CN110088626B - 用于分离生物分子的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

提供了一种分离系统、一种在分离系统中的方法和一种待提供在分离系统中的洗脱装置，用于从细胞培养物分离生物分子。所述方法包括以下步骤：‑将来自包含所述生物分子的细胞培养物(3;103;203)的进料提供给磁力分离器(5;105;205)并向所述磁力分离器提供包含能够结合该生物分子的配体的磁珠；‑通过所述磁力分离器将所述具有结合的生物分子的磁珠与其余的进料分离；‑将所述磁珠以具有添加的缓冲液的浆料形式运送至洗脱池(7;107;207)；‑在所述洗脱池中洗脱所述结合的生物分子。

Description

用于分离生物分子的方法和系统
发明技术领域
本发明涉及一种分离系统和一种在分离系统中的方法，用于从细胞培养物分离生物分子。
相关技术
传统上，通过首先澄清细胞培养物，即去除细胞、其他生物分子和不同的其余产物，来从细胞培养物分离所需的生物分子。澄清通常包括例如超速离心、深度过滤和无菌过滤。在澄清步骤之后，需要进一步纯化，例如通过色谱法。在很多方面，这是复杂、耗时且昂贵的过程。
概述
本发明的一个目的在于提供一种从细胞培养物分离生物分子的改进方法和系统。
这在根据独立权利要求的方法、系统和洗脱装置中实现。
在本发明的一个方面，提供了一种在分离系统中从细胞培养物分离生物分子的方法。所述方法包括以下步骤：
- 将来自包含所述生物分子的细胞培养物的进料提供给磁力分离器并向磁力分离器提供包含能够结合该生物分子的配体的磁珠；
- 通过磁力分离器将所述具有结合的生物分子的磁珠与其余的进料分离；
- 将所述磁珠以具有添加的缓冲液的浆料形式运送至洗脱池；
- 在洗脱池中洗脱所述结合的生物分子。
在本发明的另一个方面，提供了一种从细胞培养物分离生物分子的分离系统。所述系统包含：
- 磁力分离器，其包括用于接收来自包含所述生物分子的细胞培养物的进料和用于接收包含能够结合该生物分子的配体的磁珠的入口，所述磁力分离器配置为将所述具有所述结合的生物分子的磁珠与其余的进料分离；和
- 包含洗脱池的洗脱装置，所述洗脱池包括与来自磁力分离器的出口连接的洗脱池入口，用于接收以与缓冲液的浆料来自磁力分离器的所述分离的磁珠，其中所述洗脱装置配置为从磁珠洗脱生物分子。
在本发明的再另一个方面，提供了一种配置为连接在如上所述的分离系统中的洗脱装置。所述洗脱装置包括洗脱池，所述洗脱池包括配置为连接于磁力分离器的出口的洗脱池入口以接收以具有缓冲液的浆料形式的来自磁力分离器的磁珠，其中所述洗脱装置配置为从磁珠洗脱生物分子。
由此实现了用于分离生物分子的更有效的方法和系统。分离过程比传统的分离过程容易得多、快得多且便宜得多。当在磁力分离器中将细胞和固体污染物与磁珠分离时，珠粒被转移到具有低死体积的单独的洗脱装置以促进目标生物分子的高浓度和低洗脱体积。包括洗脱装置的系统及磁珠的易于运输和捕获将增加系统的有效性，因为可以并行地运行两个或更多个分离过程。
可以使用封闭的无菌系统，并且两个或三个分离过程可在系统中并行地运行。磁珠可重复用于下一个分离循环。洗脱可在比磁力分离器中小的体积中进行，这将改善有效性。与传统色谱法相比，批量吸收生物分子将使目标物更均匀地吸收到珠粒上。在传统色谱法中，柱子入口处的目标物浓度高，故可能发生目标物聚集体的形成。如果目标物均匀地分布在树脂床上，则在洗脱时聚集和沉淀的风险将较低。
在本发明的一个实施方案中，磁珠从洗脱池被运送以在磁力分离器中重复使用。
在本发明的一个实施方案中，在前一份在洗脱池中的同时向磁力分离器中提供新的一份来自细胞培养物的进料和磁珠，由此至少两份磁珠在分离系统中循环。由此实现了有效的过程。
其他实施方案在从属权利要求中描述。
附图简述
图1a示意性地示出了根据本发明的一个实施方案的分离系统。
图1b示意性地示出了根据本发明的另一个实施方案的分离系统。
图1c示意性地示出了根据本发明的另一个实施方案的分离系统。
图2a-2h示意性地示出了根据本发明的不同实施方案的洗脱池。
图3a为在图1a中示出的系统中分离生物分子的方法的流程图。
图3b为在图1b中示出的系统中分离生物分子的方法的流程图。
图3c为在图1c中示出的系统中分离生物分子的方法的流程图。
图4、4a-4i示意性地示出了根据本发明的一个实施方案的分离系统。
图5、5a-5f示意性地示出了根据本发明的一个实施方案的分离系统。
实施方案详述
根据本发明，提供了一种从细胞培养物分离生物分子的方法和分离系统。此外，提供了配置为连接于分离系统的洗脱装置。所述方法包括以下步骤：
- 将来自包含所述生物分子的细胞培养物的进料提供给磁力分离器并向磁力分离器提供包含能够结合该生物分子的配体的磁珠；
- 通过磁力分离器将所述具有结合的生物分子的磁珠与其余的进料分离；
- 将所述磁珠以具有添加的缓冲液的浆料形式运送至洗脱池；
- 在洗脱池中洗脱所述结合的生物分子。
在一些实施方案中，所述方法还包括从洗脱池运送磁珠以在磁力分离器中重复使用。
图1a、1b和1c示意性地示出了根据本发明的三个不同的可能的分离系统1、101、201。一些特征是相同的并将仅描述一次，并且这些系统中的一个中的一些特征也可用于其他系统中的一个中。所示三个系统1、101、201的共同之处在于它们包括磁力分离器5、105、205。这可以是例如如US 7506765中所述的高梯度磁力分离器，该专利以全文引用方式并入本文。磁力分离器从流体分离磁性颗粒。磁力分离器5、105、205包括入口5a、105a、205a，用于从包含所述生物分子的细胞培养物3、103、203接收进料和用于接收包含能够结合该生物分子的配体的磁珠。磁力分离器5、105、205配置为将所述具有所述结合的生物分子的磁珠与其余的进料分离。磁力分离器5、105、205在磁力分离器内包括磁性材料部分，当施加磁场时，这些部分将吸引磁珠。磁力分离器配置为在磁珠运送至提供在磁力分离器外并与磁力分离器连接的洗脱室7、107、207时释放磁场。磁力分离器还包括洗涤装置13、113、213，其配置为从磁力分离器5、105、205洗掉除以磁性方式结合到磁性材料部分的那些之外的其他组分。洗涤装置13、113、213包括至少一个洗涤缓冲液提供装置15、115、215和洗涤缓冲液收集装置17、117、217，所述洗涤缓冲液提供装置15、115、215连接于泵和可能地经由捕获池9、109、209连接于磁力分离器的入口5a、105a、205a，洗涤缓冲液收集装置17、117、217连接于磁力分离器的出口5b、105b、205b。洗涤装置13、113、213配置为使洗涤缓冲液流过磁力分离器5、105、205以洗掉进料中除结合到磁性部分的那些之外的其他组分。
所有三个分离系统1、101、201还包括洗脱装置8、108、208，其包括洗脱池7、107、207。洗脱池包括洗脱池入口7a、107a、207a，其与磁力分离器5、105、205的出口5b、105b、205b相连，用于接收以具有缓冲液的浆料形式来自磁力分离器的所述分离的磁珠。当从磁力分离器5、105、205向洗脱装置运送所述磁珠时，适合向磁力分离器加入缓冲液以允许磁珠流向洗脱装置8、108、208。
洗脱装置8、108、208配置为从磁珠洗脱生物分子。由此洗脱装置8、108、208包括连接于洗脱池入口7a、107a’、207a’的缓冲液提供装置8a、108a、208a和连接于洗脱池出口7b、107b’、207b’的收集装置8b、108b、208b。洗脱装置配置为通过从缓冲液提供装置提供洗脱缓冲液并在收集装置中收集洗脱液来进行洗脱，并还可能地通过从缓冲液提供装置提供清洁缓冲液并在收集装置中收集废物来进行解吸和就地清洗CIP，并且还可能地通过从缓冲液提供装置提供平衡缓冲液来进行洗脱池中磁珠的平衡。
在一些实施方案中，洗脱池107、207包括两个入口107a、107a’；207a、207a’和两个出口107b、107b’；207b、207b’。实际上，图1a中示出的分离系统中的洗脱池7也可具有两个入口和两个出口而不是仅一个入口和一个出口以及引导流体的阀门。并且相应地，图1b和1c中示出的分离系统的洗脱池可如图1a中所示仅具有一个入口和一个出口。
在图1b中示出的实施方案中，洗脱池107包括洗脱池第一出口107b，用于运送磁珠以在磁力分离器105中重复使用，和洗脱池第二出口107b’，用于在收集装置108b中收集洗脱液和废物。
在图1c中示出的实施方案中，洗脱池207包括洗脱池第一出口207b，用于向贮存容器215运送磁珠，和洗脱池第二出口207b’，用于在收集装置208b中收集洗脱液和废物。图1c中示出的分离系统201为没有磁珠的循环和再利用的系统。在该系统中，细胞培养物203可提供有磁珠并连接于分离系统201。可能地，细胞培养物203的所有内容物均可提供给磁力分离器205。在洗脱室207中洗脱生物分子后，磁珠被回收在贮存容器215中。
在图1b和1中示出的实施方案中，洗脱池107、207包括洗脱池第一入口107a、207a，用于从磁力分离器105、205接收磁珠，和洗脱池第二入口107a’、207a’，用于从缓冲液提供装置108a、208a接收洗脱缓冲液、就地清洗CIP缓冲液和平衡缓冲液。
洗脱池7、107、207包括保留装置502a-c、f-h，用于将磁珠保持在洗脱池内并允许过量的缓冲液从洗脱池排出。这些保留装置以及洗脱池的进一步细节示于图2a-2e中并在下文进一步描述。
在图1a和1b中示出的实施方案中，洗脱池出口7b、107b配置为从洗脱池运送磁珠以在磁力分离器5、105、205中重复使用。
图1a和1b中示出的分离系统1、101包括捕获池9、109，其连接于磁力分离器5、105的入口5a、105a。如果向细胞培养物203中加入了磁珠，则在图1c中示出的实施方案中，细胞培养物203也可被称为捕获池209。另一替代方案是将磁珠直接加到磁力分离器5、105、205中。对于所有实施方案，细胞培养物和磁珠分别直接加到磁力分离器中都是可能的，并应为本发明所涵盖。
图1a和1b中示出的捕获池9、109包括细胞培养物入口9a、109a，用于从细胞培养物3、103接收进料，和至少一个磁珠入口9b、109b、109c，用于接收磁珠。捕获池9、109配置为混合来自细胞培养物的进料和磁珠，从而允许特定的生物分子结合到磁珠，然后将其运送至磁力分离器5、105。
在根据本发明的分离系统1、101、201中，可在前一份在洗脱池7、107、207中的同时向磁力分离器5、105、205中提供新的一份来自细胞培养物3、103、203的进料和磁珠。由此，可在分离系统中同时使用至少两份磁珠而可使得分离生物分子的过程更有效。
在图1a和1b中示出的实施方案中，磁珠在分离系统1、101中循环并且可在一个前一份在洗脱池7、107中且一个前一份在捕获池9、109中的同时向磁力分离器5、105中提供新的一份来自细胞培养物3、103的进料和磁珠。由此，三份磁珠在分离系统1、101、201中循环。
对于图1a-1c中示出的所有实施方案，细胞培养物3、103、203、磁力分离器5、105、205和洗脱装置8、108、208可通过预先灭菌的柔性管和无菌连接器连接。此外，洗脱池可以是预先灭菌和一次性的。由此可提供仅供一次性使用的封闭且无菌的分离系统。
图1b中示出的分离系统101还包括连接于洗脱池出口107b并配置为从洗脱池接收磁珠的中间池111。中间池111配置为运送磁珠以可能地在磁力分离器5、105、205中重复使用。在一个实施方案中，中间池111包括排泄装置，用于从中间池111去除多余的缓冲液。可也或可代之以向图1a和1b中的系统的捕获池9、109提供这样的排泄装置。
在一些实施方案中，中间池111中的排泄装置构造为保留装置502b-c、f、h并包括磁体，用于在从中间池排泄缓冲液的同时通过磁力将磁珠保持在中间池111内。
在本发明的另一个方面，提供了洗脱装置8、108、208，其配置为连接在如上所述的分离系统中。
图2a-2h示意性地示出了根据本发明的不同实施方案的不同洗脱池307a-h。图2a-2h中示出的任何洗脱池307a-h均可用作图1a-1c中示出的系统中的洗脱池7、107、207及用作如图4和5中示出的洗脱池EC。
图2a示出了洗脱池307a。该洗脱池307a具有内隔室，用于容纳来自磁力分离器的磁珠。洗脱池307a包括第一入口309a，用于从磁力分离器接收磁珠。洗脱池307a还包括第二入口309b，用于从如上所述缓冲液提供装置8a、108a、208a接收缓冲液如洗脱缓冲液、CIP缓冲液和平衡缓冲液。在此实施方案中，洗脱池307a还包括第一出口311a，用于运送磁珠以可能地如上所述重复使用。洗脱池307a还包括连接于如上所述收集装置8b、108b、208b的第二出口311b。在另一个实施方案中，洗脱池可提供一个单个入口和一个单个出口并向该入口和出口连接阀门以正确地引导缓冲液和磁珠。关于图2a-h中描述的所有洗脱池307a-h均可提供有一个或两个入口和出口，虽然如图2a和2g中公开的洗脱池307a和307g仅示出为具有两个入口和两个出口。
洗脱池307a的体积可以是使得从磁力分离器接收的所有内容物(即称为磁珠浆料的磁珠和缓冲液)都可装入洗脱池中的尺寸，或者该体积可更小。如果洗脱池307a具有较小的体积，则可通过流动填充(即，使磁珠浆料流过洗脱池307a)来在洗脱池中填充磁珠。需要在洗脱池307a中提供保留装置502a以在允许缓冲液从洗脱池排出的同时将磁珠保持在洗脱池307a内。保留装置502a可例如为过滤器，也称玻璃料或烧结物，其提供为使得其覆盖来自洗脱池307a的出口311a、311b。另一种可能的保留装置可为仅夹紧出口的夹管阀或提供给出口或靠近出口的洗脱室部分的磁力。如果洗脱池的内部体积小于待从磁力分离器接收的磁珠浆料的总体积，则在本发明的一个实施方案中，洗脱池的体积可小于待接收的磁珠浆料总量的体积的一半。由此，流动填充将在洗脱室内提供具有合适空隙体积例如小于60%的磁珠床。另一方面，如果洗脱池307a具有布置为容下全部所接收的磁珠浆料的较大内部体积，则可使用例如重力或磁力来提供适合于洗脱过程的磁珠填充床。可向靠近出口的洗脱池部分提供磁力，如例如图2f中所示。任选地，可在图2a-2h中示出的所有实施方案中向入口和出口二者或仅向入口提供用于在洗脱池中分配缓冲液的分配系统，但这未示出。
图2b中示出了与图2a中所公开相似的洗脱池307b。然而，在此洗脱池307b中，仅提供一个入口309和一个出口311。如上所述，也可在洗脱池307b的此实施方案中代之以提供两个入口和两个出口。在洗脱池307b的此实施方案中，提供了磁力形式的保留装置502b。在洗脱池307b的出口311周围或靠近出口311的洗脱池部分周围提供了可打开和关闭的磁体。当施加磁力时，磁珠将被保持在洗脱池307b内而缓冲液可通过磁珠排出。由此填充磁珠床。这可如上所述并取决于洗脱池307b的内部体积的大小来完成，即例如流动填充、重力填充或通过使用来自保留装置502b的磁力来填充。
图2c中示出了根据本发明的洗脱池307c的另一个实施方案。该实施方案也仅包括一个入口309’和一个出口311’，然而，可如上所述代之以提供两个入口和两个出口。在该实施方案中，出口311’提供在洗脱池307c的侧壁313的下部。其中下部是指图中的方向并在提供入口309’的相对侧。在图2a和2b中示出的前述实施方案中，出口代之以提供在洗脱池307a、307b的底部中。向出口311’提供保留装置502c，这里以磁力形式示出。然而，在此实施方案中也可代之以提供过滤器或夹管阀。洗脱池307c的尺寸和填充磁珠的方法对应于如关于图2a和2b所述的前述实施方案。
图2d示出了根据本发明的洗脱池307d的另一个实施方案。图2b中示出了一个入口309和一个出口311，然而，也可提供两个入口和两个出口。提供了覆盖出口311的如图2a中的以过滤器形式的保留装置502a。在此实施方案中，还在洗脱池307d内提供接合器(adaptor)504。接合器最初提供在靠近洗脱池307d的入口309的起始位置。洗脱池的内部体积由洗脱池307d的内壁和接合器限定。将磁珠浆料提供到洗脱池307d中并通过迫使接合器朝向洗脱池307d的出口311来提供磁珠的填充。缓冲液将通过保留装置502a和出口311排出。当获得合适的填充床时，接合器停止。这可以是例如小于60%的空隙体积。在另一个实施方案中，入口提供在洗脱池的底部中，出口提供在顶部中，并可从洗脱池的底部而不是如图2d中所示从顶部提供接合器。
图2e示出了根据本发明的洗脱池307e的另一个实施方案。在此实施方案中，入口309”提供在洗脱池307e的底部315中，而不是如前述实施方案中那样提供在顶部中。出口311”提供在洗脱池307e的另一端。如前面所讨论，在此实施方案中也可提供两个入口和两个出口。接合器504’提供在洗脱池307e内并与洗脱池的底部315和内侧壁一起限定洗脱池307e的内部体积。在此实施方案中，缓冲液可通过接合器504’排出，但磁珠将被保持在入口309”和接合器504’之间。通过使磁珠浆料流入洗脱池307e中并通过向来自接合器504’的流动提供合适的力，可实现具有合适空隙体积的磁珠填充床。提供给接合器504’的力可改变。可为入口309”提供保留装置如夹管阀。
图2f示出了根据本发明的洗脱池307f的另一个实施方案。在此实施方案中，提供了宽而短的洗脱池。由此将提供短的磁珠床。这会在洗脱过程中给出较低的压力和增加的流动及因此较快的洗脱。一个入口309示出在洗脱池307f的顶部中，一个出口311示出在洗脱池的底部中。保留装置502f以磁力的形式提供，该磁力施加到洗脱室侧壁的一部分而不仅是出口。由此，磁力也如上所述用于磁珠的填充。还示出了提供给出口311的呈夹管阀形式的额外保留装置502g。
图2g示出了根据本发明的洗脱池307g的另一个实施方案。在此实施方案中，洗脱池307g包括第一入口309a’，用于从提供在洗脱池307g的侧壁313中的磁力分离器接收磁珠。洗脱池307g还包括第二入口309b’，用于从如上所述缓冲液提供装置8a、108a、208a接收缓冲液如洗脱缓冲液、CIP缓冲液和平衡缓冲液。第二入口309b’通过可移动的第一接合器504a提供。在此实施方案中，洗脱池307g还包括第一出口311a’，用于运送磁珠以可能地如上所述重复使用。第一出口311a’也提供在洗脱池307g的侧壁313中。洗脱池307g还包括连接于如上所述收集装置8b、108b、208b的第二出口311b’。第二出口311b’通过第二可移动接合器504b提供。用于容纳磁珠的洗脱池307g的内部体积由侧壁313及第一和第二接合器504a、504b限定。第一和第二接合器504a、504b都可提供有保留装置502a，如过滤器、玻璃料或烧结物。此外，第一和第二接合器504a、504b都可提供有用于分配样品提供和收集的分配系统。然而，这可能没有必要。图2g示出了可移动接合器的四个不同位置I、II、III、IV。在第一位置I中，第一和第二接合器504a、504b都处于缩回位置，即提供洗脱室507g的最大内部体积。在此位置，第一接合器504a提供在第一入口309a’的上方(参考图中的方向) - 由此第一入口309a’可到达洗脱室的内部体积。在此第一位置，第二接合器504b也提供在第一出口311a’的下方(参考图中的方向)，并由此第一出口311a’可到达洗脱室的内部体积。由此，洗脱池的内部体积(也称腔室)是开放的以便冲洗。在第二个位置II，腔室提供在用于捕获磁珠的位置。通过第一入口309a’从磁力分离器接收磁珠浆料。在提供给第二接合器504b的保留装置502a上建立磁珠床，缓冲液将穿过保留装置502a并通过第二出口311b’从洗脱池307g流出。在第三个位置III，腔室处于关闭位置。第一接合器504a已向下移动到第一入口309a’的下方(参考图中的方向)。洗脱池307g现在处于关闭位置并还可能处于压缩位置。可能地，第一接合器504a在向下移动时压缩磁珠床。然而，洗脱也可在开放式床中进行。在第三个位置，洗脱池现在准备好进行如上所述的洗脱、解吸、CIP和平衡。在第四个位置IV，第二接合器504b已再次缩回，从而打开第一出口311a’的腔室。由此，洗脱池307g现在准备好运送磁珠以可能地如上所述重复使用。可通过加入额外的缓冲液冲出磁珠和/或通过使用第一接合器504a压出磁珠。
图2h示出了根据本发明的洗脱池307h在三个位置I、II、III的另一个实施方案。在此实施方案中，洗脱池307h为柔性管，可能比系统中其余的管道更大。这里示出了如何通过提供呈夹管阀形式的保留装置502h在有或无磁性元件的情况下在柔性管自身中进行洗脱。保留装置502h可压缩一部分洗脱池307h以收集从磁力分离器提供的磁珠，同时让缓冲液通过。可进行洗脱和可能地CIP、解吸和平衡，然后可释放保留装置502h以运送磁珠以可能地如上所述重复使用。
图3a为在图1a中示出的系统中分离生物分子的方法的流程图。该方法的步骤按顺序描述如下：
A1：将来自细胞培养物3的进料提供给捕获池9。所述进料包含待分离的生物分子。所述捕获池9包含含有能够结合该生物分子的配体的磁珠。在捕获池9中，生物分子将与磁珠结合。可能地，在捕获池9中提供混合以改善结合。在一个替代的实施方案中，将细胞培养物直接提供到磁力分离器中而不是提供到捕获池中。在此实施方案中，捕获将在磁力分离器内而不是在捕获池中发生，并且捕获池仅是用于贮存磁珠的中间步骤。
A3：将来自捕获池9的细胞培养物和磁珠提供给磁力分离器5。
A5：通过如上所述施加磁力，在磁力分离器中分离出具有结合的生物分子的磁珠。该步骤还包括通过使用如上所述的洗涤装置13洗掉进料的其他颗粒。可能地，在磁珠与磁性材料部分结合时，提供一个或多个其中向磁力分离器中提供洗涤缓冲液的洗涤循环。将洗涤缓冲液收集在磁力分离器外部，最后将缓冲液加到磁力分离器中并释放磁力。
A7：将磁珠和缓冲液以浆料形式运送至洗脱池7。在洗脱之前，可如上所述将磁珠填充在床中 - 例如通过磁力、重力、流动填充或通过使用接合器。
A9：通过从缓冲液提供装置8a提供洗脱缓冲液并将洗脱的生物分子收集在收集装置8b中来从磁珠洗脱结合的生物分子。可能地，也可通过从缓冲液提供装置8a向洗脱池7提供CIP缓冲液并在收集装置8b中收集CIP缓冲液来就地清洗(CIP)洗脱池7和磁珠。并可能地，还通过从缓冲液提供装置8a提供平衡缓冲液并在收集装置8b中收集平衡缓冲液来平衡磁珠。可能地，还如上所述进行解吸。
A11：将磁珠运送至捕获池9。该步骤可包括通过迫使接合器朝向洗脱池的出口来推出磁珠。其还可包括通过向洗脱池中提供一定量的缓冲液将洗脱池中的磁珠床重新悬浮，然后可将磁珠和缓冲液的浆料从洗脱池泵出或推出到中间容器111中。另一替代方案或补充可以是移除保留装置如底部过滤器或使磁珠保持在洗脱池内的磁力并将磁珠泵送或推动到捕获池109。
然后可通过向捕获池9加入新的细胞培养物来继续该过程。采用这种设置，可以如上所述使两份或甚至三份磁珠在系统中循环。由此，一份在磁力分离器5中，而一份在洗脱池7中，一份可同时在捕获池9中。由此实现了分离生物分子的有效过程。图1a中示出的系统和如图3a中的流程图中所述的过程可容易地适应在洗脱步骤之后去除磁珠和向捕获池9中加入新的磁珠的可能性。
图3b为在图1b中示出的系统中分离生物分子的方法的流程图。该方法的步骤按顺序描述如下：
B1：将来自细胞培养物103的进料提供给捕获池109。所述进料包含待分离的生物分子。还向捕获池109提供来自磁珠贮存罐121和/或来自系统中提供的中间池111的磁珠。如果由于某种原因需要提供新的磁珠而不是重复使用来自先前的分离的磁珠，则可从磁珠贮存罐121提供这些新的磁珠。磁珠包含能够结合待分离的生物分子的配体。在捕获池109中，生物分子将与磁珠结合。可能地，在捕获池109中提供混合以改善结合。
B3：将来自捕获池109的细胞培养物和磁珠提供给磁力分离器105。
B5：通过如上文关于图3a所述施加磁力和洗涤，在磁力分离器中分离出具有结合的生物分子的磁珠。
B7：将磁珠和缓冲液以浆料形式运送至洗脱池107并可能地如上所述填充磁珠。
B9：从磁珠洗脱结合的生物分子并可能地如上文关于图3a所述进行CIP、平衡和解吸。
B11：将磁珠从洗脱池107运送至中间容器111。该步骤可包括通过迫使接合器朝向洗脱池的出口来推出磁珠。其还可包括通过向洗脱池中提供一定量的缓冲液将洗脱池中的磁珠床重新悬浮，然后可将磁珠和缓冲液的浆料从洗脱池泵出或推出到中间容器111中。另一替代方案或补充可以是移除保留装置如底部过滤器或使磁珠保持在洗脱池内的磁力并将磁珠泵送或推动到捕获池109。
B13：如果在将磁珠从洗脱池运送至中间容器的步骤B11过程中加入了缓冲液，则任选地从磁珠浆料排泄缓冲液。在一个实施方案中，排泄可通过向中间容器111提供磁力来提供，该磁力将磁珠保持在容器内，同时缓冲液可通过出口123排泄到废物容器125。
B15：将磁珠提供给捕获池109以便在下一个分离过程中重复使用。然而，在一个实施方案中，可在该过程的某个阶段从系统中取出部分或全部磁珠到废物容器125并将其用从磁珠贮存罐121提供给捕获池109的新磁珠替代。
图3c为在图1c中示出的系统中分离生物分子的方法的流程图。该方法的步骤按顺序描述如下：
C1：将直接来自细胞培养物203的进料提供给磁力分离器205。在此实施方案中已向细胞培养物203中提供磁珠，因此细胞培养物也可称为捕获池209。所述磁珠具有结合待分离的生物分子的配体。或者，可代之以将磁珠直接提供到磁力分离器205中并且生物分子在磁力分离器内与磁珠结合，即细胞培养物和磁珠分别提供到磁力分离器中。
C3：通过如上文关于图3a所述施加磁力和洗涤，在磁力分离器中分离出具有结合的生物分子的磁珠。
C5：将磁珠和缓冲液以浆料形式运送至洗脱池207并可能地如上所述填充磁珠。
C7：从磁珠洗脱结合的生物分子并可能地如上文关于图3a所述进行CIP、平衡和解吸。
C9：将磁珠从洗脱池207运送至贮存容器215。该步骤可包括通过迫使接合器朝向洗脱池的出口来推出磁珠。其还可包括通过向洗脱池中提供一定量的缓冲液将洗脱池中的磁珠床重新悬浮，然后可将磁珠和缓冲液的浆料从洗脱池泵出或推出到贮存容器215中。另一替代方案或补充可以是移除保留装置如底部过滤器或使磁珠保持在洗脱池内并将磁珠泵送或推动到贮存容器215的磁力。
当包含细胞培养物的生物反应器应被完全清空或空出部分到磁力分离器中以进行生物分子分离时，如图3c的流程图中所述的方法可能是有用的。当由于不同的原因重复使用磁珠是不合适的时，它也可能是有用的。
图4示出了根据本发明的一个实施方案的分离系统701。图4a-4i示出了当使用图4的分离系统时分离过程的不同状态。在本发明的此实施方案中，系统中不需要泵来移动磁珠。泵被用于提供用于洗涤、洗脱等的缓冲液，并且这些缓冲液流将推动细胞和磁珠通过系统。由此降低了因泵而损伤磁珠的风险。下面给出了更详细的描述。
图5示出了根据本发明的一个实施方案的分离系统801。图5a-5f示出了当使用图5的分离系统时分离过程的不同状态。同样在此实施方案中避免使用泵来移动磁珠。下面给出了更详细的描述。
在图4和5中，EC为洗脱池，CC为捕获池，BP为生物过程反应器，MS为磁力分离器。P为泵，V为阀门，并且泵和阀门都可以是合适的类型，在一个实施方案中是一次性的。废物容器W示意为用于收集来自不同过程步骤的废物，小瓶C提供用于样品收集。
具有或不具有磁珠的样品液体的流体流动路径由双线示出。
用于引入流体和用于从回路去除液体的流体流动路径由单线示出。
在图4中示出的系统中，捕获池CC、磁力分离器MS和洗脱池EC提供有用于保留磁珠的磁体。白色磁体表示非活性的，黑色磁体表示被激活的。图4a-4i中示出了使用图4中所示系统的分离过程的不同步骤并按顺序描述如下：
图4a：间歇模式分离。初始状态包括两批磁珠，一批在捕获池CC中，一批在洗脱池EC中。在此状态下，系统中没有流动。
图4b：通过重力或通过泵(未示出)或通过其他合适的措施将细胞培养物(进料)从生物过程反应器BP引入到捕获池CC中。捕获池CC优选以合适的方式搅动，例如通过搅拌器、通过波动等。生物分子在预定的时间期间被捕获到珠粒上。
图4c：将缓冲液泵入捕获池CC中以将进料和磁珠推入磁力分离器MS中。磁力分离器中的磁体MS被激活而捕获磁珠，其余的进料被传到废物W。
图4d：将CIP溶液泵入捕获池CC中并通过阀门排泄到废物W(可能涉及若干步骤)。冲洗溶液被泵送通过磁力分离器MS以去除细胞等并运送至废物W。这可进行若干次并可在冲洗过程中使磁体失活以悬浮磁珠并然后重新激活以捕获磁珠。
图4e：一旦捕获池CC被清洁，通过泵送缓冲液将磁珠从洗脱池EC推向捕获池CC。继续磁力分离器MS的冲洗(任选)。
图4f：通过经阀门排泄来从捕获池CC去除过量的缓冲液。在此实施方案中，这被动地进行，即在重力作用下进行。该步骤是任选的，取决于稀释进料是否是可接受的。继续冲洗(如果需要) - 或者可将珠粒从磁力分离器MS推/冲向洗脱池EC，参见4g。
图4g：从生物过程反应器BP向捕获池CC加入进料。可将磁珠从磁力分离器MS推/冲向洗脱池EC，并由出口处激活的磁体捕获于其中。
图4h：在捕获池CC中，生物分子在预定的时间内被捕获到珠粒上。在洗脱池EC中，生物分子从珠粒洗脱。洗脱的产物被收集在小瓶C中。
图4i：将缓冲液泵入捕获池CC中以将进料和磁珠推入磁力分离器MS中。磁力分离器MS中的磁体被激活以捕获磁珠，并且进料被传到废物W。在洗脱池EC中，磁珠被洗涤并重新激活。
然后循环4d-4i直至生物过程反应器BP变空。
图5示出了在捕获池CC和洗脱池EC中无清洁和洗涤步骤的简化过程。下面参考图5a-5f描述在图5中所示系统中进行的分离过程的过程步骤。
图5a：包含两批磁珠的初始状态，一批在捕获池CC中，一批在洗脱池EC中。在此状态下，系统中没有流动。
图5b：从生物过程反应器BP向捕获池CC加入进料。
图5c：将缓冲液泵入捕获池CC中以将进料和磁珠推入磁力分离器MS中。磁力分离器MS中的磁体被激活以捕获磁珠，并且进料被传到废物W。
图5d：将冲洗溶液泵送通过磁力分离器MS以去除细胞等。通过泵送缓冲液将磁珠从洗脱池EC推向捕获池CC。
图5e：从生物过程反应器BP向捕获池CC加入进料。将磁珠从磁力分离器MS推/冲向洗脱池EC，并由出口处激活的磁体捕获于其中。
图5f：在捕获池CC中，生物分子在预定的时间内被捕获到磁珠上。在洗脱池EC中，生物分子从磁珠洗脱，并且洗脱的产物被收集在小瓶C中。
然后重复5d、5e、5f直至完成该批次。
为了达到尽可能高的浓度，通过在预定的时间内使珠粒与预定体积的洗脱缓冲液接触来以间歇模式进行洗脱。将包含洗脱的目标样品的洗脱缓冲液收集在洗脱小瓶中。然后将磁珠(包括剩余的目标样品)在不进行CIP的情况下运送至捕获池。
在这些系统中，磁珠(和细胞)不必通过任何泵，否则它们损伤的可能性会增大。附图中公开的一般过程也可适用于回路中使用泵的情况，只要可证实珠粒不被损伤或者只要来自受损珠粒的碎屑在过程中没有问题。通过将一个池布置在后续池的上方，可由重力促进回路中的一些步骤。例如，可将洗脱池EC布置在捕获池CC上方以促进磁珠从洗脱池EC向捕获池CC的运送并减少该输送所需的缓冲液的量。

Claims (45)

1.一种在分离系统中从细胞培养物分离生物分子的方法，所述方法包括以下步骤：
-将来自包含所述生物分子的细胞培养物的进料提供给磁力分离器并向所述磁力分离器提供包含能够结合该生物分子的配体的磁珠；
-通过所述磁力分离器将结合生物分子的磁珠与其余的进料分离；
-将所述磁珠以具有添加的缓冲液的浆料形式运送至洗脱池；
-在所述洗脱池中填充磁珠的浆料以在所述洗脱池内提供空隙体积小于60％的磁珠床，其中所述填充通过使所述磁珠浆料流过所述洗脱池进行，其中所述洗脱池包括保留装置以使所述磁珠保持在所述洗脱池内并允许过量的缓冲液从所述洗脱池排出；和
-在所述洗脱池中洗脱所述结合的生物分子。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括从所述洗脱池运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
-在提供给所述磁力分离器之前于捕获池中混合来自所述细胞培养物的所述进料和所述磁珠，从而允许所述生物分子结合到所述磁珠。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中分离步骤包括：
-向所述磁力分离器施加磁场，从而允许所述磁珠以磁性方式结合到所述磁力分离器内的磁性材料部分；
-从所述磁力分离器洗掉除以磁性方式结合到所述磁性材料部分的那些之外的其他组分；
并且其中将所述磁珠运送至洗脱池的步骤包括
-在运送所述磁珠之前释放施加给所述磁力分离器的磁场。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
-在所述洗脱之后就地清洗CIP所述洗脱池和所述磁珠；和
-在所述CIP之后和从所述洗脱池运送所述磁珠之前在所述洗脱池中平衡所述磁珠。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
-在洗脱之后和CIP之前解吸。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中在前一份在所述洗脱池中的同时向所述磁力分离器中提供新的一份来自所述细胞培养物的进料和磁珠，由此，至少两份磁珠在所述分离系统中循环。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在一个前一份在所述洗脱池中且一个前一份在捕获池中的同时向所述磁力分离器中提供新的一份来自所述细胞培养物的进料和磁珠，由此，三份磁珠在所述分离系统中循环。
9.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括通过预先灭菌的柔性管和无菌连接器连接所述系统的部分的第一步骤。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中填充步骤包括在所述洗脱池内推动接合器，同时由保留装置将所述磁珠保持在所述洗脱池内并允许缓冲液从所述洗脱池排出。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中填充步骤包括允许所述磁珠在重力和/或磁力作用下在所述洗脱池的下部中构建填充床，同时允许过量的缓冲液从所述洗脱池排出。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中填充步骤包括通过使所述磁珠浆料流入所述洗脱池的底部入口中来流动填充所述磁珠，所述洗脱池包括接合器，在磁珠浆料开始充填所述洗脱池时所述接合器位于所述洗脱池中的起始位置处，所述起始位置比所述接合器的最终位置更靠近所述洗脱池的底部入口，所述最终位置对应于向所述洗脱池中充填磁珠完成时所述接合器的位置，所述接合器保持朝向所述浆料的流动方向的力并允许缓冲液在充填过程中通过所述接合器排出。
13.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在洗脱后释放所述洗脱池中的保留装置和从所述洗脱池运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中释放保留装置包括打开底部封闭件、移除底部过滤器或移除磁力。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述运送所述磁珠通过在所述洗脱池中朝向所述洗脱池的底部入口推动接合器来进行。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述从所述洗脱池运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用的步骤还包括向所述洗脱池中加入缓冲液以再悬浮所述床和从所述洗脱池泵出或推出所述磁珠的步骤。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述从所述洗脱池运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用的步骤还包括从所述洗脱池向中间池运送所述磁珠的步骤，其中过量的缓冲液可被移除。
18.根据权利要求17所述的方法，其中过量的缓冲液通过由磁力将所述磁珠保持在所述中间池内同时从所述中间池排泄缓冲液来从所述中间池移除。
19.一种用于从细胞培养物分离生物分子的分离系统，其中所述系统包含：
-磁力分离器，其包括用于接收来自包含所述生物分子的细胞培养物的进料和用于接收包含能够结合该生物分子的配体的磁珠的入口，所述磁力分离器配置为将结合生物分子的磁珠与其余的进料分离；和
-包含洗脱池的洗脱装置，所述洗脱池包括与来自所述磁力分离器的出口连接的洗脱池入口，用于接收以具有缓冲液的浆料形式来自所述磁力分离器的所述分离的磁珠，其中所述洗脱装置配置为在所述洗脱池中填充磁珠的浆料以在所述洗脱池内提供空隙体积小于60％的磁珠床并从所述磁珠洗脱所述生物分子，
其中所述洗脱池包括保留装置以将所述磁珠保持在所述洗脱池内并允许过量的缓冲液从所述洗脱池排出。
20.根据权利要求19所述的分离系统，其中所述洗脱池包含配置为从所述洗脱池运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用的洗脱池出口。
21.根据权利要求19或20所述的分离系统，所述分离系统还包含：
-捕获池，其连接于所述磁力分离器的入口并包括用于接收来自细胞培养物的进料的细胞培养物入口和至少一个用于接收磁珠的磁珠入口，所述捕获池配置为混合来自所述细胞培养物的进料与所述磁珠，从而允许所述生物分子在运送至所述磁力分离器之前与所述磁珠结合。
22.根据权利要求19或20所述的分离系统，其中所述磁力分离器在所述磁力分离器内包括磁性材料部分，当施加磁场时，所述部分吸引所述磁珠，并且所述磁力分离器配置为当所述磁珠待运送至所述洗脱池时释放所述磁场，所述磁力分离器还包括洗涤装置，所述洗涤装置配置为从所述磁力分离器洗掉除以磁性方式结合到所述磁性材料部分的那些之外的其他组分。
23.根据权利要求22所述的分离系统，其中所述洗涤装置包括至少一个连接于泵并经由捕获池连接于所述磁力分离器的入口的洗涤缓冲液提供装置和连接于所述磁力分离器的出口的洗涤缓冲液收集装置，所述洗涤装置配置为使洗涤缓冲液流过所述磁力分离器以洗掉所述进料中除结合到所述磁性部分的那些之外的其他组分。
24.根据权利要求19或20所述的分离系统，其中所述洗脱装置包括连接于洗脱池入口的缓冲液提供装置和连接于洗脱池出口的收集装置，并且其中所述洗脱装置配置为通过从所述缓冲液提供装置提供洗脱缓冲液并在所述收集装置中收集洗脱液来进行洗脱，并还通过从所述缓冲液提供装置提供清洁缓冲液并在所述收集装置中收集废物来进行就地清洗CIP，并且还通过从所述缓冲液提供装置提供平衡缓冲液来进行所述洗脱池中所述磁珠的平衡。
25.根据权利要求19或20所述的分离系统，其中在前一份在所述洗脱池中的同时向所述磁力分离器中提供新的一份来自所述细胞培养物的进料和磁珠，由此，至少两份磁珠在所述分离系统中循环。
26.根据权利要求25所述的分离系统，其中在一个前一份在所述洗脱池中且一个前一份在捕获池中的同时向所述磁力分离器中提供新的一份来自所述细胞培养物的进料和磁珠，由此，三份磁珠在所述分离系统中循环。
27.根据权利要求19或20所述的分离系统，其中所述细胞培养物、所述磁力分离器和所述洗脱装置通过预先灭菌的柔性管和无菌连接器封闭系统连接。
28.根据权利要求19或20所述的分离系统，其中所述洗脱池包括洗脱池第一出口，用于运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用，和洗脱池第二出口，用于在收集装置中收集洗脱液和废物。
29.根据权利要求19或20所述的分离系统，其中所述洗脱池包括洗脱池第一入口，用于从所述磁力分离器接收磁珠，和洗脱池第二入口，用于从缓冲液提供装置接收洗脱缓冲液、就地清洗CIP缓冲液和平衡缓冲液。
30.根据权利要求19所述的分离系统，其中所述保留装置为夹管阀、磁力或过滤器。
31.根据权利要求19或20所述的分离系统，其中所述洗脱池包括用于在所述洗脱池中填充所述磁珠的接合器和配置为将所述磁珠保持在所述洗脱池内同时允许其他缓冲液从所述洗脱池排出的保留装置。
32.根据权利要求31所述的分离系统，其中所述接合器还配置为通过朝向所述洗脱池的出口推动所述接合器并移除配置为将所述磁珠保持在所述洗脱池内的保留装置而用于运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用。
33.根据权利要求19或20所述的分离系统，其中所述洗脱池包括接合器，在磁珠浆料开始从所述洗脱池的底部入口充填所述洗脱池时所述接合器位于所述洗脱池中的起始位置处，所述起始位置比最终位置更靠近所述底部入口，所述最终位置对应于向所述洗脱池中充填磁珠完成时所述接合器的位置，所述接合器保持朝向所述浆料的流动方向的力并允许缓冲液在充填过程中通过所述接合器排出。
34.根据权利要求19或20所述的分离系统，所述分离系统还包括连接于洗脱池出口并配置为从所述洗脱池接收所述磁珠的中间池，所述中间池还配置为运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用。
35.根据权利要求34所述的分离系统，其中所述中间池包括排泄装置以从所述中间池去除过量的缓冲液。
36.根据权利要求35所述的分离系统，其中所述排泄装置包括磁体，用于由磁力将所述磁珠保持在所述中间池内同时从所述中间池排泄缓冲液。
37.一种配置为连接在根据权利要求19-36中任一项所述的分离系统中的洗脱装置，所述洗脱装置包括洗脱池，所述洗脱池包括洗脱池入口，其配置为连接于磁力分离器的出口以接收以具有缓冲液的浆料形式的来自所述磁力分离器的磁珠，其中所述洗脱装置配置为在所述洗脱池中填充磁珠的浆料以在所述洗脱池内提供空隙体积小于60％的磁珠床并从所述磁珠洗脱生物分子，其中所述洗脱池包括保留装置以将所述磁珠保持在所述洗脱池内并允许过量的缓冲液从所述洗脱池排出。
38.根据权利要求37所述的洗脱装置，其中所述洗脱池包括洗脱池出口，其配置为从所述洗脱池运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用。
39.根据权利要求37或38所述的洗脱装置，其中所述洗脱装置包括连接于洗脱池入口的缓冲液提供装置和连接于洗脱池出口的收集装置，并且其中所述洗脱装置配置为通过从所述缓冲液提供装置提供洗脱缓冲液并在所述收集装置中收集洗脱液来进行洗脱，并还通过从所述缓冲液提供装置提供清洁缓冲液并在所述收集装置中收集废物来进行就地清洗CIP，并且还通过从所述缓冲液提供装置提供平衡缓冲液来进行所述洗脱池中所述磁珠的平衡。
40.根据权利要求37或38所述的洗脱装置，其中所述洗脱池包括洗脱池第一出口，用于运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用，和洗脱池第二出口，用于在收集装置中收集洗脱液和废物。
41.根据权利要求37或38所述的洗脱装置，其中所述洗脱池包括洗脱池第一入口，用于从所述磁力分离器接收磁珠，和洗脱池第二入口，用于从缓冲液提供装置接收洗脱缓冲液、就地清洗CIP缓冲液和平衡缓冲液。
42.根据权利要求37所述的洗脱装置，其中所述保留装置为夹管阀、磁力或过滤器。
43.根据权利要求37或38所述的洗脱装置，其中所述洗脱池包括用于在所述洗脱池中填充所述磁珠的接合器和配置为将所述磁珠保持在所述洗脱池内同时允许其他缓冲液从所述洗脱池排出的保留装置。
44.根据权利要求43所述的洗脱装置，其中所述接合器还配置为通过朝向所述洗脱池的出口推动所述接合器并移除配置为将所述磁珠保持在所述洗脱池内的保留装置而用于运送所述磁珠以在所述磁力分离器中重复使用。
45.根据权利要求37或38所述的洗脱装置，其中所述洗脱池包括接合器，在磁珠浆料开始从所述洗脱池的底部入口充填所述洗脱池时所述接合器位于所述洗脱池中的起始位置处，所述起始位置比最终位置更靠近所述底部入口，所述最终位置对应于向所述洗脱池中充填磁珠完成时所述接合器的位置，所述接合器保持朝向所述浆料的流动方向的力并允许缓冲液在充填过程中通过所述接合器排出。
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