JP2017156130A - クロマトカラムの充填剤充填方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】充填剤の充填に伴う作業難の軽減を図り、雑菌混入を防いで清浄で効率よく充填剤を充填することができるクロマトカラムの充填剤充填方法を提供する。【解決手段】バルブ15,25を閉、バルブ17、平板栓26を開とし、充填剤スラリーを配管16を介してカラム2内に導入しつつ可動栓20を上方移動させる。次いで、バルブ17,25を閉、バルブ15、平板栓26を開とし、可動栓20を押し下げ、スラリー中の保存液をフィルタ12及びスペース13を経てバルブ15から排出して充填剤層を形成する。その後、バルブ15,25を開、バルブ17、平板栓26を閉とし、純水又は平衡化バッファーを充填剤層に通液して充填剤層内の液を置換する。【選択図】図2
Description
本発明は、例えば、医薬品やファインケミカル、機能性成分などの分離・精製工程で用いられるクロマトカラムのカラムに充填剤を充填する方法に関する。
バイオテクノロジー分野での近年の進歩に伴って、タンパク質のような生体物質及び生化学物質を回収、精製及び分離するための迅速で一段と精密な技術が必要とされている。医薬品やファインケミカル、機能性成分などの分離・精製工程ではクロマトグラフィーが広く用いられている。
クロマトグラフィーには、分離精製の原理や対象により、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等がある。クロマトグラフィーによる分離精製原理の例として、ゲル濾過クロマトグラフィー(以下ゲル濾過と略)について説明する。ゲル濾過は、タンパク質や多糖類、核酸などの生体分子を精製する際に用いられる代表的な方法の一つである。ゲル濾過では、カラムに充填されたゲル粒子状の充填剤にサンプル通すことにより、様々な大きさの分子を分子量(ここでは溶液中での分子の大きさの意味)に従って分離することができる。担体には小さな孔が開いてあり、小さい分子はその孔に入り込むため、長い間カラム内にとどまることになる。そのため、高分子ほど早く溶出され、低分子ほど溶出されるまで時間がかかる。
特許文献1に記載されているように、一般に、一連のクロマト構成操作、分離精製操作と、メンテナンス作業は、例えば以下のように行われる。なお、湿潤状態で新品購入または使用途中で一次保存されている充填剤は、雑菌繁殖を抑えるための化学薬品、例えばエタノールを含む保存液(例えばエタノール濃度20%)に浸漬された状態(以下、混合液という。)にあり、目的成分の分離精製に用いる直前に、雑菌繁殖を抑制する化学薬品により洗浄して使用される。湿潤状態で新品購入または使用途中で一次保存されている充填剤として、例えば、セファロースやデキストランなどを重合した天然高分子および、これら天然高分子にイオン交換基やアフィニティ基などの官能基を導入した平均粒子径数十μmから百数十μm程度の充填剤がタンパクや核酸等の分離精製用に汎用されている。これらの天然高分子は、柔軟性に富み、水分含有率が高く、一方、乾燥に弱く、また、微生物に毒性がない為、保管の際、湿潤状態に保つと同時に、微生物汚染や微生物繁殖を防ぐ必要があり、更に、医薬品精製に用いる為、人体に安全な状態で保管することが不可欠な為、例えばエタノール20%水溶液が保存液として汎用されている。
(1) カラム準備
予め洗浄して乾燥させた清浄な各部品を、カラムに組み立て、純水あるいは平衡化バッファーを満たし、気泡を除去する。
(2) 充填剤準備
粒子状の充填剤を純水あるいは平衡化バッファーでデカンテーション操作を繰り返して洗浄し、化学薬品、例えばエタノールを含む保存液から置換した後に、純水あるいは平衡化バッファーを所定量加えて充填剤スラリーを調製する。
(3) 充填剤のカラム充填
スラリーを気泡が入らないようにカラムに注入し、その後、スラリー注入口をシールする。
(4) クロマト分離精製
カラムをクロマト送液システムに接続し、精製目的成分の分離精製を繰り返す。
(5) 充填剤洗浄
所定回数の精製を行った後、または充填剤が汚れた際に、カラムをクロマト送液システムから外し、充填剤をカラムから抜き出してNaOHなどの洗浄薬剤を含む洗浄液で洗浄する。
(6) 前記工程(1)〜(5)を繰り返す。
(1) カラム準備
予め洗浄して乾燥させた清浄な各部品を、カラムに組み立て、純水あるいは平衡化バッファーを満たし、気泡を除去する。
(2) 充填剤準備
粒子状の充填剤を純水あるいは平衡化バッファーでデカンテーション操作を繰り返して洗浄し、化学薬品、例えばエタノールを含む保存液から置換した後に、純水あるいは平衡化バッファーを所定量加えて充填剤スラリーを調製する。
(3) 充填剤のカラム充填
スラリーを気泡が入らないようにカラムに注入し、その後、スラリー注入口をシールする。
(4) クロマト分離精製
カラムをクロマト送液システムに接続し、精製目的成分の分離精製を繰り返す。
(5) 充填剤洗浄
所定回数の精製を行った後、または充填剤が汚れた際に、カラムをクロマト送液システムから外し、充填剤をカラムから抜き出してNaOHなどの洗浄薬剤を含む洗浄液で洗浄する。
(6) 前記工程(1)〜(5)を繰り返す。
本発明は、充填剤の充填に伴う作業負担の軽減を図り、雑菌混入を防いで清浄で効率よく充填剤を充填することができるクロマトカラムの充填剤充填方法を提供することを目的とする。
本発明のクロマトカラムの充填剤充填方法は、カラム軸心方向を上下方向としたカラムと、該カラムの一端側に設けられた固定栓と、該カラム内に設けられた可動栓とを有するクロマトカラムの該カラム内に充填剤スラリーを導入して充填剤層を形成するクロマトカラムの充填剤充填方法において、該固定栓と可動栓との一方の栓に充填剤スラリーをカラム内に導入可能な充填剤スラリー導入部を設けておき、該可動栓を固定栓から離反させつつ該導入部を介してカラム内に充填剤スラリーを導入し、その後、該導入部を閉じ、可動栓を固定栓に接近移動させ、可動栓及び固定栓の少なくとも一方を介して充填剤スラリー中の液を流出させて充填剤層を形成する。
本発明の一態様では、カラム内に導入する充填剤スラリーの圧力によって可動栓を固定栓から離反移動させる。
本発明の一態様では、前記固定栓は前記カラムの下端に設置されており、該固定栓は、カラム内に臨む面がフィルタにて構成されており、前記充填剤スラリーの導入部は、該フィルタを貫通する配管と、該配管のカラム側の先端に設けられた平板栓と、該配管に設けられたバルブとを有する。
本発明の一態様では、前記充填剤層を形成した後、カラム内に純水又は平衡化バッファーを通水して充填剤層内の液を置換する。
本発明方法によると、バルブの操作と可動栓の昇降によりカラム内に充填剤層が形成される。従って、本発明方法によると、充填剤の充填に伴う作業負担の軽減を図り、雑菌混入を防いで清浄で効率よく充填剤を充填することができる。
以下、図面を参照して実施の形態について説明する。図1は、本発明方法で充填剤が充填されるクロマトカラム1の概略的な縦断面図である。
図1の通り、クロマトカラム1は、筒軸心方向を鉛直方向とした円筒状のカラム2と、該カラム2の下端に取り付けられた固定栓10と、該カラム2内に上下方向移動可能に設置された可動栓20と、可動栓20を所定高さに固定するための固定ロッド(図示略)等を備えている。なお、該可動栓20を上下移動させるジャッキを備えてもよい。
固定栓10は、カラム2の下端のフランジ部2aにクランプやボルト等の取付手段(図示略)によって取り付けられた円盤状の固定栓本体11と、該固定栓本体11の上面の凹所11aに被さる、多孔質材よりなる円盤状のフィルタ12等を備えている。また凹所11aの底面には、中心から外周方向へ放射状に延在する複数の突起(図示しない)が設けられている。フィルタ12は、凹所11aの周囲の段部11d及び前記突起に係止されており、フィルタ12と凹所11a底面との間に液の流通用のスペース13が設けられている。なお、段部11dと前記突起は略同じ高さに設計されている。
固定栓本体11には、該スペース13に配管14が接続され、該配管14にバルブ15が接続されている。
フィルタ12の中央には充填剤スラリーの導入用の配管16が設けられ、この配管16の先端に平板栓26が設けられている。平板栓26の上面はフィルタ12の上面と面一となっている。平板栓26は、弁体を弁座に対し下方から接離させることにより閉・開が行われるよう構成されている。この配管16は短い管状であり、フィルタ12、スペース13及び固定栓本体11を貫通している。配管16の末端にはバルブ17が接続されている。
可動栓20は、外周面がカラム2の内周面にOリング(図示略)等を介して水密的にかつ摺動可能に接している円盤状の可動栓本体21と、該可動栓本体21の下面の凹所21aに被さる、多孔質材よりなる円盤状のフィルタ22等を備えている。凹所21aの天井面には、中心から外周方向へ放射状に延在する複数の突起(図示しない)が設けられている。フィルタ22は、凹所21aの周囲の段部21d及び前記突起に係止されており、フィルタ22と凹所21a天井面との間に液の流通用のスペース23が設けられている。なお、段部21dと前記突起は略同じ高さに設計されている。
可動栓本体21には、該スペース23に連通する液流通用のポート24が設けられており、該ポート24にバルブ25が接続されている。
このクロマトカラム1のカラム2内に充填剤層Bを形成する手順について次に説明する。
予め洗浄して乾燥させた清浄な各部品を用いて図1の通り、カラムを組み立てておく。図1の通り、可動栓20を下降させて固定栓10に密着させ、バルブ15,25を開、バルブ17を閉とし、固定栓10側から可動栓20側へ純水あるいは平衡化バッファーを流して、気泡を抜く。次いで図2の通り、バルブ15,25を閉とし、バルブ17及び平板栓26を開とし、可動栓20を上方向に移動させて充填剤スラリーをカラム内に吸い込むか、または、充填剤スラリーをポンプ(図示略)で送液し、可動栓20を送液圧で上昇させ、カラム2内に充填剤スラリーSを所定量導入する。
カラム内に所定量の充填剤スラリーが導入された後、可動栓20の上昇を止めるか又は送液ポンプを止める。カラム2内に導入する充填剤スラリー量は、可動栓20から固定栓10までの間隔とカラム2の断面積から算出する。充填剤スラリーの流動性が悪い場合、純水あるいは平衡化バッファーで希釈すればよく、希釈した場合は、希釈倍率によって充填剤スラリー注入量を算出して、この算出した量の希釈スラリーを導入する。
次いで、図3の通り、バルブ17,25及び平板栓26を閉とし、バルブ15を開とし、可動栓20を下降させ、カラム2内の充填剤スラリー中の液をフィルタ12を透過させて搾出し、バルブ15を介して流出させる。充填剤粒子同士が密着して所定高さの充填剤層Bが形成されるまで可動栓20を低圧で下降させ、その後、バルブ15,17,25及び平板栓26を閉とする。この操作により、充填剤スラリー中の液(例えば保存液)のほとんどが排出される。なお、図3では、バルブ15を開とし、バルブ15から排液しているが、逆に図4の通り、バルブ15を閉、バルブ25を開とし、充填剤スラリー中の液をフィルタ22を透過させてバルブ25を介して排液してもよい。バルブ15,25の双方を開とし、双方のバルブを介して排液してもよい。
その後、図5の通り、バルブ15,25を開とし、バルブ17及び平板栓26は閉のままとし、バルブ15からフィルタ12を通して充填剤層Bへ純水あるいは平衡化バッファーよりなる洗浄液を通液して充填剤層B内に残留する保存液を洗い流す。洗浄排液はバルブ25から排出される。バルブ25を通って排出されてきた排液中の化学薬品濃度が所定量以下になるまで充填剤層Bを洗浄する。この洗浄後、バルブ15,17,25及び平板栓26を閉とする。なお、図5では、洗浄液を固定栓10側から可動栓20側へ上向流で通液しているが、逆に可動栓20側から固定栓10側へ下降流で通液してもよい。
上記のようにして洗浄された充填剤層Bを有するクロマトカラム1を用いてクロマト分離精製を行うことができる。即ち、このクロマトカラムをクロマト送液システムに接続し、精製目的成分の分離精製を行う。
所定回数の分離精製操作を行った後、または充填剤が汚れた場合には、クロマトカラムをクロマト送液システムから外し、充填剤をカラムから抜き出して洗浄化学薬剤、例えばNaOHなどを含む洗浄液で洗浄し、再度、上記と同様にしてカラム2に充填し、クロマト分離精製に使用する。上記説明では、クロマトカラムをクロマト送液システムから外し充填剤を洗浄する場合を例示したが、クロマトカラムをクロマト送液システムに接続したまま上記操作を行っても構わない。
なお、内径1000mmのカラム内に400リットルの充填剤スラリーを導入し、高さ300mmの充填剤層Bを形成する場合、従来法では合計約20日を要していた。また、充填剤層Bの洗浄に要する純水あるいは平衡化バッファー量は1000〜1600リットルであった。
これに対し、図示の本発明方法によると、約1.5〜2.5時間で充填剤層を形成することができ、充填剤層Bの洗浄に要する純水あるいは平衡化バッファー量も400〜800リットル程度であった。
従来法に比べて、本発明の方法は、充填時間を大幅に短縮でき、作業効率の飛躍的向上、洗浄に用いる純水あるいは平衡化バッファー使用料の大幅な低減、および雑菌への曝露のリスク低減を図ることができる。
上記説明は本発明の一例であり、本発明は上記以外の態様とされてもよい。例えば、上記実施の形態では、固定栓10をカラム2の下端側としているが、上下逆とし、固定栓10をカラム2の上端側としてもよい。
上記平板栓26の弁体及び弁座は、テーパ形となっているが、円柱形の弁体を円筒形の弁座に挿抜して閉・開する構成としてもよい。
本発明は、カラム直径が50〜2000mm(好ましくは100〜1600mm)のいずれのカラムについても本発明を使用することができる。ただし、50〜100mm程度であれば手動での操作も可能であるが、カラムが大型の場合は(例えば300mm以上)、人手作業が困難になる上に作業時間が長時間化するほど雑菌混入のリスクが高くなってしまうため駆動手段による機械的操作による自動化が求められる。よって本発明はカラム直径300mm以上(例えば300〜2000mm)のカラムの操作において好適に用いることができる。
1 クロマトカラム
2 カラム
10 固定栓
20 可動栓
15,17,25 バルブ
26 平板栓
2 カラム
10 固定栓
20 可動栓
15,17,25 バルブ
26 平板栓
Claims (4)
- カラム軸心方向を上下方向としたカラムと、
該カラムの一端側に設けられた固定栓と、
該カラム内に設けられた可動栓とを有するクロマトカラムの該カラム内に充填剤スラリーを導入して充填剤層を形成するクロマトカラムの充填剤充填方法において、
該固定栓と可動栓との一方の栓に充填剤スラリーをカラム内に導入可能な充填剤スラリー導入部を設けておき、
該可動栓を固定栓から離反させつつ該導入部を介してカラム内に充填剤スラリーを導入し、
その後、該導入部を閉じ、可動栓を固定栓に接近移動させ、可動栓及び固定栓の少なくとも一方を介して充填剤スラリー中の液を流出させて充填剤層を形成することを特徴とするクロマトカラムの充填剤充填方法。 - 請求項1において、カラム内に導入する充填剤スラリーの圧力によって可動栓を固定栓から離反移動させることを特徴とするクロマトカラムの充填剤充填方法。
- 請求項1又は2において、前記固定栓は前記カラムの下端に設置されており、
該固定栓は、カラム内に臨む面がフィルタにて構成されており、
前記充填剤スラリーの導入部は、該フィルタを貫通する配管と、該配管のカラム側の先端に設けられた平板栓と、該配管に設けられたバルブとを有することを特徴とするクロマトカラムの充填剤充填方法。 - 請求項1ないし3のいずれか1項において、前記充填剤層を形成した後、カラム内に純水又は平衡化バッファーを通水して充填剤層内の液を置換することを特徴とするクロマトカラムの充填剤充填方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016037420A JP2017156130A (ja) | 2016-02-29 | 2016-02-29 | クロマトカラムの充填剤充填方法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017156130A true JP2017156130A (ja) | 2017-09-07 |
Family
ID=59809662
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016037420A Pending JP2017156130A (ja) | 2016-02-29 | 2016-02-29 | クロマトカラムの充填剤充填方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07120449A (ja) * | 1993-10-22 | 1995-05-12 | Sekisui Chem Co Ltd | 液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法 |
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-
2016
- 2016-02-29 JP JP2016037420A patent/JP2017156130A/ja active Pending
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