KR20210143187A - 크로마토그래피 칼럼의 소독 방법 - Google Patents

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안나 그론버그
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Abstract

본 발명은, a) 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼에 분리 수지 입자들의 패킹층 및 이동가능 어댑터를 제공하는 단계; b) 어댑터를 패킹층과 접촉시켜, 패킹층을 통해 칼럼 출구로 소독 유체를 수송하는 단계; c) 패킹층과 어댑터 사이에 갭(gap)을 제공하도록 어댑터를 상승시키는 단계; d) 갭을 폐쇄하도록 어댑터를 하강시키는 단계; 및 e) 패킹층을 통해 칼럼 출구로 평형화 액체를 수송하는 단계를 포함하는, 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼의 소독 방법을 개시한다.

Description

크로마토그래피 칼럼의 소독 방법
본 발명은 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼, 및 보다 특히 소독 유체를 사용한 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼의 소독 방법에 관한 것이다.
미생물 오염은 많은 실험실 및 생산 환경에서 발견된다. 선호되는 조건 하에 빠르게 대량으로 증식하면 이들 미생물은 크로마토그래피 장비 및 크로마토그래피 수지의 성능을 악화시키고 기능을 손상시킬 수 있다. 부가적으로, 미생물은 제작 전반에 걸쳐 바이오산물의 오염물로 남아 있을 수 있으며, 그 결과로서 뱃치(batch) 파손 및 관련 비용이 발생한다. 결과적으로, 전체 생산 프로세스 전반에 걸쳐 위생적인 루틴을 따르는 것이 중요하다. 소독 (미생물 개체군을 감소시키기 위한 화학적 작용제의 사용으로 정의됨)은 바이오산물을 오염시킬 위험을 최소화하는 수준으로 미생물 존재를 유지하기 위해 크로마토그래피 시스템에 보편적으로 사용된다.
소독제 퍼아세트산 (PAA)은, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US20180036445에 논의된 바와 같이, 영양 및 포자-형성 박테리아 둘 모두의 제거에 효율적인 산화제이다. 상기 작용제는 예를 들어 단백질 A(Protein A) 수지 및 대부분의 하드웨어 바이오프로세스 장비와 상용가능하다. 단백질 A 수지를 20 mM 수성 PAA로 30분 동안 또는 30 mM PAA로 15분 동안 처리하는 것은 수지의 정제 성능에 유의하게 영향을 미치지 않고 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 크로마토그래피 수지의 소독을 위해 NaOH 용액이 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2017194593A1 참조).
패킹층(packed bed) 칼럼의 소독이 효과적이기 위해서는, 전체 층 및 모든 액체-접촉 표면이 소독제와 접촉하는 것이 필수적이다. 이는 이동가능 어댑터가 있는 현대 프로세스 칼럼에 있어서 특히 중요한데, 여기서 상단 층 담지체(top bed support)와 칼럼 튜브 사이에 정체 구역이 존재한다.
따라서, 층 내의 수지 전량과 소독제 간 뿐만 아니라 모든 액체-접촉 칼럼 표면과의 효율적인 접촉을 허용하는 패킹층 칼럼 소독 방법이 필요하다.
본 발명의 한 측면은 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼의 소독 방법을 제공하는 것이다. 이는,
a) 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼에 분리 수지 입자들의 패킹층 및 이동가능 어댑터를 제공하는 단계;
b) 어댑터를 패킹층과 접촉시켜, 패킹층을 통해 칼럼 출구로 소독 유체를 수송하는 단계;
c) 패킹층과 어댑터 사이에 갭(gap)을 제공하도록 어댑터를 상승시키는 단계;
d) 갭을 폐쇄하도록 어댑터를 하강시키는 단계; 및
e) 패킹층을 통해 칼럼 출구로 평형화 액체를 수송하는 단계
를 포함하는 방법으로 달성된다.
한 가지 이점은, 층을 재패킹할 필요가 전혀 없이 층의 효율적인 소독이 계내 달성될 수 있다는 것이다. 추가 이점은, 방법이 자동화에 부합하다는 것이다.
본 발명의 추가의 적합한 실시양태는 종속항들에 기재되어 있다.
도 1은 이동가능 어댑터가 있는 바이오프로세스 칼럼의 개략적인 개관을 나타낸다.
도 2는 이동가능 어댑터가 있는 바이오프로세스 칼럼의 사시도를 나타낸다.
도 3은 이동가능 어댑터와 칼럼 벽 사이의 슬라이드가능한 씨일(slidable seal)을 나타낸다.
도 4는 어댑터-칼럼 벽 씰링(sealing)의 대안적인 배열을 나타낸다.
도 5는 하단 층 담지체(bottom bed support)와 칼럼 벽 사이의 씨일을 나타낸다.
도 6은 어댑터 내의 이동상 입구/출구가 있는 상단 밸브 어셈블리를 나타낸다.
도 7은 어댑터 내의 이동상 입구/출구가 있는 상단 밸브 서브어셈블리(subassembly)를 나타낸다.
도 8은 하단 층 담지체 내의 통합된 이동상 및 수지 밸브를 나타낸다.
도 9는 하단 층 담지체 내의 통합된 이동상 및 수지 밸브를 나타낸다.
도 10은 하단 층 담지체 내의 통합된 이동상 및 수지 밸브를 나타낸다.
도 11은 소독 프로세스의 개략도를 나타낸다.
도 12는 조합된 패킹 및 소독 프로세스의 개략도를 나타낸다.
<정의>
청구된 발명의 대상을 보다 명확하고 간결하게 기재 및 나타내기 위해, 하기 설명 및 여기에 첨부된 청구범위에서 사용되는 구체적인 용어들에 대해 하기 정의들이 제공된다.
단수 표현은, 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수형 지시대상을 포함한다. 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 본원에서 사용되는 근사화 용어는, 관련된 기본 기능의 변화를 초래하지 않고, 허용가능하게 다양할 수 있는 임의의 정량적 표현을 변경시키기 위해 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 변경된 값은 명시된 정확한 값으로 제한되어서는 안된다. 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용된 분자량, 반응 조건들 등과 같은 특성들, 성분들의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변경되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기술된 수치 파라미터들은 본 발명의 실시양태들에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성들에 따라 다양할 수 있는 어림값들이다. 최소한 각 수치 파라미터는 적어도, 통상적인 반올림 기술들을 적용함으로써 및 보고된 유효 숫자들의 수치에 비추어 해석되어야 한다.
본 발명을 설명하기 위해 본원에 사용된 바와 같이, "업(up)", "다운(down)", "상향", "하향", "상부", "하부", "상단", "하단", "수직", "수평", "위", "아래" 및 임의의 다른 방향성 용어들은 첨부 도면들에서 해당 방향을 지칭한다.
<실시양태들의 상세한 설명>
도 1-12에 의해 예시된 한 측면에서, 본 발명은 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼의 소독 방법을 개시한다. 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a) 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼(1)에 분리 수지 입자들의 패킹층(4) 및 이동가능 어댑터(2)를 제공함. 어댑터는 예를 들어 하나 이상의 전기 모터(22) 또는 유압 액추에이터에 의해 수직으로 이동가능할 수 있다. 분리 수지는 가교된 폴리사카라이드, 예컨대 가교된 아가로스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 그것은 가교된 합성 중합체, 예를 들어 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 또는 메타크릴레이트 공중합체를 포함할 수 있다. 수지는 리간드, 예컨대 친화성 리간드, 이온 교환 리간드, 다중모드 리간드 및/또는 소수성 리간드를 포함할 수 있다. 특히, 분리 수지에 단백질성 친화성 리간드들이 테터링될 수 있다. 이들 단백질성 친화성 리간드는 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 A의 변이체를 포함할 수 있다. 단백질 A 변이체의 예는 예를 들어 US20170334954, US7834158, US2018094024, US8329860, US9018305, US2013046056, US9040661, US9403883, US20160237124, US2018105560, US2014031522, US2010286373, CN105481954A, US20160159855, US20160159857 및 WO2018029158에 개시된 바와 같은 알칼리-안정한 단백질 A-유래의 리간드를 포함하며, 상기 문헌들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 단백질 A 변이체 리간드를 갖는 상업적으로 입수가능한 분리 수지는 예를 들어 맙셀렉트(MabSelect)TM 수레(SuRe) (지이 헬쓰케어(GE Healthcare)), 맙셀렉트 프리즘에이(PrismA) (지이 헬쓰케어), 에쉬무노(Eshmuno)TM A (이엠디-밀리포어(EMD-Millipore)), 암스피어(Amsphere)TM A3 (제이에스알(JSR)), 토요펄(TOYOPEARL)TM AF-알프로테인(rProtein) A (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)), 칸캡에이(KanCapA)TM (카네카(Kaneka)) 및 프라에스토(Praesto)TM 제티드(Jetted) A50 (푸롤라이트(Purolite))을 포함한다. 칼럼은 이동가능 어댑터가 있는 상업적으로 입수가능한 바이오프로세스 칼럼, 예를 들어 액시크롬(AxiChrom)TM (지이 헬쓰케어), 레졸루트(Resolute)TM (폴(Pall)), 프로크롬(Prochrom)TM (노바세프(Novasep)), 이에이씨-바이오(EAC-Bio) (리슈어 사이언스(Lisure Science)), 이지팩(EasyPack)TM (베르도(Verdot)) 등일 수 있다. 칼럼 (패킹층) 직경은 예를 들어 5 cm - 2 m, 예컨대 10 cm - 2 m 또는 심지어 30 cm - 2 m일 수 있고, 층 높이는 예를 들어 5 cm - 50 cm, 예컨대 8-30 cm일 수 있다. 이동가능 어댑터(2)가 있는 칼럼(1)의 전형적인 구성은 도 1에, 그리고 도 2 내의 실제 상업용 칼럼의 사시 도면으로서 개략적으로 나타나 있다. 분리 수지(4)의 패킹층은 상부(8) 및 하부(10) 다공성 층 담지체들 사이에 원통형 칼럼 튜브(6) 내에 함유된다. 하부 층 담지체는, 칼럼 하단(12)에 의해 담지된 액체 분배기(146) 상에 놓인다. 상부 층 담지체는 액체 분배기(136)를 통해 이동가능 어댑터(2)에 연결되며, 이는 씰링(14)에 의해 칼럼 튜브에 슬라이드가능하게 씰링된다. 씰링(14)의 예는 도 3에 확대되어 나타나 있다. 이 경우에, O-링(32)이 스크래퍼 링(34)을 칼럼 튜브(6)의 안쪽(36)을 향해 압박한다. 도 4는 씰링(14)의 또 다른 예를 나타내며, 여기서 2개의 스크래퍼 링(34, 114, 116)은 O-링(32, 112, 118)에 의해 칼럼 튜브(6)의 안쪽을 향해 압박된다. 이 경우에, 2개의 스크래퍼 링들(34) 사이의 공간(38)과 유체 연결된 세척 채널 (나타내지 않음)이 또한 존재할 수 있어, 이 공간의 플러싱(flushing)이 허용된다. 도 5는 하부 층 담지체(10)와 칼럼 튜브(6)의 하단 단부(42) 사이의 씰링(40)의 확대된 예를 나타낸다. 이는 O-링(44, 46 및 48)에 의해 성취될 수 있다. 칼럼 튜브는 고정된 칼럼 뚜껑(15)으로 덮일 수 있다. 상부 이동상 입구/출구(17) (상부 밸브 어셈블리(16)의 일부를 형성할 수 있음)가 분배기를 통해 상부 층 담지체에 유체 연결되고, 하부 이동상 출구/입구(18)가 분배기를 통해 하부 층 담지체에 유체 연결되어, 이동상이 입구/출구 및 패킹층을 통해 상향 또는 하향 방향으로 통과되는 것을 허용한다. 어댑터는 수직 (축방향) 이동을 위해 하나 이상의 어댑터 로드(rod)(20)에 연결될 수 있다. 어댑터 로드(들)는 로드(들)를 수직으로/축방향으로 이동시키도록 구성된 하나 이상의 액추에이터(22)에 연결될 수 있다. 액추에이터(들)는 예를 들어 하나 이상의 전기 모터 또는 유압 실린더일 수 있다. 대안적으로, 어댑터는 어댑터의 상단 또는 하단 상에 직접 가해지는 유압에 의해 또는 나사고정된(threaded) 로드(들) 상의 모터-구동식 또는 수동적 스크류 작용에 의해 이동될 수 있다. 칼럼에는 칼럼의 패킹 및 언패킹(unpacking)을 위한 하나 이상의 수지 입구/출구(24, 26)가 추가로 구비될 수 있다. 수지 입구들/출구들은 예를 들어 상부 및/또는 하부 층 담지체들을 통해 칼럼의 내부에 연결될 수 있으며, 정상적인 칼럼 작동 동안 입구들/출구들의 폐쇄를 위한 수지 밸브들(30), 및 수지 분배를 위한 노즐들(28)을 가질 수 있다. 수지 및 이동상 입구들/출구들은, 수지 밸브가 폐쇄될 때 흐름이 이동상 입구에서부터 분배기 및 층 담지체를 거쳐 패킹층으로 들어가고, 수지 밸브가 개방될 때 흐름이 수지 입구에서부터 노즐을 거쳐 바로 칼럼 튜브로 들어가도록 서로 통합될 수 있다. 이러한 밸브 및 노즐 구성의 예는 US5902485에 주어져 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 도 6 및 도 7은, 상부 층 담지체(8)의 고정을 위한 중앙 스크류(50) (O-링(52)으로 씰링됨)의 세부사항들과 함께, 이동상 입구/출구(17)를 갖는 상부 밸브 어셈블리(16)의 예를 나타낸다. 이 경우에, 입구/출구는 TC 커넥터(54)를 통해 튜빙(tubing)에 연결될 수 있고, 액체는 O-링(58)으로 씰링된 입구/출구 챔버(56)를 통하여 흐른다. 도 8-10은, 수지 밸브(30) 및 수지 입구/출구(26)와 통합된 하부 이동상 출구/입구(18)를 나타낸다. 여기서, 수지 밸브(30)는 피스톤(60)을 포함하며, 이는 피스톤 팁(62)이 하부 층 담지체(10)와 동일 높이일 때 O-링(64)을 씰링하고 분배기 및 하부 층 담지체를 통해 이동상을 안내한다.
b) 어댑터를 패킹층과 접촉시켜, 패킹층을 통해 칼럼 출구로 소독 유체를 수송함. 소독 유체는 적합하게는 산화제, 예컨대 과산(peracid) (퍼옥시산이라고도 불리움) 또는 과산화수소를 포함할 수 있다. 특히, 소독 유체는 퍼아세트산을 포함할 수 있다. 산화제 (예를 들어, 퍼아세트산)의 농도는 예를 들어 5 - 100 mM, 예컨대 5-50 mM 또는 10-30 mM일 수 있다. 대안적으로, 소독 유체는 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어 NaOH를 포함할 수 있다. 이 경우에, 수산화물의 농도는 0.1 - 2 M일 수 있으며, 0.5 - 2 M 또는 1 - 2 M이 바람직하다. 접촉 시간 (즉, 분리 수지의 패킹층이 소독 유체와 접촉하는 시간)은 예를 들어 10분 - 2시간, 예컨대 10-50분 또는 20-40분일 수 있다. 적합하게는, 온도는 실온 또는 22 +/- 5℃일 수 있다. 소독 유체의 밀도는 예를 들어 0.9 - 1.1 g/ml, 예컨대 1.0 - 1.1 g/ml일 수 있고, 유체의 점도는 예를 들어 1.0 - 2.0 mPaㆍs (22℃에서 측정 시)일 수 있다.
c) 패킹층과 어댑터 사이에 갭을 제공하도록 어댑터를 상승시킴. 갭의 높이는 예를 들어 1 cm - 10 cm, 예컨대 2 cm - 5 cm일 수 있다. 대안적으로, 그것은 층 높이에 대비하여 측정될 수 있으며, 예를 들어 층 높이의 10-40%, 예컨대 층 높이의 15-30%일 수 있다. 어댑터를 상승시키면 어댑터와 칼럼 벽 사이의 슬라이드가능한 씰링 주위의 데드레그(deadleg)와 소독용 유체 간의 개선된 접촉이 허용된다. 특히, 이는 임의의 트랩핑된 수지 입자들이 패킹층 내로 침강되는 것을 허용한다.
d) 갭을 폐쇄하도록 어댑터를 하강시킴. 어댑터는 적합하게는, 예를 들어 압축을 최대 0.04%, 예컨대 0.02-0.03% 증가시키도록 단계 b)에서와 동일한 위치로, 또는 심지어 다소 더 낮은 위치로 하강시킬 수 있다. 압축 증가는 개선된 칼럼 효율을 제공한다.
e) 패킹층을 통해 칼럼 출구로 하나 이상의 평형화 액체를 수송함. 평형화 액체는 칼럼 보관에 적합한, 예를 들어 정균 용액 (예를 들어, 20% 수성 에탄올)일 수 있다. 칼럼이 나중에 분리를 위해 즉시 사용되어야 하는 경우, 평형화 액체는 물 또는 수성 완충액, 예컨대, 의도된 크로마토그래피 단계에 적합한 평형화 완충액일 수 있다.
어댑터가 슬라이드가능한 씰링들 사이에 플러시 채널(flush channel)을 갖는 경우, 방법은 이 플러시 채널을 소독 유체로 충전하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이 소독 유체 (플러시 채널 소독 유체라 불리울 수 있음)는 잠재적으로 민감한 분리 수지와 접촉하지 않기 때문에, 적합하게는 더 높은 농도의 산화제, 예컨대 퍼아세트산, 예를 들어 50-150 mM 또는 70-120 mM의 퍼아세트산을 함유할 수 있다. 플러시 채널을 소독 유체로 충전하는 것은 적합하게는, 어댑터의 이동 동안 칼럼 벽이 소독되도록 단계 c) 이전에 수행될 수 있다. 이어서, 단계 e) 이전 또는 이후에, 플러시 채널을 적합하게는 평형화 액체로 세척한다.
특정 실시양태에서, 방법은, 단계 d)와 e) 사이에, 패킹층을 통해 칼럼 출구로 상기 논의된 바와 같은 소독 유체를 수송하는 단계 d')를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 c) 및 d)는 적어도 1회, 예컨대 2회 반복된다. 이는 소독용 유체와 어댑터 씰링 데드레그들 간의 접촉을 추가로 개선시킨다.
특정 실시양태에서, 방법은, 단계 b) 이후 및 단계 e) 이전에, 칼럼 수지 밸브를 폐쇄 및 개방 (또는 개방 및 폐쇄)하는 단계 b')를 추가로 포함한다. 이는, 소독용 액체가 밸브의 씰링 표면들 아래로 침투하는 것을 추가로 보장할 수 있다. 적합하게는, 칼럼을 통과하는 흐름을 이 단계 전에 중지시키고 그 이후에 재개한다. 이들 실시양태에서, 칼럼 수지 밸브를 폐쇄/개방 전에 소독 용액으로 평형화시킨 것이 유리하다.
일부 실시양태에서, 단계 b) 이전에, 분리 수지의 패킹층이 있는 칼럼을 생물제약의 분리를 위해 사용할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 단계 e) 이후에, 분리 수지의 패킹층이 있는 칼럼을 생물제약의 분리를 위해 사용한다. 생물제약은 예를 들어 면역글로불린, 예컨대 모노클로날 항체일 수 있으나, 그것은 또한 재조합 단백질 또는 예를 들어 백신 항원일 수 있다. 이들 실시양태의 변형양태에서, 단계 b) 이전에, 분리 수지의 패킹층이 있는 칼럼을 제1 생물제약의 분리를 위해 사용할 수 있고, 단계 e) 이후에, 분리 수지의 패킹층이 있는 칼럼을 제1 생물제약과 상이한 제2 생물제약의 분리를 위해 사용할 수 있다. 제1 및 제2 생물제약은 예를 들어 2종의 상이한 모노클로날 항체일 수 있다.
실시예
시험감염 유기체로서 P. 아에루기노사(aeruginosa)를 사용하는 삼중 연구에 의해, 맙셀렉트TM 수레 단백질 A 수지 (지이 헬쓰케어)에서 사용된 바와 같은, 아가로스 비드들로 패킹된 액시크롬TM 300 칼럼 (지이 헬쓰케어)에서 소독제로서의 퍼아세트산 (PAA)에 기반한 미리 정의된 소독 방법을 평가하였다. 수지를 포함한 프로세스 흐름과 접촉하는 모든 부분을 사전-세정하고, 시험감염시키고, 소독하고, 평가하였다. 미생물 샘플링은 시스템 상의 미리 결정된 부위에서 수행되었다. 실행 동안 프로세스 챔버로부터, 및 소독 방법을 마무리한 후 플러시 채널, 프로세스 챔버 및 수지 밸브로부터 샘플들을 통과하는 흐름을 수집하였다. 5 내지 6일의 세정 유지(clean hold) 후 샘플들을 통과하는 추가의 흐름을 수집하였다. 사용된 시험 방법은 아래에 제시되어 있다. 결과는 적시된 허용 기준에 대해 평가되었다.
시험된 항목:
액시크롬 300/300 칼럼, 일련 번호 28976588, 300 mm 직경 아크릴 튜브, 스테인레스 스틸 층 담지체들.
연구 1: 상단 및 하단 층 담지체들에서 10 ㎛ 네트
연구 2 및 3: 273*2.62 mm EPDM O-링 (art. no. 29-1659-36)과 함께 상단 층 담지체에서 20 ㎛ 네트 및 하단 층 담지체에서 10 ㎛ 네트
샘플링 지점에 직접 또는 간접 연결되고 프로세스 스트림과 접촉하는 모든 O-링이 새 것들로 교체되었다. 새로운 O-링들은 모든 3개의 실험 연구에서 사용되었다.
샘플링된 하드웨어 부분:
표 1 및 도 4-10 참조.
시험감염 유기체(들):
슈도모나스 아에루기노사, ATCC 9027, 그람 음성 박테리아
시험감염 유기체의 농도:
1x107 CFU/ml 또는 CFU/유닛 (CFU = 집락 형성 유닛)
소독제:
퍼아세트산, 밸브에서 및 패킹층에 걸쳐 20 mM 수용액. 플러시 채널에서 100 mM.
수지:
40 내지 130 ㎛의 체거름(sieving) 천들로 체거름된, 85 ㎛의 부피-가중치 중간 직경 (d50,v)의 고도로 가교된 구형 아가로스 비드들.
시스템 및 칼럼의 제조
사전-세정 프로세스로서, 해체될 수 있는 모든 칼럼 부분들 (칼럼 뚜껑, 튜브, 바닥, 및 어댑터 배킹(backing) 플레이트 제외)을 1 M NaOH-용액 중에 24시간 동안 담근 다음, 멸균 정제수로 헹군 후 어셈블리하였다.
칼럼의 나머지 부분 (즉, 칼럼 뚜껑, 바닥, 및 어댑터 배킹 플레이트)을 70% 에탄올로 분무하고, 칼럼 튜브를 20% 에탄올로 닦은 후 어셈블리하였다.
칼럼 부분들을 1 M NaOH 중에 24시간 동안 담그기 전에, 스크류들 및 너트들과 같은 작은 부분들을 제외하고는, 연구 2 및 3에서 사용된 모든 부분들을 2% 세제 용액 (YES)으로 문지르거나 닦았다. 스테인리스-스틸 층 담지체들은 40℃에서 2 * 15분 동안 1 M NaOH가 있는 초음파조에서 세정하였다.
연구 3에서는, 층 담지체들용 패스너(fastener)들을 포함한 모든 스크류 상의 나사 씨일 테이프인 PTFE를 교체한 다음, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브하였다.
그 크기로 인해 가능한 경우, 칼럼 부분들을 LAF-후드에서 어셈블리하였다. 어셈블리 동안에 부분들을 70% 에탄올로 분무하였다. 이 에탄올은 연구 2 및 3에서 클러시드(Klercide)TM 70/30 변성 에탄올로 교체되었다.
또한, 애크타(AEKTA)TM 프로세스 스키드(skid) (지이 헬쓰케어)를 먼저 20 mM PAA로 플러싱한 다음 1 M NaOH로 충전하고 밤새 방치함으로써 사전-세정하였다.
액시크롬 300 칼럼을 수지로 패킹
패킹을 위한 칼럼을 준비하기 위해, 칼럼을 칼럼 튜브가 충전될 때까지 정제수를 상향류 펌핑함으로써 공기로부터 퍼징하였다. 이 절차 동안 어댑터는 그의 프라이밍(priming) 위치에 있었다. 그 후에, 칼럼을 0.3 bar의 압력을 달성하도록 수동으로 조절한 후 흐름을 유로 내 다이어프램(diaphragm) 밸브 및 칼럼을 통해 상향 적용시켰다. 이어서, 흐름을 여전히 유지하면서 어댑터를 40 cm/h로 끌어 내리고, 플러시 채널들을 어댑터가 튜브 내 프라이밍 홈(groove)을 통과할 때까지 개방된 채로 두었다. 어댑터를 약 40 cm (연구 3) 높이에서 중지시킨 다음, 칼럼 튜브를 1 M NaOH로 충전하고 밤새 보관하였다. 그 후, 칼럼을 정제수로 평형화시키고, 어댑터를 하단 층 담지체로부터 1 cm인 시작 위치까지 아래로 이동시켰다.
그런 다음, 칼럼을 시험감염 유기체로 접종된 패킹 용액으로서 50 mM NaCl을 사용하여 수지로 패킹하였다. 패킹은 액시크롬 마스터 제어 유닛을 사용하여 수동으로 수행되었다. 모든 수지가 칼럼으로 추격 진입하였기 때문에 어댑터를 초창기에는 300 cm/h로 및 말엽에는 약 100 cm/h로 상승시킴으로써 감염된 수지의 균질 슬러리가 칼럼 내로 들어갔다. 추격은 어댑터를 여전히 칼럼에서 상향 이동시키면서 50 mM NaCl (연구 1 및 3) 또는 20 mM PAA (연구 2)를 슬러리 탱크 내로 부음으로써 수행되었다. 이어서, 수지 밸브를 폐쇄하고, 밸브 및 튜빙을 수지 없이 20 mM PAA를 사용하여 헹궜다.
어댑터가 60 cm/h로 목표 층 높이 10 cm까지 하향 구동하면서 하단 이동상이 개방된 채로 패킹이 시작되었지만, 실제 층 높이는 9.7 - 10.2 cm 사이였다. 실제 층 높이는 위생적인 실험실에서 패킹 전 지능형 패킹으로 액시크롬 300/500 칼럼에서 정제수에서 수지가 패킹되었을 때 달성된 층 높이로 결정되었다. 액시크롬 300/500에서 패킹된 층들에 대해 1 M NaOH를 사용한 CIP를 수행한 다음, 멸균 여과된 50 mM NaCl에서 언패킹하고, 이어서 이 슬러리를 상기 기재된 바와 같이 위생적인 실험실에서 패킹하였다.
수지의 감염을 위한 준비
P. 아에루기노사 ATCC 9027 (인-하우스(in-house) 글리세롤 스톡(stock))로 스트리킹된 TSA 플레이트들을 37℃에서 밤새 (O.N.) 인큐베이션하였다. 상기 플레이트들로부터의 신선한 콜로니들을 200 mL의 TSB-배지로 옮기고, 37℃에서 O.N. 진탕한 채 두었다. 접종물들의 측정된 광학 밀도 (OD), 및 P. 아에루기노사의 경우 1 OD
Figure pct00001
2x109 CFU/mL라는 가정에 기반하여, 50 mM NaCl 중에 현탁된 수지 슬러리에 첨가할 접종물에 필요한 부피들에 대해 계산하였다. 그 목적은 시험감염 유기체 현탁액들 중의 대략 ~107 CFU/ml의 최종 농도에 도달하는 것이었다. 미생물 농도들은 시험 방법 5로 결정되었다.
소독 절차
연구 1:
수지를 층 높이 9.7 cm까지 패킹하였다. 패킹층을 멸균 정제수, 2 칼럼 부피 (CV), 하향류, 60 cm/h에 이어 20 mM PAA 하향류, 120 cm/h로 4분 동안 헹구는 것으로 소독 연구가 시작되었다. 20 mM PAA를 150 cm/h의 하향류로 층을 통해 푸싱하면서 어댑터를 120 cm/h로 14 cm까지 상향 이동시켰다. 흐름을 중단시키고, 어댑터를 60 cm/h로 9.7 cm까지 하향 이동시켜 과잉의 액체를 하단 이동상을 통해 푸싱 제거하였다. 300 cm/h로 20 mM PAA를 사용하여 하향류를 가동시킴으로써 PAA 처리를 마무리하였다. 이어서, 흐름을 중단시킨 다음, PAA 처리된 층을 15분 동안 인큐베이션한 후, 정제수를 사용한 평형화를 2 CV에 대해 300 cm/h의 하향류를 가동시킴으로써 시작하였다.
이와 같은 첫 번째 소독 연구 동안에 다음에서 액체 샘플들을 수집하였다: 패킹의 압밀상(consolidation phase), 이어서 패킹 후 2 CV의 물로 헹굼 시, 및 마지막으로 방법 말엽에 2 CV의 정제수로 평형화 후.
연구 2:
칼럼을 패킹하기 전에 플러시 채널 (상부 및 하부 스크래퍼 씨일들 사이의 영역)을 시린지를 사용하여 100 mM PAA로 충전한 다음, 수지를 층 높이 10.2 cm까지 패킹하였다. 패킹층을 멸균 정제수, 2 CV, 하향류, 60 cm/h에 이어 20 mM PAA 하향류, 120 cm/h로 4분 동안 헹구는 것으로 소독 연구가 시작되었다. 20 mM PAA를 150 cm/h의 하향류로 층을 통해 푸싱하면서 어댑터를 120 cm/h로 14.5 cm까지 상향 이동시켰다. 흐름을 중단시키고, 어댑터를 60 cm/h로 10.2 cm까지 하향 이동시켜 과잉의 액체를 하단 이동상 출구/입구를 통해 푸싱 제거하였다. 20 mM PAA를 4분 동안 120 cm/h의 하향류로 가동시킴으로써 어댑터 이동을 반복하였다. 20 mM PAA를 150 cm/h의 하향류로 층을 통해 푸싱하면서 어댑터를 120 cm/h로 14.5 cm까지 상향 이동시켰다. 흐름을 중단시키고, 어댑터를 60 cm/h로 10.2 cm까지 하향 이동시켜 과잉의 액체를 하단 이동상 출구/입구를 통해 푸싱 제거하였다.
2 CV에 대해 300 cm/h로 20 mM PAA를 사용하여 하향류를 가동시킴으로써 PAA 처리를 마무리하였다. 흐름을 중단시킨 다음, PAA 처리된 층을 5분 동안 인큐베이션한 후, 정제수를 사용한 평형화를 2 CV에 대해 300 cm/h의 하향류를 가동시킴으로써 시작하였다.
두 번째 소독 연구 동안에 다음에서 액체 샘플들을 수집하였다: 패킹의 압밀상, 이어서 패킹 후 2 CV의 물로 헹굼 시, 및 마지막으로 방법 말엽에 2 CV의 정제수로 평형화 후. 소독 방법 후에 패킹층 및 수지 밸브를 20% 에탄올로 평형화시키고, 2 CV (패킹층의 경우) 및 5 L (수지 밸브의 경우) 이후 액체 샘플들을 수집하였다. 플러시 채널 내의 100 mM PAA를 pH가 증가할 때까지 20% 에탄올로 헹궈낸 다음, 액체 샘플을 수집하였다.
이어서, 칼럼을, 애크타 프로세스 스키드에 연결되면서 5일의 "세정 유지"를 위해 보관 용액 (20% 에탄올)과 함께 위생적인 실험실에 두었다. 그 후 수지 밸브 내의 에탄올의 액체 샘플을 수집한 다음, 20% 에탄올을 패킹층을 통해 60 cm/h의 하향류로 가동시키고, 0.6 CV 및 1.2 CV 이후 액체 샘플들을 수집하였다. 플러시 채널 내의 액체를 또한 수집하였다.
연구 3:
칼럼을 패킹하기 전에 플러시 채널 (상부 및 하부 스크래퍼 씨일들 사이의 영역)을 시린지를 사용하여 100 mM PAA로 충전한 다음, 수지를 층 높이 10.1 cm까지 패킹하였다. 패킹층을 멸균 정제수, 2 CV, 하향류, 60 cm/h에 이어 20 mM PAA 하향류, 120 cm/h로 4분 동안 헹구는 것으로 소독 연구가 시작되었다. 20 mM PAA를 170 cm/h의 하향류로 층을 통해 푸싱하면서 어댑터를 120 cm/h로 14.4 cm까지 상향 이동시켰다. 흐름을 중단시키고, 어댑터를 60 cm/h로 10.1 cm까지 하향 이동시켜 과잉의 액체를 하단 이동상 출구/입구를 통해 푸싱 제거하였다. 20 mM PAA를 4분 동안 120 cm/h의 하향류로 가동시킴으로써 (패킹층 내로 PAA ~ 3 cm) 어댑터 이동을 반복하였다. 흐름을 중단시키고, 수지 밸브 피스톤을 6초 이내에 2회 개방 및 폐쇄하였다. 20 mM PAA를 170 cm/h의 하향류로 층을 통해 푸싱하면서 어댑터를 120 cm/h로 14.4 cm까지 상향 이동시켰다. 흐름을 중단시키고, 어댑터를 60 cm/h로 10.1 cm까지 하향 이동시켜 과잉의 액체를 하단 이동상 출구/입구를 통해 푸싱 제거하였다.
2 CV에 대해 300 cm/h로 20 mM PAA를 사용하여 하향류를 가동시킴으로써 PAA 처리를 마무리하였다. 이어서, 흐름을 중단시킨 다음, PAA 처리된 층을 5분 동안 인큐베이션한 후, 정제수를 사용한 평형화를 2 CV에 대해 300 cm/h의 하향류를 가동시킴으로써 시작하였다.
세 번째 소독 연구 동안에 다음에서 액체 샘플들을 수집하였다: 패킹의 압밀상, 이어서 패킹 후 2 CV의 물로 헹굼 시, 및 마지막으로 방법 말엽에 2 CV의 정제수로 평형화 후. 소독 방법 후에 패킹층 및 수지 밸브를 20% 에탄올로 평형화시키고, 2 CV (패킹층의 경우) 및 3 L (수지 밸브의 경우) 이후 액체 샘플들을 수집하였다. 플러시 채널 내의 100 mM PAA를 pH가 증가할 때까지 ~150 ml의 20% 에탄올로 헹궈낸 다음, 액체 샘플을 수집하였다.
이어서, 칼럼을, 애크타 프로세스 시스템에 연결되면서 6일의 "세정 유지"를 위해 보관 용액 (20% 에탄올)과 함께 위생적인 실험실에서 인큐베이션하였다. "세정 유지" 후 임의의 액체 샘플들을 수집하기 전에 시스템을 20 mM PAA로 플러싱한 다음, 20% 에탄올로 평형화시켜 애크타 프로세스 시스템으로부터의 오염물의 위험을 최소화하였다. 수지 밸브 내의 에탄올의 액체 샘플을 수집한 다음, 20% 에탄올을 패킹층을 통해 60 cm/h의 하향류로 가동시키고, 0.6 CV 및 1.2 CV 이후 액체 샘플들을 수집하였다. 여과된 20% 에탄올의 액체 샘플을 또한 대조군으로서 상단 이동상 입구/출구로부터 수집하였다. 플러시 채널 내의 액체를 또한 수집하였다.
미생물 샘플링
미리 결정된 부위들에서 샘플들을 취하였다.
미생물학적 샘플링을 위한 칼럼의 해체
모든 액체 샘플이 수집되었을 때 여러 칼럼들 부분들의 샘플링을 시작하였다. 샘플링 지점들은 표 1 및 도 4-10에 기재되어 있다. 해체가 시작되기 전에 과잉의 액체를 패킹층에서부터 하단 이동상 출구/입구에 걸쳐 배수시켰다. 이어서, 칼럼을 위생적인 실험실에서 칼럼의 상단 유닛이 슬링(sling)들로 셀링(celling) 내 견고한 고정부에 고정될 수 있는 위치까지 이동시켰다. 그런 다음, 상부 힌지(hinge)를 이완시키고, 하단 플랜지(flange) 볼트를 제거하고, 어댑터가 100-200 cm/h로 아래로 이동하였을 때 패킹층의 샘플링이 가능해졌다. 이 해체 방법으로 ~8 cm의 개구부를 얻는 것이 가능해졌으며, 이어서 이를 통해 대부분의 수지가 플라스틱 스푼으로 제거되었다. 그런 다음, 미리 결정된 부위들 중 몇몇을 더 샘플링할 수 있었다. 이어서, 어댑터를 다시 시작 위치 (패킹층의 높이)로 이동시키고, 하단 플랜지 볼트들 및 상부 힌지를 다시 제자리에 놓았다. 그런 다음, 액시크롬 마스터(AxiChrom Master)의 유지관리 마법사(Maintenance wizard)를 사용하여 일반적인 방식으로 칼럼을 해체하였다. 칼럼 튜브가 스윙 아웃(swing out) 위치에 있으면, 샘플링되었어야 할 더 작은 부분들, 예를 들어 층 담지체들 또는 상단 입구를 제거하였고 LAF-후드에서 샘플링을 수행하였다.
대부분의 샘플링은 위생적인 실험실에서 LAF 내에서 실시되었다. 나머지 부분들은 위생적인 실험실에서 LAF 밖에서 샘플링되었다. 시스템 부분들은 가능한 가장 무균적인 방식으로 취급되었다. 소독 프로세스에서 사용된 모든 용액을 또한 분석하였다.
미생물 샘플링은 하기 방법들 중 하나에 의해 수행되었다:
시험 방법 1, 미생물 공기 샘플링
공기중 미생물들을 위한 공기의 샘플링은 미생물 공기 샘플러(Microbial Air Sampler; MAS)로 수행되었다. 아가(agar) 플레이트가 로딩된 MAS를 적합한 측정 지점에 위치시킨다. 측정이 시작될 때, 미리 정의된 부피의 주변 공기를 기계를 통해 통과시킨다. 미생물들이 충돌에 의해 아가 표면 상에 수집될 것이다.
시험 방법 2, 직접 여과
샘플 용액들 (최소 10 mL)을 멸균 튜브들 내에 수집한 다음, 0.45 ㎛의 셀룰로스 니트레이트 막 여과기들을 통해 여과하였다. 여과기들을 30-35℃에서 5일 동안 아가 플레이트들 상에서 인큐베이션한 후 플레이트들을 CFU에 대해 검사하였다.
시험 방법 3, 스왑(swab)
표면 샘플들을 스왑으로 취했다. 스왑을 등장성 스왑 헹굼 용액을 함유하는 튜브에 삽입하고, 최소 20초 동안 와류시켰다. 스왑들을 포함하는 용액들을 페트리(Petri) 접시들에 붓고, 온도 제어된 용융 아가 30 mL와 혼합하였다. 용융 아가의 최대 온도는 45℃이어야 한다. 고형화 후, 플레이트들을 30-35℃에서 5일 동안 인큐베이션한 후 플레이트들을 CFU에 대해 검사하였다.
시험 방법 4, 펩톤수 여과
탈착가능한 부분들을 무균적으로 제거하고, 50 mL의 멸균 펩톤수로 후속적으로 충전된 멸균 튜브로 옮긴 다음, 실온 (RT)에서 280 rpm으로 적어도 20분 동안 격렬하게 진탕하였다. 용액들을 0.45 ㎛의 셀룰로스 니트레이트 막 여과기를 통해 여과하였다. 여과기들을 30-35℃에서 5일 동안 아가 플레이트들 상에서 인큐베이션한 후 플레이트들을 CFU에 대해 검사하였다.
시험 방법 5, 생균수
시험감염 유기체 현탁액들의 샘플들을 0.9% NaCl 중에서 연속적으로 희석하였다. 희석된 현탁액들로부터의 샘플들을 아가 플레이트들 상에 도말하고, 30-35℃에서 1-2일 동안 인큐베이션한 후 플레이트들을 CFU에 대해 검사하였다. 샘플링된 현탁액에서 시험감염 유기체의 농도를 결정하였다.
시험 방법 6, 아가 플레이트
크로마토그래피 수지의 샘플을 소독 후 취하고, 30 ml의 용융 아가와 혼합하였다.
1 그램의 수지를 멸균 용기 내로 무균적으로 옮겼다. 용기에 용융 아가를 무균적으로 첨가하고, 수지와 혼합하여 균일하게 현탁되었다. 용융 아가의 최대 온도는 45℃이어야 한다. 현탁액을 페트리 접시들로 옮기고 거기에서 고형화시켰다. 플레이트들을 30-35℃에서 5일 동안 인큐베이션한 후 플레이트들을 CFU에 대해 검사하였다.
허용 기준
ㆍ 시험감염 유기체 농도가 적용된 현탁 수지 용액에서 106 CFU/mL보다 더 높아야 함.
ㆍ 소독 절차 (5-6일의 세정 유지 포함)를 마무리한 후 취한 액체 샘플들 (L - T)은 시험감염 유기체를 포함한 오염성 유기체들 10 CFU/10 mL의 최대 농도를 가져야 함. 연구 2 및 3 내의 하드웨어 상에서 취한 샘플들로부터의 결과들은 고려되지 않을 것임.
ㆍ 액체 샘플들 (L - T)이 음성 (0 CFU/10 mL)인 경우, 연구 2 및 3 내의 하드웨어 상에서 취한 샘플들 중 최대 10%, 즉, 5개의 샘플들이 시험감염 유기체들을 포함한 유기체들로 오염되는 것이 허용됨.
결과
표 1에는, 샘플 지점들, 액체 샘플들 및 대조군 샘플들을 포함한 소독 연구 1 내지 3으로부터의 결과들이 제시되어 있다. 발견된 오염들은 표 내의 제1 열에 이름으로 제시되어 있다. 샘플 지점들은 문자 또는 수치로 표기되었고, 도 4-10에 시각적으로 제시되어 있다.
표 1. 결과
*TNTC = 지나치게 많아서 셀 수 없음
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
디자인 논의
소독 연구가 시작되기 전에 이동가능 어댑터 디자인의 하나의 특정 부분은 아마도 세정하기가 보다 어려울 것으로 생각되었다. 그것은 상단 층 담지체와 칼럼 튜브 사이에 형성되는 데드레그이다. 이와 같은 디자인 위험은 이동가능 어댑터가 있는 프로세스 칼럼에 있어서 일반적이다.
본 소독 연구의 중요한 특징은, 먼저 균질한 수지 슬러리에 시험감염 유기체를 접종시킨 다음, 칼럼 내에 패킹한다는 것이다. 이는 칼럼의 모든 중요한 부분이 고농도의 P.a로 시험감염되도록 한다. 보다 간단한 연구에서는, 칼럼이 패킹된 후 이동상을 통해 시험감염 유기체들을 적용하였으므로, 예를 들어 데드레그가 적절히 시험감염되었는지가 불분명하다.
소독 연구
세 가지 소독 연구를 수행하였다. 마지막 연구만이 완료된 것으로 간주되었고, 적시된 허용 기준에 대해 승인되었다. 첫 번째 연구는 모든 기준을 충족시키지는 못하였다. 두 번째 연구는, 칼럼이 올바르게 시험감염되었지를 밝히기 위한 대조군 샘플이 부족하였다. 이 샘플 (표 1 내의 G로 표기됨)로부터, 칼럼이 106 내지 107 범위의 예상 값 대신에 0 CFU/mL로 시험감염되었음이 밝혀졌다. 이 결과에 대한 가장 유력한 원인은, 마지막 수지가 칼럼으로 추격 진입하는 동안의 PAA의 사용 및 그로 인해 시험감염 유기체의 농도가 검출될 수 없었던 수준까지 감소하였다는 것이다.
준비된 사전-오염된 수지 현탁액 중의 시험감염 유기체의 농도는 106 내지 108 CFU/mL의 예상 범위 내에 있었다. 완성된 압밀 후 취한 양성 대조군 (표 1 내의 샘플 G)은 연구 1 및 3에서의 수지의 적용 전과 동일한 범위 내에 있었다. 이전에 언급된 바와 같이, 연구 2 내의 상응하는 샘플은 아마도 20 mM PAA를 사용한 추격으로 인해 0 CFU/mL를 나타냈다.
1.9 CV의 멸균수를 사용한 헹굼 (표 1 내의 샘플 J)은 시험감염 유기체의 농도에 대해 log 3의 양호한 감소 효과를 나타냈다.
연구 1 내의 많은 곳에서 오염이 발견되었다. 샘플 지점(16) (층 담지체 스틸 링과 하부 스크래퍼 씨일 사이의 하부 O-링의 표면에 해당됨)에서는, 오염이 시험감염 유기체와 동일한 모폴로지를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 샘플 지점은 프로세스 스트림과 접촉한다. 다른 유기체들과 함께 시험감염 유기체가 다른 스폿(spot)들 상에서 또한 발견되었다. 연구 1은 허용 기준을 충족시키지 못했다.
연구 2 내의 4개의 샘플 지점에서 오염이 발견되었으며, 이들 중 어느것도 시험감염 유기체가 아니었고 프로세스 스트림과 접촉하지 않았다. 연구는 허용 기준은 충족시켰지만, 양성 대조군 (표 1 내의 샘플 G)에 시험감염 유기체가 보이지 않았기 때문에 이 연구는 칼럼 및 수지가 소독될 수 있음을 입증하는데 사용될 수 없다.
연구 3에서는 시험감염 유기체가 발견되지 않았다. 프로세스 스트림과 접촉하지 않은 2개의 다른 오염만이 발견되었다 (표 1 내의 샘플 3 및 27). 샘플 3에서의 오염 (수지에 위치함)은 인간 피부 상에서 흔한 그람-양성 구균인 미크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus)/리래(lylae)였다. 샘플은 이 샘플에 필요한 LAF 밖에서 부분적으로 취하고 취급하였다. 이러한 이유로 샘플은 오염될 위험이 더 높아졌다. 샘플 3에서와 동일한 유기체들인 샘플 27 내의 오염이 외부 스틸 링의 상단에서 발견되었다. 이에 대한 원인을 찾는 것은 어렵지만, 가장 유력한 이유는 오퍼레이터에 의한 취급일 수 있다. 그러나, 이 연구는 허용 기준을 충족시켰으므로 승인되었다.
모든 세 가지 연구에서 취한 공기 샘플들이 위생적인 실험실에서 7 내지 59 CFU/m3 사이의 정상 수준의 공기중 미생물 적재량을 나타냈다. 이는, 실험 절차들이 양호한 수준 (위생적이고 무균적인 실시가 되는 경우)에서 수행되었음과 공기중 유기체들에 의한 샘플들의 오염 위험이 낮았음을 나타낸다.
표 1 내의 대조군 샘플들 74 내지 82는, 재료들 및 절차들이 연구를 탈락시킬 위험을 제기하지 않았음을 나타낸다.
전체 연구 동안에 소독 방법은 여러 실행들 간에 개량되었다. 연구 1로부터의 미생물학적 샘플링 결과들로부터, 수지 밸브, 플러시 채널, 및 어댑터와 칼럼 튜브 사이의 데드레그와 관련된 영역들에서 시험감염 유기체가 발견되었기 때문에 방법을 수정해야 함을 알 수 있다.
두 번째 연구에 앞서, 액시크롬 300 칼럼을 리보플라빈과 혼합된 수지로 패킹함으로써 일부 추가의 실험들을 수행하였다. 이 실험으로부터의 결과로부터, PAA 처리 동안의 이중 어댑터 스트로크(stroke)들이 어댑터와 칼럼 튜브 사이의 데드레그에서 액체가 교환될 기회를 증가시킬 수 있었다는 결론에 도달하게 되었다.
수지 밸브의 문제는, 시험감염 유기체가 피스톤과 씰링 O-링 사이에 껴서 발생할 가능성이 가장 유력하였다. 충전 말엽에 피스톤이 폐쇄될 때, 접종된 슬러리의 일부가 껴서, 수지 밸브의 나머지 부분을 헹구고 20 mM PAA로 충전하더라도 제거할 수 없었다.
플러시 채널과 연관된 오염물들의 문제는, 연구가 노후 칼럼 튜브가 있는 칼럼에서 수행되었다는 사실 때문일 수 있다. 아크릴 튜브에 경미한 스크래치들이 있는 경우, 특히 어댑터가 이동하면서 프로세스 챔버로부터의 액체가 플러시 채널로 들어갈 수 있는 위험이 약간 있다.
이들 결론은, 연구 2에 사용된 방법에서 세 가지 주요 변화로 이어졌다.
먼저, 피스톤과 씰링 O-링 사이에 시험감염 유기체 트랩이 생기는 것을 방지하기 위해 칼럼의 충전 말엽에 20 mM PAA로 슬러리를 추격하였다. 아울러, 플러시 채널을 100 mM PAA로 충전하였으며, 이는 거의 즉시 대부분의 오염물을 사멸시켜야 한다. 방법은 또한, 층의 PAA 처리 동안 어댑터와 이중 스트로크들을 포함하도록 변형되었다.
마지막 연구 (실행 3)에서, 두 번째 연구와 비교한 주요 변화는, 충전 동안 슬러리의 추격이 PAA 대신에 50 mM NaCl로 수행되었다는 것이었다. 어댑터의 제2 스트로크 동안 수지 밸브 피스톤을 2회 개방 및 폐쇄함으로써, 수지 밸브 내의 씰링 O-링과 피스톤 사이에 오염물들이 트랩핑되는 잠재적인 문제가 해결되었다. 이 단계에서 피스톤과 그의 O-링의 양측에 20 mM PAA가 존재할 것이며, 일단 개방되면 임의의 트랩핑된 오염물들이 20 mM PAA로 처리될 것이다.
방법의 이와 같은 반복은 궁극적으로 연구 3의 성공적인 결과로 이어졌다.
방법 고려사항/개선
이 보고서에 기재된 소독 연구들은 주로, 이동가능 어댑터가 있는 액시크롬 칼럼 또는 기타 칼럼에서 예를 들어 맙셀렉트/맙셀렉트 수레를 소독할 수 있는 방법의 개발에 중점을 두었다. 소독 방법의 실행 후 패킹층의 안정성 또한 중요한 요인이다. 어댑터를 수 회 승강시키고 층으로 패킹한다는 사실이 층 완전성(integrity)에 어느 정도 영향을 미칠 수 있다. 이것이 문제인 경우 해결책은, 칼럼 안쪽의 층을 유동화시킨 다음 그것을 초기 층 높이까지 패킹하는 것일 수 있다. 여러 수지들이 매우 유망한 결과들과 함께 유동화 기술을 사용하여 평가되었으며, 층들이 안정한 것으로 입증되었다. 이 정보에 기반하여, 권장사항은, 층이 소독되고 PW로 평형화된 후에 플러시 채널을 100 mM PAA로 충전한 다음, 어댑터를 상향 이동시키고, 칼럼 안쪽의 유동화에 이어 재패킹(repacking)을 위한 압밀 및 압축을 수행하는 것일 것이다. 압축은 적합하게는, 칼럼 효율을 완전히 복원하도록, 소독 전의 압축과 비교하여 최대 0.04%, 예컨대 0.02-0.03% 증가될 수 있다.
마지막 연구에서 사용된 방법의 개략적인 사진을 도 12에서 볼 수 있다. 방법에 대한 보다 일반적인 설명에 대해서는 도 11을 참조하기 바란다.
방법의 도해는, 방법이 단계(202)에서 패킹층으로 시작되므로 새로운 수지를 처음으로 패킹할 때나 이미 생산 중인 칼럼들에 대해 모두 사용될 수 있음을 나타낸다.
소독 방법을 개발하는 동안 방법들의 모든 단계를 완전히 최적화할 시간이 충분하지 않았다. 속도를 증가시킴으로써 아마도 PAA와의 접촉 시간을 감소시킬 수 있었겠지만, 보다 높은 층 높이는 매우 높은 유속을 견디지 못할 수 있음을 기억하기 바란다. 여러 단계들에서의 최적화에 대한 몇몇 제안사항은 하기일 수 있다:
단계(308)에서, 수지에 대해 명시된 최대값에 가까운 유속의 물로 헹군다.
단계(310)에서, 유속을 증가시키고/거나, PAA가 패킹층 내로 푸싱되는 시간/거리를 감소시킨다.
단계(312)에서, 단계(310) 및 (312)에서 사용된 유속보다 더 낮은 속도로 어댑터를 상승시킨다. 아마도 어댑터가 승강되는 거리를 또한 줄일 수 있을 것이다.
단계(314)에서, 어댑터를 보다 빠르게 (그러나, 여전히 데드레그 내 수지가 중력에 의해 낙하할 시간이 있을 만큼 느리게) 단계(308)에서와 동일한 층 높이까지 하강시킨다. 단계(312)에서 어댑터 거리가 감소하면, 단계(314) 내의 어댑터 속도 또한 달라져야 할 수 있다.
단계(316)에서, 바람직하게는 단계(310)의 경우와 동일한 속도를 사용한다. 이 단계가 수행될 때, PAA는 바람직하게는 전체 층에 걸쳐 푸싱되어야 한다.
단계(208)에서, 흐름이 중단되었는지를 확인한 다음, 수지 밸브를 개방 및 폐쇄한다. 밸브를 1회 개방 및 폐쇄하는 것만으로도 피스톤과 그에 씰링되는 O-링 사이에 PAA가 들어가기에 충분할 수 있다. 대안적으로, 단계를 적어도 1회 반복할 수 있다.
단계(312)가 반복되는 경우, 바람직하게는 첫 번째 경우와 동일한 속도를 사용하고, 유속이 어댑터를 상향 이동시키기 전 충분히 높은지를 확인한다.
단계(314)가 반복될 때, 어댑터를 바람직하게는 첫 번째 경우에서와 동일한 속도로 하강시킨다. 단계(318) 이후 층의 유동화를 수행하지 않고 안정한 층을 갖기를 원하는 경우에는 아마도 최종 층 높이가 단계(306)의 높이와 상이해야 한다. 이전 단계들에서 층에 대해 반복적 패킹 및 팽창들이 수행되었기 때문에, 아마도 비드들이 보다 조밀하게 패킹될 것이므로 단계(314) 내의 층 높이가 단계(306)보다 약간 더 낮아야 한다.
단계(316)에서, 권장사항 (20 mM PAA의 경우 40분)보다 더 짧은 PAA와의 접촉 시간을 얻도록 유속을 조절한다. 더 높은 층 높이가 더 낮은 속도를 용인함을 기억하기 바라며, PAA 용액에 대한 점도 (맙셀렉트 수레에 대한 사양은 20 cm 층 높이에서 물로 500 cm/h임)를 감안한다.
단계(310-316)를 요약할 때 PAA와의 접촉 시간이 지나치게 짧은 경우, 단계들(316)과 (318) 사이에 휴지상태를 포함한다.
단계(318)에서, 수지에 대해 명시된 최대값에 가까운 유속의 물로 헹구되, 이미 패킹층 내에 있는 PAA 용액에 대한 점도를 감안하기 바란다.
연구 3 내의 소독 방법은, 소독제로서 20 mM PAA를 사용하여 층 높이 10 cm의 액시크롬 300 칼럼에서의 패킹 동안 P. 아에루기노사로 시험감염된 맙셀렉트 수레 수지를 효율적으로 소독하는데 사용될 수 있다. 샘플링으로부터의 결과 (표 1)와 함께 생균수 시험들로부터의 결과 (샘플 C 및 G, 표 1)로부터, 시험감염 유기체들 및 기타 오염들의 수가, 미리 결정된 오염 수준들에서부터 적시된 허용 기준 내의 것들 미만의 수준까지 감소된 것으로 나타났다.
본 설명서에는, 최상의 모드를 포함한 본 발명을 개시하기 위해, 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자가 임의의 장치들 또는 시스템들을 제조 및 사용하고 임의의 혼입된 방법들을 수행하는 것을 포함하여 본 발명을 실시하는 것을 가능하게 하기 위해 예들이 사용된다. 본 발명의 특허가능한 범주는 청구범위에 의해 정의되며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 떠오르는 기타 예들을 포함할 수 있다. 이러한 기타 예들은 청구범위의 문자 그대로의 용어와 상이하지 않은 구조적 요소를 갖는 경우 또는 청구범위의 문자 그대로의 용어들과 실질적 차이가 없는 등가의 구조적 요소들을 포함하는 경우 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 내용에 언급된 모든 특허 및 특허 출원은 개별적으로 포함되는 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (17)

  1. a) 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼에 분리 수지 입자들의 패킹층 및 이동가능 어댑터를 제공하는 단계;
    b) 어댑터를 패킹층과 접촉시켜, 패킹층을 통해 칼럼 출구로 소독 유체를 수송하는 단계;
    c) 패킹층과 어댑터 사이에 갭을 제공하도록 어댑터를 상승시키는 단계;
    d) 갭을 폐쇄하도록 어댑터를 하강시키는 단계; 및
    e) 패킹층을 통해 칼럼 출구로 평형화 액체를 수송하는 단계
    를 포함하는, 바이오프로세스 크로마토그래피 칼럼의 소독 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 d)와 e) 사이에, 패킹층을 통해 칼럼 출구로 소독 유체를 수송하는 단계 d')를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 c) 및 d)를 적어도 1회, 예컨대 2회 반복하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 이후 및 단계 e) 이전에, 칼럼 수지 밸브를 폐쇄 및 개방하는 단계 b')을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계 b') 이전에, 상기 칼럼 수지 밸브를 소독 유체로 평형화시킨 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 어댑터 씨일들 사이의 플러시 채널을 소독 유체로 충전하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소독 유체가 산화제를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 산화제가 과산 또는 과산화수소를 포함하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 산화제가 퍼아세트산이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소독 유체 중의 산화제의 농도가 5-100 mM, 예컨대 10-30 mM인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 수지가 가교된 폴리사카라이드, 예컨대 가교된 아가로스를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 수지에 단백질성 친화성 리간드들이 테터링된 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단백질성 친화성 리간드들이 단백질 A 또는 단백질 A의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 수지의 상기 패킹층을 상기 소독 유체와 10-50분 동안, 예컨대 20-40분 동안 접촉시키는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 이전에, 생물제약의 분리를 위해 분리 수지의 상기 패킹층이 있는 상기 칼럼을 사용하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e) 이후에, 생물제약의 분리를 위해 분리 수지의 상기 패킹층이 있는 상기 칼럼을 사용하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 이전에, 제1 생물제약의 분리를 위해 분리 수지의 상기 패킹층이 있는 상기 칼럼을 사용하고, 단계 e) 이후에, 상기 제1 생물제약과 상이한 제2 생물제약의 분리를 위해 분리 수지의 상기 패킹층이 있는 상기 칼럼을 사용하는 것인 방법.
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