CN112011534A - 一种基于纳米磁珠的唾液基因组dna提取纯化方法及试剂盒 - Google Patents

一种基于纳米磁珠的唾液基因组dna提取纯化方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，包括以下步骤1)唾液样本采集；2)唾液样本裂解；3)DNA与纳米磁珠结合；4)纳米磁珠‑DNA复合物洗涤；5)纳米磁珠‑DNA复合物洗脱；采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化；以实现快速、高通量、自动化的提取纯化唾液基因组DNA。提供了无创、非入侵的唾液样本采集方法，减少患者采血带来的疼痛和感染风险；样本采集便利，可由患者自行采集；采集后的唾液样本可常温运输，减少冷链运输产生的成本。

Description

一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及DNA提取纯化技术领域，具体涉及一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒。
背景技术
DNA是大部分生物体的遗传物质。DNA的提取纯化是分子生物学研究的基础，对DNA纯度、完整性要求高，其方法尤为重要。目前，提取DNA的方法主要有传统的酚/氯仿有机液相抽提法和非传统的螯合树脂法、玻璃粉吸附法、硅胶膜吸附柱法。
目前，人类基因组DNA样品的采集通常需要采集血液提取纯化获得，或者刮取口腔黏膜细胞提取纯化。
采取传统的酚/氯仿有机液相抽提法或硅胶膜吸附柱法由于操作繁琐、费时，需要使用离心机等大型仪器；有毒有机溶剂会对人体造成伤害或提取的DNA浓度、纯度低；单位时间通量低，难以实现自动化。
血液样品采集需要采血设备和医务人员完成，采血疼痛会造成排斥拒绝采样，侵入性采集易增加感染风险，血液样品必须低温运输保存等缺点，而刮取口腔口腔黏膜细胞收集到DNA的数量会有很大差异。
因此，亟待一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒的出现，以实现快速、高通量、自动化的提取纯化唾液基因组DNA。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化。提供了无创、非入侵的唾液样本采集方法，减少患者采血带来的疼痛和感染风险；样本采集便利，可由患者自行采集；采集后的唾液样本可常温运输，减少冷链运输产生的成本。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，以实现快速、高通量、自动化的提取纯化唾液基因组DNA。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化。提供了无创、非入侵的唾液样本采集方法，减少患者采血带来的疼痛和感染风险；样本采集便利，可由患者自行采集；采集后的唾液样本可常温运输，减少冷链运输产生的成本。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，包括以下步骤：
1)唾液样本采集；
2)唾液样本裂解；
3)DNA与纳米磁珠结合；
4)纳米磁珠-DNA复合物洗涤；
5)纳米磁珠-DNA复合物洗脱。
本发明提供的一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，以实现快速、高通量、自动化的提取纯化唾液基因组DNA。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化。提供了无创、非入侵的唾液样本采集方法，减少患者采血带来的疼痛和感染风险；样本采集便利，可由患者自行采集；采集后的唾液样本可常温运输，减少冷链运输产生的成本。
在上述技术方案的基础上，还可做如下改进：
作为优选的方案，步骤1)唾液样本采集步骤包括：采液前30min内用清水漱口2～3次，此后不可进食；用手轻柔两腮1～2min后，收集2mL唾液到唾液采集器中，拉动唾液采集器外露的封膜条带，使DNA稳定液流入收集管内，DNA稳定液与唾液混合并拧紧收集管盖，上下颠倒混匀10-15次，得到唾液样本。
使用特定唾液采集器(备案号：苏苏械备20170447号)采集唾液样本，DNA稳定液与唾液混合后可于室温下长期保存，唾液样本DNA不受破坏。
作为优选的方案，步骤2)的唾液样本裂解步骤包括：100-400μL唾液样本中，加入20～100μL蛋白酶K溶液和裂解液，混合均匀后于40～70℃温浴5～30min得到裂解后的样品。
作为优选的方案，裂解液包括：2～10M GuHCl、0.001～0.01M柠檬酸钠、1～10％吐温-20、0.05-0.5M乙酸钾和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。
作为优选的方案，步骤3)的DNA与纳米磁珠结合步骤包括：在裂解后的样品中依次加入200～800μL异丙醇、0.3～5mg纳米磁珠，混合均匀后，于室温静至结合，形成纳米磁珠-DNA复合物，将混合溶液磁性分离，弃去上清液。
作为优选的方案，所述纳米磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，直径为100～1000nm。
作为优选的方案，步骤4)的纳米磁珠-DNA复合物洗涤步骤包括：向纳米磁珠-DNA复合物中加入0.2～2mL第一洗涤液，充分混匀后，磁性分离弃去上清液，重复洗涤一次；再向纳米磁珠-DNA复合物中加入0.2～2mL第二洗涤液，磁性分离弃去上清液，去除复合物上的蛋白质及其他杂质。
作为优选的方案，所述第一洗涤液包括：0.1～1M NaCl、0.01～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.05～0.5％吐温-20；所述第二洗涤液为0.01～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。
作为优选的方案，步骤5)的纳米磁珠-DNA复合物洗脱步骤包括：将洗涤后的纳米磁珠-DNA复合物表面干燥后，加入洗脱液使DNA从纳米磁珠上洗脱下来，在磁场作用下收集上清，上清即为纯化的唾液基因组DNA。
作为优选的方案，洗脱液包括：0.01-0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。
本发明可满足大量唾液样本中提取高纯度的基因组DNA，用于后续检验；提取操作方便、快捷，不需使用大型仪器，可配合Thermo Scientific King Fish 96、杭州奥盛仪器有限公司Auto-Pure 32A核酸自动提取仪自动提取DNA，可大量、快速、有效地提取唾液液中的基因组DNA。
附图说明
图1为本发明实施例提供的试剂盒能够提取电泳条带明亮的DNA图片。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。
下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
为了达到本发明的目的，本发明提供一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，包括以下步骤：
1)唾液样本采集；
2)唾液样本裂解；
3)DNA与纳米磁珠结合；
4)纳米磁珠-DNA复合物洗涤；
5)纳米磁珠-DNA复合物洗脱。
在上述技术方案的基础上，还可做如下改进：
在一些实施例中，步骤1)唾液样本采集步骤包括：采液前30min内用清水漱口2～3次，此后不可进食；用手轻柔两腮1～2min后，收集2mL唾液到唾液采集器中，拉动唾液采集器外露的封膜条带，使DNA稳定液流入收集管内，DNA稳定液与唾液混合并拧紧收集管盖，上下颠倒混匀10-15次，得到唾液样本。
使用特定唾液采集器(备案号：苏苏械备20170447号)采集唾液样本，DNA稳定液与唾液混匀后可于室温下长期保存，唾液样本DNA不受破坏。
在一些实施例中，步骤2)的唾液样本裂解步骤包括：100-400μL唾液样本中，加入20～100μL蛋白酶K溶液和裂解液，混合均匀后于40～70℃温浴5～30min得到裂解后的样品。
在一些实施例中，裂解液包括：2～10M GuHCl、0.001～0.01M柠檬酸钠、1～10％吐温-20、0.05-0.5M乙酸钾和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。
在一些实施例中，步骤3)的DNA与纳米磁珠结合步骤包括：在裂解后的样品中依次加入200～800μL异丙醇、0.3～5mg纳米磁珠，混合均匀后，于室温静至结合，形成纳米磁珠-DNA复合物，将混合溶液磁性分离，弃去上清液。
所述室温为23℃±2℃、25℃±5℃或20℃±5℃中的任一温度。
在一些实施例中，所述纳米磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，直径为100～1000nm。
在一些实施例中，步骤4)的纳米磁珠-DNA复合物洗涤步骤包括：向纳米磁珠-DNA复合物中加入0.2～2mL第一洗涤液，充分混匀后，磁性分离弃去上清液，重复洗涤一次；再向纳米磁珠-DNA复合物中加入0.2～2mL第二洗涤液，磁性分离弃去上清液，去除复合物上的蛋白质及其他杂质。
在一些实施例中，所述第一洗涤液包括：0.1～1M NaCl、0.01～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.05～0.5％吐温-20；所述第二洗涤液为0.01～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。
在一些实施例中，步骤5)的纳米磁珠-DNA复合物洗脱步骤包括：将洗涤后的纳米磁珠-DNA复合物表面干燥后，加入洗脱液使DNA从纳米磁珠上洗脱下来，在磁场作用下收集上清，上清即为纯化的唾液基因组DNA。
在一些实施例中，洗脱液包括：0.01-0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。
实施例1
(1)取200μL的人唾液样本至于1.5mL离心管中，加入20μL的Proteinase(蛋白酶)K、200μL的裂解液涡旋混合均匀后于40～70℃温浴5～30min。再向离心管中加入350μL异丙醇、50μL纳米磁珠(10mg/mL)，漩涡震荡3min混匀后静置2min，磁吸分离直至上清澄清，弃上清液，反应过程中避免接触磁珠；
(2)继续向上述离心管中加入800μL第一洗涤液，涡旋震荡2min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，弃上清液；
(3)重复步骤(2)一次；
(4)再向上述离心管中加入800μL第二洗涤液，涡旋震荡2min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，弃上清液；保持离心管于磁性分离器上，于室温下静置10min后，取下离心管；
(5)向上述离心管中加入100μL洗脱液，漩涡震荡1min使磁珠充分重悬，于50-80℃加热5-20min后，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的离心管中，此即为纯化得到的唾液DNA，可保存于-20℃温度下。
提取完成后，测定洗脱液中的DNA含量和纯度，使用本发明的试剂盒能够提取纯度高、含量高、电泳条带明亮的DNA。结果见表1、附图1。
表1测定洗脱液中的DNA含量和纯度
Figure BDA0002078956400000071
实施例2
本发明试剂盒可配合核酸自动化提取仪，快速高通量的提取唾液样本中的基因组DNA，如使用杭州奥盛仪器有限公司Auto-Pure 32A核酸自动提取仪，使用时孔位添加试剂说明如下：
第一孔：唾液样本200μL、裂解液200μL、蛋白酶K 20μL、异丙醇350μL；
第二孔：第一洗涤液的体积800μL、纳米磁珠50μL(10mg/mL)；
第三孔：第一洗涤液的体积800μL；
第四孔：第二洗涤液的体积800μL；
第六孔：洗脱液110μL。
表2程序设置
Figure BDA0002078956400000072
Figure BDA0002078956400000081
本发明技术关键点包括：
(1)唾液样本的采集与保存方法；
(2)提取试剂的优化；
(3)提取纯化自动化仪器程序的开发。
本发明提供的一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，产生如下的有益效果：
1)本发明通过优化试剂和试剂配比，采用高浓度盐酸胍裂解液，不需分部裂解唾液样本，不需离心机等大型仪器，能够从200μL唾液样本中提取纯化纯度高(OD260/OD280：1.70～1.90)、含量高(70μg/mL唾液样本)、电泳条带明亮的DNA。
2)本发明试剂盒可配合自动化使用，提取32个唾液样本只需30min左右；纳米磁珠预先直接放置洗涤液中，减少相应操作步骤，提高单位时间DNA提取通量。
3)本发明以实现快速、高通量、自动化的提取纯化唾液基因组DNA。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化。提供了无创、非入侵的唾液样本采集方法，减少患者采血带来的疼痛和感染风险；样本采集便利，可由患者自行采集；采集后的唾液样本可常温运输，减少冷链运输产生的成本。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
1)唾液样本采集；
2)唾液样本裂解；
3)DNA与纳米磁珠结合；
4)纳米磁珠-DNA复合物洗涤；
5)纳米磁珠-DNA复合物洗脱。
2.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，步骤1)唾液样本采集步骤包括：采液前30min内用清水漱口2～3次，此后不可进食；用手轻柔两腮1～2min后，收集2mL唾液到唾液采集器中，拉动唾液采集器外露的封膜条带，使DNA稳定液流入收集管内，DNA稳定液与唾液混合并拧紧收集管盖，上下颠倒混匀10-15次，得到唾液样本。
3.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，其特征在于，步骤2)的唾液样本裂解步骤包括：100-400μL唾液样本中，加入20～100μL蛋白酶K溶液和裂解液，混合均匀后于40～70℃温浴5～30min得到裂解后的样品。
4.根据权利要求3所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，裂解液包括：2～10M GuHCl、0.001～0.01M柠檬酸钠、1～10％吐温-20、0.05-0.5M乙酸钾和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。
5.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，步骤3)的DNA与纳米磁珠结合步骤包括：在裂解后的样品中依次加入200～800μL异丙醇、0.3～5mg纳米磁珠，混合均匀后，于室温静至结合，形成纳米磁珠-DNA复合物，将混合溶液磁性分离，弃去上清液。
6.根据权利要求5所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，所述纳米磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，直径为100～1000nm。
7.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，步骤4)的纳米磁珠-DNA复合物洗涤步骤包括：向纳米磁珠-DNA复合物中加入0.2～2mL第一洗涤液，充分混匀后，磁性分离弃去上清液，重复洗涤一次；再向纳米磁珠-DNA复合物中加入0.2～2mL第二洗涤液，磁性分离弃去上清液，去除复合物上的蛋白质及其他杂质。
8.根据权利要求7所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，所述第一洗涤液包括：0.1～1M NaCl、0.01～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.05～0.5％吐温-20；所述第二洗涤液为0.01～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。
9.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，步骤5)的纳米磁珠-DNA复合物洗脱步骤包括：将洗涤后的纳米磁珠-DNA复合物表面干燥后，加入洗脱液使DNA从纳米磁珠上洗脱下来，在磁场作用下收集上清，上清即为纯化的唾液基因组DNA。
10.根据权利要求9所述的基于纳米磁珠的唾液基因组DNA提取纯化方法及试剂盒，其特征在于，洗脱液包括：0.01-0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。
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