ES2202427T3 - Aparato de separacion magnetica. - Google Patents
Aparato de separacion magnetica.Info
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Abstract
SE EXPONEN UN METODO Y UNA COLUMNA DE SEPARACION MAGNETICA (2). LA COLUMNA DE SEPARACION (2) INCLUYE UNA MATRIZ FLUIDA PERMEABLE (6) QUE FACILITA UNAS ACANALADURAS UNIFORMES QUE REDUCEN LA CAPTURA DE AIRE O SUSTANCIAS NO DESEADAS, Y REDUCE LA PERDIDA DE LAS SUSTANCIAS QUE SE BUSCAN, MOTIVADA POR UNA AVERIA MECANICA. UTILIZANDO EL METODO DE LA PRESENTE INVENCION, LAS CELULAS BIOLOGICAS BUSCADAS SE ETIQUETAN CONJUNTAMENTE CON UN ELEMENTO DE SUJECION ESPECIFICO ADECUADO Y SE AISLAN.
Description
Aparato de separación magnética.
El campo de esta invención es la aplicación de la
separación magnética de alto gradiente (HGMS) a la separación de
materiales biológicos.
La separación magnética es un procedimiento para
retener selectivamente materiales magnéticos en una cámara o columna
dispuesta en un campo magnético. Una sustancia objetivo, incluyendo
los materiales biológicos, se puede etiquetar magnéticamente
mediante su fijación a una partícula magnética mediante un asociado
de enlace específico que se conjuga a la partícula. A continuación
se aplica a la cámara una suspensión de la sustancia objetivo
etiquetada. La sustancia objetivo es retenida en la cámara en
presencia de un campo magnético. A continuación se puede eluir la
sustancia objetivo retenida cambiando la fuerza del campo magnético,
o eliminándolo.
En la cámara se puede colocar una matriz de
material de susceptibilidad magnética adecuada, de manera que cuando
se aplica un campo magnético a la cámara se induce localmente un
alto gradiente de campo magnético cerca de la superficie de la
matriz. Esto permite la retención de partículas débilmente
magnetizadas, y el planteamiento se denomina "separación magnética
de alto gradiente" (HGMS).
Los separadores magnéticos de alto gradiente
conocidos previamente o disponibles comercialmente contienen
generalmente una matriz de lana o alambre de acero. Estas matrices
provocan a menudo un enlace u oclusión no específico de sustancias
biológicas o componentes de la muestra diferentes a la sustancia
objetivo. Además, estas matrices pueden tener poros o vías no
uniformes a través de los cuales pasa la muestra, lo cual provoca
resultados de separación variables. Estas matrices no uniformes
también pueden producir gradientes magnéticos y modelos de flujo
inconsistentes que producen variabilidad en los resultados de la
separación.
El uso de la HGMS en separaciones biológicas
requiere que las condiciones suministren un elevado rendimiento con
una pureza substancial. En consecuencia, sería deseable proporcionar
dispositivos, procedimientos, y separadores magnéticos de alto
gradiente que sean relativamente fáciles de construir y usar,
proporcionando también gradientes de campo magnético y
características de flujo maximizados y uniformes durante el uso.
Sería más ventajoso si estos dispositivos, procedimientos y
separadores magnéticos se pudieran usar para realizar una variedad
de procedimientos de selección o ensayo de células con la selección
del elemento de enlace específico apropiado, mediante el cual la
sustancia objetivo se etiquetará magnéticamente.
Las técnicas de separación magnética se conocen
desde hace muchos años. Las técnicas se han usado para separar
partículas de metal férreo de un fluido, tal como aceite lubricante
o lodos acuosos de arcilla, como se describe en la patente
US-3.985.646 de Oder. En algunos casos, se usó la
separación magnética de alto gradiente, por ejemplo en las patentes
US-4.054.513 de Windle; US-5.137.629
de Dauchez; y US-4.526.681 de Friedlaender y otros.
En la separación magnética de alto gradiente, se somete a un campo
magnético una cámara de separación que contiene una matriz que se
puede magnetizar hecha de materiales como lana de acero, fibras
recubiertas de metal, y tachuelas, barras, placas, rellenos,
alambres o cojinetes de bolas de metal. Cuando se aplica el campo
magnético, cualquier partícula de metal en el fluido se ve atraída
por la matriz. Para retirar las partículas de metal de la matriz, se
apaga o se retira el campo magnético, y se lava la cámara.
Los desarrollos en los sistemas biológicos y de
diagnóstico han combinado las técnicas de separación magnética con
el uso de elementos de enlace, como anticuerpos, con afinidad
específica para un material de interés que se ha de separar o aislar
de una mezcla de materiales (patentes de Yapel,
US-4.169.804; Yen y otros,
US-4.219.411; Saur y otros,
US-4.710.472; Owen y otros,
US-4.795.698; Liberti y otros,
US-5.200.084). Molday, en la patente
US-4.452.773 describe la preparación de microesferas
de hierro y dextrano, y proporciona un resumen que describe los
diferentes medios de preparación de partículas adecuadas para la
fijación a materiales biológicos. Una descripción de los
recubrimientos poliméricos para partículas magnéticas usados en la
HGMS se encuentra en las patentes DE-3720844
(Miltenyi) y Miltenyi y otros, US-5.385.707. Los
procedimientos para preparar partículas superparamagnéticas se
describen en la patente US-4.770.183.
El uso de la HGMS con sistemas biológicos es de
interés en el desarrollo de diagnósticos. Además, la identificación
de anticuerpos específicos para muchos antígenos de superficie de
células ha conducido a un interés por el desarrollo de
procedimientos terapéuticos que implican la selección y el
transplante de células identificables.
Una descripción de un separador no magnético se
puede encontrar en la patente US-5.240.856 (Goffe y
otros).
La invención proporciona mejoras en aparatos,
procedimientos, y dispositivos magnéticos de alto gradiente para la
separación de materiales biológicos. Los dispositivos, aparatos y
procedimientos permiten una mayor especificidad y eficiencia en el
aislamiento de células, proteínas, polisacáridos, y otros materiales
biológicos particulares, u otros materiales que son magnéticos o son
capaces de una interacción de enlace específico con un elemento de
enlace etiquetado magnéticamente.
Se proporciona una columna de separación
magnética que tiene una carcasa no magnética que define una cámara
de separación, y una matriz de esferas metálicas permeable al fluido
en el interior de la cámara. Las esferas forman una red
estrechamente apilada, que crea canales substancialmente uniformes
para lograr un flujo homogéneo durante las separaciones. Un
dispositivo separador magnético puede usar la columna de separación
junto con un dispositivo de filtrado previo. El dispositivo se puede
usar en un instrumento que tiene un imán permanente o electroimán
para su uso durante las separaciones, con un brazo retráctil
opcional para mover el imán, medios de bombeo para limpiar y separar
el material objetivo, y un microprocesador para controlar el flujo
de fluido de separación.
La Figura 1 es un diagrama esquemático de una
columna de separación o de prefiltración de ejemplo de la presente
invención;
La Figura 2 representa columnas de separación y
de prefiltración, junto con los contenedores de muestra y recogida,
interconectados mediante una serie de vías de fluido o circuitos de
fluido. La figura también muestra la posición de las válvulas y una
bomba peristáltica que se usa en la realización preferida del
sistema de separación;
La Figura 3 representa una unidad controlada por
ordenador a la que se añaden columnas estériles, tuberías
desechables y contenedores de almacenamiento y recogida, como se
muestra en la Figura 2. En una realización preferida, la unidad
controlada por ordenador contiene un imán, válvulas y una bomba
peristáltica;
La Figura 4 representa el canal de flujo formado
entre tres esferas de conexión.
Se proporciona un sistema de separación magnética
para procedimientos de separación magnética. Las matrices mejoradas
de los separadores magnéticos proporcionan poros o canales uniformes
que reducen la oclusión de aire o sustancias no objetivo, disminuyen
la pérdida de sustancias objetivo debido a división mecánica, y
tienen características de flujo substancialmente homogéneas. La
retención del material etiquetado magnéticamente depende de la
interacción de las fuerzas de flujo y la atracción magnética, por lo
que un flujo más homogéneo mejora la eficacia de la separación.
Las sustancias biológicas, como las células
objetivo de varios sistemas y órganos, se etiquetan magnéticamente
con un elemento de enlace específico adecuado, y se aíslan usando el
sistema de la presente invención. El aislamiento de células
multipotenciales como células madre hematopoyéticas o progenitoras
es de particular interés. Aunque la separación de células
hematopoyéticas se usa aquí para proporcionar ejemplos de
procedimientos de separación de células, la presente invención se
puede aplicar a una amplia gama de tipos de células u otras
substancias biológicas.
El sistema de separación magnética de la presente
invención se puede usar para etiquetar y aislar magnéticamente
cualquier sustancia objetivo deseada. La separación de un componente
específico a partir de una mezcla compleja es de particular interés.
El sistema de separación de la presente invención tiene una gran
versatilidad, ya que se puede separar casi cualquier sustancia
objetivo una vez que se dispone de un elemento de enlace específico.
La sustancia objetivo o analito puede ser cualquier elemento de un
par de enlace específico, o una sustancia asociada con un elemento
de un par de enlace específico. Como ejemplo, se puede usar un par
de enlace antígeno-anticuerpo de superficie de
célula para aislar el propio antígeno, células que expresan el
antígeno, un organelo particular implicado en el procesamiento del
antígeno, etc. Los dispositivos y procedimientos descritos
posteriormente también se aplican ventajosamente a técnicas de
diagnóstico que implican el enlace de un receptor y un ligando, como
inmunoensayos y similares.
En la Figura 1 se representa un esquema de un
dispositivo separador magnético. El diagrama muestra la construcción
general del separador y el paso uniforme de fluido que resulta del
uso de una matriz de esferas metálicas. La figura 2 representa un
dispositivo de separación más complejo, que incluye las posiciones
generales de los conductos de fluido, los contenedores de recogida y
almacenamiento, y la columna de separación. Los circuitos de fluido
se pueden construir con válvulas integradas, o se pueden aplicar
externamente las válvulas a las vías del fluido.
Un tercer componente del sistema de separación de
células es un instrumento de separación de células. La Figura 3
representa un instrumento de separación de células, preferiblemente
controlado por ordenador, que puede incorporar las válvulas junto
con un imán, una bomba y un control de teclado. Un dispositivo
similar al de la Figura 2, construido sin válvulas, se puede montar
directamente sobre el instrumento de la Figura 3 para su uso en la
separación automatizada de células objetivo.
El reactivo de separación de células, que también
se puede denominar conjugado, reactivo de partículas
anticuerpo/magnéticas o etiqueta magnética, incluye un material
sensible magnéticamente enlazado a un elemento de enlace específico.
Hay muchos materiales sensibles magnéticamente bien conocidos usados
en procedimientos de separación magnética. La presente invención
implica el uso de partículas o micropartículas sensibles
magnéticamente. Partículas magnéticas adecuadas se describen en la
patente
US-4.452.773 de Molday y la Memoria de la Patente Europea EP-452342-B (publicada el 20 de Noviembre de 1994), que se incorporan aquí como referencia. También son adecuadas partículas de tamaño coloidal, como las descritas en las patentes US-4.795.698 de Owen y US-5.200.084 de Liberti y otros, incorporadas aquí como referencia.
US-4.452.773 de Molday y la Memoria de la Patente Europea EP-452342-B (publicada el 20 de Noviembre de 1994), que se incorporan aquí como referencia. También son adecuadas partículas de tamaño coloidal, como las descritas en las patentes US-4.795.698 de Owen y US-5.200.084 de Liberti y otros, incorporadas aquí como referencia.
El término "elemento de enlace específico"
tal como se usa aquí se refiere a un elemento de un par de enlace
específico, es decir, dos moléculas, normalmente dos moléculas
diferentes, en las que una de las moléculas se enlaza
específicamente a la otra molécula a través de medios químicos o
físicos. Los elementos complementarios de un par de enlace
específico se denominan a veces ligando y receptor. Además de pares
de enlace específico antígeno y anticuerpo,
péptido-MHC antígeno y pares receptores de células
T, pares de enlace específicos alternativos de interés incluyen
biotina y avidina o estreptoavidina; carbohidratos y lectinas;
secuencias de nucleótidos complementarios (incluyendo secuencias de
ácidos nucleicos usadas como sondas y agentes de captura en ensayos
de hibridación de ADN); ligandos péptido y receptor; moléculas
efector y receptor; hormonas y proteínas de enlace de hormonas;
cofactores de enzima y enzimas; inhibidores enzimáticos y enzimas;
marcadores de secreción, como se describe en la solicitud
internacional PCT/US93/10126; cuerpos monoclonales autólogos, y
similares. Los pares de enlace específicos pueden incluir análogos,
derivativos y fragmentos del elemento de enlace específico original.
Por ejemplo, un anticuerpo dirigido a un antígeno de proteína
también puede reconocer fragmentos de péptidos, peptidomiméticos
sintetizados químicamente, proteínas etiquetadas, proteínas
derivatizadas, etc., con tal de que esté presente un epitopo.
Los pares de enlace específicos inmunológicos
incluyen antígenos y anticuerpos específicos de antígeno o
receptores de antígeno de células T. Antígenos adecuados pueden ser
haptenos, proteínas, péptidos, carbohidratos, etc. Se pueden usar
procedimientos de ADN recombinante o de síntesis de péptidos para
producir análogos quiméricos, truncados o de cadena única de cada
elemento del par de enlace, en los que las proteínas quiméricas
pueden proporcionar mezcla(s) o fragmento(s) del
mismo, o una mezcla de un anticuerpo y otros elementos de enlace
específicos. Los receptores de anticuerpos y de células T pueden ser
monoclonales o policlonales, y se pueden producir a partir de
animales transgénicos, animales inmunizados, células B humanas o
animales inmortalizadas, células transfectadas con vectores de ADN
que codifican el anticuerpo o receptor de células T, etc. Los
expertos en la materia conocen bien los detalles de la preparación
de anticuerpos y su adecuación para el uso como elementos de enlace
específicos.
Para abreviar, el sistema de separación se
describirá principalmente en términos de su capacidad para
seleccionar y separar específicamente una población de células
definida (células objetivo) de una población celular mezclada, como
sangre periférica, médula ósea, sangre del cordón umbilical o la
placenta, sangre fetal o un producto de leucoforesis. Se entenderá
asimismo que algunos tejidos se pueden dividir en una única célula o
una suspensión monodispersa para permitir el aislamiento de un
subconjunto de células particular, como la separación de linfocitos
de infiltración de tumor de una masa tumoral, la separación de
células de islote pancreático de tejido renal, etc. Por ejemplo, se
pueden etiquetar distintos tipos de células con un anticuerpo
específico para permitir el purgado de células y/o el
enriquecimiento de células. La población celular objetivo se
identifica generalmente mediante un elemento de enlace específico,
como el descrito anteriormente, que se enlaza selectivamente a un
antígeno de superficie celular presente sobre las células objetivo.
Sin embargo, se debería entender que dichos aparato y procedimiento
no están limitados a dichos usos.
Para simplificar, el elemento de enlace
específico se ejemplificará aquí mediante un anticuerpo. El
anticuerpo puede estar directa o indirectamente enlazado a una
partícula magnética. Si el anticuerpo está directamente enlazado a
la partícula magnética, entonces la población celular objetivo está
etiquetada magnéticamente cuando el anticuerpo se enlaza al antígeno
de superficie celular. Si el anticuerpo está indirectamente unido a
la partícula magnética, entonces la población celular objetivo es
susceptible de etiquetado magnético cuando el anticuerpo se enlaza a
las células objetivo. La población de células
anticuerpo-enlazado se etiqueta de hecho mediante
contacto adicional de las células con un elemento de enlace
específico para el anticuerpo, en el que este elemento de enlace
específico se enlaza él mismo a una partícula magnética. Las células
objetivo, identificadas mediante dicho etiquetado magnético, se
separan a continuación de las otras células mediante un campo
magnético. Por ejemplo, un elemento de enlace específico como la
avidina se puede conjugar a una partícula magnética en la que la
avidina se enlaza a un anticuerpo biotinilado que a su vez se enlaza
específicamente a las células objetivo.
El elemento de enlace específico puede estar
directamente fijado a la partícula magnética. Esto se puede llevar a
cabo mediante grupos reactivos del elemento de enlace específico y
las propias partículas magnéticas. Por otra parte, el elemento de
enlace específico y la partícula magnética pueden estar unidos
mediante un agente de enlace o enlazador. Los términos "agente de
enlace" o "enlazador" usados aquí incluyen varios agentes
de enlace o entrecruzamiento bifuncionales, es decir, moléculas que
contienen dos grupos o "extremos" reactivos, que pueden estar
separados mediante un espaciador.
Las matrices de separación magnética de alto
gradiente convencionales se preparan típicamente a partir de
materiales como alambres, fibra recubierta de metal, o lana de
acero. En el dispositivo de separación magnética de la presente
invención, la matriz de intensificación de gradiente del separador
magnético de alto gradiente se forma a partir de pequeñas esferas de
un material susceptible magnéticamente o ferromagnético. Dichos
materiales incluyen, pero no están limitados a, hierro, acero,
cobalto, níquel, y otros metales de tierras raras o aleaciones de
los mismos. Por ejemplo, el material de la matriz puede incluir
esferas de material ferromagnético como esferas de hierro (es decir,
bolas MARABU, Kugelfabrik Schulte & Co., Wermelskirchen,
Alemania). Se conocen muchos procedimientos diferentes de
fabricación de esferas. Normalmente las esferas tienen un diámetro
medio en el intervalo entre aproximadamente 0,2 y 1,5 mm para la
separación de células grandes o complejos celulares, y
aproximadamente entre 0,05 y 0,2 mm de diámetro para el material
subcelular. Preferiblemente, las esferas tienen un diámetro medio en
el intervalo entre aproximadamente 0,2 y 0,5 mm, y más
preferiblemente, las esferas se seleccionan con un diámetro medio en
el intervalo entre aproximadamente 0,2 y 0,3 mm. Es deseable que el
tamaño de las esferas sea relativamente homogéneo, variando
normalmente no más de un 15% del tamaño medio, más normalmente no
más de aproximadamente el 10%, y preferiblemente no más de
aproximadamente el 5%.
Para la construcción de una matriz de un
separador magnético es deseable la forma esférica substancialmente
simétrica y el tamaño substancialmente uniforme de las esferas, ya
que las esferas pueden asumir una configuración de red en la que los
huecos entre las esferas forman canales o poros regulares en la
matriz. La configuración de red es un entramado estructurado de
esferas que forma canales de tamaño regular entre esferas adyacentes
y por toda la matriz. Durante la aplicación de un campo magnético al
separador, se crean gradientes de campo magnético en los huecos
entre las esferas. El tamaño uniforme, y por lo tanto el espaciado,
de las esferas proporciona un gradiente magnético substancialmente
uniforme a través de la matriz, y unas características de flujo de
fluido substancialmente uniformes. En la Figura 4 se representa un
canal de flujo. Las dimensiones del canal se pueden describir
mediante el tamaño máximo de bola o partícula que encajaría entre
las esferas de la matriz. Con referencia a la Figura 4, la relación
geométrica es r=\approx0,155R. Se entenderá a partir de las
enseñanzas de la presente invención que el tamaño del canal se puede
ajustar a un diámetro medio óptimo para el proceso de separación
deseado mediante la variación del tamaño de las esferas que se usan
para formar la matriz.
La forma esférica produce la formación de una
estructura de matriz substancialmente estable cuando se empaquetan
las esferas dentro de una carcasa que define una cámara de
separación. Como se describe en detalle a continuación, la matriz se
cubre también con un material impermeable substancialmente fluido
como un polímero plástico. Al aplicar el recubrimiento de polímero
plástico, se cierran los apretados huecos entre las esferas, lo que
resulta en una matriz optimizada hidrodinámicamente. La matriz
ferromagnética resultante ocupará normalmente aproximadamente entre
el 60 y el 75% del volumen total de la cámara de separación, y será
permeable a los fluidos. El recubrimiento impermeable cubrirá
aproximadamente entre el 1 y el 5% del volumen total. El volumen
libre estará en el intervalo entre aproximadamente el 20 y el 40%
del volumen total de la cámara de separación. En una realización
preferente, la matriz total ocupará aproximadamente entre el
75-80% del volumen total de la cámara de
separación
La Figura 1 representa un esquema de una columna
de separación a modo de ejemplo. No se representan las esferas a
escala, con el fin de representar mejor la formación de una matriz
permeable al fluido tridimensional 106. Las esferas están
empaquetadas en una carcasa 104 hecha de un material no magnético.
La carcasa del separador magnético sirve como cuerpo de la columna
de separación, y el interior de la carcasa define una cámara de
separación. Carcasas de varias longitudes, formas y diámetros están
hechas ventajosamente de plástico. Los materiales no magnéticos
apropiados para la construcción de una carcasa del separador
magnético incluyen acero inoxidable, vidrio, plástico, etc.
En una realización preferida, la carcasa del
separador magnético es un plástico al que se adhiere el
recubrimiento de la matriz, permitiendo propiedades hidrodinámicas
mejoradas en el límite entre la matriz y la carcasa. Se entenderá
que el material de recubrimiento y el material de la carcasa se
seleccionarán para su mutua compatibilidad, por ejemplo, se debe
seleccionar un recubrimiento de laca que no produzca acumulación de
restos plásticos no-adherentes en la columna. Se
conocen varios mecanismos mediante los cuales los materiales se
adhieren entre sí, y se pueden emplear para este propósito.
Convenientemente, la selección de compatibilidad se hará en función
del disolvente empleado junto con la laca. El disolvente será
ligeramente reactivo con la carcasa de plástico, de manera que se
adhiera la laca en el disolvente, pero no tan reactivo como para que
se comprometa la integridad estructural de la columna durante el
procedimiento de curado con laca. Por ejemplo, el material de
recubrimiento se pude seleccionar para incluir un disolvente que
provoque una ligera disolución del interior de la carcasa de
plástico. Durante el curado, el plástico se endurece ligando o
sellando de esta manera el material de recubrimiento y el material
de la carcasa entre sí. Un experto en la materia entenderá que la
información respecto a dicha reactividad está generalmente
disponible. Un ejemplo de una combinación apropiada de disolvente y
carcasa es metiletilcetona y el plástico ULTEM® (General
Electric).
Preferiblemente, cada uno de los materiales
seleccionados para la construcción de la columna de separación 102
será también compatible con los procedimientos de esterilización.
Preferiblemente, la carcasa tiene forma cilíndrica para facilitar el
flujo de muestra a través de la cámara de separación, así como la
formación de una matriz tridimensional 106 dentro de la carcasa. Las
paredes de la carcasa tienen preferiblemente un espesor de
aproximadamente 1 a 3 mm. La columna de separación tiene tomas de
entrada 112 y salida 114 para la introducción y la descarga de
fluidos. Generalmente, las tomas de entrada y salida son estructuras
estrechas con relación al cuerpo principal de la carcasa. Esto
facilita la fijación del separador a un circuito de fluido adicional
en un sistema de separación, y mantiene ventajosamente el
dispositivo como un sistema cerrado. Las tomas de entrada y salida
se pueden situar en sitios diferentes a los mostrados en la Figura
1, pero se entenderá que toda la estructura del separador
proporcionará preferentemente una cámara de separación que tenga la
mínima cantidad de curvas o esquinas que de otra manera podrían
ralentizar el flujo de fluido o crear espacios en los que se
acumulase la muestra.
A la entrada y salida de la columna, la columna
se construye con un mecanismo de alimentación que asegure la
distribución homogénea y el flujo óptimos a través de la matriz. El
mecanismo de distribución está compuesto por el volumen frente a la
capa de cubierta 108 y la propia capa de cubierta, lo que sirve como
resistor de flujo. El volumen de distribución (en mililitros) se
puede definir con relación al ancho de la columna (en milímetros),
teniendo normalmente una relación de aproximadamente 0.1 a 10. El
volumen de la cámara frente a la capa base 110, así como la propia
capa base, sirve asimismo como mecanismo de alimentación para los
fluidos que atraviesan la cámara vía la toma de salida.
Las columnas tienen dimensiones en las que la
relación diámetro a longitud es al menos de entre 0,2 y 1. Las
dimensiones reales de la columna dependerán del material a separar,
y de la velocidad de flujo deseada para la separación. Las
dimensiones de la columna proporcionarán una cámara que aceptará una
matriz con un área superficial adecuada para crear gradientes de
campo magnético suficientes en la cámara de separación y para
permitir la retención eficaz del material etiquetado magnéticamente.
El volumen necesario para una determinada separación se puede
determinar empíricamente, y puede variar con el tamaño, la densidad
de antígeno en la superficie celular, la afinidad del anticuerpo,
etc. Como ejemplo, un área transversal de 3 cm^{2} permite una
velocidad de flujo de 5 a 40 mL/minuto. La capacidad de enlace de
una matriz de 2 x 4 cm es aproximadamente de 109 células
etiquetadas.
Para facilitar la fabricación de la columna de
separación, la capa base 110 de material poroso no magnético se
sitúa en la carcasa de manera que cuando se colocan las esferas
ferromagnéticas en la cámara no pasan a través de la toma de salida
114. Los materiales porosos apropiados para la formación de la capa
base incluyen, pero no están limitados a, plástico poroso, metales o
vidrio sinterizado, rejillas, etc. Por ejemplo, se pueden usar
varias fritas porosas disponibles en Porex Singwitz, Alemania.
Normalmente, el material poroso tendrá un tamaño de poro de entre
aproximadamente 20 y 200 :m, preferiblemente entre 50 y 150 :m. Se
seleccionará un tamaño de poro apropiado en función de las
dimensiones de la sustancia objetivo y de la preparación del
material de la muestra. Además, el tamaño de poro no será demasiado
elevado como para permitir que las esferas rellenen las aberturas
porosas del material de la capa. A continuación de la inserción de
las esferas en la cámara, se puede agitar o hacer vibrar la carcasa
para facilitar la acomodación de las esferas en una configuración
más uniforme. Opcionalmente, la capa de cubierta 108 de material
poroso no magnético se coloca en la carcasa sobre la matriz para
mantener la configuración uniforme de la matriz durante el
almacenamiento, el manejo y el uso. También se puede aplicar presión
a la capa de cubierta 108 para empacar más firmemente las esferas
dentro de la cámara. La porción superior 116 de la columna de
separación, que incluye la toma de entrada 112 en esta realización,
se coloca a continuación sobre la parte superior de la carcasa 104 y
se fija a la carcasa. Por ejemplo, cuando se usan materiales
plásticos, la porción superior 116 se puede pegar o soldar mediante
ultrasonidos a la carcasa 104 para completar la formación de la
columna de separación. A continuación de la terminación de la
carcasa, se recubre la matriz.
Con relación a la Figura 1, se aplica un
recubrimiento a la matriz permeable al fluido descrita
anteriormente. El recubrimiento se selecciona substancialmente
impermeable a los iones y por lo tanto, protege el material de la
matriz metálica frente a la corrosión así como inhibe la fuga de
cationes de la matriz, que podría dañar las células. Además de la
formación de una capa impermeable protectora sobre el material de la
matriz, un recubrimiento completo de la matriz cierra los huecos
entre esferas, proporcionando tanto estabilidad mecánica a la matriz
como una matriz hidrodinámicamente optimizada. Dicha estabilidad
mecánica es particularmente ventajosa cuando la matriz se forma a
partir de pequeñas esferas de un metal susceptible o sensible
magnéticamente, como se describió anteriormente. Un material de
recubrimiento, como un recubrimiento de laca, se puede hacer fluir a
través de la toma de entrada 112 de la columna de separación. La
laca fluye a través de la capa de cubierta 108, la matriz 106 y la
capa base 110, recubriendo de esta manera las superficies porosas de
cada componente. El exceso de laca se hace salir de la cámara a
través de la toma de salida 114. La columna de separación recubierta
se puede centrifugar para eliminar el exceso de material de
recubrimiento de la cámara. A continuación se permite que el
recubrimiento seque. La columna de separación se puede calentar para
promover el secado del recubrimiento. Por ejemplo, la columna de
separación recubierta se puede introducir en un horno a 110ºC
durante entre cuatro y cinco horas, y a continuación se seca de
manera continuada a temperatura ambiente entre tres y siete
días.
Durante el secado, el recubrimiento endurece,
proporcionando de esta manera soporte mecánico a la matriz. Este
soporte mecánico no sólo ayuda a mantener la integridad de la matriz
durante el almacenamiento y el manejo de la columna de separación,
sino que además proporciona una estructura rígida a la matriz que no
exhibe elasticidad significante. Esta rigidez es ventajosa porque la
matriz podría de otra manera deformarse bajo la aplicación de un
campo magnético externo a la columna de separación. La fuerza del
campo magnético aplicado por los medios magnéticos externos se
encuentra típicamente en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 1,5 Tesla, y más preferiblemente entre
aproximadamente 0,2 y aproximadamente 0,8 Tesla. La fuerza del campo
debería ser suficientemente elevada y la distancia entre el imán y
la columna de separación suficientemente pequeña como para inducir
gradientes de campo magnético intensificados dentro de la matriz.
Para mantener gradientes magnéticos uniformes en el separador, el
material de la matriz no debería moverse o desplazarse en la cámara
durante la aplicación del campo magnético. Los componentes metálicos
esféricos, la carcasa y el recubrimiento, se combinan ventajosamente
en la presente invención para proporcionar una matriz mejorada con
la suficiente rigidez para resistir una deformación substancial
cuando la columna de separación se introduce dentro de un campo
magnético.
Es preferible recubrir la matriz mientras los
componentes metálicos esféricos estén dentro de la carcasa de la
columna de separación. El recubrimiento de la matriz dentro de la
carcasa elimina la división de la matriz después de que se haya
aplicado el recubrimiento. Además, el recubrimiento de la matriz
dentro de la carcasa sirve para rellenar o sellar pequeños espacios
vacíos, intersticios o grietas formados cerca de los puntos de
contacto entre las esferas, así como entre las esferas y la carcasa,
proporcionando simultáneamente una superficie uniforme a los canales
o poros formados mediante los puntos separados de las esferas. Estos
canales o poros producen la permeabilidad de la matriz. Mediante el
sellado de los espacios vacíos, existe una disminución en las áreas
en las que las células u otros componente sólidos de la muestra se
pueden atascar o atrapar físicamente, incluso en ausencia de un
campo magnético.
En la columna de separación terminada, la
selección de la matriz y los materiales de recubrimiento producirá
preferentemente canales o vías a través de la matriz permeable con
un diámetro medio comprendido en el intervalo entre 20 y 60 :m y
ocupando un volumen de entre aproximadamente el 60% y el 80% del
volumen total de la cámara de separación. Por ejemplo, una columna
de separación para la separación de células sanguíneas puede tener
un tamaño final de canal recubierto en torno a los 20 :m, con la
matriz ocupando aproximadamente el 80% del volumen total de la
cámara.
A continuación de la preparación del
recubrimiento substancialmente impermeable, la matriz y otras
superficies internas de la cámara de separación se tratan
adicionalmente mediante la adición de un material hidrofílico como
la polividona (BASF, Ludwigshafen, Alemania). Otros materiales de
recubrimiento hidrofílico apropiados son, pero no están limitados a,
polivinilpirrolidina, polietilenglicol, almidón hidroxietil, y otros
recubrimientos hidrofílicos, como acrilamidas, surfactantes o
agentes de mojado tipo detergente, e incluyendo material biológico,
pero no limitados a, heparina y seroalbúmina humana. La superficie
interior de la cámara de separación se puede hacer también
hidrofílica mediante ataque de plasma o de corona de la superficie.
El recubrimiento hidrofílico proporciona al interior de la columna
de separación y a la matriz permeable al fluido una superficie puede
mojar fácilmente. Al aumentar la capacidad para mojar estas
superficies, la introducción del fluido dentro de la columna de
separación producirá un frente de fluido uniforme a medida que pasa
a través de la cámara. Esto facilita a su vez la eliminación de
burbujas de aire de la matriz permeable y otros espacios vacíos en
la cámara de separación. Es deseable mantener la columna de
separación y otros componentes del dispositivo como un sistema
cerrado substancialmente libre de aire durante el proceso de
separación. La presencia de aire en el sistema durante la separación
de células objetivo afecta a las tensiones superficiales internas y
las áreas no ventiladas, lo que puede conducir a la destrucción de
células.
Con relación a la Figura 2, que representa un
dispositivo de separación, un dispositivo de prefiltración puede
preceder a la columna de separación 40. La figura representa el
dispositivo de prefiltración como una columna 30, sin embargo se
entenderá que pueden encontrar uso otras configuraciones, como un
prefiltro. La columna de prefiltración es generalmente una
estructura tridimensional que puede ser substancialmente idéntica a
la columna de separación en términos de su composición estructural.
Sin embargo, la columna de prefiltración puede tener dimensiones
diferentes, la matriz puede estar hecha de esferas con una
composición diferente, por ejemplo un material no ferromagnético, o
la matriz puede estar hecha de esferas con un diámetro diferente a
las usadas en la columna de separación, proporcionando de esta
manera un tamaño de poro o de canal diferente al encontrado en la
columna de separación. En una realización, la columna de
prefiltración es idéntica a la columna de separación. El paso de la
muestra a través de la columna de prefiltración sirve para atrapar y
eliminar componentes del fluido que no son deseables en el producto
de separación final. Por ejemplo, en las separaciones de células
sanguíneas, las células "pegajosas" como monocitos,
granulocitos y plaquetas se pueden eliminar de la suspensión celular
mediante la columna de prefiltración. Por otra parte, la columna de
prefiltración se puede construir con un tamaño de poro medio
inferior al de la columna de separación. Por ejemplo, el tamaño de
poro de la matriz permeable se puede seleccionar para eliminar
células tumorales grandes de la muestra antes del paso del fluido a
través de la columna de separación. El paso de la muestra de fluido
a través de la columna de prefiltración puede servir también para
apartar agregados, como agregados celulares, que pueden existir en
el fluido. Además, puesto que la columna de prefiltración contiene
materiales substancialmente idénticos a los de la columna de
separación, aquellos componentes de la muestra que se pueden enlazar
de manera no específica a la columna de separación son retenidos
ventajosamente en la columna de prefiltración. De esa manera, la
columna de prefiltración reduce la posibilidad de ensuciamiento de
la columna de separación durante el procedimiento de separación, y
reduce la recogida de células o componentes del fluido no deseados
en el producto de separación final.
Con relación a la Figura 2, se representa una
realización preferida del dispositivo de separación 25. El
contenedor de muestra 81 está conectado a un filtro de suspensión
opcional 35. El filtro de suspensión se puede usar para eliminar
componentes en partículas no deseados de la muestra de fluido y se
selecciona con un tamaño de poro suficiente para eliminar las
partículas por encima de un cierto tamaño. Por ejemplo, el filtro de
suspensión puede ser un Filtro Pall (Pall SQ40S; Pall Biomedical,
Inc., Puerto Rico), con un tamaño de poro seleccionado para eliminar
partículas de tamaño superior a 40 :m, como coágulos y agregados
celulares en muestras celulares hematopoyéticas. El filtro de
suspensión se conecta mediante la vía de fluido dos 12 a la toma de
entrada 32 de la columna de prefiltración 30.
La toma de salida 34 de la columna de
prefiltración 30 se conecta mediante la vía de fluido cinco 15 a la
toma de entrada 42 de la columna de separación 40 a la que se
aplicará el campo magnético en el transcurso del procedimiento de
separación. La toma de salida 44 de la columna de separación se
conecta mediante la vía de fluido ocho 18 al canal de distribución
88, que conduce al contenedor de recogida de producto 83, al
contenedor de residuos de lavado finales 84 y al contenedor de
muestra no etiquetada 85. Las vías de fluido separadas nueve 19,
diez 20, y once 21 conducen a esos contenedores,
respectivamente.
Este dispositivo de separación incluye además un
contenedor de lavado o tampón 80 y un contenedor de residuos de
lavado iniciales 82, conectados mediante las vías de fluido uno 16 y
tres 17, respectivamente, a la vía de fluido dos 12. El contenedor
de tampón 80 está asimismo conectado mediante la línea de lavado o
tampón 90 (vía de fluido seis) al canal de distribución 88. La línea
de tampón está además conectada a la vía de fluido cinco 15 mediante
la vía de fluido cuatro 14. Las vías de fluido, contenedores,
filtros y columnas pueden estar acopladas entre sí mediante
cualquier medio apropiado como agujas estándar, cierres Luer,
conectores macho-hembra, conectores T, conectores Y,
y conectores de 4 vías u otros acoplamientos usados habitualmente en
conjuntos de reparto de soluciones intravenosas.
El flujo de fluido a través del circuito de
fluido del dispositivo de separación se puede controlar mediante
válvulas colocadas dentro de las vías de fluido. Las vías de fluido
uno a once se asocian con válvulas correspondientes uno a once
(1-11). Las válvulas pueden estar dentro de las
propias vías o pueden ser externas a las vías. El flujo de fluido
puede estar también controlado mediante una bomba. Por ejemplo,
cuando las vías de fluido están hechas de un material flexible, como
tubería flexible, válvulas apropiadas para el control del transporte
del fluido incluyen válvulas de pinza. Las válvulas de pinza cierran
las vías de fluido al apretar las paredes de la tubería entre sí.
Los expertos en la materia entenderán que dichas válvulas de pinza
se seleccionarán para adaptarse al tamaño de la tubería elegida para
usar como vía de fluido. Además, la fuerza de compresión de la
válvula de pinza se seleccionará para lograr la compresión de la
tubería elegida y efectuar de esta manera el cierre de la vía de
fluido. Por lo tanto, las especificaciones de las válvulas se unirán
a las especificaciones de blandura o dureza (durómetro) de la
tubería seleccionada.
La realización más preferida del dispositivo de
separación incluye también un bucle de recirculación 92 (vía de
fluido siete) de manera que el fluido que ya ha pasado a través de
la columna de separación 40 se puede recircular a través de la
columna de separación. Típicamente, una bomba 64 se conectará al
bucle de recirculación para facilitar la recirculación del fluido a
través de la columna de separación, así como para controlar el flujo
a través de la columna. Los expertos en la materia entenderán que se
puede usar una variedad de bombas. Una bomba de ejemplo es una bomba
peristáltica que puede controlar el paso del fluido a través del
bucle de recirculación en cualquier dirección y a velocidades
variables. El dispositivo de separación que tiene un bucle de
recirculación permite separaciones secuenciales en una columna,
mediante un procedimiento de enlace y elución, seguido de un segundo
enlace y elución. Las separaciones secuenciales proporcionan pureza
mejorada en la población objetivo final.
La Figura 2 representa esquemáticamente una
realización preferente de un dispositivo de separación. Sin embargo,
se entenderá que un procedimiento de separación se puede realizar
usando los componentes básicos del sistema, es decir, el separador
magnético y los contenedores de recogida.
Los expertos en la materia entenderán que los
medios de recirculación y las vías de flujo de fluido de la presente
invención son también apropiados para su uso en sistemas de
separación alternos. Por ejemplo, los medios de recirculación se
pueden usar ventajosamente en un sistema en el que los medios de
separación involucren técnicas de centrifugación, columnas de
absorción o medios químicos como alternativas a los medios de
separación magnética o electromagnética.
En un procedimiento de separación de células de
ejemplo, las vías de fluido y las columnas se ceban al permitir que
un líquido de lavado fluya a través de todas las vías de fluido y
columnas, preferiblemente a velocidades de flujo y presiones
variables. El líquido de lavado puede contener materiales como una
proteína fisiológicamente aceptable, como seroalbúmina humana (HSA),
que inhibe la adhesión de las células al interior de las superficies
de los componentes de plástico del dispositivo. El líquido de lavado
puede contener también pequeñas cantidades de detergentes o
surfactantes aceptables fisiológicamente, para mejorar el mojado de
las superficies interiores.
Se encuentra que las burbujas de aire grandes en
las vías de fluido son perjudiciales para la recuperación de células
viables. Los procedimientos de eliminación de burbujas de aire de
vías de fluido son conocidos en la materia, y se pueden emplear para
este propósito. Un procedimiento de interés particular explota la
observación de que una frita permeable como la usada en la capa de
cubierta y/o en la capa base no permitirá el paso de burbujas de
aire a velocidades de flujo de fluido inferiores a aproximadamente
400 mL/minuto. Una columna se puede limpiar de burbujas de aire
circulando líquido de lavado a través de un bucle de recirculación a
velocidades de flujo inferiores a aproximadamente 400mL/minuto. Las
burbujas de aire se acumulan entonces fuera de la columna en las
capas base y/o de cubierta. A continuación se invierte la dirección
de flujo, y las burbujas se eliminan del sistema en una bolsa de
residuos apropiada. Preferiblemente se repite la secuencia para
asegurar la eliminación de todas las burbujas. Las burbujas
existentes se pueden agrandar intencionadamente mediante la
generación de presión negativa.
En dicho procedimiento de ejemplo, se pueden usar
anticuerpos conjugados magnéticamente para dar en el blanco
específicamente en las células deseadas en una población celular
mezclada. El reactivo magnético se incuba con la población celular
mezclada, y a continuación las partículas no enlazadas se eliminan
mediante cualquier medio conveniente, por ejemplo, centrifugación,
etc. Cuando se desea esterilidad celular, las incubaciones de
anticuerpos y los lavados se pueden realizar en un procedimiento de
contenedor cerrado, en el que los anticuerpos y los líquidos de
lavado se añaden a un contenedor estéril mediante una aguja estéril
o un dispositivo similar. De esta manera, se minimiza la
contaminación de las células deseadas mediante los microorganismos
de la atmósfera. En dicho sistema cerrado, particularmente cuando el
contenedor es una bolsa flexible, la mezcla de las células y el
anticuerpo se puede mejorar inyectando en el contenedor una pequeña
cantidad de aire estéril, con una relación de aproximadamente entre
0,5 y 2 de aire a líquido.
La suspensión celular incubada, que contiene
ahora células objetivo etiquetadas magnéticamente, se pasa a través
del dispositivo de separación. El sistema transporta las células a
través de un separador magnético que se posiciona dentro de o es
adyacente a un campo magnético. La fuente del campo magnético puede
ser un imán permanente o un electroimán. La columna de separación se
construye para incluir una matriz ferromagnética de esferas
ferromagnéticas apiladas, como la descrita anteriormente.
Opcionalmente, se pasa la muestra a través de una columna de
prefiltración, construida también como se indicó anteriormente,
antes del paso a través de la columna de separación. Si la columna
de separación contiene una matriz compuesta de un material distinto
a esferas ferromagnéticas, entonces la muestra se puede pasar
primero a través de una columna de prefiltración que es
substancialmente idéntica a la columna de separación.
Las células etiquetadas magnéticamente se
acumulan en la columna de separación en respuesta al campo
magnético. Las células no etiquetadas y otros componentes de la
suspensión pasan a través de la columna de separación hacia un
contenedor de muestra no etiquetada y/o un contenedor de residuos. A
continuación las células etiquetadas o purificadas se pueden eluir
de la columna de separación mediante tanto la retirada de la columna
de separación del campo magnético como la eliminación del campo
magnético de la columna de separación. Se pasa una disolución de
lavado, tal como un líquido tampón, a través de la columna de
separación con el fin de eliminar las células de la columna de
separación hacia un contenedor de recogida de producto. El
contenedor de recogida se puede usar para el procesamiento adicional
de las células objetivo o la criopreservación de las células
objetivo.
En las realizaciones preferidas, la columna de
separación es una columna de separación magnética de alto gradiente
construida con esferas ferromagnéticas, como se describió
anteriormente. Los contenedores mencionados aquí son típicamente
bolsas de plástico, como las usadas para el almacenamiento y el
reparto de fluidos intravenosos, pero se puede usar cualquier
contenedor apropiado. Los contenedores se seleccionarán en función
del volumen de recogida o almacenamiento necesario, su capacidad
para la esterilización, y su capacidad para ser usados en un sistema
cerrado, es decir, un sistema de separación en el que
substancialmente todo el aire se pueda eliminar antes del uso.
En otra realización preferente, las células
etiquetadas magnéticamente se recirculan a través de la columna de
separación para incrementar la selección de las células objetivo y
la eliminación de células no deseadas u otros componentes de la
suspensión. Algunas realizaciones preferentes incluyen también el
uso de una columna de prefiltración. Sin embargo, la columna de
prefiltración no está sometida a un campo magnético. En cambio, el
paso preliminar de la suspensión celular a través de la columna de
prefiltración produce la captura de los componentes o materiales de
la suspensión que de otra manera se podrían enlazar de manera no
específica a la columna de separación. Dicho enlace no específico
puede causar el bloqueo o el ensuciamiento de la columna de
separación, lo que a su vez podría inhibir o reducir la separación y
la recogida de la población celular etiquetada.
Las vías de fluido, los contenedores de recogida,
el filtro de suspensión, la columna de prefiltración y la columna de
separación, se pueden construir, interconectar y suministrar como un
dispositivo de separación desechable. Las células objetivo se
recogen preferiblemente en un contenedor de transferencia de sangre
estéril a partir del cual se pueden transplantar las células al
paciente, o en el que se pueden almacenar las células o ser
sometidas a procesamiento adicional. El dispositivo de separación
celular completo se puede empaquetar previamente en contenedores
apropiados. El dispositivo de empaquetado previo se puede
esterilizar y proporcionar dispuesto para el uso en el procedimiento
de separación magnética. Los reactivos necesarios para el
procedimiento de separación deseado se pueden también proporcionar
en forma de equipo. Por ejemplo, se puede proporcionar un conjugado
específico para la población celular objetivo u otro analito de
manera separada o junto con el dispositivo. El equipo puede incluir
también disoluciones de lavado, por ejemplo disolución salina
estéril estándar y/o otros líquidos tampón, como disolución salina
fosfato tamponada, EDTA 1 mM y seroalbúmina humana al 0,5%. Estos
reactivos u otras disoluciones se pueden proporcionar en
contenedores tales como bolsas de plástico que se pueden conectar a
los pasos de fluido apropiados del dispositivo de separación
celular.
El sistema de separación de la presente invención
puede estar totalmente automatizado. En el sistema automatizado, un
ordenador controla el flujo de los fluidos a través de los circuitos
de fluido y la columna de separación, controla la fuerza del campo
magnético o la posición del imán y/o la columna de separación para
proporcionar la retención y la liberación de las células o analito
objetivo etiquetados magnéticamente, y dirige los productos de
recogida finales hacia los contenedores apropiados.
Una realización de un instrumento de separación
celular automatizado, como se representa en la Figura 3, incluye
componentes mecánicos, electromecánicos y magnéticos. Los
componentes mecánicos pueden incluir: una cubierta externa del
instrumento o carcasa 15; un soporte ajustable del contenedor 21;
una bomba peristáltica 64; un soporte de la columna de prefiltración
32, y un soporte de la columna de separación 42. Los componentes
electromecánicos pueden incluir: válvulas de pinza de solenoide
1-11; un motor interno (no mostrado) para mover la
bomba peristáltica 64; un motor interno (no mostrado) para mover el
soporte de la columna de separación 42 (y de esta manera mover la
columna de separación 40) dentro o fuera del campo magnético, o para
mover el imán 50; y un detector de burbuja (sensor ultrasónico) 65,
que se usa para detectar la presencia de fluido en el circuito de
fluido. Los medios magnéticos pueden incluir imanes permanentes y
electroimanes. Se entenderá que estos componentes individuales se
pueden seleccionar entre una variedad de alternativas fácilmente
disponibles, y se pueden combinar en una variedad de configuraciones
sin alejarse de la descripción general del sistema de separación de
la presente invención.
En una realización preferida del dispositivo de
separación, se proporcionan las vías de fluido, los contenedores de
disolución y recogida, el filtro de suspensión, la columna de
prefiltración, la columna de separación y los conectores como un
componente desechable pre-montado para el sistema de
separación. El dispositivo de separación se monta en el instrumento
de separación para la realización del procedimiento de separación.
Cuando finaliza el procedimiento de separación se puede eliminar el
contenedor de recogida de producto, y se desechan los componentes
del dispositivo de separación restantes.
Preferiblemente, un microprocesador incorporado
(no mostrado) controla todos los componentes electromecánicos del
instrumento, y el software dirige el sistema para llevar a cabo las
operaciones apropiadas en una secuencia estándar. Una pantalla de
video 62 y un teclado de operación 60 permiten que el operador
observe el funcionamiento del sistema automático y controle el
funcionamiento del instrumento en modo manual. Se puede conectar una
impresora (no mostrada) al microprocesador para imprimir información
del procedimiento, etiquetas, etc.
La Figura 3 representa un instrumento de
separación y un dispositivo de separación montado. En esta
realización, el dispositivo de separación se monta o instala sobre
el instrumento situando las tuberías de las vías de fluido en sus
válvulas de pinza externas respectivas 1-11, como se
describió anteriormente. La columna de prefiltración 30 se coloca
dentro del soporte de la columna de prefiltración 32. La columna de
separación 40 se coloca dentro del soporte de la columna de
separación 42 que se mueve con relación al imán 50 mediante un brazo
retráctil 44. Una palanca de sujeción ajustable 20 se usa para
asegurar el brazo de percha 21 en una posición elevada. Existen
soportes o clavijas 22 en el brazo de sujeción en los que colocar el
contenedor de residuos de lavado inicial 82 y los contenedores de
muestra y tampón (no mostrados) cuando sea necesario. El aparato
puede también incluir un compartimento de almacenamiento 70 para
separar el contenedor de residuos finales y el contenedor de muestra
no etiquetada del contenedor de recogida de producto (no
mostrado).
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de
ilustración y no en modo limitante.
Con relación a la Figura 1, se selecciona una
carcasa cilíndrica de un material no magnético con un diámetro de 20
mm y un volumen total de unos 14 mL. Una primera frita porosa
(polipropileno) se coloca en la base de la carcasa formando de esta
manera una capa base 110. La capa base tiene un tamaño de poro medio
de aproximadamente 100 :m. Se añaden esferas de hierro
ferromagnéticas a la cámara. Las esferas tienen un diámetro medio de
entre aproximadamente 0,2 y 0,5 mm, y se colocan aproximadamente 60
gramos (entre 55 y 65 gramos) de esferas en el contenedor. Para
evitar el sobre-llenado de la cámara se prefiere
una tolerancia de 0,12 gramos. El uso de esferas con diámetros
substancialmente uniformes permite que las esferas adopten una
configuración simétrica como la mostrada en la Figura 1 en la que
las esferas están apiladas en capas fuertemente interconectadas. A
continuación se hace vibrar la carcasa durante aproximadamente cinco
segundos para asentar las esferas en una matriz uniforme 106. Se
coloca una segunda frita porosa o capa de cubierta 108 sobre las
esferas asentadas y se puede presionar sobre la cámara para
comprimir y/o sostener además las esferas en una configuración de
matriz apilada o estructura a modo de red. A continuación se fija la
porción superior 116 de la columna de separación a la parte superior
de la carcasa. El área en torno a la toma de entrada 112 y la toma
de salida 114 se puede conformar para facilitar una conexión segura
de la columna a una vía de fluido tal como una tubería de plástico.
Dicha columna puede incluir también topes 118 que inhibirán que la
tubería pase más allá de cierto punto de la columna. Las tomas se
pueden formar también para incluir cualquier medio de conexión
apropiado como puntas, cierres luer, conectores
macho-hembra, etc.
La matriz se puede recubrir como se describió
anteriormente. Una vez que la matriz recubierta se ha secado, la
columna de separación se trata también con aproximadamente 5 mL de
polividona al 1%, u otro material hidrofílico apropiado. Se permite
el paso del exceso de polividona a través de la toma de salida 112,
y se seca la columna de separación.
El siguiente procedimiento de separación celular
se ejemplifica mediante el dispositivo de separación de la Figura
2.
En las determinaciones de las velocidades de
flujo óptimas, se encontró que la mayoría de los resultados deseados
de una secuencia, por ejemplo lavado, elución, etc., ocurría en un
período de tiempo breve, proporcionando pocos beneficios adicionales
el uso de ciclos de flujo más largos. Con el fin de maximizar la
realización, se ejecutaron varios ciclos cortos en lugar de un ciclo
largo. Esto proporciona una mejor realización sin ganancia neta de
tiempo o volumen bombeado. De esta manera se minimiza la pérdida de
células, el impacto físico sobre las células durante la elución, y
la contaminación residual.
La primera fase del procedimiento de separación
celular involucra el llenado o cebado de las vías de fluido, el
filtro de suspensión, y las columnas de prefiltración y separación.
Durante el procedimiento de cebado, típicamente no se aplica el
campo magnético a la columna de separación. El cebado del
dispositivo sirve para eliminar el aire del sistema de separación,
así como para lavar el recubrimiento hidrofílico (por ejemplo PVP)
de las columnas de prefiltración y separación. En algunas etapas se
induce el flujo por gravedad y en otras con una bomba.
Las vías de fluido y la columna se limpian de
burbujas de aire mediante la circulación de líquido de lavado a
través de un bucle de recirculación a velocidades de flujo
inferiores a aproximadamente 400 mL/minuto. Se usan varios ciclos a
diferentes velocidades de flujo. Las diferentes velocidades de flujo
inducen diferentes características de flujo a través del dispositivo
de separación, así como presiones negativas, y ambas cosas ayudan a
extraer las burbujas de las tuberías y la columna. Las burbujas de
aire se acumulan entonces en la parte externa de la columna en las
capas base y/o de cubierta. A continuación se invierte la dirección
del flujo, y se eliminan las burbujas del sistema dentro de una
bolsa de residuos apropiada. La secuencia se repite durante seis
ciclos de aproximadamente 5 segundos cada uno para asegurar la
eliminación de todas las burbujas. Un ciclo de aproximadamente 4
segundos implica la recogida de aproximadamente el 90% de las
burbujas. Cada ciclo sucesivo elimina aproximadamente el 90% del
balance previo.
Se abren las válvulas 6 y 10 para permitir que un
tampón u otra disolución de lavado fluya desde el contenedor de
tampón 80 y pase a través de la línea de tampón 90 hasta el
contenedor de residuos finales 84. Se cierra la válvula 10, y se
abren las válvulas 8, 5 y 3 para cebar la columna de separación 40 y
la columna de prefiltración 30, eliminando de esta manera las
burbujas de aire y lavando el recubrimiento hidrofílico de las
columnas. Las burbujas de aire y los residuos se transportan hasta
el contenedor de residuos de lavado iniciales 82. Se puede activar
la bomba 64 para facilitar el transporte del líquido de lavado a
través de la vía designada preferiblemente al uso de la gravedad
para inducir el flujo a través del sistema. Se vuelve a abrir la
válvula 10 para permitir un drenaje adicional por gravedad de las
burbujas de aire hasta el contenedor de residuos finales 84, y se
cierran las válvulas. El líquido de lavado puede contener materiales
como seroalbúmina humana, que inhibe que las células se adhieran a
las superficies internas de los componentes del dispositivo de
plástico.
A continuación se abren las válvulas 4, 7, 8 y 10
para cebar el bucle de recirculación 92. Se activa la bomba para
hacer circular el tampón a través de la columna de separación 40
tanto en la dirección de las agujas del reloj como en dirección
contraria a las agujas del reloj por el bucle de recirculación. Se
repite este procedimiento de recirculación para el paso del tampón a
través de ambos extremos de la columna de separación con el fin de
recoger y eliminar de manera secuencial las burbujas de aire
restantes de la matriz porosa y otros espacios vacíos de la columna
de separación, y para mojar completamente el interior de la columna
de separación. El procedimiento de recirculación también sirve para
aclarar cualquier recubrimiento hidrofílico de la columna de
separación. A continuación se cierran las válvulas.
Se abren las válvulas 1, 2 y 3 para permitir el
cebado del filtro de suspensión 35. A continuación se cierran las
válvulas. Se abren a continuación las válvulas 6, 8, 5 y 2 para
permitir el paso del tampón hasta el contenedor de muestra 81. A
continuación se cierran todas las válvulas. En un sistema
automatizado, se sitúa un sensor de ultrasonidos 65 cerca de la vía
de fluido dos 12. Si cualquier burbuja de aire entra en el sistema
desde el contenedor de muestra, se detecta la interrupción de flujo
de fluido en la vía, y el instrumento cambia automáticamente al modo
de lavado. Todas las válvulas se cierran hasta que el operador puede
eliminar la burbuja de aire.
En la fase de recogida, se sitúa un imán con
relación a la columna de separación 40 de tal manera que se aplique
un campo magnético a la columna de separación. El posicionamiento
relativo puede involucrar el movimiento del imán en torno a o de
manera adyacente a la columna de separación, o el movimiento de la
columna de separación dentro del campo magnético. En una realización
de la presente invención en la que se usa un imán permanente para
proporcionar el campo magnético, el imán se mantiene ventajosamente
en una posición fija, ya que es un componente relativamente pesado
del sistema de separación. De esta manera, se monta la columna de
separación dentro de o se fija a un brazo (no mostrado) que sirve
para retraer la columna de separación dentro del campo magnético
para la fase de separación, y para desplazar a continuación la
columna de separación fuera del campo magnético para las fases de
elución y/o lavado.
En este ejemplo, se retrae la columna de
separación 40 dentro del campo magnético de un imán permanente. Se
abren las válvulas 1, 5, 8 y 11 para eliminar las burbujas de aire
de la parte inferior de la columna de prefiltración 30 y de la
columna de separación 40, y a continuación se cierran las válvulas.
Se abren las válvulas 6, 8 y 4 para eliminar cualquier burbuja de
aire de la línea de tampón 90. Se cierran las válvulas 8 y 4, y se
abre la válvula 10 para permitir el drenaje por gravedad del tampón
hacia el contenedor de residuos finales 84. A continuación se
cierran todas las válvulas.
Se abren las válvulas 2, 5, 8 y 11 para iniciar
el flujo de muestra desde el contenedor de muestra 81 y su
transporte secuencial a través del filtro de suspensión 35, la
columna de prefiltración 30 y la columna de separación 40. Las
células o analito objetivo que han sido enlazadas con un reactivo
magnético son retenidas en la columna de separación en presencia de
un campo magnético. Las células no etiquetadas y/o otros componentes
del fluido pasan a través del sistema y son recogidos en el
contenedor de muestra no etiquetada 85. Este procedimiento continúa
hasta que se vacía el contenedor de muestra y se detecta una burbuja
de aire en la vía de fluido dos 12. A continuación se cierran las
válvulas.
Se lleva a cabo un primer lavado del circuito de
fluido mediante la apertura de las válvulas 1, 5, 8 y 11 para
permitir el paso del tampón a través de las columnas de
prefiltración y separación. Se lava la vía y se vacía en el
contenedor de muestra no etiquetada 85. Se cierran las válvulas 1 y
5, y se abren las válvulas 7 y 4 para permitir un lavado por
gravedad del bucle de recirculación 92. A continuación se cierran
las válvulas. El contenedor de células no etiquetadas está
ventajosamente conectado al circuito de fluido en una vía de fluido
separada de manera que las células no etiquetadas no se destruyen o
contaminan durante el procedimiento de separación.
Se abren las válvulas 4, 8 y 10 para permitir que
el tampón aclare la columna de separación hacia el contenedor de
residuos finales 84. A continuación se cierran las válvulas.
Se abren las válvulas 6, 5, 8 y 3 para
transportar tampón sin usar a través del sistema, incluyendo la
columna de prefiltración 30. Se trata de un procedimiento de
seguridad para eliminar células residuales en la parte superior de
los conectores. A continuación se cierran las válvulas. Se abren de
nuevo las válvulas 4, 8 y 10 para permitir que el tampón aclare la
columna de separación 40 hacia el contenedor de residuos finales 84.
A continuación se cierran las válvulas.
Se abre la válvula 7, y se activa la bomba 64
para lavar a contracorriente la columna de separación 40 con el
tampón entrando en la columna de separación a través de la toma de
salida 44. A continuación se abren las válvulas 4, 8 y 10 para
permitir el aclarado por gravedad del bucle de recirculación 92
hacia el contenedor de residuos finales 84. Se cierra la válvula 7,
y el tampón lava la columna de separación hacia el contenedor de
residuos finales. A continuación se cierran todas las válvulas. Esta
secuencia se repite 3 veces usando ciclos cortos, para mejorar la
eficacia y permitir el uso de velocidades de flujo más bajas.
En ésta y otras etapas del procedimiento de
separación se usa ventajosamente una bomba. Una bomba no sólo puede
cambiar la dirección del flujo del fluido, o la circulación del
fluido conjuntamente con el bucle de recirculación, sino que también
puede operar a diferentes velocidades de flujo. Las diferentes
velocidades permiten que el fluido sea bombeado a velocidades
variables y que sea transportado a través del sistema sin depender
solamente de la gravedad. Por ejemplo, se puede realizar un lavado
de la columna de separación o las vías de fluido a una velocidad
superior con el fin de eliminar mejor del sistema los materiales
enlazados no específicamente. Además, la bomba junto con el sistema
de recirculación permite la agitación del fluido en el sistema. Esta
agitación también se puede usar para ayudar a eliminar del sistema
materiales de la muestra deseados o indeseados.
Se abren las válvulas 6 y 11 para aclarar el
canal de distribución 88. Se cierran todas las válvulas y se
desconecta el imán o se retira la columna de separación 40. Se abre
la válvula 7, y se transporta el tampón a través de la columna de
separación, lavando de esta manera las células separadas etiquetadas
magnéticamente de la columna de separación. Se puede usar la bomba
64 para facilitar el transporte del tampón de un lado a otro a
través de la columna de separación para lavar a contracorriente y
eliminar repetidamente las células etiquetadas de la columna de
separación. A continuación se cierra la válvula 7.
Es posible que algunas células etiquetadas o no
etiquetadas puedan encontrarse atrapadas o atascadas físicamente
dentro de la matriz porosa u otros espacios vacíos de la columna de
separación a medida que se pasa la muestra hacia abajo a través de
la cámara. La recuperación de las células separadas se aumenta
mediante lavado a contracorriente (es decir, transporte de la
disolución de lavado hacia arriba a través de la toma de salida 44
de la columna de separación, a través de la matriz y hacia fuera a
través de la toma de entrada 42), al empujar cualquier célula
atrapada a través de la cámara en dirección opuesta a la de entrada.
Esto es claramente preferible a forzar las células a través de la
matriz en la fase de elución y por la tanto romper posiblemente las
células.
En un procedimiento de separación magnética
preferido, se lleva a cabo una segunda recogida o
re-recogida de las células etiquetadas
magnéticamente. Se conecta el imán o se vuelve a colocar la columna
de separación 40 dentro del campo magnético. Se abre la válvula 7, y
se recircula el fluido que contiene las células etiquetadas a través
de la columna de separación a través del bucle de recirculación 92.
Preferiblemente, el fluido circula en sentido contrario a las agujas
del reloj. Esto produce la entrada de las células etiquetadas en la
columna de separación a través de la toma de salida 44 de la columna
de separación. Esto a su vez produce la recogida de la mayoría de
las células etiquetadas magnéticamente en la porción inferior de la
cámara de separación a partir de la cual las células se pueden eluir
fácilmente. Se pueden abrir las válvulas 6, 8, 5 y 3 para eliminar
cualquier célula etiquetada de los ajustes o conectores inferiores
para la re-recogida en la columna de separación. A
continuación se cierran las válvulas. También se puede volver a
abrir la válvula 7 para eliminar cualquier célula etiquetada del
bucle de recirculación para la re-recogida en la
columna de separación.
Se puede realizar un segundo lavado de la columna
de separación 40. Se hace circular el fluido a través del bucle de
recirculación 92 para lavar la porción inferior de la columna de
separación. Se abren las válvulas 4, 8 y 10 para permitir el
aclarado por gravedad del bucle de recirculación y el paso del
tampón de aclarado hacia el contenedor de residuos finales 84. A
continuación se cierran las válvulas. Esta secuencia de etapas se
puede repetir. Se abren las válvulas 6 y 11 para limpiar el canal de
distribución 88, y a continuación se cierran las válvulas. Esta
secuencia se repite 3 veces usando ciclos cortos.
Se desconecta de nuevo el imán o se elimina. Se
abren las válvulas 4, 8 y 9, permitiendo de esta manera que el
tampón elimine las células etiquetadas magnéticamente de la parte
inferior de la columna de separación 40 hacia el contenedor de
recogida de producto 83. Se puede abrir la válvula 7 y se puede
activar la bomba 64 con el fin de lavar a contracorriente las
células de la columna de separación. A continuación se para la bomba
para permitir el lavado continuado de la columna de separación hacia
el contenedor de recogida de producto. Esta etapa se puede repetir.
La recogida final de las células etiquetadas se realiza mediante
drenaje por gravedad del bucle de recirculación 92. A continuación
se cierran todas las válvulas. La elución recupera al menos
aproximadamente el 90% de las células enlazadas. Se puede realizar
una segunda elución con el fin de recoger las células enlazadas
residuales, usando los parámetros descritos anteriormente, pero
incluyendo el paso de la disolución de lavado a través del bucle de
recirculación para lavar la columna de manera más enérgica. Este
procedimiento en dos etapas permite que la mayoría de las células
objetivo escapen del procedimiento de elución más enérgico.
El contenedor de recogida de producto 83 contiene
ahora las células etiquetadas y se puede eliminar del dispositivo de
separación. El procedimiento de separación produce también la
recogida de células no etiquetadas y otros componentes de la muestra
no contaminados en un contenedor de muestra no etiquetada 85. Si se
produce un error en el procedimiento de separación, se puede
recuperar la muestra en el contenedor de muestra no etiquetada y se
puede reiniciar el procedimiento. Además, la recuperación de células
u otros componentes en el contenedor de muestra no etiquetada
permite el uso de los materiales recuperados en procedimientos de
separación adicionales u otros procedimientos. Opcionalmente se
eluyen directamente las células en una bolsa apropiada para
congelación u otro almacenamiento. En un procedimiento de separación
de células, por ejemplo, el 10-20% de la población
celular objetivo puede pasar al contenedor de células no
etiquetadas, pero el contenido no contaminado de ese contenedor se
puede volver a procesar a través del dispositivo de separación.
Preferentemente, menos del 20% de la población celular objetivo
pasará al contenedor de muestra no etiquetada durante un
procedimiento de separación.
El factor de enriquecimiento es el número de
células no etiquetadas que pasan a través del procedimiento por
células no etiquetadas que son retenidas de manera no específica
mediante el dispositivo. Normalmente el procedimiento de
separación/recogida descrito anteriormente proporcionará un factor
de enriquecimiento para los procedimientos preparativos a gran
escala de al menos aproximadamente 1000, más normalmente de al menos
aproximadamente 3000 y preferiblemente de al menos aproximadamente
5000. Los procedimientos a gran escala implicarán normalmente la
recogida de al menos aproximadamente 107 células objetivo, más
normalmente al menos aproximadamente 108 células objetivo. Una
muestra de sangre periférica que tiene una población inicial de
células CD34 positivas del 0.1% producirá la recogida de una
población de células objetivo de aproximadamente el
70-90% de pureza, que se corresponde con un factor
de enriquecimiento de entre 3000 y 10000. Se pueden obtener
resultados similares cuando el material de muestra de partida se
prepara a partir de células mononucleares de cultivo (conteniendo
generalmente aproximadamente un 0,1% de células progenitoras) o de
un producto de leucoforesis de pacientes tratados con un agente para
movilizar las células CD34+ (conteniendo generalmente
aproximadamente un 2,0% de células progenitoras).
En un procedimiento de separación de células de
ejemplo, células de sangre humana proporcionan la población celular
de muestra. Se pueden usar poblaciones celulares mezcladas como
sangre periférica, médula ósea, sangre del cordón umbilical o la
placenta, o sangre fetal, que son recogidas mediante las técnicas
estándar. Las técnicas estándar se usan también para la preparación
inicial de la muestra celular (por ejemplo, separación por densidad
de Ficoll-Hypaque, centrifugación y eliminación del
sobrenadante, etc.). Los procedimientos típicos de preparación de la
muestra reducirán el volumen de la muestra, concentrando de esta
manera las células objetivo y reduciendo la cantidad de fluido que
se debería usar en el sistema de separación. Mediante la
preconcentración de la muestra, se necesita menos anticuerpo para el
procedimiento de separación y el enlazado ocurre más rápidamente. El
material de partida preferido es un producto de leucoforesis de
pacientes tratados con un agente para movilizar las células
CD34+.
La etiqueta magnética es una partícula de
hierro/polisacárido conjugada a un anticuerpo murina monoclonal que
se enlaza específicamente a CD34, un antígeno de superficie
encontrado en células madre hematopoyéticas y progenitoras. La
suspensión celular se hace girar en una bolsa estéril a 500xg
durante 10 minutos. Usando un adaptador de punta con ventilación, se
retira el sobrenadante del plasma de la bolsa, teniendo cuidado de
no eliminar ninguna célula blanca. A partir de un volumen de partida
de 600 mL, quedan en la bolsa aproximadamente 95 g de muestra. El
pellet de células se resuspende en el fluido restante. Usando una
jeringuilla y una aguja estériles se inyecta el anticuerpo
monoclonal conjugado (10 mL de reactivo magnético que contiene 200
:g de anticuerpo) a la bolsa a través de un adaptador. Se inyecta
aire estéril (120 cc) a la bolsa para ayudar a una mezcla adecuada.
Se sella y se sacude la bolsa a temperatura ambiente durante 30
minutos. Se añade suero fisiológico normal + HSA al 0.5% (500 mL) a
la bolsa de muestra, y se mezcla abundantemente. Se centrifuga la
muestra a 500xg durante 10 minutos. Se elimina el sobrenadante (500
gramos) de la bolsa a través del adaptador. El pellet de células se
resuspende en el fluido restante. Se repiten las etapas de lavado. A
continuación se resuspende la población celular concentrada
resultante y está lista para la separación de células.
El procedimiento de separación de células madre
lleva aproximadamente treinta minutos usando un sistema automatizado
como el representado en la Figura 3. El operador carga primero el
dispositivo de separación (tuberías y conjunto de columnas) en el
instrumento y conecta al dispositivo la bolsa que contiene el
líquido de lavado o tampón y la bolsa que contiene las células
tratadas con anticuerpo (aproximadamente cinco minutos). El sistema
automatizado lava y ceba a continuación los circuitos del fluido
(aproximadamente cinco minutos) e inicia el procedimiento de
separación (aproximadamente veinte minutos) como se describió
anteriormente. El resto del ciclo se realiza automáticamente sin la
intervención del operador. El instrumento indicará que se ha
completado el ciclo.
Las células etiquetadas magnéticamente (por
ejemplo las células CD34-positivas) se retendrán
dentro de la columna de separación mediante medios de fuerza
magnética. A continuación se lava la columna y el eluyente se recoge
en un contenedor de residuos. Durante la retirada del imán, la
columna se vuelve a lavar y se recoge el complejo célula/anticuerpo
seleccionado en un contenedor separado. Las células
CD34-positivas purificadas (u otra población celular
específica) están entonces dispuestas para su uso. Se puede usar una
aguja de sellado para cerrar las tuberías entre el contenedor de
recogida de células madre y el resto del dispositivo de separación
mediante la creación de puntos de sellado por encima y por debajo de
un cierre Luer conector. Se puede eliminar el contenedor de recogida
de células madre.
Las células recogidas se pueden criopreservar o
usar inmediatamente. Las células también se pueden someter a
procesamiento adicional tal como expansión ex vivo para aumentar el
número de células madre/progenitoras a trasplantar. En ausencia de
un procedimiento de eliminación adicional, la suspensión celular
contendrá una cantidad muy pequeña del reactivo anticuerpo que
permanece fijado a las células (>99% del reactivo anticuerpo no
está enlazado y se elimina mediante un lavado de células anterior a
la separación de células).
Claims (12)
1. Sistema de separación magnética para la
separación de substancias biológicas objetivo magnéticas o
etiquetadas magnéticamente de una muestra, que comprende:
(a) un dispositivo separador (25) que
comprende:
- (i)
- una columna de separación (102, 40) conectada mediante una primera vía de fluido a un contenedor de muestra (81), en el que dicha columna de separación comprende una carcasa no magnética (104) que tiene una toma de entrada (112) y una toma de salida (114), y define una cámara de separación que tiene una relación diámetro a longitud de al menos 0,2 a 1, estando dispuesta a través de la totalidad del ancho de dicha cámara una matriz permeable al fluido (106) de esferas ferromagnéticas;
- (ii)
- un canal de distribución (88) conectado mediante una segunda vía de fluido (18) a dicha columna de separación, en el que dicho canal de distribución conduce a;
- (iii)
- un contenedor de recogida de producto (83);
- (iv)
- un contenedor de residuos de lavado (84), y
- (v)
- un contenedor de muestra no etiquetada (85);
y
(b) un instrumento de separación, que comprende
una carcasa que incluye:
- (i)
- un soporte del contenedor de muestra;
- (ii)
- una o más válvulas (1-11) para controlar el flujo de fluido a través de una o más de dichas vías de fluido;
- (iii)
- un soporte de la columna de separación (42); y
- (iv)
- medios de generación de campo magnético (50) situados sobre el instrumento de separación de manera que en uso la columna de separación (102, 40) se encuentra dentro de o adyacente a un campo magnético generado por dichos medios de generación de campo magnético,
en el que dicho dispositivo separador se puede
instalar sobre dicho instrumento de separación para la realización
de un procedimiento de separación, y en el que el dispositivo
separador se puede mantener durante el procedimiento de separación
como un sistema cerrado del que se excluye substancialmente el
aire.
2. Sistema de separación según la reivindicación
1, en el que el instrumento de separación incluye también medios de
bombeo (64) conectados al dispositivo de separación para bombear el
fluido a través de dicha columna de separación.
3. Sistema de separación según la reivindicación
2, en el que el dispositivo de separación comprende también un bucle
de recirculación (92) que conecta dicha primera vía de fluido y
dicha segunda vía de fluido de manera que el fluido que ha pasado a
través de dicha columna de separación se puede recircular a través
de dicha columna de separación, y en el que los medios de bombeo
están conectados al bucle de recirculación para bombear el fluido a
través de dicha columna de separación y dicho bucle de
recirculación.
4. Sistema de separación según las
reivindicaciones 2 ó 3, que comprende también medios motores para
mover dicho soporte de la columna de separación, moviendo de esta
manera la columna de separación dentro o fuera del campo
magnético.
5. Sistema de separación según la reivindicación
4, que comprende además:
(a) unos medios de microprocesador para controlar
dichas válvulas, dichos medios de bombeo y dicho motor, dirigiendo
de esta manera dicho instrumento para realizar las operaciones de
separación apropiadas en una secuencia deseada; y
(b) una pantalla de video (62) para permitir que
un operador controle el funcionamiento del sistema automático.
6. Sistema de separación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un detector de burbuja
(65) para detectar la presencia de fluido en dicha primera vía.
7. Sistema de separación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una columna de
prefiltración (30) en la primera vía de fluido entre dicho
contenedor de muestra y dicha columna de separación.
8. Sistema de separación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas esferas están apiladas en
una configuración de red formando de esta manera entre dichas
esferas canales substancialmente uniformes de aproximadamente 20 a
aproximadamente 60 :m de diámetro.
9. Sistema de separación según la reivindicación
7, que comprende además:
un filtro (35) entre dicho contenedor de muestra
y dicha columna de prefiltración, en el que dicho filtro elimina
componentes indeseados de la muestra antes del paso de la muestra
hacia dicha columna de prefiltración.
10. Sistema de separación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho sistema comprende además
medios motores para mover dichos medios de generación de campo
magnético con relación a dicho soporte de la columna de separación,
por lo que el campo magnético se puede retirar de la columna de
separación.
11. Sistema de separación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dichos medios de generación de
campo magnético son un imán permanente.
12. Sistema de separación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha columna, dichas vías, dicho
canal y dichos contenedores están conectados de manera
separable.
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