CN105602942A - 核酸释放剂和干血斑核酸快速提取方法 - Google Patents

核酸释放剂和干血斑核酸快速提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸释放剂和干血斑核酸快速提取方法，其中核酸释放剂由Tris-HCl、EDTA、MgCl2、Trixon？X-100、KCL和蛋白酶K加入无菌水中混合而成，且各组分的浓度如下：Tris-HCl，10～50mM/L；EDTA，1～5mM/L；MgCl2，10～50mM/L；Trixon？X-100，1～10mM/L；KCL，2～20mM/L；蛋白酶K，0.05～0.1mg/mL；干血斑核酸快速提取方法利用上述核酸释放剂得到目标核酸。本发明，操作便捷，可以对干血斑等血液样本中的核酸快速提取纯化，重复性好、特异性强，成本较低、使用安全，适用性广。

Description

核酸释放剂和干血斑核酸快速提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及核酸释放剂和干血斑核酸快速提取方法。
背景技术
干血斑(driedbloodspot，DBS)，即将全血样品收集在卡纸上的血液采集方式，比传统方法有一定的优势，它需求的血量较少，方便血样采集、存储运输，是罕见疾病筛查过程中的一项有效工具。干血斑早在上世纪六十年代就已被用于苯丙酮尿症的新生儿筛查中。随着串联质谱技术等的发展，干血斑在遗传代谢类疾病的诊断及筛查中的应用价值日渐突显。截至2015年5月，干血斑主要应用于代谢相关疾病的筛查、药物动力学研究以及新生儿筛查等。对于遗传代谢性疾病而言，代谢酶、代谢产物和核酸能够较为稳定存在于干血纸片中，因而在对代谢异常类疾病样本进行筛查分析时，干血斑能较为准确地反映样本中代谢酶、代谢产物及核酸的含量。
全血样品的干血斑检测广泛应用于临床疾病检测、流行病学调查、刑事侦缉、亲子鉴定等多个方面。90年代末和二十一世纪初，随着科学技术的发展，干血斑核酸的提取方法有了很大的改进，操作更加简单，所需设备少，适合于发展中国家及贫穷边远地区的检测。
PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA(核酸)片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。而研究表明，血红蛋白中的血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶活性，导致检测结果降低，从而影响定量结果的准确性，因此能否有效避免Taq酶活性降低是影响干血斑核酸的提取纯度的重要因素。
目前应用于PCR扩增的核酸提取方法主要有5种：(1)传统煮沸法：裂解液与血液样本混匀，高温裂解，离心得到核酸；(2)浓缩煮沸法：先用多聚糖浓缩沉淀病毒核酸，再加裂解液煮沸，离心得到核酸；(3)核酸释放法：核酸释放剂与血液样本混合，高温裂解，得到核酸；(4)离心柱法：裂解后采用层析柱吸附核酸，再洗脱得到较纯的核酸；(5)磁珠法：用磁珠吸附核酸，再洗脱得到较纯的核酸。
上述前2种提取方法缺点是需要转管、移液、离心等步骤，样本处理耗时长，操作中难免会丢失部分核酸，使定量值偏低。离心柱法比前2种煮沸法和核酸释放法提取的核酸纯度大大提高，但手工操作多，效率低。磁珠法提取步骤简单，回收率高，纯度好，易于自动化，但产品十分昂贵，目前应用并不广泛。目前来说，核酸释放法相比来说操作简单，成本低廉，对后续荧光定量PCR反应具有较强的抑制作用，因此应用最为广泛，但并没有有效地去除血红蛋白等杂质，会影响核酸的提取纯度。
因此，目前的干血斑的核酸释放法主要存在不能有效地去除血红蛋白等杂质的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是目前的干血斑的核酸释放法主要存在不能有效地去除血红蛋白等杂质的问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供了一种核酸释放剂，由Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K加入无菌水中混合而成，且各组分的浓度如下：
Tris-HCl，10～50mM/L；
EDTA，1～5mM/L；
MgCl2，10～50mM/L；
TrixonX-100，1～10mM/L；
KCL，2～20mM/L；
蛋白酶K，0.05～0.1mg/mL。
在上述核酸释放剂中，Tris-HCl的PH值为7.4。
本发明还提供了一种干血斑核酸快速提取方法，包括以下步骤：
制备上述的核酸释放剂并于-20℃的环境中储存；
制备血斑样品圆片：将干血斑采集卡上的血斑样品制成1个5×5mm的样本圆片；
提取核酸：将所述样本圆片放入离心管中，再将所述核酸释放剂升温至20℃～25℃的室温后摇匀加入所述离心管中，浸没所述样本圆片，经过30～45min的56℃温浴处理后，转移至过滤柱中，通过过滤得到目标核酸。
在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述过滤柱包括上分离管和下收集管，所述上分离管的上部设置超滤膜组件，所述下收集管通过水平的横管与所述上分离管的底部连通；
所述超滤膜组件的材质采用三氧化铝、二氧化钛、氧化锆、醋酸纤维素、磺化聚砜、聚醚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚酰亚胺、聚哌嗪、聚乙烯醇中的一种或一种以上的组合，所述超滤膜组件的结构为卷式、平板式、碟管式、中空纤维式或管式。
在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述超滤膜组件采用的是孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述二氧化钛纳米滤膜的制备方法如下：
以孔径为100nm、孔间距为30～60nm、孔隙率为40％的三氧化铝无机膜作为载体膜，将所述载体膜经过掺硅二氧化钛溶胶浸渍，然后进行水洗、干燥，在载体膜的孔道内外形成二氧化钛纳米管，得到孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述掺硅二氧化钛溶胶的制备步骤如下：
将异丙酵钛Ti(Oi-C3H7)4和正硅酸乙酯Si(OC2H5)4合为前驱体原料，加入到无水乙醇中，异丙酵钛Ti(Oi-C3H7)4、正硅酸乙酯Si(OC2H5)4和无水乙醇的摩尔数为1mM、1mM、8.35mM，搅拌并混合均匀形成前驱体溶液；
然后另取摩尔数为0.5mM的无水乙醇、0.2mM的硝酸与1mM的水混合呈水解溶液；
将水解溶液缓慢滴加到以上的前驱体溶液中，缓慢水解得到浅黄色的透明的掺硅二氧化钛溶胶。
在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述三氧化铝无机膜在掺硅二氧化钛溶胶浸渍前，用去离子水清洗并以70℃烘干，自然降至20℃～25℃的室温备用。
在上述干血斑核酸快速提取方法中，将所述三氧化铝无机膜浸入该溶胶中，5min后取出干燥，然后升温至400℃保温4h，最后以100℃/h降至20℃～25℃的室温，备用。
在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述上分离管从上到下包括内径依次增大的进口、过滤段、汇聚段和存储座，所述超滤膜组件设置在所述过滤段内，所述下收集管的上部与所述存储座的侧面连通
本发明，采用本发明实施例提供的核酸过滤柱及核酸提取试剂定量检测干血斑的核酸含量时，其操作便捷，只需将待测样本和所述核酸释放剂在离心管中混匀，采用本发明提供的核酸释放剂即可实现核酸的释放，并通过过滤柱得到较高纯度的核酸，免去了传统提取技术中的反复离心、弃上清和转管等操作，在很大程度上简化了实验步骤，减少了核酸的丢失，使检测灵敏度有了很大的提高，可以对干血斑等血液样本中的核酸快速提取纯化，重复性好、特异性强、易于判别，且用量少、成本较低、使用安全，适用于不同类型的PCR仪，可广泛应用于病原微生物的检测、法医学鉴定、基因突变的检测以及组织和血液分型等领域。
附图说明
图1为本发明和现有对照试剂QIAampDNAMicroKit实验结果进行1.5％琼脂糖凝胶电泳后的对照结果图；
图2为本发明的实施例1与现有技术中采用QIAampViralRNAMiniKit的实验结果的对照图；
图3为本发明的实施例1与现有技术中采用QIAampcadorPathogenMiniKit的实验结果的对照图；
图4为本发明的过滤柱的结构示意图。
注：图2和图3中的粗线代表Qiagen试剂的提取结果，细线代表本发明的提取结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明予以详细说明。本文中提到的单位mM是指毫摩尔，mM/L是指毫摩尔每升。
本发明提供了一种核酸释放剂，由Tris-HCl(中文名称为:三(羟甲基)氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、MgCl2(氯化镁)、TrixonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、KCL(氯化钾)和蛋白酶K加入无菌水中混合而成，且各组分的浓度如下：
Tris-HCl，10～50mM/L；
EDTA，1～5mM/L；
MgCl2，10～50mM/L；
TrixonX-100，1～10mM/L；
KCL，2～20mM/L；
蛋白酶K，0.05～0.1mg/mL。
优选的，各组分的浓度如下：
Tris-HCl，10～20mM/L；
EDTA，1～2.5mM/L；
MgCl2，10～20mM/L；
TrixonX-100，1～5mM/L；
KCL，5～15mM/L；
蛋白酶K，0.06～0.08mg/mL。
优选的，Tris-HCl的PH值为7.4。
本发明还提供了一种干血斑核酸快速提取方法，包括以下步骤：
制备上述核酸释放剂并于-20℃的环境中储存；
制备血斑样品圆片：将干血斑采集卡上的血斑样品制成1个5×5mm的样本圆片；
提取核酸：将样本圆片放入离心管中，再将核酸释放剂升温至20℃～25℃的室温后摇匀加入离心管中，浸没样本圆片，经过30～45min的56℃温浴处理后，转移至过滤柱中，通过过滤得到目标核酸。
优选的，如图4所示，过滤柱包括上分离管和下收集管5，上分离管的上部设置超滤膜组件21，下收集管5通过水平的横管51与上分离管的底部连通；
超滤膜组件的材质采用三氧化铝、二氧化钛、氧化锆、醋酸纤维素、磺化聚砜、聚醚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚酰亚胺、聚哌嗪、聚乙烯醇中的一种或一种以上的组合，超滤膜组件的结构为卷式、平板式、碟管式、中空纤维式或管式。
优选的，超滤膜组件采用的是孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
优选的，二氧化钛纳米滤膜的制备方法如下：
以孔径为100nm、孔间距为30～60nm、孔隙率为40％的三氧化铝无机膜作为载体膜，将载体膜经过掺硅二氧化钛溶胶浸渍，然后进行水洗、干燥，在载体膜的孔道内外形成二氧化钛纳米管，得到孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
优选的，掺硅二氧化钛溶胶的制备步骤如下：
将异丙酵钛Ti(Oi-C3H7)4和正硅酸乙酯Si(OC2H5)4合为前驱体原料，加入到无水乙醇中，异丙酵钛Ti(Oi-C3H7)4、正硅酸乙酯Si(OC2H5)4和无水乙醇的摩尔数为1mM、1mM、8.35mM，搅拌并混合均匀形成前驱体溶液；
然后另取摩尔数为0.5mM无水乙醇、0.2mM硝酸与1mM水混合呈水解溶液；
将水解溶液缓慢滴加到以上的前驱体溶液中，缓慢水解得到浅黄色的透明的掺硅二氧化钛溶胶。
优选的，三氧化铝无机膜在掺硅二氧化钛溶胶浸渍前，用去离子水清洗并以70℃烘干，自然降至20℃～25℃的室温备用。
优选的，将三氧化铝无机膜浸入该溶胶中，5min后取出干燥，然后升温至400℃保温4h，最后以100℃/h降至20℃～25℃的室温，备用。
优选的，上分离管从上到下包括内径依次增大的进口1、过滤段2、汇聚段3和存储座4，超滤膜组件21设置在过滤段2内，下收集管5的上部与存储座4的侧面连通。
下面以具体实施例对本发明进行说明，其中以实施例1中的参数为最佳。
实施例1.
制备核酸释放剂：将PH值为7.4的Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K加入无菌水中混合均匀，其中Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K的浓度分别为13mM/L、2mM/L、14.5mM/L、2mM/L、10mM/L、0.065mg/mL，储存于温度为-20℃的环境中；
制备血斑样品圆片：将干血斑采集卡上分离出1个5×5mm的样本圆片，放入离心管中，可用打孔器打孔1个5×5mm血斑(或将圆形的血斑剪为约5×5mm的样品)。
将核酸释放液转移至过滤柱，5000xg的离心力离心过滤1min得到滤液。
将滤液转移至另一洁净无酶的离心管中，在-20℃温度下保存即可得到最终提取纯化的干血斑核酸释放剂，干血斑核酸释放剂的参数如表1所示：
表1干血斑核酸释放剂的参数表
试剂名称 终浓度 体积/质量
1M Tris-HCL(PH＝7.4) 13mM/L 13ul
0.5M EDTA 2mM/L 4ul
MgCl2 14.5mM/L 1.377mg
Trixon X-100 2mM/L 20ul
KCl 10mM/L 0.745mg
蛋白酶K 0.065mg/ml 65ug
将上述核酸释放剂储存于-20℃的核酸释放试剂拿出，升至20℃～25℃的室温后摇匀，离心管内加入50ul核酸释放试剂，经过30min的56℃水浴处理，转移至过滤柱中，通过过滤得到目的核酸DNA。
对照试剂选用QIAampDNAMicroKit提取的样本量为1个5×5mm血斑，洗脱体积为100ul。
提取完成后，分别取干血斑DNA溶液5ul做1.5％琼脂糖凝胶电泳，本发明和对照试剂的对照结果如图1所示，其中左侧为本发明的实验结果，右侧为对照试剂的实验结果，可看出本发明的DNA提取的完整性更高。
若将上述干血斑采集卡换成含有丙型肝炎病毒(HCV病毒)的干血斑采集卡，提取完成后，取HCV核酸RNA提取液2ul作为模板，进行HCV荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见下表2。
表2HCV核酸RNA提取液的检测结果
本发明与对照试剂QIAampViralRNAMiniKit提取出的HCV的扩增曲线如图2所示，横坐标是循环数，纵坐标是RFU荧光单位，代表荧光强度。使用本发明的实验结果与采用QIAampViralRNAMiniKit的实验结果比较，无论是高拷贝还是低拷贝的RNA都能和现有技术基本无区别，图中只标注了最高和最低的两种情况，CT值都低于现有技术，也就是说，本发明与QIAampViralRNAMiniKit的Qiagen硅胶膜吸附柱法的病毒RNA提取效率处于同一水平，对于低浓度和高浓度样品提取效率还略优于对照试剂，提取RNA的损耗较低，因此，本发明在快速核酸提取应用方面具有明显优势。
若干血斑采集卡换成含有乙型肝炎病毒(HBV病毒)的干血斑采集卡，提取完成后，取HBV核酸DNA提取液2ul作为模板，进行HBV荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见下表2：
表2HBV核酸DNA提取液的检测结果
本发明与对照试剂QIAampcadorPathogenMiniKit提取出的HCV的扩增曲线如图3所示，横坐标是循环数，纵坐标是RFU荧光单位，代表荧光强度。使用本发明的实验结果与采用QIAampcadorPathogenMiniKit的实验结果比较，无论是高拷贝还是低拷贝的RNA都能和现有技术基本无区别，图中只标注了最高和最低的两种情况，CT值都低于现有技术，也就是说，本发明与QIAampcadorPathogenMiniKit的Qiagen硅胶膜吸附柱法的病毒DNA提取效率处于同一水平，对于低浓度和高浓度样品提取效率还略优于对照试剂，提取RNA的损耗较低，因此，本发明在快速核酸提取应用方面具有明显优势。
实施例2
1L核酸释放剂的溶液中，其中Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K的浓度分别为10mM/L、2.5mM/L、10mM/L、5mM/L、14.005mM/L、0.06mg/mL。
实施例3
1L核酸释放剂的溶液中，其中Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K的浓度分别为20mM/L、1mM/L、12mM/L、1mM/L、7.485mM/L、0.08mg/mL。
实施例4
1L核酸释放剂的溶液中，其中Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K的浓度分别为11mM/L、2mM/L、20mM/L、3.5mM/L、5mM/L、0.065mg/mL。
实施例5
1L核酸释放剂的溶液中，其中Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K的浓度分别为10mM/L、2.5mM/L、12mM/L、2mM/L、15mM/L、0.065mg/mL。
实施例6
1L核酸释放剂的溶液中，其中Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K的浓度分别为50mM/L、5mM/L、30mM/L、10mM/L、2mM/L、0.05mg/mL。
实施例7
1L核酸释放剂的溶液中，其中Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K的浓度分别为20mM/L、3.95mM/L、50mM/L、3mM/L、20mM/L、0.1mg/mL。
本发明，采用本发明实施例提供的核酸过滤柱及核酸提取试剂定量检测干血斑的核酸含量时，其操作便捷，只需将待测样本和核酸释放剂在离心管中混匀，采用本发明提供的核酸释放剂即可实现核酸的释放，并通过过滤柱得到较高纯度的核酸，免去了传统提取技术中的反复离心、弃上清和转管等操作，在很大程度上简化了实验步骤，减少了核酸的丢失，使检测灵敏度有了很大的提高，可以对干血斑等血液样本中的核酸快速提取纯化，重复性好、特异性强、易于判别，且用量少、成本较低、使用安全，适用于不同类型的PCR仪，可广泛应用于病原微生物的检测、法医学鉴定、基因突变的检测以及组织和血液分型等领域。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.核酸释放剂，其特征在于，由Tris-HCl、EDTA、MgCl2、TrixonX-100、KCL和蛋白酶K加入无菌水中混合而成，且各组分的浓度如下：
Tris-HCl，10～50mM/L；
EDTA，1～5mM/L；
MgCl2，10～50mM/L；
TrixonX-100，1～10mM/L；
KCL，2～20mM/L；
蛋白酶K，0.05～0.1mg/mL。
2.如权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，Tris-HCl的PH值为7.4。
3.干血斑核酸快速提取方法，其特征在于,包括以下步骤：
制备如权利要求1、2所述核酸释放剂并于-20℃的环境中储存；
制备血斑样品圆片：将干血斑采集卡上的血斑样品制成1个5×5mm的样本圆片；
提取核酸：将所述样本圆片放入离心管中，再将所述核酸释放剂升温至20℃～25℃的室温后摇匀加入所述离心管中，浸没所述样本圆片，经过30～45min的56℃温浴处理后，转移至过滤柱中，通过过滤得到目标核酸。
4.如权利要求3所述的干血斑核酸快速提取方法，其特征在于，所述过滤柱包括上分离管和下收集管，所述上分离管的上部设置超滤膜组件，所述下收集管通过水平的横管与所述上分离管的底部连通；
所述超滤膜组件的材质采用三氧化铝、二氧化钛、氧化锆、醋酸纤维素、磺化聚砜、聚醚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚酰亚胺、聚哌嗪、聚乙烯醇中的一种或一种以上的组合，所述超滤膜组件的结构为卷式、平板式、碟管式、中空纤维式或管式。
5.如权利要求4所述的干血斑核酸快速提取方法，其特征在于，所述超滤膜组件采用的是孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
6.如权利要求5所述的干血斑核酸快速提取方法，其特征在于，所述二氧化钛纳米滤膜的制备方法如下：
以孔径为100nm、孔间距为30～60nm、孔隙率为40％的三氧化铝无机膜作为载体膜，将所述载体膜经过掺硅二氧化钛溶胶浸渍，然后进行水洗、干燥，在载体膜的孔道内外形成二氧化钛纳米管，得到孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
7.如权利要求6所述的干血斑核酸快速提取方法，其特征在于，所述掺硅二氧化钛溶胶的制备步骤如下：
将异丙酵钛Ti(Oi-C3H7)4和正硅酸乙酯Si(OC2H5)4合为前驱体原料，加入到无水乙醇中，异丙酵钛Ti(Oi-C3H7)4、正硅酸乙酯Si(OC2H5)4和无水乙醇的摩尔数为1mM、1mM、8.35mM，搅拌并混合均匀形成前驱体溶液；
然后另取摩尔数为0.5mM的无水乙醇、0.2mM的硝酸与1mM的水混合呈水解溶液；
将水解溶液缓慢滴加到以上的前驱体溶液中，缓慢水解得到浅黄色的透明的掺硅二氧化钛溶胶。
8.如权利要求7所述的干血斑核酸快速提取方法，其特征在于，所述三氧化铝无机膜在掺硅二氧化钛溶胶浸渍前，用去离子水清洗并以70℃烘干，自然降至20℃～25℃的室温备用。
9.如权利要求7所述的干血斑核酸快速提取方法，其特征在于，将所述三氧化铝无机膜浸入该溶胶中，5min后取出干燥，然后升温至400℃保温4h，最后以100℃/h降至20℃～25℃的室温，备用。
10.如权利要求3所述的干血斑核酸快速提取方法，其特征在于，所述上分离管从上到下包括内径依次增大的进口、过滤段、汇聚段和存储座，所述超滤膜组件设置在所述过滤段内，所述下收集管的上部与所述存储座的侧面连通。
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