CN104837536B - 清洁填充床层析柱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种从至少一种污染物层析分离至少一种目标生物分子的方法，该方法包括以下步骤：a)提供包括分离基质颗粒的固化床的轴向层析柱，其中固化床被限制在底部支撑网和可移动的顶部适配器之间；b)在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子；c)提高适配器至少10%的固化床高度；d)在足以液化所述床的条件下，使清洗液向上流动通过床，和；e)重新填充液化床的基质颗粒以创建固化床并降低适配器以致它接触填充床，并任选地压实填充床，和；f)在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子。

Description

清洁填充床层析柱的方法
本发明的技术领域
本发明涉及层析基质的清洁和/或消毒方法，和更特别涉及包括清洁/消毒步骤的层析分离方法。本发明还涉及一种清洁和/或消毒层析柱的方法。
发明背景
层析是当今用于生物制药工业的一种行之有效的纯化方法。典型地，含有目标生物分子的液体进料通过含有基质颗粒(也称为树脂、介质等)的填充床的柱，配体经化学偶联于基质颗粒。目标生物分子结合于基质上的配体并可在用洗脱缓冲液解吸附后以纯化的形式回收。或者，在纯化的非-结合目标分子可在流通(即已经通过柱的贫液)中回收时，某些杂质结合。
层析基质是昂贵的，因此通常重复用来纯化后续批次的目标生物分子。为了能够重复利用，基质通常使用碱性清洁溶液例如1 M NaOH，在柱中原位清洁。碱引起强结合的污染物的解吸附并水解蛋白质污染物。这个过程称为就地清洗，缩写为CIP。具有蛋白质配体的介质，例如通常用于单克隆抗体处理的蛋白A介质，提出某些特别的清洁挑战，即它们比其它介质更昂贵，因此有一种使用它们多个周期的强烈动机。在其它方面，蛋白质配体是或多或少对碱敏感的，这对清洁溶液中的NaOH浓度设定了限制。已经开发了新的碱稳定性蛋白A变体，见例如美国专利号8,198.404，其允许使用最高0.5 M浓度的NaOH溶液用于清洁，但清洁效率仍比通常用于例如碱-稳定的离子交换基质的1 M溶液稍低。为此目的，提出不同的清洁溶液，见例如WO 2006/126942、US 7,052,609和US 6,972,327，但它们不确保完全除去所有物质。
虽然使用碱性清洁溶液的CIP一般允许重复使用基质，但存在CIP后残存污染物的问题。这尤其涉及床的入口部分，其中由于污染物的强吸附和由于溶解物质的局部沉淀常常出现污垢。污垢减少CIP清洁溶液对该区域基质颗粒的可接近性且沉淀的物质往往难以溶解。
因此，需要改进的清洁程序，特别是在不同的细胞培养批次之间使用的程序。
发明概述
本发明的一个方面是提供一种分离方法，其中分离基质可以高基质纯度和低生物负担重复用于多个细胞培养批次。这采用如在权利要求1中定义的方法实现。
一个优点是增强的清洗提供了一种高纯度和清洁度的基质。另外的优点是该方法确保整个基质材料(包括固化床的任何污染的顶层)的清洁和/或消毒，并可创建具有改进的分离效率的分层床。
本发明的第二方面提供一种备选的分离方法，其中高纯度和清洁度的分离基质被重复使用。这采用如在权利要求书中定义的方法实现。
本发明的第三方面是提供一种有效清洁和/或消毒层析柱的方法。这可采用如在权利要求书中定义的方法实现。
本发明的其它合适的实施方案在所附的权利要求书中描述。
附图简述
图1. 包括自依据本发明的再填充床的5个床横截切片(1 = 沉降的床顶部，5 =沉降的床底部)的粒度分析的微分数量(均数)作图。A10072609 Start.#av是在柱实验之前琼脂糖基质批号的参照分析。
图2. 包括自依据本发明的再填充床的5个床横截切片(1 = 沉降的床顶部，5 =沉降的床底部)的粒度分析的微分体积(均数)作图。A10072609 Start.#av是在柱实验之前琼脂糖基质批号的参照分析。
定义
表达“固化床”在此意指颗粒的体积分数高到足以使床表现为固体或可塑性(可变形)固体的颗粒的床。在流变学方面，这可以表示使得床具有高于约100 Pa的屈服应力。在层析特性方面，其意指该床是足够稳定的，以致液体可以通过粒子之间的间隙体积输送，而不破坏床的结构。
表达“液化床”在此意指颗粒的体积分数足够低，以致床表现为液体或浆液。在流变学方面，这可以表示使得床具有低于约50 Pa的屈服应力。在处理特性方面，其意指该床是可倾注的和可用泵抽送的。以类似的方式，表达“液化所述床”在此意指将该床转化为液化床的行动。
实施方案的详细描述
在第一方面，本发明公开一种从至少一种污染物层析分离至少一种目标生物分子的方法。该方法包括以下步骤：
a) 提供包括分离基质颗粒的固化床的轴向层析柱，所述固化床被限制在底部支撑网和可移动的顶部适配器之间；
b) 在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子；
c) 提高适配器至少10%的固化床高度；
d) 在足以液化所述床的条件下，使第一清洗液向上流动通过床，和；
e) 重新填充液化床的基质颗粒以创建固化床并降低适配器以致它接触填充床，并任选地压实填充床，和；
f) 在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子。
所述柱可以是任何带有可移动的顶部适配器的轴向柱，例如AxichromTM、ChromaflowTM、BPG或XK柱(GE Healthcare)，但对于过程的自动化，如果适配器是可液压移动的例如在Chromaflow和Axichrom柱中，则是有利的。基质颗粒可包含配体例如亲和性配体、离子交换配体、多式配体(multimodal ligand)、螯合配体等。目标生物分子可例如是蛋白、肽、核酸或病毒颗粒。它们可以例如是抗体、抗体片断、抗体融合蛋白、疫苗抗原、胰岛素等。目标生物分子可应用于柱作为粗制进料，例如澄清的细胞培养上清或血浆部分，或它们可以半纯化的形式应用，例如作为来自先前的层析步骤的洗脱液。在步骤f)中的目标生物分子可以是与步骤b)中的目标生物分子相同的，但它也可以是不同的，以致第一目标生物分子种类在步骤b)中被分离，而第二(不同的)目标生物分子种类在步骤f)中被分离。在步骤b)和f)中要除去的污染物可以是非-产物-相关的，例如宿主细胞蛋白、DNA、内毒素、病毒、细胞培养基组分等，产物相关的例如聚集体、错折叠的或其它灭活的种类、片断、同种型等或过程相关的例如浸出的蛋白配体、病毒灭活化学物、缓冲液组分、改良试剂等。在步骤b)和f)中的分离可以是结合-洗脱分离的形式，即目标生物分子吸附在基质颗粒上，然后用洗脱缓冲液解吸附/洗脱。或者，分离可以是流通分离的形式，其中污染物吸附在基质颗粒上和目标生物分子从流通部分回收。分离还可以中间模式进行，其中从流通部分和洗涤/洗脱溶液二者回收目标生物分子，例如如在WO 2006/99308中所描述的，该文献通过引用以其全文结合到本文中。
升高适配器以对床的液化给出足够的空间，因为在床中的颗粒的体积分数必须增加以允许液化。适配器可例如升高至少10%或15%，例如至少25%或至少35%、10-250%、10-35%、10-25%、15-250%、15-35%、100-250%或25-250%的固化床高度。适配器的少许升高意味着液化床的体积小，结果清洗液量可以保持在低水平。在其它方面，向上的流速将不得不小心控制，以抵消基质颗粒朝向适配器的沉降和收集。较高的升高使得容易控制流速，但需要较高量的清洗液。这在一定程度上可以通过再循环清洗液，可能时经由过滤器抵消。适配器的升高可通过外力，例如液压系统进行，但它也可以通过步骤d)中的清洗液的流动进行。在这种情况下，步骤c)通过释出适配器作为步骤d)的部分进行，这样它能够以垂直方向自由移动，关闭适配器的出口并使清洗液向上流动以致适配器移动到所需的高度。然后可锁定适配器的位置，打开出口并继续步骤d)。关于步骤d)，技术人员将意识到，可能需要一定量的实验或模拟(例如使用下述的Richardson-Zaki方程)，以确定用于床的液化的最佳条件，特别是涉及流速分布。如果柱侧壁是透明的，这允许直接观察液化，则可有利于实验。
重新填充床和压实可使用用于柱填充的标准方法进行，例如如在生产商对所用具体基质的使用说明书中所述。重新填充可例如通过沉降，通过使填充液向下流动通过柱或通过推动适配器向下以迫使基质颗粒进入固化床进行。装填结果也可(如果需要)通过熟知的柱效率(板数)试验评价。
在使用填充床柱的生物加工过程中，床的顶层容易受到污染。这是由于进料组分对珠粒的不可逆吸附和进料中不溶性组分受到顶层珠粒的沉淀或过滤作用二者所致。随着污染的增加，珠粒之间的间隙孔大小减少，导致提高过滤效果和加速污染。这种污垢是特别难以经常规CIP去除的，但当床在液化过程中被打破时，所有的珠粒表面变得可以接近并通过该过程的机械作用促进胶体材料的释出。这特别适用于其中进出珠粒的扩散已经在清洁床中受限制的珠粒-珠粒接触区，由于污染物将主要地沉积这些区域周围，因此在污染的填充床中在那里物质的运输严重受限。通过打破床，先前接触的区域将易于扩散和水动力将进一步有助于去除污垢层。此外，实现了柱部件表面的清洁改进。
在重新填充期间，先前的顶层珠粒也被分配到整个床中，防止了任何残留胶体材料的污染加速作用。
而且，重新填充床导致床的一定程度的分层，在底部富集较大的珠粒，而较小的珠粒位于顶部。这可在步骤f)的分离期间用来有利于液流以向上的方向流动。然后目标生物分子将首先接触大的珠粒，然后逐步接触较小的珠粒，这提供更有效的质量传输，如在MLi, A Liapis: J. Sep. Sci. 35, 947-956, 2012中所述。如果适配器升高至一高位，例如升高至100-250%的固化床高度，这意味着重新填充将从低基质颗粒浓度进行，将促进分层。
在第二方面，本发明公开一种从至少一种污染物层析分离至少一种目标生物分子的方法。该方法包括以下步骤：
a) 提供包括分离基质颗粒的固化床的轴向层析柱，所述固化床被限制在底部支撑网和可移动的顶部适配器之间；
b) 在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子；
c) 卸下所述固化床并将基质颗粒输送到一单独的清洗容器中；
d) 使清洗容器中的基质颗粒与第一清洗液接触；
e) 将清洁的基质颗粒输送回到所述柱并重新装填固化床，和；
f) 在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子。
将基质颗粒输送至一单独的清洗容器中的优点是可以在该容器中较容易地实施搅拌。它还允许使用与柱不相容的清洗液，例如腐蚀液或与垫片不相容的溶剂等。
目标生物分子可以是例如蛋白、肽、核酸或病毒颗粒。它们可以是例如抗体、抗体片断、抗体融合蛋白、疫苗抗原、胰岛素等。可以将目标生物分子应用于柱作为粗制进料，例如澄清的细胞培养上清液或血浆部分，或它们可以半纯化的形式应用，例如作为来自先前的层析步骤的洗脱液。在步骤f)中的目标生物分子可以与步骤b)中的目标生物分子相同，但它们也可以是不同的，以致第一目标生物分子种类在步骤b)中被分离，而第二(不同的)目标生物分子种类在步骤f)中被分离。在步骤b)和f)中的分离可以是结合-洗脱分离的形式，即目标生物分子吸附在基质颗粒上，然后用洗脱缓冲液解吸附/洗脱。或者，分离可以是流通分离的形式，其中污染物吸附在基质颗粒上和目标生物分子从流通部分回收。分离还可以中间模式进行，其中从流通部分和洗涤/洗脱溶液二者回收目标生物分子，例如如在WO2006/99308中所描述的。
在可应用于第一和第二方面的一些实施方案中，所述方法还包括步骤b)之后的通过输送第二清洗液通过固化床清洗柱的步骤b’)。这可以是使用例如pH至少10，例如至少12、至少13或13-14的碱性清洁溶液的就地清洁(CIP)步骤。通常可使用0.1-1 M NaOH溶液。第二清洗液可具有与第一清洗液基本相同的组成，或其可具有不同的组成。
在可应用于第一和第二方面的某些实施方案中，所述方法还包括在步骤f)之后的通过输送第三清洗液通过固化床清洗柱的步骤f’)。这可以是使用例如pH至少10，例如至少12、至少13或13-14的碱性清洁溶液的CIP步骤。通常可使用0.1-1 M NaOH溶液。第三清洗液可具有与第一和/或第二清洗液基本相同的组成，或其可具有不同的组成。
在可应用于第一和第二方面的一些实施方案中，所述方法还包括重复步骤b)和b’)和/或步骤f)和f’)至少一次。所述方法可例如以阶段的形式(campaign form)使用，第一阶段包括一个细胞培养批次的几个层析处理周期，各周期之间具有CIP。然后使柱经受如在步骤c)和d)中所述的清洁并再填充。然后其可用于第二培养批次的多个处理周期的第二阶段，包括各周期之间的CIP。第一和第二阶段可任选地包括两种不同的目标生物分子的处理。
在可应用于第一和第二方面的一些实施方案中，所述方法还包括在步骤e)和f)之间的贮存柱的步骤。柱可以例如贮存至少一周，例如至少一月、至少3月或1周至2年，例如1周至1年。贮存温度可例如是室温或15-30℃。特别重要的是，在贮存前除去污染物、污垢和任何孢子或微生物，以避免生物在柱中生长的任何危险和避免在贮存期间污染物/污垢的进一步固化。
在可应用于所有方面的一些实施方案中，所述过程或方法还包括在步骤c)中搅动液化床。所述搅动可包括在第一方面的步骤c)中应用振荡流。也可包括例如振动或超声处理液化床。它也可包括适配器上和下的振荡运动或它可包括通过喷嘴(例如在美国专利号5,902,485 (该文献通过引用以其全文结合到本文中)中描述的喷嘴)应用的经喷射(例如液体喷射)的搅动。所述搅动促进床的液化，特别是用于小直径柱并可进一步帮助从基质颗粒释放不溶性污染物。在严重污染的床中，污染物可作为一种胶起作用，保持基质颗粒在一起，然后床的初始破裂可能导致聚集粒子成块。迫切需要通过搅动来分散任何这样的块，以便能使所有颗粒和清洗液之间有良好的接触。振荡流例如可以作为向上的流速的周期性变化，作为上升流与没有施加液流的时期交替的脉冲或作为向上和向下的流动的交替脉冲进行。床的液化的交替脉冲串也可跟随着一个不断向上的流动，以保持基质颗粒在剩余的清洗循环期间悬浮。通过喷嘴的喷射的搅动可在具有用于填充和卸下床的一个或多个喷嘴的柱中常规地进行。这样的柱的实例是ChromaflowTM和AxichromTM，两者得自GE HealthcareBio-Sciences AB，瑞典。
在可应用于所有方面的某些实施方案中，分离基质颗粒，当用纯水平衡时，具有1.0-1.4 g/ml，例如1.0-1.1或1.00-1.05 g/ml的密度。如果颗粒具有比周围的液体更高的密度则是有利的，但为了促进液化和重新填充，密度不应太高。
在可应用于所有方面的一些实施方案中，基质颗粒包括固定化蛋白质配体，例如蛋白A、蛋白G、蛋白L、单链骆驼抗体(camelid antibodies)或其功能性变体。蛋白质配体为捕获商业上重要的蛋白例如抗体和抗体片断提供非常高的选择性，但它们对于高碱性清洗液的稳定性是有限的。具有蛋白质配体的基质也是昂贵的，强调对于不同的过程重复使用它们的重要性。因此，改进过程间的这些基质的清洗具有特别的重要性。
在可应用于所有方面的某些实施方案中，第一清洗液，以及任选地第二和/或第三清洗液都是碱性的，例如具有至少10、至少12、至少13或13-14的pH值。碱性清洗液通常是最有效的清洗液，清洁效率一般随着pH而增加，虽然在许多情况下基质的稳定性对有用的pH范围设定上限。碱性清洗液可以是NaOH、KOH等的水溶液，例如具有10 mM-5M，例如10 mM-1M或10 mM-0.1 M的NaOH或KOH浓度，但它们也可包含其它组分例如水可混溶的溶剂、表面活性剂、离液剂(chaotrope)、还原剂、盐、消毒剂等。清洗液还可提供柱的消毒，即杀死存在于床或柱的其它地方中的微生物或孢子。这可通过碱实现，但在基质和柱与其它消毒剂像例如次氯酸盐、二氧化氯、过氧化氢或过乙酸(peracetic acid)相容的情况下，使用这些试剂也是可能的。在也适用于所有方面的一些实施方案中，一或多种清洗液是酸性的，例如包括磷酸、乙酸、苄醇和/或过乙酸的一种或多种。
在可应用于所有方面的一些实施方案中，层析柱的内径是至少2.5 cm，例如至少10 cm、至少20 cm、2.5-200 cm、10-200 cm或20-200 cm。液化具有较大直径的固化床是更容易的。此外，该方法对于生物药物的实验性和最大规模的生产是特别有利的，其中通常使用大直径的柱。
在可应用于所有方面的某些实施方案中，固化床的高度是5-50 cm，例如5-40或5-30 cm。如果床高度不超过30-50 cm，液化仍是较容易的。在其它方面，如果床高度为至少5cm，尤其是在较大直径的柱中，重新填充是较容易的。如果使用10-50，例如10-40 cm的床高度，则有利于重新填充床的分层。
在可应用于所有方面的一些实施方案中，层析柱的内径与固化床的高度之间的比率是至少0.4，例如0.4-40、1-40、1-20、5-40、5-20、至少0.4、至少1或至少5。高的直径/高度比使得液化床更容易，但如果比率不是太高，可有利于重新填充。
在可应用于所有方面的某些实施方案中，基质颗粒基本上是球形的，(体积-加权的)平均直径为至少20 µm，例如30-300 µm、30-150 µm或50 - 100 µm。如果平均珠粒直径为20 µm或更高，则有利于液化和重新填充二者，并且不超过300 µm以避免过高的沉降速度是有利的。同样，球形有利于液化和重新填充。
在可应用于所有方面的一些实施方案中，基质粒度分布的(体积-加权的)变异系数是10-50 %，例如10-40 %或15-35 %。基质颗粒的合理的多分散性允许床在重新填充期间所需的分层。在其它方面，在柱的操作期间，太高的多分散性将会引起过度的背压(backpressure)。
在可应用于所有方面的某些实施方案中，基质颗粒包含多糖载体，例如交联琼脂糖。多糖基质是亲水性的和有弹性的，这有利于液化和重新填充。它们也是非-脆性的，这减小了在清洁和重新填充操作期间磨损的风险。此外，它们对这些操作具有合适的密度。在一些实施方案中，使用无高密度填充剂的多糖载体。这样的载体将具有在1.0-1.05 mg/ml范围内的密度。
在可主要应用于第一和第三方面的一些实施方案中，在步骤d)中向上流动的速度是100-500 cm/h，例如200-400 cm/h和第一清洗液的粘度是1.0-1.5 mPas，例如1.0-1.3mPas。流速和粘度影响在清洁期间的液化和基质颗粒的悬浮，技术人员应意识到，可能需要某些实验工作以对给定的液体粘度找到最佳流速。或者，合适的流速可使用例如Richardson-Zaki方程u = ui εn计算，其中u是颗粒在悬浮液空隙度(液体的体积分数) ε中的沉降速度。ui是颗粒在无限稀释时的自由沉降速度和n是取决于系统的雷诺数(Reynoldsnumber) Re (依据Re<0.2: n = 4.65 + 19.5 d/D；0.2<Re<1: n = (4.35 + 17.5 d/D)Re-0.03；1<Re<200；n = (4.45+18 d/D) Re-0.1；200<Re<500: n = 4.45 Re-0.1；Re>500: N =2.39，其中d是平均颗粒直径和D是柱的内径)所选择的一个系数。ui可以从斯托克斯定律(Stokes’ law)计算：ui = g d2 (ρp-ρl)/18 η，其中g是重力加速度，ρp是颗粒密度，ρl是液体密度和η是液体粘度。可以适当地选择向上的流速，以使其在与u相同的范围内。
在可应用于所有方面的某些实施方案中，所述过程或方法还包括在步骤d)和e)之间移出清洁的基质颗粒的样品并分析样品的纯度的步骤。该步骤确保通过清洁步骤获得足够的基质纯度。如果柱具有大的体积，例如至少1 L或至少10 L，移出小样品(例如少于1 mL或少于10 mL)将不会不利于随后的过程步骤。根据基质的类型和污染物特征，可应用几种不同的分析方法，例如氨基酸分析、氮分析、Raman或IR光谱等。
在可应用于第一和第二方面的一些实施方案中，所述方法还包括在步骤f)之后回收目标生物分子，并且任选地在进一步纯化后，将其用于药物制剂的步骤。如果在步骤f)中的目标生物分子是第二目标生物分子，不同于步骤b)中的第一目标生物分子，这可能例如意味着残留的第一目标生物分子的最大遗留将是0.8 mg/L填充床。大体说来，对于药用的纯度要求是非常高的，且基质中的任何污染物的强力消除是必不可少的。
在第三方面，本发明公开一种清洁和/或消毒填充床层析柱的方法，其包括以下步骤：
a) 提供包括分离基质颗粒的固化床的轴向层析柱，所述固化床被限制在底部支撑网和可移动的顶部适配器之间；
b) 提高适配器至少10%的固化床高度；
c) 在足以液化所述床的条件下，使清洗液向上流动通过床，和；
d) 通过使填充液向下流动通过柱，重新填充液化床的基质颗粒，以创建固化床并降低适配器以致它接触填充床，并任选地压实填充床。
该方法将完成对基质颗粒和柱部件二者的清洁。
上面讨论的实施方案也适用于这个方面。注意第三方面中的步骤b)、c)和d)分别对应于第一方面中的步骤c)、d)和e)。
实施例
材料/研究装置
柱：XK-26/20 (26 mm内径)，产品编号. 28-9889-48，购自GE Healthcare。
层析系统：Äkta Avant A25-32105，GE Healthcare，包括Unicorn 6.1软件。
Multisizer 3, AD48164, Beckman Coulter AB (粒度分布分析)
蛋白分离介质/化学品
琼脂糖基质：依据在美国专利号6,602,990中描述的方法制备的高硬度交联琼脂糖珠粒。平均珠粒直径是80 µm和如通过逆尺寸排阻层析法(用右旋糖苷作为探针分子)测定的孔隙度相当于分子量110 kDa的右旋糖苷的0.54的KD值，意味着对于右旋糖苷分子可获得54%的珠粒体积。用于孔隙度测定的方法描述于L Hagel等: J Chromatogr A 743,33-42 (1996)中。
0.1 M NaOH，Titrisol®，得自Merck, 德国。
红色染料：Procion Red, H-E7B，得自Drystar Textilfarben, 德国。
蓝色染料：Procion Blue, H-EGN 125，得自Drystar Textilfarben, 德国。
方法
一般凝胶洗涤程序和浆液中凝胶含量的测定
含有20%乙醇的凝胶浆液琼脂糖基质用Milli-Q水在一玻璃滤器上(Schott Duran4)使用负压反复洗涤。然后将半干的基质转移到量筒中并将Milli-Q水以大约50/50 (v/v)凝胶/水比例加入。对于填充研究，以获得精确的50% (v/v)的沉降基质浓度的方式，将Milli-Q水加入到固定基质浆液或者将其从固定基质浆液中吸出。
在装填之前将50%基质浆液填充到XK-26/20柱中
将量筒中的沉降浆液震摇至均匀的悬浮液。在该程序过程中用Parafilm覆盖量筒的开口端。然后，将需要的体积精确地加入到柱中。
粒度分析
粒度分布在Malvern Mastersizer激光衍射仪上测量。数据按数量和体积分布绘图。
样品制备概述
于室温下使样品悬浮于0.9% NaCl中持续大约3天，以确保珠粒已达到稳定的粒度。样品(g)/NaCl-体积比列出如下：
样品(横截切片) 样品(g)/NaCl-体积比
1 0.73 g样品+ 22 mL NaCl-溶液
2 0.84 g样品和NaCl-溶液至20 mL
3 0.83 g样品和NaCl-溶液至20 mL
4 1.25 g样品和NaCl-溶液至30 mL
5 1.81 g样品和NaCl-溶液至40 mL
结果和讨论
非-着色基质
填充
目标是获得60 mm高，压实的沉降床(60 mm高度等于32 mL)。为了该目的，将70 mL50%基质浆液灌注到柱中(移去上端件)。在填充柱后，安装上端件并将Milli-Q水以25 mL/min (283 cm/h)向下泵送。继续填充10分钟。监测柱背压至3.5巴(对于XK 26/20的上限为5巴)。在完成填充后，降低上端件直至它达到床表面。此后，通过用上适配器推挤填充床另外5 mm进一步压实床。压实床的最终高度是57 mm (30 mL基质)。
卸下
对于卸下程序，流动方向在Unicorn软件中改为向上。理想地，使用0.1 M NaOH作为溶剂(CIP溶液)，卸下的流速应为1个柱体积(CV)/min。一个柱体积(相对于填充基质)等于30 mL/min (339 cm/h)。然而，对于Äkta Avant的上流速是25 mL/min (283 cm/h)。因此，这是选择的流速。在卸下方案中，程序描述如下：
- 拧松上端件螺帽
- 用一回形针扣住上端件弹簧，从而使得上端件能够自由移动
- 启动泵
- 当上端件到达所需位置时，关闭泵
- 紧固上端件螺帽
- 除去回形针(完全锁定上端件)
在施加向上方向的液流时，缓慢升高上端件至所需位置，其总共封闭67 mL。在卸下期间，整个填充床升起。在完成该程序后，注意到2分钟后，填充的基质床开始分解。大约40分钟后，基质沉积在柱底部。
5.1.3 流动振荡
为了加速床的分解，可以振荡的方式改变液流方向。理想地，振荡应使用0.1 MNaOH，以25 mL/min (283 cm/h)的流速，通过改变向上和向下流动来进行。所用的泵送系统具有一定的反应时间用于改变液流方向。即是说，这花了大约15秒达到选择的流速。在开发期注意到，与下降时间段比较，使用较长的上升时间段是有利的。为此的理由是当基质被填充到柱底部(向下流动方向)时，基质“塞”不如在相反方向上那样容易分解。最终振荡方案包括6个合并的上下流动周期。每个周期包括一个向上流动的2.5分钟时间段，之后是1分钟的向下流动的时间段。振荡方案的总时间是23.5分钟。
用有色树脂的试验
为证明开发的混合方案的效率，进行用染色基质的研究。
染色和凝胶浆液制备
含有20%乙醇的大约500 mL琼脂糖基质用红色或者蓝色染料染色。两种制备的基质(红色和蓝色染料)使用负压，用Milli-Q水在两个玻璃滤器(Schott Duran 4)上反复洗涤。
将半-干着色的基质置于两个量筒(各100 mL)中。将Milli-Q水加入到各量筒中至大约50/50基质/水比例。在填充前，向固定基质中加入Milli-Q水，以达到1份蓝色和1份红色着色的50% (v/v)基质浆液。
5.2.2 填充(3层)
先前填充的未着色基质床具有57 mm的高度。为达到这种床高度，需要70 mL 50%基质浆液。优选地，3种-着色的床应包含3层，包括在底部的1个蓝色层，在中间的1个无色层和最后是在顶部的红色层。对于每层，使用23 mL浆液，接着是上述填充方案。Milli-Q水是选择的填充液体。填充程序后接着降低上端件直至与凝胶表面接触。最后，机械推动适配器深入柱内5 mm。
5.2.3 卸下
使用0.1 M NaOH，以25 mL/min (283 cm/h)的流速进行卸下。程序与对于无色床的相同，这使得上端件能够以流动方向自由向上移动，直至它到达优选的上端位置。在这一点上，泵停止并且锁住端件。
5.2.4 振荡
通过使用振荡方案，分解着色床。如同对于无色床，使用向上和向下的泵送，以25mL/min流速进行振荡。选择的振荡液体是0.1 M NaOH。
5.2.5 沉降床的移出和分析
振荡程序后，使柱中的紫色浆液沉降1小时。然后降低上端件至与床接触(在松开使柱连接于Äkta Avant的毛细管螺母后)。最后，移去下端件，并通过向下推动上端件，有可能挤出紫色床到塑料托盘上。将移出的床切成5个可目视观察的横断切片并发现对于紫色是均匀的，显示在清洁程序期间已获得颗粒的完全再次混合。
5个横截切片的粒度-分析
使5个横截切片悬浮于0.9% NaCl中。在图1和2中，分别显示微分数量(均数)和微分体积(均数)的绘图。在表1中，列出结果。
表1. 对横截切片1-5的粒度分析结果。Start是柱实验前琼脂糖基质批次的粒度分析。
样品 d50vol d50数目
Start 85,9 66,5
1 86,7 67,9
2 86,5 66,8
3 86,0 67,2
4 88,0 68,3
5 89,1 72,6
评论：底部横截切片(5号)含有具有最高d50vol和d50数-值的珠粒。
此文字说明书使用实施例公开本发明，包括最佳方式，并且还能使本领域的任何技术人员实施本发明，包括制备和使用任何装置或系统和进行任何合并的方法。本发明的可专利保护的范围由权利要求书限定，和可包括本领域技术人员可发现的其它实施例。这样的其它实施例意欲在权利要求书的范围内，如果它们具有不同于权利要求书的文字语言的结构要素，或如果它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差异的等效结构要素的话。指出描述的与一个实施方案有关的任何特征也可与所述的任何其它方面和实施方案的一个或多个特征组合使用。

Claims (32)

1.一种从至少一种污染物层析分离至少一种目标生物分子的方法，其包括以下步骤：
a) 提供包括分离基质颗粒的固化床的轴向层析柱，所述固化床被限制在底部支撑网和可移动的顶部适配器之间；
b) 在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子；
c) 提高适配器至少10%的固化床高度；
d) 在足以液化所述床的条件下，使第一清洗液向上流动通过床，和；
e) 重新填充液化床的基质颗粒以创建固化床并降低适配器以致它接触填充床，和；
f) 在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子。
2.权利要求1的方法，其中步骤e)进一步包括压实填充床。
3.权利要求1的方法，其还包括在步骤b)之后通过输送第二清洗液通过固化床清洗柱的步骤b’)。
4.权利要求1的方法，其还包括在步骤f)之后通过输送第三清洗液通过固化床清洗柱的步骤f’)。
5.权利要求3或4的方法，其还包括重复步骤b)和b’)和/或步骤f)和f’)至少一次。
6.权利要求1的方法，其还包括在步骤b)和f)之间贮存柱至少一周的步骤。
7.权利要求1的方法，其还包括在步骤d)中搅动液化床。
8.权利要求7的方法，其中所述搅动包括振动或超声处理液化床或基质颗粒。
9.权利要求7或8的方法，其中所述搅动包括通过从一个或多个喷嘴喷射来搅动。
10.权利要求7或8的方法，其中所述搅动包括在步骤d)中的振荡流动。
11.权利要求1的方法，其中分离基质颗粒，当用纯水平衡时，具有1.0-1.4 g/ml的密度。
12.权利要求11的方法，其中分离基质颗粒，当用纯水平衡时，具有1.0-1.05 g/ml的密度。
13.权利要求1的方法，其中基质颗粒包括固定化蛋白质配体。
14.权利要求13的方法，其中所述固定化蛋白质配体包含蛋白A、蛋白G、蛋白L、单链骆驼抗体，或蛋白A、蛋白G、蛋白L、单链骆驼抗体的功能性变体。
15.权利要求1的方法，其中第一清洗液是碱性的。
16.权利要求15的方法，其中所述第一清洗液具有至少10、至少12、至少13或13-14的pH值。
17.权利要求1的方法，其中层析柱的内径是至少2.5 cm。
18. 权利要求17的方法，其中层析柱的内径是至少10 cm、至少20 cm或10-200 cm。
19.权利要求1的方法，其中固化床的高度是5-50 cm。
20.权利要求1的方法，其中层析柱的内径与固化床的高度之间的比率是至少0.4。
21.权利要求20的方法，其中层析柱的内径与固化床的高度之间的比率是0.4-40。
22.权利要求1的方法，其中基质颗粒基本上是球形的，具有至少20 µm的平均直径。
23.权利要求22的方法，其中基质颗粒具有30-300 µm的平均直径。
24.权利要求1的方法，其中基质粒度分布的变异系数是10-50 %。
25.权利要求1的方法，其中基质颗粒包含多糖载体。
26.权利要求25的方法，其中多糖载体包含交联琼脂糖。
27.权利要求1的方法，其中在步骤d)中向上的流速是100-500 cm/h和第一清洗液的粘度是1.0-1.5 mPas。
28.权利要求1的方法，其还包括在步骤d)和e)之间的移出清洁的基质颗粒的样品并分析样品的纯度的步骤。
29.权利要求1的方法，其还包括在步骤f)之后的回收第二目标生物分子的步骤。
30.权利要求29的方法，其还包括在进一步纯化第二目标生物分子后，将其用于药物制剂。
31.一种清洁和/或消毒填充床层析柱的方法，其包括以下步骤：
a) 提供包括分离基质颗粒的固化床的轴向层析柱，所述固化床被限制在底部支撑网和可移动的顶部适配器之间；
b) 提高适配器至少10%的固化床高度；
c) 在足以液化所述床的条件下，使清洗液向上流动通过床，和；
d) 通过使填充液向下流动通过柱，重新填充液化床的基质颗粒，以创建固化床并降低适配器以致它接触填充床。
32.权利要求31的方法，其中步骤d)进一步包括压实填充床。
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