CN118308348A - 分离非囊泡miRNA的方法 - Google Patents

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CN118308348A CN202410531773.6A CN202410531773A CN118308348A CN 118308348 A CN118308348 A CN 118308348A CN 202410531773 A CN202410531773 A CN 202410531773A CN 118308348 A CN118308348 A CN 118308348A
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Abstract

本发明涉及分离非囊泡miRNA的方法。具体地，本发明提供了方法和试剂盒，其通过使用包含缓冲剂的酸性结合缓冲液来促进非囊泡miRNA结合到包含阴离子交换基团的固相上，从而从生物样品如血清和血浆中分离无细胞非囊泡miRNA。此外，由于拥挤剂的存在和通过增加所述固相的表面电荷密度，可以改善非囊泡miRNA与所述固相的结合。

Description

分离非囊泡miRNA的方法
本申请是国际申请日2022年6月15日、国际申请号PCT/EP2022/066288于2023年12月15日进入中国国家阶段、申请号202280042857.2、发明名称“分离非囊泡miRNA的方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明提供了从生物样品中分离无细胞非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA的改善方法。
背景技术
来自无细胞生物流体如血浆、血清或尿液的细胞外核酸代表着研究和诊断的重要分析物。细胞外核酸包括DNA和RNA，在本领域中也被称为无细胞核酸或循环核酸，因为在体液中经常发现这样的无细胞核酸。特别相关的细胞外核酸如包括miRNA在内的细胞外RNA（本文中也称为“无细胞RNA”或“cfRNA”）。细胞外RNA例如存在于外泌体和其它细胞外囊泡（EV）中，它们含有mRNA和miRNA以及其它RNA转录本（如tRNA和Y-RNA）。细胞外囊泡中包含的细胞外RNA也称为囊泡RNA。因此，在血浆、血清或其它无细胞体液中，miRNA（和其它RNA）存在于外泌体和其它细胞外囊泡（EV）内，在那里很好地抵御了无处不在的内源性RNA酶。细胞外囊泡也可包含DNA。然而，无细胞RNA，如无细胞miRNA，也存在于EV以外的独立群体中。无细胞非囊泡miRNA往往与蛋白质缔合（例如，与Ago2蛋白或其它Argonaute蛋白缔合的miRNA），从而抵御被RNA酶降解。在miRNA的情况下，对RNA酶的抵御似乎应归于与Ago2以及潜在的其它保护蛋白（其它Argonaute蛋白、miRNA结合蛋白如核磷蛋白1、可能的脂蛋白或其它保护剂）的紧密缔合。在健康供体血浆中的EV内主要发现的miRNA的实例是let-7a和miR-150，而miR-16和miR-122大多位于EV之外并被证明与Ago2蛋白缔合。
现有技术中已知许多方法来分离细胞外囊泡，这进而允许从分离的EV中回收囊泡RNA。细胞外囊泡的分离方法包括使用例如密度梯度或蔗糖垫层的超速离心法、或尺寸排阻色谱、或二者的组合（Enderle等，2015. 通过一种新的基于离心柱的方法对来自外泌体和其它细胞外囊泡的RNA的表征（Characterization of RNA from exosomes and otherextracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method）. PloSone, 10(8), e0136133）。其它方法包括基于聚合物的沉淀、免疫捕获（靶向EV膜蛋白）和超滤。此外，顺序膜过滤或膜亲和柱通常用于分离EV（例如exoRNeasy试剂盒（QIAGEN，Hilden），还参见Srinivasan等，2019；Cell，177(2)，446-462）。虽然阴离子交换固相（包括粒子、膜或改性的表面）有效地捕获游离核酸和EV（与所含的囊泡核酸一起），但通常不结合非囊泡RNA-蛋白质复合体，如Ago2-miRNA复合体。这使得对无细胞非囊泡RNA，特别是非囊泡miRNA的有效分离具有挑战性，并且需要改善现有技术的方法。
对于无细胞非囊泡miRNA的分离，已知的方法是基于免疫捕获Ago2-miRNA复合体。这可以通过适当的抗体来实现，所述抗体例如与磁性珠粒直接偶联、或使用生物素化抗体和链霉亲和素珠粒间接偶联。此外，囊泡miRNA和非囊泡miRNA的共纯化方法是已知的，如miRNeasy血清/血浆试剂盒（QIAGEN，Hilden）。然而，这些现有技术的方法非常费力，一次限于很少的样品数和/或依赖于特异性抗体，因此价格昂贵。例如，在血清和血浆样品的情况下，由于存在高浓度的其它蛋白质和污染物，只能处理少量样品。此外，程序的自动化在大多数情况下是困难的。
由于囊泡miRNA和非囊泡miRNA是通过不同的机制（例如，EV的主动分泌或细胞死亡）从细胞释放的，因此还需要提供允许分离囊泡miRNA群体和非囊泡miRNA群体使之彼此分开的方法。将囊泡miRNA和非囊泡miRNA提供在分开的级分中可以提供额外的信息，包括不同的病理过程（例如毒性相比于癌症），因此可以为潜在的诊断应用提供更高的特异性。
因此，迫切需要改善的方法用于从无细胞或细胞贫化的生物样品（如血清或血浆样品）中同时或作为分开的级分来分离囊泡RNA和非囊泡RNA，特别是miRNA。因而本发明的目的是避免现有技术的缺点并提供这类改善的方法和用于执行这类方法的试剂盒。
发明内容
本发明克服了现有技术的核心缺点。特别是，本发明提供了用于从无细胞或细胞贫化的生物样品、特别是无细胞或细胞贫化的体液如血清或血浆样品中富集无细胞非囊泡RNA、特别是无细胞非囊泡miRNA的改善方法。如实施例所证明的，通过使用修改的结合条件来改善难以捕获的无细胞非囊泡miRNA的结合，实现了非囊泡RNA与包含阴离子交换基团的固相的结合改善。所述修改的结合条件包括降低pH、增加结合混合物的离子强度、添加分子拥挤剂（molecular crowding agents）（例如PEG）、使用更强的离子交换基质（更高的负电荷密度）、或上述的任何组合。不希望在理论上受到约束，这些修改的结合条件似乎充分削弱了Ago2和/或其它保护蛋白之间的相互作用，从而允许囊泡miRNA与阴离子交换表面结合，但所述miRNA不会被样品中可能存在的RNA酶降解。
此外，通过选择本文中所述的适当的结合条件，可以在一个级分中同时分离（例如回收所有无细胞miRNA）或在分开的级分中分离囊泡RNA和非囊泡RNA（如囊泡miRNA和非囊泡miRNA）。可以如下实现所述囊泡miRNA群体和非囊泡miRNA群体的分开富集：在非囊泡RNA、如非囊泡miRNA没有充分结合并因此保留在结合混合物中的条件下，首先使EV结合到阴离子交换表面。然后，使用如本文中所述的修改的结合条件，例如通过使用更强的结合条件和/或使用具有更高阴离子强度并因此与非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的结合亲和力更好的不同阴离子交换基质，可以从剩余样品中富集非囊泡RNA。术语富集在本文中以广义使用，并尤其涵盖目标分析物的分离和纯化，所述目标分析物即非囊泡RNA和/或囊泡RNA，如优选的非囊泡miRNA和/或囊泡miRNA。
根据第一方面，提供了一种从包含非囊泡RNA和任选的细胞外囊泡的无细胞或细胞贫化的生物样品中富集非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的方法，其中所述方法包括
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，和
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液；
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与所述结合混合物分离。
根据第一方面的方法允许从包含非囊泡RNA和任选的细胞外囊泡的无细胞或细胞贫化的生物样品中富集非囊泡RNA、优选非囊泡miRNA。本文描述了实现将非囊泡RNA高效捕获到固相的合适的酸性结合缓冲液。另外，如果所述无细胞或细胞贫化的生物样品中包含细胞外囊泡，那么包含囊泡RNA、如囊泡miRNA的细胞外囊泡（EV）也可以同时结合到固相上，从而允许同时分离非囊泡RNA和囊泡RNA，如非囊泡miRNA和囊泡miRNA。根据第一方面的方法还可以用于从预先贫化EV的无细胞或细胞贫化的生物样品中富集非囊泡RNA，如非囊泡miRNA。
根据第二方面，提供了一种从包含细胞外囊泡和非囊泡RNA的无细胞或细胞贫化的生物样品中顺序富集细胞外囊泡和非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的方法，其中所述方法包括
(X)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，和
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
-并使细胞外囊泡结合到包含阴离子交换基团的固相上；
将带有结合的细胞外囊泡的固相与剩余结合混合物分离，其中所述剩余结合混合物包含非囊泡RNA；
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物，和
-任选的包含缓冲剂的酸性结合缓冲液；
-并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与(A)的剩余结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)任选地从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA。
根据第三方面，提供了一种用于执行根据第一或第二方面的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含：
(a)根据本发明的结合缓冲液；
(b)包含用于结合细胞外RNA和细胞外囊泡的阴离子交换基团的固相；
(c)任选的洗涤缓冲液；和
(d)任选的裂解缓冲液。
如本文所公开的，所述试剂盒可包含
(x)包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，其中所述酸性结合缓冲液(x)不同于所述酸性结合缓冲液(a)，其中优选地，所述酸性结合缓冲液(a)与所述酸性结合缓冲液(x)的不同之处在于以下特征中的一个或多个
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂；和/或
(b’)不同于所述固相(b)的包含阴离子交换基团的第二固相，其中优选地，所述固相(b)与固相(b’)的不同之处在于：(i) 它包含更多的阴离子交换基团；和/或(ii)它包含更强的阴离子交换基团。
通过以下描述和权利要求书，本申请的其它目的、特征、优点和方面对于本领域技术人员将变得显而易见。然而，应当理解，给出以下描述、权利要求书和具体实施例，在指示本申请的优选实施方案的同时，仅作为说明。
附图说明
图1：使用不同结合条件回收的miRNA的Ct值。在pH（3、3.5或4）和离子强度不等的不同结合缓冲液（甲酸盐、乙酸盐）存在下，通过结合到携带组胺官能团的磁性阴离子交换珠粒上来富集人血浆样品中的囊泡miRNA和非囊泡miRNA。(A) 囊泡miRNA let-7a的Ct值。(B) 非囊泡miRNA miR-122的Ct值。
图2：使用不同结合条件回收的miRNA的Ct值。使用包括具有不同离子强度的结合缓冲液的改良的exoRNeasy方法来富集人血浆样品中的囊泡miRNA和非囊泡miRNA。(A) 囊泡miRNA miR-150的Ct值。(B) 非囊泡miRNA miR-122的Ct值。
图3：使用不同结合基质回收的miRNA的Ct值。比较了囊泡miRNA和非囊泡miRNA从携带组胺或His10肽作为官能团的磁性阴离子交换珠粒中的回收。作为参考，还使用exoRNeasy Maxi试剂盒回收miRNA。(A) 囊泡miRNA let-7a的Ct值。(B) 非囊泡miRNA miR-122的Ct值。
图4：在存在PEG或没有PEG下结合后回收的miRNA的Ct值。人血浆样品中的囊泡miRNA和非囊泡状miRNA由于在5.5% PEG存在下或在不存在PEG的情况下与携带组胺官能团的磁性阴离子交换珠粒结合而被富集。作为参考，还使用exoRNeasy Maxi试剂盒回收miRNA。(A) 囊泡miRNA miR-150的Ct值。(B) 非囊泡miRNA miR-122的Ct值。
图5：从EV结合到磁性珠粒上获得的上清液中或从EV结合到exoRNeasy离心柱（spin column）上获得的穿流液（flow-through）中的非囊泡miR-122的结合。(A) 非囊泡miRNA miR-122的Ct值。(B) 囊泡miRNA miR-150的Ct值。
具体实施方式
如在发明内容中所解释的，本文中公开的本发明的不同方面和实施方案对本领域做出了重大贡献，这也在下文中解释。
本文中使用的术语“细胞外囊泡”（EV）特别是指细胞来源的任何类型的分泌囊泡。EV可大致分类为外泌体、微囊泡（MV）和凋亡小体。诸如外泌体和微囊泡的EV是由细胞分泌的小囊泡。已经发现，EV通过许多不同的体液包括血液和尿液进行循环，这使得它们容易接触到。由于EV组成与亲本细胞的相似性，循环中的EV是生物标志物的有价值的来源。循环中的EV可能由外泌体和MV的混合物构成。它们含有核酸，特别是mRNA、miRNA、和受脂质双层保护而不被降解的其它小RNA。所述内容物被相应地专门包装，并代表了局部和远程细胞通讯的机制。它们可以在细胞间运输RNA。EV如外泌体是循环中的生物标志物的丰富和多样化来源。源细胞可以是健康细胞或癌细胞。所述源细胞也可以是其它受疾病影响的细胞或受影响的细胞、包括受应激影响的细胞。例如，所述细胞可受到神经变性疾病的影响。另一个实例是应激细胞，如经历老化的细胞。应激细胞可释放更多的EV和细胞外DNA。癌细胞、特别是分裂的癌细胞经常活跃地分泌EV，如外泌体。作为肿瘤微环境的一部分，EV如外泌体似乎在成纤维细胞生长、促结缔组织增生反应以及上皮-间充质转化（EMT）和SC的启动以及治疗抵抗的建立和转移癌治疗抵抗的启动方面发挥着重要作用。因此，对EV、相应地对EV内容物如囊泡RNA的分析有高度的兴趣。
本文中使用的术语“非囊泡RNA”是指在无细胞或细胞贫化的生物样品中不包含在EV中的RNA。这种不包含在EV中的无细胞RNA，本文中称为非囊泡RNA，是如背景技术中所解释的，也特别令人感兴趣。通常，这类非囊泡RNA由非囊泡miRNA提供，非囊泡miRNA往往与蛋白质缔合（例如，与Ago2蛋白或其它Argonaute蛋白缔合的miRNA），从而抵御被RNA酶降解。
在健康供体血浆中的EV内主要发现的miRNA的实例是let-7a和miR-150，而miR-16和miR-122大多位于EV之外并被证明与Ago2蛋白缔合。因此，这些miRNA可以分别用作囊泡RNA和非囊泡RNA的标志物。
根据第一方面的方法
根据第一方面，提供了一种从包含非囊泡RNA和任选的细胞外囊泡的无细胞或细胞贫化的生物样品中富集非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的方法，其中所述方法包括
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，和
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与所述结合混合物分离。
在实施方案中，所述方法包括
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA。
根据一个实施方案，所述无细胞或细胞贫化的生物样品包含细胞外囊泡，并且其中步骤(A)包括使非囊泡RNA和细胞外囊泡结合到所述固相上，以及步骤(B)包括将带有结合的非囊泡RNA和结合的细胞外囊泡的固相与所述结合混合物分离。
在实施方案中，步骤(D)包括从所述固相回收非囊泡RNA和细胞外囊泡、或非囊泡RNA和提取的囊泡RNA。
在优选的实施方案中，待富集的非囊泡RNA是非囊泡miRNA。在一个实施方案中，细胞外囊泡中包含的囊泡RNA可以与非囊泡RNA一起被富集。
本发明提供的结合条件使得难以捕获的非囊泡RNA如非囊泡miRNA能够有效地结合到包含阴离子交换基团的固相上。由此提供了一种用于从无细胞或细胞贫化的生物样品中富集无细胞非囊泡RNA（特别是非囊泡miRNA）的改善的方法。如本文中别处所解释的，非囊泡miRNA与阴离子交换表面的结合尤其具有挑战性，因为蛋白质如Ago2与非囊泡miRNA缔合，这损害了所述无细胞非囊泡miRNA与所述固相的阴离子交换基团的结合。根据第一方面的方法通过提供削弱蛋白质-miRNA相互作用的特定结合条件，克服了这些问题。这是通过在结合步骤(A)期间添加包含缓冲剂的酸性结合缓冲液来实现的。结合后，所述带有结合的非囊泡RNA的固相与剩余结合混合物分离，允许进一步处理，例如洗涤和回收、特别是洗脱所述结合的非囊泡RNA并任选地通过定量RT-PCR来分析洗脱的非囊泡RNA。重要的是，在步骤(A)中使用的结合条件不损害包含囊泡RNA、如囊泡miRNA的细胞外囊泡与阴离子交换基团的结合。因此，如果在所述无细胞或细胞贫化的生物样品中还包含细胞外囊泡（EV）的话，它们可以另外结合到所述阴离子交换表面上，使得在结合后，非囊泡RNA（特别是非囊泡miRNA）和EV被结合并由此被捕获到所述阴离子交换固相上。这有利地允许从无细胞或细胞贫化的生物样品中同时分离出非囊泡RNA和囊泡RNA，如非囊泡miRNA和囊泡miRNA。
此外，根据第一方面的方法可以用于从细胞外囊泡被贫化的无细胞或细胞贫化的生物样品中富集非囊泡RNA，优选非囊泡miRNA。这允许富集囊泡RNA贫化的非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA。对于这样的细胞外囊泡贫化，也可以使用现有技术方法。此外，对于在分开的级分中回收非囊泡RNA/miRNA和囊泡RNA/miRNA，可以使用根据第二方面的有利方法。
现在将详细描述根据第一方面的方法的各个步骤和优选实施方案。
步骤(A)
步骤(A)包括制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，和
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上。所述包含阴离子交换基团的固相可包含在所述结合混合物中，例如以提供阴离子交换表面的粒子、优选磁性粒子的形式。所述结合混合物也可以穿过包含阴离子交换基团的膜，从而将非囊泡RNA、如非囊泡miRNA结合到并由此捕获到所述膜上。如本文中所公开的，EV，如果包含在所述细胞贫化或无细胞生物样品中，也可以同时结合到所述固相上。所述包含阴离子交换基团的固相也可通过使容纳带有阴离子交换基团的结合混合物的容器的至少一部分官能化来提供。在本发明的环境中，这样的阴离子交换改性表面也可用作固相。
如本文中所公开的，优选使用阴离子交换粒子、更优选磁性阴离子交换粒子作为固相。这简化了所述粒子的处理，因为它们可以借助于磁铁来处理，这有利于自动化。因此，本文中涉及包含阴离子交换基团的固相的整个公开内容也特别适用于其中将磁性阴离子交换粒子用作固相的优选实施方案。
所述结合混合物包含含有缓冲剂的酸性结合缓冲液。所述酸性结合缓冲液可与所述生物样品和所述固相以任何次序接触。在实施方案中，所述酸性结合缓冲液首先与所述生物样品混合，然后将得到的混合物与所述固相接触，以制备根据步骤(A)的结合混合物。如实施例中所示，所选择的pH以及所使用的缓冲剂影响非囊泡miRNA与所述固相的阴离子交换表面的结合程度。同时，不损害EV（其包含囊泡miRNA）的结合。因此，根据第一方面的方法允许调节结合条件，如果在优选为体液的所述无细胞或细胞贫化的生物样品中包含EV的话，所述结合条件促进非囊泡RNA和EV的结合。
本发明的酸性结合缓冲液
pH
如本文中所公开和在实施例部分中所显示的，所述结合缓冲液的pH影响非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA是否能够有效地结合到所述阴离子交换表面上还是在所述结合混合物中保持未结合。
在实施方案中，所述结合缓冲液的pH为≤ 5.0、优选≤ 4.5或更优选≤ 4.0。这样的酸性pH确保了所述非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA与所述固相的阴离子交换基团的高效结合。选择所述酸性pH以使目标RNA能够结合，并且所述酸性pH可在1.5至5.0或2.0至5.0的范围内。在实施方案中，所述结合缓冲液的pH在2.5至5.0，优选3.0至4.5或3.0至4.0的范围内。如实施例所示，在如本方法中使用的低酸性pH下，改善了非囊泡RNA的结合。不希望在理论上受到约束，认为本方法中使用的低酸性pH特别是充分削弱了miRNA-蛋白质复合体以使miRNA与所述基质结合。为了确保良好的结合，这样的酸性pH可以由技术人员确定。
如实施例所示，与EV的结合相比，非囊泡RNA（特别是非囊泡miRNA）与所述固相的阴离子交换基团的结合对pH变化更敏感。因此，虽然EV在较宽的酸性pH范围内显示出相似的结合效率，但非囊泡miRNA在较高的pH下的有效结合较低。有利地，在允许有效结合非囊泡miRNA的较低pH下，EV的结合不会受到损害。这种结合行为可以有利地用于建立所述结合混合物中的酸性结合条件，在该条件下，非囊泡miRNA以良好的收率与所述固相的阴离子交换基团结合，同时不损害EV与所述固相的阴离子交换基团的结合。这允许同时结合非囊泡和EV。此外，并且如本文所公开的，这些发现可以用于建立结合条件，在所述结合条件中EV与所述阴离子交换固相结合，同时非囊泡RNA的有效结合较低并因此主要保留在所述结合混合物中。这种可以使用本文中公开的酸性结合条件建立的差异性结合行为可以用于根据第二方面的方法，以在步骤(X)中将EV结合到阴离子交换固相上，同时非囊泡RNA如非囊泡miRNA保留在所述结合混合物中。然后，在后续的步骤(A)中，通过调节所述结合混合物以使非囊泡RNA能够结合（例如，通过降低pH、增加离子强度和/或添加拥挤剂）和/或通过在步骤(A)中使用更强的阴离子交换固相，可以从剩余结合混合物中回收所述非囊泡RNA。详细情况结合根据第二方面的方法来描述。
在实施方案中，步骤(A)中制备的结合混合物的pH为≤ 5.5、≤ 5.0或≤ 4.5。优选地，步骤(A)中的结合混合物的pH为≤ 4。它可以在2.5至5.0，如3.0至4.5或3.0至4.0的范围内。如本文中所公开的，在所述结合混合物中建立相应的酸性pH允许调节所述结合条件并从而允许促进非囊泡RNA的结合。如实施例所证明，在这些条件下不会损害EV的结合。为了维持稳定的pH，步骤(A)中制备的结合混合物的pH优选在所述酸性结合缓冲液的缓冲范围内。
尽管对于许多应用而言，通过将所述生物样品与所述酸性结合缓冲液接触来建立所述结合混合物中的pH是优选的，但是本发明也涵盖了其中在所述生物样品与所述结合缓冲液接触之后调节并由此修改所述结合混合物的pH值的实施方案。因此，根据一个实施方案，调节所述结合混合物的pH值以确保所述结合混合物的pH在预期范围内。合适的pH值如上所述，并参考相应的公开内容。例如，可以手动进行调节。可以确定所述结合混合物的pH值，然后通过添加适当的pH调节物质如酸或碱，将其调节到期望的pH值。如果所述生物样品的pH值异常高或低，这样的程序可能是有利的。然而，优选地，所述结合混合物的pH仅通过添加根据本发明的酸性结合缓冲液来建立。
根据一个有利的实施方案，在步骤(A)中，所述结合混合物的pH低于所述固相的电离形式的阴离子交换基团的pKa。所述结合混合物的pH可以比所述阴离子交换基团的pKa低至少1、至少1.5、至少2或至少2.5个单位。
如本文中所公开的，所述步骤(A)的结合混合物可以通过使所述无细胞或细胞贫化的生物样品与所述酸性结合缓冲液和所述包含阴离子交换基团的固相进行接触来制备。在实施方案中，所述步骤(A)的结合混合物中的结合条件是仅通过将所述生物样品与所述结合缓冲液和所述固相接触来建立的。在实施方案中，所述酸性结合缓冲液在步骤(A)中与所述生物样品接触，样品与结合缓冲液之比选自10:1至1:10之间的范围，优选5:1至1:5、4:1至1:4、3:1至1:3、或2:1至1:2，更优选1:1。因此，所述结合缓冲液的pH是根据样品-缓冲液比来选择的。
缓冲剂
如本文中所公开的，所述酸性结合缓冲液包含缓冲剂。选择缓冲剂使其具有包括所述结合混合物的期望结合pH值在内的缓冲能力，以允许所述非囊泡RNA、例如特别是优选的非囊泡miRNA与所述固相的阴离子交换表面高效结合。原则上，可以使用在所用的酸性pH范围内有效的任何缓冲体系。
在实施方案中，所述步骤(A)的酸性结合缓冲液包含基于羧酸的缓冲剂。根据一个实施方案，所述缓冲剂包含羧酸和所述羧酸的盐。所述羧酸可包含1至3个羧酸基团。在实施方案中，所述缓冲剂包含选自乙酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、丙酸盐、乳酸盐和酒石酸盐的缓冲组分。
根据在实施例中所示的实施方案，所述缓冲剂包含选自乙酸盐和甲酸盐的缓冲组分。如实施例中所证明，乙酸盐和甲酸盐是合适的缓冲剂，当以适当的pH和/或离子强度使用这样的缓冲液时，可以收率良好地有效捕获非囊泡RNA。如果在优选为体液的无细胞或细胞贫化的生物样品中包含EV的话，EV与所述固相的阴离子交换基团的结合不会受到损害，从而可以将EV共同捕获到所述阴离子交换表面上。
在一个有利的实施方案中，所述步骤(A)的酸性结合缓冲液的pH为≤ 4.5、优选pH≤ 4，并且所述结合缓冲液包含乙酸盐或甲酸盐作为缓冲剂。如实施例证明的，乙酸盐和甲酸盐在确保无细胞非囊泡miRNA结合方面特别有效。所述pH可以在2.5至4.5，如3.0至4.0的范围内。在另一个优选实施方案中，所述缓冲组分是乙酸盐。
所述酸性结合缓冲液可包含缓冲剂，所述缓冲剂优选为如上所述的基于羧酸的缓冲剂，其浓度为1M或更低，如0.75M或更低或0.5M或更低。所述酸性结合缓冲液可以例如包含浓度在25 mM至1000 mM、如50mM至750mM、100mM至650mM或200mM至500mM范围内的缓冲剂。合适的浓度也取决于与所述生物样品接触的所述结合缓冲液的体积。如实施例所示，例如1体积的所述结合缓冲液与1体积的所述生物样品混合，所指示的浓度对于这样的1:1定量特别有效。所述结合缓冲液的其它合适浓度可以基于所述无细胞或细胞贫化的生物样品和所述结合缓冲液的这种其它混合比信息来容易地确定。然后，由此产生的结合混合物可以与所述阴离子交换固相接触以结合非囊泡RNA，包括非囊泡RNA和EV。然而，其它接触次序也是可行的，并且在本发明的范围内。
根据一个实施方案，所述结合缓冲液包含缓冲剂，所述缓冲剂优选是如上所述的基于羧酸的缓冲剂，其浓度为至少25 mM，如至少50 mM或至少150 mM，例如至少200 mM。所述步骤(A)的酸性结合缓冲液可包含例如浓度在25mM至650mM、50mM至600mM、150mM至550mM或200mM至500mM范围内的所述缓冲剂。如实施例中所证明，酸性结合缓冲液的pH≤4并且包含的缓冲剂优选为如上所述的基于羧酸的缓冲剂且浓度≥200mM、例如在200mM至500mM范围内，这样的酸性结合缓冲液尤其适合于改善非囊泡miRNA与所述阴离子交换固体载体的结合，同时不损害包含囊泡miRNA的EV的结合。
如本文中所公开的，所述结合混合物通过使所述生物样品与所述酸性结合缓冲液接触来制备，并且所述结合混合物可包括含有阴离子交换基团的固相（如磁性阴离子交换粒子）。因此，已在上面详细描述的酸性结合缓冲液的组分也包含在所述结合混合物中。因而参考上述公开内容。
如上所述，所述酸性结合缓冲液在步骤(A)中与所述生物样品接触，样品与结合缓冲液之比可选自宽泛的范围，优选4:1至1:4，如3:1至1:3或2:1至1:2，更优选1:1。
在实施方案中，所述步骤(A)的结合混合物包含源自所述结合缓冲液的缓冲剂，其浓度为500mM或更低，如300mM或更低、250mM或200mM或更低。所述步骤(A)的结合混合物可包含源自所述酸性结合缓冲液的缓冲剂，其优选为如上所述的基于羧酸的缓冲剂，浓度在10mM至500mM，如20mM至400mM、25mM至300mM或50mM至250mM的范围内。在实施方案中，所述浓度在50mM至200mM的范围内。
任选的非缓冲盐
根据一个实施方案，所述结合缓冲液还包含非缓冲盐。所述结合缓冲液包含作为缓冲剂的缓冲盐和另外的非缓冲盐。所述非缓冲盐可以用于增加离子强度以改善非囊泡RNA、例如特别是非囊泡miRNA的结合。所述盐可以是非离液盐，并优选是一价盐。合适的盐包括碱金属盐，如碱金属卤化物。所述非缓冲盐可选自氯化钠、氯化钾、氯化锂和氯化铯，优选选自氯化钠和氯化钾，更优选如果包含的话，所述非缓冲盐是氯化钠。在步骤(A)中使用的酸性结合缓冲液中的总盐浓度优选为1M或更低，如0.75M或更低或0.5M或更低。所述酸性结合缓冲液中的总盐浓度可以在25mM至1000mM、50mM至750mM、100mM至650mM或200mM至500mM的范围内。在所述步骤(A)的结合混合物中，由于添加所述结合缓冲液和任选的其它试剂而被引入所述结合混合物中的盐的总浓度优选为500mM或更低、400mM或更低或300mM或更低。在实施方案中，这样引入的盐的总浓度为250 mM或更低或200 mM或更低。
拥挤剂
根据一个实施方案，所述结合缓冲液和/或所述结合混合物包含拥挤剂。如实施例中所证明，添加拥挤剂（如PEG）改善了非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA与所述固相的阴离子交换表面的结合。然而，添加拥挤剂不是要求的，因此这是一种可以包含在所述酸性结合缓冲液中并因此可以包含在所述步骤(A)的结合混合物中的任选但有利的组分。
拥挤剂是本领域中已知的。已经记载了几种引起分子拥挤的大分子。实例包括但不限于聚(烷撑氧)聚合物（例如聚乙二醇或聚丙二醇）、葡聚糖、合成聚合物聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、或蛋白质如血清白蛋白（例如BSA）。优选地，所述拥挤剂选自聚(烷撑氧)聚合物和葡聚糖。
在一个有利的实施方案中，所述酸性结合缓冲液包含聚(烷撑氧)聚合物，优选聚乙二醇。所包含的聚乙二醇的分子量可以在5000 Da至40000 Da，如5000至30000 Da、6000至20000 Da或6000至10000 Da的范围内。在实施方案中，所述结合缓冲液包含的聚乙二醇的浓度选自2%至30% (w/v)， 如3%至20% (w/v)或4%至15% (w/v)。在实施例中，使用的浓度为5% (w/v)。
在实施方案中，所述结合缓冲液中拥挤剂的浓度在2%至10% (w/v)，如2.5%至7.5%(w/v)或4%至6% (w/v)的范围内。
所述拥挤剂源自所述步骤(A)的结合混合物中的结合缓冲液或单独添加到所述混合物中，其浓度可以在1%至15%，如1.5% %至10%或2%至5%的范围内。
包含阴离子交换基团的固相
如本文中所公开的，对由于存在阴离子交换基团而提供阴离子交换表面的固相有几种不同的选项。所述固相可以由粒子、膜/过滤器或官能化表面（例如，容纳所述样品的容器的内壁的至少一部分）提供。当确定所述结合混合物中其它组分（如缓冲剂）的浓度时，不考虑所述固相。
所述固相提供阴离子交换表面，并因此在其表面包含阴离子交换基团。所述固相可以例如由多孔分离机构如过滤器或膜提供，或者可以由粒子、优选磁性粒子提供。所述固相优选由粒子或多孔的膜或过滤器提供。特别优选使用包含阴离子交换表面基团的磁性粒子。
根据一个有利的实施方案，采用通过使用更多或更强的阴离子交换基团来增加表面电荷密度或强度是尤其优选的，因为增加表面电荷和/或强度改善了非囊泡RNA与所述固相的结合，特别是非囊泡miRNA与所述固相的结合。
可以使用包含在所述结合条件下携带正电荷的官能团的各种阴离子交换基团，它们提供结合带负电荷的分析物、如非囊泡RNA和EV的能力。根据一个实施方案，在步骤(A)中使用的固相包含含有至少一个伯、仲、叔或季氨基基团的阴离子交换基团。根据一个实施方案，所述固相由粒子如磁性粒子提供，并包含含有至少一个伯、仲、叔或季氨基基团的阴离子交换基团。根据另一个实施方案，所述固相由例如设置在离心柱中的过滤器或膜提供，并包含含有至少一个伯、仲、叔或季氨基基团的阴离子交换基团。所述氨基官能团也可以是杂环或杂芳环的一部分，比如在例如组氨酸或组胺中的咪唑环的一部分。如本文中所公开的，这样的官能团可以作为单体、低聚物或聚合物提供在所述固相的表面，从而在所述粒子表面上提供密度越来越高的正电荷。如实施例所证明，非囊泡miRNA与电荷密度更高的阴离子交换表面结合的倾向显著更高。因此，对于结合非囊泡miRNA，使用提供高电荷密度的阴离子交换基团可能是有利的。
所述阴离子交换基团可以作为配体偶联到所述固相如粒子、膜或其它固相的表面，这是本领域中公知的。
所述固相的表面可包含单一类型的阴离子交换基团，然而，也可使用不同类型的阴离子交换基团。用于结合带电分子如非囊泡RNA（特别是非囊泡miRNA）和EV的合适的阴离子交换基团由单胺、二胺、多胺、和含氮芳族或脂族杂环基团提供。优选地，所述阴离子交换基团包含至少一个氨基基团，优选伯、仲或叔氨基基团。
在实施方案中，所述阴离子交换基团包含选自下式的伯胺、仲胺和叔胺的基团
(R)3N、(R)2NH、RNH2和/或X-(CH2)n-Y
其中
X是(R)2N、RNH或NH2，
Y是(R)2N、RNH或NH2，
R彼此独立地是任选取代的直链、支链或环状的烷基、烯基、炔基或芳基取代基，所述取代基可包含一个或多个杂原子，所述杂原子优选选自O、N、S和P，并且
n为0至20范围内的整数，优选为0至18。
因此，所述阴离子交换基团可具有可电离的、特别是可质子化的基团，并且任选地可具有多于一个可相同或不同的可电离基团。可质子化基团优选是在高pH值下为中性或不带电而在低pH值下质子化从而具有正电荷的化学基团。特别是，所述可质子化基团在非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA与固相发生结合时的结合pH下是带正电荷的。在实施方案中，所述（质子化的）可质子化基团的pKa值在5至13，如6至约12.5或7至约12的范围内。在实施方案中，所述pKa值在8至12或9至11.5的范围内。
合适的阴离子交换基团的实例特别包括氨基基团，如伯、仲和叔氨基基团以及环胺、芳族胺和杂环胺。优选的是叔氨基基团。所述氨基基团可带有烷基、烯基、炔基和/或芳族取代基，包括环状取代基和与氮原子一起形成杂环或杂芳族环的取代基。所述取代基可包含1至20个碳原子，如1至12、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、或1或2个碳原子。它们可以是直链或支链的，并且可包含杂原子如氧、氮、硫、硅和卤素（例如氟、氯、溴）原子。在实施方案中，所述取代基包含不多于4个、更优选不多于3个、不多于2个或不多于1个杂原子。
胺官能团的实例是伯胺如氨甲基（AM）、氨乙基（AE）、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基如二乙基氨基乙基（DEAE）、乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、三甲氨基（TMA）、三乙氨基乙基（TEAE）、直链或支链的聚乙烯亚胺（PEI）、羧化或羟烷基化的聚乙烯亚胺、聚醚胺（jeffamine）、精胺、亚精胺、3-(丙氨基)丙胺、聚酰胺基胺（PAMAM）树枝状聚合物、聚烯丙胺、聚乙烯胺、N-吗啉乙基、聚赖氨酸和四氮杂环烷烃。
在一个实施方案中，作为配体提供在所述固相表面上的阴离子交换基团的每个阴离子交换基团包含1至20、1至15或1至10个可电离基团，如优选的氨基基团。在优选的实施方案中，用于结合非囊泡RNA的固相的阴离子交换基团的每个阴离子交换基团包含1至8、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2个可电离基团，如优选的氨基基团。
如本文中所公开的，所述阴离子交换基团可包含至少一个作为杂环或杂芳族环的一部分的氨基基团。所述氨基基团可以是咪唑环的一部分。所述阴离子交换基团可包含例如组氨酸和/或组胺。根据一个实施方案，所述固相包含与羧基改性的表面偶联的组胺。或者，咪唑羧酸例如4-咪唑乙酸可以与表面例如氨基改性的表面偶联。
根据一个实施方案，所述阴离子交换基团包含组氨酸或组胺。组氨酸基团的数量优选为至少3个或至少4个。根据一个实施方案，所述阴离子交换基团选自：(i) 低聚组氨酸，其中组氨酸单体的数量在4至18，如5至16、6至14、7至13或优选8至12的范围内，和(ii)组胺基团，任选地，其中所述阴离子交换基团的每个阴离子交换基团包含1个组胺基团。
根据一个实施方案，所述阴离子交换基团选自(i) 聚组氨酸和(ii) 包含Bis-Tris基团的阴离子交换基团。根据一个实施方案，所述聚组氨酸中的组氨酸单体数量为至少30个。
在实施方案中，阴离子交换粒子被用作步骤(A)中用于非囊泡RNA结合的固相。磁性粒子是优选的。所述磁性粒子可具有例如亚铁磁性、铁磁性、顺磁性或超顺磁性。通过将磁性纳入形成所述粒子的基本材料例如氧化铁、例如氧化亚铁或氧化铁或磁铁矿中，可以向所述粒子提供磁性。这样的磁性粒子是本领域中公知的，因此本文中不需要详细描述。可以在本发明的环境中使用的阴离子交换粒子包括但不限于用阴离子交换基团官能化的颗粒材料。作为所述粒子的基本材料，可以使用适合于阴离子交换色谱的任何材料，包括但不限于：含硅材料如二氧化硅和聚硅酸材料，硼硅酸盐，硅酸盐，无机玻璃，有机聚合物如聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯、琼脂糖、多糖如纤维素，金属氧化物如氧化铝、氧化镁、氧化钛和氧化锆，金属如金或铂，交联葡聚糖（sephadex），琼脂糖（sepharose），聚丙烯酰胺，二乙烯基苯聚合物，苯乙烯二乙烯基苯聚合物，葡聚糖，及其衍生物；玻璃或二氧化硅。在实施方案中，所述粒子由矿物材料或聚合材料制成或含有矿物材料或聚合材料，如二氧化硅、玻璃、石英、聚乙烯、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸甲酯。重要的是，所述粒子在其表面包含阴离子交换基团并由此提供与非囊泡RNA相互作用的阴离子交换表面。这样的表面可以通过用合适的阴离子交换基团对所述粒子的基础材料进行官能化来提供。对于用阴离子交换基团对粒子进行官能化以提供阴离子交换表面，几种方法是可行的并且为技术人员所知。所述阴离子交换基团可以以共价或非共价即静电的方式直接结合到所述粒子的表面上，和/或可以形成为形成表面包覆层或设置在所述粒子表面的聚合物或其它组合物的一部分。所述阴离子交换基团也可以沉淀在所述粒子上。根据一个实施方案，所述阴离子交换基团以包覆层的形式施加在所述粒子上。优选共价连接所述阴离子交换基团。所述粒子可在其表面包含用于连接所述阴离子交换基团的官能团，例如，诸如Si-O-Si、Si-OH、(聚)硅酸、醇、二醇或多元醇、羧酸酯、胺、磷酸酯或膦酸酯的官能团。所述阴离子交换基团可以例如通过使用环氧化物、（活化的）羧酸、硅烷、酸酐、酰基氯、甲酰基基团、甲苯基（tresyl）基团或五氟苯基基团来连接到所述固相上。所述官能团可以直接连接到所述固相上，或通过（直链或支链的）间隔基、例如烃如-(CH2)n-基团、碳水化合物、聚乙二醇和聚丙二醇连接到所述固相上。在实施方案中，所述固相包含羧基基团，以通过使用基于碳二亚胺的反应、特别是使所述粒子的羧基基团与所述阴离子交换基团中包含的氨基基团反应进行共价连接来连接阴离子交换基团。或者，也可以使用由包含所述阴离子交换基团如氨基官能团的单体构成的聚合物作为阴离子交换材料。在某些实施方案中，所述粒子具有含硅表面，如聚硅酸表面，并且所述阴离子交换基团通过使用合适的有机硅烷如氨基硅烷偶联到所述表面上。
所述阴离子交换基团可包含连接到接头结构上的质子化基团。所述接头可以是直链、支链或环状的亚烷基、亚烯基或亚炔基基团，所述亚烷基、亚烯基或亚炔基基团可包含1至20个碳原子，如1至12、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2个碳原子。它还可包含杂原子如氧、氮、硫、硅和卤素（例如氟、氯、溴）原子，优选不多于4个、更优选不多于3个、不多于2个或不多于1个杂原子。在实施方案中，所述接头基团是亚烷基，特别是亚丙基基团。
根据一个实施方案，所述粒子包含含硅表面、优选聚硅酸表面，所述表面用包含至少一个阴离子交换基团、如所述优选的二烷基氨基烷基基团的硅烷化合物衍生化。涉及使用有机硅烷如氨基硅烷的合适的方法是公知的。
在实施方案中，在步骤(A)中使用的固相的阴离子交换基团包含至少一个可电离基团，其中所述基团可通过质子化而电离，其中所述可电离基团在所述结合混合物的酸性pH下质子化，而在碱性pH下、如在至少8、至少9或至少10的碱性pH下为中性或不带电。在步骤(A)中使用的固相可包含在所述结合混合物的pH下、任选地在pH≤ 5、如pH ≤ 4下每个阴离子交换基团具有单个正电荷的阴离子交换基团。
如本文中所公开的，在步骤(A)中使用的固相的阴离子交换基团和所述结合条件可以进行调节，以建立所述非囊泡RNA与所述固相的阴离子交换基团的结合，同时在这些结合条件下不损害细胞外囊泡与所述固相的阴离子交换基团的结合。在实施方案中，使用磁性阴离子交换粒子，其中为了非囊泡RNA结合，所述磁性粒子的阴离子交换基团由作为咪唑环的一部分的氨基基团提供，优选其中所述氨基基团是组胺的咪唑环的一部分，并且其中所述步骤(A)的酸性结合缓冲液的pH为≤ 5、优选≤ 4。所述缓冲剂可包含选自乙酸盐和甲酸盐的缓冲组分。如上所公开，所述酸性结合缓冲液可包含浓度在25mM至1000mM、50mM至750mM、100mM至650mM或200mM至500mM范围内的缓冲剂，并任选地包含拥挤剂，如PEG或葡聚糖。
所述粒子优选是球形的。所述粒子的平均直径可选自100 nm至35 µm，如150 nm至30 µm、200 nm至25 µm、250 nm至20 µm、300 nm至15 µm或350 nm至10 µm的范围。实例包括400 nm至7.5 µm、450 nm至5 µm、500 nm至3 µm和550 nm至2.5 µm。合适的示例性范围包括但不限于100 nm至10 µm、150nm至7.5µm、200nm至5µm、300 nm至4 µm、500 nm至3.5 µm、550nm至2 µm和600nm至1.5µm。各个尺寸的粒子，特别是较小尺寸如10µm或更小、7.5µm或更小、优选5µm或更小、2.5µm或更小或1.5µm或更小的粒子，易于处理并且可以很好地重悬在所述结合混合物中。此外，各个小粒子提供了可以结合的大表面积，从而可以从所述步骤(A)的结合混合物中有效收集所述非囊泡RNA。
当使用粒子如磁性粒子来进行所述结合步骤时，所述阴离子交换粒子不包含在会阻止所述粒子在所述结合混合物中移动的柱或其它装置中。相反，在容器中包含的所述结合混合物中所述粒子可以移动，例如当搅动所述结合混合物时。因此，必须从所述结合混合物中收集所述粒子以回收结合的非囊泡RNA。根据一个优选的实施方案，所述粒子是磁性的。这简化了所述粒子的处理，因为它们可以借助于磁铁来处理，这有利于自动化。所述粒子可具有亚铁磁性、铁磁性、顺磁或超顺磁性，并且在实施方案中是超顺磁性的。这样的性质可以通过将合适的磁性材料并入到所述粒子中来实现。合适的方法是技术人员所知的。优选地，所述磁性材料例如被用作所述粒子的基础材料的二氧化硅、聚硅酸、玻璃或聚合物材料完全囊封。在某些优选的实施方案中，所述核酸结合基质是含硅粒子，优选聚硅酸粒子，优选携带阴离子交换基团的磁性聚硅酸粒子。
合适的粒子和阴离子交换基团的实例在WO 2010/072834 A1、DE10 2008 063001A1、WO2010072821A1、DE 10 2008 063 003、WO 99/29703和WO0248164中描述，对所述文献进行引用。
添加一定量的所述阴离子交换粒子，使得所述阴离子交换表面的结合容量优选超过所述无细胞或细胞贫化的生物样品中所含的非囊泡RNA（和任选的EV）。这支持了回收的非囊泡RNA的高收率。每毫升样品的合适粒子量（以mg计）的非限制性实例包括0.1mg至10mg、0.15mg至5mg、0.2mg至3.5mg、和0.25mg至3mg。所述合适量尤其取决于要处理的样品体积和所使用的阴离子交换粒子，可以由技术人员确定。
在步骤(A)结束时，非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA与所述阴离子交换固相结合。此外，如果在所述无细胞或细胞贫化的生物样品中包含EV的话，则非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA以及EV结合到所述固相上。
在一个替代实施方案中，在步骤(A)结束时，主要由非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA构成的非囊泡RNA结合到所述固相上。如本文别处详细解释的，这是通过在步骤(A)之前进行EV贫化步骤来实现的。还结合根据第二方面的方法公开了这样的方法。
步骤(A)的合适结合条件如下所述：
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为2.5至3.5、(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂，并使用带有组胺基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为2.5至3.5、(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂，并使用带有His10基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为2.5至3.5、(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂，并使用带有组胺基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为2.5至3.5、(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂，并使用带有His10基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为2.5至3.5、(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂、(iii) 聚乙二醇作为拥挤剂并使用带有组胺基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为2.5至3.5、(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂、(iii) 聚乙二醇作为拥挤剂并使用带有His10基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为2.5至3.5、(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂、(iii) 聚乙二醇作为拥挤剂并使用带有组胺基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为2.5至3.5、(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂、(iii) 聚乙二醇作为拥挤剂并使用带有His10基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为≤ 4、(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂，并使用带有组胺基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为≤ 4、(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂，并使用带有His10基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为≤ 4、(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂，并使用带有组胺基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为≤ 4、(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂，并使用带有His10基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为≤ 4、(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂、(iii) 聚乙二醇作为拥挤剂并使用带有组胺基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为≤ 4、(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂、(iii) 聚乙二醇作为拥挤剂并使用带有His10基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为≤ 4、(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂、(iii) 聚乙二醇作为拥挤剂并使用带有组胺基团的磁性阴离子交换粒子；
-酸性结合缓冲液，所述缓冲液：(i) pH为≤ 4、(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂、(iii) 聚乙二醇作为拥挤剂并使用带有His10基团的磁性阴离子交换粒子。
生物样品
所述无细胞或细胞贫化的生物样品包含无细胞非囊泡RNA、如特别是非囊泡miRNA，并任选地包含含有囊泡RNA的细胞外囊泡。根据一个实施方案，所述无细胞或细胞贫化的生物样品是或源自于体液或细胞培养液。它可以是细胞培养上清液。
特别是，所述包含细胞外非囊泡RNA的无细胞或细胞贫化的生物样品可以是无细胞或细胞贫化的体液样品。所述无细胞或细胞贫化的体液样品优选是或源自于去除细胞的以下样品：全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、汁液（liquor）、脑脊液、滑液、间质液、腹水、乳液、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物。其它体液是汗液和泪液。
在实施方案中，所述无细胞或细胞贫化的生物样品选自血浆、血清、和无细胞或细胞贫化的尿液。根据一个有利的实施方案，选自血浆和血清。如实施例中所证明，本发明的方法尤其适合于从人血浆样品中分离非囊泡RNA。
根据一个实施方案，在步骤(A)之前，所述方法包括从体液样品中去除细胞，从而提供所述无细胞或细胞贫化的生物样品。
在一个实施方案中，所述包含非囊泡RNA、如特别是非囊泡miRNA并任选地包含含有囊泡RNA的细胞外囊泡的生物样品是或源自于细胞培养液，特别是细胞培养上清液。所述生物样品可以是通过去除细胞从细胞培养液获得的样品。
去除细胞的方法是本领域所知的。去除细胞并提供无细胞或细胞贫化的生物样品的常见方法包括但不限于离心、过滤和密度梯度离心。
根据一个实施方案，所述生物样品是EV贫化的。从生物样品中贫化EV的方法在本文中的别处描述，并参考相应的公开内容。如本领域中所知，可以通过以下方法中的至少一种从所述生物样品中分离细胞外囊泡并由此将其贫化：与固相结合、超速离心、超滤、梯度、密度梯度离心、亲和捕获特别是生化亲和捕获、抗体捕获、尺寸排阻色谱、或前述的组合。所有这些方法都可以与本发明结合使用，以提供EV贫化的生物样品，所述生物样品可以如本文所述进一步加工，以便富集并进而分离非囊泡RNA。有许多方案和商业产品可用于细胞外囊泡/外泌体分离，并且为技术人员所知。例如，EV和EV内容物可以使用现有的方法来分离，所述方法例如exoEasy/exoRNeasy、miRCURY外泌体分离试剂盒（或等效物）、超速离心、尺寸排阻色谱、免疫捕获或本领域中已知的其它方法。对于EV的分离，还描述了基于使用体积排阻聚合物如PEG的方法。
根据另一个实施方案，所述无细胞或细胞贫化的生物样品包含无细胞非囊泡RNA、如特别是非囊泡miRNA，以及细胞外囊泡（包含囊泡RNA）。如本文所公开的，当在步骤(A)中处理相应的无细胞或细胞贫化的生物样品时，非囊泡RNA和EV结合到步骤(A)中的固相上。
步骤(B)
在步骤(B)中，从剩余结合混合物中分离所述带有结合的非囊泡RNA的固相。从而收集所述带有结合的非囊泡RNA的固相。为此目的，可以使用本领域中已知的任何手段。合适的手段包括但不限于在使用磁性粒子情况下的磁性分离、在例如使用非磁性粒子情况下的离心、沉降、施加真空、过滤等。当使用膜或其它多孔材料作为固相时，可通过例如重力流动、离心、真空或正压进行分离处理。合适的分离方法为本领域技术人员所知。
在实施方案中，在步骤(B)中分离所述带有结合的非囊泡RNA的固相后，所述方法可以包括
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA。
洗涤步骤
与剩余结合混合物分离后，可以用洗涤缓冲液洗涤带有结合的非囊泡RNA的固相。这样的洗涤步骤可以进行一次或多次。如实施例中所证明，单个洗涤步骤可能就足够了。
根据一个实施方案，在洗涤步骤(C)中，使用洗涤溶液。在有利的实施方案中，使用pH在3.5至6.5、优选4.5至5.5范围内的洗涤缓冲液。根据一个实施方案，所述洗涤缓冲液的pH为≤ 6.5、≤ 6或≤ 5.5。此外，在实施方案中，所述洗涤缓冲液的pH为≥ 3.5、≥ 4或≥4.5。
根据一个实施方案，所述洗涤溶液是包含基于羧酸的缓冲剂的洗涤缓冲液，任选地，其中(i) 所述缓冲剂包含羧酸和所述羧酸的盐，如乙酸盐。在实施方案中，所述洗涤缓冲液包含乙酸盐并且pH为5.0。
根据一个实施方案，所述洗涤缓冲液包含所述缓冲剂，所述缓冲剂的浓度选自(i)0.5M或更低、0.4M或更低、0.35M或更低、或优选0.3M或更低；或(ii) 在50mM至500mM，如100mM至400mM、150mM至350mM或200mM至300mM范围内的浓度。
RNA的回收或纯化
在分离并优选洗涤之后，可以从所述固相中回收、优选洗脱所述非囊泡RNA，特别是非囊泡miRNA。对各种固相、包括（磁性）粒子和膜的合适的洗脱方案是本领域中已知的，并且技术人员可以选择合适的方法。下文也描述了合适的回收和洗脱方案。
根据一个实施方案，在(D)中的回收包括使所述固相与裂解缓冲液接触，并将所述固相与洗脱物分离。如果EV也与所述固相结合并分离，则回收中使用裂解溶液允许释放所述结合的非囊泡RNA和此外的囊泡RNA。如本文中别处所述，相关的分子信息可通过分析存在于细胞外囊泡如外泌体中的RNA分子来获得。EV已被证明含有各种小RNA物种，包括miRNA、piRNA、tRNA（及其片段）、穹窿体RNA、Y RNA、rRNA的片段以及长的非编码RNA，还有mRNA。因此，如果除了非囊泡RNA之外还结合了EV（这通常是在步骤(A)之前没有从所述无细胞或细胞贫化的生物样品中贫化EV时的情况），则回收的RNA包含非囊泡RNA和囊泡RNA。所述裂解溶液可包含离液盐，例如胍盐，如硫氰酸胍。所述裂解溶液还可以包含苯酚。在实施方案中，用于回收的裂解溶液包含离液盐和任选的去垢剂。然后，如果需要，也可以在步骤(E)中从获得的裂解物/洗脱物中进一步纯化所释放的RNA。
使用浓度为1M至3M的硫氰酸胍和浓度为1M至3M的三(羟甲基)氨基甲烷（Trizma碱），可将所述裂解缓冲液的pH调节到pH 7至9、优选7.5至8.5。合适的裂解缓冲液是可商购的（例如QIAzol裂解试剂，QIAGEN，Hilden），并且可以将pH调节到pH 7.5至8.5。根据一个实施方案，所述裂解缓冲液的pH为8，并包含2M的硫氰酸胍和2M的三(羟甲基)氨基甲烷（Trizma碱）。如实施例中所证明，这样的裂解缓冲液适用于溶解核蛋白复合体和裂解结合的包含囊泡RNA的EV。随后，可以通过标准方法（例如miRNeasy试剂盒、exoRNeasy试剂盒，QIAGEN，Hilden）从获得的洗脱物中分离非囊泡来源的miRNA和囊泡来源的miRNA。
非囊泡RNA也可以通过使用一种或多种洗脱溶液洗脱。所述非囊泡RNA可以通过使用允许所述细胞外RNA可被直接分析的洗脱溶液来洗脱。
根据一个实施方案，洗脱涉及提高pH值。因此，洗脱可以例如在高于结合pH的洗脱pH下发生。例如，可以提高洗脱期间的pH，使其超过所述阴离子交换基质的pKa（例如，超过≥1的pH步长）。所述洗脱pH优选为≥ 7.0或≥ 7.5。根据一个实施方案，所述洗脱溶液具有碱性pH，优选为至少8.0、至少8.3或至少8.5。在实施方案中，所述洗脱溶液的pH为≤ 9.5或≤ 9.0。根据一个实施方案，所述洗脱溶液包含缓冲剂，所述缓冲剂任选地选自Tris、HEPES、HPPS或氨缓冲剂，优选Tris。
此外，离子强度可以用于辅助或影响所述洗脱。根据一个实施方案，所述洗脱溶液中的总盐浓度为至少500mM，如至少750mM、至少1M或至少1.2M。当使用更强地结合RNA的阴离子交换固相时，这样的盐浓度可能是有利的。例如，强结合所述RNA的基于聚乙烯亚胺或基于聚组氨酸的阴离子交换粒子可能需要包含这样的较高盐浓度的洗脱溶液。
根据一个实施方案，所述洗脱溶液中的总盐浓度为500mM或更低，如250mM或更低、200mM或更低、150mM或更低、或100mM或更低，任选地50mM 或更低。根据一个特定的实施方案，所述洗脱溶液包含选自5至250 mM的盐浓度。例如，所述洗脱溶液可包含200mM至10mM的盐，特别是200mM至10mM的Tris。这样的洗脱溶液可具有如上所述的较高pH以帮助洗脱。
也可以通过加热和/或振荡来帮助洗脱。加热步骤可改善洗脱和/或允许使用包含较少盐的洗脱溶液，这可以有利地允许直接使用所获得的RNA进行分析，避免了后续的净化，例如通过去除盐。
如上文已经指出的，所述包含结合的非囊泡RNA和任选的结合的细胞外囊泡的固相可以在步骤(D)中与作为提取或裂解试剂的溶液接触以便进行回收，任选地其中所述洗脱溶液包含苯酚和/或包含离液盐，所述离液盐任选地选自胍盐、硫氰酸盐、碘盐、高氯酸盐、三氯乙酸盐和三氟乙酸盐。任选地，这样的洗脱溶液的pH为至少7.5或至少8。
回收步骤(D)也可包含一个或多个子步骤。根据一个实施方案，所述固相包含结合的非囊泡RNA和囊泡RNA，回收步骤(D)包括(aa) 在至少一种去垢剂的存在下裂解所述结合的细胞外囊泡并将释放的囊泡RNA结合到所述阴离子交换固相上，使得非囊泡RNA和释放的囊泡RNA都结合到所述固相上。有利地，所述用于EV裂解的去垢剂基本上不抑制所述释放的囊泡RNA与所述固相的阴离子交换基团的结合。因此，为使所述释放的囊泡RNA与所述固相的阴离子交换基团能够结合，不需要去除所述去垢剂。步骤(D)还可包括(bb) 洗涤所述结合后被释放的囊泡RNA和非囊泡RNA。步骤(D)还可包括(cc) 从所述阴离子交换固相中洗脱所述结合后被释放的囊泡RNA和非囊泡RNA。合适的洗脱溶液如上所述并且包括例如提高pH和/或离子强度以从所述阴离子交换固相释放所述结合的RNA。子步骤(aa)可包括将分离的包含所述结合的非囊泡RNA和结合的细胞外囊泡的阴离子交换固相与酸性裂解试剂接触，所述酸性裂解试剂包含所述至少一种适合于裂解细胞外囊泡的去垢剂，使得囊泡RNA被释放到裂解物中。本领域中也公开了细胞外囊泡的基于去垢剂的裂解（参见，例如Osteikoetxea等，Org Biomol Chem 2015 Oct 14；13 (38)：9775）。在所述裂解和重结合步骤中，可以根据去垢剂的选择来选择去垢剂的浓度，以实现细胞外囊泡的高效裂解和重结合。在步骤(aa)中用于裂解所述细胞外囊泡的所述至少一种去垢剂可选自非离子表面活性剂和阴离子去垢剂。不受理论的约束，当非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂提供在所述裂解混合物中时，被认为不干扰或基本上不干扰所述释放的RNA和所述阴离子交换粒子的结合。根据一个特定的实施方案，所述用于细胞外囊泡裂解的去垢剂选自Triton X-100、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸盐、十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl）和/或Ecosurf SA-9。所述酸性裂解试剂具有促进所述释放的囊泡RNA与所述固相的阴离子交换基团结合的酸性pH，从而实现非囊泡RNA和释放的囊泡RNA与所述固相的结合。根据一个优选的实施方案，所述酸性裂解试剂的pH在2.5至5.5，如2.7至5.3、3至5或3至4.7的范围内。所述酸裂解试剂的pH可以在3.5至4.5的范围内，如4.0。它可包含缓冲剂，如基于羧酸的缓冲剂，任选地是乙酸盐。所述缓冲剂可以以≤500mM、如≤450mM、≤400mM、≤350mM、优选≤300mM或≤250mM的浓度存在于所述酸性裂解试剂中。根据一个实施方案，步骤(D)中使用的酸性裂解试剂不包含离液盐和/或有机溶剂。根据一个优选的实施方案，步骤(aa)包括添加蛋白酶。所述蛋白酶可以有利地帮助裂解，并因此改善所述囊泡RNA的收率，并且还可以支持仍然与所述非囊泡RNA缔合的任何蛋白质的降解。不受理论的约束，蛋白酶，如蛋白酶K，被认为使在回收期间可能存在的降解酶失活。此外，可以去除污染物，例如与所述阴离子交换基团或固相结合的蛋白质。根据一个优选的实施方案，所述蛋白酶（protease）是蛋白质酶（proteinase），优选蛋白酶K。这样的蛋白酶消化步骤也可以在本方法的其它步骤中进行，例如在结合步骤(A)期间和/或在洗涤步骤(C)期间进行。步骤(D)的子步骤(aa)还可以包括温育所述裂解混合物以使结合的细胞外囊泡裂解，并将释放的囊泡RNA直接结合到所述阴离子交换基团上，以提供带有结合的非囊泡RNA和囊泡RNA的固相。根据一个特定的实施方案，温育是在室温或更高温度下进行的。例如，可以发现适合提高温度使得添加的蛋白酶更具活性，例如通过加热到30℃或更高、35℃或更高、40℃或更高或45℃或更高的温度。本领域中可以由技术人员容易地找到合适的温度。对于步骤(D)的子步骤(bb)和(cc)，可使用如上所述的洗涤和洗脱条件。用于裂解EV和将释放的囊泡RNA重结合到所述固相的阴离子交换基团上以及随后的洗涤和洗脱步骤的合适的实施方案也公开在PCT申请PCT/EP2020/086585中，该申请要求我们引用的欧洲申请19216752.6的优先权。
根据一个实施方案，回收步骤(D)不涉及在至少一种去垢剂的存在下裂解结合的细胞外囊泡。根据一个实施方案，回收步骤(D)不涉及在至少一种去垢剂存在下裂解结合的细胞外囊泡并将释放的核酸、如优选RNA结合到所述阴离子交换固相上。
在实施方案中，所述方法包括
(E)从洗脱物中纯化RNA。
如本文中所公开的，在回收步骤(D)中得到的洗脱物包含非囊泡RNA。如果细胞外囊泡也在步骤(A)中结合到所述固相上，则它还可包含囊泡RNA。在这种情况下，非囊泡RNA和囊泡RNA被回收在一个级分中。然而，如果将细胞外囊泡预先贫化（例如，使用根据本发明的顺序方法），则所获得的洗脱物将主要包含非囊泡RNA。无论怎样，都可使用任何RNA分离方法进一步纯化所包含的RNA。合适的方法是本领域中已知的和可商购的。进一步纯化所获得的RNA可以有利于下游分析用途。如有必要，可使用纯化步骤(E)进一步净化所述回收的RNA，这对于涉及需要特别纯的RNA输入材料的方法的下游分析是有利的。然而，本文中公开了不需要进一步净化的步骤(D)的回收选项。
ExoRNasy Midi/Maxi试剂盒（QIAGEN，Hilden）提供了一种具体的回收和纯化方案，所述试剂盒可以纳入包括使用包括粒子和膜在内的各种固相的本发明方法中。在带有结合的非囊泡RNA和任选的包含囊泡RNA的EV的固相分离之后，将基于苯酚/硫氰酸胍的裂解缓冲液（例如QIAzol裂解试剂，QIAGEN，Hilden）添加到所述固相中。之后，所述洗脱物可用于进一步处理，如RNA纯化。在使用粒子作为固相的情况下，应进行约2分钟至5分钟的温育步骤，任选地通过搅动所述样品来进行。随后，可以收集上清液用于进一步的RNA纯化。或者，在膜、例如离心柱中的膜用作固相的情况下，对管子进行离心，随后收集穿流液以供进一步处理。将所述样品搅动、例如涡旋，并温育约2分钟至5分钟。所述裂解缓冲液溶解核蛋白并裂解EV，从而释放miRNA。接下来，向所述洗脱物、例如上清液或穿流液添加氯仿，并搅动、例如涡旋所述样品。随后，将所述样品温育约2分钟至5分钟，然后离心以去除苯酚。离心后，所述样品分成三个相：含有RNA的上部无色水相；薄的白色中间相；和下部的红色有机相。回收所述包含源自非囊泡RNA和任选的源自囊泡RNA的miRNA的水相，并添加乙醇。将所述样品转移到离心柱（例如RNasy离心柱，QIAGEN，Hilden）以结合所述RNA。几个洗涤步骤后，可以用无RNA酶的水洗脱所述RNA。
所获得的和任选进一步纯化的RNA可使用分子方法进行分析。在实施方案中，本发明的方法包括使用回收的非囊泡RNA、如非囊泡miRNA作为模板进行逆转录和任选进行扩增反应。此外，富集的囊泡RNA（例如，与非囊泡RNA一起作为一个级分获得或作为分开的级分提供）可以被逆转录和任选被扩增以供分析目的。在实施方案中，所述逆转录和扩增反应是定量RT-PCR。
例如，可以定量miRNA-16或miRNA-122的量来研究非囊泡miRNA的分离性能。另外，可以定量let-7a或miRNA-150的量来研究囊泡miRNA的分离性能。
细胞外囊泡（EV）贫化的生物样品
根据一个实施方案，在步骤(A)之前进行EV贫化步骤以提供生物样品。用于从无细胞或细胞贫化的生物样品中富集并由此分离EV的合适的方法是本领域中已知的，并且在本文中的别处也进行了描述。这些方法可以用于提供细胞外囊泡（EV）贫化的无细胞或细胞贫化的生物样品，所述生物样品可以在步骤(A)中用于制备所述结合混合物。
在实施方案中，在步骤(A)中的制备之前，所述方法还包括
(i)使所述生物样品与第一固相接触，其中所述包含囊泡RNA的细胞外囊泡结合到第一固相上，其中所述第一固相与步骤(A)的固相具有相同类型或不同类型；
(ii)使带有结合的包含囊泡RNA的细胞外囊泡的第一固相与剩余的生物样品分离，其中所述剩余生物样品是包含细胞外非囊泡RNA的细胞外囊泡贫化的生物样品。
根据该实施方案，所述生物样品与第一固相接触。在一个有利的实施方案中，所述第一固相与在步骤(A)中使用的固相的类型相同。
根据一个实施方案，所述方法还包括
(iii)从所述第一固相中回收、优选洗脱所述细胞外囊泡RNA。
根据该实施方案，类似于如上所述的裂解步骤来裂解如此贫化并由此回收的EV，以在回收步骤(D)中释放所述囊泡RNA、特别是囊泡miRNA。随后，或并行地，可以根据步骤(A)和(B)进一步处理所述细胞外囊泡贫化的生物样品。
细胞贫化的生物样品
在实施方案中，所述方法包括在步骤(A)之前从体液样品中去除细胞，从而提供细胞贫化或无细胞的体液样品作为包含非囊泡RNA的生物样品（包括非囊泡RNA和包含囊泡RNA的细胞外囊泡），然后在步骤(B)中与所述结合缓冲液和所述固相接触以制备所述结合混合物。将含细胞的体液分离成即至少一个含细胞级分和即至少一个细胞贫化级分的方法是本领域中公知的，因此不需要详细描述。常用的方法包括但不限于离心、过滤和密度梯度离心。不同的方法也可以组合。进行所述方法以便保留所包含的细胞的完整性。这是有利的，因为分离期间的细胞破碎会使例如所述细胞贫化级分中包含的细胞外核酸被从破坏的细胞中释放的细胞核酸污染。
自动化
根据本发明的方法可以手动进行，或通过使用自动化系统进行。自动化系统特别具有可以同时处理许多样品的优点，并且自动化系统不容易出错，因为避免了操作错误。在要处理大量样品的情况下，这是一个特别的优点，而在许多实验室中，为医疗和/或诊断目的对样品进行分析就是这样的情况。本方法特别适合于自动化。因此，根据一个实施方案，所述方法使用自动化系统来进行。在该实施方案中，优选使用选自磁性粒子的固相，因为这简化了所述处理。借助于磁场，例如通过使用永磁体，可以容易地处理所述包含结合的分析物的磁性粒子。该实施方案例如与能够处理磁性粒子的已建立的机器人系统相容。在此，本领域中使用的不同机器人系统可以结合本方法使用。由于相应的系统是现有技术中公知的并且也是可商购的（例如，QIAsymphony®，QIAGEN，HILDEN），因此它们不需要在此进行任何详细描述。在另一种用于处理磁性粒子的替代系统中，包含所述磁性粒子的样品被吸入吸管尖端，并通过施加磁体到例如吸管尖端的侧面而将所述磁性粒子收集在所述吸管尖端中。然后，可以将剩余的样品从所述吸管尖端释放，同时收集的磁性粒子由于所述吸管尖端中的磁体而保留。然后可以对收集的磁性粒子进行进一步处理。这样的系统也是现有技术中公知的并且也是可商购的（例如，BioRobot EZ1，QIAGEN，HILDEN），因此不需要在此进行任何详细描述。
根据第二方面的方法
根据第二方面，提供了一种从包含细胞外囊泡和非囊泡RNA的无细胞或细胞贫化的生物样品中顺序富集细胞外囊泡和非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的方法，其中所述方法包括
(X)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，和
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
-并使细胞外囊泡结合到包含阴离子交换基团的固相上；
将带有结合的细胞外囊泡的固相与剩余结合混合物分离，其中所述剩余结合混合物包含非囊泡RNA；
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述包含非囊泡RNA的剩余结合混合物，和
-任选的包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
-并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与(A)的剩余结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)任选地从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA。
根据第二方面的方法通过在步骤(X)中将包含囊泡RNA的细胞外囊泡结合到固相上并将带有结合的细胞外囊泡的第一固相与剩余生物样品（细胞外囊泡（EV）贫化的包含非囊泡RNA的生物样品）分离，从而允许顺序分离囊泡和非囊泡RNA，特别是miRNA。然后在步骤(A)中修改所述结合条件。根据一个实施方案，所述结合条件通过制备结合混合物来改变，所述结合混合物包含所述细胞外囊泡贫化的剩余结合混合物、阴离子交换固相和包含缓冲剂的酸性结合缓冲液。根据另一个实施方案，所述结合条件通过使用不同的阴离子交换固相来修改，所述不同的阴离子交换固相例如包含比在步骤(X)中使用的固相的阴离子交换基团更强的阴离子交换基团，以在步骤(A)中如此修改的结合条件下实现非囊泡RNA、例如特别是非囊泡miRNA的结合。在该实施方案中，为了与步骤(X)相比改变所述结合混合物的化学组成，不一定要在步骤(A)中添加第二酸性结合缓冲液。在这种情况下，步骤(A)中的制备结合混合物可以简单地包括将在步骤(X)中获得的剩余结合混合物与更强的阴离子交换固相接触以实现包含在所述结合混合物中的非囊泡RNA的结合，这也如实施例中所证明。此外，这些选项也可以组合。在步骤(A)中使用的修改的结合条件促进了非囊泡RNA结合到所述包含阴离子交换基团的固相上。这可以如同所解释的那样，通过在步骤(A)中使用与在步骤(X)中使用的不同的酸性结合缓冲液和/或不同的阴离子交换固相来实现。之后，将带有结合的非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA的固相与剩余结合混合物分离。然后，还可以如上文结合第一方面的方法所述，从所述固相中回收所述非囊泡RNA。此外，在步骤(A)中结合的EV、相应地所含的囊泡RNA也可使用结合第一方面描述的回收方法从所述固相中回收。优选地，所述囊泡RNA和非囊泡RNA被洗脱，并由此作为分开的级分被回收。
根据一个实施方案，在步骤(X)和步骤(A)中，使用不同的酸性结合缓冲液。根据一个实施方案，在步骤(A)中使用的酸性结合缓冲液与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液的不同之处在于以下特征中的一个或多个：
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂。
如实施例中所证明，在步骤(A)和步骤(X)中使用不同的结合缓冲液允许在步骤(A)中高效结合非囊泡RNA，所述非囊泡RNA在步骤(X)（其中结合细胞外囊泡）中不结合或结合程度显著较低。
现在将详细描述根据第二方面的方法的各个步骤和优选实施方案。
步骤(X)
步骤(X)包括制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述细胞贫化或无细胞的生物样品，和
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使细胞外囊泡结合到包含阴离子交换基团的固相上；
以及将带有结合的细胞外囊泡的固相与剩余结合混合物分离，其中所述剩余结合混合物包含非囊泡RNA。
所述细胞贫化或无细胞的生物样品已在本文中的别处结合根据第一方面的方法进行描述并参考相应的公开内容。
在步骤(X)中使用的第一固相可以由粒子、优选磁性粒子提供，或由膜或其它多孔载体材料提供。在酸性结合缓冲液的存在下允许结合细胞外囊泡的包含阴离子交换基团的合适的固相，如粒子和膜，在本文中的别处结合根据第一方面的方法进行描述并且参考在此也适用的相应公开内容。可以用于步骤(X)中以实现优先结合细胞外囊泡、同时非囊泡RNA如非囊泡miRNA主要保留在所述结合混合物中而不与所述固相结合的合适的酸性结合缓冲液，结合根据第一方面方法进行描述。如在实施例中解释和证明的，步骤(X)和步骤(A)中可使用相同类型的酸性结合缓冲液，例如，如果步骤(X)中使用较弱的阴离子交换固相的话。此外，如果pH的酸性较低和/或如果离子强度下降，则非囊泡RNA与所述阴离子交换固相的结合减少。用于将细胞外囊泡结合到所述阴离子交换固相上、同时至少相当一部分非囊泡RNA保持不结合的合适的结合条件也在实施例中描述，并且可以由技术人员根据本文中提出的教导来确定。
此外，在步骤(X)中将带有结合的细胞外囊泡的固相与剩余的生物样品分离，其中所述剩余的生物样品是包含非囊泡RNA、特别是非囊泡miRNA的细胞外囊泡贫化的生物样品。
分离程序是本领域中已知的并在本文中的别处讨论，并且取决于在步骤(X)中使用的固相的类型。所述第一固相的类型可以不同于所述第二固相的类型。在优选的实施方案中，所述第一固相和所述第二固相的类型相同。
步骤(A)和(B)
根据第二方面的方法的步骤(A)和(B)可基本上对应于根据第一方面的方法的步骤(A)和(B)。因此，参考相应的公开内容，该内容也适用于根据第二方面的方法。
下面描述合适的实施方案。
步骤(A)的固相可以是与步骤(X)的固相相同或不同类型的。如本文中所公开的，在步骤(A)中使用带有更强阴离子交换基团的固相允许非囊泡RNA结合到所述固相上且不改变在步骤(X)中获得的剩余结合混合物的化学组成。所述包含非囊泡RNA的剩余结合混合物可以简单地与允许从所述剩余结合混合物中结合非囊泡RNA的不同固相接触。例如，为此目的，可使用更强的阴离子交换固相。
因此，根据一个有利的实施方案，步骤(A)包括使用与在步骤(X)中使用的阴离子交换固相不同的阴离子交换固相，从而与步骤(X)相比，在步骤(A)中改善了非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的结合。根据一个实施方案，在步骤(A)中使用的固相与在步骤(X)中使用的固相的不同之处在于
(i) 它包含更多的阴离子交换基团；和/或
(ii) 它包含更强的阴离子交换基团。
如本文中的别处所述，在步骤(A)中，利用阴离子交换基团的表面电荷密度或强度的增加改善了非囊泡RNA与所述固相的结合。
如本文中所公开的，在步骤(A)中改变所述剩余结合混合物的化学组成以实现所述非囊泡RNA的结合也在本发明的范围内。例如，在步骤(X)中获得的包含非囊泡RNA的剩余结合混合物可通过修改下列中的一项或多项来制备步骤(A)的结合混合物，以在步骤(A)中实现非囊泡RNA与所述阴离子交换固相的结合。这样的修改可包括：
(i) 降低pH；
(ii) 增加离子强度；和/或
(iii) 添加拥挤剂。
在步骤(A)中，可以通过将在步骤(X)中获得的包含非囊泡RNA的剩余结合混合物与具有(i)较低的酸性pH、(ii)包含盐以增加离子强度和/或(iii)包含拥挤剂如PEG的溶液接触，来准备这样修改的结合条件。合适的pH值、盐和拥挤剂以及盐和聚集剂的合适浓度结合根据第一方面的方法的步骤(A)来详细描述，并且为了简明起见，参考相应的公开内容。
根据一个实施方案，在根据第二方面的方法的步骤(A)中制备所述结合混合物包括将从步骤(X)获得的包含非囊泡RNA的剩余结合混合物与不同于在步骤(X)中使用的结合缓冲液的酸性结合缓冲液接触。如本文中所公开的，作为阴离子交换固相，可以在步骤(A)中使用相同类型或不同类型（例如，包含更强的阴离子交换基团和/或提供不同的形式）来结合所述非囊泡RNA。
因此，根据一个实施方案，在步骤(X)和步骤(A)中使用不同的酸性结合缓冲液。根据一个实施方案，在步骤(A)中使用的酸性结合缓冲液与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液的不同之处在于以下特征中的一个或多个：
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂。
如实施例中所证明，在步骤(A)和步骤(X)中使用不同的结合缓冲液允许在步骤(A)中高效结合非囊泡RNA，所述非囊泡RNA在步骤(X)（其中结合细胞外囊泡）中不结合或结合程度显著较低。
特别是，在根据第二方面的方法的步骤(A)中也可使用上述结合根据第一方面的方法描述的相同的酸性结合缓冲液。参考也适用于此的相应的公开内容。
其它实施方案
在实施方案中，步骤(X)还包括
- 任选地洗涤分离的固相，以及
-从分离的固相中回收细胞外囊泡和/或所述细胞外RNA中所含的囊泡RNA。
根据一个实施方案，回收结合到(X)的第一固相上的所述细胞外囊泡的囊泡RNA。在优选的实施方案中，回收包含在分离的细胞外囊泡中的囊泡RNA包括使所述固相与裂解缓冲液接触，任选地其中所述裂解缓冲液包含硫氰酸胍，以及使所述固相与包含囊泡RNA的洗脱物分离。该回收步骤的细节已在上面结合步骤(D)进行了描述，并且我们参考相应的公开内容。可以使用相同的回收步骤来回收包含在所述细胞外囊泡中并在步骤(X)中结合到所述固相上并与所述固相分离的所述囊泡RNA。
回收所述细胞外囊泡和/或包含在所述细胞外RNA中的囊泡RNA可以与(D) 任选地从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA以任何次序进行或并行进行。
根据一个实施方案，在步骤(X)和步骤(A)中使用相同类型的固相。有利地，在步骤(X)和步骤(A)中可以使用相同的包含阴离子交换基团的固相。通过调节步骤(X)中的结合条件，可以建立步骤(X)中细胞外囊泡的优先结合条件，使得细胞外囊泡在步骤(X)中结合到所述固相上，而非囊泡RNA在步骤(X)中至少部分保留在所述结合混合物中并且不被捕获到所述固相上。优选地，在步骤(X)中选择结合条件，使得非囊泡RNA主要不在步骤(X)中结合，从而可以在步骤(A)中从剩余结合混合物中回收。本文中公开了合适的结合条件并在实施例中说明。优选地，所述固相由粒子、优选磁性粒子提供。合适的实施方案在上文结合根据第一方面的方法描述。在步骤(X)和步骤(A)中使用相同的固相，如包含阴离子交换基团的磁性粒子，允许提供可以在步骤(X)和步骤(A)中使用的单个磁性粒子容器。这是有利的，因为它促进了自动化。在不同的实施方案中，在步骤(X)和步骤(A)中使用不同的固相。在这种情况下，优选在步骤(A)中使用的固相与在步骤(X)中使用的固相的不同之处在于(i)它包含更多的阴离子交换基团；和/或(ii)它包含更强的阴离子交换基团。例如，季阴离子交换基团为非囊泡RNA、如非囊泡miRNA提供了非常强的结合亲和力。其它合适的实例在本文中的别处并特别是结合根据第一方面的方法进行描述。此外，在步骤(X)和步骤(A)中可以使用不同形式的固相，例如在一个结合步骤中使用磁性粒子而在另一个结合步骤中使用膜。
此外，包含阴离子交换基团的固相也可通过在步骤(A)中用阴离子交换基团对容纳所述生物样品/结合混合物的容器的至少一部分进行官能化来提供。这样的固相也可以在步骤(X)中使用。
随后，可使用如上文对所述第一方面的方法所述的可商购的方法（例如，miRNeasy试剂盒，QIAGEN，Hilden），从所述级分（囊泡miRNA和非囊泡miRNA）各自分离出所述RNA，优选miRNA。然后，可以各自分析分离的囊泡RNA和非囊泡RNA，例如通过定量RT-PCR进行分析。
根据第三方面的试剂盒
根据第三方面，提供了一种用于执行根据第一和第二方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含缓冲剂的酸性结合缓冲液；
(b)包含阴离子交换基团的固相，所述固相适合于在由所述酸性结合缓冲液(a)建立的条件下结合非囊泡RNA；
(c)任选的洗涤缓冲液；和
(d)任选的回收溶液。
有利地，所述试剂盒可以配备不同的缓冲液组和/或不同的包含阴离子交换基团的固相，其允许使用者在富集非囊泡RNA作为单独的级分或富集包含非囊泡RNA和囊泡RNA在内的所有细胞外RNA之间进行选择。此外，如本文中所公开的，也可以将细胞外囊泡或囊泡RNA作为分开的组分进行富集。因此，根据本发明的试剂盒为用户提供了极大的灵活性。
在实施方案中，所述试剂盒包含
(x)包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，其中所述酸性结合缓冲液(x)不同于所述酸性结合缓冲液(a)，其中优选地，所述酸性结合缓冲液(a)与所述酸性结合缓冲液(x)的不同之处在于以下特征中的一个或多个
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂。
在步骤(X)和(A)中使用不同结合缓冲液的优点已经在本文中的别处描述并参考相应的公开内容。
根据一个实施方案，所述试剂盒包含
(b’)不同于所述固相(b)的包含阴离子交换基团的第二固相，其中优选地，所述固相(b)与固相(b')的不同之处在于：(i) 它包含更多的阴离子交换基团；和/或(ii)它包含更强的阴离子交换基团。
在步骤(X)和(A)中使用不同结合固相的优点已经在本文中的别处描述并参考相应的公开内容。
根据一个实施方案，所述试剂盒包含结合缓冲液(x)和第二固相(b’)，其中第二固相(b’)适合于在由所述酸性结合缓冲液(x)建立的条件下结合细胞外囊泡。
如本文中所述，结合缓冲液(x)与固相(b’)相结合使用允许建立下述的结合条件，该结合条件允许有效且优先地将细胞外囊泡捕获到所述固相，同时非囊泡RNA不结合或结合不太好，从而保留在所述结合混合物中。然后，可以使用结合缓冲液(a)和固相(b)从细胞外囊泡贫化的剩余结合混合物中回收所述非囊泡RNA。此外，如本文中所公开的，也可以在所述试剂盒中使用相同的固相(b)，并且仅提供不同的结合缓冲液(x)和(a)来建立不同的结合条件，从而允许顺序分离出细胞囊泡和非囊泡RNA。这有利地允许在不同级分中回收囊泡RNA和非囊泡RNA用于随后的分析。
根据一个实施方案，所述试剂盒具有以下特征中的一个或多个：
(i)所述酸性结合缓冲液(a)具有根据本发明限定的特征中的一个或多个，
(ii)所述固相(b)具有根据本发明限定的特征中的一个或多个，其中优选所述固相由磁性粒子提供；
(iii)所述洗涤缓冲液(c)具有根据本发明限定的特征中的一个或多个；和/或
(iv)所述回收溶液(d)是包含硫氰酸胍的裂解溶液。
此外，所述试剂盒可包含结合根据第一方面的方法描述的回收/洗脱溶液。
根据第四方面的用途
根据第四方面，提供了包含缓冲剂的酸性结合缓冲液在分离生物样品中包含的细胞外RNA中的用途，其中在所述缓冲剂的存在下，所述细胞外RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上。所述结合缓冲液可以如结合所述第一方面的方法所定义的，并且参考相应的公开内容。
根据一个实施方案，所述用途包括执行根据第一或第二方面的方法。根据一个实施方案，所述用途包括顺序分离(i) 细胞外囊泡miRNA和(ii) 细胞外非囊泡miRNA。根据一个替代实施方案，所述用途包括同时分离(i) 细胞外囊泡miRNA和(ii) 细胞外非囊泡miRNA。
其它实施方案
下面再次并更详细地描述本发明的实施方案。本发明特别是公开并提供了以下各项：
1. 一种从包含非囊泡RNA和任选的细胞外囊泡的无细胞或细胞贫化的生物样品中富集非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的方法，其中所述方法包括
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与所述结合混合物分离。
2. 根据第1项所述的方法，其中所述方法包括
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA。
3. 根据第1或2项所述的方法，其中所述无细胞或细胞贫化的生物样品包含细胞外囊泡，并且其中步骤(A)包括将非囊泡RNA和细胞外囊泡结合到所述固相上，以及步骤(B)包括将带有结合的非囊泡RNA和结合的细胞外囊泡的固相与所述结合混合物分离。
4. 根据第2和3项所述的方法，其中步骤(D)包括从所述固相回收非囊泡RNA和细胞外囊泡、或非囊泡RNA和提取的囊泡RNA。
5. 根据第1或2项所述的方法，其中所述无细胞或细胞贫化的生物样品是细胞外囊泡贫化的。
6. 一种从包含细胞外囊泡和非囊泡RNA的无细胞或细胞贫化的生物样品中顺序富集细胞外囊泡和非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的方法，其中所述方法包括
(X)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，和
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使细胞外囊泡结合到包含阴离子交换基团的固相上；
将带有结合的细胞外囊泡的固相与剩余结合混合物分离，其中所述剩余结合混合物包含非囊泡RNA；
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物，
-任选的包含缓冲剂的酸性结合缓冲液；
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与(A)的剩余结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)任选地从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA。
7. 根据第6项所述的方法，其中步骤(A)中的制备结合混合物包括将在步骤(X)中获得的包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物与不同于在步骤(X)中使用的固相的阴离子交换固相接触。
8. 根据第6或7项所述的方法，其中步骤(A)中的制备结合混合物包括修改在步骤(X)中获得的包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物，以实现非囊泡RNA结合到在步骤(A)中使用的阴离子交换固相上，其中修改包括以下一种或多种
(i) 降低pH；
(ii) 增加离子强度；和/或
(iii) 添加拥挤剂，如聚乙二醇。
9. 根据第7项所述的方法，其中所述结合混合物的化学组成与步骤(X)相比没有改变，并且其中通过使用不同的阴离子交换固相来实现非囊泡RNA的结合。
10. 根据第6至8项中的任一项所述的方法，其中步骤(A)包括将从步骤(X)获得的包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物与包含缓冲剂的酸性结合缓冲液接触以制备所述结合混合物，其中在步骤(X)和步骤(A)中使用不同的酸性结合缓冲液。
11. 根据第6至8或第10项中的任一项所述的方法，其中步骤(A)包括将在步骤(X)中获得的包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物与不同于在步骤(X)中使用的固相的阴离子交换固相接触并与包含缓冲剂的酸性结合缓冲液接触以制备所述结合混合物，其中在步骤(X)和步骤(A)中使用不同的酸性结合缓冲液。
12. 根据第10或11项所述的方法，其中在步骤(A)中使用的酸性结合缓冲液与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液的不同之处在于以下特征中的一个或多个：
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂。
13. 根据第6至12项中的任一项所述的方法，其中步骤(A)包括使用与在步骤(X)中使用的阴离子交换固相不同的阴离子交换固相，使得与步骤(X)相比，在步骤(A)中改善了非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的结合。
14. 根据第6至13项中的任一项所述的方法，其中在步骤(A)中使用的固相与在步骤(X)中使用的固相的不同之处在于
(i) 它包含更多的阴离子交换基团；和/或
(ii) 它包含更强的阴离子交换基团。
15. 根据第1至14项中的任一项所述的方法，其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液的pH为≤ 5.0，优选≤ 4.5或≤ 4.0。
16. 根据第15项所述的方法，其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液的pH在2.5至5.0，优选3.0至4.5或3.0至4.0的范围内。
17. 根据第1至16项中的任一项所述的方法，其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液包含基于羧酸的缓冲剂。
18. 根据第17项所述的方法，其中所述缓冲剂包含羧酸和所述羧酸的盐。
19. 根据第18项所述的方法，其中所述羧酸
(i) 包含1至3个羧酸基团；
(ii) 是脂族的；和/或
(iii) 是饱和的，
任选其中所述缓冲剂包含选自柠檬酸盐、草酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐和酒石酸盐的缓冲组分。
20. 根据第17至19项中的任一项所述的方法，其中所述缓冲剂包含选自乙酸盐和甲酸盐的缓冲组分。
21. 根据第1至20项中的任一项所述的方法， (i) 其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液包含的所述缓冲剂的浓度为1M或更低、如0.75M或更低或0.5M或更低；或(ii) 其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液包含的所述缓冲剂的浓度在25mM至1000mM、50mM至750mM、100mM至650mM或200mM至500mM的范围内。
22. 根据第1至21项中的任一项所述的方法，其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液包含非缓冲盐。
23. 根据第1至22项中的任一项所述的方法，其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液和/或所述结合混合物包含拥挤剂。
24. 根据第23项所述的方法，其中所述拥挤剂选自聚(烷撑氧)聚合物和葡聚糖。
25. 根据第24项所述的方法，其中所述拥挤剂是聚乙二醇，其中优选地，所述聚乙二醇的分子量在5000 Da至40000 Da，如5000至30000 Da、6000至20000 Da或6000至10000Da的范围内。
26. 根据第1至25项中的任一项所述的方法，其中(A)中的所述酸性结合缓冲液选自下列之中：
(aa)它包含：(i) pH为2.5至5、优选3至4，以及(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂；
(bb)它包含：(i) pH为2.5至5、优选3至4，以及 (ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂；
(cc)它包含：(i) pH为2.5至5、优选3至4，(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂，以及 (iii) 拥挤剂，优选聚乙二醇；
(dd)它包含：(i) pH为2.5至5、优选3至4，以及(ii) 浓度为250mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂，以及(iii) 拥挤剂，优选聚乙二醇；
(ee)它包含：(i) pH为≤ 5、优选≤ 4，以及(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂；
(ff)它包含：(i) pH为≤ 5以及(ii) 浓度为200mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂；
(gg)它包含：(i) pH为≤ 5，(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂，以及(iii) 拥挤剂，优选聚乙二醇；和
(hh)它包含：(i) pH为≤ 5，(ii)浓度为250mM至500mM的甲酸盐作为缓冲剂，以及(iii) 拥挤剂，优选聚乙二醇。
27. 根据第1至26项中的任一项所述的方法，其中在步骤(A)中使用的固相由粒子、优选磁性粒子或者多孔膜或过滤器提供。
28. 根据第27项中的任一项所述的方法，其中在步骤(A)中使用的固相包含阴离子交换基团，所述阴离子交换基团包含至少一个伯、仲、叔或季氨基基团。
29. 根据第28项所述的方法，其中所述固相的阴离子交换基团包含至少一个氨基基团，其中所述氨基基团是咪唑环的一部分，优选其中所述氨基基团是组胺的咪唑环的一部分。
30. 根据第1至29项中的任一项所述的方法，其中在(A)中，所述具有酸性pH的结合缓冲液包含缓冲剂并任选地包含拥挤剂，并且所述固相选自下列之中：
(aa) (i) pH为2.5至5、优选3至4，以及(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂，以及 (iii) 携带组胺和/或His 10的磁性阴离子交换粒子；
(bb)(i) pH为≤ 5、优选≤ 4，(ii) 浓度为250mM至500mM的乙酸盐作为缓冲剂，以及 (iii) 携带组胺和/或His 10的磁性阴离子交换粒子。
31. 根据第1至30项中的任一项所述的方法，其中所述无细胞或贫细胞生物样品具有以下特征中的一个或多个：
(i) 它是或源自于体液或细胞培养液；
(ii) 它是或源自于去除细胞的以下样品：全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、汁液、脑脊液、滑液、间质液、腹水、乳液、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物；
(iii) 它选自血浆、血清、和无细胞或细胞贫化的尿液；
(iv) 它选自血浆和血清，
任选其中在步骤(A)之前，所述方法包括从体液样品中去除细胞，从而提供所述无细胞或细胞贫化的生物样品。
32. 根据第2至31项中的任一项所述的方法，其中洗涤步骤(C)包括使用pH在3.5至6.5、优选4.5至5.5范围内的洗涤溶液、优选洗涤缓冲液。
33. 根据第32项所述的方法，其中所述洗涤溶液是包含基于羧酸的缓冲剂的洗涤缓冲液，任选其中(i) 所述缓冲剂包含羧酸和所述羧酸的盐，如乙酸盐。
34. 根据第32或33项所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含所述缓冲剂，所述缓冲剂的浓度选自(i) 0.5M或更低、0.4M或更低、0.35M或更低、或优选0.3M或更低；或(ii)在10mM至500mM，如100mM至400mM、150mM至350mM或200mM至300mM范围内的浓度。
35. 根据第2至34项中的任一项所述的方法，其中在(D)中的回收包括使所述固相与裂解缓冲液接触，任选其中所述裂解缓冲液包含硫氰酸胍，并将所述固相与洗脱物分离。
36. 根据第2至34项中的任一项所述的方法，其中在(D)中的回收包括使所述固相与洗脱溶液接触并将所述固相与洗脱物分离，其中所述洗脱溶液具有以下特征中的一个或多个：
(i)它的pH高于步骤(A)的所述结合混合物的pH，其中优选所述洗脱溶液的pH为至少7.0或至少7.5，如至少8.0、至少8.3或至少8.5；
(ii)它的pH超过所述固相的电离形式的阴离子交换基团的pKa，其中优选所述洗脱溶液的pH超过所述阴离子交换基团的pKa至少1个单位；
(iii)它具有碱性pH，其中所述洗脱溶液的pH为9.5或更低、或9.0或更低；
(iv)它包含缓冲剂，其中任选所述缓冲剂任选自TRIS、HEPES、HPPS和氨缓冲剂，优选所述缓冲剂是TRIS；
(v)它的总盐浓度为至少500mM，如至少750mM、至少1M或至少1.2M；
(vi)它的总盐浓度为500mM或更低，如250mM或更低、200mM或更低、150mM或更低、或100mM或更低，任选50mM或更低；
(vii)它的盐浓度选自5mM至200mM，如10mM至200mM，优选所述洗脱溶液包含浓度为10 mM至200 mM的TRIS；和/或
(viii)所述洗脱溶液是10 mM Tris，pH 8.5。
37. 根据第2至36项中的任一项所述的方法，其中所述方法包括
(E)从洗脱物中纯化RNA。
38. 根据第6至37项中的任一项所述的方法，当从属于第6项时，其中步骤(X)还包括
- 任选地洗涤分离的固相，以及
-从分离的固相中回收细胞外囊泡和/或所述细胞外RNA中包含的囊泡RNA。
39.根据第38项所述的方法，其中回收分离的细胞外囊泡中包含的囊泡RNA包括使所述固相与裂解缓冲液接触，任选其中所述裂解缓冲液包含硫氰酸胍，以及使所述固相与包含囊泡RNA的洗脱物分离。
40. 根据第6至39项中的任一项所述的方法，当从属于第6项时，其中在步骤(X)和步骤(A)中使用相同类型的固相。
41. 根据第1至40项中的任一项所述的方法，其中所述非囊泡RNA包含非囊泡miRNA或主要由非囊泡miRNA组成。
42. 根据第1至41项中的任一项所述的方法，其中所述囊泡RNA包含囊泡miRNA。
43. 根据第1项和从属于第1项的从属项所述的方法，其中所述回收的RNA包含非囊泡miRNA和囊泡miRNA。
44. 根据第6项和从属于第6项的从属项所述的方法，其中囊泡miRNA和非囊泡miRNA作为分开的级分提供。
45. 根据第1至44项中的任一项所述的方法，其中待富集的非囊泡RNA是非囊泡miRNA，其中所述方法包括
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，
其中所述生物样品选自血浆和血清并任选是细胞外囊泡贫化的，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
其中所述结合缓冲液的pH为≤ 5.0、优选≤ 4.5或≤ 4.0，
其中所述缓冲剂包含基于羧酸的缓冲组分、优选选自乙酸盐和甲酸盐，
(i) 其中所述酸性结合液包含浓度为1M或更低、如0.75M或更低或0.5M或更低的所述缓冲剂；或(ii) 其中所述酸性结合缓冲液包含浓度在25mM至1000mM、50mM至750mM、100mM至650mM或200mM至500mM范围内的所述缓冲剂，
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上，
其中在步骤(A)中使用的固相由粒子、优选磁性粒子或膜提供，
其中所述固相的阴离子交换基团包含至少一个氨基基团，其中所述氨基基团是咪唑环的一部分，优选其中所述氨基基团是组胺的咪唑环的一部分；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与剩余结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA，任选其中在(D)中的回收包括使所述固相与裂解缓冲液接触，任选其中所述裂解缓冲液包含硫氰酸胍，并将所述固相与洗脱物分离；以及
(E)任选从洗脱物中纯化RNA。
46. 根据第6至43项中的任一项所述的方法，其中待富集的非囊泡RNA是非囊泡miRNA并且所述细胞外囊泡包含囊泡miRNA，其中所述方法包括
(X)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使细胞外囊泡结合到包含阴离子交换基团的固相上；
将带有结合的细胞外囊泡的固相与剩余结合混合物分离，其中所述剩余结合混合物包含非囊泡RNA；
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
其中所述结合缓冲液的pH为≤ 5.0、优选≤ 4.5或≤ 4.0，
其中所述缓冲剂包含基于羧酸的缓冲组分、优选选自乙酸盐和甲酸盐，
(i) 其中所述酸性结合液包含浓度为1M或更低、如0.75M或更低或0.5M或更低的所述缓冲剂；或(ii) 其中所述酸性结合缓冲液包含浓度在25mM至1000mM、50mM至750mM、100mM至650mM或200mM至500mM范围内的所述缓冲剂，
其中在步骤(A)中使用的酸性结合缓冲液与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液的不同之处在于以下特征中的一个或多个：
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂，
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上，其中在步骤(A)中使用的固相由粒子、优选磁性粒子或膜提供，
任选其中所述固相的阴离子交换基团包含至少一个氨基基团，其中所述氨基基团是咪唑环的一部分，优选其中所述氨基基团是组胺的咪唑环的一部分。
并任选其中在步骤(A)中使用的固相与在步骤(X)中使用的固相的不同之处在于
(i) 它包含更多的阴离子交换基团；和/或
(ii) 它包含更强的阴离子交换基团，
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与(A)的剩余结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA，任选其中在(D)中的回收包括使所述固相与裂解缓冲液接触，任选其中所述裂解缓冲液包含硫氰酸胍，并将所述固相与洗脱物分离；以及
(E)任选从洗脱物中纯化RNA。
47. 一种用于执行根据第1至46项中的任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含
(a)包含缓冲剂的酸性结合缓冲液；
(b)包含阴离子交换基团的固相，所述固相适合于在由所述酸性结合缓冲液(a)建立的条件下结合非囊泡RNA；
(c)任选的洗涤溶液；和
(d)任选的回收溶液。
48. 根据第47项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含
(x)包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，其中所述酸性结合缓冲液(x)不同于所述酸性结合缓冲液(a)，其中优选地，所述酸性结合缓冲液(a)与所述酸性结合缓冲液(x)的不同之处在于以下特征中的一个或多个
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂。
49. 根据第47或48项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含
(b’)不同于所述固相(b)的包含阴离子交换基团的第二固相，其中优选地，所述固相(b)与所述固相(b’)的不同之处在于：(i) 它包含更多的阴离子交换基团；和/或(ii)它包含更强的阴离子交换基团。
50. 根据第48或49项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含结合缓冲液(x)和第二固相(b’)，其中第二固相(b’)适合于在由所述酸性结合缓冲液(x)建立的条件下结合细胞外囊泡。
51. 根据第47至50项中的任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒具有以下特征中的一个或多个：
(i)所述酸性结合缓冲液(a)具有如第15至26项中的任一项限定的特征中的一个或多个，
(ii)所述固相(b)具有如第27至29项中的任一项限定的特征中的一个或多个，其中优选所述固相由磁性粒子提供；
(iii)所述洗涤缓冲液(c)具有如第32至34项中的任一项限定的特征中的一个或多个；和/或
(iv)所述回收溶液(d)是包含硫氰酸胍的裂解溶液。
52. 根据第47至51项中的任一项所述的试剂盒，其中所述酸性结合缓冲液(x)具有如第15至25项中的任一项限定的特征中的一个或多个。
53. 根据第47至52项中的任一项所述的试剂盒，其中所述固相(b’)具有如第27至29项中的任一项限定的特征中的一个或多个，任选其中所述固相(b)包含的阴离子交换基团含有至少一个季氨基基团。
54. 根据第47至53项中的任一项所述的试剂盒，其中所述回收溶液(d)是具有如第36项中限定的一个或多个特征的洗脱溶液。
本发明不受本文中公开的示例性方法和材料的限制，并且在本发明的实施方案的实践或检验中可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料。数值范围包括限定该范围的数字在内。本文中提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可以通过参考作为整体的说明书来阅读。
如在本说明书、项目和权利要求中所用的不带数量指示的单数形式包括复数方面，除非上下文另有明确规定。术语“包括”、“具有”、“包含”及其变体同义地使用，并将被解释为非限制性的。可以存在其它组分和步骤。在整个说明书中，其中组合物被描述为包括组分或材料，另外设想，除非另有描述，否则在实施方案中，所述组合物也可以基本上由所列举的组分或材料的任何组合组成，或由其组成。提及“公开内容”和“本发明”等包括在本文中教导的单个或多个方面；等等。本文中教导的方面由术语“发明”所包涵。
优选选择和组合本文中描述的优选实施方案，并且由优选实施方案的相应组合产生的具体主题也属于本公开。
实施例
应当理解，以下实施例仅用于说明目的，而不应被解释为以任何方式限制本发明。
下面的实施例证明了本发明的方法在从体液如血浆的细胞外级分中有效富集非囊泡RNA如非囊泡miRNA中的重大优势。所述实施例表明，本发明的教导允许改善非囊泡RNA、如非囊泡miRNA与包含阴离子交换基团的固相的结合。特别是，可以通过如下方式来改善非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的结合：(i) 更为酸性的pH（例如，在大约2.5至5.0，如3.0至4.5或3.0至4.0的范围内），(ii) 增加离子强度，(iii) 使用包含高数量/密度的阴离子交换基团的固相，(iv) 添加拥挤剂，如聚乙二醇或(v) (i)至(iv)中的两种或更多种的组合。
如下面的实施例进一步证明的，当使用这些措施中的一个或多个来改善非囊泡RNA如非囊泡miRNA与所述阴离子交换固相的结合时，细胞外囊泡与所述固相的结合不受影响或仅受到适度影响。如实施例中所示，这允许在从相同的结合混合物中回收细胞外囊泡的方法中，通过结合到阴离子交换固相上来改善非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的结合并由此回收。然后，可以对结合的细胞外囊泡和结合的非囊泡RNA进行进一步处理，以纯化包括囊泡RNA和非囊泡RNA（如非囊泡miRNA）的RNA级分。此外，可以将在非囊泡RNA和细胞外囊泡的结合行为中鉴定的差异用于在分开的级分中富集细胞外囊泡（并由此富集囊泡RNA）和非囊泡RNA（如非囊泡miRNA）。下面的实施例说明了合适的实施方案，其中细胞外囊泡和非囊泡RNA在分开的结合步骤中结合。这允许将囊泡RNA和非囊泡RNA作为分开的级分提供。
缩写：
EV细胞外囊泡
GTC硫氰酸胍
miRNA微小RNA
PCR聚合酶链反应
PEG聚乙二醇
RT-PCR逆转录聚合酶链反应
exoRNeasy Midi/Maxi试剂盒（QIAGEN，Hilden）是可商购的。简而言之，在带有结合的RNA的固相分离之后，将基于苯酚/硫氰酸胍的裂解缓冲液（例如QIAzol裂解试剂，QIAGEN）加入离心柱。然后，对所述离心柱进行离心，随后将穿流液/裂解物收集到新的试管中。简单地说，将所述含有裂解物的试管涡旋并在室温下温育5分钟。该步骤促进了核蛋白复合体的解离。接下来，向所述裂解物添加氯仿，然后搅动所述样品，例如涡旋15秒。随后，将所述样品温育约2分钟至5分钟，然后离心除去苯酚。离心后，所述样品分成三个相：含有RNA的上部无色水相；薄的白色中间相；和下部的红色有机相。将所述包含RNA的水相转移到新的试管中，并添加乙醇。将所述样品转移到新的离心柱（例如RNeasy离心柱，QIAGEN，Hilden）以结合RNA。几个洗涤步骤后，可以用无RNA酶的水洗脱RNA。在所述试剂盒中用于结合的固相也可用于本发明。
实施例1：pH和离子强度的影响
将1ml来自健康供体的人血浆与等量的不同结合缓冲液（见下表1）混合，并与0.5mg携带组胺官能团的磁性阴离子交换珠粒一起在翻转振荡器（end-over-end shaker）上温育10分钟。将所述珠粒收集在磁力架（magnetic rack）上，去除上清液，并将所述珠粒在PH5的235 mM乙酸盐中洗涤一次。然后用700 µl QIAzol裂解试剂（用2M GTC、2M Trizma碱溶液将pH调至8）处理所述珠粒以裂解所述结合的囊泡并洗脱其内容物。所述裂解步骤还溶解结合的核蛋白复合体，然后洗脱它们的成分。
在相分离步骤中，使用90 µl氯仿，按照miRNeasy Micro程序从所述QIAzol洗脱物中分离RNA。
作为参比，将另外1ml同样的血浆样品用exoRNeasy Maxi试剂盒进行处理。
使用miRCURY LNA RT和SYBR Green PCR试剂盒，以各自的miRCURY测定法通过定量实时RT-PCR对代表性的miRNA let-7a（囊泡）和miR-122（非囊泡）进行相对定量。
所有的分离都一式两份进行的，对每个洗脱物都进行了两次重复测定。
结果：
虽然囊泡miRNA let-7a的Ct值全部在1个循环上下变化（图1A），但在低pH和更高离子强度的缓冲液的条件下，即在分别含有465 mM乙酸盐或甲酸盐的pH为3.5的结合缓冲液、以及分别含有240 mM甲酸盐或465 mM甲酸盐的pH为3的结合缓冲液的条件下，非囊泡miR-122的Ct值降低了3-4个循环，对应于高大约8-16倍的回收率（图1B）。
实施例2：离子强度的影响
将1ml来自健康供体的人血浆根据exoRNeasy Maxi方案进行处理，所述方案有以下修改：如实施例1那样将QIAzol调至pH 8，结合缓冲液XBP用50、100、240或465 mM乙酸盐缓冲液代替，洗涤缓冲液XWP用PH 5的235 mM乙酸盐代替。未修改的exoRNeasy方案纳入作为参比。所有的样品都一式两份处理。
使用miRCURY LNA RT和SYBR Green PCR试剂盒，以各自的miRCURY测定法通过定量实时RT-PCR对代表性的miRNA miR-150（囊泡）和miR-122（非囊泡）进行相对定量。
结果：
虽然囊泡miRNA miR-150的Ct值在所有条件之间基本不变（图2A），但非囊泡miRNAmiR-122的Ct值随着缓冲液离子强度的增加而逐渐改善（图2B）。
实施例3：结合基质的影响
将1 ml来自健康供体的人血浆与等体积的pH 4的465 mM乙酸盐混合，并与0.5 mg携带组胺或His10肽作为官能团的磁性阴离子交换珠粒一起在翻转振荡器上温育10分钟。将所述珠粒收集在磁力架上，去除上清液，并将所述珠粒在PH 5的235 mM乙酸盐中洗涤一次。然后，如实施例1那样对所述珠粒进行进一步处理并分离RNA。
作为参比，将另外1ml同样的血浆用exoRNeasy Maxi试剂盒根据未修改的exoRNeasy方案进行处理。
使用miRCURY LNA RT和SYBR Green PCR试剂盒，以各自的miRCURY测定法通过定量实时RT-PCR对代表性的miRNA let-7a（囊泡）和miR-122（非囊泡）进行相对定量。
所有的分离都一式两份进行的，对每个洗脱物都进行了两次重复测定。
结果：
同样，囊泡let-7a的Ct值和相应地囊泡let-7a的回收率在所述两种珠粒类型之间没有显著差异（图3A）。对于非囊泡miR-122，由于His10珠粒的电荷密度较高，Ct值增加了3-4个循环（图3B）。
实施例4：分子拥挤的影响（PEG）
将1 ml来自健康供体的人血浆与等体积的pH 4的465 mM乙酸盐混合，所述乙酸盐有或没有5% PEG 8000，并与0.5 mg携带组胺官能团的磁性阴离子交换珠粒一起在翻转振荡器上温育10分钟。将所述珠粒收集在磁力架上，去除上清液，并将所述珠粒在pH 5的235mM乙酸盐中洗涤一次。然后，如实施例1那样对所述珠粒进行进一步处理并分离RNA。
作为参比，将另外1ml同样的血浆用exoRNeasy Maxi试剂盒根据未修改的exoRNeasy方案进行处理。
使用miRCURY LNA RT和SYBR Green PCR试剂盒，以各自的miRCURY测定法通过定量实时RT-PCR对代表性的miRNA miR-150（囊泡）和miR-122（非囊泡）进行相对定量。
所有的分离都一式两份进行的，对每个洗脱物都进行了两次重复测定。
结果：
向所述结合缓冲液添加PEG仅略微改变了囊泡miR-150的回收（图4A），而非囊泡miR-122的回收改善了5个循环，或约30倍（图4B）。
实施例5：两步程序
将1 ml来自健康供体的人血浆与等体积的pH 4的465 mM乙酸盐混合，并与0.5 mg携带组胺官能团的磁性阴离子交换珠粒一起在翻转振荡器上温育10分钟。将所述珠粒收集在磁力架上，保留上清液用于提取未结合的物质，并将所述珠粒在pH 5的235 mM乙酸盐中洗涤一次。然后，如实施例1那样对所述珠粒进行进一步处理并分离RNA。
作为参比，将另外1ml同样的血浆用exoRNeasy Maxi试剂盒根据未修改的exoRNeasy方案进行处理。保留了exoEasy离心柱的穿流液用于提取未结合的物质。
将上清液和穿流液级分施加到新鲜的exoEasy Maxi离心柱上，并根据exoRNeasyMaxi方案进一步处理所述柱。
使用miRCURY LNA RT和SYBR Green PCR试剂盒，以各自的miRCURY测定法通过定量实时RT-PCR对代表性的miRNA miR-150和miR-122进行相对定量。
所有的分离都一式两份进行的，对每个洗脱物都进行了两次重复测定。
结果：
结果表明了从EV与磁性珠粒结合的上清液中高效回收非囊泡miR-122（图5A的左侧第二条），所述磁性珠粒结合了包含囊泡miRNA-150的细胞外囊泡（图5B的左侧条）。相反，只有少量的非囊泡miR-122结合到所述磁性珠粒（图5A的左侧条）上，并可以从所述参比方法的穿流液中回收（图5A的右侧条）。
所述exoEasy离心柱中的膜含有高密度的季氨基基团，因此对EV和核酸都有更高的亲和力。

Claims (16)

1.一种从包含非囊泡RNA和任选的细胞外囊泡的无细胞或细胞贫化的生物样品中富集非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的方法，其中所述方法包括
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与所述结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)任选地从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述无细胞或细胞贫化的生物样品包含细胞外囊泡，并且其中步骤(A)包括将非囊泡RNA和细胞外囊泡结合到所述固相上以及步骤(B)包括将带有结合的非囊泡RNA和结合的细胞外囊泡的固相与所述结合混合物分离，并且其中如果进行步骤(D)的话，所述步骤(D)包括从所述固相回收非囊泡RNA和细胞外囊泡、或非囊泡RNA和提取的囊泡RNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述无细胞或细胞贫化的生物样品是细胞外囊泡贫化的。
4.一种从包含细胞外囊泡和非囊泡RNA的无细胞或细胞贫化的生物样品中顺序富集细胞外囊泡和非囊泡RNA、如非囊泡miRNA的方法，其中所述方法包括
(X)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使细胞外囊泡结合到包含阴离子交换基团的固相上；
将带有结合的细胞外囊泡的固相与剩余结合混合物分离，其中所述剩余结合混合物包含非囊泡RNA；
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物，
-任选的包含缓冲剂的酸性结合缓冲液；
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与(A)的剩余结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)任选地从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(A)中的制备结合混合物包括将在步骤(X)中获得的包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物与不同于在步骤(X)中使用的固相的阴离子交换固相接触，其中在步骤(A)中使用的固相与在步骤(X)中使用的固相的不同之处在于
(i) 它包含更多的阴离子交换基团；和/或
(ii) 它包含更强的阴离子交换基团；
任选地其中所述结合混合物的化学组成与步骤(X)相比没有改变并且其中通过使用不同的阴离子交换固相来实现所述非囊泡RNA的结合。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中步骤(A)中的制备结合混合物包括修改在步骤(X)中获得的包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物以实现非囊泡RNA结合到在步骤(A)中使用的所述阴离子交换固相上，其中修改包括以下一种或多种
(i) 降低pH；
(ii) 增加离子强度；和/或
(iii) 添加拥挤剂，如聚乙二醇。
7.根据权利要求4至6中的任一项所述的方法，其中步骤(A)包括将从步骤(X)获得的包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物与包含缓冲剂的酸性结合缓冲液接触以制备所述结合混合物，其中在步骤(X)和步骤(A)中使用不同的酸性结合缓冲液并且其中在步骤(A)中使用的酸性结合缓冲液与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液的不同之处在于以下特征中的一个或多个：
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液的pH为≤ 5.0，优选≤ 4.5或≤ 4.0，并且其中优选地，步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液的pH在2.5至5.0，优选3.0至4.5或3.0至4.0的范围内。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的方法，其中步骤(A)和任选地步骤(X)的所述酸性结合缓冲液具有以下特征中的一个或多个：
(i) 它包含基于羧酸的缓冲剂，任选地其中所述缓冲剂包含选自柠檬酸盐、草酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐和酒石酸盐的缓冲组分，优选选自乙酸盐和甲酸盐的缓冲组分；
(ii) 它包含的所述缓冲剂的浓度为1M或更低、如0.75M或更低或0.5M或更低，任选地其中它包含的所述缓冲剂的浓度在25mM至1000mM、50mM至750mM、100mM至650mM或200mM至500mM的范围内；
(iii) 它包含非缓冲盐。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中步骤(A)的所述酸性结合缓冲液和/或所述结合混合物包含拥挤剂，其中优选地，所述拥挤剂选自聚(烷撑氧)聚合物和葡聚糖，更优选所述拥挤剂是聚乙二醇。
11.根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中在步骤(A)和/或步骤(X)中使用的所述固相具有以下特征中的一个或多个：
(i) 它由粒子、优选磁性粒子或者多孔膜或过滤器提供；
(ii) 它包含阴离子交换基团，所述阴离子交换基团包含至少一个伯、仲、叔或季氨基基团。
12.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中待富集的非囊泡RNA是非囊泡miRNA，其中所述方法包括
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，
其中所述生物样品选自血浆和血清并任选地是细胞外囊泡贫化的，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
其中所述结合缓冲液的pH为≤ 5.0、优选≤ 4.5或≤ 4.0，
其中所述缓冲剂包含基于羧酸的缓冲组分、优选选自乙酸盐和甲酸盐，
(i) 其中所述酸性结合液包含浓度在25mM至1000mM、50mM至750mM、100mM至650mM或200mM至500mM范围内的所述缓冲剂，
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上，
其中在步骤(A)中使用的所述固相由粒子、优选磁性粒子或膜提供；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与剩余结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的固相；
(D)从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA；以及
(E)任选从洗脱物中纯化RNA。
13.根据权利要求4至11中的任一项所述的方法，其中待富集的非囊泡RNA是非囊泡miRNA并且所述细胞外囊泡包含囊泡miRNA，其中所述方法包括
(X)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-所述生物样品，任选地选自血浆或血清，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
并使细胞外囊泡结合到包含阴离子交换基团的固相上；
将带有结合的细胞外囊泡的固相与剩余结合混合物分离，其中所述剩余结合混合物包含非囊泡RNA；
(A)制备结合混合物，所述结合混合物包含
-包含非囊泡RNA的所述剩余结合混合物，
-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
其中所述结合缓冲液的pH为≤ 5.0、优选≤ 4.5或≤ 4.0，
并使非囊泡RNA结合到包含阴离子交换基团的固相上，
任选地其中在步骤(A)中使用的所述固相与在步骤(X)中使用的所述固相的不同之处在于
(i)它包含更多的阴离子交换基团；和/或
(ii)它包含更强的阴离子交换基团；
(B)将带有结合的非囊泡RNA的固相与(A)的剩余结合混合物分离；
(C)任选地洗涤分离的带有结合的非囊泡RNA的固相；
(D)从所述固相中回收、优选洗脱非囊泡RNA；以及
(E)任选从洗脱物中纯化RNA。
14.一种用于执行根据权利要求1至13中的任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含
(a)包含缓冲剂的酸性结合缓冲液；
(b)包含阴离子交换基团的固相，所述固相适合于在由所述酸性结合缓冲液(a)建立的条件下结合非囊泡RNA；
(c)任选的洗涤溶液；和
(d)任选的回收溶液。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下组分中的一个或多个
(x)包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，其中所述酸性结合缓冲液(x)不同于所述酸性结合缓冲液(a)，其中优选地，所述酸性结合缓冲液(a)与所述酸性结合缓冲液(x)的不同之处在于以下特征中的一个或多个
(i)它具有更低的pH；
(ii)它具有更高的离子强度；和/或
(iii)它包含拥挤剂或包含与在步骤(X)中使用的所述酸性结合缓冲液相比浓度更高的拥挤剂；
(b’)不同于所述固相(b)的包含阴离子交换基团的第二固相，其中优选地，所述固相(b)与所述固相(b’)的不同之处在于：(i) 它包含更多的阴离子交换基团；和/或(ii)它包含更强的阴离子交换基团，任选地其中所述试剂盒还包含结合缓冲液(x)和第二固相(b’)，其中所述第二固相(b’)适合于在由所述酸性结合缓冲液(x)建立的条件下结合细胞外囊泡。
16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其中
(i)所述酸性结合缓冲液(a)和/或所述酸性结合缓冲液(x)具有如权利要求8至10中的任一项限定的特征中的一个或多个，
(ii)所述固相(b)和/或所述固相(b’)如权利要求11所限定，其中优选所述固相由磁性粒子提供。
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