CN109456957A

CN109456957A - 蛋白酶变体、液体洗涤剂组合物及其应用

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Publication number: CN109456957A
Application number: CN201811557501.4A
Authority: CN
Inventors: 安群; 王俊; 冯甲; 周雨叶; 孙飞野
Original assignee: Guangzhou Liby Enterprise Group Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Liby Enterprise Group Co Ltd
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109456957B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供一种蛋白酶变体、液体洗涤剂组合物及其应用。一种蛋白酶变体，其为亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶，所述蛋白酶变体至少包含以下氨基酸置换：G97D+A98R+S99N，其中所述位置对应于SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸位置。本发明还提供一种液体洗涤剂组合物及其应用。

Description

蛋白酶变体、液体洗涤剂组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白酶变体、液体洗涤剂组合物及其应用。

背景技术

在洗涤剂工业中，酶在洗涤剂配制品中已应用数十年。用于这些配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、甘露糖苷酶和其他酶或它们的混合物。目前商业上最为重要的酶是蛋白酶。

越来越多的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体。

已描述多种有用的蛋白酶和蛋白酶变体，其中很多已提供在不同洗涤剂中的改进活性、稳定性以及溶解度。

然而，仍然需要许多进一步改进的工业用途蛋白酶或蛋白酶变体。因为当前加酶的洗涤产品还无法完全解决温度和pH等洗涤条件会随时间而发生变化导致去污效果下降的问题，其结果是许多污渍在当前洗涤产品和洗涤条件下仍然难以完全去除。此外，液体洗涤剂中的特殊环境可致使酶失活，不利于加酶洗涤产品保持质量稳定，导致存储后的加酶洗涤产品在洗涤过程中洗涤性能损失。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种蛋白酶变体、液体洗涤剂组合物及其应用。

为解决上述技术问题，发明采用如下所述的技术方案。一种蛋白酶变体，其为亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶，

所述蛋白酶变体至少包含以下氨基酸置换：G97D+A98R+S99N，其中所述位置对应于SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸位置。

优选地，所述蛋白酶变体还包含置换L124M。

优选地，所述蛋白酶变体还包含选自以下的一种或多种改变：Q12K、S101R、A151G、N184G、A194P、N218S、N155*、A161R。

优选地，所述蛋白酶变体至少包括3个位点的置换。

优选地，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

优选地，所述蛋白酶变体与SEQ ID NO:3具有至少96.6％的序列同一性的氨基酸序列。

优选地，所述蛋白酶变体具有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。

一种液体洗涤剂组合物，包含上述的蛋白酶变体。

优选地，所述液体洗涤剂组合物还包含淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、角质酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶中的一种或多种。

一种液体洗涤剂组合物的应用，将上述的液体洗涤剂组合物用于衣物洗涤和/或餐具洗涤。

本发明的有益效果在于：

本发明所提供的蛋白酶变体与亲本枯草杆菌酶相比具有改良的稳定性或洗涤性能，因此更适用于液体洗涤剂，如衣物液体洗涤剂组合物和餐具洗涤组合物。

附图说明

图1为枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ ID：1)与枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID：2)及枯草杆菌酶变体(SEQ ID：3)的氨基酸序列的比对。

具体实施方式

为使本领域的普通技术人员更加清楚地理解发明的目的、技术方案和优点，以下结合附图和实施例对发明做进一步的阐述。

定义

液体洗涤剂为洗涤剂在环境温度(例如25℃)下为液体。

术语“改善的性质”指与本文所定义的蛋白酶变体相关的与亲本蛋白酶相比改善的特征。这样的改善的性质包括但不限于改善的洗涤性能、蛋白酶活性、改善的热稳定性、改善的pH活性特征、提高的pH稳定性、提高的稳定性、贮存条件下改善的稳定性和化学稳定性。

“改善的稳定性”或“提高的稳定性”在本文中定义为当在相同的条件下测试时，相对于包含亲本蛋白酶的组合物的稳定性，包含变体蛋白酶的洗涤剂组合物老化后蛋白酶活性的相对提高。蛋白酶稳定性通过比较在包含感兴趣的蛋白酶的液体洗涤剂组合物中于特定的温度下温育特定的时间段后测得的残余蛋白酶活性来确定。可使用如在实施例4所描述的测定来对蛋白酶稳定性进行测量。

术语“洗涤性能”用作洗涤剂在例如洗涤如洗衣过程中去除存在于待清洁的物品上的污渍的能力。洗衣洗涤性能可如实施例5中所示例的那样测量，即通过向纺织品施用(标准化的)污渍，并使纺织品进行洗涤程序和测量经纺织品的颜色的亮度。术语“改进的洗涤性能”在此被定义为根据本发明的蛋白酶变体相对于亲本蛋白酶的洗涤性能，若果在两种或更多种感兴趣的洗涤剂组合物之间没有显著或有意义的差异，则洗涤性能在本文中以“同等”表示。

术语“残留活性”或“残余活性”在此文中意指存储后，特别是在液体洗涤剂中存储后留下的或剩余的蛋白酶活性。在将蛋白酶添加至洗涤剂中之后，当测量残留活性时，在t₁测量该蛋白酶的活性。然后在存储一定量的时间之后，典型的数分钟或数周后，在t₂测量残留活性。

术语“蛋白酶”在本文中理解为具有蛋白酶活性的酶。术语“蛋白酶活性”意指能够通过蛋白酶降解蛋白为氨基酸，其为通过水解在多肽链中将氨基酸连接在一起形成蛋白的肽键而进行的蛋白分解代谢。

术语“野生型蛋白酶”意指由天然存在的野生型生物体如自然界中存在的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物表达的蛋白酶。野生型蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶309，即SEQ ID NO：2的氨基酸1至269。

术语“亲本”或“亲本蛋白酶”意指对其加以改变以产生本文定义的变体的蛋白酶，即用来描述对其进行突变来获得本文定义的蛋白酶变体的起始蛋白酶。

术语“成熟多肽”在本文中定义为具有蛋白酶变体活性的多肽，其为经翻译和任何翻译后修饰，如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化、自身催化活化等之后形成的最终形式多肽。

“蛋白酶变体”在本文中理解为与其亲本相比在一个或多个(几个)特定位置包含改变或修饰，如取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基的多肽。蛋白酶变体可通过在适于包含编码所述蛋白酶变体的基因的微生物表达所述基因的条件下培养所述微生物而获得。编码蛋白酶变体的基因可经过人为干预通过修饰编码野生型蛋白酶的基因序列而获得。

置换：对于氨基酸置换，使用如下命名法：原始氨基酸、位置、置换的氨基酸。相应地，在12位用赖氨酸取代谷氨酰胺命名为“Q123K”或“Asn123Lys”。多重突变可用加号(“+”)分开，例如，“Q123K+L234M”或“Asn123Lys+Leu234Met”，分别代表在123位及234位用赖氨酸(K)取代谷氨酰胺(Q)，及用甲硫氨酸(M)取代亮氨酸(L)。

缺失：对于氨基酸缺失，使用一下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，位置155处天冬酰胺的缺失命名为“Asn155*”或“N155*”。多个缺失可如上述对于取代那样用(“+”)分开。

插入：对于氨基酸插入，使用了如下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、新插入的氨基酸。例如，在195位甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“G195GK”。当插入多于一个氨基酸残基时，例如在G195之后插入Lys和Ala时，表示为：Gly195GlyLysAla或G195GKA。

在其中置换和插入发生在同一位置处的情况下，可表示为S99SD+S99A或简写为S99AD。

不同改变：当可在某个位置处引入不同的改变时，所述不同的改变由逗号分开，例如，“Asn184Asp,Gly,Ser”表示位置184处的天冬酰胺被天冬氨酸或甘氨酸或丝氨酸置换。或者，不同的改变或任选的置换可在括号中指示，例如，Asn184[Asp,Gly,Ser]或Asn184{Asp,Gly,Ser}或者简写为N184[D,G,S]或N184{D,G,S}。

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS：The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite),赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)的尼德尔(Needle)程序。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(EBLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且如下计算的：

(一致的残基*100)/(比对长度-比对中的空位总数)

术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖用于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

术语“磺酸盐”意指“磺酸”同金属离子结合形成的化合物，常见为磺酸钠、磺酸钙、磺酸镁和磺酸钡等，“磺酸”是磺基和烃基相连形成的一类有机化合物物。通式为R-SO₃H其中，R表示烃基。

术语“硫酸酯盐”是指一类阴离子官能团为硫酸根的化合物，可以作为表面活性剂，包括烷基硫酸盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐、甘油脂肪酸酯硫酸盐、硫酸化蓖麻酸钠、环烷硫酸钠、脂肪酰胺烷基硫酸钠等。

术语“非离子型表面活性剂”是指在水溶液中不电离一类表面活性剂，其亲水基团主要是由一定数量的含氧基团，一般为醚基和羟基构成。包括烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪酸甲酯乙氧基化物、聚丙二醇环氧乙烷加成物、烷基糖苷等。

术语“阴离子型表面活性剂”是指在水中电离后起表面活性作用的部分带负电荷的表面活性剂，主要包括羧酸盐、磺酸盐、硫酸酯盐和磷酸盐等。

术语“阳离子型表面活性剂”是指在水中电离后起表面活性剂作用的部分带正点的表面活性剂，主要包括胺盐型、季铵盐型、杂环型和啰盐型。

本发明涉及蛋白酶变体，其包含具有与SEQ ID NO：2具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白酶，其中所述蛋白酶是包含置换G97D+A98R+S99N的枯草杆菌酶变体。

优选的，所述蛋白酶与SEQ ID NO:3具有至少96.6％、97.0％、97.4％、97.8％、98.1％、98.5％、98.9％、99.3％、99.6％或100％的序列的同一性。因此，所述蛋白酶具有与SEQ ID NO：3的少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸改变的氨基酸序列。所述氨基酸改变是不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸置换或删除，通常为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸的置换或删除；

保守置换的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组中。如由H.Neurath和R.L.Hill在1979,In,The Proteins,AcademicPress,New York中有述，通常不改变特定活性的氨基酸置换。常见的置换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、35Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。或者，所述氨基酸改变具有使得多肽的物理化学性质改变的性质。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

多肽中的关键氨基酸可根据本领域已知的程序如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定。在后一技术中，在分子中的每一残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得突变分子的蛋白酶活性以鉴定对分子的活性至关重要的氨基酸残基。另见Hilton et al.,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过结构的物理分析来确定，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记的技术结合推定的接触位点氨基酸的突变而确定。参见例如deVos et al.,1992,Science 255:306-312；Smith et al,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver et al.,1992,FEBS Lett.309:59-64。对于BPN’(SEQ ID NO:1)，包含氨基酸S221、H64和D32的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。优选地，如本文所定义的蛋白酶变体包含这些必需氨基酸并且没有这些氨基酸的置换。

优选地，本发明的蛋白酶具有与SEQ ID NO:3具有至少96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，包含置换G97D+A98R+S99N(对应于SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸位置的位置)，并优选还包含选自以下的一个或多个改变：S3T、R10F、V11I、Q12K、A13T、P14Q、A15Q、L21I、T22F、S24N、V26A、K27R、S36A、T38S、N43R、R45A、V51I、P52S、G53S、T58Y、Q59H、G61N、E89D、S101R、V104L、S105A、I107V、L111I、G115I、G118N、V121I、A122I、L124M、P129T、P131G、A133S、Q137L、S141R、T143N、S144N、R145A、V147I、V149L、A151G、S153A、N155*、S159T、A161R、G162Q、S163G、I165V、S166N、A172S、N173G、A174V、G178A、T180V、N184G、N185Q、Q191T、A194P、G195E、L196I、D197E、V199S、P210T、S212N、T213R、N218S、Q236S、K237R、N238Y、W241Y、S242T、V244N、N248Q、H249R、L250I、K251N、N252Q、S256Y、S265N、N269H、E271G、A272R和R275Q，或更优选地，至少一个或多个氨基酸置换，其选自：Q12K、S101R、L124M、A151G、N155*、A161R、N184G、A194P、N218S，其中所述位置对应于SEQID NO:1的多肽的氨基酸位置。更优选地，本发明的适用于液体洗涤剂组合物中的蛋白酶具有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。

优选地，本发明的液体洗涤剂用蛋白酶为源自迟缓芽胞杆菌的枯草杆菌酶的变体，更优选是与SEQ ID NO:2具有至少95％、96％、97％、98％、99％或至少100％序列同一性并包含置换G97D+A98R+S99N的蛋白酶为具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶309的变体。换句话说，优选地，本发明的适用于液体洗涤剂的蛋白酶变体是包含与SEQ IDNO:2具有至少95％序列同一性的枯草杆菌蛋白酶309变体，所述变体至少包含以下氨基酸置换：G97D+A98R+S99N，其中所述位置对应于SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸位置。

最优选地，所述蛋白酶包含置换G97D+A98R+S99N并还包含选自以下的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或全部氨基酸置换：S3T、R10F、V11I、Q12K、A13T、P14Q、A15Q、L21I、T22F、S24N、V26A、K27R、S36A、T38S、N43R、R45A、V51I、P52S、G53S、T58Y、Q59H、G61N、E89D、S101R、V104L、S105A、I107V、L111I、G115I、G118N、V121I、A122I、L124M、P129T、P131G、A133S、Q137L、S141R、T143N、S144N、R145A、V147I、V149L、A151G、S153A、N155*、S159T、A161R、G162Q、S163G、I165V、S166N、A172S、N173G、A174V、G178A、T180V、N184G、N185Q、Q191T、A194P、G195E、L196I、D197E、V199S、P210T、S212N、T213R、N218S、Q236S、K237R、N238Y、W241Y、S242T、V244N、N248Q、H249R、L250I、K251N、N252Q、S256Y、S265N、N269H、E271G、A272R和R275Q，或更优选地，选自Q12K、S101R、L124M、A151G、N155*、A161R、N184G、A194P、N218S，其中所述位置对应于SEQ ID NO:1的多肽的氨基酸位置。

本发明的用于液体洗涤剂内包含的蛋白酶可使用本领域技术人员已知的合适方法制备，优选使用常见的靶向基因突变技术和表达系统。

优选地，包含本发明的蛋白酶变体的液体洗涤剂可以为衣物去污剂、漂白去污剂、餐具洗涤剂。优选用作洗衣去污剂。所述洗涤剂组合物可以是表1中的提供的模式洗涤剂，也可是商品化的液体洗涤剂，如汰渍、碧浪、奥妙、超能、立白、妈妈壹选、威露士或任何其他品牌外延及洗涤剂浓缩形式。

若所使用的商品洗涤剂包含酶，则使用前于沸水浴孵育10min灭活酶。

表1模式液体洗涤剂制剂(总组合物的重量/重量％)

本发明者已发现，在多种液体洗涤剂组合物背景条件下，与不同之处仅在于枯草杆菌酶变体已由相等重量/重量％的其亲本代替的洗涤剂制剂的蛋白酶稳定性相比，在液体洗涤剂组合物背景中的老化过程中蛋白酶稳定性意外提高。

相同的条件下(如实施例4中所述)，优选使用表2所示的洗涤制剂测试时，与不同之处仅在于蛋白酶变体已由相等含量的其亲本代替的洗涤剂组合物的蛋白酶稳定性相比，于包含如本文所述的蛋白酶变体的洗涤剂组合物，发现在37℃下老化4周后约87％的残余蛋白酶活性，在45℃下老化4周后约35％的残余酶活性，相比之下，包含亲本蛋白酶而不是所述变体的比较性制剂在37℃老化4周后残余活性为约68％，在45℃下老化4周后残余活性已降至10％以下。蛋白酶变体与其亲本相比稳定性的提高在37℃及45℃下贮存1周后均已明显。

当在相同的条件下，优选使用表2所示的洗涤剂制剂并于37℃或45℃下老化1周测试时，与不同之处仅在于所述蛋白酶已由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白酶代替的相同洗涤剂相比，包含与SEQ ID NO:3具有至少96％的同一性但与其不同的蛋白酶的液体洗涤剂组合物在老化过程中显示出至少73％、82％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的蛋白酶稳定性。并且当在相同的条件下，优选使用表2所示的洗涤剂制剂并于37℃和45℃下老化1周测试时，与不同之处仅在于所述蛋白酶已由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白酶代替的洗涤剂组合物相比，还在老化过程中显示出提升或同等的洗涤性能。

如本文实施例中所详述的(实施例5)，与包含亲本蛋白酶的表2所示液体洗涤剂组合物相比，包含蛋白酶变体的液体洗涤剂组合物在37℃及45℃下老化去除蛋白性污渍均有明显提升的性能。

实施例

实施例1：蛋白酶变体的构建和表达

本发明的变体可通过本领域技术人员已知的方法构建和表达。下面是一个如何制备本发明的变体的可能实例：

定向突变：

本发明的蛋白酶变体制备所有DNA操作均通过PCR进行，用含有所需突变的寡聚物的PCR产生的DNA片段的传统克隆(例如，Sambrook et al.；Molecular Cloning；ColdSpring Harbor Laboratory Press)来制备。使用编码蛋白酶变体的重组枯草杆菌来表达蛋白酶变体。经接种合适培养基(例如，20g/L葡萄糖、30g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母粉)培养。培养通常在30℃、250rpm震荡培养下进行3天。

实施例2：蛋白酶变体的纯化

发酵完成后，将培养液在14000g、4℃条件下离心20分钟，回收离心上清液。将回收上清液通过0.22μm过滤装置过滤以去除剩余芽孢杆菌宿主细胞。用3M Tris碱溶液调节0.22μm过滤液的pH至pH 8.0待过柱纯化。配制20mM Tris/HCl、1mM CaCl₂、pH8.0平衡缓冲溶液，并用该溶液平衡MEPHypercel柱(Pall Corporation)。在用平衡缓冲液洗涤柱后，进样上述pH经调节的0.22μm过滤液，用20mM CH₃COOH/NaOH、1mM CaCl₂、pH4.5溶液对柱逐步洗脱。使用Suc-AAPF-pNA测定法于pH9.0下测定分析来自柱的级分的蛋白酶活性，并合并峰级分。用20％(体积/体积)的CH₃COOH或3M Tris碱溶液调节来自MEP Hypercel柱的合并峰级分的pH至pH6.0，并用去离子水稀释该pH调节的合并物至与20mM MES/NaOH、2mM CaCl₂、pH6.0溶液相同的电导率。将经稀释的合并物施加到在经20mM MES/NaOH、2mM CaCl₂、pH6.0平衡缓冲液平衡的Fast Flow柱(GE Healthcare)中。在用平衡缓冲液洗涤柱后，用线性NaCl梯度(0→0.5M)相同缓冲液洗脱蛋白酶变体，至少五个柱体积进行洗脱。使用Suc-AAPF-pNA测定法于pH9.0下分析来自柱的级分的蛋白酶活性并通过SDS-PAGE将活性级分进行分析。将在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅观察到一个条带的级分合并，此即为纯化的枯草杆菌蛋白酶制剂并用于另外的实验。

实施例3：蛋白酶活性的检测

通过采用Suc-AAPF-pNA作为底物的方法测定蛋白水解活性。Suc-AAPF-pNA是N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且是可被内切蛋白酶裂解的封闭肽。裂解后释放游离的PNA分子，该分子呈现黄色并可通过可见风光光度法在波长405nm处检测。Suc-AAPF-PNA底物由Bachem(目录号L1400，溶解于DMSO中)制造。将待分析的蛋白酶样品在活性缓冲液(100mM Tris,10mM CaCl₂,0.005％TritonX-100,pH8.6)中稀释。通过向96孔微量滴定板转移180μl经稀释的酶样品并加入20μl底物工作溶液(1mg/ml，在100mM Tris pH8.6中)进行测定。将溶液于室温下混合，并在OD 405nm处测定吸收值，每10秒测定一次，测定40次。时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟吸光度)与所讨论蛋白酶在给定条件集下的活性成正比。将蛋白酶样品稀释至斜率为线性的水平。

实施例4：在包含由SEQ ID NO:3表示的枯草杆菌酶变体与亲本蛋白酶的不同液体洗涤剂制剂中于37℃和45℃贮存中的稳定性比较。

液体洗涤剂配方制备见下表所示

表2液体洗涤剂配方

物料名称	含量/％
		脂肪醇聚氧乙烯醚	11
脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠	5
		磷酸盐	1
氯化钙	0.01
		丙二醇	2
柠檬酸钠	2
		防腐剂	0.01
颜料	0.001
		香精	0.3
蛋白酶	0.3
		水	补至100

测试方法：将添加亲本蛋白酶及由SEQ ID NO:3表示的蛋白酶变体的不同的液体洗涤剂分别置于37℃和45℃条件下贮存1、2、4和8周后，按照上述酶活性测试方法，取180μl反应液于波长405nm处分别测量OD₄₀₅值，分别以对应蛋白酶的初始值作为100％，计算相对酶活性，衡量不同蛋白酶在液体洗涤中的稳定性。

37℃时的测试结果见下表：

45℃时的测试结果见下表：

实施例5：在包含由SEQ ID NO:3表示的枯草杆菌酶变体与亲本蛋白酶的不同液体洗涤剂制剂中于37℃和45℃贮存中的洗涤性能比较。

洗涤性能评价

去污力评价

为了比较含蛋白酶变体及亲本蛋白酶变体洗衣液的洗涤性能，进行去污力测试。将添加亲本蛋白酶及由SEQ ID NO:3表示的蛋白酶变体的不同的液体洗涤剂分别置于37℃和45℃条件下贮存1、2、4和8周后，进行去污力测试。采用国标蛋白JB-02污布。液体洗涤剂按表2所示制备。

实验条件：采用250ppm硬水、洗涤浓度为3g/L、洗涤时间20min、温度为30℃、采用国标规定的RQHL型立式去污机、转速为60转。

37℃时的测试结果见下表：

从上面的数据可以看出，与含亲本蛋白酶液体洗涤剂相比，含SEQ ID NO：3所示蛋白酶变体洗涤剂在国标蛋白去污力的表现有明显的提升。

45℃时的测试结果见下表：

从上面的数据可以看出，与含亲本蛋白酶液体洗涤剂相比，含SEQ ID NO：3所示蛋白酶变体洗涤剂在国标蛋白去污力的表现保持其性能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何为背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州立白企业集团有限公司

<120> 蛋白酶变体、液体洗涤剂组合物及其应用

<130> JY181-2803933

<141> 2018-12-19

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Glu Glu Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gln Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gln Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Xaa Met Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Pro His Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 3

<211> 268

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 3

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Lys Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Arg

85 90 95

Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Gly Ala Ser Gly Ser Gly Arg Gly Ser Ile Ser Tyr

145 150 155 160

Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Ile Val

180 185 190

Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala

195 200 205

Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala

210 215 220

Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg

225 230 235 240

Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr

245 250 255

Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

Claims

1.一种蛋白酶变体，其为亲本蛋白酶的变体，其特征在于：所述亲本蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶，

所述蛋白酶变体至少包含以下氨基酸置换：G97D+A98R+S99N，其中所述位置对应于SEQID NO:1的多肽的氨基酸位置。

2.如权利要求1所述的蛋白酶变体，其特征在于：所述蛋白酶变体还包含置换L124M。

3.如权利要求1所述的蛋白酶变体，其特征在于：所述蛋白酶变体还包含选自以下的一种或多种改变：Q12K、S101R、A151G、N184G、A194P、N218S、N155*、A161R。

4.如权利要求3所述的蛋白酶变体，其特征在于：所述蛋白酶变体至少包括3个位点的置换。

5.如权利要求1-4任一项所述的蛋白酶变体，其特征在于：所述亲本蛋白酶与SEQ IDNO：2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

6.如权利要求1-4任一项所述的蛋白酶变体，其特征在于：所述蛋白酶变体与SEQ IDNO:3具有至少96.6％的序列同一性的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的蛋白酶变体，其特征在于：所述蛋白酶变体具有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。

8.一种液体洗涤剂组合物，其特征在于：包含如权利要求1所述的蛋白酶变体。

9.如权利要求8所述的液体洗涤剂组合物，其特征在于：还包含淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、角质酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶中的一种或多种。

10.一种液体洗涤剂组合物的应用，其特征在于：将权利要求8所述的液体洗涤剂组合物用于衣物洗涤和/或餐具洗涤。