시아인, 특히 한국인에게 적용될 수 있는 부분이다. 이에, 상기 변이는 한국인에서 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위해 분석 가능한 지표로 활용될 수 있다.
본 발명에서, “유전자”는 용어 “폴리뉴클레오타이드”, “핵산”과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 유전자는 폴리펩타이드 사슬 생성에 관여하는 DNA 조각을 포함하며, 이는 코딩 부위 이전 및 이후의 부위, 예를 들면 프로모터 및 3'-미번역 부위를 각각 포함할 뿐만 아니라, 개별적인 코딩 단편(엑손) 사이의 개입서열(인트론)을 포함하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, “유전자 돌연변이”는 야생형 유전자의 DNA 서열 일부에 변이가 일어나 아미노산을 지정하는 코돈이 변경된 것으로, 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 절단형(truncating) 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이(또는 과오 돌연변이), 넌센스(nonsense) 돌연변이, 넌스탑(non-stop) 돌연변이, 프레임 시프트(frame shift) 돌연변이, 인-프레임(in-frame) 돌연변이(또는 해독틀내 돌연변이), 스플라이스 돌연변이, 및 스플라이스 사이트(splice_region) 돌연변이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자 돌연변이는 미스센스 돌연변이이다. 상기 미스센스 돌연변이의 표기 방식은 “(아미노산 종류)아미노산 위치(새 아미노산 종류)”로, 예를 들어, R274W는 특정 아미노산 서열에서 274번째 위치의 알지닌이 트립토판으로 대체되었음을 의미할 수 있다.
본 발명에서, “발병 위험도” 또는 “발병 가능성”은 알츠하이머병의 발병의 상대적 위험을 의미할 수 있으며, 구체적으로 알츠하이머병으로 진행될 가능성을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서, “예측”은 병리 상태의 존재 또는 특징의 확인을 통해, 알츠하이머병의 발병 가능성을 판단하는 것뿐만 아니라, 알츠하이머병 치료 후, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, “SHARPIN(SHANK associated RH domain interactor)”은 보존된 막-근위 잔기(W/yKXGFFKR)에서 α1 및 α2 인테그린 꼬리에 결합하여 백혈구에서 β1 및 β2 인테그린 활성화를 억제하는 40kDa 이하의 단백질을 암호화하는 유전자를 말한다. 상기 SHARPIN은 포유동물 유래, 바람직하게는 사람 또는 사람과 동일한 계통의 SHARPIN 및 그의 돌연변이체일 수 있다. 사람과 같은 계통이라 함은 유전자 또는 mRNA가 사람의 SHARPIN 유전자 또는 이로부터 유래하는 mRNA와 80% 이상의 서열 유사성을 가진 다른 포유동물을 말하는 것으로, 구체적으로, 사람, 영장류, 설치류 등을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 SHARPIN를 암호화하는 유전자는 NCBI Accession No. NM_000008.11, NM_000081.7, NM_005106.4 또는 NM_041761.1에 공지된 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 NCBI Accession No. NP_112236.3, NP_079616.2, NP_112415.1 또는 NP_001267344.1에 공지된 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 SHARPIN 유전자 서열의 820번째 염기는 G가 A로 치환된 것으로, NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시할 수 있다.
본 발명에 따른 정보 제공 방법은, 상기 820번째 염기가 A인 경우, 즉 야생형 SHARPIN 유전자의 820번째 염기가 G에서 A로 치환된 경우, 820번째 염기가 G인 경우보다 알츠하이머병 발병 위험도가 높다고 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기와 같이 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 염기의 치환이 확인된 경우, SHARPIN 단백질의 274번째 아미노산은 알지닌(R)에서 트립토판(W)으로 변이된 것을 포함한다.
본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 80개, 보다 더 바람직하게는 40 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, “폴리뉴클레오타이드”는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 비변형된 DNA 또는 변형된 RNA 또는 변형된 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다. 따라서, 예를 들어 본 명세서에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드는 비제한적으로 단일- 및 이중가닥 DNA, 단일- 및 이중가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중가닥 RNA, 및 단일- 및 이중가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는 이중가닥이거나, 또는 단일- 및 이중가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA는 본 명세서에서 의도된 용어와 같은 “폴리뉴클레오타이드”이다. 또한, 이노신과 같은 비통상적 염기 또는 삼중수소화 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본 명세서에 정의된 바와 같은 “폴리뉴클레오타이드”에 포함될 수 있다. 일반적으로, 용어 “폴리뉴클레오타이드”는 비변형된 폴리뉴클레오타이드의 모든 화학적, 효소적 및/또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기술을 비롯한 다양한 방법에 의해, 그리고 세포 및 유기체 내의 DNA 발현에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서, 상기 단일염기다형성 마커가 알츠하이머병 발병 위험도 예측에 이용될 수 있다는 것은, 알츠하이머병이 발병된 군의 유전자 분석 결과 단일염기다형성 부위에서 특정 염기가 존재할 확률이 높다는 것에 근거한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기의 치환 여부를 확인하는 단계는 상기 rs77359862로 표시되는 서열에 해당하는 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계로부터 수행될 수 있다. 상기 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업계에 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 PCR을 통해 표적 핵산을 증폭하고, 이를 정제하여 얻는 방법일 수 있다. 그 외, 상기 방법은 리가아제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplication) (Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 또는 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 변이 여부를 확인하는 단계는, 820번째 염기의 유전자형을 확인하는 것으로부터 수행될 수 있다. 상기 변이 여부를 확인하는 단계는, 서열분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들어, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), 분자 도치 프로브(Molecular Inversion Probe) 어레이 기술(예를 들어, Affymetrix GeneChip), 및 BreadArray 기술(예를 들어, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 SNP 칩을 통해 수행될 수 있다.
또한, 유전자형을 확인하는 단계에서는 유전자 서열 분석이 수행될 수 있다. 상기 서열 분석은 당업계에 공지된 모든 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열 분석은 자동염기서열분석기를 통해 수행되거나, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법 또는 도트 하이브리드화법 등 공지의 방법 중 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 한국인에서의 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하는데 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은, SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기의 돌연변이를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 SNP 유전자 세트를 제공한다.
본 발명에서, “다형성(polymorphism)”은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립유전자가 존재하는 경우를 의미하며, “다형성 부위(polymorphic site)”란 상기 대립유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 “단일염기다형성”, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)이라고 한다.
게놈 유전자의 99.9%는 개체 내에서 공통적이고, 나머지 0.1%가 특정 질환에 대한 발병 위험도, 과민성 등과 관련한 개체 차이에 관여하고 있다고 여겨지는데, 이러한 발병 위험도 또는 과민성과 직접적으로 관련있다고 생각되는 것이 SNP이다. SNP는 출현 빈도가 높고, 게놈 전체에 걸쳐 거의 균등하게 분포되어 있기 때문에 상기 발병 위험도 또는 과민성과 유전자의 관련성을 연구하는 신뢰성 높은 유전자 다형성이라고 판단되고 있다. 따라서, 이러한 SNP의 변화를 효과적으로 분석하는 경우, 자연적인 유전자 변형과 관련된 각종 질환과의 연관성과 관련된 정보를 효과적으로 분석할 수 있어, 유전적 질환의 스크리닝 및 개인별 맞춤 치료에 크게 기여할 수 있다.
이러한 SNP의 위치는 보통 매우 보존된 서열들이 그 전후로 존재하게 된다. SNP는 보통 특정 위치의 한 염기가 다른 염기로 치환되어 일어나게 되는데, 뉴클레오타이드의 결실이나 중복에 의해서도 일어날 수 있다. 특히, 대립유전자형(allele)의 빈도가 5% 이하인 경우를 rare SNP(레어 SNP)라고 하며, 대립유전자형의 빈도가 5% 이상인 경우에는 common SNP(커먼 SNP)라고 한다. rare SNP는 민족별 또는 인종별로 다르게 나타날 수 있다. 이러한 rare SNP, 일정하게 정의된 집단(population)의 정의를 인류 전체로 볼 것인지, 특정 집단에 한정하여 볼 것인지에 따라 rare SNP의 범위가 변화할 수 있고, 한 집단에서 common SNP로 보이는 변이라 하더라도, 다른 집단에서는 rare SNP의 양상을 나타낼 수 있음은 자명한 사실에 해당한다.
상기 “대립유전자(allele)”는 상동 염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대 본 발명에서는 오직 두 가지 대립형질로만 이루어질 수 있는 단일염기다형성을 마커로 사용하였는바, 본 발명에서 사용되는 SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에서, “rs_id”는 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs_id를 의미한다. 이와 같은 표에 기재된 rs_id는 본 발명의 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다.
또한, 본 발명은, 상기 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 앞서 기술한 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드는 프로브 또는 프라이머일 수 있다.
본 발명에서, “프라이머(primer)”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며, 단일쇄일 수 있다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명에서, “프로브(probe)”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 상기 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위해 단일 가닥일 수 있다. 상기 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되지 않는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 가질 수 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플레스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3' 말단 또는 5' 말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 항체란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 SNP 마커를 포함하는 폴리펩타이드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터를 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체와 같은 특수 항체도 포함될 수 있다. 본 발명의 알츠하이머병의 발병 위험도 예측용 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드, 이와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드, 이에 특이적인 항체 또는 상기 폴리펩타이드의 cDNA를 포함하는 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서, 상기 키트는 DNA 칩, RT-PCR 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 알츠하이머병의 발병 위험도 예측용 마커인 SNP 다형성 마커의 증폭을 통해 확인하거나, SNP 다형성 마커의 발현 수준을 DNA 또는 mRNA의 수준으로 확인함으로써 알츠하이머병의 발병 위험도를 예측할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서, 상기 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 마커의 유전자에 대해 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브, 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한, 바람직하게는, 본 발명에 따른 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 알츠하이머병의 발병 위험도 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩 키트는 돌연변이된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다. 단백질 칩 키트는 항체의 면역학적 검출을 위해 기재, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 발색 효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광 물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질로는 AVTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
상기와 같이 제작된 본 발명의 키트의 경우, 기존의 일반적인 유전자의 돌연변이 검색 방법에 비해 시간과 비용이 절감되어 매우 경제적이다. SSCP(Single Strand Conformational Polymorphism), PTT(Protein Truncation Test), 클로닝(Cloning), 직접 염기서열 분석(Direct sequencing) 등과 같은 기존의 유전자 돌연변이 검색 방법을 이용하여 한 유전자를 모두 검사하려면 평균적으로 수일 내지 수개월이 소요된다. 또한, 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing; NGS)을 통해서도 빠르고 간단하게 유전자 돌연변이를 정밀하게 검사할 수 있다. 돌연변이를 SSCP, 클로닝, 직접 염기 서열 분석, RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 등의 기존 분석 방법에 의해 검사하는 경우, 검사 완료까지 약 한달 가량 소요되는 반면, 본 발명의 키트를 이용하면 시료 DNA가 준비되어 있을 경우, 약 10시간 내지 11시간 내에 결과를 얻을 수 있고, 칩 하나에 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트가 함께 집적되어 있기 때문에 기존의 방법에 비해 시간뿐만 아니라 비용까지 절감할 수 있다. 기존의 방법에 비해 매 실험당 평균 절반 이하의 시약비가 소모되므로, 연구자의 인건비까지 감안했을 때 더욱 큰 비용의 절감 효과를 기대할 수 있게 된다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드, 이와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드, 이에 특이적인 항체 또는 상기 폴리펩타이드의 cDNA를 포함하는 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오타이드에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 프로브 폴리뉴클레오타이드를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오타이드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1 M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 한국인에서의 알츠하이머병 발병 위험도를 예측할 수 있는 SNP 유전자 세트, 조성물, 정보 제공 방법, 및 키트에 관한 것으로, 전장 유전체 연관성 분석(GWAS)을 통해 알츠하이머병 발병 위험도와 연관된 SNP 변이를 확인하였는바, 상기 SNP 변이를 통해 한국인에서의 알츠하이머병 진단 또는 발병 예측에 활용할 수 있다.
도 1은 GWAS 결과를 나타낸 것으로, (a)는 해마에 대한 SHARPIN의 부위 관련 맨하탄 플롯(Manhattan plot)이고, (b)는 SHARPIN 및 알츠하이머(AD) 상태에서 rs77359862 사이의 매개 분석 결과를 나타낸 것이며, (c)는 rs77359862의 AD 발병 연령에 미치는 영향을 케플런-마이어(Kaplan-Meier) 생존곡선을 통해 나타낸 것이고, (d)는 각 집단 별로 SHARPIN에서 rs77359862의 마이너 대립 유전자 빈도를 나타낸 것이다. 이를 통해, rs77359862는 서양인에서는 쉽게 발견되지 않는 동아시아인, 나아가 한국인과 밀접한 관련이 있는 유전자임을 확인할 수 있다.
도 2는 아밀로이드 베타(Amyloid-beta) 축적 정도, 인지 기능 및 피질 위축과 rs77359862 A 대립 유전자와의 연관성을 나타낸 것으로, (a)는 Aβ-PET 데이터에 대한 표준 흡수값 비율(SUVR)에 대한 SHARPIN에서 rs77359862의 박스 플롯을 나타낸 것이고, (b)는 서울 신경 심리 검사(SNSB) 점수에 대한 SHARPIN의 rs77359862 박스 플롯을 나타낸 것이며, (c)는 rs77359862 변이가 뇌 전체 영역 중 어느 부분에 많은 영향을 미치는지 확인하기 위해 피질 세선화맵을 나타낸 것이다.
도 3은 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 사용하여 HOIP-SHARPIN 복합체에 대한 SHARPIN(R274W) 돌연변이의 효과를 나타낸 것으로, (a)는 SHARPIN 및 HOIP 단백질의 도메인 맵을 나타낸 것이고, (b)는 야생형(WT)에서 Arg274 잔기의 위치를 나타내는 HOIPUBA-SHARPINUBL(PDB: 5X0W)의 WT 결정 구조 및 수동으로 돌연변이된 Trp274(box)를 나타낸 것이며, (c)는 WT 및 돌연변이에서 60ns 동안 단백질 복합체의 전체 전역 편차를 나타내는 제곱 평균 제곱근(RMSD) 플롯을 나타낸 것이고, (d)는 단백질 복합체의 각 잔기가 60초 시뮬레이션 기간 동안 겪은 변동을 나타내는 RMSF 플롯을 나타낸 것이다.
도 4는 HOIP와의 상호작용에 대한 WT SHARPIN 및 SHARPIN(R274W)의 비교를 나타낸 것으로, (a)는 플래그 태그가 지정된 SHARPIN 변이체(WT 및 R247W) 및 Myc 태그가 지정된 HOIP로 일시적으로 공동 형질 감염된 293T 세포를 각각 면역 침전에 사용한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 (a)에서 사용된 샘플을 사용하여 항 플래그 항체에 의해 면역 침전을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 돌연변이의 경우 HOIP과의 결합이 제대로 되고 있지 않음을 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명에 따른 프로토콜의 전체 분석 순서도를 나타낸 것이다.
도 6은 3개의 PC 스코어((a) PC1 vs PC2; (b) PC2 vs PC3; 및 (c) PC1 vs PC3)가 있는 MDS 플롯을 나타낸 것이다.
도 7은 각 MRI 특성에 대한 GWAS의 맨하튼 플롯을 나타낸 것이다.
도 8은 GWAS의 QQ(Quantile-Quantile) 플롯을 나타낸 것이다.
도 9는 희귀 변이체 및 DGE(differential gene expression) 분석을 통한 유전자 기반 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 서양인 데이터셋인 ADNI(a) 및 UKB(b) 결과에서 SHARPIN에 대한 상위 SNP 지역 플롯을 나타낸 것이다.
도 11은 WT(a), in-silico 돌연변이 복합체(b) 및 WT 복합체(c)의 표면에서의 상호 작용을 나타낸 것이다.
도 12는 시뮬레이션 후 WT(a)와 돌연변이 복합체(b)의 표면에서의 상호작용을 나타낸 것이다.
도 13은 복합체 표면의 정전기 전위를 나타낸 것이다. (a) WT 및 (b) 돌연변이체 사이에 전하의 변화가 명확하게 드러난다.
도 14는 (a) WT 및 (b) 돌연변이체의 소수성에 따라 색상이 지정된 표면 모델을 나타낸 것이다.
이하, 본 출원을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
[실시예 1] 실험 방법 및 조건
1. GWAS(Genome-wide Association Study) 참가자
연구 샘플에는 광주 조선대학교의 GARD(Gwangju Alzheimer's & Related Dementia) 코호트에 등록된 4,563명의 피험자가 포함되어 있으며, 임상 치매 등급(CDR) 점수와 자기공명영상(MRI)을 활용한 신경 심리학적 평가를 받았다. 알츠하이머병 상태의 임상 진단은 NINCDS-ADRDA(National Instititute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer Disease and Research Disorders Association) 기준에 따라 이루어졌다. 인지기능 정상(cognitively normal; CN) 피험자는 일상 생활의 인지 기능 또는 활동에서 신경 질환이나 손상의 증거가 없었다. 뇌 MRI, 두부 외상 병력 또는 정신 기능에 영향을 미칠 수 있는 정신 장애의 병력이 발견된 대상은 제외하였다. 기준선에는 1,614명의 인지기능 정상(CN), 1,813명의 경도 인지 장애(mild cognitive impairment; MCI) 및 1,136명의 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD) 피험자가 있었다. 629명의 CN 및 247명의 MCI 피험자의 하위 집합은 2010년-2020년 사이에 적어도 한 번의 추적 검사를 받았다(평균 추적 기간: 28.6개월). 추적 검사 후, 53명의 CN 및 21명의 MCI 피험자가 각각 MCI 및 AD로 재분류되어 1,561명의 CN, 1,845명의 MCI 및 1,157명의 알츠하이머병(AD) 피험자를 포함하는 최종 샘플을 만들었다.
연구 프로토콜은 한국 조선대학교 병원 기관 심의위원회(CHOSUN 2013-21-018-070)의 승인을 받았다. 인지 장애인을 위한 모든 자원봉사자 또는 승인된 보호자는 참여 전에 서면 동의를 받았다.
2. 유전자형 분석, 품질 관리, 대치 및 주요 구성요서 분석 절차
5,570명의 피험자에 대해, Affymetrix 맞춤형 SNP 칩인 KoreanChip을 사용하여 유전자형을 분석하였다. 유전자형 데이터는 PLINK와 ONETOOL을 사용하여 처리하였다. Hardy-Weinberg 평형(p<1x10-5)이 아닌 유전형 call rate가 95% 미만이거나, Chi-square 실험에 의해 결정된 CN, MCI 및 AD 사이의 유의미한 call rate 차이(p<1x10-5)인 경우 SNP는 제거하였다. 이 필터를 적용한 후, 4,563명의 피험자와 685,742개의 SNP가 남았다.
유전자형은 SHAPEIT를 사용하여 사전 단계를 수행한 다음, 1000 Genomes Phase 3 참조 패널과 IMPUTE2를 사용하여 대치하였다. INFO 점수가 0.5 미만, 유전자형 call rate가 0.98 미만이거나 HWE에 대한 p-value가 1x10-6이면 대치된 SNP를 제거하였다. 유전자형 call rate가 0.95 미만이거나 APOE 유전자형이 누락된 경우 대상을 필터링하였다. 그 결과, 4,562명의 피험자와 13,715,061개의 SNP가 남았다. 정도 관리(Quality Control)에 대한 자세한 절차는 도 5에 나타나있다. 조상의 주요 구성 요소(PC) 분석은 인구 계층화의 증거가 거의 없음을 나타내었다(도 6).
3. 뇌 MRI 획득 및 처리
T1 가중 이미지(Siemens Healtheneers, Erlangen, Germany)는 다른 곳에서 설명된 절차에 따라 획득하였고, FreeSurfer V.5.3으로 전처리하였다. GWAS를 위해 선택된 알츠하이머병 관련 특성에는 내후각 피질(entorhinal), 하두정소엽(inferior parietal), 중간 측두회(middle temporal) 및 상전두고랑 영역(superior frontal region)의 해마 부피 및 피질 두께 측정이 포함되었다. MRI 형질은 유전자형 데이터가 있는 209명의 AD, 1,449명의 MCI 및 985명의 CN 피험자에게 이용 가능했다. 1.5T(n=688) 스캐너와 비교하여 3.0T(n=1,955)로 측정한 피험자 간의 비정규 특성 분포와 실질적인 특성 분포 차이를 관찰했기 때문에 각 하위 그룹에 대한 특성을 표준화한 다음 역 정규 변환으로 변환하였다. MRI 특성에 대한 기술 통계는 Rex Version 3.0.3 소프트웨어(RexSoft Inc., Seoul, Korea)를 사용하여 얻었다.
4. 관련 분석 방법
PLINK와 대치된 SNP 유전자형 및 나이, 성별, APOE 유전자형에 대한 공변량을 포함하는 선형 회귀 모델을 사용하여 각 형질에 대해 전장 유전자 분석(GWAS)을 수행하였다. PC 분석은 EIGENSOFT를 사용하여 유전적 관계 매트릭스를 설명하였다. APOE 유전자형은 ε2/ε2, ε2/ε3, ε3/ε3, ε2/ε4, ε3/ε4 및 ε4/ε4에 대한 5개의 더미 변수가 있는 클래스 변수로 코딩되었다. 총 SNP(3,930,740 SNP)가 0.01보다 작은 대립 유전자 빈도를 가지고 실험되었다. 유전체 차원의 유의적 임계 값은 p<5.0x10-8로 설정되었다. LocusZoom을 사용하여 지역 플롯을 생성하고, R 소프트웨어 v.3.6(R Development Core Team, Vienna, Austria)을 사용하여 QQ, Miami 및 Manhattan 플롯을 생성했다. 후속 분석은 ADNI 및 AddNeuroMed 데이터 세트에서 수행되어 유전체 전체의 중요한 결과를 복제하거나 확장하기 위해 GWAS에서 사용된 것과 유사한 모델을 사용하여 ADNI(n=1,566) 및 AddNeuroMed(n=288) 데이터 세트에서 수행되었다.
5. 전체 뇌 피질 두께 측정과의 연관성을 테스트하기 위한 통계적 방법
MRI 특성과 관련된 대부분의 SNP의 효과는 전체 뇌 피질 두께 측정에 미치는 영향에 대해 추가로 평가되었다. SNP 유전자형의 효과는 우성 모델을 사용하여 분석되었다. MATLAB(R2012a, The Mathworks, Natick, MA, USA)에서 구현된 SurfStat 도구 상자(http://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat/)를 사용하여 점별 피질 위축을 추론하기 위해 일반 선형 모델(GLM)을 적용하였다. 나이, 성별, APOE ε4 상태 및 mri 전계 강도를 공변량으로 조정하였다. RFT(random filed theory) 기반 보정을 적용하여 여러 지점 별 피질 두께 비교를 보정하였다.
6. 희귀 변이체를 이용한 유전자 기반 연관 분석
해마 부피 및 내후각 피질 두께에 대한 MAF(Minor Allele Freqeuncy_) <0.01(9,784,321 SNPs)의 SNP를 포함한 유전자 기반 분석은 유전체 유전자좌의 특성화, 후보 SNP의 주석, 기능적 유전자 매핑(mapping), 및 유전자-기반 분석과 같은 기능을 포함하는 FUMA(Functional Mapping and Annotation of Genome-Wide Association Studies)에서 SNP2GENE을 사용하여 수행되었다. 유전체 주석(MAGMA) 도구의 다중마커 분석은 유전자 기반 분석에 사용되었다. 유전체 차원의 유의적 임계값은 p<2.6x10-6으로 설정되었으며, 공변량은 GWAS와 동일했다.
7. 중재 분석
MRI 형질과 유전체 차원에서 유의미한 연관성을 보여주는 SNP는 985명의 CN 및 209명의 AD 피험자의 샘플에서 추가로 평가되어 AD 위험에 대한 영향이 특정 MRI 특성을 통해 매개되는지 여부를 결정했다. 중재 모델은 AD를 결과로, SNP를 예측 변수로, MRI 특성 변수를 중재자로 사용하여 선형 회귀를 사용하여 평가되었다. 모델에는 성별, 나이, 3개의 PC 및 log로 보정한 뇌 전체 부피(ICV)도 공변량으로 포함되었다. 4개 및 10,000개의 편향 보정 부트 스트랩 샘플을 선택하여 SPSS에 구현된 PROCESS 매크로를 사용하여 중재 분석을 수행하였다.
8. AβPET의 PET 영상 측정 및 인지 성능과의 연관성을 테스트하기 위한 통계 방법
뇌에서 아밀로이드 베타(Aβ)의 축적은 77명의 AD, 196명의 MCI 및 193명의 CN 피험자를 대상으로 양전자 방출 단층 촬영(Aβ-PET)으로 측정되었다. Aβ-PET 이미지(General Electric Medical Systems, Milwaukee, WI, USA)의 전처리는 다른 곳에서 설명된 방법을 사용하여 수행하였다. Aβ-PET 데이터에 대한 표준 흡수값 비율(SUVR)은 참조 영역으로 사용된 전체 소뇌와 함께 미리 정의된 6개의 해부학적으로 관련된 관심 피질 영역(frontal, temporal, parietal, precuneus, anterior, cingulate, and posterior cingulate)의 평균 활동 농도로 정의되었다. SUVR 값이 1.11 미만은 양수이고 그렇지 않으면 음수로 간주하였다. 본 발명자들은 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 GWS SHARPIN SNP와 나이 및 성별에 맞게 조정된 파생된 이진 SUVR 변수의 연관성을 평가하였다. 서울 신경 심리 검사 (Seoul Neuropsychological Screening Battery, SNSB)로 평가한 인지 능력의 5개 영역(주의, 전두엽/행동 기능, 언어, 기억, 시공간 능력)과 이 SNP의 연관성은 나이 및 성별에 대한 공변량을 포함하는 선형 회귀 모델을 사용하여 테스트되었다.
9. 분자 역학 시뮬레이션 및 분석
분자 역학(MD) 시뮬레이션은 리간드 HOIL-1 상호작용 단백질 N-말단 UBA 도메인(HOIP UBA)에 결합된 SHARPIN UBL 도메인의 결정 구조를 사용하여 수행되었다(PDB ID: 5X0W). 결정 구조에서 SHARPIN UBL 도메인(Ala235) 및 HOIP UBA 도메인(gly589=Gly593)의 누락된 잔기는 참조 SHARPIN 서열 및 Chimera1.13.1의 Modweb 버전 r214를 사용하여 모델링되었다. 결정 구조의 셀레노 메티오닌 잔기는 CHARMM-GUI를 사용하여 메티오닌으로 대체되었다. 돌연변이 변이체 R274W는 Pymol v2.3 돌연변이 유발 기능을 사용하여 SHARPIN UBN 도메인(PDB: 5X0W에서)의 Arg274 잔기를 Trp으로 설정하기 위해 HOIP UBA 도메인과 복합된 SHARPIN UBL 도메인(wt) 및 SHARPIN UBL 도메인(R274W)을 최소 10Å 박스-패딩이 있는 PBC 직사각형 상자에서 TIP3P 물로 용해시키고 0.15M NaCl로 중화하였다. 12,000 단계에 대한 어닐링 후, 야생형(WT) 및 돌연변이 복합체는 모두 0K 온도에서 에너지를 최소화를 위해 10,000 단계 동안 310K의 온도에 도달하도록 설정되었다. 이어서 200-ps 평형 단계를 실행하여 열을 분배하였다.
10. 면역침전(IP)
pCMV3flag8SHARPIN(#50014) 및 HOIP ORF 클론(# RC204117) 플라스미드는 각각 Addgene과 Origene에서 구입했다. HOIP는 pcDNA6/myc-His A로 클로닝하였다. 돌연변이 SHARPIN R247W는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 구축되었다. SHARPIN WT 및 SHARPIN R247W 벡터를 293T 세포로 트랜스펙틴(# 170-3351; Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 HOIP-myc 벡터로 트랜스펙션하였다. 36시간 후 IP 용액 완충액: 30mM Tris-Cl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1% Triton-X100, 1mM Na3VO4, 50mM NaF, 1mM PMSF, 10% 글리세롤 및 2mM EDTA, 에서 4℃ 및 1시간동안 세포를 용해시켰다. 면역침전을 위해 1mg 세포 추출물을 1㎍의 항-c-Myc 9E10 일차 항체(sc-40; Santa Cruz Biotechnology, Tx, USA) 또는 항-Flag M2 일차 항체(F3165; Sigma-Aldrich, MO, USA)와 함께 밤새 4℃에서 배양하고, 단백질 A/G 아가로스 비드(P9203; GenDEPOT, TX, USA)에 2시간동안 도포하였다. 3회 세척한 후, 용해물을 면역블롯팅하였다.
11. 면역블롯
제조된 용해물을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동한 다음, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(IPVH00010; Millipore, Billerica, MA)으로 옮겼다. 막을 5% 스킴 밀크로 블록킹하고, PBS에서 0.1% Tween20으로 세척한 후, 항-c-Myc 9E10(sc-40; Santa Cruz) 일차 항체와 함께 배양하였다. 그런 다음, 막을 홀스래디쉬 과산화 효소-접합된 항-mouse IgG(ab131368; Abcam, Cambridge, UK)와 함께 실온에서 2시간동안 추가로 배양하였다. 신호는 Clarity Western ECL 기질(1705061; Bio-Rad)를 사용하여 개발되었으며, Fusion Solo S 이미징 시스템(VILBER, Collegien, France)로 감지하였다.
[실시예 2] 결과
1. 한국인에게서 여러 유전자가 해마의 양 및 내막 두께와 관련이 있다.
5개의 sMRI 특성에 대한 광범위 유전체 연합연구(GWAS)는 여러 부위에서 변이체와 함께 해마 부피(hippocampal volume; HV) 및 내후각피질 두께(entorhinal thickness; ET)에 대한 광범위 유전체 유의성(GWS, p<5.0x10-8) 및 암시적 연관성(p<1.0x10-6) 을 나타내었다(도 7 및 표 1). 유전체 인플레이션에 대한 증거는 거의 없었고(모든 특성에 대해 λ<1.03, 도 8), 두 분석 모두 명목 유의 수준(nominal significance level)을 유지했음을 보여주었다. APOE와의 연관성 분석은 표 1에 요약되어 있다. 본 발명자들은 APOE가 내후각 피질(entorhinal cortex), 하두정소엽(inferior parietal), 중간 측두회(middle temporal) 및 상전두고랑(superior frontal), 및 해마에서 유의한 것이고, APOE isoform 유전자형에 대한 우도비검정법(likelihood ratio test) 결과는 각각 p=5.1x10-11 및 6.3x10-20임을 밝혀냈다. 유전형 ε4ε4 및 ε3ε4는 유전형 ε3ε3과 비교하여 내후각 피질, 하두정소엽, 중간 측두회 및 상전두고랑, 및 해마 특성에 유의하게 다른 영향을 미쳤지만, 그 외에는 영향을 미치지 않았다. 비-유의성은 작은 표본 크기로 부분적으로 설명될 수 있다. APOE 영향을 조정한 후 p<1.0x10-6인 다른 SNP의 결과는 하기 표 1에 요약하였다.
표현형 염색체 염기쌍(BP) SNP MA MAF HWE에 대한
유의확률		 I(INFO) / G β SE 유의확률 유전자
내후각 8 145154282 rs77359862 A 0.01 0.15 G -0.59 0.10 5.0×10-9 SHARPIN
14 27221601 rs7160806 G 0.39 0.97 I(0.992) -0.13 0.02 7.1×10-7 NOVA1-AS1
14 27219914 rs1956822 G 0.39 1 I(0.995) -0.13 0.02 5.8×10-7 NOVA1-AS1
해마 8 145154282 rs77359862 A 0.01 0.15 G -0.62 0.08 5.1×10-12 SHARPIN
8 144984345 rs80120848 A 0.01 1 G -0.53 0.09 2.3×10-8 EPPK1 & PLEC
18 48554594 rs150912768 T 0.01 1 I(0.953) -0.45 0.09 6.9×10-7 SMAD4 & ELAC1
GWS 연관성은 내후각 두께(p=5.0x10-9, β=-0.59) 및 해마 부피(p=5.1x10-12, β=-0.62)의 감소와 함께 SHARPIN에서 미스센스 돌연변이(rs77359862)도 관찰되었다. PLEC에서 약 5kb 다운스트림에 위치한 rs80120848은 GWS 수준에서 HV와도 관련이 있었다(p=2.3x10-8, β=-0.53). rs80120848은 189kb이고, rs77359862(r=0.6857)와 어느 정도 상관관계가 있기 때문에 독립적인 연관 신호가 아닐 수 있다(도 1a). 긴 유전자 간 비 단백질 코딩 RNA 2588을 코딩하는 NOVA-AS1에 위치한 2개의 SNP(rs7160806, p=7.1x10-7; rs1956822, p=5.8x10-7)를 갖는 ET에 대해, 그리고 SMAD4와 중첩되지만 역전사된 시작 부위를 갖는 알 수 없는 기능의 유전자인 LOC1053722에 위치한 rs150912768(p=6.9x10-7)을 갖는 HV에 대해 암시적인 연관성이 관찰되었다. APOE를 조정하지 않은 결과는 표 1에 있다. APOE를 제외하고 NECTIN2는 하두정소엽 및 중간 측두회 두께에 대한 암시적인 유의성 임계값에 도달했으며, 상전두고랑 두께에 대한 변화는 없었다. 전체 뇌 위축에 대한 rs77359862의 효과를 평가하기 위해 전체 뇌의 점별 피질 두께 측정에 대한 일반 선형 모델(general linear model; GLM)을 적용했다. 본 발명자들은 rs77359862 A 대립유전자를 갖는 84명의 피질이 내후각 피질과 해마에서 다른 피질 위축(N=2,559)보다 유의하게 더 큰 피질 위축(p<0.05)을 가짐을 발견하였다(도 2c).
APOE 유전자형을 조정한 후, 소수 대립 유전자 빈도(minor allele frequency; MAF)가 0.01 미만인 희귀 변이에 대한 18,229개의 단백질 코딩 유전자를 사용한 유전자 기반 분석 결과, HV와 ET와의 여러 유전자 전반에서 유의미한 연관성(2.7x10-6)이 있고(도 9a), ET가 있는 COX7A2L(234 SNPs, p=1.9x10-6) 및 HV가 있는 유전자: GUCA1A(64 SNPs, p=7.7x10-7), VIT(289 SNPs, p=7.1x10-9) 및 METTL6(163 SNPs, p=1.9x10-6)을 포함하여 유전체 인플레이션에 대한 증거가 거의 없음을 밝혀냈다(도 9b). HV 및 GABRR2의 연관성은 유전자 전반에 걸친 유의성 임계값에 거의 도달하였다(109 SNPs, p=3.9x10-6).
2. SHARPIN 미스센스 변이체 rs77359862는 알츠하이머병과 관련하여, 뇌 변화에 미치는 영향을 통해 알츠하이머병 위험에 간접적으로 영향을 미친다.
다음으로, 중재 분석을 수행하여 HV 및 ET에 미치는 영향을 통해 rs77359862가 알츠하이머병 위험에 미치는 간접 효과를 추정하였다. 도 1b에 나타난 바와 같이, rs77359862는 알츠하이머병 상태(총 효과, OR=3.23, p=3.8x10-4)와 유의하게 관련되어 있지만, HV 및 ET와의 연관성을 조절한 후, 이것의 강도 관계는 약화되었다(OR=1.11, p=0.82). 이는 알츠하이머병 위험에 대한 rs77359862의 효과를 기본으로 하는 메커니즘이 특히 해마 및 내후각 피질 영역에서 신경 변성에 대한 직접적인 기여에 의해 매개됨을 의미한다. 알츠하이머병에 대한 rs77359862의 전체 간접 효과(rs77359862→해마 및 내후측 피질→알츠하이머병), 해마를 통한 간접 효과(rs77359862→해마→알츠하이머병)가 67%를 차지하고, 내후측 피질을 통한 간접 효과(rs77359862→내후측 피질→알츠하이머병)는 33%를 차지하였다. rs77359862의 전체 간접 효과의 교차비(odds ratio; OR)의 추정값은 4.20(95%의 신뢰구간(CI): [1.91, 10.05])이고, 해마 및 내후각 부위를 통한 교차비는 1.61(CI: [1.14, 2.44])이었다. 이들 각각은 rs77359862의 A 대립 유전자가 해마를 통한 알츠하이머병의 위험을 각각 160% 및 61%까지 증가시킨다는 것을 의미한다.
3. SHARPIN 미스센스 돌연변이 rs77359862는 알츠하이머병과 관련하여 임상 측정 및 바이오마커와 관련이 있다.
본 발명자들은 rs77359862 미스센스 변이체의 관련성이 나이와 성별에 대한 공변량을 포함하는 선형 회귀 모델을 사용하여, 인지 기능의 여러 척도와 연관되어 있는지 평가하였다. 기억력 측정(β=-0.41, p=0.0001)과 전두엽/집행기능(β=-0.21, p=0.04)에서 관찰되었으나, 주의력(β=-0.09, p=0.38), 언어(β=-0.18, p=0.09) 또는 시각 공간 능력(β=-0.10, p=0.33)에서는 관찰되지 않았다(도 2b). 다음으로, 생존 곡선을 추정하기 위한 Kaplan-Meier 접근법을 사용하여 알츠하이머병 증상 발병 연령에 대한 rs77359862의 효과를 조사하였다. 이 분석은 rs77359862 돌연변이 변이체를 갖는 개체의 알츠하이머병 발병이 G 대립 유전자를 가진 개체보다 평균 1.5년 더 빠르다는 것을 보여주었다(로그-순위 실험 p=7.9x10-4, 도 1c).
본 발명자들은 또한 rs77359862가 기준선에서 CN 또는 MCI로 분류된 876명의 피험자 하위 그룹에서 알츠하이머병(AD)으로 이어지는 임상 단계 전반에 걸쳐 진행에 미치는 영향을 조사하였으며, 평균 28.8개월동안 세로로 추적하였다. 이 그룹 내에서 53명의 CN 및 21명의 MCI 참가자(전체의 8.4%)가 각각 MCI 및 AD로 전환되었다(표 S4). 전환자 사이에서 돌연변이 대립 유전자의 빈도(6/74=8.1%)는 비-전 환자(26/802=3.2%)보다 높았다. APOE 유전자형을 조정하는 비례 위험 모델을 사용하여 전환 가능성에 대한 rs77359862 유전자형의 영향을 분석한 결과, 돌연변이 대립 유전자를 가진 참가자는 다음 인지 단계로 진행할 가능성이 2.66배 더 높았다(p=0.023).
양전자 방출 단층 촬영(Aβ-PET)에 의해 측정된 뇌에서의 Aβ 축적에 대한 rs773959682의 연관성은 Aβ-PET 영상화를 받은 집단 77명의 AD, 196명의 MCI 및 193명의 CN 대상에서 평가되었다. Aβ의 수준은 대뇌 피질 대 소뇌 표준 흡수값 비율(SUVR)을 계산하여 결정하였다. 이 466명의 피험자 중 163명은 양성 SUVR이었고, 303명은 음성 SUVR이었다. 나이와 성별에 대한 공변량과 함께 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 이 연관성을 분석한 결과, rs77359862 미스센스 변이체의 보균자가 비보균자보다 Aβ 축적 더 많았음을 입증하였다(p=0.03, 교차비=2.57; 도 2a).
4. 다른 코호트에서 SHARPIN 미스센스 변이체 rs77359862와 HV의 연관성
rs77359862 미스센스 변이체의 빈도는 본 연구에서 인지적으로 정상인 한국인(1.4%), 안산-안성 코호트(1.7%)뿐만 아니라 gnomAD 데이터베이스에 포함된 다른 동아시아인(1.4%)에서와 일관되게 1% 이상이었다(도 1d). 본 발명자들은 본 연구에서 후기 발병 알츠하이머병을 가진 한국인(4.3%)과 분당서울대학교 병원에서 진단받은 78명의 조기 발병 알츠하이머병(EOAD) 환자(3.4%)에서 더 높은 빈도를 관찰하였다. 이 변이체는 태국 EOAD 환자 샘플(6.2%)에서 더 많이 나타났다. 대조적으로, rs77359862 미스센스 변이체는 유럽 조상의 비-핀란드인에게는 나타나지 않는다(MAF=0.0001). 따라서, rs77359862/AD 연관성은 유럽 조상 인구에서 평가할 수 없다. 따라서, 본 발명자들은 SHARPIN에서의 다른 희귀 기능적 변이가 비-아시아인의 MIR 특성 및 AD와 관련있을 수 있다고 가정하였다. 본 발명자들은 ADNI 코호트의 전체 유전체 서열 데이터와 NeuroMed 코호트 데이터에 대한 GWAS를 사용하여 유전자 경계를 넘어서는 20kb를 포함하는 SHARPIN과 HV의 연관성을 확인하는 유전자 기반 분석을 수행하였다. 유전자 기반 분석은 ADNI(86 SNPs; p=0.002) 및 NeuroMed(93 SNPs; p=0.04) 모두에서 SHARPIN과 유의한 연관성을 보였으며, 이는 결합된 샘플의 메타 분석 결과에서 더 유의미했다(도 10a).
5. rs77359862 미스센스 변이체로 인한 SHARPIN 복합 구조의 안정성 변화
rs77359862 변이체는 RING-between-RING(RBR) 도메인 유형 ε3 리가아제를 코딩하는 리간드 HOIL-1 상호작용 단백질(HOIP)에 대한 SHARPIN의 결합과 관련된 도메인에 위치한다. 이 결합은 선형 유비퀴틴 사슬 조립 복합체(LUBAC)의 형성을 위한 중요한 단계인 HOIP의 SHARPIN 매개 활성화에 필요하다. 참조 단백질 서열(NP_112236: SHARPIN [Homo sapiens])과 매핑된 단백질 5X0W_B 사이의 서열 유사성은 동일했으며, 참조 서열의 26%를 차지하였다. 이 두 단백질의 결합 부위는 HOIP N-말단 UBA 도메인(HOIPUBA)과 SHARPIN의 UBL 도메인(SHARPINUBL)이다(도 3a).
rs77359862 돌연변이는 극성 Arg274를 소수성 Trp(NP_112236.3: p.Arg274Trp)로 대체하고, SHARPINUBL에 위치한다(도 3b). 표면에서 아미노산의 화학적 특성에서 이 스위치는 결합된 HOIPUBA-SHARPINUBL 복합체의 안정성에 영향을 미치는 것으로 생각되었다(도 3b). 이 돌연변이의 효과를 이해하기 위해 WT 복합체(PDB: 5X0W) 및 in-silico SHARPIN 돌연변이(R274W) 복합체에 대한 분자 동적(MD) 시뮬레이션을 수행하고 60 ns 이내의 구조적 변화를 비교하였다. 도 3c에 나타난 바와 같이, 제곱 평균 제곱근 편차(RMSD) 분석은 두 복합체(HOIPUBA-SHARPINUBL 및 HOIPUBA-SHARPINUBL(R274W))가 실행 초기 10 ns 이후 안정된 것으로 나타났다. 돌연변이 HOIPUBA-SHARPINUBL(R274W)의 글로벌 RMSD 값은 시간이 지남에 따라 WT 복합체보다 2-3Å 높았다. 이는 주로 RSMF(root mean square fluctuation) 플롯을 사용하여 추론된 돌연변이 SHARPINUBL(R274W) 복합체의 α1, α2 및 β4를 포함한 구조적 요소의 변동 때문이었다(도 3d).
WT HOIPUBA 및 SHARPINUBL 사이의 표면에 대한 상호작용은 수소결합과 염 다리에 기여하는 잔기에 의해 강화되었다(도 1d). 60 ns에 대한 MD 시뮬레이션에서 WT 표면은 6개의 수소결합과 19개의 염 다리로 몇 배 더 강화되어 두 단백질 간의 결합 에너지가 크게 증가했음을 나타내었다(도 11b-c, 및 도 12a). 흥미롭게도, SHARPIN의 루프(β3-α2)에 있는 잔기인 Arg274는 HOIP의 α3에서 Glu518과 3개의 염 다리를 형성하여 시뮬레이션 중에 SHARPIN과 HOIP 사이의 표면에서 분자간 상호작용이 증가하였다(도 12a). WT HOIPUBA 및 SHARPINUBL 복합 구조를 안정화하는데 있어서 Arg274의 역할은 MD 시뮬레이션을 통해 명확하게 관찰되었다(도 12a). 여기서 잔기는 HOIP Glu518과 연결하기 위한 입체 구조 변화를 겪었지만, 결정구조에서 다른 아미노산과 상호작용하지는 않았다(도 11c). 반면, SHARPINUBL(R274W) 돌연변이는 시뮬레이션 중에 표면을 안정화시키지 못했다. 이는 HOIPUBA-SHARPINUBL(R274W, 2개의 수소결합 및 8개의 염 다리)사이의 수소결합 및 염 다리 수의 명확한 감소에 의해 추정할 수 있다(도 11b 및 도 12b). 또한, 양으로 하전된 알지닌이 비극성 트립토판으로 대체된 R274W 돌연변이의 측쇄 특성으로 인해 표면의 정전기 전위가 SHARPINUBL(R274W)의 결합면을 따라 반전되었다(도 13a 및 b). 표면의 전하는 두 단백질 모두 유사해져 상호 작용력을 약화시킬 수 있다. 따라서, 이러한 관찰은 반전된 정전기 특성을 가진 수소결합 및 염 다리의 감소가 시뮬레이션 중에 HOIPUBA-SHARPINUBL(R274W) 복합체를 불안정화하고 분리할 가능성이 있는 반면, 복합체는 상호작용이 약해진 것처럼 보였지만 60 ns 후에도 남아있음을 의미한다. 흥미롭게도, 두 단백질 사이의 소수성 패치의 변화가 돌연변이 시뮬레이션 모델에서 관찰되었다(도 14a 및 b). 시뮬레이션 중에 HOIPUBA의 Phe509는 돌연변이 SHARPINUBL(R274W)에서 대체된 소수성 트립토판에 가까워져 트립토판의 인돌링으로 π-π 스태킹을 형성했다. 이로 인해 분자간 소수성 상호작용이 증가하고 돌연변이 복합체에서 다른 상호작용력의 손실을 보상하였다.
이러한 관찰은 공동면역침전(co-IP) 실험에 의해 더욱 뒷받침되었다. SHARPIN(R274W)에서 274번 위치의 알지닌(R)의 트립토판(W)으로의 단일 점 돌연변이가 HOIP에 대한 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 확인하기 위해 플래그 태그가 지정된 SHAPRIN WT 또는 R274W 돌연변이 단백질을 Myc 태그가 있는 야생형 HOIP와 함께 면역침전시켰다. SHAPRIN(R274W)과 HOIP 사이의 결합은 HOIP의 형질감염 수율을 고려하더라도 WT의 결합에 비해 60% 감소하였다(도 4a 및 b). 이와 함께, 본 연구는 SHARPIN 돌연변이 R274W가 HOIPUBA와 SHARPINUBL 간의 상호작용을 불안정하게 만들 수 있으며, 이러한 불안정화가 SHARPIN 매개 하류 경로에 영향을 미칠 수 있음을 밝혔다.
[실시예 3] 결론
이전의 GWAS는 알츠하이머병에 대한 유전체 차원의 중요성을 갖는 많은 유전적 위험 유전자좌를 밝혀냈지만, 일관되게 복제되지는 않았다. 대부분의 GWAS에서 사례/대조군 연구 설계는 다른 신경 퇴행성 또는 뇌 혈관 질환에 의해 오염되기 쉬운 실험군 및 고령에 따라 향후 알츠하이머병 사례를 포함하는 대조군과 같은 한계가 있다. 따라서, 알츠하이머병의 임상 진단과 뇌 영상을 이용한 정량 표현형은 GWAS에서 고려되어야 하며, 새로운 발견도 알츠하이머병에서의 뇌 기능 장애로 해석되어야 한다.
이와 관련하여, 본 연구는 APOE 효과를 조정한 후, 알츠하이머(AD), MCI 및 대조군의 임상 스펙트럼에 걸쳐 5개의 MRI 뇌 영역에서의 부피 및 영역 변화에 대한 GWAS 신호를 조사하였다. 본 발명자들의 연구 설계에서 SHARPIN의 rs77359862는 내후각 피질과 해마에서 유전체 전체의 유의미한 결과로 발견되었다(p<5.0x10-8). 본 발명자들의 전체 두뇌 분석은 SHARPIN의 rs77359862가 내후각 피질 및 해마 부피에서 뇌 위축과 강하게 연관되어 있음을 확인하여, rs77359862 A 대립 유전자를 가진 피험자가 주요 대립 유전자를 가진 피험자보다 더 큰 해마 위축을 나타냄을 보여주었다. 또한, ADNI 및 AddNeuroMed 코호트에서 다른 SHARPIN 변이체와 해마 용적의 유의한 연관성을 발견하였다. 또한, Soheili-Nezhad et al[참고문헌 1]에서는 UK biobank[참고문헌 2](UKB) 코호트 데이터(N=8,428)를 사용하여 내후각 피질의 GWAS를 수행했으며, rs77359862에서 4,325개의 염기쌍이 떨어진 곳에 위치한 rs34173062가 왼쪽 및 오른쪽 내후각 피질의 두께(각각 p=0.002 및 8.6x10-4)와 유의하게 연관되어 있음을 발견하였다. Fundacio ACE(GR@ACE), IGAP(International Genetics of Alzheimer's project)와 UKB 데이터를 사용한 이전의 메타-GWAS 연구에서도 SHARPIN의 중요성을 뒷받침했다(SNP=rs34674752, OR=1.13, p=1.0x10-9)[참고문헌 3]. 결과는 SHARPIN 유전자가 영국, 미국, 및 한국에서 수행된 세 가지 큰 집단 모두에서 알츠하이머병과 연관되어 있음을 시사했다.
또한, 중재 분석은 SHARPIN 변이체가 내후각 피질과 해마를 통해 알츠하이머병의 위험을 증가시키는 것으로 나타냈다(OR=4.2). 본 발명자들의 PET 발견은 rs77359862가 알츠하이머병에 결정적으로 관여하고, 기능적으로 전두엽 및 기억에 관련된 것들과 관련이 있는 PET 이미지의 아밀로이드 플라크의 주요 구성인 Aβ 축적에 영향을 미친다는 것을 시사했다. Jung et al[참고문헌 4]에 따르면, 언어나 시공간 장애가 아닌 실행 및 기억력은 인지 저하 위험이 더 높았으며, rs77359862가 집행 및 기억 능력과 유의하게 연관되어 있음을 알 수 있었다. 마지막으로, 본 발명자들은 rs77359862 A 대립 유전자를 가진 CN 또는 MCI 환자가 각각 MCI 또는 AD로 회귀할 가능성이 훨씬 더 높음을 전향적으로 관찰하였다. 이 결과는 AD의 병리학에 해당하며, 내후각 피질 및 해마와 같은 기억과 관련된 뇌 영역의 뉴런과 연결이 아밀로이드 축적을 통해 손상된다. 또한, 이 변이는 한국과 태국의 다른 데이터 세트에서 EOAD 환자로 중복되어 EOAD와 관련이 있을 수 있고, 아시아 인구에서 중요한 역할을 할 수 있다.
SHARPIN은 NF-kb 신호(PMID: 21811235)를 억제하는 HOIP와 함께 LUBAC(linear ubiquitination assembly complex)의 구성 요소이다. HOIP와의 복합체 형성에 대한 SHARPIN UBL 도메인의 돌연변이(R274W) 효과를 연구하기 위해 WT 및 돌연변이 변이체(R274W) 모두에 대해 결정 구조(PDB: 5X0W)를 사용하여 310K에서 60 ns MD 시뮬레이션을 수행했다. 본 발명자들의 MD 분석은 돌연변이 복합체 HOIP UBA 도메인과 SHARPIN UBL 도메인(R274W)이 다음과 같은 이유로 인해 표면에서 복합체를 불안정하게 할 수 있음을 강력하게 시사하였다. 첫째, RMSD 플롯은 전체 전역 편차가 WT에 비해 돌여변이 변이체에서 더 높다는 것을 보여주었다. WT에 비해 돌연변이 SHARPIN UBL 도메인(R274W)의 α1의 원자 변동은 더 높은 RMSD를 설명할 수 있다. 둘째, WT 복합체에서 HOIP UBA 도메인과 SHARPIN UBL 도메인 사이의 경계면에서 안정적인 상호작용이 돌연변이에서 중단되었다. 표면에서 수소결합과 염 다리의 수를 기반으로 한 상호작용은 R274W 돌연변이에서 크게 깨졌다. 셋째, 극성 알지닌을 비극성 소수성 트립토판으로 대체하여 두 단백질을 보유하는 정전기 전위가 표면에서 반전되었다. 이로 인해 시뮬레이션 중에 복합체가 분해되었을 수 있다. 그러나, 두 단백질은 추가적인 소수성 트립토판(R274W)과 함께 보존된 소수성 패치로 인해 불안정한 복합체로 함께 유지된다. 돌연변이 변이체에서 Trp274는 표면 소수성 패치 및 π-π 상호작용과 HOIPUBA의 인접 Phe509 상호작용으로 인해 HOIP UBA 도메인과 SHARPIN UBL 도메인간의 소수성 상호작용이 향상되었을 수 있다. 실제로 HOIP와 R274W 돌연변이 SHARPIN 사이의 물리적 상호작용은 WT SHARPIN과의 상호작용에 비해 크게 감소했다. 이 불안정한 복합체는 하류 SHARPIN 매개 NF-kB 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있다.
신경계에서, NF-kB 신호 전달은 신경 염증, 기억력 강화 결핍, Aβ 제거 및 신경 세포 사멸을 포함하는 알츠하이머병의 병태 생리학에서 핵심적인 역할을 한다(PMID: 20066105). SHARPIN의 희귀한 기능적 변종은 이전에 일본인에서 발견되었으며, 후기 발병 AD의 위험 증가와 관련이 있다. 이 돌연변이 SHARPIN은 HEK293 세포에서 NF-kB 활성화의 감소를 보여주었다. 또한, SHARPIN은 성숙한 뉴런의 시냅스 부위에서 풍부하여, SHANK1(PMID: 11178875)과 공존한다. 활성화된 NF-kB는 활성화된 시냅스에서 장기 기억에 중요한 소마로 이동할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. SHARPIN 돌연변이에 의한 뉴런 NF-kB 활성의 감소는 애니-아폽토시스 경로를 억제하고 뉴런에서 아폽토시스 또는 괴사를 유발할 수 있다(PMID: 2006615, PMID: 30467385). 최근 연구에 따르면, siRNA를 사용한 SHARPIN의 녹다운은 대식세포에서 Aβ 유도 식균 작용을 억제하여 R274W 돌연변이 SHARPIN을 가진 피험자에서 아밀로이드 플라크 축적의 현저한 증가를 뒷받침한다.
MAF가 0.01 미만인 희귀 변종은 AD의 유전 가능한 특성이 누락된 것을 식별하는데 큰 영향을 미치며 핵심적인 것으로 생각된다. 유전자 기반 테스트에서 COX7A2L, GUCA1A, VIT, GABRR2 및 METTL6이 중요한 희귀 변종임을 발견했다. AD 환자는 말초 조직과 뇌 조직 모두에서 COX7A2A의 가족 유전자인 사이토크롬 c 산화 효소(COX)가 결핍된 것으로 보고되었다. 이것은 AD의 생체 에너지 결함에 중요한 역할을 할 수 있다. VIT는 뇌 비대칭에 관여하는 것으로 알려져 있다. GABRR는 GABA(gamma-aminobutyric aicd) 수용체 서브유닛 rho-2를 암호화하며 해마에서 중요한 유전자이다. 뇌의 주요 어제 신경 전달 물질인 GABA는 피질의 뉴런에 널리 분포되어 있으며, 리간드-게이트 염화물 채널인 GABA 수용체에 결합하여 많은 피질 기능에 기여한다. 따라서, GABRR2는 일반적인 인지 능력에 관여한다.
[참고문헌]
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4: Jung, Y.H., Park, S., Jang, H., Cho, S.H., Kim, S.J., Kim, J.P., Kim, S.T., Na, D.L., Seo, S.W., and Kim, H.J. (2020). Frontal-executive dysfunction affects dementia conversion in patients with amnestic mild cognitive impairment. Scientific Reports 10, 772.

Claims (11)

  1. 환자로부터 얻은 유전자 시료에 대하여,
    SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기의 치환 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 820번째 염기가 A인 경우, G인 경우보다 알츠하이머병 발병 위험도가 높다고 예측하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 염기의 치환이 발생된 경우, SHARPIN 단백질의 274번째 아미노산이 알지닌(R)에서 트립토판(W)으로 변이된 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 한국인의 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위한 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  5. SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 SNP 유전자 세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 SNP 유전자 세트는 한국인의 알츠하이머병 발병 위험도를 예측하기 위한 것인, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 SNP 유전자 세트.
  7. SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드는 프로브 또는 프라이머인 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 조성물.
  9. SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드; 또는 이에 특이적인 항체;를 포함하는 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 조성물
  10. SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드; 이와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드; 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드; 이에 특이적인 항체; 또는 상기 폴리펩타이드의 cDNA를 포함하는 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 마이크로어레이.
  11. SHARPIN 유전자 중 NCBI refSNP ID: rs77359862로 표시되는 820번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드; 이와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드; 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드; 이에 특이적인 항체; 또는 상기 폴리펩타이드의 cDNA를 포함하는 알츠하이머병 발병 위험도 예측용 키트.
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