ES2896939T3 - Un método de separación de biomoléculas - Google Patents

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Abstract

Un método en un sistema de separación (1; 101; 201; 701; 801) para separar una biomolécula de un cultivo celular, que comprende las etapas de: - suministrar un alimento de un cultivo celular (3; 103; 203; BP) que comprende dicha biomolécula a un separador magnético (5; 105; 205; MS) y suministrar al separador magnético perlas magnéticas que comprenden ligandos capaces de unir esta biomolécula; - separar mediante el separador magnético dichas perlas magnéticas con biomoléculas unidas del resto del alimento; - enviar dichas perlas magnéticas como una suspensión con un tampón añadido a una célula de elución (7; 107; 207; EC); - empaquetar la suspensión de perlas magnéticas en la célula de elución (7; 107; 207) para proporcionar un lecho de perlas magnéticas dentro de la célula de elución con un volumen vacío inferior al 60%; y - eluir las biomoléculas unidas en la célula de elución.

Description

DESCRIPCIÓN
Un método de separación de biomoléculas
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a un método en un sistema de separación para separar una biomolécula de un cultivo celular.
Técnica relacionada
Tradicionalmente, una biomolécula deseada se separa de un cultivo celular aclarando primero el cultivo celular, es decir, eliminando células, otras biomoléculas y diferentes productos de reposo. La clarificación comprende habitualmente, por ejemplo, ultracentrifugación, filtración profunda y filtración estéril. Después de la etapa de clarificación es necesaria una purificación adicional, por ejemplo mediante cromatografía. En muchos sentidos, este es un procedimiento complicado, lento y costoso.
El documento US 2016/0184737 A1 describe un procedimiento para la separación a gran escala de moléculas que comprende proporcionar partículas porosas magnéticas que tienen afinidad por dicha molécula a una solución con dichas moléculas, mediante lo cual se puede obtener una concentración de dichas moléculas.
Compendio
Es un objeto de la presente invención proporcionar un método mejorado para separar biomoléculas de un cultivo celular.
Esto se logra con un método según la reivindicación independiente.
En un aspecto de la invención, se proporciona un método en un sistema de separación para separar una biomolécula de un cultivo celular. El método comprende las etapas de:
- proporcionar un alimento de un cultivo celular que comprende dicha biomolécula a un separador magnético y proporcionar al separador magnético perlas magnéticas que comprenden ligandos capaces de unir esta biomolécula;
- separar mediante el separador magnético dichas perlas magnéticas con biomoléculas unidas del resto del alimento;
- enviar dichas perlas magnéticas como una suspensión con un tampón añadido a una célula de elución;
- empaquetar la suspensión de perlas magnéticas en la célula de elución para proporcionar un lecho de perlas magnéticas dentro de la célula de elución con un volumen vacío inferior al 60%; y
- eluir las biomoléculas unidas en la célula de elución.
De este modo se consigue un método más eficaz para separar biomoléculas. El procedimiento de separación es mucho más fácil, rápido y económico que los procedimientos de separación tradicionales. Cuando las células y los contaminantes sólidos se separan de las perlas magnéticas en el separador magnético, las perlas se transfieren a una disposición de elución separada con un volumen muerto bajo para facilitar una concentración alta y un volumen de elución bajo de la biomolécula diana.
La elución se puede realizar en un volumen menor que en el separador magnético, lo que mejorará la efectividad. Una captación por lotes de biomolécula dará una captación más homogénea de la diana en las perlas en comparación con la cromatografía tradicional. En la cromatografía tradicional, la concentración de la diana es alta en la entrada de la columna y puede ocurrir la formación agregada de la diana. Si la diana se distribuye uniformemente en el lecho de resina, existe un menor riesgo de agregación y precipitación en la elución.
En una realización de la invención, las perlas magnéticas se envían desde la célula de elución para su reutilización en el separador magnético.
En una realización de la invención, el método comprende además la etapa de:
- mezclar el alimento del cultivo celular y las perlas magnéticas en una célula de captura antes de que se proporcionen al separador magnético permitiendo que las biomoléculas se unan a las perlas magnéticas.
En otra realización más de la invención, la etapa de separación comprende:
- aplicar un campo magnético al separador magnético permitiendo que las perlas magnéticas se unan magnéticamente a partes de material magnético dentro del separador magnético;
- lavar otros componentes del separador magnético que no estén unidos magnéticamente a las partes de material magnético;
- y la etapa de enviar dichas perlas magnéticas a una célula de elución comprende
- liberar el campo magnético al separador magnético antes de que se reenvíen las perlas magnéticas.
En otra realización más, el método comprende además las etapas de
- limpiar in situ , CIP, de la célula de elución y de las perlas magnéticas después de la elución;
- equilibrar las perlas magnéticas en la célula de elución después del CIP y antes del envío de las perlas magnéticas desde la célula de elución; y
- tira opcional después de la elución y antes del CIP.
Según una realización de la invención, se proporciona una nueva porción de alimento del cultivo celular y perlas magnéticas al separador magnético mientras que una porción anterior está en la célula de elución, por lo que al menos dos porciones de perlas magnéticas están circulando en el sistema de separación, tal como donde se proporciona una nueva porción de alimento del cultivo celular y perlas magnéticas en el separador magnético, mientras que una porción anterior está en la célula de elución y una porción anterior está en una célula de captura, por lo que tres porciones de perlas magnéticas están circulando en el sistema de separación.
Según otra realización más, el método comprende además una primera etapa de conectar las partes del sistema mediante tubos flexibles preesterilizados y conectores asépticos.
Según otra realización más, el empaquetado se realiza haciendo fluir la suspensión de perlas magnéticas a través de la célula de elución, donde dicha célula de elución comprende una disposición de retención para mantener las perlas magnéticas dentro de la célula de elución y permitir que el exceso de tampón escape de la célula de elución.
Según otra realización más, la etapa de empaquetado comprende empujar un adaptador dentro de la célula de elución mientras se mantienen las perlas magnéticas dentro de la célula de elución mediante una disposición de retención y permite que el tampón escape de la célula de elución. Alternativamente, según otra realización, la etapa de empaquetado comprende permitir que las perlas magnéticas construyan un lecho empaquetado en una parte inferior de la célula de elución por fuerza de gravedad y/o una fuerza magnética mientras se permite que el exceso de tampón escape de la célula de elución. Según otra realización alternativa más, la etapa de empaquetado comprende empaquetar en flujo las perlas magnéticas haciendo fluir la suspensión de perlas magnéticas en una entrada inferior de la célula de elución, cuya célula de elución comprende un adaptador colocado en una posición inicial en la célula de elución cuando una suspensión de perlas magnéticas comienza a llenar la célula de elución, estando dicha posición de inicio más cerca de la entrada inferior de la célula de elución que una posición final del adaptador, correspondiendo dicha posición final a la posición del adaptador cuando se completa el llenado de perlas magnéticas en la célula de elución, manteniendo dicho adaptador una fuerza hacia la dirección del flujo de la suspensión y permitiendo que el tampón escape a través del adaptador durante el empaquetado.
Según otra realización, el método comprende además la etapa de liberar una disposición de retención en la célula de elución después de la elución y enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución posiblemente para su reutilización en el separador magnético. Según una realización del mismo, liberar una disposición de retención comprende abrir un cierre inferior, retirar un filtro inferior o eliminar una fuerza magnética. Según una realización alternativa del mismo, el envío de las perlas magnéticas se realiza empujando un adaptador en la célula de elución hacia una salida de la célula de elución. Según otra realización alternativa de la misma, la etapa de enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución posiblemente para su reutilización en el separador magnético comprende además la etapa de:
a) añadir un tampón a la célula de elución para volver a suspender el lecho y bombear o expulsar las perlas magnéticas de la célula de elución; y/o
b) enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución a una célula intermedia donde se puede eliminar el exceso de tampón, por ejemplo manteniendo las perlas magnéticas dentro de la célula intermedia por fuerza magnética mientras se drena la célula intermedia del tampón.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1a muestra esquemáticamente un sistema de separación según la descripción.
La figura 1b muestra esquemáticamente un sistema de separación según la descripción.
La figura 1c muestra esquemáticamente un sistema de separación según la descripción.
Las figuras 2a-2h muestran esquemáticamente una célula de elución según la descripción.
La figura 3a es un diagrama de flujo de un método para separar una biomolécula en el sistema mostrado en la figura la.
La figura 3b es un diagrama de flujo de un método para separar una biomolécula en el sistema mostrado en la figura lb.
La figura 3c es un diagrama de flujo de un método para separar una biomolécula en el sistema mostrado en la figura lc .
Las figuras 4, 4a-4i muestran esquemáticamente un sistema de separación según la descripción.
Las figuras 5, 5a-5f muestran esquemáticamente un sistema de separación según la descripción.
Descripción detallada de realizaciones
Según la invención, se proporciona un método para separar una biomolécula de un cultivo celular. Además, se describe una disposición de elución configurada para conectarse a un sistema de separación. El método comprende las etapas de:
- proporcionar un alimento de un cultivo celular que comprende dicha biomolécula a un separador magnético y proporcionar perlas magnéticas que comprenden ligandos capaces de unir esta biomolécula al separador magnético;
- separar mediante el separador magnético dichas perlas magnéticas con biomoléculas unidas del resto del alimento;
- enviar dichas perlas magnéticas como una suspensión con un tampón añadido a una célula de elución;
- empaquetar la suspensión de perlas magnéticas en la célula de elución para proporcionar un lecho de perlas magnéticas dentro de la célula de elución con un volumen vacío inferior al 60%; y
- eluir las biomoléculas unidas en la célula de elución.
En algunas realizaciones, el método comprende además enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución para su reutilización en el separador magnético.
Las figuras 1a, 1b y 1c muestran esquemáticamente tres posibles sistemas de separación diferentes. 1, 101, 201. Algunas características son las mismas y se describirán solo una vez y algunas características en uno de los sistemas también se pueden usar en uno de los otros sistemas. Común para los tres sistemas mostrados 1, 101, 201 es que comprenden un separador magnético 5, 105, 205. Esto podría, por ejemplo, ser un separador magnético de alto gradiente como se describe en el documento US 7506765. Un separador magnético separa las partículas magnéticas de un fluido. El separador magnético 5; 105; 205 comprende una entrada 5a; 105a; 205a para recibir un alimento de un cultivo celular 3; 103; 203 que comprende dicha biomolécula y para recibir perlas magnéticas que comprenden ligandos capaces de unirse a esta biomolécula. El separador magnético 5; 105; 205 está configurado para separar dichas perlas magnéticas con dicha biomolécula unida del resto del alimento. El separador magnético 5; 105; 205 comprende partes de material magnético dentro del separador magnéti
cuando se aplica un campo magnético. El separador magnético está configurado para liberar el campo magnético cuando las perlas magnéticas deben enviarse a una célula de elución. 7; 107; 207 proporcionado fuera del separador magnético y conectado al separador magnético. El separador magnético comprende además una disposición de lavado 13; 113; 213 configurado para lavar otros componentes del separador magnético 5; 105; 205 que los unidos magnéticamente a las partes de material magnético. La disposición de lavado 13; 113; 213 comprende al menos una disposición de suministro de tampón de lavado 15; 115; 215 conectado a una bomba y a la entrada 5a; 105a; 205a del separador magnético posiblemente a través de una célula de captura 9; 109; 209 y una disposición de recolección de tampón de lavado 17; 117; 217 conectado a una salida 5b; 105b; 205b del separador magnético. La disposición de lavado 13; 113; 213 está configurada para hacer fluir el tampón de lavado a través del separador magnético 5; 105; 205 para lavar otros componentes del alimento que no estén unidos a las partes magnéticas.
Los tres sistemas de separación 1; 101; 201 también comprenden una disposición de elución 8; 108; 208 que comprende una célula de elución 7; 107; 207. La célula de elución comprende una entrada de célula de elución 7a; 107a; 207a, en conexión con una salida 5b; 105b; 205b del separador magnético 5; 105; 205 para recibir dichas perlas magnéticas separadas como una suspensión con tampón del separador magnético. Al reenviar dichas perlas magnéticas desde el separador magnético 5; 105; 205 al tampón de la disposición de elución se añade adecuadamente al separador magnético para permitir que las perlas magnéticas fluyan hacia la disposición de elución. 8; 108; 208.
La disposición de elución 8; 108; 208 está configurada para eluir la biomolécula de las perlas magnéticas. Por la presente, la disposición de elución 8; 108; 208 comprende una disposición de suministro de tampón 8a; 108ab; 208a conectada a una entrada de célula de elución 7a; 107 a'; 207a' y una disposición de recogida 8b; 108b; 208b conectada a una salida de célula de elución 7b; 107b'; 207b'. La disposición de elución está configurada para realizar la elución proporcionando tampón de elución desde la disposición de suministro de tampón y recogiendo el eluido en la disposición de recogida y posiblemente también realizando la tira y limpieza en su lugar, CIP, proporcionando tampón de limpieza desde la disposición de provisión de tampón y recogiendo los desechos en la disposición de recogida y posiblemente realizando también el equilibrio de las perlas magnéticas en la célula de elución proporcionando tampón de equilibrio desde la disposición que proporciona el tampón.
En algunas variantes, la célula de elución 107, 207 comprende dos entradas 107a, 107a'; 207a, 207a' y dos salidas 107b, 107b'; 207b, 207b'. De hecho, también la célula de elución 7 en el sistema de separación mostrado en la figura 1 a puede tener dos entradas y dos salidas en lugar de solo una entrada y una salida y válvulas que dirigen los fluidos. Y, en consecuencia, las células de elución de los sistemas de separación mostrados en la figura 1b y 1c podrían tener solo una entrada y una salida como se muestra en la figura 1 a.
En la variante que se muestra en la figura 1 b, la célula de elución 107 comprende una primera salida de la célula de elución 107b para enviar las perlas magnéticas para su reutilización en el separador magnético 105 y una segunda salida de la célula de elución 107b' para recoger eluidos y residuos en una disposición de recogida 108b.
En la variante que se muestra en la figura 1c, la célula de elución 207 comprende una primera salida de la célula de elución 207b para enviar las perlas magnéticas a un recipiente de almacenamiento 215 y una segunda salida de la célula de elución 207b' para recoger eluidos y residuos en una disposición de recogida 208b. El sistema de separación 201 que se muestra en la figura 1c es un sistema sin circulación y reutilización de las perlas magnéticas. En este sistema, se puede proporcionar un cultivo celular 203 con perlas magnéticas y conectarlo al sistema de separación 201. Posiblemente todo el contenido del cultivo celular 203 podría proporcionarse al separador magnético 205. Las perlas magnéticas se recuperan en el recipiente de almacenamiento 215 después de la elución de las biomoléculas en la célula de elución 207.
La célula de elución 107; 207 comprende en la variante mostrada en las figuras 1b y 1 una primera entrada de la célula de elución 107a; 207a para recibir perlas magnéticas del separador magnético 105; 205 y una segunda entrada de célula de elución 107a'; 207a' para recibir tampón de elución, limpieza en el lugar, CIP, tampón y tampón de equilibrio de una disposición de suministro de tampón 108a; 208a.
La célula de elución 7; 107; 207 comprende una disposición de retención 502a-c, f-h para mantener las perlas magnéticas dentro de la célula de elución y permitir que el exceso de tampón escape de la célula de elución. Esta disposición de retención y otros detalles de las células de elución se muestran en las figuras 2a-2e y se describen más adelante.
En las variantes que se muestran en la figura 1a y 1b, una salida de célula de elución 7b; 107b está configurada para enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución para su reutilización en el separador magnético 5; 105; 205.
Los sistemas de separación 1; 101 que se muestra en la figura 1a y 1b comprenden una célula de captura 9; 109 que está conectada a la entrada 5a; 105a del separador magnético 5; 105. El cultivo celular 203 en la variante que se muestra en la figura 1c también se puede llamar célula de captura 209 si se agregan perlas magnéticas al cultivo celular 203. Otra alternativa sería agregar perlas magnéticas directamente al separador magnético 5; 105; 205 en su lugar. La adición separada de cultivo celular y perlas magnéticas directamente en el separador magnético es posible para todas las realizaciones y debería ser abarcada por esta invención.
Las células de captura 9; 109 que se muestra en las figuras 1a y 1b comprende una entrada de cultivo celular 9a; 109a para recibir un alimento de un cultivo celular 3; 103 y al menos una entrada de perlas magnéticas 9b; 109b; 109c para recibir perlas magnéticas. La célula de captura 9; 109 está configurada para mezclar el alimento del cultivo celular y las perlas magnéticas, lo que permite que la biomolécula específica se una a las perlas magnéticas antes de enviarla al separador magnético 5; 105.
En los sistemas de separación 1; 101; 201 una nueva porción de alimento del cultivo celular 3; 103; 203 y perlas magnéticas se pueden proporcionar en el separador magnético 5; 105; 205 mientras que una porción anterior está en la célula de elución 7; 107; 207. De este modo, se pueden usar al menos dos porciones de perlas magnéticas en el sistema de separación simultáneamente y los procedimientos para separar biomoléculas se pueden hacer más efectivos.
En las variantes que se muestran en la figura 1a y 1b, las perlas magnéticas están circulando en el sistema de separación. 1; 101 y todavía una nueva porción de alimento del cultivo celular 3; 103 y se pueden proporcionar perlas magnéticas en el separador magnético 5; 105 mientras que una porción anterior está en la célula de elución 7; 107 y una porción anterior está en una célula de captura 9; 109. De este modo, tres porciones de perlas magnéticas están circulando en el sistema de separación 1; 101; 201.
Para todas las variantes que se muestran en las figuras 1a-1c, el cultivo celular 3; 103; 203, el separador magnético 5; 105; 205 y la disposición de elución 8; 108; 208 se puede conectar mediante tubos flexibles preesterilizados y conectores asépticos. Además, la célula de elución puede esterilizarse previamente y desecharse. De este modo se puede proporcionar un sistema de separación cerrado y estéril para un solo uso.
El sistema de separación 101 que se muestra en la figura 1 b comprende además una célula intermedia 111 conectada a una salida de célula de elución 107b y configurada para recibir las perlas magnéticas de la célula de elución. La célula intermedia 111 está configurada para enviar las perlas magnéticas para su posible reutilización en el separador magnético 5; 105; 205. La célula intermedia 111 comprende en una variante un dispositivo de drenaje para eliminar el exceso de tampón de la célula intermedia 111. Una disposición de drenaje de este tipo también podría proporcionarse o en su lugar a la célula de captura. 9, 109 de los sistemas de la figura 1a y 1b.
En algunas variantes, la disposición de drenaje en la célula intermedia 111 se construye como la disposición de contención 502 b-c, f, h y comprende un imán para mantener las perlas magnéticas dentro de la célula intermedia 111 por fuerza magnética mientras drena la célula intermedia del tampón.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una disposición de elución 8; 108; 208 que está configurada para estar conectada en un sistema de separación como se describe anteriormente.
Las figuras 2a-2h muestran esquemáticamente diferentes células de elución. 307a-h según diferentes variantes de la descripción. Cualquiera de las células de elución 307a-h que se muestra en las figuras 2a-2h se puede utilizar como célula de elución 7; 107; 207 en los sistemas mostrados en las figuras 1a-1c y como célula de elución, CE, como se muestra en las figuras 4 y 5.
La figura 2a muestra una célula de elución 307a. Esta célula de elución 307a tiene un compartimento interior para el alojamiento de las perlas magnéticas procedentes del separador magnético. La célula de elución 307a comprende una primera entrada 309a para recibir las perlas magnéticas del separador magnético. La célula de elución 307a comprende además una segunda entrada 309b para recibir el tampón, tal como el tampón de elución, tampón CIP y tampón de equilibrio de una disposición de suministro de tampón 8a, 108a, 208a como se describió anteriormente. La célula de elución 307a comprende además en esta variante una primera salida 311 a para enviar las perlas magnéticas, posiblemente para su reutilización como se describió anteriormente. La célula de elución 307a comprende además una segunda salida 311b conectada a una disposición de recogida 8b; 108b; 208b como se describió anteriormente. En otra variante, se podría proporcionar una sola entrada y una sola salida a la célula de elución y las válvulas conectadas a la entrada y salida para dirigir correctamente el tampón y las perlas magnéticas. Todas las células de elución 307a-h descritas en relación con las figuras 2a-h se pueden proporcionar con una o dos entradas y salidas incluso si solo las células de elución 307a y 307g como se describe en las figuras 2a y 2g se muestran con dos entradas y dos salidas.
El volumen de la célula de elución. 307a puede ser de un tamaño tal que todo el contenido recibido del separador magnético, es decir, perlas magnéticas y tampón, llamado suspensión de perlas magnéticas, pueda caber en la célula de elución o el volumen puede ser menor. Si la célula de elución 307a tiene un volumen más pequeño, las perlas magnéticas se pueden empaquetar en la célula de elución por empaquetado de flujo, es decir, hacer fluir la suspensión de perlas magnéticas a través de la célula de elución 307a. Una disposición de retención 502a debe proporcionarse en la célula de elución 307a para mantener las perlas magnéticas dentro de la célula de elución 307a mientras se permite que el tampón se escape de la célula de elución. La disposición de retención 502a puede ser, por ejemplo, un filtro, también llamado frita o sinterizado siempre que cubra las salidas 311a, 311b de la célula de elución 307a. Otra posible disposición de retención podría ser una válvula de pinza que simplemente apriete la(s) salida(s) o una fuerza magnética proporcionada a la(s) salida(s) o a una parte de la célula de elución cercana a la(s) salida(s). Si el volumen interno de la célula de elución es menor que el volumen total de suspensión de perlas magnéticas que se recibirán del separador magnético, el volumen de la célula de elución puede ser, en una realización de la invención, menos de la mitad del volumen de la cantidad total de la suspensión de las perlas magnéticas que se van a recibir. Por este medio, según la presente invención, el empaquetado de flujo proporcionará un lecho de perlas magnéticas dentro de la célula de elución con un volumen vacío inferior al 60%. Si, por otro lado, la célula de elución 307a tiene un volumen interno mayor dispuesto para comprender toda la suspensión de perlas magnéticas recibida, por ejemplo, se podría usar fuerza gravitacional o fuerza magnética para proporcionar un lecho empaquetado de perlas magnéticas adecuado para el procedimiento de elución. Se podría proporcionar fuerza magnética a una parte de la célula de elución cercana a la salida, como se muestra, por ejemplo, en la figura 2f. Opcionalmente, se puede proporcionar un sistema de distribución para distribuir tampón en la célula de elución tanto a la entrada como a la salida o solo a la entrada en todas las realizaciones mostradas en las figuras 2a-2h, sin embargo, esto no se muestra.
En la figura 2b, se muestra una célula de elución similar 307b como la que se describe en la figura 2a. Sin embargo, en esta célula de elución 307b solo se proporcionan una entrada 309 y una salida 311. Como se describió anteriormente, también se podrían proporcionar dos entradas y dos salidas en esta realización de la célula de elución 307b. En esta variante de la célula de elución 307b se proporciona una disposición de retención 502b en forma de fuerza magnética. Se proporciona un imán que se puede encender y apagar alrededor de la salida 311 de la célula de elución 307b o alrededor de una parte de la célula de elución cercana a la salida 311. Las perlas magnéticas se mantendrán dentro de la célula de elución 307b cuando se aplica la fuerza magnética y el amortiguador puede escapar a través de las perlas magnéticas. De este modo se empaqueta un lecho de perlas magnéticas. Esto podría hacerse como se describe anteriormente y dependiendo del tamaño del volumen interno de la célula de elución 307b, es decir, por ejemplo, empaquetado de flujo, empaquetado gravitacional o empaquetado mediante el uso de la fuerza magnética de la disposición de retención 502b.
En la figura 2c se muestra otra variante de una célula de elución 307c según la descripción. Además, esta variante comprende solo una entrada 309' y una salida 311' sin embargo, se podrían proporcionar dos entradas y dos salidas como se discutió anteriormente. La salida 311' se proporciona en esta variante en una parte inferior de una pared lateral 313 de la célula de elución 307c. Donde inferior se refiere a las direcciones en los dibujos y un lado opuesto a donde se proporciona la entrada 309'. En las variantes descritas anteriormente que se muestran en las figuras 2a y 2b, la salida se proporciona en el fondo de la célula de elución 307a, 307b. Una disposición de retención 502c se proporciona a la salida 311', aquí se muestra en forma de fuerza magnética. Sin embargo, también en esta variante se podría proporcionar un filtro o una válvula de pinza. El tamaño de la célula de elución 307c y los métodos de empaquetado de las perlas magnéticas corresponden a las variantes descritas previamente como se describe en relación con las figuras 2a y 2b.
La figura 2d muestra otra variante de una célula de elución 307d según la descripción. Se muestran una entrada 309 y una salida 311 como en la figura 2b, sin embargo, también podrían proporcionarse dos entradas y dos salidas. Una disposición de retención 502a en forma de un filtro como en la figura 2a se proporciona cubriendo la salida 311. En esta variante, un adaptador 504 también se proporciona dentro de la célula de elución 307d. El adaptador se proporciona inicialmente en una posición de inicio que está cerca de la entrada 309 de la célula de elución 307d. El volumen interno de la célula de elución está definido por las paredes internas de la célula de elución 307d y el adaptador. La suspensión de perlas magnéticas se introduce en la célula de elución 307d y el empaquetado de las perlas magnéticas se proporciona forzando el adaptador hacia la salida 311 de la célula de elución 307d. El tampón escapará a través de la disposición de retención 502a y la salida 311. El adaptador se detiene cuando se logra un lecho empaquetado adecuado. Esto podría ser, por ejemplo, un volumen vacío inferior al 60%. En otra variante, la entrada se proporciona en la parte inferior de la célula de elución y la salida en la parte superior y se puede proporcionar un adaptador desde la parte inferior de la célula de elución en lugar de como se muestra en la figura 2d desde la parte superior.
La figura 2e muestra otra variante de una célula de elución 307e según la descripción. En esta variante, una entrada 309" se proporciona en un fondo 315 de la célula de elución 307e en lugar de en una parte superior como en las variantes descritas anteriormente. Una salida 311" se proporciona en el otro extremo de la célula de elución 307e. Como se discutió anteriormente, también se podrían proporcionar dos entradas y dos salidas en esta variante. Un adaptador 504' se proporciona dentro de la célula de elución 307e y define el volumen interno de la célula de elución 307e junto con el fondo 315 y las paredes laterales internas de la célula de elución. En esta variante, el tampón puede escapar a través del adaptador 504' pero las perlas magnéticas se mantendrán entre la entrada 309" y el adaptador 504'. Haciendo fluir la lechada de perlas magnéticas hacia la célula de elución 307e y proporcionando una fuerza adecuada hacia el flujo del adaptador 504' se puede conseguir un lecho compacto de perlas magnéticas que tenga un volumen de huecos adecuado. La fuerza proporcionada al adaptador 504' puede ser variada. Se podría proporcionar una disposición de retención, como una válvula de pinza, en la entrada 309".
La figura 2f muestra otra variante de una célula de elución 307f según la descripción. En esta variante, se proporciona una célula de elución ancha y corta. Por la presente, se proporcionará un lecho corto de perlas magnéticas. Esto proporciona una presión más baja durante la elución y un flujo aumentado y, por lo tanto, una elución más rápida. Una entrada 309 se muestra en la parte superior de la célula de elución 307f y una salida 311 se muestra en la parte inferior de la célula de elución. Una disposición de retención 502f se proporciona en forma de una fuerza magnética que se aplica a una parte de las paredes laterales de la célula de elución y no solo a la salida. De este modo, la fuerza magnética se usa también para el empaquetado de las perlas magnéticas como se describe anteriormente. Una disposición de retención adicional 502g en forma de una válvula de pinza se muestra también proporcionada a la salida 311.
La figura 2g muestra otra variante de una célula de elución 307g según la descripción. En esta variante, la célula de elución 307g comprende una primera entrada 309a' para recibir las perlas magnéticas del separador magnético proporcionado en una pared lateral 313 de la célula de elución 307g. La célula de elución 307g comprende además una segunda entrada 309b' para recibir tampón, tal como tampón de elución, tampón CIP y tampón de equilibrio de una disposición de suministro de tampón 8a, 108a, 208a como se describió anteriormente. La segunda entrada 309b' se proporciona a través de un primer adaptador móvil 504a. La célula de elución 307g comprende además en esta variante una primera salida 311a' para enviar las perlas magnéticas, posiblemente para su reutilización como se describe anteriormente. La primera salida 311a' se proporciona también en una pared lateral 313 de la célula de elución 307g. La célula de elución 307g comprende además una segunda salida 311b' conectada a una disposición de recogida 8b; 108b; 208b como se describió anteriormente. La segunda salida 311 b' se proporciona a través de un segundo adaptador móvil 504b. Un volumen interno de la célula de elución 307g para alojar las perlas magnéticas está definido por la pared lateral 313 y el primer y segundo adaptadores 504a, 504b. Tanto el primer como el segundo adaptadores 504a, 504b se pueden proporcionar con un dispositivo de retención 502a, como un filtro, frita o sinterizado. Además, tanto el primer como el segundo adaptadores 504a, 504b pueden contar con un sistema de distribución para el suministro y la recogida de muestras distribuidas. Sin embargo, esto puede no ser necesario. La figura 2g muestra cuatro posiciones diferentes de los adaptadores móviles, I, II, III, IV. En la primera posición, I, tanto el primer como el segundo adaptadores 504a, 504b están en posiciones retraídas, es decir, proporcionando un volumen interno máximo de la célula de elución 507g. En esta posición, el primer adaptador 504a se proporciona por encima (refiriéndose a las direcciones en los dibujos) de la primera entrada 309a' - por la presente la primera entrada 309a' tiene acceso a un volumen interno de la célula de elución. En esta primera posición, también el segundo adaptador 504b se proporciona debajo (refiriéndose a las instrucciones en los dibujos) de la primera salida 311a' y por la presente la primera salida 311a' tiene acceso al volumen interno de la célula de elución. De este modo, el volumen interno de la célula de elución, también llamado cámara, se abre para el aclarado. En una segunda posición, II, la cámara se proporciona en una posición para atrapar perlas magnéticas. Se recibe una suspensión de perlas magnéticas a través de la primera entrada 309a' del separador magnético. Se construye un lecho de perlas magnéticas sobre la disposición de retención 502a proporcionado al segundo adaptador 504b y el tampón pasará por el dispositivo de retención 502a y fuera de la célula de elución 307g a través de la segunda salida 311b'. En la tercera posición, III, la cámara está en una posición cerrada. El primer adaptador 504a se ha movido hacia abajo por debajo de la primera entrada 309a' (refiriéndose a las instrucciones del dibujo). La célula de elución 307g está ahora en una posición cerrada y posiblemente también en una posición comprimida. Posiblemente el primer adaptador 504a comprimió un lecho de perlas magnéticas al moverse hacia abajo. Sin embargo, la elución también se podría realizar en un lecho abierto. En la tercera posición, la célula de elución está ahora lista para elución, tira, CIP y equilibrado como se describió anteriormente. En una cuarta posición, IV, el segundo adaptador 504b se ha retraído de nuevo abriendo así la cámara para la primera salida 311a'. Por la presente, la célula de elución 307g ahora está lista para el reenvío de las perlas magnéticas posiblemente para su reutilización como se describe anteriormente. Las perlas magnéticas se pueden lavar agregando un tampón adicional y/o presionarlas usando el primer adaptador 504a.
La figura 2h muestra otra variante de una célula de elución 307h según la descripción en tres posiciones, I, II, III. En esta variante, la célula de elución 307h es un tubo flexible, posiblemente más grande que el resto de los tubos del sistema. Aquí se muestra cómo se podría realizar la elución en el propio tubo flexible proporcionando una disposición de retención 502h en forma de válvula de pinza con o sin componente magnético. La disposición de retención 502h Puede comprimir una parte de la célula de elución 307h para recoger perlas magnéticas proporcionadas por el separador magnético mientras se deja pasar el tampón. Se puede realizar la elución y posiblemente CIP, tira y equilibrado y, a continuación, la disposición de retención 502h podría liberarse para reenviar las perlas magnéticas posiblemente para su reutilización como se discutió anteriormente.
La figura 3a es un diagrama de flujo de un método para separar una biomolécula en el sistema mostrado en la figura 1a. Las etapas del método se describen en orden a continuación:
A1: suministro de alimento a partir de un cultivo celular 3 a una célula de captura 9. Dicho alimento comprende una biomolécula que se va a separar. Dicha célula de captura 9 comprende perlas magnéticas que comprenden ligandos capaces de unirse a esta biomolécula. En la célula de captura 9 la biomolécula se unirá a las perlas magnéticas. Posiblemente se proporcione mezcla en la célula de captura 9 para mejorar la unión. En una realización alternativa, el cultivo celular se proporciona directamente al separador magnético en lugar de a la célula de captura. En esta realización, la captura tendrá lugar dentro del separador magnético en lugar de en la célula de captura y la célula de captura es solo una etapa intermedia para almacenar las perlas magnéticas.
A3: suministro del cultivo celular y las perlas magnéticas de la célula de captura 9 al separador magnético 5.
A5: separación de las perlas magnéticas con biomolécula unida en el separador magnético aplicando una fuerza magnética como se describe anteriormente. Esta etapa también incluye lavar otras partículas del alimento usando el dispositivo de lavado 13 como se describió anteriormente. Posiblemente se proporcionan uno o más ciclos de lavado donde se proporciona un tampón de lavado en el separador magnético cuando las perlas magnéticas están unidas a partes de material magnético. El tampón de lavado se recoge fuera del separador magnético y finalmente se añade un tampón al separador magnético y se libera la fuerza magnética.
A7: reenvío de las perlas magnéticas y el tampón en una suspensión a la célula de elución 7. Antes de la elución, las perlas magnéticas pueden empaquetarse en un lecho como se describe anteriormente, por ejemplo, mediante fuerza magnética, fuerza gravitacional, empaquetado de flujo o mediante el uso de un adaptador.
A9: elución de la biomolécula unida de las perlas magnéticas proporcionando un tampón de elución de la disposición que proporciona el tampón 8a y recogida de la biomolécula eluida en la disposición de recogida 8b. Posiblemente la célula de elución 7 y las perlas magnéticas también se limpian en su lugar, CIP, proporcionando un tampón CIP a la célula de elución 7 del tampón que proporciona la disposición 8a y recoge el tampón CIP en la disposición de recogida 8b. Y posiblemente las perlas magnéticas también se equilibran al proporcionar un tampón de equilibrio de la disposición que proporciona el tampón 8a y recoger el tampón de equilibrio en la disposición de recogida 8b. Posiblemente también se realice la tira como se describió anteriormente.
A11: reenvío de las perlas magnéticas a la célula de captura 9. Esta etapa puede incluir empujar las perlas magnéticas forzando un adaptador hacia la salida de la célula de elución. También podría incluir resuspender el lecho de perlas magnéticas en la célula de elución proporcionando una cantidad de tampón en la célula de elución y, a continuación, la suspensión de perlas magnéticas y el tampón podría bombearse o empujarse desde la célula de elución hacia el recipiente intermedio 111. Otra alternativa o complementaria puede ser eliminar una disposición de retención, tal como un filtro de fondo o una fuerza magnética que mantiene las perlas magnéticas dentro de la célula de elución y bombea o empuja las perlas magnéticas hacia la célula de captura 109.
Y, a continuación, el procedimiento puede continuar agregando un nuevo cultivo celular a la célula de captura 9. Con esta configuración, es posible tener dos o incluso tres porciones de perlas magnéticas circulando en el sistema como se describió anteriormente. Por este medio, una parte está en el separador magnético 5 mientras que una porción está en la célula de elución 7 y una porción puede estar al mismo tiempo en la célula de captura 9. De este modo se consigue un procedimiento eficaz para separar una biomolécula. El sistema que se muestra en la figura 1a y el procedimiento que se describe en el diagrama de flujo de la figura 3a se pueden adaptar fácilmente para la posibilidad de eliminar las perlas magnéticas después de la etapa de elución y la adición de nuevas perlas magnéticas a la célula de captura. 9.
La figura 3b es un diagrama de flujo de un método para separar una biomolécula en el sistema mostrado en la figura lb . Las etapas del método se describen en orden a continuación:
B1: suministro de alimento a partir de un cultivo celular 103 a una célula de captura 109. Dicho alimento comprende una biomolécula que se va a separar. También suministro a la célula de captura 109 de perlas magnéticas de un tanque de almacenamiento de perlas magnéticas 121 y/o de una célula intermedia 111 proporcionado en el sistema. Si por alguna razón es necesario proporcionar nuevas perlas magnéticas en lugar de reutilizar las perlas magnéticas de una separación anterior, estas nuevas perlas magnéticas se pueden proporcionar desde el tanque de almacenamiento de perlas magnéticas 121. Las perlas magnéticas comprenden ligandos capaces de unirse a la biomolécula que se va a separar. En la célula de captura 109 la biomolécula se unirá a las perlas magnéticas. Posiblemente se proporcione mezclado en la célula de captura 109 para mejorar la unión.
B3: suministro del cultivo celular y las perlas magnéticas de la célula de captura 109 al separador magnético 105.
B5: separación de las perlas magnéticas con biomolécula unida en el separador magnético aplicando una fuerza magnética y lavando como se describe anteriormente en relación con la figura 3a.
B7: reenvío de las perlas magnéticas y el tampón en una suspensión a la célula de elución 107 y posiblemente empaquetado de las perlas magnéticas como se describió anteriormente.
B9: elución de la biomolécula unida de las perlas magnéticas y posiblemente CIP, equilibrado y separación como se describe anteriormente en relación con la figura 3a.
B11: reenvío de las perlas magnéticas de la célula de elución 107 a un contenedor intermedio 111. Esta etapa puede incluir empujar las perlas magnéticas forzando un adaptador hacia la salida de la célula de elución. También podría incluir resuspender el lecho de perlas magnéticas en la célula de elución proporcionando una cantidad de tampón en la célula de elución y, a continuación, la suspensión de perlas magnéticas y el tampón podría bombearse o empujarse desde la célula de elución hacia el recipiente intermedio 111. Otra alternativa o complementaria puede ser eliminar una disposición de retención, tal como un filtro de fondo o una fuerza magnética que mantiene las perlas magnéticas dentro de la célula de elución y bombea o empuja las perlas magnéticas hacia la célula de captura 109.
B13: opcionalmente drenaje del tampón de la suspensión de perlas magnéticas si se agregó tampón durante la etapa de reenvío B11 de las perlas magnéticas de la célula de elución al recipiente intermedio. En una realización, el drenaje puede proporcionarse proporcionando una fuerza magnética al recipiente intermedio 111 que mantendrá las perlas magnéticas dentro del recipiente mientras que el tampón se puede drenar a través de una salida 123 a un contenedor de residuos 125.
B15: suministro de las perlas magnéticas a la célula de captura 109 para su reutilización en un próximo procedimiento de separación. Sin embargo, en una realización, partes o todas las perlas magnéticas podrían en alguna etapa del procedimiento ser sacadas del sistema al contenedor de desechos 125 y ser reemplazado por nuevas perlas magnéticas proporcionadas a la célula de captura 109 del tanque de almacenamiento de perlas magnéticas 121.
La figura 3c es un diagrama de flujo de un método para separar una biomolécula en el sistema mostrado en la figura lc . Las etapas del método se describen en orden a continuación:
C1: suministro de un alimento directamente de un cultivo celular 203 en el separador magnético 205. Ya se han proporcionado perlas magnéticas al cultivo celular 203 en esta realización y el cultivo celular también podría denominarse célula de captura 209. Dichas perlas magnéticas tienen un ligando que se une a la biomolécula que se va a separar. Alternativamente, las perlas magnéticas podrían proporcionarse directamente en el separador magnético 205 y la biomolécula se unirá a las perlas magnéticas dentro del separador magnético, es decir, se proporcionan cultivos celulares y perlas magnéticas dentro el separador magnético individualmente.
C3: separación de las perlas magnéticas con biomolécula unida en el separador magnético aplicando una fuerza magnética y lavando como se describe anteriormente en relación con la figura 3a.
C5: reenvío de las perlas magnéticas y el tampón en una suspensión a la célula de elución 207 y posiblemente empaquetado de las perlas magnéticas como se describió anteriormente.
C7: elución de la biomolécula unida de las perlas magnéticas y posiblemente CIP, equilibrado y separación como se describe anteriormente en relación con la figura 3a.
C9: reenvío de las perlas magnéticas de la célula de elución 207 a un recipiente de almacenamiento 215. Esta etapa puede incluir empujar las perlas magnéticas forzando un adaptador hacia la salida de la célula de elución. También podría incluir resuspender el lecho de perlas magnéticas en la célula de elución proporcionando una cantidad de tampón en la célula de elución y, a continuación, la suspensión de perlas magnéticas y el tampón podría bombearse o empujarse fuera de la célula de elución y dentro del recipiente de almacenamiento 215. Otra alternativa o complementaria puede ser eliminar una disposición de retención como un filtro de fondo o una fuerza magnética que mantiene las perlas magnéticas dentro de la célula de elución y bombea o empuja las perlas magnéticas hacia el recipiente de almacenamiento 215.
El método descrito en el diagrama de flujo de la figura 3c puede ser útil cuando un biorreactor que comprende un cultivo celular debe vaciarse completamente o vaciarse en unas pocas porciones en el separador magnético para la separación de biomoléculas. También podría ser útil cuando la reutilización de las perlas magnéticas por diferentes motivos no sea adecuada.
La figura 4 muestra un sistema de separación 701 según una variante de la descripción. Las figuras 4a-4i muestran diferentes estados del procedimiento de separación cuando se usa el sistema de separación de la figura 4. En esta variante de la descripción no se necesita una bomba para mover las perlas magnéticas en el sistema. Las bombas se utilizan para proporcionar tampón para el lavado, elución, etc. y estos flujos de tampón empujarán las células y las perlas magnéticas a través del sistema. De este modo, se reduce el riesgo de dañar las perlas magnéticas por las bombas. A continuación se ofrece una descripción más detallada.
La figura 5 muestra un sistema de separación 801 según una variante de la descripción. Las figuras 5a-5f muestran diferentes estados del procedimiento de separación cuando se usa el sistema de separación de la figura 5. También en esta variante se evitan las bombas para mover las perlas magnéticas. A continuación se ofrece una descripción más detallada.
En las figuras 4 y 5EC es célula de elución, CC es célula de captura, BP es reactor de bioproceso y MS es separador magnético. P es bombas, V es válvulas y tanto las bombas como las válvulas pueden ser del tipo adecuado, en una variante desechable. Un contenedor de residuos, W, se muestra para la recogida de residuos de las diferentes etapas del procedimiento y un vial, C se proporciona para la recogida de muestras.
Las rutas de flujo de fluido para el líquido de muestra con o sin perlas magnéticas se muestran con líneas dobles.
Las rutas de flujo de fluido para la introducción de fluidos y para la eliminación de líquidos del circuito se muestran con líneas simples.
En el sistema que se muestra en la figura 4, la célula de captura, CC, el separador magnético, MS y la célula de elución, EC, están provistos de imanes para retener perlas magnéticas. Los imanes blancos significa que no están activos, los imanes negros significa que están activados. Las diferentes etapas para el procedimiento de separación utilizando el sistema que se muestra en la figura 4 se muestran en las figuras 4a-4i y se describen en orden a continuación:
Fig. 4a: separación del modo por lotes. Estado inicial que comprende dos lotes de perlas magnéticas, uno en la célula de captura, CC y uno en la célula de elución, EC. En este estado no hay flujo en el sistema.
Fig.4b: el cultivo celular (alimento) se introduce en la célula de captura, CC, del reactor de bioprocesos, BP, ya sea por gravedad o por una bomba (no mostrada) o por otros medios adecuados. La célula de captura, CC, se agita preferiblemente de una manera adecuada, por ejemplo mediante un agitador, mediante un movimiento ondulatorio, etc. Las biomoléculas se capturan en perlas durante un tiempo predeterminado.
Fig.4c: el tampón se bombea a la célula de captura, CC, para empujar el alimento y las perlas magnéticas en el separador magnético, MS. El imán en el separador magnético, MS, se activa para capturar las perlas magnéticas y el resto del alimento se pasa a los desechos, W.
Fig.4d: las soluciones CIP se bombean a la célula de captura, CC, y se drenan a través de una válvula a los desechos, W (puede implicar varias etapas). La(s) solución(es) de aclarado se bombea(n) a través del separador magnético, MS, para eliminar las células, etc. y enviarlas a los desechos, W. Esto puede realizarse varias veces y el imán puede desactivarse para suspender las perlas magnéticas y, a continuación, reactivarse para capturar las perlas magnéticas de nuevo durante el aclarado.
Fig.4e: una vez que la célula de captura, CC, está limpia, se empujan perlas magnéticas limpias de la célula de elución, EC, a la célula de captura, CC, bombeando el tampón. El aclarado del separador magnético, MS, continúa (opcional).
Fig.4f: el exceso de tampón se elimina de la célula de captura, CC, drenando a través de una válvula. En esta variante, esto se realiza de forma pasiva, es decir, por gravedad. Esta etapa es opcional dependiendo de si es aceptable diluir el alimento o no. El aclarado se continúa (si es necesario); alternativamente, las perlas se pueden empujar/lavar desde el separador magnético, MS, a la célula de elución, EC, véase 4g.
Fig.4g: se agrega alimento a la célula de captura, CC, del reactor de bioprocesos, BP. Las perlas magnéticas pueden ser empujadas/expulsadas del separador magnético, MS, a la célula de elución, EC, y capturadas en el mismo por un imán activado en la salida.
Fig.4h: se capturan biomoléculas en perlas durante un tiempo predeterminado en la célula de captura, CC. Las biomoléculas se eluyen de las perlas en la célula de elución, EC. El producto eluido se recoge en el vial. C.
Fig.4i: el tampón se bombea a la célula de captura, CC, para empujar el alimento y las perlas magnéticas en el separador magnético, MS. El imán en el separador magnético, MS, se activa para capturar las perlas magnéticas y el alimento se pasa a los desechos, W. Las perlas magnéticas se lavan y se reactivan en la célula de elución, EC.
A continuación, el bucle 4d-4i hasta el reactor de bioproceso, BP, está vacío.
La figura 5 muestra un procedimiento simplificado sin etapas de limpieza y lavado en la célula de captura, CC, y la célula de elución, EC. Las etapas del procedimiento de separación realizadas en el sistema que se muestra en la figura 5 se describen a continuación con referencia a las figuras 5a-5f.
Fig.5a: estado inicial que comprende dos lotes de perlas magnéticas, uno en la célula de captura, CC y uno en la célula de elución, EC. En este estado no hay flujo en el sistema.
Fig.5b: se agrega alimento a la célula de captura, CC, del reactor de bioprocesos, BP.
Fig.5c: el tampón se bombea a la célula de captura, CC, para empujar el alimento y las perlas magnéticas en el separador magnético, MS. El imán en el separador magnético, MS, se activa para capturar las perlas magnéticas y el alimento se pasa a los desechos, W.
Fig.5d: la(s) solución(es) de aclarado se bombea(n) a través del separador magnético, MS, para eliminar las células, etc. Las perlas magnéticas se empujan desde la célula de elución, EC, a la célula de captura, CC, bombeando el tampón.
Fig.5e: se agrega alimento a la célula de captura, CC, del reactor de bioprocesos, BP. Las perlas magnéticas se empujan/aclaran desde el separador magnético, MS, a la célula de elución, EC, y se capturan en el mismo por un imán activado en la salida.
Fig.5f: se capturan biomoléculas en las perlas magnéticas durante un tiempo predeterminado en la célula de captura, CC. Las biomoléculas se eluyen de las perlas magnéticas en la célula de elución, EC, y el producto eluido se recoge en el vial, C.
A continuación, repetir 5d, 5e, 5f hasta completar el lote.
Para lograr la concentración más alta posible, la elución se realiza en modo discontinuo poniendo en contacto las perlas con un volumen predeterminado de tampón de elución durante un tiempo predeterminado. El tampón de elución que incluye la muestra diana eluida se recoge en un vial de elución. A continuación, las perlas magnéticas (incluida la muestra diana restante) se envían a la célula de captura sin CIP.
En estos sistemas, las perlas magnéticas (y las células) no tienen que pasar a través de ninguna bomba donde existe una mayor probabilidad de que se dañen. El procedimiento general descrito en las figuras se puede aplicar también usando bombas en el circuito en caso de que se pueda verificar que las perlas no estén dañadas o en caso de que los desechos de las perlas dañadas estén bien en el procedimiento. La gravedad puede facilitar algunas etapas en el bucle colocando una célula encima de la célula siguiente. Por ejemplo, la célula de elución, EC, puede disponerse encima de la célula de captura, CC, para facilitar el transporte de perlas magnéticas desde la célula de elución, EC, a la célula de captura, CC y reducir la cantidad de tampón necesario para este transporte.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método en un sistema de separación (1; 101; 201; 701; 801) para separar una biomolécula de un cultivo celular, que comprende las etapas de:
- suministrar un alimento de un cultivo celular (3; 103; 203; BP) que comprende dicha biomolécula a un separador magnético (5; 105; 205; MS) y suministrar al separador magnético perlas magnéticas que comprenden ligandos capaces de unir esta biomolécula;
- separar mediante el separador magnético dichas perlas magnéticas con biomoléculas unidas del resto del alimento;
- enviar dichas perlas magnéticas como una suspensión con un tampón añadido a una célula de elución (7; 107; 207; EC);
- empaquetar la suspensión de perlas magnéticas en la célula de elución (7; 107; 207) para proporcionar un lecho de perlas magnéticas dentro de la célula de elución con un volumen vacío inferior al 60%; y
- eluir las biomoléculas unidas en la célula de elución.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además una etapa de enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución (7; 107; 207; EC) para su reutilización en el separador magnético (5; 105; 205; MS).
3. El método según la reivindicación 1 o 2, que comprende además la etapa de:
- mezclar el alimento del cultivo celular y las perlas magnéticas en una célula de captura (9; 109; 209; CC) antes de que se proporcionen al separador magnético (5; 105; 205; MS) permitiendo que las biomoléculas se unan a las perlas magnéticas.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de separación comprende: - aplicar un campo magnético al separador magnético (5; 105; 205; MS) permitiendo que las perlas magnéticas se unan magnéticamente a partes de material magnético dentro del separador magnético;
- lavar otros componentes del separador magnético que no estén unidos magnéticamente a las partes de material magnético;
y en el que la etapa de enviar dichas perlas magnéticas a una célula de elución (7; 107; 207; EC) comprende - liberar el campo magnético al separador magnético (5; 105; 205; MS) antes de que se envíen las perlas magnéticas.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además las etapas de
- limpiar in situ , CIP, la célula de elución (7; 107; 207; EC) y las perlas magnéticas después de la elución;
- equilibrar las perlas magnéticas en la célula de elución después del CIP y antes del envío de las perlas magnéticas desde la célula de elución; y
- tira opcional después de la elución y antes del CIP.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se proporcionan una nueva porción de alimento del cultivo celular (3; 103; 203; BP) y perlas magnéticas en el separador magnético (5; 105; 205; MS) mientras que una porción anterior está en la célula de elución (7; 107; 207; EC), por lo que al menos dos porciones de perlas magnéticas están circulando en el sistema de separación (1; 101; 201; 701; 801), como en el caso de que una nueva porción del alimento del cultivo celular (3; 103) y las perlas magnéticas se proporcionan en el separador magnético (5; 105) mientras que una porción anterior está en la célula de elución (7; 107) y una porción anterior está en una célula de captura (9; 109), por lo que tres porciones de perlas magnéticas están circulando en el sistema de separación (1; 101; 201).
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una primera etapa de conectar las partes del sistema mediante tubos flexibles preesterilizados y conectores asépticos.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el empaquetado se realiza haciendo fluir la suspensión de perlas magnéticas a través de la célula de elución (7; 107; 207), en el que dicha célula de elución comprende una disposición de retención (502a-c, fh) para mantener la perlas magnéticas dentro de la célula de elución y permitir que el exceso de tampón escape de la célula de elución.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la etapa de empaquetado comprende empujar un adaptador (504) dentro de la célula de elución (7; 107; 207) mientras se mantienen las perlas magnéticas dentro de la célula de elución mediante una disposición de retención (502a- c, fh) y permitiendo que el tampón escape de la célula de elución.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la etapa de empaquetado comprende permitir que las perlas magnéticas construyan un lecho empaquetado en una parte inferior de la célula de elución por fuerza de gravedad y/o una fuerza magnética mientras se permite que el exceso de tampón escape de la célula de elución.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la etapa de empaquetado comprende empaquetar en flujo las perlas magnéticas haciendo fluir la suspensión de perlas magnéticas en una entrada inferior (506) de la célula de elución (7; 107; 207), célula de elución que comprende un adaptador (504) colocado en una posición de inicio en la célula de elución cuando una suspensión de perlas magnéticas comienza a llenar la célula de elución, dicha posición de inicio está más cerca de la entrada inferior (506) de la célula de elución que una posición final del adaptador, correspondiendo dicha posición final a la posición del adaptador (504) cuando se completa el llenado de perlas magnéticas en la célula de elución, manteniendo dicho adaptador una fuerza hacia la dirección de flujo de la suspensión y permitiendo que el tampón escape a través del adaptador durante empaquetado.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de liberar una disposición de retención (502a-e) en la célula de elución (7; 107; 207) después de la elución y enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución posiblemente para su reutilización en el separador magnético (5; 105; 205).
13. El método según la reivindicación 12, en el que liberar una disposición de retención (502a-e) comprende abrir un cierre de fondo, extraer un filtro de fondo o retirar una fuerza magnética.
14. El método de la reivindicación 12, en el que el reenvío de las perlas magnéticas se realiza empujando un adaptador (504) en la célula de elución (7; 107; 207) hacia una salida (506) de la célula de elución.
15. El método de la reivindicación 12, en el que la etapa de enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución (7; 107; 207) posiblemente para su reutilización en el separador magnético (5; 105; 205) comprende además la etapa de:
a) añadir un tampón a la célula de elución (7; 107; 207) para volver a suspender el lecho y bombear o expulsar las perlas magnéticas de la célula de elución; y/o
b) enviar las perlas magnéticas desde la célula de elución a una célula intermedia (111) donde se puede eliminar el exceso de tampón, por ejemplo manteniendo las perlas magnéticas dentro de la célula intermedia por fuerza magnética mientras se drena la célula intermedia del tampón.
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