JPH0741164B2

JPH0741164B2 - 脱脂材及びこれを用いた脱脂方法

Info

Publication number: JPH0741164B2
Application number: JP61230024A
Authority: JP
Inventors: 國世井上; 博之猪原
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1986-09-30
Filing date: 1986-09-30
Publication date: 1995-05-10
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: JPS6388035A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は生物由来他の水性溶液から蛋白質及びその他の
生理活性物質を得る目的において、混在する脂質を効率
的に除去するために用いる脱脂材及びこれを用いた脱脂
方法に関する。

〔発明の背景〕

動物由来の血清，脊髄液，腹水液，尿などの体液、動物
組織の破砕物に由来する水性溶液、動物や植物細胞及び
微生物の培養液、及びこれらの培養細胞の破砕物に由来
する水性溶液などから、蛋白質及びその他の生理活性物
質をえるためには、これらの水性溶液に混在して存在す
る脂質をまず除去する必要がある。脂質は、これらの目
的とする物質と相互作用し、分離・精製の妨害となるか
らである。

近年、生理活性物質の分離・精製には高速液体クロマト
グラフィー（HPLC）のような高価なカラム系が用いら
れ、作業の効率は飛躍的に上昇した。一方、試料中への
わずかの脂質の混入により、カラム充填剤には大きい損
傷を与えるので、試料からの効率的な脂質の除去は極め
て重要な工程である。

従来用いられてきた脂質の除去方法の１つは、ブタノー
ル，クロロホルム，ピリジン，トルエン，エーテル，ア
セトンなどの有機溶媒を10〜40％となるよう水性溶液に
加え、撹拌したのち、静置又は遠心分離により、水性層
と有機溶媒層に分離させ、通常有機溶媒層に移行した脂
質を水性層に存在する目的の生理活性物質から分離・除
去するものである。この方法については古くから知られ
ているが、この問題点の１つは、有機溶媒の添加と撹拌
に際して目的とする蛋白質あるいは他の生理活性物質の
不可逆的変性と失活がおこりやすい点である。また、時
として、これらの蛋白質や他の生理活性物質は沈殿を形
成することがある。これらの過程に伴う失活を回避すべ
く、低温下、たとえば−20℃で、ゆっくり有機溶媒を添
加するなどの工夫がなされるのが普通であるが、目的の
活性の損失は、一般に無視できない位に大きい。また、
他の１つの問題点は目的の蛋白質あるいはその他の生理
活性物質の水性層への分配が一般にその物性に依存して
変化するため、有機溶媒層への分配が避けられず、この
ことによる目的物質の損失があることである。

従来から用いられて来た脱脂方法の他の１つは、塩を添
加することにより、目的の生理活性物質を沈殿させ、沈
殿しない脂質から分離する方法である。塩析と呼ばれる
この方法は、目的の生理活性物質が特に蛋白質である時
には、有効に用いられることが知られている。塩として
は通常、溶解性の高い硫酸アンモニウムが用いられる
が、塩化ナトリウムや塩カリウム，硫酸カルシウムなど
も用いられる。本方法の問題点も先の有機溶媒添加と同
様、目的の生理活性物質が塩の添加により、変性，失活
しやすいことと、この生理活性物質の沈殿が一般に不完
全であり、本物質の損失が避けられないことである。さ
らに、他の問題点は沈殿した目的の物質を再溶解し、透
析やゲル過などの煩雑な脱塩操作を行う必要があるこ
とである。

〔発明の目的〕

近年、微生物のみならず、動物や植物の組織及びこれら
の培養細胞を用いる物質の生産がさかんになって来た。
目的の物質が水溶性物質である場合、このものの精製に
おいて、生体試料に混在する脂質を効率よく除去するこ
とは重要である。とりわけ、動物の組織や細胞に由来す
る生体試料では、脂肪，遊離脂肪酸，リポ蛋白質などの
脂質の含量が高く、脂質除去は極めて重要な問題であ
る。

近年、正常型やがん化した動物細胞や遺伝子組換え動物
細胞や動物組織を用いる有用生理活性物質が工業的規模
で生産されるようになってきた。これにはモノクロナル
抗体，インターフェロン，インターロイキン，他のリン
ホカイン，ウロキナーゼ，組織プラスミノーゲン・アク
ティベーターや生理活性ペプチドなどを列挙することが
でき、これらの分離・精製で、脂質を除去することが同
様に重要な問題である。

本発明の目的は、特に前述の生体試料である水性溶液か
ら、目的の生理活性物質の活性を出来るだけ失うことな
く、脂質を除去するための脱脂材およびこの脱脂材を用
いて、該水性溶液から脂質を除去する方法である。

〔発明の構成〕

本発明者等は、前述した脂質除去に関する問題点を解決
すべく鋭意研究をかさねた結果、本発明に到達した。

以下、本発明を更に詳しく説明する。

本発明は、各種の鎖長をもつ炭化水素鎖あるいはフェニ
ル基を各種の基材に共有結合させてえられる複合物を生
体由来の水性溶液に含まれる脂質の脱脂材に関する。

更には、本脱脂材を用いて、生体由来の水性溶液から脂
質を除去する方法に関する。すなわち、該脱脂材を粒状
に形成したものをカラムに充填し、生体由来の水性溶液
をカラムに通過させ、脂質を吸着除去する方法である。
この脱脂方法において特筆すべきことは、当該水性溶液
の前処理、例えば、希釈，濃縮、あるいは塩や有機溶媒
の添加，透析などを必要としないことである。固型物
を、例えば0.45μｍの口径をもつ過膜等で除去した該
水性溶液であれば、何の前処理もなく、脱脂工程にまわ
しうる。さらに別の特筆すべき点は、かかる脱脂工程に
おいて、目的の生理活性物質の吸着や変性などによる損
失は通常ほとんどおこらないことである。

〔発明の効果〕

基材に共有結合させた炭化水素鎖の炭素数が１ないし18
のとき、及び基材にフェニル基を共有結合させたとき、
脱脂効果は試料の水性溶液のpHに依存せず、十分満足で
きるものであった。特に、炭素数が４ないし８の炭化水
素鎖を共有結合させたとき、及びフェニル基を共有結合
させたときにより好ましい結果を与えた。

試料の水性溶液のイオン強度が0.5M以下のとき、目的と
する生理活性物質の吸着は実質的におこらなかった。こ
のことは、とりもなおさず、試料として、血清，腹水液
などの体液や細胞の培養液を用いるときには、通常、問
題なく前処理なしで脱脂処理に供しうることを示してい
る。イオン強度が0.5Mをこえるときは、例えば水あるい
は適当な緩衝液で希釈すればよい。

炭素鎖を基材に共有結合させた脱脂材の場合、一般的傾
向として、炭素鎖長の長い方が脱脂効果は大きいが、蛋
白質の吸着もおこりうる可能性があるので、目的の生理
活性物質が、より水溶性の化合物、例えば、糖，親水性
アミノ酸や親水性ペプチドであれば、比較的高塩濃度
（イオン強度0.5〜1.0M）で、比較的長鎖炭化水素鎖
（炭素数８〜30）で脱脂することも可能ではあるが、し
かし、一般に蛋白質やペプチドと脂質との分離の場合に
は、比較的短い炭化水素鎖（炭素数１〜８）を用いて、
低塩濃度（イオン強度0.5M以下）で脱脂をするとき、目
的の蛋白質やペプチドの脱脂材への吸着による損失が少
ないので好ましい。

脱脂材に用いる基材について説明する。

本質的に天然又は合成の基材を不都合なく用いることが
できる。具体的には、デキストラン，アガロース，セル
ロース，スチレン−ブタジエンゴムや天然ゴム等のラテ
ックス，シリカゲル，ヒドロキシアパタイト，アクリル
アミドポリマー，ビニルポリマー，（メタ）アクリレー
トポリマー，スチレンポリマー及びこれら合成樹脂のコ
ポリマーなどを列挙できる。合成樹脂の中では、アルコ
ール性水酸基をもつ親水性樹脂がとりわけすぐれてお
り、具体的には、グリセリンジ（メタ）アクリレート,2
−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレ
ングリコールジ（メタ）アクリレート，ペンタエリスリ
トールポリ（メタ）アクリレート，グリシジル（メタ）
アクリレートなどのコポリマーを列挙できる。これらの
基材の粒径としては、5,000〜10オングストローム、好
ましくは1,000〜50オングストロームである。基材の孔
径は1,000〜２μｍ、好ましくは100〜10μｍである。こ
れらの基材に炭化水素鎖やフェニル基を公知の方法で共
有結合させることができる。通常、エーテル結合，エス
テル結合あるいはイソシアネートを用いる尿素結合であ
り、シリカゲルを基材の場合には、Si−Ｏ−Si（シロキ
サン）結合が用いられる。これらにおいて適用される有
機化学的方法は、例えば萩ら、「東洋曹達研究報告」第
81巻,81頁,1981年に記載されている。

炭化水素鎖としては、メチル基，エーテル基，プロピル
基，ブチル基，オクチル基，ドデシル基，オクタデシル
基などの炭素数１〜18の飽和又は不飽和基で、分岐を有
していてもよい。炭素数がこれ以上の炭化水素鎖は脱脂
効果において格別すぐれているとはいえない。従って、
実質的には炭素数１〜18、好ましくは４〜８の炭化水素
鎖であればよい。

本発明の脱脂材は、いろいろな方法で用いられる。例え
ば、生体試料の水性溶液中に本脱脂材を加え、目的の生
体成分を変性させないよう低温（４℃以下）で注意深く
撹拌したのち、静置，過あるいは遠心分離などの方法
により、脱脂材を除去し、当該水性溶液中の脂質を除去
する方法。さらに一般的なのは、脱脂材を粒状に形成し
てカラムに充填し、このカラムに生体試料の水性溶液を
流入させ、流出してくる脱脂された溶液をあつめること
により脱脂する方法である。

とりわけ後者の方法の利点は、脱脂工程に続いて、次の
カラム・クロマトグラフィー工程へ直接連結できる点で
ある。生体由来の水性溶液からの物質の分離には、各種
のカラム・クロマトグラフィーが用いられる。例えば、
分子ふるいゲル・クロマトグラフィー，イオン交換クロ
マトグラフィー，疎水的相互作用クロマトグラフィー，
親和性吸着クロマトグラフィーなどがある。従来、軟質
ゲルが、これらの目的に広く用いられてきたが、近年、
実験室においても、工業的規模においても、硬質ゲルを
用いたHPLCが使われている。とりわけ、HPLC用ゲルは一
般に高価であり、分離を担当する主カラム系に先立ち、
プレカラム又はガードカラムと呼ばれるカラムに試料を
通過させ、主カラムへの浮遊粒子等の流入による主カラ
ムのゲルの汚損を防ぐ。

通常、分離用ゲル製造業者により充填されたカラムを用
いるHPLCにおいては汚損したゲルを洗浄・再生し、再充
填することは一般のユーザーにとっては、困難な作業で
あり、プレカラムの使用は、一般に強く推奨される。本
発明における脱脂材は一方ではこのプレカラム用の充填
材としても十分に用いうることが可能である。

本発明者等は、脱脂材として例えば、オクチル基を結合
させたセルロースやブチル基を結合させた親水性ビニル
ポリマー（商品名「トヨパール」，東洋曹達工業（株）
製）をカラムに充填したのち、ウシ血清やマウスのハイ
ブリドーマを移植したマウス腹水液をこのカラムに通過
させ、脂質を除去した水性溶液をえた。さらにまた、こ
のカラムをプレカラムとして、主カラムに連結させて、
連続的にクロマトグラフィーを行うことができ、例え
ば、アルブミン，グロブリン，トランスフェリンなどを
分離することができた。

次に、脱脂効果の確認法について述べる。

生体由来の水性溶液を脱脂材に通過させるに際して、通
過前と通過後の総蛋白質量，目的の生理活性物質量、及
び総脂質量（中性脂肪と遊離脂肪酸）を定量した。蛋白
質は、ウシ血清アルブミンを標準物質とするロウリー法
によった。目的物質の定量は、酵素であればその活性、
抗体であれば抗原への結合性あるいはプロテインＡへの
結合性など、その物質にあわせて公知の分析法を用い
た。脂質については、以下に説明するように遊離脂肪
酸，中性脂肪（トリグリセリド），りん脂質及びリポ蛋
白質について定量した。遊離脂肪酸は、コエンザイムＡ
（CoA）とアデノシン・三りん酸（ATP）の存在下にアシ
ルCoAシンセターゼの作用により、アシルCoA,アデノシ
ン・一りん酸（AMP）およびピロりん酸を生成する。生
成したアシルCoAはアシルCoAオキシターゼの作用によ
り、pH6.8で酸化され、2,3−トランス−エノイルCoA及
び過酸化水素を生成する。生成した過酸化水素はペルオ
キシターゼの作用により、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ
−（β−ヒドロキシエチル）−アニリンと４−アミノア
ンチビリンとを定量的に酸化縮合させ、赤紫色の色素を
生成させる。このものは550nmの吸光度の測定により定
量される。実際の測定は和光純薬工業（株）製の商品名
「NEFA・Ｃ−Testwako」キットを用いて行った。

トリグリセリドはリポプロテイン・リパーゼの作用によ
り、グリセリンと脂肪酸に分解される。生成したグリセ
リンはATP,ニコチンアミドアデノシン・ジヌクレチド
（NAD）の存在下でグリセロキナーゼ及びグリセリン−
３−りん酸脱水素酵素の作用で最終的にジヒドロキシア
セトンりん酸となる。同時に補酵素NADはNADH₂に還元さ
れる。生成したNADH₂はシアホラーゼの酵素作用で、テ
トラゾリウム塩を還元して紫色のジホルマザンを生成す
る。これの吸光度を560nmで測定して、トリグリセリド
を定量する。実際の測定は和光純薬工業（株）製の商品
名「Triglyceridec II−Test wako」キットを用いて行
った。

りん脂質を含む溶液にトリクロル酢酸を加えるとりん脂
質は蛋白質と共に沈殿する。遠心分離により、沈殿をあ
つめ、硫酸及び過マンガン酸塩を加え、沸とう水浴中で
加熱すると、無機りん酸が生じる。これにモリブデン酸
アンモニウム及び還元剤を加えると、モリブデン・ブル
ーが生じ青色を呈する。これを660nmで測定し、りん脂
質を定量する。

リポ蛋白質を含む溶液に、ヘパリンと塩化カルシウムを
加えると、選択的にリポ蛋白質が沈殿する。この沈殿に
コレステロール・エステラーゼ，コレステロール・オキ
シターゼ,4−アミノアンチピリン及びフェノールを含む
発色試薬を加えると、沈殿中のエステル型コレステロー
ルは遊離型コレステロールとなり、既存の遊離型コレス
テロールと共にコレステロールオキシターゼにより酸化
されて対応する過酸化水素を生成する。過酸化水素はパ
ーオキシダーゼの作用により、フェノールと４−アミノ
アンチピリンを定量的に縮合させ、赤色の色素を生成さ
せる。これを505nmの吸光度を測定することにより、沈
殿中の総コレステロール量を求める。これに、血清につ
いて経験的に求められた係数2.86を乗じることにより、
リポ蛋白質の含量を求める。これは、和光純薬工業
（株）製、商品名「β−Lipoprotein C−Test wako」キ
ットを用いて行った。

以下に本発明を実施例を挙げて詳細に説明する。ただ
し、本発明は実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）ヒトのＣ反応性蛋白質に対するモノクロナル抗体を産生
するハイブリドーマを移植したマウスの腹水液7.5mlを
「ブチル・トヨパール650M」（東洋曹達工業（株）製、
商品名：親水性ビニルポリマー１）を充填した内径2.2c
m,高さ5.0cmのカラムに通過させた。その後、溶出に用
いた緩衝液は40mM NaCl含有、20mM Tris−HCl緩衝液、p
H8.0であり、流速は4.5ml/分で10分間溶出した。カラム
を通過させる前後の脂質と蛋白質の濃度は次表のとおり
であった。

（実施例２）実施例１における「ブチル・トヨパール650M」の代わり
に「フェニル−セファロースCL−4B」及び「オクチル・
セファロースCL−4B」（共にファルマシア社製、商品
名）、「TSKゲルODS−120T」，「TSKゲル・スチレン6
0」（共に東洋曹達工業（株）製、商品名）及びメチル
基を共有結合させた「トヨパールHW−60」（東洋曹達工
業（株）製、商品名）を用いて、同じ条件で実施した実
験の結果を以下に示す。数字は、脱脂材処理の前後にお
ける各成分の除去率（％）である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】炭素数が１ないし18の炭化水素鎖あるいは
フェニル基を共有結合させた天然又は合成樹脂の基材か
らなる水性溶液中の脂質を除去するための脱脂材。
【請求項２】合成樹脂の基材がポリスチレン，スチレン
系コポリマー，（メタ）アクリレート系コポリマー又は
アガロースの一種である特許請求の範囲第１項記載の脱
脂材。
【請求項３】炭素数が１〜18の炭化水素鎖あるいはフェ
ニル基を共有結合させた粒状の天然又は合成基材からな
る脱脂材をカラムに充填して、これに脂質含有水性溶液
を通過させ、脂質を除去し、該水性溶液中に存在する蛋
白質及びその他の生理活性物質を精製することを特徴と
する脱脂方法。