WO2023085772A1 - Mirna 억제제를 이용한 혈관평활근세포 증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Mirna 억제제를 이용한 혈관평활근세포 증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023085772A1
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mir
mirna
smooth muscle
vascular smooth
muscle cell
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PCT/KR2022/017553
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강상원
이상혁
김예린
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이화여자대학교 산학협력단
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular smooth muscle cell proliferative diseases comprising a miRNA (microRNA) inhibitor as an active ingredient; a kit for diagnosing vascular smooth muscle cell proliferative diseases comprising an agent capable of detecting miRNA; a method for providing information on diagnosis of the disease; and treatment methods.
  • a miRNA miRNA
  • EC endothelial cell
  • smooth muscle cells smooth muscle cells
  • internal accumulation of low-density lipoproteins combined with impaired blood flow can cause inflammation in ECs, and monocytes/macrophages adhere to inflamed EC lesions, infiltrate the EC monolayer, and absorb lipid particles to become foam cells.
  • monocytes/macrophages adhere to inflamed EC lesions, infiltrate the EC monolayer, and absorb lipid particles to become foam cells.
  • the generated macrophage-driven foam cells and immune cells of atherosclerotic lesions secrete many growth factors and cytokines that stimulate smooth muscle cells for dedifferentiation and fibrotic cap formation. The entire atherogenic process, including the initial inflammatory response, eventually results in occlusion of the arterial lumen.
  • miRNA Since microRNA (abbreviated as miRNA) was discovered while studying the lin-4 gene in nematodes in 1993, the role of miRNA as a translational regulator has received much attention over the past few decades. A unique feature of miRNAs is that they simultaneously regulate the expression of multiple genes in their 3' UTR, and in fact, several studies have attempted to find and characterize vascular miRNAs that regulate the growth of vascular smooth muscle cells (Farina, 2020 #2619; Torella, 2018 # 2618; Ji, 2007 #2617). Nevertheless, there has been no genome-wide screen for common vascular miRNAs in rodents and humans.
  • the present inventors have diligently studied to screen for vascular miRNAs related to hyperproliferation and migration of arterial smooth muscle cells.
  • the present invention was completed by identifying miRNAs, and in particular, confirming that miR-370-3p is a new miRNA related to proliferative diseases of smooth muscle cells, which is very important in atherosclerosis.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular smooth muscle cell proliferative diseases comprising a miRNA (microRNA) inhibitor as an active ingredient.
  • a miRNA miRNA
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing vascular smooth muscle cell proliferative diseases including an agent capable of detecting miRNA.
  • Another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing vascular smooth muscle cell proliferative diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating vascular smooth muscle cell proliferative diseases comprising administering the pharmaceutical composition containing a miRNA expression inhibitor to a non-human subject in need thereof.
  • the present invention discovered miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p and miR-410-3p, a subset of miRNAs involved in proliferative diseases of vascular smooth muscle cells, and these miRNAs were damaged compared to the control group.
  • the expression of miR-370-3p was significantly increased by more than 5-fold in arteries, and miR-370-3p in particular was found to be highly expressed in coronary tissues of patients with atherosclerosis, so it can be usefully used for the diagnosis of the disease, and furthermore, vascular smooth muscle cells using it It can also be used for prevention or treatment of proliferative diseases.
  • Figure 1a is a heat map analysis of miRNAs differentially expressed on days 3 and 5 of arterial injury compared to sham control from a balloon injured artery animal model.
  • Figure 1b is a graph showing 8 up-regulated miRNAs and 2 down-regulated miRNAs showing a 5-fold or more change in expression level among differentially expressed miRNAs.
  • Figure 1c is a graph confirming that 6 of the 8 up-regulated miRNAs of Figure 1b were remarkably expressed in human smooth muscle cells.
  • Figure 2a shows that miR-132-3p and miR-370-3p have significant inhibitory effects on smooth muscle cell proliferation, as confirmed using human vascular smooth muscle cells transfected with miRNA inhibitors to confirm the role of up-regulated miRNAs. and miR-130b-5p, miR-132-3p and miR-410-3p markedly inhibit monocyte adhesion.
  • 2b and 2c are graphs showing that miR-132-3p and miR-370-3p inhibitors inhibit time-dependent proliferation of human vascular smooth muscle cells by inducing cell cycle arrest in the cell cycle G1 phase.
  • 2D is a graph showing that miR-132-3p and miR-370-3p inhibitors significantly increased the levels of p21 and p27, which are cyclin-dependent kinase inhibitors.
  • Figure 2e is a graph confirming that miR-132-3p is involved in smooth muscle cell phenotype transition through conversion of smooth muscle cells to a contractile phenotype by restoring the SMA level of miR-132-3p inhibitor.
  • Figure 2f is a graph confirming again that the synthetic phenotype of human vascular smooth muscle cells was transformed into a contractile phenotype by the miR-132-3p inhibitor through F-actin filaments.
  • Figure 3a confirms the arterial expression levels through in situ hybridization of the four selected miRNAs. It was confirmed that miR-410-3p was induced by balloon injury.
  • Figure 3b is a photograph and a graph confirming that catheter-mediated local intramural delivery of the selected four miRNA inhibitors markedly regressed neointimal proliferation in balloon injured lesions compared to the control group.
  • Figure 3c shows the antiproliferative efficacy in EC, as miR-130b-5p inhibitor among miRNAs promotes recovery of EC monolayer through re-endothelialization.
  • Figure 4 profiles differentially-expressed genes (DEGs) in injured arteries.
  • Figure 4b confirms up-regulated and down-regulated DEGs through heat map analysis.
  • Figure 4c is a graph confirming that the predicted target genes of the selected four miRNAs were down-regulated in the balloon-injured carotid artery compared to the sham control group through real-time PCR.
  • 4D is a graph confirming that SOCS2, BMP7, TSPAN2, and SMAD6 are target genes of miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p, and miR-410-3p miRNAs, respectively, through real-time PCR.
  • Figure 5a confirms high expression of miR-370-3p in coronary tissue sections of human patients with atherosclerosis type II and type IV lesions.
  • 5b shows the relationship between miR-370-3p and BMP7 through serum stimulation. Serum stimulation induced miR-370-3p expression, but decreased BMP7 expression.
  • Figure 5d confirms that miR-370-3p mimics reduce luciferase expression containing a wild-type UTR rather than a negative control mutated two contiguous nucleotides within the miR-370-3p target region of human BMP7-3'UTR. .
  • Figure 5f demonstrates that smooth muscle cell proliferation inhibited by the miR-370-3p inhibitor was restored as BMP7 was reduced by siRNA transfection.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular smooth muscle cell proliferative diseases comprising a miRNA (microRNA) inhibitor as an active ingredient.
  • a miRNA miRNA
  • the present invention provides a use of miRNA (microRNA) inhibitors for preventing or treating vascular smooth muscle cell proliferative diseases.
  • miRNA miRNA
  • the term "miRNA” can be described as microRNA, microRNA, etc., and is a small RNA that plays a role in controlling the gene expression of organisms, specifically, complementary to the target mRNA 3'UTR (untranslated region). It is a small RNA containing 20 to 25 nucleotides that can play an important regulatory role in the gene expression process through inhibition of target mRNA translation by base pairing.
  • the miRNA plays an important role in cellular functions including proliferation, differentiation, and apoptosis, and is an evolutionarily conserved regulator present in all animals, and some miRNAs have epigenetic regulatory mechanisms related to their promoter regions ( histone modifications, DNA methylation, etc.) can lead to gene expression regulation.
  • the miRNA used in the present invention regulates the hyperproliferation, phenotypic transition, and migration of smooth muscle cells, and specifically, miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p and miR -410-3p was determined. In addition, their key target genes were further identified, and in particular, miR-370-3p was found to be a new miRNA related to atherosclerosis, which was identified for the first time by the present inventors.
  • miRNA inhibitor refers to an agent that reduces the expression or activity of each miRNA in a cell, which directly acts on each miRNA or indirectly acts on a top regulator to regulate target gene expression. It can mean blocking miRNA.
  • the miRNA inhibitor may mean to regulate vascular smooth muscle cell function and neointimal proliferation in vivo by inhibiting miRNAs upregulated in injured arteries, specifically miR-132-3p, miR-370- Each inhibitor for 3p, miR-130b-5p or miR-410-3p may be meant, but is not limited thereto.
  • miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p or miR-410-3p specific inhibitors may be used for the miRNA suppression, specifically, each miRNA-specific inhibitor siRNA aptamers, antisense oligonucleotides, ribozymes or compounds, but are not limited thereto.
  • siRNA aptamers, antisense oligonucleotides, ribozymes or compounds may be used.
  • any compound that inhibits miRNA associated with neointimal growth in vivo may be used.
  • the injured artery for the purpose of the present invention, is artificially damaged artery to screen for vascular miRNAs whose expression is related to arterial smooth muscle cell hyperplasia. did
  • RNAs differentially expressed in injured arteries their expression in human aortic smooth muscle cells was confirmed among 62 miRNAs differentially expressed on the 3rd and 5th day of injury compared to the control group. Six upregulated miRNAs were identified (Fig. 1).
  • upregulated means that mature miRNA (mature miRNA) increases as the transcription and processing of a specific miRNA increases.
  • can Increased expression for the purpose of the present invention may specifically mean a significant increase of 5 times or more compared to the control group, but is not limited thereto.
  • vascular smooth muscle cells refers to cells constituting the inner wall of blood vessels and functions to maintain a constant blood pressure through contraction and relaxation. In normal blood vessels, smooth muscle cells differentiate to produce proteins necessary for contraction and relaxation and stop cell proliferation. However, when functional problems arise and dedifferentiation occurs, blood vessels become narrow, resulting in diseases such as arteriosclerosis and restenosis. These vascular diseases are closely related to the function of vascular smooth muscle cells, and therefore, vascular smooth muscle cell models are a major cell model in research on vascular diseases.
  • the term “proliferation” refers to an increase in the number of organisms or tissue cells through cell division, and usually means an increase in cells in the body of a multicellular organism.
  • the cell proliferation may mean the proliferation of vascular smooth muscle cells, and excessive proliferation of these vascular smooth muscle cells is an important factor in the progression of atherosclerotic lesions.
  • vascular smooth muscle cell proliferative disease refers to a disease caused by excessive proliferation of vascular smooth muscle cells.
  • the vascular smooth muscle cell proliferative diseases include not only vascular stenosis, vascular restenosis, atherosclerosis, and atherosclerosis, which are directly caused by the proliferation of vascular smooth muscle cells, but also secondary to these diseases. It can include heart failure, myocardial infarction, angina pectoris, arrhythmia, hypertensive heart disease, congenital heart disease, stroke, or peripheral vascular stenosis, which are induced or worsening symptoms.
  • the vascular smooth muscle cell proliferative disease may be specifically, vascular stenosis, vascular restenosis, atherosclerosis, or atherosclerosis.
  • the vascular stenosis is a disease in which the inside of a blood vessel is abnormally narrowed and blood flow is reduced due to inflammation, blood clots, and excessive proliferation of smooth muscle cells after the vessel wall is damaged.
  • Vascular restenosis is a recurrence of vascular stenosis, which often occurs after a vascular procedure, such as dilating a blood vessel lumen or opening a clogged vessel to resolve vascular stenosis.
  • vascular procedures such as angioplasty, such as stent/balloon angioplasty, or vascular bypass or vascular graft, such as coronary artery bypass surgery, may damage blood vessels or , causing inflammation and vasoconstriction.
  • Atherosclerosis is a disease in which fat is deposited or fibrotic in the inner layer of arteries. Both the progression of arteriosclerosis and vascular restenosis that occurs after stent insertion for vascular expansion are related to the proliferation, migration, and extracellular matrix secretion of vascular smooth muscle cells. is known to be caused by
  • prevention refers to any activity that inhibits or delays the onset of vascular smooth muscle cell proliferative disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention
  • treatment refers to the administration of the pharmaceutical composition. It refers to all activities that improve or beneficially change the symptoms of suspected or affected subjects of vascular smooth muscle cell proliferative diseases by
  • the pharmaceutical composition of the present invention inhibits the activity and/or expression of miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p or miR-410-3p, thereby preventing or treating diseases related thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p or miR-410-3p inhibitor as an active ingredient in an amount of 0.1 to 75% by weight based on the total weight of the composition, more preferably may be contained in an amount of 1 to 50% by weight.
  • the pharmaceutical composition may further include a complex form with various nucleic acid carriers (viral or non-viral carriers) known in the art to increase the in vivo delivery efficiency of the miRNA inhibitor.
  • nucleic acid carriers viral or non-viral carriers
  • the viral carrier lentivirus, adenovirus, and adeno-associated virus can be used to deliver miRNA-encoding vectors into the nucleus of cells to express miRNA inhibitors.
  • non-viral carriers include inorganic nanoparticle-based carriers whose size and shape can be controlled using inorganic materials such as gold, carbon, and silica, and PLGA and PEI specially modified for effective delivery in specific cells.
  • Lipid transporters using polymer-based carriers such as , liposomes, etc. which are composed of a lipid bilayer and have water as an inner phase and can encapsulate and deliver nucleic acids, etc., can protect miRNA inhibitors and improve stability during blood circulation.
  • the pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be single or multiple administrations. It is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be administered parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is the patient's condition and weight, the severity of the disease, the drug form , Depending on the administration route and time, it can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • miR-132-3p and miR-370-3p showed significant inhibitory effects on vascular smooth muscle cell proliferation as a result of confirming up-regulated miRNAs regulating vascular smooth muscle cell function in vitro. , it was confirmed that monocyte adhesion to vascular smooth muscle cells was significantly inhibited by miR-130b-5p, miR-132-3p and miR-410-3p, and in-depth analysis of proliferation-related miR-132-3p and miR-370-3p Through investigation, it was confirmed that there is a possibility of regulating phenotypic transition and proliferation signals, respectively (FIG. 2).
  • miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p and miR-410-3p were identified to identify up-regulated miRNAs that regulate neointimal proliferation in vivo.
  • the expressions of miR-132-3p and miR-370-3p were significantly increased in balloon-injured carotid arteries compared to sham controls, and miR-130b-5p and miR-410-3p were also significantly increased by balloon injury.
  • the inhibitors of the miRNA markedly regressed the neointimal proliferation in balloon injury lesions compared to the control group, and the inhibitor of miR-130b-5p promoted monolayer recovery called re-endothelialization, thereby showing that these four miRNAs It was confirmed that plays a distinct role in arterial homeostasis, such as intravascular inflammation and proliferation (FIG. 3).
  • differentially DEGs commonly predicted in mice and humans through a target prediction database were selected as target genes of each miRNA using DEGs expressed by , and by confirming that these target genes were downregulated in damaged arteries, -132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p, and miR-410-3p's core target genes are SOCS2 (Suppressor of Cytokine Signaling 2), BMP7 (Bone morphogenetic protein 7), TSPAN2 (Tetraspanin-2) ) and SMAD6 (SMAD family member 6) (FIG. 4).
  • miR-370 since miR-370 was detected in the blood of patients with unstable angina, type 2 diabetes, and hyperlipidemia, the miR-370/bone morphogenic protein (BMP)-7 axis in the proliferation of smooth muscle cells was biologically As a result of examining the significance, high expression of miR-370-3p was confirmed in coronal tissue sections of human patients with atherosclerosis type II and type IV lesions. Therefore, it was confirmed that miR-370 is a new miRNA associated with atherosclerosis, and in human vascular smooth muscle cells, the level of BMP7 protein was increased through miR-370 inhibition, and BMP7 treatment led to SMAD1/5/9 phosphorylation in human smooth muscle cells.
  • BMP-7 bone morphogenic protein
  • miRNA inhibitor in vascular smooth muscle cells, it can be expected that it can be used to prevent or treat proliferative diseases.
  • the present invention provides a kit for diagnosing vascular smooth muscle cell proliferative diseases including an agent capable of detecting miRNA.
  • diagnosis means confirming the presence or characteristics of a pathological state.
  • diagnosis relates to a vascular smooth muscle cell proliferative disease, and can be interpreted as meaning an act of objectively determining whether there has been overproliferation or migration of vascular smooth muscle cells from a target patient.
  • the diagnostic kit of the present invention can be used to qualitatively and/or quantitatively detect miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p and miR-410-3p or their target genes in a specimen. .
  • the kit includes a microarray, an aptamer chip kit, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a blotting kit, an immunoprecipitation kit, an immunofluorescence test kit, a protein chip kit, and an RT-PCR kit. It may be selected from the group consisting of kits and combinations thereof, and more specifically, it may be an RT-PCT kit, but is not limited thereto as long as it can measure the expression level of miRNA or its target gene.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • the present invention a) measuring the expression level of miRNA in an isolated biological sample; and b) determining that there is a risk of vascular smooth muscle cell proliferative disease when the expression level of the miRNA is increased in the control group.
  • Measuring the expression level of miRNA in the isolated biological sample may specifically mean the expression level of miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p or miR-410-3p, More specifically, it may mean measuring the expression level of miR-370-3p.
  • the information providing method may further include determining whether the expression level of the miRNA target gene in the separated biological sample is reduced compared to a control group, and specifically, the target gene may refer to BMP7.
  • the agent for measuring the expression level may mean an agent capable of specifically binding to and recognizing miRNA or its target gene, or amplifying it.
  • it may be an antibody, primer or probe that specifically binds to the miRNA or its target gene, but is not limited thereto, and those skilled in the art will be able to select an appropriate agent for the purpose of the invention.
  • the agent may be directly or indirectly labeled to measure the expression level of the miRNA or its target gene.
  • ligands, beads, radionuclides, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescers, chemiluminescent materials, magnetic particles, haptens, dyes, and the like may be used as the label, but are limited thereto. It doesn't work.
  • the ligands include biotin, avidin, and streptavidin
  • the enzymes include luciferase, peroxidase, and beta-galactosidase
  • the fluorescent materials include fluorescein, coumarin, rhodamine, phycoerythrin and sulforhodamic acid chloride (Texas red); and the like, but are not limited thereto.
  • Most of the known labels can be used as such detectable labels, and those skilled in the art will be able to select appropriate labels according to the purpose of the invention.
  • primer refers to a base sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template, and a starting point for copying a template strand. A short sequence that functions as a point.
  • the primers used for miRNA amplification are prepared in appropriate conditions (eg, four different nucleoside triphosphates and a polymerizing agent such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and at an appropriate temperature.
  • the primer sequence does not have to be completely complementary to the polynucleotide of the miRNA of the gene or its complementary polynucleotide, and can be used as long as it is sufficiently complementary to hybridize.
  • probe refers to a labeled nucleic acid fragment or peptide capable of specific binding to miRNA.
  • specific examples include oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, oligonucleotide peptide probes, and polypeptide probes ( polypeptide), etc.
  • the separated biological sample may specifically mean blood or coronary tissue sections of patients with atherosclerosis type II and type IV lesions, and the coronary tissue is more specifically scraped from clogged arterial vessels. It may mean an organization created, but is not limited thereto.
  • miR-370-3p has been detected in the blood of patients with unstable angina pectoris, type 2 diabetes and hyperlipidemia, and by confirming high expression in the coronary tissue sections of the patients with atherosclerosis, it was confirmed that it is a new miRNA related to atherosclerosis. .
  • the method of the present invention for providing information necessary for determining whether or not the disease has occurred is the expression level of miRNA or its target gene from the blood or coronary tissue of an individual suspected of having vascular smooth muscle cell proliferative disease, specifically atherosclerosis. It may include the step of quantitatively analyzing.
  • the term "individual” may include, without limitation, mammals including, for example, rats, livestock, humans, etc., which are likely to have or have a vascular smooth muscle cell proliferative disease.
  • the present invention provides the use of a preparation for measuring the expression level of a miRNA or miRNA target gene for preparing a preparation for diagnosing a vascular smooth muscle cell proliferative disease can do.
  • vascular smooth muscle cell proliferative disease The "vascular smooth muscle cell proliferative disease”, “diagnosis” and “miRNA” are as described above.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular smooth muscle cell proliferative diseases comprising the miRNA expression inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier It is possible to provide a method for treating vascular smooth muscle cell proliferative diseases, including administering to a subject in need thereof.
  • vascular smooth muscle cell proliferative disease The "vascular smooth muscle cell proliferative disease”, "prevention”, “treatment” and “miRNA” are as described above.
  • the expression inhibitor may mean that siRNA (small interfering RNA), aptamer or antisense RNA that binds complementarily to each miRNA, but is not limited thereto.
  • the term "subject" may refer to all animals, including humans, who have or have suffered from the vascular smooth muscle cell proliferative disease of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention By administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject, the effects of preventing and treating the above diseases can be obtained.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "administration” refers to introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a subject by any suitable method, and the route of administration may be administered through various parenteral routes as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition may be appropriately administered to a subject according to a conventional method, administration route, and dosage used in the art according to purpose or necessity.
  • routes of administration include parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal administration
  • parenteral injection includes intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration.
  • an appropriate dosage and frequency of administration may be selected according to a method known in the art, and the amount and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention actually administered are the type of symptom to be treated, the route of administration, gender, health condition, It can be appropriately determined by various factors such as diet, the age and weight of the individual, and the severity of the disease.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to inhibit or alleviate the increase in vascular permeability at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical use, and the effective dose level is subject type and severity, age , gender, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the wheatgrass extract may be administered at a dose of 0.01 to 500 mg/kg per day, specifically 10 to 100 mg/kg, and the administration may be administered once a day or divided into several times.
  • composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be single or multiple administrations. It is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • composition of the present invention can be used alone for the prevention or treatment of vascular smooth muscle cell proliferative diseases, and can be used in combination with surgery, hormone therapy, drug therapy, and methods using biological response modifiers.
  • the present invention provides differentially expressed genes (Differentially Expressed Genes, DEGs) at 3 days and 5 days after injury in damaged arteries.
  • DEGs differentially expressed genes
  • Profiling It provides a target gene screening method for miRNA that inhibits vascular smooth muscle cell proliferation or migration, including.
  • the screening method includes: 1) profiling differentially expressed genes (DEGs) on days 3 and 5 after injury in injured arteries; 2) in silico target profiling for miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p and miR-410-3p through a target prediction database using the DEGs; 3) selecting DEGs commonly predicted in mice and humans from two or more databases as target genes of each miRNA; and 4) confirming that the selected target gene is down-regulated in the injured artery.
  • DEGs differentially expressed genes
  • the profiling in step 1) means gene expression profiling, and expression levels of several genes between two or more samples can be compared simultaneously.
  • analyzing gene expression northern blotting, microarray analysis, RNA sequencing, etc. can be used, and in the present invention, overall gene expression changes were confirmed through RNA sequencing, but is not limited thereto .
  • the target prediction database in step 2) is for predicting the target gene of miRNA, and the function of miRNA can usually be known through the gene controlled by miRNA.
  • miRNAs mature miRNA
  • 38,589 human miRNAs (mature miRNA ) is databased (miRBase database, version 22.1). It can be predicted by aligning the 3'UTR of the target gene and the miRNA seed, and the prediction accuracy is improved by adding structural features or evolutionarily conserved binding sites.
  • Programs that provide such prediction results include DIANA-microT, MicroInspector, MiRanda, PicTar, RNA22, RNAhybrid, TargetBoost, TargetScan, miRDB, miRmap, and the like. In the present invention, TargetScan, miRDB and miRmap were used, but are not limited thereto.
  • the target gene of step 3) specifically refers to a gene capable of regulating intracellular expression through complementary binding of miRNA to mRNA, and one miRNA target gene may exist innumerable.
  • the screening in step 4) means gene screening, and may mean selecting target genes present in the library. Screening methods may include screening using hybridization, screening using antibodies, screening using gene expression differences, screening using specific protein binding, etc. In the present invention, screening using gene expression differences was used, but is limited thereto It is not.
  • a carotid artery balloon injury model was constructed using 10-week-old male albino rats (Sprague-Dawley rats) adapted to the environment for one week after basal breeding.
  • balloon injury was created in the rat left common carotid artery using a 2F balloon catheter (Fogarty balloon embolectomy catheter). After exposing the left external carotid artery and electrocoagulating the peripheral arterial branches, a catheter was inserted through a transverse incision in the external carotid artery, placed 1 cm inside the cut site, dilated, and moved back and forth along the common carotid artery to damage the carotid artery.
  • 2F balloon catheter Fegarty balloon embolectomy catheter
  • the transfection complex 200 nM miRNA/10 ⁇ l Lipofectamin RNAimax in 200 ⁇ l Opti-MEM
  • the lumen was washed once with saline, and after the catheter was removed, the perforated area was sealed and blood flow was re-established by releasing the clap of the common carotid artery. Unless otherwise specified, mice were then allowed to recover in cages for up to 14 days.
  • the balloon-injured rats were anesthetized and fixed with heparinized saline containing 3.7% formaldehyde by transcardiac perfusion-fixation, and then the common carotid artery was resected.
  • Blood vessels were paraffin embedded and cut with a rotary microtome (Leica RM2255).
  • Two serial tissue sections (thickness of 4 ⁇ m) were obtained from the middle part of the common carotid artery and stained with haematoxylin & eosin.
  • the lumen, inner elastic layer and outer elastic layer areas were measured using NIH Image v 1.62.
  • the intimal and medial areas were determined by subtracting the luminal area from the inner elastic area and the inner elastic area from the outer elastic area, respectively. For analysis, values obtained from two serial sections per rat were averaged.
  • Qiagen QIAzol Lysis Reagent
  • RNA sequencing was performed using the TruSeq Small RNA Prep kit (Illumina). Briefly, 1 ⁇ g of total RNA was ligated with 3' and 5' RNA adapters. Reverse transcription PCR was performed using primers that anneal to the 3' and 5' adapters to generate and enrich the cDNA construct. The cDNA library was purified with a Pippin prep electrophoresis platform (Sage Science), and the quality of the library was verified with a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Small RNA sequencing was performed using the Hiseq 2500 system (Illumina) with a 1X51 setup.
  • mRNA sequencing library was prepared for mRNA sequencing using TruSeq RNA Prep Kit v2 (Illumina). Briefly, mRNA samples were purified from 1 ⁇ g of total RNA using poly-T oligo-attached magnetic beads, and fragmented mRNAs were primed with random hexamers and reverse transcribed. The mRNA template was removed and the cDNA second strand was synthesized. After 3' A-tailing and 5' end repairing, the DNA sequencing adapter was ligated to the cDNA template. PCR was then performed to amplify the template. The quality of the library was verified with a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) and mRNA sequencing was performed using a Hiseq 2500 system (Illumina) with a 2X101 setup.
  • HASMC Primary human aortic SMC
  • SmGM smooth muscle cell growth medium
  • fetal bovine serum containing growth factors and antibiotics (cat. no. cc-4149, Lonza) was used.
  • Human vascular smooth muscle cells were mainly used in experiments of passages 5-7.
  • HEK293T cells were cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin, and all cultures were maintained at 37° C. in a humidified incubator containing 5% CO 2 .
  • mirVana miRNA mimic or inhibitor (Invitrogen, USA) and siRNA (Bioneer, Korea) were transfected using Lipofectamine RNAi max (Invitrogen).
  • Qiagen QIAzol Lysis Reagent
  • individual cDNAs were synthesized from 40 ng of isolated total RNA using the TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit and specific RT primers from TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems).
  • Expression levels of mature miRNAs were quantified by quantitative real-time PCR using TaqMan Universal Master Mix II and specific FAM-based probes and primers from TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol.
  • the thermal cycling conditions of miRNA were as follows. After initial enzyme activation at 95°C for 10 minutes, denaturation at 95°C for 15 seconds, annealing at 60°C for 60 seconds, and extension were repeated 40 times to amplify.
  • U87, snoRNA and U6 were used as internal controls for rat carotid artery, and U6 was used as internal control for human vascular smooth muscle cells.
  • RNA verification reverse transcription was performed with 1 ⁇ g of total RNA isolated using the ImProm-II RT system (Promega). Quantitative real-time PCR was performed using gene-specific primers (all from Qiagen) and SYBR Green (from Roche).
  • the thermal cycling conditions of mRNA were as follows. After initial denaturation at 95°C for 15 minutes, denaturation at 94°C for 15 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 30 seconds were repeated 40 times for amplification.
  • Human vascular smooth muscle cells were rinsed twice with cold phosphate buffered saline (PBS) and rapidly frozen in liquid nitrogen.
  • the cells were cultured in 20 mM HEPES (pH 7.0), 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM EDTA (pH 8.0), 2 mM EGTA (pH 8.0), 1 mM DTT, 5 mM Na 3 It was lysed with a lysis buffer containing VO 4 , 5 mM NaF, 1 mM AEBSF, 5 ⁇ g/ml aprotinin, and 5 ⁇ g/ml leupeptin.
  • PBS cold phosphate buffered saline
  • the clarified lysate was separated in 30 ⁇ g portions on a denaturing polyacrylamide gel and transferred to a nitrocellulose membrane.
  • the membrane was incubated overnight with the primary antibody in a Tris buffered saline (TBS) solution containing 0.05% Tween-20 and 5% BSA at 4°C.
  • TBS Tris buffered saline
  • HRP-conjugated secondary antibody diluted 1:3000 in TBS solution containing 0.05% Tween-20 and 5% skim milk. Immunoreactive bands were visualized using WESTSAVE up ECL solution (cat. no. LF-QC0101, Abfrontier, Korea).
  • miRNA inhibitor-transfected human vascular smooth muscle cells were seeded in a 96-well plate at a density of 2,000 cells/well, grown for the indicated time, and then WST-1 reagent ( 10 ⁇ l/well) and incubated for 1 hour at 37°C. The number of viable cells was estimated by measuring absorbance at 450 nm.
  • human vascular smooth muscle cells (1 ⁇ 10 5 cells) were harvested after 48 hours of transfection. The cells were fixed, permeabilized with 70% ethanol overnight at -20°C, treated with 100 ⁇ g/ml RNase A for 1 hour at 37°C, and then stained with 10 ⁇ g/ml propidium iodide. Intracellular DNA content was measured using the FACSCalibur system (BD biosciences), and the percentage of G0/G1 diploid cells was analyzed using Modfit LT software (Verity Software House).
  • tissue staining paraffin sections of balloon-injured carotid arteries were deparaffinized using xylene and rehydrated in ethanol. The rehydrated tissue sections were boiled for 20 minutes in a citric acid-based antigen unmasking solution (Vector Laboratories) for antigen retrieval. In the case of double immunofluorescence, the tissue sections were blocked for 1 hour with PBS-T (0.3% Triton X-100 in PBS) containing 5% normal donkey serum. The samples were then incubated with FITC-conjugated anti-vWF antibody (1:50 dilution, Abcam) overnight at 4°C. After washing three times with PBS-T, samples were incubated with Cy3-conjugated anti-SMA antibody (1:200 dilution, Sigma Aldrich) for 2 hours at room temperature in the dark.
  • human vascular smooth muscle cells were fixed with 3.7% formaldehyde for 15 minutes and permeabilized with PBS-T for 15 minutes at room temperature.
  • the cells were labeled with Alexa Fluor 488-conjugated phalloidin (cat. no A12379, Invitrogen) for 60 min at room temperature.
  • the fixed cells were incubated with a permeabilization solution (0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate) for 2 minutes at 4°C, and the TUNEL reaction mixture of the In Situ Cell Death Detection Kit (Roche Diagnostics) and incubated at 37° C. for 60 minutes.
  • Nuclear DNA was labeled with DAPI, and fluorescence images were obtained using an LSM880 Airyscan confocal microscope (Carl Zeiss).
  • Chemotactic cell migration was measured using a 24-well transwell culture chamber (Costar; 8 mm pore size). The upper chamber was coated with gelatin B (1 mg/ml) and air-dried for 1 hour. Human vascular smooth muscle cells were transfected with miRNA inhibitors for 24 hours, serum-starved for 18 hours, and then plated again in the upper chamber at a density of 6,000 cells/chamber using basal medium. Complete medium was added to the lower chamber and the transwell chamber was incubated at 37° C. for 24 hours. Cells that did not migrate from the top of the membrane were removed, and cells that passed through and adhered to the bottom of the membrane were fixed and stained with 0.6% hematoxylin and 0.5% eosin. The number of stained cells in 4 sections was counted and averaged.
  • Human vascular smooth muscle cells were transfected with miRNA inhibitors for 24 hours and plated again in 96-well plates (4,000 cells/well). Then, human vascular smooth muscle cells were stimulated with TNF- ⁇ (10 ng/ml) for 18 hours. Separately, monocytic U937 cells (1X10 6 cell/well) were stimulated with IFN- ⁇ (50 ⁇ g/ml) for 24 hours. Activated U937 cells were labeled with 4 ⁇ M tetramethylrhodamine ethyl ester, perchlorate (cat. No. T-669, Molecular Probes) for 30 minutes, and the labeled U937 cells (1 ⁇ 10 5 cell/well) were confluent human vascular smooth muscle cells. and incubated at 37° C. for 1 hour. Unbound U937 cells were gently removed by washing three times with PBS, and the attached U937 cells were detected and counted using a ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad).
  • a reporter plasmid pMirTarget containing the full-length 3'UTR sequence of human BMP7 gene (hBMP7-3'UTR) was purchased from Origene (cat. no. SC218118). Two consecutive nucleotides in the miR-370-3p target region #1 (nucleotides 229 - 235) of the hBMP7-3'UTR were mutated to serve as a negative control.
  • HEK293T cells were plated in 24-well plates and transfected with the reporter plasmid for 6 hours. Then, the cells were transfected with the miR-370-3p mimic for 48 hours, lysed and analyzed for protein. Equal amounts of cell lysate were subjected to luciferase assay. Luminescence signals were measured with a VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer).
  • miR-370-3p in arterial tissues was detected with miRCURY LNA miRNA in situ hybridization (ISH) Optimization Kits (Qiagen) according to the manufacturer's protocol. 5' and 3' DIG-modified has-miR-370-3p miRCURY LNA miRNA Detection Probes were used for hybridization. Briefly, 4 ⁇ m paraffin sections of fixed arterial tissue were deparaffinized and rehydrated. Nuclease was inactivated with proteinase K at 37°C for 10 minutes, and hybridization was performed by incubation with miRNA detection probes (40 nM each) for 1 hour at a temperature 30°C lower than the RNA Tm value of the probe.
  • ISH miRCURY LNA miRNA in situ hybridization
  • Example 1 Identification of miRNAs differentially expressed in injured arteries
  • RNA samples were prepared, separated and purified into small RNAs and messenger RNAs through appropriate purification procedures. Both RNA pools were library constructed and sequenced based on HiSeq, and small RNA sequencing data were first analyzed with RSEM software.
  • 62 miRNAs were differentially expressed at the two time points compared to the sham control (FIG. 1A).
  • the miRNAs were examined one by one in terms of novelty as well as relevance to the vascular system, and 50 miRNAs were selected for quantitative verification by miRNA-specific real-time PCR.
  • 12 up-regulated miRNAs and 6 down-regulated miRNAs showed a more than 5-fold change in injured arteries compared to sham controls, and 1/5 of miRNAs were transiently down-regulated at 3 days after injury , which means its potential as an early-response miRNA.
  • miRNAs that were not identified in the human database or whose seed sequences did not match between mice and humans were filtered out, and among the remaining miRNA candidates, miRNAs such as miR-221-3p, miR-21-5p and miR-146a-5p. is known as smooth muscle cell hyperplasia ⁇ Sun, 2011 #2627; Liu, 2009 #2623; Ji, 2007 #2625 ⁇ , supporting the validity of a screening strategy using a rodent model.
  • the top 10 miRNAs showed dramatic expression changes of more than 5-fold in injured carotid arteries (Fig. 1B).
  • Fig. 1B To investigate their relevance to humans, their expression levels in cultured primary human vascular smooth muscle cells having a synthetic phenotype were confirmed.
  • qPCR analysis revealed that 6 out of 8 up-regulated miRNAs were prominent in human smooth muscle cells. It was confirmed that it was expressed (FIG. 1C).
  • miRNA screening using a rodent model revealed a subset of miRNAs, including some known candidates involved in neointimal proliferation.
  • miR-132-3p and miR-370-3p showed significant inhibitory effects (Fig. 2A), and monocyte adhesion to human vascular smooth muscle cells as an inflammatory sign miR-130b-5p, miR -132-3p and miR-410-3p were significantly inhibited by three miRNAs.
  • proliferation-related miRNAs namely miR-132-3p and miR-370-3p, were investigated in depth. Both miRNA inhibitors induced cell cycle arrest in the G1 phase, consistently inhibiting the time-dependent proliferation of human vascular smooth muscle cells (Fig.
  • the levels of the cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27 were significantly higher than those of both miRNAs. significantly increased by the inhibitor (Fig. 2D). However, this miRNA inhibition was not accompanied by apoptosis in human vascular smooth muscle cells, suggesting cell proliferation inhibition of smooth muscle cell proliferation.
  • miR-132-3p and miR-370-3p as the phenotypic transition of smooth muscle cells from a contractile state to a synthetic state by dedifferentiation must be preceded by proliferation-dependent neointimal hyperplasia. Whether 3p is involved in phenotypic transition was investigated.
  • miR-132-3p and miR-370-3p have the potential to regulate phenotypic transition and proliferation signals, respectively.
  • Fig. 3B Catheter-mediated local intramural delivery of miRNA inhibitors significantly reduced neointimal proliferation in balloon injury lesions compared to controls (Fig. 3B), carotid immunity against von Willebrand (vWF) and SMA as EC and smooth muscle cell markers. Fluorescent staining showed that the miR-130b-5p inhibitor promoted the so-called re-endothelialization of EC monolayer recovery (Fig. 3C), and miR-130b-5p was anti-proliferative in ECs unlike smooth muscle cells. function was performed.
  • DEGs differentially expressed genes
  • miR-370 was detected in the blood of patients with unstable angina, type 2 diabetes and hyperlipidemia [Hoekstra, 2010 #2635; Motawae, 2015 #2636; Gao, 2012 #2637], miR-370 in smooth muscle cell proliferation
  • BMP-7 bone morphogenic protein
  • BMP7 gene is a genuine miR-370 target in human smooth muscle cells. Since treatment with recombinant BMP7 was previously reported to inhibit smooth muscle cell proliferation [Lagna, 2007 #2641; Dorai, 2000 #2640], the involvement of the miR-370/BMP7 axis in smooth muscle cell proliferation was investigated. As a direct evidence, BMP7 treatment significantly induced SMAD1/5/9 phosphorylation in human vascular smooth muscle cells (Fig. 5E), suggesting an anti-mitotic effect of BMP7 in smooth muscle cells. In addition, cell proliferation assays demonstrated that BMP7 depletion restored smooth muscle cell proliferation inhibited by miR-370 inhibitors (Fig. 5F), and thus miR-370-dependent regulation of BMP7 expression inhibited smooth muscle cell growth and development of damaged arteries. It was confirmed that it is a prerequisite for neointimal proliferation.
  • the miRNA inhibitors of the present invention specifically, each of miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p and miR-410-3p inhibitors have a proliferation inhibitory effect on smooth muscle cells, which Through this, it can be expected that the inclusion of the miRNA inhibitor in smooth muscle cells is effective in preventing or treating vascular smooth muscle cell proliferative diseases.

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Abstract

본 발명은 miRNA(microRNA) 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; miRNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환 진단용 키트; 상기 질환 진단의 정보 제공 방법; 및 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 평활근세포의 증식성 질환에 관여하는 miRNA의 subset, miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p을 발굴하였으며, 이들 miRNA는 대조군 대비 손상 동맥에서 5배 이상으로 현저히 발현이 증가하였으며, 특히 miR-370-3p는 동맥경화 환자의 관상 조직에서 높은 발현을 확인함에 따라, 이와 관련된 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 이를 이용한 혈관평활근세포 증식성 질환 치료 용도로도 활용될 수 있다.

Description

MIRNA 억제제를 이용한 혈관평활근세포 증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 miRNA(microRNA) 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; miRNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환 진단용 키트; 상기 질환 진단의 정보 제공 방법; 및 치료 방법에 관한 것이다.
정상 동맥 혈관은 건강한 내피 세포(EC) 단층과 수축성 평활근 세포(평활근세포)의 두 가지 주요 세포 유형으로 구성된다. 그러나 혈류 장애와 결합된 저밀도 지단백질의 내부 축적은 EC에 염증을 일으킬 수 있으며, 단핵구/대식세포는 염증이 있는 EC 병변에 부착되어 EC 단층으로 침투하고 지질 입자를 흡수하여 거품 세포가 된다. 생성된 대식세포 구동 거품 세포와 동맥경화 병변의 면역 세포는 역분화 및 섬유성 캡 형성을 위해 평활근세포를 자극하는 많은 성장 인자와 사이토카인을 분비한다. 초기 염증 반응을 포함한 전체 죽상 형성 과정은 결국 동맥 내강의 폐색을 초래하게 된다. 현재, 동맥경화증 환자에서 폐쇄된 동맥을 복구할 수 있는 유일한 방법은 혈관성형술과 스텐트 시술을 병행하는 것이나, 시술 후에는 내피 손상으로 인해 주요 합병증인 혈전증이 생기며, 이는 스텐트 내 재협착이라고 하는 추가적인 신생내막 증식을 유발한다. 이러한 재협착 합병증 과정은 다시 동맥경화의 후기 단계에서 역분화된 평활근세포의 증식 및 이동과 유사하며, 따라서 이것은 어떤 표적 접근법도 동맥경화를 예방하기 위한 올바른 해결책이 될 수 없음을 시사한다.
microRNA(약칭 miRNA)는 1993년 선충에서 lin-4 유전자를 연구하던 중에 발견된 이후 miRNA의 번역 조절자로서의 기능이 지난 수십년 동안 많은 관심을 받아왔다. miRNA의 독특한 특징은 3' UTR에서 여러 유전자의 발현을 동시에 조절하는 것이며, 실제로 여러 연구에서 혈관 평활근세포의 성장을 조절하는 혈관 miRNA를 찾고 특성화하려고 시도하였다(Farina, 2020 #2619;Torella, 2018 #2618;Ji, 2007 #2617). 그럼에도 불구하고 설치류와 인간의 공통적인 혈관 miRNA의 게놈 전체에 대한 스크리닝은 없었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 동맥 평활근세포의 과증식 및 이동과 관련된 혈관 miRNA를 스크리닝하고자 예의 노력 연구한 결과, 평활근세포 증식을 나타내는 표준 동물 모델을 사용하여 동맥 평활근세포 증식 및 이동을 조절하는 중요한 4개의 miRNA를 확인하였고, 특히 miR-370-3p가 죽상동맥경화증에서 매우 중요한 평활근세포의 증식성 질환과 관련된 새로운 miRNA임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 miRNA(microRNA) 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 miRNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 혈관평활근세포 증식성 질환 진단의 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 miRNA 발현 억제제를 포함하는 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 인간을 제외한 개체에 투여하는 것을 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 혈관평활근세포의 증식성 질환에 관여하는 miRNA의 subset, miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p을 발굴하였으며, 이들 miRNA는 대조군 대비 손상 동맥에서 5배 이상으로 현저히 발현이 증가하였으며, 특히 miR-370-3p는 동맥경화 환자의 관상 조직에서 높은 발현을 확인함에 따라, 상기 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 이를 이용한 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료 용도로도 활용될 수 있다.
도 1a는 풍선 손상 동맥 동물 모델로부터 샴 대조군(sham control)과 비교하여 동맥 손상 3일 및 5일에 차등발현한 miRNA에 대한 히트맵 분석이다.
도 1b는 차등 발현한 miRNA 중 발현양이 5배 이상 변화를 보인 8개의 상향 조절된 miRNA와 2개의 하향 조절된 miRNA를 나타낸 그래프이다.
도 1c는 도 1b의 상향 조절된 8개의 miRNA 중 6개가 인간 평활근세포에서 두드러지게 발현되었음을 확인한 그래프이다.
도 2a는 상향 조절된 miRNA의 역할을 확인하기 위해 miRNA 억제제로 형질감염된 인간 혈관평활근세포를 사용하여 확인한 결과, miR-132-3p 및 miR-370-3p가 평활근세포 증식에 유의한 억제 효과를 나타내었고, miR-130b-5p, miR-132-3p 및 miR-410-3p가 단핵구 부착을 현저히 억제함을 확인한 그래프이다.
도 2b 및 2c는 miR-132-3p 및 miR-370-3p 억제제가 세포 주기 G1 단계에서 세포 주기 정지를 유도하여 인간 혈관평활근세포의 시간 의존적 증식을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 2d는 miR-132-3p 및 miR-370-3p 억제제가 사이클린 의존성 키나제 억제제인 p21 및 p27의 수준을 현저히 증가시킴을 나타낸 그래프이다.
도 2e는 miR-132-3p 억제제가 SMA 수준을 회복시킴으로써 평활근세포가 수축 표현형으로 전환된 것을 통해, miR-132-3p가 평활근세포 표현형 전이에 관여함을 확인한 그래프이다.
도 2f는 F-액틴 필라멘트를 통해 인간 혈관평활근세포의 합성 표현형이 miR-132-3p 억제제에 의해 수축 표현형으로 변형되었음을 재차 확인한 그래프이다.
도 3a는 선택된 4개의 miRNA의 제자리 교잡(in situ hybridization)을 통한 동맥 발현 수준을 확인한 결과, miR-132-3p 및 miR-370-3p는 풍선 손상 동맥에서 현저히 증가되었고, miR-130b-5p 및 miR-410-3p는 풍선 손상에 의해 유도됨을 확인한 것이다.
도 3b는 선택된 4개의 miRNA 억제제의 카테터 매개 국소적 교내 전달이 대조군 대비 풍선 손상 병변에서 신생 내막 증식을 현저히 퇴행시킴을 확인한 사진 및 그래프이다.
도 3c는 miRNA 중에서도 miR-130b-5p 억제제가 재내피화(re-endothelialization)를 통해 EC 단층의 회복을 촉진함에 따라, EC에서의 항증식 효능을 나타내는 것이다.
도 4a는 손상 동맥에서 차등적으로 발현된 유전자(differentially-expressed genes, DEGs)를 프로파일링한 것이다.
도 4b는 히트맵 분석을 통해 상향 조절 및 하향 조절된 DEG를 확인한 것이다.
도 4c는 real time PCR을 통해, 선택된 4개의 miRNA의 예상 표적 유전자들의 샴 대조군에 비해 풍선 손상 경동맥에서 하향 조절되었음을 확인한 그래프이다.
도 4d는 real time PCR을 통해, miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p miRNA 각각의 표적 유전자가 SOCS2, BMP7, TSPAN2 및 SMAD6임을 확인한 그래프이다.
도 5a는 동맥경화증 II형 및 IV형 병변이 있는 인간 환자의 관상 조직 절편에서 miR-370-3p의 높은 발현을 확인한 것이다.
도 5b는 혈청 자극을 통해 miR-370-3p와 BMP7과의 관계를 조사한 것으로, 혈청자극은 miR-370-3p 발현을 유도하였으나, BMP7 발현은 감소시켰다.
도 5c는 miR-370-3p 억제를 통해 혈관평활근세포에서 BMP7 단백질 수준이 증가함을 확인한 것이다.
도 5d는 miR-370-3p 모방체가 인간 BMP7-3'UTR의 miR-370-3p 표적 영역 내 2개의 연속 뉴클레오티드를 돌연변이시킨 음성 대조군이 아닌 야생형 UTR을 함유하는 루시퍼라제 발현을 감소시킴을 확인한 것이다.
도 5e는 BMP7 처리로 인한 혈관평활근세포에서 SMAD1/5/9 인산화 유도를 확인한 것이다.
도 5f는 siRNA 형질감염에 의해 BMP7이 감소됨에 따라 miR-370-3p 억제제에 의해 억제된 평활근세포 증식이 회복됨을 입증한 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 단, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 즉, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있으며, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명의 하나의 양태로서, 전술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 miRNA(microRNA) 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miRNA(microRNA) 억제제의 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에서 용어, "miRNA"는 microRNA, 마이크로RNA 등으로 기재할 수 있으며, 생물의 유전자 발현을 제어하는 역할을 하는 small RNA로, 구체적으로는 타겟 mRNA 3'UTR(untranslated region)과의 상보적인 염기쌍 배열에 의한 타겟 mRNA 번역의 억제를 통해, 유전자 발현 과정에서 중요한 조절 역할을 할 수 있는 20~25개의 뉴클레오티드를 포함하는 small RNA이다. 상기 miRNA는 증식, 분화, 세포사멸 등을 포함하는 세포 기능에 있어서 중요한 역할을 하며, 모든 동물에 존재하는 진화적으로 보존된 조절물질로서, 일부 miRNA는 그 프로모터 부위와 관련된 후성유전학적 조절 기작(히스톤 변형, DNA 메틸화 등)을 통해 유전자 발현 조절을 일으킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 miRNA는 평활근세포의 과증식, 표현형 전이, 이동 등을 조절하는 것으로, 풍선 손상 동맥 모델을 통해 구체적으로, miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p를 결정하였다. 또한, 이들의 핵심 표적 유전자를 추가로 확인하였으며, 특히 miR-370-3p은 죽상동맥경화증과 관련된 새로운 miRNA임을 발견한 것으로, 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다.
본 발명의 용어, "miRNA 억제제"는 세포 내 각 miRNA의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로서, 상기 각 miRNA에 직접적으로 작용하거나 또는 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 표적 유전자 발현을 조절하는 miRNA를 차단하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 miRNA 억제제는 손상 동맥에서 상향 발현된 miRNA를 억제함으로써 혈관평활근세포 기능 및 생체내 신생 내막 증식을 조절하는 것을 의미할 수 있으며, 구체적으로 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p에 대한 각각의 억제제를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA 억제는 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p 각각에 특이적인 억제제를 사용할 수 있으며, 구체적으로, 각 miRNA에 특이적인 siRNA 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상, 상기 화합물은 생체 내 신생 내막 증식과 관련한 miRNA를 억제시키는 화합물이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다.
상기 손상 동맥은, 본 발명의 목적상 발현이 동맥 평활근세포 과증식과 관련된 혈관 miRNA를 스크리닝하기 위해 인위적으로 동맥을 손상시킨 것으로, 구체적으로, 쥐 경동맥을 풍선을 통해 손상시키는 모델을 제작하여 실험에 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 손상 동맥에서 차등 발현되는 miRNA를 확인한 결과, 대조군 대비 손상 3일차 및 5일차에 차등적으로 발현된 62개의 miRNA 중 인간 대동맥 평활근세포에서의 이들의 발현을 확인하여 최종 6개의 상향 조절된 miRNA를 확인하였다(도 1).
상기 용어, "상향 조절된"이란, 특정 miRNA의 전사와 프로세싱이 증가함에 따라 성숙한 miRNA (mature miRNA)가 증가하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 대조군과 비교하여 손상 동맥 모델에서 생합성이 증가한 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 발현이 증가한 것은 구체적으로, 대조군 대비 5배 이상 현저히 증가한 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "혈관평활근세포"는, 혈관 내벽을 구성하는 세포로, 수축과 이완을 통해 혈압을 일정하게 유지하는 기능을 하는 세포를 의미한다. 정상 혈관에서는 평활근 세포가 분화되면서 수축 및 이완에 필요한 단백질을 만들고 세포 증식을 멈추게 되지만, 기능에 문제가 생겨 역분화할 경우, 혈관이 좁아지면서 동맥 경화 및 혈관 재협착 등의 질환을 일으키게 된다. 이러한 혈관 질환은 혈관평활근세포의 기능과 밀접한 관련이 있으며, 따라서 혈관평활근세포 모델은 혈관 질환 연구에 있어서 주요한 세포모델이다.
본 발명에서 용어, "증식"은 생물이나 조직 세포 따위가 세포 분열을 하여 그 수를 늘려가는 것으로, 보통 다세포생물의 체내에서 세포가 증가되어 가는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 세포 증식은 혈관평활근세포의 증식을 의미할 수 있으며, 이러한 혈관평활근세포의 과다한 증식은 동맥경화증 병변의 진행에 중요한 요소이다.
본 발명에서 용어, "혈관평활근세포 증식성 질환"은 혈관평활근세포의 과도한 증식에 의해 발생하는 질환을 의미한다. 상기 혈관평활근세포 증식성 질환은 혈관평활근세포의 증식에 의해 직접적으로 발생하는 혈관협착증(stenosis), 혈관 재협착증(restenosis), 죽상동맹경확증, 아테롬성동맥경화증 뿐만 아니라, 이들 질환에 의해 2차적으로 유발되거나 증상이 심화되는 심혈관계 질환인 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중 또는 말초혈관협착증 등을 포 함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈관평활근세포 증식성 질환은 구체적으로, 혈관협착증, 혈관재협착증, 죽상동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증일 수 있다.
상기 혈관협착증은, 혈관벽이 손상된 후 염증, 혈정, 평활근세포의 과도한 증식 등으로 혈관 내부가 비정상적으로 좁아지고 혈류량이 감소하는 질환이다. 혈관재협착증은, 혈관협착증이 재발하는 것으로, 주로 혈관 협착을 해결하기 위해 혈관 내강(lumen)을 확장하거나 막힌 혈관을 통하게 하는 등의 혈관 시술 이후에 발생하는 경우가 많다. 스텐트(stent)/혈관 풍선 성형술(balloon angioplasty)과 같은 혈관 성형술, 관동맥 문합술(coronary artery bypass surgery)과 같은 혈관우회술(vascular bypass 또는 vascular graft)등의 혈관 시술은 시술 자체로 혈관에 손상을 가하거나, 염증을 일으키면서 혈관협착을 일으킨다. 죽상동맥경화증은 동맥의 내층에 지방이 침착되거나 섬유화되어 있는 질환으로, 동맥경화의 진행과 혈관 확장을 위해 스텐트 삽입 후 발생하는 혈관재협착증은 모두 혈관평활근세포의 증식, 이동, 세포외 기질 분비에 의한 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 혈관평활근세포 증식성 질환의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 혈관평활근세포 증식성 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p의 활성 및/또는 발현을 저해함으로써 이와 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분으로서 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p 억제제를 조성물의 총중량을 기준으로 0.1 내지 75 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 50 중량%로 함유할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 miRNA 억제제의 생체 내 전달 효율을 높이기 위하여 당업계에 알려진 다양한 핵산 전달체(바이러스성 또는 비바이러스성 전달체)와 복합체 형태를 추가로 포함할 수 있다. 상기 바이러스성 전달체로는 구체적으로, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관바이러스가 miRNA를 암호화하는 벡터를 세포 내 핵으로 전달하여 miRNA 억제제를 발현하는데 사용할 수 있다. 또한 비 바이러스성 전달체로는 금, 탄소, 실리카와 같은 무기물질을 이용하여 사이즈와 형태를 조절할 수 있는 무기 나노입자 기반의 전달체, 특정 세포 특이적으로 효과적 전달을 위해 특별히 변형이 많이 된 PLGA와 PEI와 같은 폴리머 기반 전달체, 지질 이중층으로 이루어져 있고 내상이 물로 되어 있어 핵산 등을 봉입하여 전달할 수 있는 리포좀 등을 이용한 지질 수송체는 miRNA 억제제를 보호하여 혈액 순환 시 안정성을 증진시킬 수 있다.
상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 시험관 내 혈관평활근세포 기능을 조절하는 상향 조절된 miRNA를 확인한 결과, miR-132-3p 및 miR-370-3p가 혈관평활근세포 증식에 있어서 유의한 억제 효과를 나타내었고, miR-130b-5p, miR-132-3p 및 miR-410-3p에 의해 혈관평활근세포에 대한 단핵구 부착이 현저히 억제됨을 확인하였으며, 증식 관련 miR-132-3p 및 miR-370-3p에 대한 심층 조사를 통해, 각각 표현형 전이와 증식 신호를 조절할 가능성이 있음을 확인하였다(도 2).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 생체 내 신생 내막 증식을 조절하는 상향 조절된 miRNA를 확인하기 위해, miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p의 동맥 발현 수준을 조사한 결과, miR-132-3p 및 miR-370-3p의 발현이 샴 대조군에 비해 풍선 손상 경동맥에서 현저히 증가되었고, miR-130b-5p 및 miR-410-3p도 풍선 손상에 의해 실질적으로 유도되었으며, 상기 miRNA의 억제제는 대조군 대비 풍선 손상 병변에서 신생 내막 증식을 현저히 퇴행시켰고, miR-130b-5p 억제제는 재내피화라고 불리는 단층의 회복을 촉진함을 보임으로써, 이들 4개의 miRNA가 혈관 내 염증 및 증식과 같은 동맥 항상성에서 뚜렷한 역할을 함을 확인하였다(도 3).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p의 핵심 표적 유전자를 확인하기 위해, 손상 동맥에서 두 시점에 차등적으로 발현된 유전자(DEGs)를 이용하여 표적 예측 데이터베이스를 통해 쥐와 인간에서 공통적으로 예측한 DEG를 각 miRNA의 표적 유전자로 선택하였으며, 이들 표적 유전자가 손상 동맥에서 하향 조절된 것을 확인함으로써, 상기 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p의 각 핵심 표적 유전자가 SOCS2(Suppressor of Cytokine Signalling 2), BMP7(Bone morphogenetic protein 7), TSPAN2(Tetraspanin-2) 및 SMAD6(SMAD family member 6)임을 밝혔다(도 4).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 불안정형 협심증, 제2형 당뇨병 및 고지혈증 환자의 혈액에서 miR-370이 검출되었기 때문에 평활근세포 증식에 있어서 miR-370/BMP(bone morphogenic protein)-7 축의 생물학적 중요성을 조사한 결과, 동맥경화증 II형 및 IV형 병변이 있는 인간 환자의 관상 조직 절편에서 miR-370-3p의 높은 발현을 확인하였다. 따라서, miR-370이 죽상동맥경화증과 관련된 새로운 miRNA임을 확인하였고, 인간 혈관 평활근세포에서는 miR-370 억제를 통해 BMP7 단백질의 수준을 증가시켰으며, BMP7 처리는 인간 평활근세포에서 SMAD1/5/9 인산화를 현저하게 유도하였고, BMP7 고갈이 miR-370 억제제에 의한 평활근세포 증식 억제를 방해함으로써, miR-370 의존적 BMP7 발현은 평활근세포 성장과 손상된 동맥에서 발생하는 신생내막 증식의 전제 조건임을 확인하였다(도 5).
따라서, 본 발명의 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p의 세포 증식 억제 효과를 바탕으로 혈관평활근세포에서 상기 miRNA 억제제를 포함시킴으로써, 혈관평활근세포 증식성 질환을 예방하거나 치료하는데 이용할 수 있음을 예상할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 전술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 miRNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환 진단용 키트를 제공한다.
상기 "miRNA" 및 "혈관평활근세포 증식성 질환"은 상술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인한 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 혈관평활근세포 증식성 질환에 관한 것으로, 목적하는 환자로부터 혈관평활근세포의 과증식 또는 이동이 있었는지의 여부를 객관적으로 판별하는 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 검체 내의 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p 또는 이들의 표적 유전자를 정성적 및/또는 정량적으로 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 키트는 구체적으로, 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 블랏팅(blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트, RT-PCR 키트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로 RT-PCT 키트 일 수 있으나, miRNA 또는 이의 표적 유전자 발현 수준을 측정할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 전술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 a) 분리된 생물학적 시료에서 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 대조군에서 상기 miRNA의 발현 수준이 증가하면 혈관평활근세포 증식성 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환 진단의 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 "혈관평활근세포 증식성 질환" 및 "진단"은 상술한 바와 같다.
상기 분리된 생물학적 시료에서 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 구체적으로, miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p의 발현 수준을 의미할 수 있으며, 더욱 구체적으로, miR-370-3p의 발현 수준을 측정한 것을 의미할 수 있다.
상기 정보 제공 방법은, 상기 분리된 생물학적 시료에서 miRNA의 표적 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 감소하는지 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 표적 유전자는 BMP7을 의미할 수 있다.
또한, 상기 miRNA 또는 이의 표적 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다. 상기 발현 수준을 측정하는 제제는, miRNA 또는 이의 표적 유전자에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나, 증폭시킬 수 있는 제제를 의미할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 miRNA 또는 이의 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 항체, 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업자라면 발명의 목적에 맞게 적절한 제제를 선택할 수 있을 것이다.
상기 제제는 상기 miRNA 또는 이의 표적 유전자의 발현 수준 측정을 위해 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지에는 리간드, 비드(bead), 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광물질(fluorescer), 화학발광물질, 자성 입자, 합텐 및 염료 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 예로, 상기 리간드에는 바이오틴, 아비딘 및 스트렙토아비딘 등이 포함되고, 상기 효소에는 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제 및 베타 갈락토시다아제 등이 포함되며, 상기 형광물질에는 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 피코에리트린 및 설포로다민산 클로라이드(텍사스 레드: Texas red) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 검출 가능한 표지물로 공지의 표지물 대부분이 사용될 수 있고, 당업자라면 발명의 목적에 맞게 적절한 표지물을 선택할 수 있을 것이다
상기 용어 "프라이머"는, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기 쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서, 상기 miRNA 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이 트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에 서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티 드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 유전자의 miRNA의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.
상기 용어 "프로브"란, miRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 라벨링(labeling)된 핵산 단편 또는 펩타이드를 의미한다. 구체적인 예로, 올리고뉴클 레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로 브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, 올리고펩타이 드(oligonucleotide peptide) 프로브, 폴리펩타이드 프로브(polypeptide) 등의 형 태로 제작될 수 있다.
본 발명에서 상기 분리된 생물학적 시료는 구체적으로, 동맥경화증 II형 및 IV형 병변이 있는 환자의 혈액 또는 관상 조직 절편인 것을 의미할 수 있으며, 상기 관상 조직은 더욱 구체적으로는, 막힌 동맥 혈관으로부터 긁어낸 조직을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
miR-370-3p는 불안정형 협심증, 제2형 당뇨병 및 고지혈증 환자의 혈액에서 검출된 바 있으며, 상기 동맥경화증 환자의 관상 조직 절편에서 높은 발현을 확인함으로써, 죽상동맥경화증과 관련된 새로운 miRNA임을 확인하였다.
본 발명의 상기 질환의 발병여부 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 혈관평활근세포 증식성 질환, 구체적으로 죽상동맥경화증의 발병이 의심스러운 개체의 혈액 또는 관상 조직으로부터 miRNA 또는 이의 표적 유전자의 발현 수준을 정량 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용어, "개체"는, 예를 들어 혈관평활근세포 증식성 질환이 별병될 가능성이 있거나, 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 전술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은, 혈관평활근세포 증식성 질환 진단용 제제를 제조하기 위한 miRNA 또는 miRNA 표적 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공할 수 있다.
상기 "혈관평활근세포 증식성 질환", "진단" 및 "miRNA"는 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 전술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은, 상기 miRNA 발현 억제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 혈관평활근세포 증식성 질환의 치료 방법을 제공할 수 있다.
상기 "혈관평활근세포 증식성 질환", "예방", "치료" 및 "miRNA"는 상술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 억제제는 각 miRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(small interfering RNA), 압타머 또는 안티센스 RNA인 것인 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 혈관평활근세포 증식성 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여함으로 상기 질환의 예방 및 치료 효과를 얻을 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약 물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 밀싹 추출물은 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용할 수 있고, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 전술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 손상 동맥에서 손상 후 3일 및 5일에 차등적으로 발현된 유전자(Differentially Expressed Genes, DEGs)를 프로파일링하는 단계를 포함하는 혈관평활근세포 증식 또는 이동을 억제하는 miRNA의 표적 유전자 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 "손상 동맥", "혈관평활근세포", "증식" 및 "miRNA"는 상술한 바와 같다.
상기 스크리닝 방법은, 구체적으로, 1) 손상 동맥에서 손상 후 3일 및 5일에 차등적으로 발현된 유전자(Differentially Expressed Genes, DEGs)를 프로파일링하는 단계; 2) 상기 DEGs를 이용하여 표적 예측 데이터베이스를 통해 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p에 대한 in silico 표적 프로파일링하는 단계; 3) 두 개 이상의 데이터베이스에서 쥐와 인간에서 공통적으로 예측한 DEG를 각 miRNA의 표적 유전자로 선택하는 단계; 및 4) 상기 선택된 표적 유전자가 손상 동맥에서 하향 조절된 것을 확인하는 단계를 포함한다.
상기 1) 단계의 프로파일링은 유전자 발현 프로파일링을 의미하는 것이며, 두 개 이상의 샘플 간 여러 유전자의 발현 수준을 동시에 비교할 수 있다. 유전자 발현을 분석하는데 있어서, 노던 블로팅(northern blotting), 마이크로어레이(microarray) 분석, RNA 시퀀싱 등을 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 RNA 시퀀싱을 통해 전체 유전자 발현 변화를 확인하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 2) 단계의 표적 예측 데이터베이스는, miRNA의 표적 유전자를 예측하기 위한 것으로, miRNA의 기능은 대게 miRNA가 조절하는 유전자를 통해 알 수 있으며, miRNA는 2018년 10월 기준 human miRNA 38,589개(mature miRNA)가 데이터베이스화 되어 있다(miRBase database, version 22.1). 표적 유전자의 3'UTR과 miRNA의 seed를 alignment하여 예측할 수 있으며, 구조적인 특징을 덧붙이거나, 진화적으로 보존된 결합자리 등을 추가함으로써 예측 정확도를 높이고 있다. 이러한 예측 결과를 제공하는 프로그램으로는, DIANA-microT, MicroInspector, MiRanda, PicTar, RNA22, RNAhybrid, TargetBoost, TargetScan, miRDB, miRmap 등이 있다. 본 발명에서는 TargetScan, miRDB 및 miRmap을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 3) 단계의 표적 유전자는 구체적으로, miRNA가 mRNA와 상보적인 결합을 통해 세포내 발현을 조절할 수 있는 유전자를 의미하는 것으로, 하나의 miRNA의 표적 유전자는 수없이 많이 존재할 수 있다.
상기 4) 단계의 스크리닝은 유전자 스크리닝을 의미하며, 라이브러리 내 존재하는 표적 유전자를 골라내는 것을 의미할 수 있다. 스크리닝 방법에는 혼성화를 이용한 스크리닝, 항체를 이용한 스크리닝, 유전자 발현 차이를 이용한 스크리닝, 특정 단백질과의 결합을 이용한 스크리닝 등이 존재할 수 있으며, 본 발명에서는 유전자 발현 차이를 이용한 스크리닝을 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 경동맥 풍선 손상 모델 제작
기초 사육 후 1주일간 환경에 적응시킨 생후 10주된 수컷 알비노 랫드 (Sprague-Dawley rats)를 이용하여 경동맥 풍선손상 모델을 제작하였다.
구체적으로, 쥐 왼쪽 총경동맥에 2F 풍선도자 카테터 (Fogarty balloon embolectomy catheter)를 사용하여 풍선 손상을 생성하였다. 좌측 외경동맥을 노출시켜 주변 동맥 가지는 전기 응고한 뒤, 외경동맥의 횡절개를 통해 카테터를 삽입해, 절단 부위로부터 1 cm 안쪽에 위치시켜 팽창시킨 다음 총경동맥을 따라 앞뒤로 움직이게 하여 경동맥을 손상시켰다. miRNA 억제제의 카테터 매개 동맥 내 전달을 위해, 형질감염 복합체 (200 nM miRNA/10 μl Lipofectamin RNAimax in 200μl Opti-MEM)를 손상된 경동맥 내강에 주입하고 15분 간 배양하였다. 카테터를 제거하기 전 내강을 식염수로 한번 씻어주고, 카테터를 제거한 후에는 천공된 부위를 봉인하고 총경동맥의 clap을 풀어 혈류를 재확립하였다. 별 다른 명시가 없는 한, 쥐는 그 후 최대 14일 동안 우리에서 회복되었다.
실험예 2. 조직병리학적 분석
풍선 손상 쥐를 마취시키고 3.7% 포름알데히드를 함유한 헤파린화 식염수로 경심관류(transcardiac perfusion-fixation) 고정 후 총경동맥을 절제하였다. 혈관을 파라핀 포매하고, 회전 마이크로톰(Leica RM2255)으로 절단하였다. 총경동맥의 중간 부위로부터 2개의 연속 조직 절편(두께 4 μm)을 수득하고, haematoxylin & eosin으로 염색하였다. 내강, 내부 탄성층 및 외부 탄성층 영역은, NIH Image v 1.62를 사용하여 측정하였다. 내막 및 내측 영역은 각각 내부 탄성 영역에서 내강 영역을 빼고, 외부 탄성 영역에서 내부 탄성 영역을 뺌으로써 결정하였다. 분석을 위해 쥐 당 2개의 연속 절편에서 얻은 값의 평균을 구하였다.
실험예 3. RNA 시퀀싱
small RNA 및 mRNA 시퀀싱을 수행하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAzol Lysis Reagent(Qiagen)를 사용하여 쥐의 경동맥 조직에서 전체 RNA를 분리하였다. 샴 대조군(sham control)의 경우 총 RNA의 양을 증가시키기 위해 3개의 경동맥 조직을 풀링하였다. 총 RNA 추출물의 순도와 무결성은 각각 NanoDrop 8000 분광광도계(Thermo Scientific) 및 Bioanalyzer(Agilent Technologies)로 측정하였고, RIN 값이 8보다 큰 샘플을 시퀀싱 프로세스에 사용하였다.
먼저, small RNA 시퀀싱을 위해 TruSeq Small RNA Prep 키트(Illumina사)를 사용하여 small RNA 라이브러리를 준비하였다. 간략하게는, 1μg의 총 RNA는 3' 및 5' RNA 어댑터로 라이게이션하였다. 역전사 PCR은 cDNA 컨스트럭트를 생성하고 강화(enriching)하기 위해 3' 및 5' 어댑터에 어닐링하는 프라이머를 사용하여 실시하였다. cDNA 라이브러리는 Pippin prep 전기영동 플랫폼(Sage Science)으로 정제하였고, 라이브러리의 품질은 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)로 검증하였다. small RNA 시퀀싱은 1X51 설정으로 Hiseq 2500 시스템(Illumina)을 사용하여 실시하였다.
다음으로, mRNA 시퀀싱을 위해 TruSeq RNA Prep 키트 v2(Illumina사)를 사용하여 mRNA 시퀀싱 라이브러리를 준비하였다. 간략하게는, mRNA 샘플은 poly-T oligo-attached magnetic bead를 사용하여 1 μg의 총 RNA로부터 정제하였고, 단편화된 mRNA는 무작위 헥사머로 프라이밍하였고, 역전사하였다. mRNA 주형을 제거하고 cDNA 두 번째 가닥을 합성하였다. 3' A-테일링 및 5' 말단 리페어링 이후, DNA 시퀀싱 어댑터를 cDNA 템플릿에 라이게이션하였다. 그런 다음, 템플릿을 증폭하기 위해 PCR을 수행하였다. 라이브러리의 품질은 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)로 검증하였고, mRNA 시퀀싱은 2X101 설정으로 Hiseq 2500 시스템(Illumina)을 사용하여 수행하였다.
실험예 4. 세포 배양
일차 인간 혈관평활근세포(human aortic SMC, HASMC)는 Lonza사로부터 구입하고 성장 인자 및 항생제(cat. no. cc-4149, Lonza)가 포함된 5% 소태아혈청을 포함하는 평활근 세포 성장 배지(SmGM)에서 계대 배양하여 증식시켰다. 인간 혈관평활근세포는 주로 계대수 5~7의 실험에 사용하였다. HEK293T 세포는 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였으며, 모든 배양은 37℃에서 5% CO2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 유지시켰다.
mirVana miRNA 모방체 또는 억제제(Invitrogen, USA) 및 siRNA(Bioneer, Korea)는 리포펙타민 RNAimax(Invitrogen사)를 사용하여 형질감염시켰다.
세포를 6-웰 플레이트에 1×105 cells/well의 밀도로 분주하였다. 24시간 후, miRNA 모방체(각각 0.1 nM), miRNA 억제제(각각 10~150 nM) 또는 siRNA(각각 100 nM)를 포함하는 형질감염 복합체를 배양 플레이트에 첨가한 다음 형질감염 24시간 후에 새로운 배양 배지로 교체하였다.
실험예 5: 실시간 정량 PCR(Real-time quantitative PCR) 총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 QIAzol Lysis Reagent(Qiagen)를 사용하여 배양된 인간 혈관평활근세포 및 쥐의 경동맥 조직으로부터 분리하였다. miRNA 검증을 위해, TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit와 TaqMan MicroRNA Assays(Applied Biosystems)의 특정 RT 프라이머를 사용하여 분리한 총 RNA 40 ng으로 개별 cDNAs를 합성하였다. 성숙한 miRNA의 발현 수준은 제조사의 프로토콜에 따라 TaqMan Universal Master Mix II와 TaqMan MicroRNA Assays(Applied Biosystems)의 특정 FAM 기반 프로브 및 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 통해 정량화 하였다.
miRNA의 열 사이클링 조건은 다음과 같다. 95℃에서 10분간 초기 효소 활성화시킨 후, 95℃에서 15초 변성, 60℃에서 60초 어닐링 및 연장을 40회 반복하여 증폭시켰다.
U87, snoRNA 및 U6은 쥐의 경동맥에 대한 내부 대조군으로 사용하였고, U6은 인간 혈관평활근세포에 대한 내부 대조군으로 사용하였다.
mRNA 검증을 위해, ImProm-II RT system(Promega사)을 사용하여 분리된 총 RNA 1 μg으로 역전사를 수행하였다. 정량적 실시간 PCR은 유전자 특이적 프라이머(모두 Qiagen사) 및 SYBR Green(Roche사)을 사용하여 수행하였다.
mRNA의 열 사이클링 조건은 다음과 같다. 95℃에서 15분간 초기 변성 이후, 94℃에서 15초 변성, 55℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 30초 연장을 40회 반복하여 증폭시켰다.
용융 곡선 분석은 PCR 종료 시 수행하였으며, β-액틴 또는 18S RNA를 하우스키핑 유전자로 사용하였다. CFX Connect 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad사)을 사용하여 성숙한 miRNA 및 전사체의 수준을 검출하였다. 상대적 유전자 발현은 ΔΔCt 값으로 결정하였다.
실험예 6: 면역블랏 분석
인간 혈관평활근세포를 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 두 번 헹구고, 액체 질소에서 신속하게 동결시켰다. 상기 세포는 20 mM HEPES(pH 7.0), 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA(pH 8.0), 2 mM EGTA(pH 8.0), 1 mM DTT, 5 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 1 mM AEBSF, 5 μg/ml aprotinin, 및 5 μg/ml leupeptin을 포함한 용해 완충액으로 용해시켰다. 12,000×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 정제된 용해물을 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 30 μg씩 분리하고 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 4℃에서 0.05% Tween-20 및 5% BSA를 포함하는 Tris 완충 식염수(TBS) 용액에서 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 다음으로, 상기 멤브레인을 0.05% Tween-20 및 5% 탈지유를 함유하는 TBS 용액에서 1:3000로 희석한 HRP-접합 이차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 면역 반응성 밴드는 WESTSAVE up ECL 솔루션(cat. no. LF-QC0101, Abfrontier, Korea)을 사용하여 시각화하였다.
실험예 7: 세포 증식 및 세포 주기 분석
세포 증식 분석을 위해, miRNA 억제제-형질감염된 인간 혈관평활근세포(miRNA inhibitor-transfected HASMC)를 96-well 플레이트에 2,000 cells/well의 밀도로 시딩하고, 표시된 시간 동안 성장시킨 다음, WST-1 시약(10 μl/well)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 생존 세포수는 450 nm에서 흡광도를 측정하여 추정하였다.
세포 주기 분석을 위해, 인간 혈관평활근세포(1×105 세포)를 48시간 형질감염 후에 회수하였다. 상기 세포를 고정시키고, -20℃에서 밤새 70% 에탄올 투과처리하고, 37℃에서 1시간 동안 100 μg/ml RNase A로 처리한 다음, 10 μg/ml propidium iodide로 염색하였다. 세포 내 DNA 함량은 FACSCalibur 시스템(BD biosciences사)으로 측정하였고, G0/G1 이배체 세포의 백분율은 Modfit LT 소프트웨어(Verity Software House 사)를 사용하여 분석하였다.
실험예 8: 면역형광 염색
조직 염색은, 풍선 손상 경동맥의 파라핀 절편을 자일렌을 이용하여 탈파라핀화하고, 에탄올에서 재수화하였다. 상기 재수화된 조직 절편은 항원 복구(antigen retrieval)를 위해 시트르산 기반 항원 unmasking 솔루션(Vector Laboratories)에서 20분 동안 보일링하였다. 이중 면역형광법의 경우, 상기 조직 절편을 5% 정상 당나귀 혈청이 포함된 PBS-T(0.3 % Triton X-100 in PBS) 으로 1시간 동안 블로킹하였다. 그런 다음, 상기 샘플을 4℃에서 밤새 FITC-접합된 항-vWF 항체(1:50 희석, Abcam)와 함께 인큐베이션하였다. PBS-T로 3회 세척한 후, 샘플을 Cy3-접합된 항-SMA 항체(1:200 희석, Sigma Aldrich)와 함께 어두운 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
F-액틴 염색은, 인간 혈관평활근세포를 15분 동안 3.7% 포름알데히드로 고정하고 실온에서 15분 동안 PBS-T로 투과시켰다. 상기 세포는 실온에서 60분 동안 Alexa Fluor 488-접합 phalloidin(cat. no A12379, Invitrogen)으로 라벨링하였다.
TUNEL 분석은, 상기 고정된 세포를 4℃에서 2분 동안 투과성 용액(0.1% Triton X-100, 0.1% 시트르산나트륨)과 함께 인큐베이션하고, In Situ Cell Death Detection Kit(Roche Diagnostics)의 TUNEL 반응 혼합물과 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
Nuclear DNA는 DAPI로 라벨링하였고, 형광 이미지는 LSM880 Airyscan 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 수득하였다.
실험예 9: 트랜스웰 이동 분석(Transwell migration assay)
화학주성 세포 이동(chemotactic cell migration)은 24-well 트랜스웰 배양 챔버(Costar; 8 mm 기공 크기)를 사용하여 측정하였다. 상부 챔버는 젤라틴 B(1 mg/ml)로 코팅하고 1시간 동안 에어드라이하였다. 인간 혈관평활근세포를 24시간 동안 miRNA 억제제로 형질감염시키고, 18시간 동안 혈청 결핍시킨 다음, 기저 배지를 이용하여 6,000 cell/챔버의 밀도로 상부 챔버에 다시 플레이팅하였다. 완전 배지를 하부 챔버에 첨가하고, 트랜스웰 챔버를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 멤브레인 위쪽에서 이동하지 않은 세포를 제거하고, 통과하여 막 아래쪽에 부착된 세포를 고정하고, 0.6% hematoxylin과 0.5% eosin으로 염색하였다. 4개 부분에서 염색된 세포의 수를 세고 평균을 내었다.
실험예 10: 단핵구 부착 분석(Monocyte adhesion assay)
인간 혈관평활근세포를 24시간 동안 miRNA 억제제로 형질감염시키고, 96-well 플레이트(4,000 cell/well)에 다시 플레이팅하였다. 그런 다음, 인간 혈관평활근세포를 18시간 동안 TNF-α(10 ng/ml)로 자극하였다. 별도로, 단핵구 U937 세포(1X106 cell/well)를 24시간 동안 IFN-γ(50 μg/ml)로 자극하였다. 활성화된 U937 세포를 4 μM tetramethylrhodamine ethyl ester, perchlorate (cat. No. T-669, Molecular Probes)로 30분 동안 라벨링하고, 라벨링된 U937 세포(1×105 cell/well)를 confluent 인간 혈관평활근세포에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 U937 세포를 PBS로 3회 세척하여 부드럽게 제거하고, 부착된 U937 세포는 ZOE Fluorescent Cell Imager(Bio-Rad)를 사용하여 검출하여 카운팅하였다.
실험예 11: 루시퍼라제 리포터 분석
miR-370-3p의 표적 유전자 예측을 위해, 인간 BMP7 유전자(hBMP7-3'UTR)의 전장 3'UTR 서열을 포함하는 리포터 플라스미드 pMirTarget을 Origene사(cat. no. SC218118)로부터 구입하였다. hBMP7-3'UTR의 miR-370-3p 표적 영역 #1(뉴클레오티드 229 - 235) 내 2개의 연속 뉴클레오티드를 돌연변이시켜 음성 대조군으로 하였다. 리포터 분석을 위해 HEK293T 세포를 24-well 플레이트에 플레이팅하고, 리포터 플라스미드로 6시간 동안 형질감염시켰다. 그런 다음, 상기 세포를 48시간 동안 miR-370-3p 모방체로 형질감염시키고, 용해시켜 단백질 분석하였다. 동일한 양의 세포 용해물을 루시퍼라제 분석에 적용하였다. 발광 신호(luminescence signal)는 VICTOR Multilabel Plate Reader(Perkin Elmer)로 측정하였다.
실험예 12: 제자리 교잡(In situ hybridization)
동맥 조직 내 miR-370-3p 발현은 제조사의 프로토콜에 따라 miRCURY LNA miRNA in situ hybridization(ISH) Optimization Kits(Qiagen사)로 검출하였다. 5' 및 3' DIG-modified has-miR-370-3p miRCURY LNA miRNA Detection Probe는 혼성화에 사용하였다. 간략하게는, 고정된 동맥 조직의 4 μm 파라핀 절편을 탈파라핀화하고 재수화하였다. 뉴클레아제는 37℃에서 10분 동안 proteinase K로 비활성화하였고, 혼성화는 miRNA 검출 프로브(각각 40 nM)와 함께 프로브의 RNA Tm 값보다 30℃ 낮은 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하여 실시하였다. 슬라이드는 각 어닐링 온도에서 saline-sodium citrate(SSC) 혼성화 완충액의 연속 희석액으로 세척하고, 면역 검출은 alkaline phosphatase-conjugated anti-DIG antibody (cat. no. 11093274910, Roche)를 60분 동안 실온에서 인큐베이션하여 수행하였다. 상기 슬라이드를 37℃에서 2시간 동안 0.2 nM Levamisol을 포함하는 NBT/BCIP(cat. no. 11697471001, Roche) 기질 용액과 함께 인큐베이션하여 발색시켰다. 또한, scramble 프로브를 연속조직 절편에 어닐링한 것을 컨트롤로 이용하였으며, 세포핵은 Nuclear Fast Red로 라벨링하였다.
실험예 13: 통계 분석
달리 명시되지 않는 한, 데이터는 두 가지 그룹 간의 Student's t-test 및 여러 그룹에 대한 Turkey's test를 사용하여 one-way ANOVA으로 분석하였다. P<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1: 손상 동맥에서 차등 발현되는 miRNA의 확인
이전 연구에서 조사된 쥐 경동맥 풍선 손상 모델로부터 손상 시간에 따른 신생내막 비후의 조직학적 분석을 기반으로, 풍선 손상 후 3일 및 5일의 두 시점을 선택하고, 평활근세포 역분화 및 증식의 개시를 지시하는 miRNA를 확인하였다.
구체적으로, 전체 RNA 샘플을 준비하고 적절한 정제 절차를 통해 small RNAs와 메신저 RNAs로 분리하고 정제하였다. 두 RNA 풀(pools)은 라이브러리 구성 및 HiSeq 기반 시퀀싱하였고, small RNA 시퀀싱 데이터는 먼저 RSEM 소프트웨어로 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 62개의 miRNA가 샴 대조군(sham control)과 비교하여 두 시점에서 차등적으로 발현되었다(도 1A). 혈관계와의 관련성뿐만 아니라 신규성 측면에서 상기 miRNA를 하나씩 검사하고 miRNA-specific real-time PCR에 의한 정량적 검증을 위해 50개의 miRNA를 선택하였다. 그 결과, 12개의 상향 조절된 miRNA와 6개의 하향 조절된 miRNA가 샴 대조군과 비교하여 손상된 동맥의 5배 이상의 변화가 나타났으며, miRNA의 1/5은 손상 후 3일에 일시적으로 하향 조절되었고, 이는 조기 반응(early-response) miRNA로서의 가능성을 의미한다. 인간 데이터베이스에서 확인되지 않았거나 쥐와 인간 사이에 종자 서열이 일치하지 않은 일부 miRNA는 걸러 내었고, 나머지 miRNA 후보 중, miR-221-3p, miR-21-5p 및 miR-146a-5p와 같은 miRNA는 평활근세포 증식증(hyperplasia)으로 알려져 있어{Sun, 2011 #2627;Liu, 2009 #2623; Ji, 2007 #2625}, 설치류 모델을 사용한 선별 전략의 타당성을 뒷받침하였다.
8개의 상향 조절된 miRNA와 2개의 하향 조절된 miRNA를 포함한 상위 10개의 miRNA는 손상된 경동맥에서 5배 이상의 극적인 발현 변화를 보였다(도 1B). 이의 인간 관련성을 알아보기 위해, 합성 표현형을 보유하는 배양된 1차 인간 혈관평활근세포에서의 이들의 발현 수준을 확인한 결과, qPCR 분석을 통해 8개의 상향 조절된 miRNA 중 6개가 인간 평활근세포에서 두드러지게 발현되었음을 확인하였다(도 1C).
이와 같이, 설치류 모델을 사용한 miRNA 스크리닝을 통해 신생내막 증식과 관련된 일부 알려진 후보를 포함하는 miRNA의 하위 집합을 발견하였다.
실시예 2. 시험관 내 평활근세포 기능을 조절하는 상향 조절된 miRNA
평활근세포 생물학에서 상향 조절된 miRNA의 역할을 결정하기 위해 miRNA 억제제로 형질감염된 인간 혈관평활근세포를 사용하여 시험관 내에서 세 가지 유형의 세포 기반 분석을 수행하였다.
평활근세포 증식에 있어서, miR-132-3p와 miR-370-3p는 유의한 억제 효과를 나타내었고(도 2A), 염증 징후로서의, 인간 혈관평활근세포에 대한 단핵구 부착은 miR-130b-5p, miR-132-3p 및 miR-410-3p의 3개의 miRNA에 의해 현저히 억제 되었다. 이러한 세포 분석을 기반으로, 증식 관련 miRNA, 즉, miR-132-3p 및 miR-370-3p에 대한 심층 조사하였다. 두 miRNA 억제제 모두 G1 단계에서 세포 주기 정지를 유도하여 인간 혈관평활근세포의 시간 의존적 증식을 지속적으로 억제하였고(도 2B 및 2C), 이와 일관되게, 사이클린 의존성 키나제 억제제인 p21 및 p27의 수준은 두 miRNA 억제제에 의해 현저히 증가되었다(도 2D). 그러나, 이러한 miRNA 억제는 인간 혈관평활근세포에서 세포 사멸을 동반하지 않았으며, 이는 평활근세포 증식의 세포 증식 억제를 시사한다.
손상된 동맥 조직에서, 역분화에 의한 수축성 상태에서 합성 상태로의 평활근세포의 표현형 전이는 증식 의존적 신생내막 증식증(proliferation-dependent neointimal hyperplasia)에 선행되야 함에 따라, miR-132-3p와 miR-370-3p가 표현형 전이에 관여하는지 여부를 조사하였다.
생체 내 동맥 환경을 모방하는 가장 간단한 방법으로서, 라미닌으로 코팅된 플레이트의 높은 합류점에서 배양하여 인간 혈관평활근세포의 수축성 표현형을 유도하였다. 높은 합류점의 평활근세포가 낮은 합류점에서 리플레이팅(re-plated)되었을 때, 세포는 합성 표현형으로 점차적으로 변형되었다. 상기 실험예 6의 면역블랏 분석을 통해, miR132-3p 억제제의 형질감염이 낮은 합류점에 의해 사라진 SMA 수준을 회복시키는 것을 확인하였다(도 2E). 실제로, F-액틴 필라멘트의 면역형광 염색은 낮은 합류점에서 인간 혈관평활근세포의 합성 표현형이 miR-132-3p 억제제에 의해 수축성 표현형으로 변형되었음을 입증하였다(도 2F).
따라서, miR-132-3p와 miR-370-3p가 각각 표현형 전이와 증식 신호를 조절할 가능성이 있음을 확인하였다.
실시예 3. 생체 내 신생 내막 증식을 조절하는 상향조절된 miRNA
풍선 손상 모델을 통해 생체 내 miRNA의 효능을 평가하기 위해, 상기 실험예 12와 같이 제자리 교잡(in situ hybridization)을 통해 4개의 기능성 miRNA의 동맥 발현 수준을 조사하였다.
그 결과, 염색 이미지는 2개의 증식 관련 miRNA(miR-132-3p 및 miR-370-3p)의 발현이 샴 대조군에 비해 풍선 손상 경동맥에서 현저히 증가되었음을 보여주었고(도 3A), 다른 두 개의 염증 관련 miRNA(miR-130b-5p 및 miR-410-3p)도 풍선 손상에 의해 실질적으로 유도되었다. 풍선 손상을 입은 쥐 동맥에서 상기 4개의 miRNA의 생체 내 기능을 평가하였다.
miRNA 억제제의 카테터 매개 국소적 교내 전달은 대조군과 비교하여 풍선 손상 병변에서 신생내막 증식을 현저하게 감소시켰고(도 3B), EC 및 평활근세포 마커로서 폰 빌레브란트(vWF) 및 SMA에 대한 경동맥의 면역형광 염색은 miR-130b-5p 억제제가 소위 재내피화(re-endothelialization)라고 불리는 EC 단층의 회복을 촉진한다는 것을 보여주었으며(도 3C), miR-130b-5p는 평활근세포와 달리 EC에서 항증식 기능을 수행하였다.
이를 통해, 상기 4개의 miRNA가 혈관 내 염증 및 증식과 같은 동맥 항상성에서 뚜렷한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
실시예 4. 기능적 miRNA의 표적 유전자 확인
다음으로, 실시예 3에서 선택된 miRNA의 생물학적 결과를 파악하기 위해 mRNA 시퀀싱을 수행하고 풍선 손상된 쥐의 경동맥에서 차등적으로 발현된 유전자(DEGs)를 프로파일링하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 샴 대조군과 비교하여 손상 후 3일 및 5일에 3,699 DEGs가 유의적으로 변경되었음을 확인하였다(도 4a). 히트맵 분석은 상향 조절된 DEGs와 하향 조절된 DEGs가 각각 반반인 것으로 나타났다(도 4b). 이러한 DEGs를 사용하여 표적 예측 데이터베이스(TargetScan, miRDB 및 miRmap)를 통해 상기 선택된 miR-132-3p/miR-370-3p and miR-130b-5p/miR-410-3p에 대한 in silico 표적 프로파일링을 수행하였고, 하나 이상의 데이터베이스에서 쥐와 인간 모두에 대해 공통적으로 높은 예측 점수(TargetScan<-0.1, miRDB>70, miRmap>70)를 나타낸 DEGs가 각 miRNA의 예상 표적으로 선택되었다. 유전자 온톨로지(GO) enrichment analysis는 동족 miRNA(cognate miRNA)와 기능적으로 연관되는 표적 유전자 풀을 추가로 특정하였고, 이어서 실시간 PCR을 통해 선택된 유전자 중 샴 대조군에 비해 풍선 손상 경동맥에서 하향 조절된 유전자들을 확인하였다(도 4c). 인간 관련성을 위해, miRNA 억제제로 형질 감염된 인간 혈관평활근세포에서 상기 표적 유전자의 발현을 추가로 조사하였다.
그 결과, 실시간 PCR을 통해 각각의 miRNA에 대한 핵심 표적 유전자를 밝혀냈었고, SOCS2, BMP7, TSPAN2 및 SMAD6가 각각 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p에 대한 특이적 표적임을 확인하였다(도 4d).
실시예 5. 평활근세포 증식에 필수 MiR-370/BMP7 축
특히, 불안정형 협심증, 제2형 당뇨병 및 고지혈증 환자의 혈액에서 miR-370이 검출되었기 때문에[Hoekstra, 2010 #2635;Motawae, 2015 #2636;Gao, 2012 #2637], 평활근세포 증식에 있어서 miR-370/BMP(bone morphogenic protein)-7 축의 생물학적 중요성을 조사하기 위해, 인간 세포 및 동맥 조직에서 miR-370의 검출을 시도하였다.
제자리 교잡을 통해 동맥경화증 II형 및 IV형 병변이 있는 인간 환자의 관상 조직 절편에서 miR-370-3p의 높은 발현을 확인하였고(도 5a), 이는 miR-370이 죽상동맥경화증과 관련된 새로운 miRNA임을 확인하였다. 이후, 배양된 인간 혈관평활근세포에서 miR-370과 BMP7의 관계를 조사하였고, 실제로, 혈청 자극은 miR-370-3p의 발현을 유도하였지만, 반대로 BMP7의 발현을 감소시켰다(도 5b). 이와 일관되게, 인간 BMP7 유전자의 3-UTR 영역을 사용한 리포터 분석은 돌연변이 UTR이 아닌 야생형 UTR을 함유하는 루시퍼라제의 발현이 miR-370 모방체에 의해 확실히 감소되었음을 보여주었다(도 5d). 또한, 웨스턴 블롯 분석은 miR-370 억제가 인간 평활근세포의 BMP7 단백질의 수준을 증가시켰음을 분명히 보여주었다(도 5d).
이러한 결과는, BMP7 유전자가 인간 평활근세포에서 진정한 miR-370 표적임을 집합적으로 확인시켜준 것이다. 재조합 BMP7의 처리는 이전에 평활근세포 증식을 억제하는 것으로 보고되었기 때문에[Lagna, 2007 #2641;Dorai, 2000 #2640], 평활근세포 증식에서 miR-370/BMP7 축의 관여를 알아보았다. 직접적인 증거로서, BMP7 처리는 인간 혈관평활근세포에서 SMAD1/5/9 인산화를 현저하게 유도하였고(도 5E), 이는 평활근세포에서 BMP7의 항분열 효과를 시사하는 것이다. 또한, 세포 증식 분석은, BMP7 고갈이 miR-370 억제제에 의해 억제된 평활근세포 증식을 회복시킨다는 것을 입증하였고(도 5F), 따라서 miR-370 의존적 BMP7 발현조절은 평활근세포 성장과 손상된 동맥에서 발생하는 신생내막 증식의 전제 조건임을 확인하였다.
이를 종합하면, 본 발명의 miRNA 억제제, 구체적으로 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 및 miR-410-3p 각각의 억제제는 평활근세포에 대한 증식 억제 효과를 가지며, 이를 통해 평활근세포에서 상기 miRNA 억제제를 포함시킴으로써 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 예상할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. miRNA(microRNA) 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1에 있어서, 상기 miRNA는 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 miRNA 억제제는 손상 동맥에서 상향 발현된 miRNA를 억제함으로써 시험관내 혈관평활근세포 기능 및 생체내 신생 내막 증식을 조절하는 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 miRNA 억제제는 miRNA에 특이적인 siRNA, 압타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 혈관평활근세포 증식성 질환은 혈관협착증, 혈관재협착증, 죽상동맥경화증, 아테롬성동맥경화증, 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중 및 말초혈관협착증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것인, 약학 조성물.
  6. miRNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 키트는, 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트, qRT-PCR(quantitative real time PCR) 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 키트.
  9. 분리된 생물학적 시료에서 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    대조군에서 상기 miRNA의 발현 수준이 증가하면 혈관평활근세포 증식성 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환 진단의 정보 제공 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 정보 제공 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 생물학적 시료에서 miRNA 표적 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 감소하는지 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정보 제공 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 분리된 생물학적 시료는 동맥경화증 환자의 혈액 또는 관상 조직 절편인 것인, 정보 제공 방법.
  13. miRNA 발현 억제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 혈관평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 이를 필요로 하는 인간을 제외한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 혈관평활근세포 증식성 질환의 치료 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-132-3p, miR-370-3p, miR-130b-5p 또는 miR-410-3p으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 치료 방법.
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