ES2202427T3

ES2202427T3 - Aparato de separacion magnetica.

Info

Publication number: ES2202427T3
Application number: ES96903650T
Authority: ES
Inventors: Stephan Miltenyi
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH; Miltenyi Biotec Inc
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH; Miltenyi Biotec Inc
Priority date: 1995-02-27
Filing date: 1996-01-29
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-01-29
Also published as: DE69638141D1; US5711871A; EP1308211A3; ATE459423T1; WO1996026782A1; IL116914A0; DE69628584T2; EP0869838B1; EP0869838A1; DK1308211T3; IL116914A; AU4766396A; US5705059A; EP1308211A2; US5691208A; EP1308211B1; DE69628584D1; EP0869838A4

Abstract

SE EXPONEN UN METODO Y UNA COLUMNA DE SEPARACION MAGNETICA (2). LA COLUMNA DE SEPARACION (2) INCLUYE UNA MATRIZ FLUIDA PERMEABLE (6) QUE FACILITA UNAS ACANALADURAS UNIFORMES QUE REDUCEN LA CAPTURA DE AIRE O SUSTANCIAS NO DESEADAS, Y REDUCE LA PERDIDA DE LAS SUSTANCIAS QUE SE BUSCAN, MOTIVADA POR UNA AVERIA MECANICA. UTILIZANDO EL METODO DE LA PRESENTE INVENCION, LAS CELULAS BIOLOGICAS BUSCADAS SE ETIQUETAN CONJUNTAMENTE CON UN ELEMENTO DE SUJECION ESPECIFICO ADECUADO Y SE AISLAN.

Description

Aparato de separación magnética.

Introducción Campo de la técnica

El campo de esta invención es la aplicación de la separación magnética de alto gradiente (HGMS) a la separación de materiales biológicos.

Antecedentes

La separación magnética es un procedimiento para retener selectivamente materiales magnéticos en una cámara o columna dispuesta en un campo magnético. Una sustancia objetivo, incluyendo los materiales biológicos, se puede etiquetar magnéticamente mediante su fijación a una partícula magnética mediante un asociado de enlace específico que se conjuga a la partícula. A continuación se aplica a la cámara una suspensión de la sustancia objetivo etiquetada. La sustancia objetivo es retenida en la cámara en presencia de un campo magnético. A continuación se puede eluir la sustancia objetivo retenida cambiando la fuerza del campo magnético, o eliminándolo.

En la cámara se puede colocar una matriz de material de susceptibilidad magnética adecuada, de manera que cuando se aplica un campo magnético a la cámara se induce localmente un alto gradiente de campo magnético cerca de la superficie de la matriz. Esto permite la retención de partículas débilmente magnetizadas, y el planteamiento se denomina "separación magnética de alto gradiente" (HGMS).

Los separadores magnéticos de alto gradiente conocidos previamente o disponibles comercialmente contienen generalmente una matriz de lana o alambre de acero. Estas matrices provocan a menudo un enlace u oclusión no específico de sustancias biológicas o componentes de la muestra diferentes a la sustancia objetivo. Además, estas matrices pueden tener poros o vías no uniformes a través de los cuales pasa la muestra, lo cual provoca resultados de separación variables. Estas matrices no uniformes también pueden producir gradientes magnéticos y modelos de flujo inconsistentes que producen variabilidad en los resultados de la separación.

El uso de la HGMS en separaciones biológicas requiere que las condiciones suministren un elevado rendimiento con una pureza substancial. En consecuencia, sería deseable proporcionar dispositivos, procedimientos, y separadores magnéticos de alto gradiente que sean relativamente fáciles de construir y usar, proporcionando también gradientes de campo magnético y características de flujo maximizados y uniformes durante el uso. Sería más ventajoso si estos dispositivos, procedimientos y separadores magnéticos se pudieran usar para realizar una variedad de procedimientos de selección o ensayo de células con la selección del elemento de enlace específico apropiado, mediante el cual la sustancia objetivo se etiquetará magnéticamente.

Literatura relevante

Las técnicas de separación magnética se conocen desde hace muchos años. Las técnicas se han usado para separar partículas de metal férreo de un fluido, tal como aceite lubricante o lodos acuosos de arcilla, como se describe en la patente US-3.985.646 de Oder. En algunos casos, se usó la separación magnética de alto gradiente, por ejemplo en las patentes US-4.054.513 de Windle; US-5.137.629 de Dauchez; y US-4.526.681 de Friedlaender y otros. En la separación magnética de alto gradiente, se somete a un campo magnético una cámara de separación que contiene una matriz que se puede magnetizar hecha de materiales como lana de acero, fibras recubiertas de metal, y tachuelas, barras, placas, rellenos, alambres o cojinetes de bolas de metal. Cuando se aplica el campo magnético, cualquier partícula de metal en el fluido se ve atraída por la matriz. Para retirar las partículas de metal de la matriz, se apaga o se retira el campo magnético, y se lava la cámara.

Los desarrollos en los sistemas biológicos y de diagnóstico han combinado las técnicas de separación magnética con el uso de elementos de enlace, como anticuerpos, con afinidad específica para un material de interés que se ha de separar o aislar de una mezcla de materiales (patentes de Yapel, US-4.169.804; Yen y otros, US-4.219.411; Saur y otros, US-4.710.472; Owen y otros, US-4.795.698; Liberti y otros, US-5.200.084). Molday, en la patente US-4.452.773 describe la preparación de microesferas de hierro y dextrano, y proporciona un resumen que describe los diferentes medios de preparación de partículas adecuadas para la fijación a materiales biológicos. Una descripción de los recubrimientos poliméricos para partículas magnéticas usados en la HGMS se encuentra en las patentes DE-3720844 (Miltenyi) y Miltenyi y otros, US-5.385.707. Los procedimientos para preparar partículas superparamagnéticas se describen en la patente US-4.770.183.

El uso de la HGMS con sistemas biológicos es de interés en el desarrollo de diagnósticos. Además, la identificación de anticuerpos específicos para muchos antígenos de superficie de células ha conducido a un interés por el desarrollo de procedimientos terapéuticos que implican la selección y el transplante de células identificables.

Una descripción de un separador no magnético se puede encontrar en la patente US-5.240.856 (Goffe y otros).

Descripción de la invención

La invención proporciona mejoras en aparatos, procedimientos, y dispositivos magnéticos de alto gradiente para la separación de materiales biológicos. Los dispositivos, aparatos y procedimientos permiten una mayor especificidad y eficiencia en el aislamiento de células, proteínas, polisacáridos, y otros materiales biológicos particulares, u otros materiales que son magnéticos o son capaces de una interacción de enlace específico con un elemento de enlace etiquetado magnéticamente.

Se proporciona una columna de separación magnética que tiene una carcasa no magnética que define una cámara de separación, y una matriz de esferas metálicas permeable al fluido en el interior de la cámara. Las esferas forman una red estrechamente apilada, que crea canales substancialmente uniformes para lograr un flujo homogéneo durante las separaciones. Un dispositivo separador magnético puede usar la columna de separación junto con un dispositivo de filtrado previo. El dispositivo se puede usar en un instrumento que tiene un imán permanente o electroimán para su uso durante las separaciones, con un brazo retráctil opcional para mover el imán, medios de bombeo para limpiar y separar el material objetivo, y un microprocesador para controlar el flujo de fluido de separación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático de una columna de separación o de prefiltración de ejemplo de la presente invención;

La Figura 2 representa columnas de separación y de prefiltración, junto con los contenedores de muestra y recogida, interconectados mediante una serie de vías de fluido o circuitos de fluido. La figura también muestra la posición de las válvulas y una bomba peristáltica que se usa en la realización preferida del sistema de separación;

La Figura 3 representa una unidad controlada por ordenador a la que se añaden columnas estériles, tuberías desechables y contenedores de almacenamiento y recogida, como se muestra en la Figura 2. En una realización preferida, la unidad controlada por ordenador contiene un imán, válvulas y una bomba peristáltica;

La Figura 4 representa el canal de flujo formado entre tres esferas de conexión.

Descripción de las realizaciones específicas

Se proporciona un sistema de separación magnética para procedimientos de separación magnética. Las matrices mejoradas de los separadores magnéticos proporcionan poros o canales uniformes que reducen la oclusión de aire o sustancias no objetivo, disminuyen la pérdida de sustancias objetivo debido a división mecánica, y tienen características de flujo substancialmente homogéneas. La retención del material etiquetado magnéticamente depende de la interacción de las fuerzas de flujo y la atracción magnética, por lo que un flujo más homogéneo mejora la eficacia de la separación.

Las sustancias biológicas, como las células objetivo de varios sistemas y órganos, se etiquetan magnéticamente con un elemento de enlace específico adecuado, y se aíslan usando el sistema de la presente invención. El aislamiento de células multipotenciales como células madre hematopoyéticas o progenitoras es de particular interés. Aunque la separación de células hematopoyéticas se usa aquí para proporcionar ejemplos de procedimientos de separación de células, la presente invención se puede aplicar a una amplia gama de tipos de células u otras substancias biológicas.

El sistema de separación magnética de la presente invención se puede usar para etiquetar y aislar magnéticamente cualquier sustancia objetivo deseada. La separación de un componente específico a partir de una mezcla compleja es de particular interés. El sistema de separación de la presente invención tiene una gran versatilidad, ya que se puede separar casi cualquier sustancia objetivo una vez que se dispone de un elemento de enlace específico. La sustancia objetivo o analito puede ser cualquier elemento de un par de enlace específico, o una sustancia asociada con un elemento de un par de enlace específico. Como ejemplo, se puede usar un par de enlace antígeno-anticuerpo de superficie de célula para aislar el propio antígeno, células que expresan el antígeno, un organelo particular implicado en el procesamiento del antígeno, etc. Los dispositivos y procedimientos descritos posteriormente también se aplican ventajosamente a técnicas de diagnóstico que implican el enlace de un receptor y un ligando, como inmunoensayos y similares.

En la Figura 1 se representa un esquema de un dispositivo separador magnético. El diagrama muestra la construcción general del separador y el paso uniforme de fluido que resulta del uso de una matriz de esferas metálicas. La figura 2 representa un dispositivo de separación más complejo, que incluye las posiciones generales de los conductos de fluido, los contenedores de recogida y almacenamiento, y la columna de separación. Los circuitos de fluido se pueden construir con válvulas integradas, o se pueden aplicar externamente las válvulas a las vías del fluido.

Un tercer componente del sistema de separación de células es un instrumento de separación de células. La Figura 3 representa un instrumento de separación de células, preferiblemente controlado por ordenador, que puede incorporar las válvulas junto con un imán, una bomba y un control de teclado. Un dispositivo similar al de la Figura 2, construido sin válvulas, se puede montar directamente sobre el instrumento de la Figura 3 para su uso en la separación automatizada de células objetivo.

El reactivo de separación de células, que también se puede denominar conjugado, reactivo de partículas anticuerpo/magnéticas o etiqueta magnética, incluye un material sensible magnéticamente enlazado a un elemento de enlace específico. Hay muchos materiales sensibles magnéticamente bien conocidos usados en procedimientos de separación magnética. La presente invención implica el uso de partículas o micropartículas sensibles magnéticamente. Partículas magnéticas adecuadas se describen en la patente
US-4.452.773 de Molday y la Memoria de la Patente Europea EP-452342-B (publicada el 20 de Noviembre de 1994), que se incorporan aquí como referencia. También son adecuadas partículas de tamaño coloidal, como las descritas en las patentes US-4.795.698 de Owen y US-5.200.084 de Liberti y otros, incorporadas aquí como referencia.

El término "elemento de enlace específico" tal como se usa aquí se refiere a un elemento de un par de enlace específico, es decir, dos moléculas, normalmente dos moléculas diferentes, en las que una de las moléculas se enlaza específicamente a la otra molécula a través de medios químicos o físicos. Los elementos complementarios de un par de enlace específico se denominan a veces ligando y receptor. Además de pares de enlace específico antígeno y anticuerpo, péptido-MHC antígeno y pares receptores de células T, pares de enlace específicos alternativos de interés incluyen biotina y avidina o estreptoavidina; carbohidratos y lectinas; secuencias de nucleótidos complementarios (incluyendo secuencias de ácidos nucleicos usadas como sondas y agentes de captura en ensayos de hibridación de ADN); ligandos péptido y receptor; moléculas efector y receptor; hormonas y proteínas de enlace de hormonas; cofactores de enzima y enzimas; inhibidores enzimáticos y enzimas; marcadores de secreción, como se describe en la solicitud internacional PCT/US93/10126; cuerpos monoclonales autólogos, y similares. Los pares de enlace específicos pueden incluir análogos, derivativos y fragmentos del elemento de enlace específico original. Por ejemplo, un anticuerpo dirigido a un antígeno de proteína también puede reconocer fragmentos de péptidos, peptidomiméticos sintetizados químicamente, proteínas etiquetadas, proteínas derivatizadas, etc., con tal de que esté presente un epitopo.

Los pares de enlace específicos inmunológicos incluyen antígenos y anticuerpos específicos de antígeno o receptores de antígeno de células T. Antígenos adecuados pueden ser haptenos, proteínas, péptidos, carbohidratos, etc. Se pueden usar procedimientos de ADN recombinante o de síntesis de péptidos para producir análogos quiméricos, truncados o de cadena única de cada elemento del par de enlace, en los que las proteínas quiméricas pueden proporcionar mezcla(s) o fragmento(s) del mismo, o una mezcla de un anticuerpo y otros elementos de enlace específicos. Los receptores de anticuerpos y de células T pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden producir a partir de animales transgénicos, animales inmunizados, células B humanas o animales inmortalizadas, células transfectadas con vectores de ADN que codifican el anticuerpo o receptor de células T, etc. Los expertos en la materia conocen bien los detalles de la preparación de anticuerpos y su adecuación para el uso como elementos de enlace específicos.

Para abreviar, el sistema de separación se describirá principalmente en términos de su capacidad para seleccionar y separar específicamente una población de células definida (células objetivo) de una población celular mezclada, como sangre periférica, médula ósea, sangre del cordón umbilical o la placenta, sangre fetal o un producto de leucoforesis. Se entenderá asimismo que algunos tejidos se pueden dividir en una única célula o una suspensión monodispersa para permitir el aislamiento de un subconjunto de células particular, como la separación de linfocitos de infiltración de tumor de una masa tumoral, la separación de células de islote pancreático de tejido renal, etc. Por ejemplo, se pueden etiquetar distintos tipos de células con un anticuerpo específico para permitir el purgado de células y/o el enriquecimiento de células. La población celular objetivo se identifica generalmente mediante un elemento de enlace específico, como el descrito anteriormente, que se enlaza selectivamente a un antígeno de superficie celular presente sobre las células objetivo. Sin embargo, se debería entender que dichos aparato y procedimiento no están limitados a dichos usos.

Para simplificar, el elemento de enlace específico se ejemplificará aquí mediante un anticuerpo. El anticuerpo puede estar directa o indirectamente enlazado a una partícula magnética. Si el anticuerpo está directamente enlazado a la partícula magnética, entonces la población celular objetivo está etiquetada magnéticamente cuando el anticuerpo se enlaza al antígeno de superficie celular. Si el anticuerpo está indirectamente unido a la partícula magnética, entonces la población celular objetivo es susceptible de etiquetado magnético cuando el anticuerpo se enlaza a las células objetivo. La población de células anticuerpo-enlazado se etiqueta de hecho mediante contacto adicional de las células con un elemento de enlace específico para el anticuerpo, en el que este elemento de enlace específico se enlaza él mismo a una partícula magnética. Las células objetivo, identificadas mediante dicho etiquetado magnético, se separan a continuación de las otras células mediante un campo magnético. Por ejemplo, un elemento de enlace específico como la avidina se puede conjugar a una partícula magnética en la que la avidina se enlaza a un anticuerpo biotinilado que a su vez se enlaza específicamente a las células objetivo.

El elemento de enlace específico puede estar directamente fijado a la partícula magnética. Esto se puede llevar a cabo mediante grupos reactivos del elemento de enlace específico y las propias partículas magnéticas. Por otra parte, el elemento de enlace específico y la partícula magnética pueden estar unidos mediante un agente de enlace o enlazador. Los términos "agente de enlace" o "enlazador" usados aquí incluyen varios agentes de enlace o entrecruzamiento bifuncionales, es decir, moléculas que contienen dos grupos o "extremos" reactivos, que pueden estar separados mediante un espaciador.

Las matrices de separación magnética de alto gradiente convencionales se preparan típicamente a partir de materiales como alambres, fibra recubierta de metal, o lana de acero. En el dispositivo de separación magnética de la presente invención, la matriz de intensificación de gradiente del separador magnético de alto gradiente se forma a partir de pequeñas esferas de un material susceptible magnéticamente o ferromagnético. Dichos materiales incluyen, pero no están limitados a, hierro, acero, cobalto, níquel, y otros metales de tierras raras o aleaciones de los mismos. Por ejemplo, el material de la matriz puede incluir esferas de material ferromagnético como esferas de hierro (es decir, bolas MARABU, Kugelfabrik Schulte & Co., Wermelskirchen, Alemania). Se conocen muchos procedimientos diferentes de fabricación de esferas. Normalmente las esferas tienen un diámetro medio en el intervalo entre aproximadamente 0,2 y 1,5 mm para la separación de células grandes o complejos celulares, y aproximadamente entre 0,05 y 0,2 mm de diámetro para el material subcelular. Preferiblemente, las esferas tienen un diámetro medio en el intervalo entre aproximadamente 0,2 y 0,5 mm, y más preferiblemente, las esferas se seleccionan con un diámetro medio en el intervalo entre aproximadamente 0,2 y 0,3 mm. Es deseable que el tamaño de las esferas sea relativamente homogéneo, variando normalmente no más de un 15% del tamaño medio, más normalmente no más de aproximadamente el 10%, y preferiblemente no más de aproximadamente el 5%.

Para la construcción de una matriz de un separador magnético es deseable la forma esférica substancialmente simétrica y el tamaño substancialmente uniforme de las esferas, ya que las esferas pueden asumir una configuración de red en la que los huecos entre las esferas forman canales o poros regulares en la matriz. La configuración de red es un entramado estructurado de esferas que forma canales de tamaño regular entre esferas adyacentes y por toda la matriz. Durante la aplicación de un campo magnético al separador, se crean gradientes de campo magnético en los huecos entre las esferas. El tamaño uniforme, y por lo tanto el espaciado, de las esferas proporciona un gradiente magnético substancialmente uniforme a través de la matriz, y unas características de flujo de fluido substancialmente uniformes. En la Figura 4 se representa un canal de flujo. Las dimensiones del canal se pueden describir mediante el tamaño máximo de bola o partícula que encajaría entre las esferas de la matriz. Con referencia a la Figura 4, la relación geométrica es r=\approx0,155R. Se entenderá a partir de las enseñanzas de la presente invención que el tamaño del canal se puede ajustar a un diámetro medio óptimo para el proceso de separación deseado mediante la variación del tamaño de las esferas que se usan para formar la matriz.

La forma esférica produce la formación de una estructura de matriz substancialmente estable cuando se empaquetan las esferas dentro de una carcasa que define una cámara de separación. Como se describe en detalle a continuación, la matriz se cubre también con un material impermeable substancialmente fluido como un polímero plástico. Al aplicar el recubrimiento de polímero plástico, se cierran los apretados huecos entre las esferas, lo que resulta en una matriz optimizada hidrodinámicamente. La matriz ferromagnética resultante ocupará normalmente aproximadamente entre el 60 y el 75% del volumen total de la cámara de separación, y será permeable a los fluidos. El recubrimiento impermeable cubrirá aproximadamente entre el 1 y el 5% del volumen total. El volumen libre estará en el intervalo entre aproximadamente el 20 y el 40% del volumen total de la cámara de separación. En una realización preferente, la matriz total ocupará aproximadamente entre el 75-80% del volumen total de la cámara de separación

La Figura 1 representa un esquema de una columna de separación a modo de ejemplo. No se representan las esferas a escala, con el fin de representar mejor la formación de una matriz permeable al fluido tridimensional 106. Las esferas están empaquetadas en una carcasa 104 hecha de un material no magnético. La carcasa del separador magnético sirve como cuerpo de la columna de separación, y el interior de la carcasa define una cámara de separación. Carcasas de varias longitudes, formas y diámetros están hechas ventajosamente de plástico. Los materiales no magnéticos apropiados para la construcción de una carcasa del separador magnético incluyen acero inoxidable, vidrio, plástico, etc.

En una realización preferida, la carcasa del separador magnético es un plástico al que se adhiere el recubrimiento de la matriz, permitiendo propiedades hidrodinámicas mejoradas en el límite entre la matriz y la carcasa. Se entenderá que el material de recubrimiento y el material de la carcasa se seleccionarán para su mutua compatibilidad, por ejemplo, se debe seleccionar un recubrimiento de laca que no produzca acumulación de restos plásticos no-adherentes en la columna. Se conocen varios mecanismos mediante los cuales los materiales se adhieren entre sí, y se pueden emplear para este propósito. Convenientemente, la selección de compatibilidad se hará en función del disolvente empleado junto con la laca. El disolvente será ligeramente reactivo con la carcasa de plástico, de manera que se adhiera la laca en el disolvente, pero no tan reactivo como para que se comprometa la integridad estructural de la columna durante el procedimiento de curado con laca. Por ejemplo, el material de recubrimiento se pude seleccionar para incluir un disolvente que provoque una ligera disolución del interior de la carcasa de plástico. Durante el curado, el plástico se endurece ligando o sellando de esta manera el material de recubrimiento y el material de la carcasa entre sí. Un experto en la materia entenderá que la información respecto a dicha reactividad está generalmente disponible. Un ejemplo de una combinación apropiada de disolvente y carcasa es metiletilcetona y el plástico ULTEM® (General Electric).

Preferiblemente, cada uno de los materiales seleccionados para la construcción de la columna de separación 102 será también compatible con los procedimientos de esterilización. Preferiblemente, la carcasa tiene forma cilíndrica para facilitar el flujo de muestra a través de la cámara de separación, así como la formación de una matriz tridimensional 106 dentro de la carcasa. Las paredes de la carcasa tienen preferiblemente un espesor de aproximadamente 1 a 3 mm. La columna de separación tiene tomas de entrada 112 y salida 114 para la introducción y la descarga de fluidos. Generalmente, las tomas de entrada y salida son estructuras estrechas con relación al cuerpo principal de la carcasa. Esto facilita la fijación del separador a un circuito de fluido adicional en un sistema de separación, y mantiene ventajosamente el dispositivo como un sistema cerrado. Las tomas de entrada y salida se pueden situar en sitios diferentes a los mostrados en la Figura 1, pero se entenderá que toda la estructura del separador proporcionará preferentemente una cámara de separación que tenga la mínima cantidad de curvas o esquinas que de otra manera podrían ralentizar el flujo de fluido o crear espacios en los que se acumulase la muestra.

A la entrada y salida de la columna, la columna se construye con un mecanismo de alimentación que asegure la distribución homogénea y el flujo óptimos a través de la matriz. El mecanismo de distribución está compuesto por el volumen frente a la capa de cubierta 108 y la propia capa de cubierta, lo que sirve como resistor de flujo. El volumen de distribución (en mililitros) se puede definir con relación al ancho de la columna (en milímetros), teniendo normalmente una relación de aproximadamente 0.1 a 10. El volumen de la cámara frente a la capa base 110, así como la propia capa base, sirve asimismo como mecanismo de alimentación para los fluidos que atraviesan la cámara vía la toma de salida.

Las columnas tienen dimensiones en las que la relación diámetro a longitud es al menos de entre 0,2 y 1. Las dimensiones reales de la columna dependerán del material a separar, y de la velocidad de flujo deseada para la separación. Las dimensiones de la columna proporcionarán una cámara que aceptará una matriz con un área superficial adecuada para crear gradientes de campo magnético suficientes en la cámara de separación y para permitir la retención eficaz del material etiquetado magnéticamente. El volumen necesario para una determinada separación se puede determinar empíricamente, y puede variar con el tamaño, la densidad de antígeno en la superficie celular, la afinidad del anticuerpo, etc. Como ejemplo, un área transversal de 3 cm^{2} permite una velocidad de flujo de 5 a 40 mL/minuto. La capacidad de enlace de una matriz de 2 x 4 cm es aproximadamente de 109 células etiquetadas.

Para facilitar la fabricación de la columna de separación, la capa base 110 de material poroso no magnético se sitúa en la carcasa de manera que cuando se colocan las esferas ferromagnéticas en la cámara no pasan a través de la toma de salida 114. Los materiales porosos apropiados para la formación de la capa base incluyen, pero no están limitados a, plástico poroso, metales o vidrio sinterizado, rejillas, etc. Por ejemplo, se pueden usar varias fritas porosas disponibles en Porex Singwitz, Alemania. Normalmente, el material poroso tendrá un tamaño de poro de entre aproximadamente 20 y 200 :m, preferiblemente entre 50 y 150 :m. Se seleccionará un tamaño de poro apropiado en función de las dimensiones de la sustancia objetivo y de la preparación del material de la muestra. Además, el tamaño de poro no será demasiado elevado como para permitir que las esferas rellenen las aberturas porosas del material de la capa. A continuación de la inserción de las esferas en la cámara, se puede agitar o hacer vibrar la carcasa para facilitar la acomodación de las esferas en una configuración más uniforme. Opcionalmente, la capa de cubierta 108 de material poroso no magnético se coloca en la carcasa sobre la matriz para mantener la configuración uniforme de la matriz durante el almacenamiento, el manejo y el uso. También se puede aplicar presión a la capa de cubierta 108 para empacar más firmemente las esferas dentro de la cámara. La porción superior 116 de la columna de separación, que incluye la toma de entrada 112 en esta realización, se coloca a continuación sobre la parte superior de la carcasa 104 y se fija a la carcasa. Por ejemplo, cuando se usan materiales plásticos, la porción superior 116 se puede pegar o soldar mediante ultrasonidos a la carcasa 104 para completar la formación de la columna de separación. A continuación de la terminación de la carcasa, se recubre la matriz.

Con relación a la Figura 1, se aplica un recubrimiento a la matriz permeable al fluido descrita anteriormente. El recubrimiento se selecciona substancialmente impermeable a los iones y por lo tanto, protege el material de la matriz metálica frente a la corrosión así como inhibe la fuga de cationes de la matriz, que podría dañar las células. Además de la formación de una capa impermeable protectora sobre el material de la matriz, un recubrimiento completo de la matriz cierra los huecos entre esferas, proporcionando tanto estabilidad mecánica a la matriz como una matriz hidrodinámicamente optimizada. Dicha estabilidad mecánica es particularmente ventajosa cuando la matriz se forma a partir de pequeñas esferas de un metal susceptible o sensible magnéticamente, como se describió anteriormente. Un material de recubrimiento, como un recubrimiento de laca, se puede hacer fluir a través de la toma de entrada 112 de la columna de separación. La laca fluye a través de la capa de cubierta 108, la matriz 106 y la capa base 110, recubriendo de esta manera las superficies porosas de cada componente. El exceso de laca se hace salir de la cámara a través de la toma de salida 114. La columna de separación recubierta se puede centrifugar para eliminar el exceso de material de recubrimiento de la cámara. A continuación se permite que el recubrimiento seque. La columna de separación se puede calentar para promover el secado del recubrimiento. Por ejemplo, la columna de separación recubierta se puede introducir en un horno a 110ºC durante entre cuatro y cinco horas, y a continuación se seca de manera continuada a temperatura ambiente entre tres y siete días.

Durante el secado, el recubrimiento endurece, proporcionando de esta manera soporte mecánico a la matriz. Este soporte mecánico no sólo ayuda a mantener la integridad de la matriz durante el almacenamiento y el manejo de la columna de separación, sino que además proporciona una estructura rígida a la matriz que no exhibe elasticidad significante. Esta rigidez es ventajosa porque la matriz podría de otra manera deformarse bajo la aplicación de un campo magnético externo a la columna de separación. La fuerza del campo magnético aplicado por los medios magnéticos externos se encuentra típicamente en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,5 Tesla, y más preferiblemente entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 0,8 Tesla. La fuerza del campo debería ser suficientemente elevada y la distancia entre el imán y la columna de separación suficientemente pequeña como para inducir gradientes de campo magnético intensificados dentro de la matriz. Para mantener gradientes magnéticos uniformes en el separador, el material de la matriz no debería moverse o desplazarse en la cámara durante la aplicación del campo magnético. Los componentes metálicos esféricos, la carcasa y el recubrimiento, se combinan ventajosamente en la presente invención para proporcionar una matriz mejorada con la suficiente rigidez para resistir una deformación substancial cuando la columna de separación se introduce dentro de un campo magnético.

Es preferible recubrir la matriz mientras los componentes metálicos esféricos estén dentro de la carcasa de la columna de separación. El recubrimiento de la matriz dentro de la carcasa elimina la división de la matriz después de que se haya aplicado el recubrimiento. Además, el recubrimiento de la matriz dentro de la carcasa sirve para rellenar o sellar pequeños espacios vacíos, intersticios o grietas formados cerca de los puntos de contacto entre las esferas, así como entre las esferas y la carcasa, proporcionando simultáneamente una superficie uniforme a los canales o poros formados mediante los puntos separados de las esferas. Estos canales o poros producen la permeabilidad de la matriz. Mediante el sellado de los espacios vacíos, existe una disminución en las áreas en las que las células u otros componente sólidos de la muestra se pueden atascar o atrapar físicamente, incluso en ausencia de un campo magnético.

En la columna de separación terminada, la selección de la matriz y los materiales de recubrimiento producirá preferentemente canales o vías a través de la matriz permeable con un diámetro medio comprendido en el intervalo entre 20 y 60 :m y ocupando un volumen de entre aproximadamente el 60% y el 80% del volumen total de la cámara de separación. Por ejemplo, una columna de separación para la separación de células sanguíneas puede tener un tamaño final de canal recubierto en torno a los 20 :m, con la matriz ocupando aproximadamente el 80% del volumen total de la cámara.

A continuación de la preparación del recubrimiento substancialmente impermeable, la matriz y otras superficies internas de la cámara de separación se tratan adicionalmente mediante la adición de un material hidrofílico como la polividona (BASF, Ludwigshafen, Alemania). Otros materiales de recubrimiento hidrofílico apropiados son, pero no están limitados a, polivinilpirrolidina, polietilenglicol, almidón hidroxietil, y otros recubrimientos hidrofílicos, como acrilamidas, surfactantes o agentes de mojado tipo detergente, e incluyendo material biológico, pero no limitados a, heparina y seroalbúmina humana. La superficie interior de la cámara de separación se puede hacer también hidrofílica mediante ataque de plasma o de corona de la superficie. El recubrimiento hidrofílico proporciona al interior de la columna de separación y a la matriz permeable al fluido una superficie puede mojar fácilmente. Al aumentar la capacidad para mojar estas superficies, la introducción del fluido dentro de la columna de separación producirá un frente de fluido uniforme a medida que pasa a través de la cámara. Esto facilita a su vez la eliminación de burbujas de aire de la matriz permeable y otros espacios vacíos en la cámara de separación. Es deseable mantener la columna de separación y otros componentes del dispositivo como un sistema cerrado substancialmente libre de aire durante el proceso de separación. La presencia de aire en el sistema durante la separación de células objetivo afecta a las tensiones superficiales internas y las áreas no ventiladas, lo que puede conducir a la destrucción de células.

Con relación a la Figura 2, que representa un dispositivo de separación, un dispositivo de prefiltración puede preceder a la columna de separación 40. La figura representa el dispositivo de prefiltración como una columna 30, sin embargo se entenderá que pueden encontrar uso otras configuraciones, como un prefiltro. La columna de prefiltración es generalmente una estructura tridimensional que puede ser substancialmente idéntica a la columna de separación en términos de su composición estructural. Sin embargo, la columna de prefiltración puede tener dimensiones diferentes, la matriz puede estar hecha de esferas con una composición diferente, por ejemplo un material no ferromagnético, o la matriz puede estar hecha de esferas con un diámetro diferente a las usadas en la columna de separación, proporcionando de esta manera un tamaño de poro o de canal diferente al encontrado en la columna de separación. En una realización, la columna de prefiltración es idéntica a la columna de separación. El paso de la muestra a través de la columna de prefiltración sirve para atrapar y eliminar componentes del fluido que no son deseables en el producto de separación final. Por ejemplo, en las separaciones de células sanguíneas, las células "pegajosas" como monocitos, granulocitos y plaquetas se pueden eliminar de la suspensión celular mediante la columna de prefiltración. Por otra parte, la columna de prefiltración se puede construir con un tamaño de poro medio inferior al de la columna de separación. Por ejemplo, el tamaño de poro de la matriz permeable se puede seleccionar para eliminar células tumorales grandes de la muestra antes del paso del fluido a través de la columna de separación. El paso de la muestra de fluido a través de la columna de prefiltración puede servir también para apartar agregados, como agregados celulares, que pueden existir en el fluido. Además, puesto que la columna de prefiltración contiene materiales substancialmente idénticos a los de la columna de separación, aquellos componentes de la muestra que se pueden enlazar de manera no específica a la columna de separación son retenidos ventajosamente en la columna de prefiltración. De esa manera, la columna de prefiltración reduce la posibilidad de ensuciamiento de la columna de separación durante el procedimiento de separación, y reduce la recogida de células o componentes del fluido no deseados en el producto de separación final.

Con relación a la Figura 2, se representa una realización preferida del dispositivo de separación 25. El contenedor de muestra 81 está conectado a un filtro de suspensión opcional 35. El filtro de suspensión se puede usar para eliminar componentes en partículas no deseados de la muestra de fluido y se selecciona con un tamaño de poro suficiente para eliminar las partículas por encima de un cierto tamaño. Por ejemplo, el filtro de suspensión puede ser un Filtro Pall (Pall SQ40S; Pall Biomedical, Inc., Puerto Rico), con un tamaño de poro seleccionado para eliminar partículas de tamaño superior a 40 :m, como coágulos y agregados celulares en muestras celulares hematopoyéticas. El filtro de suspensión se conecta mediante la vía de fluido dos 12 a la toma de entrada 32 de la columna de prefiltración 30.

La toma de salida 34 de la columna de prefiltración 30 se conecta mediante la vía de fluido cinco 15 a la toma de entrada 42 de la columna de separación 40 a la que se aplicará el campo magnético en el transcurso del procedimiento de separación. La toma de salida 44 de la columna de separación se conecta mediante la vía de fluido ocho 18 al canal de distribución 88, que conduce al contenedor de recogida de producto 83, al contenedor de residuos de lavado finales 84 y al contenedor de muestra no etiquetada 85. Las vías de fluido separadas nueve 19, diez 20, y once 21 conducen a esos contenedores, respectivamente.

Este dispositivo de separación incluye además un contenedor de lavado o tampón 80 y un contenedor de residuos de lavado iniciales 82, conectados mediante las vías de fluido uno 16 y tres 17, respectivamente, a la vía de fluido dos 12. El contenedor de tampón 80 está asimismo conectado mediante la línea de lavado o tampón 90 (vía de fluido seis) al canal de distribución 88. La línea de tampón está además conectada a la vía de fluido cinco 15 mediante la vía de fluido cuatro 14. Las vías de fluido, contenedores, filtros y columnas pueden estar acopladas entre sí mediante cualquier medio apropiado como agujas estándar, cierres Luer, conectores macho-hembra, conectores T, conectores Y, y conectores de 4 vías u otros acoplamientos usados habitualmente en conjuntos de reparto de soluciones intravenosas.

El flujo de fluido a través del circuito de fluido del dispositivo de separación se puede controlar mediante válvulas colocadas dentro de las vías de fluido. Las vías de fluido uno a once se asocian con válvulas correspondientes uno a once (1-11). Las válvulas pueden estar dentro de las propias vías o pueden ser externas a las vías. El flujo de fluido puede estar también controlado mediante una bomba. Por ejemplo, cuando las vías de fluido están hechas de un material flexible, como tubería flexible, válvulas apropiadas para el control del transporte del fluido incluyen válvulas de pinza. Las válvulas de pinza cierran las vías de fluido al apretar las paredes de la tubería entre sí. Los expertos en la materia entenderán que dichas válvulas de pinza se seleccionarán para adaptarse al tamaño de la tubería elegida para usar como vía de fluido. Además, la fuerza de compresión de la válvula de pinza se seleccionará para lograr la compresión de la tubería elegida y efectuar de esta manera el cierre de la vía de fluido. Por lo tanto, las especificaciones de las válvulas se unirán a las especificaciones de blandura o dureza (durómetro) de la tubería seleccionada.

La realización más preferida del dispositivo de separación incluye también un bucle de recirculación 92 (vía de fluido siete) de manera que el fluido que ya ha pasado a través de la columna de separación 40 se puede recircular a través de la columna de separación. Típicamente, una bomba 64 se conectará al bucle de recirculación para facilitar la recirculación del fluido a través de la columna de separación, así como para controlar el flujo a través de la columna. Los expertos en la materia entenderán que se puede usar una variedad de bombas. Una bomba de ejemplo es una bomba peristáltica que puede controlar el paso del fluido a través del bucle de recirculación en cualquier dirección y a velocidades variables. El dispositivo de separación que tiene un bucle de recirculación permite separaciones secuenciales en una columna, mediante un procedimiento de enlace y elución, seguido de un segundo enlace y elución. Las separaciones secuenciales proporcionan pureza mejorada en la población objetivo final.

La Figura 2 representa esquemáticamente una realización preferente de un dispositivo de separación. Sin embargo, se entenderá que un procedimiento de separación se puede realizar usando los componentes básicos del sistema, es decir, el separador magnético y los contenedores de recogida.

Los expertos en la materia entenderán que los medios de recirculación y las vías de flujo de fluido de la presente invención son también apropiados para su uso en sistemas de separación alternos. Por ejemplo, los medios de recirculación se pueden usar ventajosamente en un sistema en el que los medios de separación involucren técnicas de centrifugación, columnas de absorción o medios químicos como alternativas a los medios de separación magnética o electromagnética.

En un procedimiento de separación de células de ejemplo, las vías de fluido y las columnas se ceban al permitir que un líquido de lavado fluya a través de todas las vías de fluido y columnas, preferiblemente a velocidades de flujo y presiones variables. El líquido de lavado puede contener materiales como una proteína fisiológicamente aceptable, como seroalbúmina humana (HSA), que inhibe la adhesión de las células al interior de las superficies de los componentes de plástico del dispositivo. El líquido de lavado puede contener también pequeñas cantidades de detergentes o surfactantes aceptables fisiológicamente, para mejorar el mojado de las superficies interiores.

Se encuentra que las burbujas de aire grandes en las vías de fluido son perjudiciales para la recuperación de células viables. Los procedimientos de eliminación de burbujas de aire de vías de fluido son conocidos en la materia, y se pueden emplear para este propósito. Un procedimiento de interés particular explota la observación de que una frita permeable como la usada en la capa de cubierta y/o en la capa base no permitirá el paso de burbujas de aire a velocidades de flujo de fluido inferiores a aproximadamente 400 mL/minuto. Una columna se puede limpiar de burbujas de aire circulando líquido de lavado a través de un bucle de recirculación a velocidades de flujo inferiores a aproximadamente 400mL/minuto. Las burbujas de aire se acumulan entonces fuera de la columna en las capas base y/o de cubierta. A continuación se invierte la dirección de flujo, y las burbujas se eliminan del sistema en una bolsa de residuos apropiada. Preferiblemente se repite la secuencia para asegurar la eliminación de todas las burbujas. Las burbujas existentes se pueden agrandar intencionadamente mediante la generación de presión negativa.

En dicho procedimiento de ejemplo, se pueden usar anticuerpos conjugados magnéticamente para dar en el blanco específicamente en las células deseadas en una población celular mezclada. El reactivo magnético se incuba con la población celular mezclada, y a continuación las partículas no enlazadas se eliminan mediante cualquier medio conveniente, por ejemplo, centrifugación, etc. Cuando se desea esterilidad celular, las incubaciones de anticuerpos y los lavados se pueden realizar en un procedimiento de contenedor cerrado, en el que los anticuerpos y los líquidos de lavado se añaden a un contenedor estéril mediante una aguja estéril o un dispositivo similar. De esta manera, se minimiza la contaminación de las células deseadas mediante los microorganismos de la atmósfera. En dicho sistema cerrado, particularmente cuando el contenedor es una bolsa flexible, la mezcla de las células y el anticuerpo se puede mejorar inyectando en el contenedor una pequeña cantidad de aire estéril, con una relación de aproximadamente entre 0,5 y 2 de aire a líquido.

La suspensión celular incubada, que contiene ahora células objetivo etiquetadas magnéticamente, se pasa a través del dispositivo de separación. El sistema transporta las células a través de un separador magnético que se posiciona dentro de o es adyacente a un campo magnético. La fuente del campo magnético puede ser un imán permanente o un electroimán. La columna de separación se construye para incluir una matriz ferromagnética de esferas ferromagnéticas apiladas, como la descrita anteriormente. Opcionalmente, se pasa la muestra a través de una columna de prefiltración, construida también como se indicó anteriormente, antes del paso a través de la columna de separación. Si la columna de separación contiene una matriz compuesta de un material distinto a esferas ferromagnéticas, entonces la muestra se puede pasar primero a través de una columna de prefiltración que es substancialmente idéntica a la columna de separación.

Las células etiquetadas magnéticamente se acumulan en la columna de separación en respuesta al campo magnético. Las células no etiquetadas y otros componentes de la suspensión pasan a través de la columna de separación hacia un contenedor de muestra no etiquetada y/o un contenedor de residuos. A continuación las células etiquetadas o purificadas se pueden eluir de la columna de separación mediante tanto la retirada de la columna de separación del campo magnético como la eliminación del campo magnético de la columna de separación. Se pasa una disolución de lavado, tal como un líquido tampón, a través de la columna de separación con el fin de eliminar las células de la columna de separación hacia un contenedor de recogida de producto. El contenedor de recogida se puede usar para el procesamiento adicional de las células objetivo o la criopreservación de las células objetivo.

En las realizaciones preferidas, la columna de separación es una columna de separación magnética de alto gradiente construida con esferas ferromagnéticas, como se describió anteriormente. Los contenedores mencionados aquí son típicamente bolsas de plástico, como las usadas para el almacenamiento y el reparto de fluidos intravenosos, pero se puede usar cualquier contenedor apropiado. Los contenedores se seleccionarán en función del volumen de recogida o almacenamiento necesario, su capacidad para la esterilización, y su capacidad para ser usados en un sistema cerrado, es decir, un sistema de separación en el que substancialmente todo el aire se pueda eliminar antes del uso.

En otra realización preferente, las células etiquetadas magnéticamente se recirculan a través de la columna de separación para incrementar la selección de las células objetivo y la eliminación de células no deseadas u otros componentes de la suspensión. Algunas realizaciones preferentes incluyen también el uso de una columna de prefiltración. Sin embargo, la columna de prefiltración no está sometida a un campo magnético. En cambio, el paso preliminar de la suspensión celular a través de la columna de prefiltración produce la captura de los componentes o materiales de la suspensión que de otra manera se podrían enlazar de manera no específica a la columna de separación. Dicho enlace no específico puede causar el bloqueo o el ensuciamiento de la columna de separación, lo que a su vez podría inhibir o reducir la separación y la recogida de la población celular etiquetada.

Las vías de fluido, los contenedores de recogida, el filtro de suspensión, la columna de prefiltración y la columna de separación, se pueden construir, interconectar y suministrar como un dispositivo de separación desechable. Las células objetivo se recogen preferiblemente en un contenedor de transferencia de sangre estéril a partir del cual se pueden transplantar las células al paciente, o en el que se pueden almacenar las células o ser sometidas a procesamiento adicional. El dispositivo de separación celular completo se puede empaquetar previamente en contenedores apropiados. El dispositivo de empaquetado previo se puede esterilizar y proporcionar dispuesto para el uso en el procedimiento de separación magnética. Los reactivos necesarios para el procedimiento de separación deseado se pueden también proporcionar en forma de equipo. Por ejemplo, se puede proporcionar un conjugado específico para la población celular objetivo u otro analito de manera separada o junto con el dispositivo. El equipo puede incluir también disoluciones de lavado, por ejemplo disolución salina estéril estándar y/o otros líquidos tampón, como disolución salina fosfato tamponada, EDTA 1 mM y seroalbúmina humana al 0,5%. Estos reactivos u otras disoluciones se pueden proporcionar en contenedores tales como bolsas de plástico que se pueden conectar a los pasos de fluido apropiados del dispositivo de separación celular.

El sistema de separación de la presente invención puede estar totalmente automatizado. En el sistema automatizado, un ordenador controla el flujo de los fluidos a través de los circuitos de fluido y la columna de separación, controla la fuerza del campo magnético o la posición del imán y/o la columna de separación para proporcionar la retención y la liberación de las células o analito objetivo etiquetados magnéticamente, y dirige los productos de recogida finales hacia los contenedores apropiados.

Una realización de un instrumento de separación celular automatizado, como se representa en la Figura 3, incluye componentes mecánicos, electromecánicos y magnéticos. Los componentes mecánicos pueden incluir: una cubierta externa del instrumento o carcasa 15; un soporte ajustable del contenedor 21; una bomba peristáltica 64; un soporte de la columna de prefiltración 32, y un soporte de la columna de separación 42. Los componentes electromecánicos pueden incluir: válvulas de pinza de solenoide 1-11; un motor interno (no mostrado) para mover la bomba peristáltica 64; un motor interno (no mostrado) para mover el soporte de la columna de separación 42 (y de esta manera mover la columna de separación 40) dentro o fuera del campo magnético, o para mover el imán 50; y un detector de burbuja (sensor ultrasónico) 65, que se usa para detectar la presencia de fluido en el circuito de fluido. Los medios magnéticos pueden incluir imanes permanentes y electroimanes. Se entenderá que estos componentes individuales se pueden seleccionar entre una variedad de alternativas fácilmente disponibles, y se pueden combinar en una variedad de configuraciones sin alejarse de la descripción general del sistema de separación de la presente invención.

En una realización preferida del dispositivo de separación, se proporcionan las vías de fluido, los contenedores de disolución y recogida, el filtro de suspensión, la columna de prefiltración, la columna de separación y los conectores como un componente desechable pre-montado para el sistema de separación. El dispositivo de separación se monta en el instrumento de separación para la realización del procedimiento de separación. Cuando finaliza el procedimiento de separación se puede eliminar el contenedor de recogida de producto, y se desechan los componentes del dispositivo de separación restantes.

Preferiblemente, un microprocesador incorporado (no mostrado) controla todos los componentes electromecánicos del instrumento, y el software dirige el sistema para llevar a cabo las operaciones apropiadas en una secuencia estándar. Una pantalla de video 62 y un teclado de operación 60 permiten que el operador observe el funcionamiento del sistema automático y controle el funcionamiento del instrumento en modo manual. Se puede conectar una impresora (no mostrada) al microprocesador para imprimir información del procedimiento, etiquetas, etc.

La Figura 3 representa un instrumento de separación y un dispositivo de separación montado. En esta realización, el dispositivo de separación se monta o instala sobre el instrumento situando las tuberías de las vías de fluido en sus válvulas de pinza externas respectivas 1-11, como se describió anteriormente. La columna de prefiltración 30 se coloca dentro del soporte de la columna de prefiltración 32. La columna de separación 40 se coloca dentro del soporte de la columna de separación 42 que se mueve con relación al imán 50 mediante un brazo retráctil 44. Una palanca de sujeción ajustable 20 se usa para asegurar el brazo de percha 21 en una posición elevada. Existen soportes o clavijas 22 en el brazo de sujeción en los que colocar el contenedor de residuos de lavado inicial 82 y los contenedores de muestra y tampón (no mostrados) cuando sea necesario. El aparato puede también incluir un compartimento de almacenamiento 70 para separar el contenedor de residuos finales y el contenedor de muestra no etiquetada del contenedor de recogida de producto (no mostrado).

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no en modo limitante.

Ejemplos Ejemplo 1 Columna de separación / columna de prefiltración 104

Con relación a la Figura 1, se selecciona una carcasa cilíndrica de un material no magnético con un diámetro de 20 mm y un volumen total de unos 14 mL. Una primera frita porosa (polipropileno) se coloca en la base de la carcasa formando de esta manera una capa base 110. La capa base tiene un tamaño de poro medio de aproximadamente 100 :m. Se añaden esferas de hierro ferromagnéticas a la cámara. Las esferas tienen un diámetro medio de entre aproximadamente 0,2 y 0,5 mm, y se colocan aproximadamente 60 gramos (entre 55 y 65 gramos) de esferas en el contenedor. Para evitar el sobre-llenado de la cámara se prefiere una tolerancia de 0,12 gramos. El uso de esferas con diámetros substancialmente uniformes permite que las esferas adopten una configuración simétrica como la mostrada en la Figura 1 en la que las esferas están apiladas en capas fuertemente interconectadas. A continuación se hace vibrar la carcasa durante aproximadamente cinco segundos para asentar las esferas en una matriz uniforme 106. Se coloca una segunda frita porosa o capa de cubierta 108 sobre las esferas asentadas y se puede presionar sobre la cámara para comprimir y/o sostener además las esferas en una configuración de matriz apilada o estructura a modo de red. A continuación se fija la porción superior 116 de la columna de separación a la parte superior de la carcasa. El área en torno a la toma de entrada 112 y la toma de salida 114 se puede conformar para facilitar una conexión segura de la columna a una vía de fluido tal como una tubería de plástico. Dicha columna puede incluir también topes 118 que inhibirán que la tubería pase más allá de cierto punto de la columna. Las tomas se pueden formar también para incluir cualquier medio de conexión apropiado como puntas, cierres luer, conectores macho-hembra, etc.

La matriz se puede recubrir como se describió anteriormente. Una vez que la matriz recubierta se ha secado, la columna de separación se trata también con aproximadamente 5 mL de polividona al 1%, u otro material hidrofílico apropiado. Se permite el paso del exceso de polividona a través de la toma de salida 112, y se seca la columna de separación.

Ejemplo 2 Procedimiento de separación celular

El siguiente procedimiento de separación celular se ejemplifica mediante el dispositivo de separación de la Figura 2.

Antecedentes

En las determinaciones de las velocidades de flujo óptimas, se encontró que la mayoría de los resultados deseados de una secuencia, por ejemplo lavado, elución, etc., ocurría en un período de tiempo breve, proporcionando pocos beneficios adicionales el uso de ciclos de flujo más largos. Con el fin de maximizar la realización, se ejecutaron varios ciclos cortos en lugar de un ciclo largo. Esto proporciona una mejor realización sin ganancia neta de tiempo o volumen bombeado. De esta manera se minimiza la pérdida de células, el impacto físico sobre las células durante la elución, y la contaminación residual.

Cebado del dispositivo de separación

La primera fase del procedimiento de separación celular involucra el llenado o cebado de las vías de fluido, el filtro de suspensión, y las columnas de prefiltración y separación. Durante el procedimiento de cebado, típicamente no se aplica el campo magnético a la columna de separación. El cebado del dispositivo sirve para eliminar el aire del sistema de separación, así como para lavar el recubrimiento hidrofílico (por ejemplo PVP) de las columnas de prefiltración y separación. En algunas etapas se induce el flujo por gravedad y en otras con una bomba.

Las vías de fluido y la columna se limpian de burbujas de aire mediante la circulación de líquido de lavado a través de un bucle de recirculación a velocidades de flujo inferiores a aproximadamente 400 mL/minuto. Se usan varios ciclos a diferentes velocidades de flujo. Las diferentes velocidades de flujo inducen diferentes características de flujo a través del dispositivo de separación, así como presiones negativas, y ambas cosas ayudan a extraer las burbujas de las tuberías y la columna. Las burbujas de aire se acumulan entonces en la parte externa de la columna en las capas base y/o de cubierta. A continuación se invierte la dirección del flujo, y se eliminan las burbujas del sistema dentro de una bolsa de residuos apropiada. La secuencia se repite durante seis ciclos de aproximadamente 5 segundos cada uno para asegurar la eliminación de todas las burbujas. Un ciclo de aproximadamente 4 segundos implica la recogida de aproximadamente el 90% de las burbujas. Cada ciclo sucesivo elimina aproximadamente el 90% del balance previo.

Se abren las válvulas 6 y 10 para permitir que un tampón u otra disolución de lavado fluya desde el contenedor de tampón 80 y pase a través de la línea de tampón 90 hasta el contenedor de residuos finales 84. Se cierra la válvula 10, y se abren las válvulas 8, 5 y 3 para cebar la columna de separación 40 y la columna de prefiltración 30, eliminando de esta manera las burbujas de aire y lavando el recubrimiento hidrofílico de las columnas. Las burbujas de aire y los residuos se transportan hasta el contenedor de residuos de lavado iniciales 82. Se puede activar la bomba 64 para facilitar el transporte del líquido de lavado a través de la vía designada preferiblemente al uso de la gravedad para inducir el flujo a través del sistema. Se vuelve a abrir la válvula 10 para permitir un drenaje adicional por gravedad de las burbujas de aire hasta el contenedor de residuos finales 84, y se cierran las válvulas. El líquido de lavado puede contener materiales como seroalbúmina humana, que inhibe que las células se adhieran a las superficies internas de los componentes del dispositivo de plástico.

A continuación se abren las válvulas 4, 7, 8 y 10 para cebar el bucle de recirculación 92. Se activa la bomba para hacer circular el tampón a través de la columna de separación 40 tanto en la dirección de las agujas del reloj como en dirección contraria a las agujas del reloj por el bucle de recirculación. Se repite este procedimiento de recirculación para el paso del tampón a través de ambos extremos de la columna de separación con el fin de recoger y eliminar de manera secuencial las burbujas de aire restantes de la matriz porosa y otros espacios vacíos de la columna de separación, y para mojar completamente el interior de la columna de separación. El procedimiento de recirculación también sirve para aclarar cualquier recubrimiento hidrofílico de la columna de separación. A continuación se cierran las válvulas.

Se abren las válvulas 1, 2 y 3 para permitir el cebado del filtro de suspensión 35. A continuación se cierran las válvulas. Se abren a continuación las válvulas 6, 8, 5 y 2 para permitir el paso del tampón hasta el contenedor de muestra 81. A continuación se cierran todas las válvulas. En un sistema automatizado, se sitúa un sensor de ultrasonidos 65 cerca de la vía de fluido dos 12. Si cualquier burbuja de aire entra en el sistema desde el contenedor de muestra, se detecta la interrupción de flujo de fluido en la vía, y el instrumento cambia automáticamente al modo de lavado. Todas las válvulas se cierran hasta que el operador puede eliminar la burbuja de aire.

Primera recogida de las células etiquetadas magnéticamente

En la fase de recogida, se sitúa un imán con relación a la columna de separación 40 de tal manera que se aplique un campo magnético a la columna de separación. El posicionamiento relativo puede involucrar el movimiento del imán en torno a o de manera adyacente a la columna de separación, o el movimiento de la columna de separación dentro del campo magnético. En una realización de la presente invención en la que se usa un imán permanente para proporcionar el campo magnético, el imán se mantiene ventajosamente en una posición fija, ya que es un componente relativamente pesado del sistema de separación. De esta manera, se monta la columna de separación dentro de o se fija a un brazo (no mostrado) que sirve para retraer la columna de separación dentro del campo magnético para la fase de separación, y para desplazar a continuación la columna de separación fuera del campo magnético para las fases de elución y/o lavado.

En este ejemplo, se retrae la columna de separación 40 dentro del campo magnético de un imán permanente. Se abren las válvulas 1, 5, 8 y 11 para eliminar las burbujas de aire de la parte inferior de la columna de prefiltración 30 y de la columna de separación 40, y a continuación se cierran las válvulas. Se abren las válvulas 6, 8 y 4 para eliminar cualquier burbuja de aire de la línea de tampón 90. Se cierran las válvulas 8 y 4, y se abre la válvula 10 para permitir el drenaje por gravedad del tampón hacia el contenedor de residuos finales 84. A continuación se cierran todas las válvulas.

Se abren las válvulas 2, 5, 8 y 11 para iniciar el flujo de muestra desde el contenedor de muestra 81 y su transporte secuencial a través del filtro de suspensión 35, la columna de prefiltración 30 y la columna de separación 40. Las células o analito objetivo que han sido enlazadas con un reactivo magnético son retenidas en la columna de separación en presencia de un campo magnético. Las células no etiquetadas y/o otros componentes del fluido pasan a través del sistema y son recogidos en el contenedor de muestra no etiquetada 85. Este procedimiento continúa hasta que se vacía el contenedor de muestra y se detecta una burbuja de aire en la vía de fluido dos 12. A continuación se cierran las válvulas.

Primer lavado de la columna de separación

Se lleva a cabo un primer lavado del circuito de fluido mediante la apertura de las válvulas 1, 5, 8 y 11 para permitir el paso del tampón a través de las columnas de prefiltración y separación. Se lava la vía y se vacía en el contenedor de muestra no etiquetada 85. Se cierran las válvulas 1 y 5, y se abren las válvulas 7 y 4 para permitir un lavado por gravedad del bucle de recirculación 92. A continuación se cierran las válvulas. El contenedor de células no etiquetadas está ventajosamente conectado al circuito de fluido en una vía de fluido separada de manera que las células no etiquetadas no se destruyen o contaminan durante el procedimiento de separación.

Se abren las válvulas 4, 8 y 10 para permitir que el tampón aclare la columna de separación hacia el contenedor de residuos finales 84. A continuación se cierran las válvulas.

Se abren las válvulas 6, 5, 8 y 3 para transportar tampón sin usar a través del sistema, incluyendo la columna de prefiltración 30. Se trata de un procedimiento de seguridad para eliminar células residuales en la parte superior de los conectores. A continuación se cierran las válvulas. Se abren de nuevo las válvulas 4, 8 y 10 para permitir que el tampón aclare la columna de separación 40 hacia el contenedor de residuos finales 84. A continuación se cierran las válvulas.

Se abre la válvula 7, y se activa la bomba 64 para lavar a contracorriente la columna de separación 40 con el tampón entrando en la columna de separación a través de la toma de salida 44. A continuación se abren las válvulas 4, 8 y 10 para permitir el aclarado por gravedad del bucle de recirculación 92 hacia el contenedor de residuos finales 84. Se cierra la válvula 7, y el tampón lava la columna de separación hacia el contenedor de residuos finales. A continuación se cierran todas las válvulas. Esta secuencia se repite 3 veces usando ciclos cortos, para mejorar la eficacia y permitir el uso de velocidades de flujo más bajas.

En ésta y otras etapas del procedimiento de separación se usa ventajosamente una bomba. Una bomba no sólo puede cambiar la dirección del flujo del fluido, o la circulación del fluido conjuntamente con el bucle de recirculación, sino que también puede operar a diferentes velocidades de flujo. Las diferentes velocidades permiten que el fluido sea bombeado a velocidades variables y que sea transportado a través del sistema sin depender solamente de la gravedad. Por ejemplo, se puede realizar un lavado de la columna de separación o las vías de fluido a una velocidad superior con el fin de eliminar mejor del sistema los materiales enlazados no específicamente. Además, la bomba junto con el sistema de recirculación permite la agitación del fluido en el sistema. Esta agitación también se puede usar para ayudar a eliminar del sistema materiales de la muestra deseados o indeseados.

Primera elución de las células separadas de la columna de separación

Se abren las válvulas 6 y 11 para aclarar el canal de distribución 88. Se cierran todas las válvulas y se desconecta el imán o se retira la columna de separación 40. Se abre la válvula 7, y se transporta el tampón a través de la columna de separación, lavando de esta manera las células separadas etiquetadas magnéticamente de la columna de separación. Se puede usar la bomba 64 para facilitar el transporte del tampón de un lado a otro a través de la columna de separación para lavar a contracorriente y eliminar repetidamente las células etiquetadas de la columna de separación. A continuación se cierra la válvula 7.

Es posible que algunas células etiquetadas o no etiquetadas puedan encontrarse atrapadas o atascadas físicamente dentro de la matriz porosa u otros espacios vacíos de la columna de separación a medida que se pasa la muestra hacia abajo a través de la cámara. La recuperación de las células separadas se aumenta mediante lavado a contracorriente (es decir, transporte de la disolución de lavado hacia arriba a través de la toma de salida 44 de la columna de separación, a través de la matriz y hacia fuera a través de la toma de entrada 42), al empujar cualquier célula atrapada a través de la cámara en dirección opuesta a la de entrada. Esto es claramente preferible a forzar las células a través de la matriz en la fase de elución y por la tanto romper posiblemente las células.

Re-recogida de las células etiquetadas magnéticamente

En un procedimiento de separación magnética preferido, se lleva a cabo una segunda recogida o re-recogida de las células etiquetadas magnéticamente. Se conecta el imán o se vuelve a colocar la columna de separación 40 dentro del campo magnético. Se abre la válvula 7, y se recircula el fluido que contiene las células etiquetadas a través de la columna de separación a través del bucle de recirculación 92. Preferiblemente, el fluido circula en sentido contrario a las agujas del reloj. Esto produce la entrada de las células etiquetadas en la columna de separación a través de la toma de salida 44 de la columna de separación. Esto a su vez produce la recogida de la mayoría de las células etiquetadas magnéticamente en la porción inferior de la cámara de separación a partir de la cual las células se pueden eluir fácilmente. Se pueden abrir las válvulas 6, 8, 5 y 3 para eliminar cualquier célula etiquetada de los ajustes o conectores inferiores para la re-recogida en la columna de separación. A continuación se cierran las válvulas. También se puede volver a abrir la válvula 7 para eliminar cualquier célula etiquetada del bucle de recirculación para la re-recogida en la columna de separación.

Segundo lavado de la columna de separación

Se puede realizar un segundo lavado de la columna de separación 40. Se hace circular el fluido a través del bucle de recirculación 92 para lavar la porción inferior de la columna de separación. Se abren las válvulas 4, 8 y 10 para permitir el aclarado por gravedad del bucle de recirculación y el paso del tampón de aclarado hacia el contenedor de residuos finales 84. A continuación se cierran las válvulas. Esta secuencia de etapas se puede repetir. Se abren las válvulas 6 y 11 para limpiar el canal de distribución 88, y a continuación se cierran las válvulas. Esta secuencia se repite 3 veces usando ciclos cortos.

Elución final de las células etiquetadas de la columna de separación

Se desconecta de nuevo el imán o se elimina. Se abren las válvulas 4, 8 y 9, permitiendo de esta manera que el tampón elimine las células etiquetadas magnéticamente de la parte inferior de la columna de separación 40 hacia el contenedor de recogida de producto 83. Se puede abrir la válvula 7 y se puede activar la bomba 64 con el fin de lavar a contracorriente las células de la columna de separación. A continuación se para la bomba para permitir el lavado continuado de la columna de separación hacia el contenedor de recogida de producto. Esta etapa se puede repetir. La recogida final de las células etiquetadas se realiza mediante drenaje por gravedad del bucle de recirculación 92. A continuación se cierran todas las válvulas. La elución recupera al menos aproximadamente el 90% de las células enlazadas. Se puede realizar una segunda elución con el fin de recoger las células enlazadas residuales, usando los parámetros descritos anteriormente, pero incluyendo el paso de la disolución de lavado a través del bucle de recirculación para lavar la columna de manera más enérgica. Este procedimiento en dos etapas permite que la mayoría de las células objetivo escapen del procedimiento de elución más enérgico.

El contenedor de recogida de producto 83 contiene ahora las células etiquetadas y se puede eliminar del dispositivo de separación. El procedimiento de separación produce también la recogida de células no etiquetadas y otros componentes de la muestra no contaminados en un contenedor de muestra no etiquetada 85. Si se produce un error en el procedimiento de separación, se puede recuperar la muestra en el contenedor de muestra no etiquetada y se puede reiniciar el procedimiento. Además, la recuperación de células u otros componentes en el contenedor de muestra no etiquetada permite el uso de los materiales recuperados en procedimientos de separación adicionales u otros procedimientos. Opcionalmente se eluyen directamente las células en una bolsa apropiada para congelación u otro almacenamiento. En un procedimiento de separación de células, por ejemplo, el 10-20% de la población celular objetivo puede pasar al contenedor de células no etiquetadas, pero el contenido no contaminado de ese contenedor se puede volver a procesar a través del dispositivo de separación. Preferentemente, menos del 20% de la población celular objetivo pasará al contenedor de muestra no etiquetada durante un procedimiento de separación.

El factor de enriquecimiento es el número de células no etiquetadas que pasan a través del procedimiento por células no etiquetadas que son retenidas de manera no específica mediante el dispositivo. Normalmente el procedimiento de separación/recogida descrito anteriormente proporcionará un factor de enriquecimiento para los procedimientos preparativos a gran escala de al menos aproximadamente 1000, más normalmente de al menos aproximadamente 3000 y preferiblemente de al menos aproximadamente 5000. Los procedimientos a gran escala implicarán normalmente la recogida de al menos aproximadamente 107 células objetivo, más normalmente al menos aproximadamente 108 células objetivo. Una muestra de sangre periférica que tiene una población inicial de células CD34 positivas del 0.1% producirá la recogida de una población de células objetivo de aproximadamente el 70-90% de pureza, que se corresponde con un factor de enriquecimiento de entre 3000 y 10000. Se pueden obtener resultados similares cuando el material de muestra de partida se prepara a partir de células mononucleares de cultivo (conteniendo generalmente aproximadamente un 0,1% de células progenitoras) o de un producto de leucoforesis de pacientes tratados con un agente para movilizar las células CD34+ (conteniendo generalmente aproximadamente un 2,0% de células progenitoras).

Ejemplo 3 Recogida de células progenitoras hematopoyéticas Preparación de la muestra

En un procedimiento de separación de células de ejemplo, células de sangre humana proporcionan la población celular de muestra. Se pueden usar poblaciones celulares mezcladas como sangre periférica, médula ósea, sangre del cordón umbilical o la placenta, o sangre fetal, que son recogidas mediante las técnicas estándar. Las técnicas estándar se usan también para la preparación inicial de la muestra celular (por ejemplo, separación por densidad de Ficoll-Hypaque, centrifugación y eliminación del sobrenadante, etc.). Los procedimientos típicos de preparación de la muestra reducirán el volumen de la muestra, concentrando de esta manera las células objetivo y reduciendo la cantidad de fluido que se debería usar en el sistema de separación. Mediante la preconcentración de la muestra, se necesita menos anticuerpo para el procedimiento de separación y el enlazado ocurre más rápidamente. El material de partida preferido es un producto de leucoforesis de pacientes tratados con un agente para movilizar las células CD34+.

Incubación del conjugado magnético

La etiqueta magnética es una partícula de hierro/polisacárido conjugada a un anticuerpo murina monoclonal que se enlaza específicamente a CD34, un antígeno de superficie encontrado en células madre hematopoyéticas y progenitoras. La suspensión celular se hace girar en una bolsa estéril a 500xg durante 10 minutos. Usando un adaptador de punta con ventilación, se retira el sobrenadante del plasma de la bolsa, teniendo cuidado de no eliminar ninguna célula blanca. A partir de un volumen de partida de 600 mL, quedan en la bolsa aproximadamente 95 g de muestra. El pellet de células se resuspende en el fluido restante. Usando una jeringuilla y una aguja estériles se inyecta el anticuerpo monoclonal conjugado (10 mL de reactivo magnético que contiene 200 :g de anticuerpo) a la bolsa a través de un adaptador. Se inyecta aire estéril (120 cc) a la bolsa para ayudar a una mezcla adecuada. Se sella y se sacude la bolsa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añade suero fisiológico normal + HSA al 0.5% (500 mL) a la bolsa de muestra, y se mezcla abundantemente. Se centrifuga la muestra a 500xg durante 10 minutos. Se elimina el sobrenadante (500 gramos) de la bolsa a través del adaptador. El pellet de células se resuspende en el fluido restante. Se repiten las etapas de lavado. A continuación se resuspende la población celular concentrada resultante y está lista para la separación de células.

Separación de células

El procedimiento de separación de células madre lleva aproximadamente treinta minutos usando un sistema automatizado como el representado en la Figura 3. El operador carga primero el dispositivo de separación (tuberías y conjunto de columnas) en el instrumento y conecta al dispositivo la bolsa que contiene el líquido de lavado o tampón y la bolsa que contiene las células tratadas con anticuerpo (aproximadamente cinco minutos). El sistema automatizado lava y ceba a continuación los circuitos del fluido (aproximadamente cinco minutos) e inicia el procedimiento de separación (aproximadamente veinte minutos) como se describió anteriormente. El resto del ciclo se realiza automáticamente sin la intervención del operador. El instrumento indicará que se ha completado el ciclo.

Las células etiquetadas magnéticamente (por ejemplo las células CD34-positivas) se retendrán dentro de la columna de separación mediante medios de fuerza magnética. A continuación se lava la columna y el eluyente se recoge en un contenedor de residuos. Durante la retirada del imán, la columna se vuelve a lavar y se recoge el complejo célula/anticuerpo seleccionado en un contenedor separado. Las células CD34-positivas purificadas (u otra población celular específica) están entonces dispuestas para su uso. Se puede usar una aguja de sellado para cerrar las tuberías entre el contenedor de recogida de células madre y el resto del dispositivo de separación mediante la creación de puntos de sellado por encima y por debajo de un cierre Luer conector. Se puede eliminar el contenedor de recogida de células madre.

Las células recogidas se pueden criopreservar o usar inmediatamente. Las células también se pueden someter a procesamiento adicional tal como expansión ex vivo para aumentar el número de células madre/progenitoras a trasplantar. En ausencia de un procedimiento de eliminación adicional, la suspensión celular contendrá una cantidad muy pequeña del reactivo anticuerpo que permanece fijado a las células (>99% del reactivo anticuerpo no está enlazado y se elimina mediante un lavado de células anterior a la separación de células).

Claims

1. Sistema de separación magnética para la separación de substancias biológicas objetivo magnéticas o etiquetadas magnéticamente de una muestra, que comprende:

(a) un dispositivo separador (25) que comprende:

(i): una columna de separación (102, 40) conectada mediante una primera vía de fluido a un contenedor de muestra (81), en el que dicha columna de separación comprende una carcasa no magnética (104) que tiene una toma de entrada (112) y una toma de salida (114), y define una cámara de separación que tiene una relación diámetro a longitud de al menos 0,2 a 1, estando dispuesta a través de la totalidad del ancho de dicha cámara una matriz permeable al fluido (106) de esferas ferromagnéticas;

(ii): un canal de distribución (88) conectado mediante una segunda vía de fluido (18) a dicha columna de separación, en el que dicho canal de distribución conduce a;

(iii): un contenedor de recogida de producto (83);

(iv): un contenedor de residuos de lavado (84), y

(v): un contenedor de muestra no etiquetada (85);

y

(b) un instrumento de separación, que comprende una carcasa que incluye:

(i): un soporte del contenedor de muestra;

(ii): una o más válvulas (1-11) para controlar el flujo de fluido a través de una o más de dichas vías de fluido;

(iii): un soporte de la columna de separación (42); y

(iv): medios de generación de campo magnético (50) situados sobre el instrumento de separación de manera que en uso la columna de separación (102, 40) se encuentra dentro de o adyacente a un campo magnético generado por dichos medios de generación de campo magnético,

en el que dicho dispositivo separador se puede instalar sobre dicho instrumento de separación para la realización de un procedimiento de separación, y en el que el dispositivo separador se puede mantener durante el procedimiento de separación como un sistema cerrado del que se excluye substancialmente el aire.

2. Sistema de separación según la reivindicación 1, en el que el instrumento de separación incluye también medios de bombeo (64) conectados al dispositivo de separación para bombear el fluido a través de dicha columna de separación.

3. Sistema de separación según la reivindicación 2, en el que el dispositivo de separación comprende también un bucle de recirculación (92) que conecta dicha primera vía de fluido y dicha segunda vía de fluido de manera que el fluido que ha pasado a través de dicha columna de separación se puede recircular a través de dicha columna de separación, y en el que los medios de bombeo están conectados al bucle de recirculación para bombear el fluido a través de dicha columna de separación y dicho bucle de recirculación.

4. Sistema de separación según las reivindicaciones 2 ó 3, que comprende también medios motores para mover dicho soporte de la columna de separación, moviendo de esta manera la columna de separación dentro o fuera del campo magnético.

5. Sistema de separación según la reivindicación 4, que comprende además:

(a) unos medios de microprocesador para controlar dichas válvulas, dichos medios de bombeo y dicho motor, dirigiendo de esta manera dicho instrumento para realizar las operaciones de separación apropiadas en una secuencia deseada; y

(b) una pantalla de video (62) para permitir que un operador controle el funcionamiento del sistema automático.

6. Sistema de separación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un detector de burbuja (65) para detectar la presencia de fluido en dicha primera vía.

7. Sistema de separación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una columna de prefiltración (30) en la primera vía de fluido entre dicho contenedor de muestra y dicha columna de separación.

8. Sistema de separación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas esferas están apiladas en una configuración de red formando de esta manera entre dichas esferas canales substancialmente uniformes de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 :m de diámetro.

9. Sistema de separación según la reivindicación 7, que comprende además:

un filtro (35) entre dicho contenedor de muestra y dicha columna de prefiltración, en el que dicho filtro elimina componentes indeseados de la muestra antes del paso de la muestra hacia dicha columna de prefiltración.

10. Sistema de separación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho sistema comprende además medios motores para mover dichos medios de generación de campo magnético con relación a dicho soporte de la columna de separación, por lo que el campo magnético se puede retirar de la columna de separación.

11. Sistema de separación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dichos medios de generación de campo magnético son un imán permanente.

12. Sistema de separación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha columna, dichas vías, dicho canal y dichos contenedores están conectados de manera separable.