JP6348507B2 - 充填ベッドクロマトグラフィーカラムの洗浄方法 - Google Patents

Description

本発明は、クロマトグラフィーの基材を洗浄及び／又は衛生化する方法に関し、より詳細には、洗浄／衛生化ステップを含むクロマトグラフィー分離プロセスに関する。本発明は、クロマトグラフィーカラムを洗浄及び／又は衛生化する方法にも関する。

クロマトグラフィーは今日、生物薬剤産業で使用される定着した精製方法である。典型的には、目的生体分子を含む供給液を、リガンドを化学結合させたマトリックス粒子（樹脂、媒体などとも呼ばれる）の充填ベッドを収容するカラムに通液する。目的生体分子は基材表面のリガンドと結合し、溶出緩衝液による脱着後、精製された状態で回収し得る。或いは、特定の不純物が結合し、精製された未結合の目的分子がフロースルーつまりカラムを通過した除去後の液体中で回収し得る。

クロマトグラフィーの基材は高価なので、通常は目的生体分子の後続バッチの精製用に再利用される。再利用を可能にするために、基材はカラム内のその場で、典型的には１Ｍ 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）などアルカリ性洗浄溶液で洗浄される。アルカリは、強く結合した夾雑物質を脱着させ、タンパク質性夾雑物質を加水分解する。このプロセスは定置洗浄と呼ばれ、ＣＩＰと略される。一般にモノクローナル抗体のプロセスに使用されるプロテインＡ媒体などのタンパク質性リガンドを担持する媒体は、他の媒体よりも高価なので何サイクルも使用することが強く望まれるという点で、洗浄は特別な課題である。他方で、タンパク質性リガンドはある程度アルカリの影響を受けやすいことから、洗浄溶液中のＮａＯＨ濃度は限られる。新しいアルカリ安定性プロテインＡが各種開発されており（例えば米国特許第８１９８４０４号参照）、最高０．５Ｍ濃度のＮａＯＨ溶液を洗浄に使用することが可能であるが、洗浄効率は、例えばアルカリ安定性イオン交換基材で一般的に使用される１Ｍ溶液よりもやはり幾分低い。この目的で異なる洗浄溶液が提案されているが（例えば国際公開第２００６／１２６９４２号、米国特許第７０５２６０９号及び同第６９７２３２７号参照）、物質すべてを完全に除去する保証はない。

アルカリ性洗浄溶液でのＣＩＰは基材の再利用を概ね可能にするが、ＣＩＰ後に残存する夾雑物質の問題がある。このことは特に、夾雑物質の強力な吸着及び溶解した物質の局所的な沈殿のせいでファウリング（汚れの付着）がしばしば生じるベッドの入口部に関する。ファウリングのせいでこの領域のマトリックス粒子にＣＩＰ洗浄溶液が届きにくくなり、沈殿した物質の溶解が困難になることが多い。

したがって、洗浄手順の改善、具体的には異なる細胞培養バッチ間に使用される手順が必要とされている。

米国特許出願公開第２０１１／００７７７６６号明細書

本発明の一態様は、分離基材を高基材純度及び低バイオバーデンで複数の細胞培養バッチに再利用できる分離プロセスを提供することである。このことは、請求項１において定義されるプロセスによって実現される。

一利点は、洗浄が強化されて高い純度及び衛生度の基材が提供されることである。さらなる利点は、このプロセスは圧密化ベッドのどのように汚れた最上層も含めすべての基材充填物全体の洗浄及び／又は衛生化を保証し、分離効率が改善された層化ベッドが生成できることである。

本発明の第２の態様は、高い純度及び衛生度の分離基材が再利用される、代替の分離プロセスを提供することである。このことは、特許請求の範囲において定義されるプロセスによって実現される。

本発明の第３の態様は、クロマトグラフィーカラムの高効率な洗浄及び／又は衛生化の方法を提供することである。このことは、特許請求の範囲において定義される方法を用いて実現される。

本発明のさらなる好適な実施形態が、従属項に記載される。

本発明による再充填ベッドの５つのベッド輪切り部（１＝沈降後のベッド最上部、５＝沈降後のベッド最下部）の粒度分析を含む示差個数（平均）プロットである。Ａ１００７２６０９ Ｓｔａｒｔ．＃ａｖは、カラム実験前のアガロース基材のロットの基準分析である。 本発明による再充填ベッドの５つのベッド輪切り部（１＝沈降後のベッド最上部、５＝沈降後のベッド最下部）の粒度分析を含む示差体積（平均）プロットである。Ａ１００７２６０９ Ｓｔａｒｔ．＃ａｖは、カラム実験前のアガロース基材のロットの基準分析である。

定義
本明細書では「圧密化ベッド」という表現は、ベッドが固体又は可塑性（変形可能な）固体として挙動するのに十分高い粒子体積率を有する粒子のベッドを意味する。このことは、レオロジー用語では、ベッドが約１００Ｐａよりも高い降伏応力を有するように、と表現することができる。クロマトグラフィー特性の観点からは、液体がベッドの構造を破壊することなく粒子間の間隙体積を通って送液されることができるほど、ベッドが安定していることを意味する。

本明細書では「液状化ベッド」という表現は、粒子体積率が、ベッドが液体又はスラリーとして挙動するのに十分低いことを意味する。このことは、レオロジー用語では、ベッドが約５０Ｐａよりも低い降伏応力を有するように、と表現することができる。操作特性の観点からは、ベッドを注いだり汲みあげたり（押し出したり）できることを意味する。同様に、本明細書では「ベッドを液状化する」という表現は、ベッドを液状化ベッドに替える動作を意味する。

実施形態の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、１種以上の夾雑物質から１種以上の目的生体分子をクロマトグラフィー分離する方法を開示する。プロセスは、次のステップを含む。
（ａ）分離マトリックス粒子の圧密化ベッドを有する軸流クロマトグラフィーカラムを用意するステップであって、圧密化ベッドは下部担体ネットと可動上部アダプターの間に納められている、ステップ、
（ｂ）カラムで目的生体分子を１種以上の夾雑物質から分離するステップ、
（ｃ）アダプターを圧密化ベッドの高さの１０％以上持ち上げるステップ、
（ｄ）第１の洗浄液を、ベッドを液状化するのに十分な条件下で、ベッドを上方向に通過させるステップ、及び
（ｅ）液状化ベッドのマトリックス粒子を再充填して圧密化ベッドを作り、アダプターを下降させて充填ベッドと接触させ、随意で圧縮させるステップ、及び
（ｆ）カラムで目的生体分子を１種以上の夾雑物質から分離するステップ。

カラムは、例えばＡｘｉｃｈｒｏｍ（商標）、Ｃｈｒｏｍａｆｌｏｗ（商標）、ＢＰＧ又はＸＫカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）など、可動上部アダプターがついているどのような軸流カラムであってもよいが、プロセスを自動化するためには、アダプターがＣｈｒｏｍａｆｌｏｗやＡｘｉｃｈｒｏｍのカラムなどのように液圧で動くのが有利である。マトリックス粒子は、親和性リガンド、イオン交換リガンド、マルチモーダルリガンド、キレートリガンド他などのリガンドを含み得る。目的生体分子は、例えばタンパク質、ペプチド、核酸又はウイルス粒子であり得る。それらは例えば抗体、抗体断片、抗体融合タンパク質、ワクチン抗原、インスリン他であり得る。目的生体分子は、未精製供給液として、例えば清澄細胞培養上澄み液又は血漿画分としてカラムに加えることができるし、或いは半精製の状態で、例えば前回のクロマトグラフィーのステップの溶出分として加えられ得る。ステップ（ｆ）の目的生体分子は、ステップ（ｂ）の目的生体分子と同じであってもよいが、異なっていてもよく、したがって第１の目的生体分子種はステップ（ｂ）で分離され、第２の別の目的生体分子種はステップ（ｆ）で分離される。ステップ（ｂ）及びステップ（ｆ）で除去される夾雑物質は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシン、ウイルス、細胞培地成分他など産物に関連しないものか、凝集塊、ミスフォールドもしくはその他の不活性種、断片、アイソフォーム他など産物に関連するものか又は浸出タンパク質リガンド、ウイルス不活化物質、緩衝液成分、修飾試薬他などプロセスに関するものであり得る。ステップ（ｂ）及びステップ（ｆ）の分離は、結合−溶出分離の形態であり得、つまり目的生体分子がマトリックス粒子に吸着し、次いで溶出緩衝液で脱着／溶出される。或いは、分離はフロースルー分離の形態であり得、夾雑物質がマトリックス粒子に吸着し、目的生体分子はフロースルー画分から回収される。分離はさらに、例えば国際公開第２００６／９９３０８号（その全容を本明細書中で参照して援用する）に記載されているように、目的生体分子がフロースルー画分と洗浄／溶出溶液の両方から回収される、中間モードで行うことができる。

アダプターの持ち上げは、液状化できるようにベッドの粒子体積率を増加させなければならないので、ベッドを液状化するのに十分なスペースを与えるために行われる。アダプターは、例えば、圧密化ベッドの高さの２５％以上又は３５％以上、１０％〜２５０％、１０％〜３５％、１０％〜２５％、１５％〜２５０％、１５％〜３５％、１００％〜２５０％又は２５％〜２５０％など、１０％以上又は１５％持ち上げることができる。アダプターを少しだけ持ち上げることは、液状化ベッドの体積が小さいことを意味し、したがって洗浄液の量は少量でよい。他方で、その場合は上方向の流量を注意深く制御して、沈降とアダプターに向けてのマトリックス粒子の集合を相殺しなければならない。より高く持ち上げると、流量の制御は容易になるが、洗浄液の量はより多く必要になる。このことは、できればフィルターを介して洗浄液を循環させることによって、ある程度までは相殺できる。アダプターの持ち上げは、液圧装置などの外力によって行うことができるが、ステップ（ｄ）の洗浄液の流れによって行うこともできる。この場合は、アダプターが垂直方向に自由に動くことができるようにアダプターを解放し、出口をアダプターから閉鎖して、洗浄液を上方向に流してアダプターが所望の高さまで動くようにすることによって、ステップ（ｃ）をステップ（ｄ）の一部として行う。次いでアダプターを所定位置に固定し、出口を開いて、ステップ（ｄ）を続行する。ステップ（ｄ）については、当業者であれば、いくらか実験又は（例えば下で説明するＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｚａｋｉ方程式を用いて）シミュレーションを行って、特に流速プロファイルに関してベッドの液状化の最高条件を決定することが必要であり得ることを理解しよう。実験は、カラム側壁が透明であれば、液状化を直接観察できるので、容易になり得る。

ベッドの再充填及び圧縮は、例えば特定の使用基材について製造業者の使用説明書に記載されているような、カラム充填の標準的な方法により行うことができる。再充填は、例えば、沈降により、充填流体を下方向にカラムを通過させることにより又はアダプターを押し下げてマトリックス粒子を圧密化ベッドにすることにより行うことができる。充填の結果は、所望であれば、周知のカラム効率（段数）試験により評価することもできる。

充填ベッドカラムをバイオプロセスに使用している間、ベッドの最上層はファウリングの影響を受けやすい傾向がある。このことは、供給液成分がビーズに不可逆的に吸着することと、最上層のビーズによって供給液中の不溶性成分が沈殿又は濾過されることの両方のせいである。ファウリングが増大すると、ビーズ間の間隙孔のサイズが縮小し得、濾過効果の増大とファウリングの加速につながる。このファウリングは従来のＣＩＰでは特に除去し難いが、ベッドが液状化手順で崩れると、すべてのビーズ表面がアクセス可能になり、プロセスの力学的作用によってコロイド状物質の解放が促進される。このことは特にビーズ−ビーズ接触域に当てはまり、ここでは汚れのないベッドでもビーズ内及び外への拡散が限られ、夾雑物質はこれらの区域の周りに特に堆積することになるので、汚れた充填ベッドでは物質移送が非常に制限される。ベッドを崩すことによって、もとの接触域は拡散のためにアクセス可能になり、流体力がさらにファウリング層の除去に貢献することになる。加えて、カラム器具表面の洗浄が改善される。再充填中、もとの最上層のビーズもベッド全体に分布することになり、コロイド状物質が残存していてもファウリング加速効果が防止される。

さらに、ベッドの再充填は、より大きいビーズが底部に集まり、より小さいビーズが上部に集まって、ある程度のベッド層化につながる。このことは、ステップ（ｆ）の分離中、流れが上方向であれば、有利に利用できる。したがって目的生体分子はまず大きいビーズに接触し、だんだん小さくなっていくビーズと接触することになるが、このことは、Ｍ Ｌｉ，Ａ Ｌｉａｐｉｓ：Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．３５，９４７−９５６，２０１２に記載されているように、より効率のよい物質移送をもたらす。アダプターが高い位置にまで、例えば圧密化ベッドの高さの１００〜２５０％持ち上げられると層化が促進されることになり、このことは再充填が、低いマトリックス粒子濃度で行われることを意味する。

第２の態様では、本発明は、１種以上の夾雑物質から１種以上の目的生体分子をクロマトグラフィー分離する方法を開示する。このプロセスは、次のステップを含む。
（ａ）分離マトリックス粒子の圧密化ベッドを有する軸流クロマトグラフィーカラムを用意するステップであって、圧密化ベッドは下部担体ネットと可動上部アダプターの間に納められている、ステップ、
（ｂ）カラムで目的生体分子を１種以上の夾雑物質から分離するステップ、
（ｃ）圧密化ベッドを充填解除し、マトリックス粒子を別の洗浄容器に移送するステップ、
（ｄ）洗浄容器内のマトリックス粒子を第１の洗浄液と接触させるステップ、
（ｅ）洗浄済みのマトリックス粒子をカラムに戻し、圧密化ベッドを再充填するステップ、及び
（ｆ）カラムで目的生体分子を１種以上の夾雑物質から分離するステップ。

マトリックス粒子を別の洗浄容器に移送する利点は、この容器内の方が撹拌しやすいことである。また、カラムと適合しない洗浄液、例えばガスケット他と適合しない腐食性液体又は溶媒を用いることも可能になる。

目的生体分子は、例えばタンパク質、ペプチド、核酸又はウイルス粒子であり得る。それらは例えば抗体、抗体断片、抗体融合タンパク質、ワクチン抗原、インスリン他であり得る。目的生体分子は、未精製供給液として、例えば清澄細胞培養上澄み液又は血漿画分としてカラムに加えられ得又は半精製の状態で、例えば前回のクロマトグラフィーのステップの溶出分として加えられ得る。ステップ（ｆ）の目的生体分子は、ステップ（ｂ）の目的生体分子と同じであってもよいが、異なっていてもよく、したがって第１の目的生体分子種はステップ（ｂ）で分離され、第２の別の目的生体分子種はステップ（ｆ）で分離される。ステップ（ｂ）及びステップ（ｆ）の分離は、結合−溶出分離の形態であり得、つまり目的生体分子がマトリックス粒子に吸着し、次いで溶出緩衝液で脱着／溶出される。或いは、分離はフロースルー分離の形態であり得、夾雑物質がマトリックス粒子に吸着し、目的生体分子はフロースルー画分から回収される。分離はさらに、例えば国際公開第２００６／９９３０８号に記載されているように、目的生体分子がフロースルー画分と洗浄／溶出溶液の両方から回収される、中間モードで行うことができる。

第１の態様及び第２の態様の両方に適用される一部の実施形態では、プロセスは、さらに、ステップ（ｂ）の後、第２の洗浄液を圧密化ベッドに送って通過させることによってカラムを洗浄するステップ（ｂ’）を含む。これは、例えば、ｐＨが１２以上、１３以上又は１３〜１４など、ｐＨ１０以上のアルカリ性洗浄溶液を用いる定置洗浄（ＣＩＰ）ステップであり得る。ステップは典型的には０．１〜１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いることができる。第２の洗浄液は、第１の洗浄液とほぼ同じ成分を有するか又は異なる成分を有することができる。

第１の態様及び第２の態様の両方に適用される特定の実施形態では、プロセスは、さらに、ステップ（ｆ）の後、第３の洗浄液を圧密化ベッドに送って通過させることによってカラムを洗浄するステップ（ｆ’）を含む。これは、例えば、ｐＨが１２以上、１３以上又は１３〜１４など、ｐＨ１０以上のアルカリ性洗浄溶液を用いるＣＩＰステップであり得る。ステップは典型的には０．１〜１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いることができる。第３の洗浄液は、第１及び／又は第２の洗浄液とほぼ同じ成分を有するか又は異なる成分を有することができる。

第１の態様及び第２の態様の両方に適用される一部の実施形態では、プロセスは、ステップ（ｂ）とステップ（ｂ’）及び／又はステップ（ｆ）とステップ（ｆ’）を１回以上繰り返すことを含む。プロセスは、例えば、キャンペーンの形態で利用することができ、第１のキャンペーンは１つの細胞培養バッチのいくつかのクロマトグラフィープロセスサイクルを含み、サイクルの合間にＣＩＰを行う。次いでステップ（ｃ）及びステップ（ｄ）に記載のようにカラムを洗浄し、再充填する。カラムは次に、第２のキャンペーンで第２の培養バッチの複数のプロセスサイクルに使用され、サイクルの合間にＣＩＰが含まれる。第１及び第２のキャンペーンは、２種類の異なる目的生体分子のプロセスを随意で含むことができる。

第１の態様及び第２の態様の両方に適用される一部の実施形態では、プロセスは、さらに、ステップ（ｅ）とステップ（ｆ）の間にカラムを保存するステップを含む。カラムは、１週間以上（例えば１か月以上、３か月以上）又は１週間乃至２年間（例えば１週間乃至１年間）保存し得る。保存温度は、例えば、室温又は１５℃〜３０℃であり得る。保存する前に、夾雑物質、汚れ、及びあらゆる胞子もしくは微生物を除去して、カラム内での生物増殖のあらゆるリスクを予防し、また、保存中に夾雑物質／汚れがさらに不溶化することを予防することが非常に大切である。

すべての態様に適用される特定の実施形態では、プロセス又は方法は、さらに、ステップ（ｃ）で液状化ベッドを撹拌することを含む。撹拌は、第１の態様のステップ（ｃ）で振動流を加えることを含み得る。撹拌は、例えば液状化ベッドの震動又は超音波処理も含み得る。撹拌は、アダプターの上下の振動運動を含み得又は例えば米国特許第５９０２４８５号（その全容を本明細書中で参照して援用する）に記載のノズルなどのノズルからのジェット流（例えば液体ジェット流）による撹拌も含み得る。撹拌は、特に小径のカラムではベッドの液状化を促進し、さらにマトリックス粒子から不溶性夾雑物質を解放しやすくし得る。汚れがひどいベッドでは、夾雑物質はマトリックス粒子をまとめる糊として働くことがあり、その場合は１回目のベッドの崩壊の結果、凝集した粒子の塊ができることがある。そのような塊をすべて撹拌によって分散させて、すべての粒子と洗浄液が良好に接触できるようにすることが非常に望ましい。振動流は、例えば、上昇流の速度における周期的変動として、流れを加えない周期と交互に上昇流の脈動として又は上昇流と下降流の交互の脈動として、実施することができる。ベッドを液状化するための交互の脈動列に続いて一定の上昇流を与えて、残りの洗浄サイクルの間マトリックス粒子を浮遊させておいてもよい。ノズルからのジェット流による撹拌は、ベッドの充填及び充填解除用に１以上のノズルを有するカラム内で便利に行うことができる。そのようなカラムの例は、Ｃｈｒｏｍａｆｌｏｗ（商標）及びＡｘｉｃｈｒｏｍ（商標）であり、どちらもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン）から入手可能である。

すべての態様に適用される特定の実施形態では、分離マトリックス粒子は純水と平衡化されると、１．０ｇ／ｍｌ〜１．１ｇ／ｍｌ又は１．００ｇ／ｍｌ〜１．０５ｇ／ｍｌなど、１．０ｇ／ｍｌ〜１．４ｇ／ｍｌの密度を有する。周囲の液体よりも粒子の方が密度が高いことが有利であるが、液状化と再充填を容易にするためには密度は高すぎてはいけない。

すべての態様に適用される一部の実施形態では、マトリックス粒子は固定化されたプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ラクダ科の動物の一本鎖抗体又はそれらの機能的異種などのタンパク質性リガンドを含む。タンパク質性リガンドは、抗体や抗体断片などの商業上関心の高いタンパク質を高選択的に捕捉するが、高アルカリ性洗浄液に対する安定性は限られる。タンパク質性リガンドを担持する基材は高価でもあり、尚更別のプロセスにも再利用したい。このように、これら基材のプロセス間洗浄の改善には大きな関心が寄せられている。

すべての態様に適用される特定の実施形態では、第１の洗浄液は、及び随意だが第２及び／又は第３の洗浄液も、ｐＨ値が１０以上、１２以上、１３以上又は１３〜１４などのアルカリ性である。アルカリ性洗浄液は、ふつうは最も効果的であり、洗浄効率は一般にはｐＨとともに増大するが、多くの場合は基材の安定性のせいで有用なｐＨ範囲に上限が設けられる。アルカリ性洗浄溶液は、ＮａＯＨ、水酸化カリウム（ＫＯＨ）他の水溶液であり得、例えばＮａＯＨ又はＫＯＨの濃度は１０ｍＭ〜１Ｍ又は１０ｍＭ〜０．１Ｍなど１０ｍＭ〜５Ｍであるが、水と混和する溶媒、界面活性剤、カオトロープ、還元剤、塩、殺菌剤他などの他の成分も含んでよい。洗浄液は、カラムの衛生化、つまりベッド又はカラム内の他の場所に存在する微生物又は胞子の殺菌も提供し得る。このことはアルカリによって実現し得るが、例えば次亜塩素酸塩、二酸化塩素、過酸化水素又は過酢酸のような他の殺菌剤を用いることも、これらの剤と基材及びカラムが適合する場合は可能である。やはりすべての態様に適用される一部の実施形態では、洗浄液のうちの１種類又は複数が酸性であり、例えばリン酸、酢酸、ベンジルアルコール及び／又は過酢酸のうちの１種類又は複数である。

すべての態様に適用される一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムの内径は、１０ｃｍ以上、２０ｃｍ以上、２．５ｃｍ〜２００ｃｍ、１０ｃｍ〜２００ｃｍ又は２０ｃｍ〜２００ｃｍなど、２．５ｃｍ以上である。圧密化ベッドの直径が大きいほど液状化が容易になる。さらに、プロセスは、ふつうは大径のカラムが使用される、生物薬剤のパイロット製造及びフルスケール製造にとって特に有利である。

すべての態様に適用される特定の実施形態では、圧密化ベッドの高さは、５ｃｍ〜４０ｃｍ又は５ｃｍ〜３０ｃｍなど、５ｃｍ〜５０ｃｍである。前述したが、ベッドの高さが３０ｃｍ〜５０ｃｍを超えなければ液状化はより容易になる。他方で、ベッドの高さが少なくとも５ｃｍであれば、特に大径のカラムでは再充填がより容易になる。再充填ベッドの層化は、ベッドの高さが１０ｃｍ〜４０ｃｍなど、１０ｃｍ〜５０ｃｍのものを用いれば容易になる。

すべての態様に適用される一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムの内径と圧密化ベッドの高さの比は、０．４〜４０、１〜４０、１〜２０、５〜４０、５〜２０、少なくとも０．４、少なくとも１又は少なくとも５など、少なくとも０．４である。直径／高さの比が高いとベッドの液状化はより容易になるが、再充填は比が高すぎない方が容易になる。

すべての態様に適用される特定の実施形態では、マトリックス粒子は基本的には球状であり、（体積加重）平均径は、３０μｍ〜３００μｍ、３０μｍ〜１５０μｍ又は５０μｍ〜１００μｍなど、少なくとも２０μｍである。平均ビーズ径が２０μｍ以上であれば液状化と再充填の両方が容易になるが、過度に高い沈降速度を防止するには３００μｍを超えないことが有利である。また、球形状は液状化と再充填を容易にする。

すべての態様に適用される一部の実施形態では、マトリックス粒度分布の（体積加重）変動係数は、１０％〜４０％又は１５％〜３５％など、１０％〜５０％である。マトリックス粒子の適当な多分散性は、再充填中、ベッドの所望の層化を可能にする。他方で、多分散性が高すぎると、カラムの操作中に過剰な背圧を誘発することになる。

すべての態様に適用される特定の実施形態では、マトリックス粒子は架橋アガロースなどの多糖類担体を含む。多糖類基材は、親水性及び弾性なので、液状化及び再充填が容易である。非脆性でもあるので、洗浄及び再充填の操作中に摩損する恐れが減少する。さらに、このような操作に適した密度を有している。一部の実施形態では、高密度フィラーなしの多糖類担体が用いられる。そのような担体の密度は、１．０ｍｇ／ｍｌ〜１．０５ｍｇ／ｍｌの範囲となる。

主として第１の態様及び第３の態様に適用される一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の上昇流の速度は、２００ｃｍ／時〜４００ｃｍ／時など１００ｃｍ／時〜５００ｃｍ／時であり、第１の洗浄液の粘度は１．０ｍＰａｓ〜１．３ｍＰａｓなど１．０ｍＰａｓ〜１．５ｍＰａｓである。速度と粘度は洗浄中のマトリックス粒子の液状化及び懸濁に影響するので、当業者であれば、所与の液体粘度に対する最適な速度を見出すために何らかの実験作業が必要であり得ることを理解しよう。或いは、適切な流速は、例えばＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｚａｋｉ方程式ｕ＝ｕ_iεⁿを用いて計算することができ、式中、ｕは、排除体積（液体体積率）εの懸濁液中の粒子沈降速度である。ｕ_iは、無限希釈状態で妨害されない粒子沈降速度であり、ｎはＲｅ＜０．２：ｎ＝４．６５＋１９．５ｄ／Ｄ；０．２＜Ｒｅ＜１：ｎ＝（４．３５＋１７．５ｄ／Ｄ）Ｒｅ^-0.03；１＜Ｒｅ＜２００；ｎ＝（４．４５＋１８ｄ／Ｄ）Ｒｅ^-0.1；２００＜Ｒｅ＜５００：ｎ＝４．４５Ｒｅ^-0.1；Ｒｅ＞５００：Ｎ＝２．３９（式中、ｄは平均粒径であり、Ｄはカラムの内径である）による系のレイノルズ数Ｒｅに応じて選択された係数である。ｕ_iは、ストークスの法則ｕ_i＝ｇｄ²（ρ_p−ρ_l）／１８η（式中、ｇは重力加速度であり、ρ_pは粒子密度であり、ρ_lは液体密度であり、ηは液体粘度である）で計算することができる。上昇流の速度は、ｕと同じ範囲になるように適切に選択し得る。

すべての態様に適用される特定の実施形態では、プロセス又は方法はさらに、ステップ（ｄ）とステップ（ｅ）の間に、洗浄済みのマトリックス粒子の試料を回収し、この試料を純度に関し分析するステップを含む。このステップは、洗浄ステップで十分な基材純度が得られていることを確認する。カラム容量が例えば少なくとも１Ｌ又は少なくとも１０Ｌと大きい場合、少量の試料（例えば１ｍＬ未満又は１０ｍＬ未満）を回収しても次のプロセスのステップに悪影響はない。基材の種類と夾雑物質のプロファイルにより、アミノ酸分析、窒素分析、ラマン又はＩＲ分光法他など、いくつかの異なる分析方法を適用できる。

第１の態様及び第２の態様の両方に適用される一部の実施形態では、プロセスはさらに、ステップ（ｆ）の後、目的生体分子を回収し、随意でさらに精製してから薬剤調合に使用するステップを含む。ステップ（ｆ）の目的生体分子がステップ（ｂ）の第１の目的生体分子とは別の第２の目的生体分子である場合、例えば第１の目的生体分子の残渣の最大キャリーオーバーは０．８ｍｇ／Ｌの充填ベッドになることを意味し得る。全体として、製薬に使用するための純度要件は非常に高く、基材中のいっさいの夾雑物質を徹底的に排除することが不可欠である。

第３の態様では、本発明は、充填ベッドクロマトグラフィーカラムを洗浄及び／又は衛生化する方法を開示し、方法は以下のステップを含む。
（ａ）分離マトリックス粒子の圧密化ベッドを有する軸流クロマトグラフィーカラムを用意するステップであって、圧密化ベッドは下部担体ネットと可動上部アダプターの間に納められている、ステップ、
（ｂ）アダプターを圧密化ベッドの高さの１０％以上持ち上げるステップ、
（ｃ）洗浄液を、ベッドを液状化するのに十分な条件下で、ベッドを上方向に通過させるステップ、及び
（ｄ）充填流体を下方向にカラムを通過させて液状化ベッドのマトリックス粒子を再充填して圧密化ベッドを作り、アダプターを下降させて充填ベッドと接触させ、随意で圧縮させるステップ。

この方法は、マトリックス粒子とカラム器具の両方の洗浄を実現することになる。

上記の実施形態はこの態様にも適用される。なお、第３の態様のステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、及びステップ（ｄ）は、それぞれ第１の態様のステップ（ｃ）、ステップ（ｄ）、及びステップ（ｅ）に対応する。

材料／調査したユニット
カラム：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＸＫ−２６／２０（内径２６ｍｍ）、商品番号２８−９８８９−４８。

クロマトグラフィー系：Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ Ａ２５−３２１０５ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社 Ｕｎｉｃｏｒｎ ６．１ソフトウェア内蔵。

マルチサイザー３、ＡＤ４８１６４、ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＢ）（粒度分布分析）
タンパク質分離媒体／化学物質
アガロース基材：高剛性の架橋アガロースビーズを米国特許第６６０２９９０号に記載の方法によって調製した。平均ビーズ径は８０μｍであり、逆サイズ排除クロマトグラフィーでデキストランをプローブ分子として決定した空隙率は、分子量１１０ｋＤａのデキストランでＫ_D値が０．５４に相当し、このことはビーズ体積の５４％をデキストラン分子が利用できたことを意味している。空隙率を決定する方法は、Ｌ Ｈａｇｅｌ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ７４３，３３−４２（１９９６）に記載されている。

０．１Ｍ ＮａＯＨ、ドイツ国メルク社（Ｍｅｒｃｋ）のＴｉｔｒｉｓｏｌ（登録商標）。

赤色色素：ドイツ国Ｄｒｙｓｔａｒ Ｔｅｘｔｉｌｆａｒｂｅｎ社のＰｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ、Ｈ−Ｅ７Ｂ。

青色色素：ドイツ国Ｄｒｙｓｔａｒ Ｔｅｘｔｉｌｆａｒｂｅｎ社のＰｒｏｃｉｏｎ Ｂｌｕｅ、Ｈ−ＥＧＮ １２５。

方法
一般的なゲル洗浄手順及びスラリー中ゲル含有量の決定
２０％エタノールを含むゲルスラリーのアガロース基材をガラスフィルター（Ｓｃｈｏｔｔ Ｄｕｒａｎ ４）上で減圧（ｕｎｄｅｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を用いてＭｉｌｌｉ−Ｑ水で繰り返し洗った。次いで半乾きの基材をメスシリンダーに移し、およそ５０／５０（ｖ／ｖ）のゲル／水比になるまでＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えた。充填の調査のために、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を沈降した基材スラリーに加えるか又はそれから吸引して、ちょうど５０％（ｖ／ｖ）の沈降基材濃度が得られるようにした。

充填前に５０％基材スラリーをＸＫ−２６／２０カラムに満たす
メスシリンダー内で沈降したスラリーを振盪して均質な懸濁液にした。この手順の間、シリンダーの開放端をパラフィルムで覆った。次いでちょうど必要なだけの量をカラムに加えた。

粒度分析
粒度分布は、マルバーン社（Ｍａｌｖｅｒｎ）のマスターサイザーレーザー回折器で測定した。データは個数と体積両方の分布としてプロットした。

試料調製の概要
試料は室温でおよそ３日間０．９％ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）に懸濁させて、ビーズが安定した粒度を得ていることを確認した。試料（ｇ）／ＮａＣｌ体積の比は次のとおりであった。

結果と考察
無着色基材
充填
目的は、高さ６０ｍｍの圧縮された沈降ベッド（高さ６０ｍｍは３２ｍＬに等しい）を得ることであった。このために、７０ｍＬの５０％基材スラリーをカラムに注入した（上端要素は取り外した）。カラムを満たしてから上端要素を取り付け、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を下方向に２５ｍＬ／分（２８３ｃｍ／時）で押し出した。充填作業は１０分続いた。カラムの背圧は３．５バール（ＸＫ２６／２０での上限は５バール）になるように監視した。充填が終了すると、上端要素をベッド表面に達するまで下降させた。その後充填ベッドを上部アダプターでさらに５ｍｍ押して、ベッドをさらに圧縮した。圧縮ベッドの最終高さは５７ｍｍ（基材は３０ｍＬ）であった。

充填解除
充填解除の手順では、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアで流れの方向を上方向に変更した。理想的には、充填解除の流量は、０．１Ｍ ＮａＯＨを溶媒として（ＣＩＰ溶液）、１カラム体積（ＣＶ）／分とすべきである。（充填した基材に対する）１カラム体積は、３０ｍＬ／分（３３９ｃｍ／時）に等しい。しかし、Ａｋｔａ Ａｖａｎｔの最高流量は２５ｍＬ／分（２８３ｃｍ／時）である。したがって、これは選択した流量であった。充填解除プロトコルでは手順は次のとおりであった。

上端要素のナットを緩める
上端要素のスプリングをペーパークリップで妨害して上端要素が自由に動けるようにする
ポンプを始動する
上端要素が所望の位置に達したらポンプを停止する
上端要素のナットを締める
ペーパークリップを取り外す（上端要素は完全に固定される）
上方向に流れを加えると、上端要素は所望の位置まで徐々に持ち上がって、全部で６７ｍＬを包囲する。充填ベッド全体が充填解除中持ち上がる。この手順が終わってから２分後に充填基材ベッドが崩れ始めたことが通知された。およそ４０分後、基材はカラム底部に沈降していた。

５．１．３流れの振動
ベッドが崩れる速度を上げるために、流れの方向は振動する態様に変更することができる。理想的には、振動は、０．１Ｍ ＮａＯＨを２５ｍＬ／分（２８３ｃｍ／時）の流量で用いて交互の上昇流と下降流によって実施すべきである。使用したポンプ装置は、流れの方向を変えるのに一定の反応時間を有した。すなわち、選択した流量に達するのにおよそ１５秒を要した。なお、展開相においては、下方向の時間と比べて上方向の時間が長い方が有利であった。この理由は、基材がカラムの底部（下向きの流れの方向）に充填されている場合、基材の「栓」は反対方向のように容易に崩されないからである。最終の振動プロトコルは、組合せた６つの上昇流と下降流のサイクルを含んでいた。各サイクルは、２．５分の上昇流期間、続いて１分の下降流期間を含んだ。振動プロトコルの全体時間は２３．５分であった。

着色樹脂での試験
開発した混合プロトコルの効率を証明するために、染色した基材を用いて調査を行った。

染色及びゲルスラリーの調製
２０％エタノールを含むおよそ５００ｍＬのアガロース基材を赤色又は青色の色素で染色した。２種類の調製済み基材（赤色色素と青色色素）を２つのガラスフィルター（Ｓｃｈｏｔｔ Ｄｕｒａｎ ４）上で減圧を用いてＭｉｌｌｉ−Ｑ水で繰り返し洗った。

半乾きの着色基材を２本のメスシリンダー（各１００ｍＬ）に入れた。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水をおよそ５０／５０の基材／水比となるまで各シリンダーに加えた。充填する前に、沈降した基材にＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて、１種類の青色に着色された５０％（ｖ／ｖ）基材スラリーと、１種類の赤色に着色された５０％（ｖ／ｖ）基材スラリーを得た。

５．２．２充填（３層）
前述の充填無着色基材ベッドの高さは５７ｍｍであった。このベッド高さを得るために、７０ｍＬの５０％基材スラリーが必要であった。好ましくは、３色のベッドは、最下部の青色１層、真ん中の無着色１層、そして最上部の赤色１層を含む３層を含むべきである。各層に２３ｍＬのスラリーを用い、上述の充填プロトコルを行った。選択した充填液はＭｉｌｌｉ−Ｑ水であった。充填手順後、ゲル表面と接触するまで上端要素を下降させた。最後にアダプターをカラム内にさらに５ｍｍ深く、機械的に押し込んだ。

５．２．３充填解除
充填解除は、０．１Ｍ ＮａＯＨを２５ｍＬ／分（２８３ｃｍ／時）の流量で用いて実施した。この手順は無着色ベッドの手順と同じであり、上端要素を好ましい上端位置に達するまで流れ方向に自由に上方向に移動させた。達した時点でポンプを停止して端部要素を固定した。

５．２．４振動
振動プロトコルを用いて着色ベッドを崩した。無着色ベッドについては、振動は２５ｍＬ／分の流量で上方向と下方向のポンプ作用を用いて実施した。選択した振動液は０．１Ｍ ＮａＯＨであった。

５．２．５沈降ベッドの回収と分析
振動手順後、カラム内の紫色のスラリーを１時間かけて沈殿させた。次いで（カラムをＡｋｔａ Ａｖａｎｔに接続していた毛管ナットを外してから）上端要素を下降させてベッドと接触させた。最後に、下端要素を取り外し、上端要素を押下することによって紫色のベッドをプラスチックトレイ上に押し出すことができた。回収したベッドを５つに輪切りし、視認の結果紫色については均質であることが見出され、洗浄手順の間に粒子が完全に混合されたことが示された。

５つの輪切り部の粒度分析
５つの輪切り部を０．９％ ＮａＣｌに懸濁させた。図１と図２では、それぞれ示差個数（平均）プロットと示差体積（平均）プロットを示す。表１に結果を示す。

本明細書では、最良の形態も含め本発明を開示するために、また、あらゆる当業者が、あらゆるデバイスやシステムを作製し利用し、あらゆる組み入れた方法を実施することを含め本発明を実施することを可能にするために、諸例を用いている。本発明の特許可能な範囲は、特許請求の範囲により定められ、当業者が想到する他の例も含み得る。そのような他の例は、それらが特許請求の範囲の文言と異ならない構造的要素を備える場合又は特許請求の範囲の文言と実質的に差異のない均等な構造的要素を含む場合は、特許請求の範囲内とする。なお、１つの実施形態に関して記載したどの特徴も、ここに記載した他のどの態様及び実施形態の１以上の特徴と組合せて使用してもよい。

Claims (10)

1. １種以上の夾雑物質から１種以上の目的生体分子をクロマトグラフィー分離する方法であって、
   
   （ａ）分離マトリックス粒子の圧密化ベッドを有する軸流クロマトグラフィーカラムを用意するステップであって、圧密化ベッドは下部担体ネットと可動上部アダプターの間に納められている、ステップ、
   （ｂ）カラムで目的生体分子を１種以上の夾雑物質から分離するステップ、
   （ｃ）アダプターを圧密化ベッドの高さの１０％以上持ち上げるステップ、
   （ｄ）第１の洗浄液が、ベッドを液状化するのに十分な条件下で、ベッドを通って上の方へ流れるようにするステップ、及び
   （ｅ）液状化ベッドのマトリックス粒子を再充填して圧密化ベッドを作り、アダプターを下降させて充填ベッドと接触させ、適宜圧縮させるステップ、及び
   （ｆ）カラムで目的生体分子を１種以上の夾雑物質から分離するステップ
   を含む、方法。
2. １種以上の夾雑物質から１種以上の目的生体分子をクロマトグラフィー分離する方法であって、
   （ａ）分離マトリックス粒子の圧密化ベッドを有する軸流クロマトグラフィーカラムを用意するステップであって、圧密化ベッドは下部担体ネットと可動上部アダプターの間に納められている、ステップ、
   （ｂ）カラムで目的生体分子を１種以上の夾雑物質から分離するステップ、
   （ｃ）圧密化ベッドを充填解除し、マトリックス粒子を別の洗浄容器に移送するステップ、
   （ｄ）洗浄容器内のマトリックス粒子を第１の洗浄液と接触させるステップ、
   （ｅ）洗浄済みのマトリックス粒子をカラムに戻し、圧密化ベッドを再充填するステップ、及び
   （ｆ）カラムで目的生体分子を１種以上の夾雑物質から分離するステップ
   を含む、方法。
3. さらに、ステップ（ｂ）の後、第２の洗浄液を圧密化ベッドに送って通過させることによってカラムを洗浄するステップ（ｂ’）、及び適宜ステップ（ｂ）とステップ（ｂ’）を少なくとも１度繰り返すことを含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. さらに、ステップ（ｄ）で液状化ベッドを撹拌することを含んでおり、適宜、撹拌が、（ｉ）液状化ベッド又はマトリックス粒子を震動又は超音波処理すること、（ｉｉ）１以上のノズルからのジェット流による撹拌、及び／又は（ｉｉｉ）ステップ（ｄ）での振動流を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
5. 分離マトリックス粒子が、純水と平衡化したときに、１．０ｇ／ｍｌ〜１．４ｇ／ｍｌ、例えば１．０ｇ／ｍｌ〜１．０５ｇ／ｍｌ、の密度を有する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
6. マトリックス粒子が、固定化タンパク質リガンド、例えば固定化されたプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ラクダ科の動物の一本鎖抗体又はそれらの機能的異種、を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
7. 第１の洗浄液がアルカリ性、例えば１０以上、１２以上、１３以上又は１３〜１４のｐＨ値を有するもの、である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
8. （ｉ）クロマトグラフィーカラムの内径が２．５ｃｍ以上、例えば１０ｃｍ以上、２０ｃｍ以上又は１０ｃｍ〜２００ｃｍ、であり、（ｉｉ）圧密化ベッドの高さが５ｃｍ〜５０ｃｍであり、及び／又は（ｉｉｉ）クロマトグラフィーカラムの内径と圧密化ベッドの高さの比が０．４以上、例えば０．４〜４０、である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
9. さらに、ステップ（ｄ）とステップ（ｅ）の間に、洗浄済みのマトリックス粒子の試料を回収し、試料を純度に関し分析するステップ、及び／又はステップ（ｆ）の後、第２の目的生体分子を回収し、適宜さらに精製してから薬剤調合に使用するステップを含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
10. 充填ベッドクロマトグラフィーカラムを洗浄及び／又は衛生化する方法であって、
    （ａ）分離マトリックス粒子の圧密化ベッドを有する軸流クロマトグラフィーカラムを用意するステップであって、圧密化ベッドは下部担体ネットと可動上部アダプターの間に納められている、ステップ、
    （ｂ）アダプターを圧密化ベッドの高さの１０％以上持ち上げるステップ、
    （ｃ）洗浄液が、ベッドを液状化するのに十分な条件下で、ベッドを通って上の方へ流れるようにするステップ、及び
    （ｄ）充填流体を下方向にカラムを通過させて液状化ベッドのマトリックス粒子を再充填して圧密化ベッドを作り、アダプターを下降させて充填ベッドと接触させ、適宜圧縮させるステップ
    を含む、方法。