CN113430193A - 一种核酸采集试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸采集技术领域，尤其涉及一种核酸采集试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括滤纸、裂解液、纯化试剂、Ep管；所述滤纸为：whatman 3mm滤纸或whatman Grade GF/F:0.7μm滤纸。本发明的试剂盒用于保存样品核酸，能保障有效的DNA质量；快速溶解细胞膜并改变蛋白质特性；阻止细菌、真菌和其他微生物的生长；保护检验人员安全；采集后滤纸上保存的核酸可直接进行核酸分析。是一种安全、便捷、方便、稳定的核酸采集试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及核酸采集技术领域，尤其涉及一种核酸采集试剂盒及其使用方法。
背景技术
目前，动物传染病频发，使养殖企业对疾病的诊断需求越来越大，政府对疫病的监测要求越来越严。与此同时，出现了跨地区病死动物病料、血样的邮寄、递送、实验室后期样品保存、处理等生物安全问题；例如在兽医临床样品采集运输过程中，可能会增加疫情交叉传播、继发感染的疫情风险，以及采集不当出现样品交叉污染等问题。因此，现有技术中急需一种安全、便捷、方便、稳定的采集核酸的产品，来满足现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全、便捷、方便的核酸采集试剂盒及其使用方法来满足现有技术的不足。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种核酸采集试剂盒，包括如下组分：滤纸、裂解液、纯化试剂；
所述滤纸为：whatman 3mm滤纸或whatman Grade GF/F:0.7μm滤纸。
作为优选，所述裂解剂为：SDS水溶液、异硫氰酸胍水溶液和蛋白酶K中的一种或多种；
所述SDS水溶液的质量浓度为1.5～2.5％；
所述异硫氰酸胍水溶液的摩尔浓度为3.5～4.5mol/L。
作为优选，所述SDS水溶液中还包括摩尔浓度为190～210mmol/L的Tris-Cl和摩尔浓度为0.4～0.6mmol/L的EDTA。
作为优选，所述SDS水溶液的pH为7.4～7.6。
作为优选，所述异硫氰酸胍水溶液中还包括摩尔浓度为24～26mmol/L的柠檬酸钠、摩尔浓度为95～105mmol/L的β-巯基乙醇和质量浓度为0.4～0.6％的N-十二烷基肌氨酸钠。
作为优选，所述异硫氰酸胍水溶液的pH为6.9～7.1。
作为优选，所述纯化试剂包括乙酸钾水溶液、Tris乙醇溶液、异丙醇、酚/氯仿/异戊醇抽提液、质量浓度为100％的乙醇、TE和ddH2O中的一种或几种；
所述乙酸钾水溶液的质量浓度为490～510g/L；
每升所述的乙酸钾水溶液中还包括9～11mL乙酸；
所述Tris乙醇溶液的配制方法为：每升质量浓度为70～80％的乙醇中溶解28～32gTris得到。
作为优选，所述试剂盒中还包括硅酸纤维离心柱、Ep管、生物安全自封袋。
本发明还提供了所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：将待测样品放于经裂解液处理后的滤纸上，纯化，得到核酸样品。
作为优选，还包括如下步骤：将待测样品放于经裂解液处理后的滤纸上后再次进行裂解处理的步骤。
本发明提供了一种核酸采集试剂盒及其使用方法，本发明的核酸采集试剂盒较现有技术具有如下优点：
(1)以特殊植物纤维载体作为存储核酸的新型介质，优化了样品吸收和洗脱指标；保障有效的核酸样本量；
(2)采用科学的裂解液浸泡载体，使核酸样品细胞膜快速溶解，改变蛋白质特性，释放核酸；
(3)采用本发明的试剂盒采集得到的核酸样品可直接进行PCR、SNP分析；
(4)本发明的试剂盒采集核酸能够阻止细菌、真菌和其他微生物的生长，保护检验人员安全；
(5)本发明的试剂盒具有方便、快捷、安全和稳定的特性。
附图说明
图1为实施例1试剂盒的使用流程图。
图2为实施例2试剂盒的使用流程图。
图3为实施例3试剂盒的使用流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种核酸采集试剂盒，包括如下组分：滤纸、裂解液、纯化试剂；
所述滤纸为：whatman 3mm滤纸或whatman Grade GF/F:0.7μm滤纸。
在本发明中，所述裂解剂为：SDS水溶液、异硫氰酸胍水溶液和蛋白酶K中的一种或多种；
所述SDS水溶液的质量浓度为1.5～2.5％，优选为2％；
在本发明中，所述SDS为离子型去污剂，能迅速破坏生物膜，抑制RNase和DNase活性。
所述异硫氰酸胍水溶液的摩尔浓度为3.5～4.5mol/L，优选为4mol/L。
在本发明中，所述异硫氰酸胍为强蛋白变性剂。
在本发明中，所述SDS水溶液中还包括摩尔浓度为190～210mmol/L的Tris-Cl，和摩尔浓度为0.4～0.6mmol/L的EDTA；
所述Tris-Cl的摩尔浓度优选为200mmol/L；
所述EDTA的摩尔浓度优选为0.5mmol/L。
在本发明中，所述Tris-Cl的作用为提供所需溶剂的pH环境；
所述EDTA的作用为Ca2+和Mg2+等二价金属离子螯合剂，通过螯二价合金属离子达到抑制DNase活性作用。
在本发明中，所述SDS水溶液的pH为7.4～7.6，优选为7.5。
在本发明中，所述异硫氰酸胍水溶液中还包括摩尔浓度为24～26mmol/L的柠檬酸钠、摩尔浓度为95～105mmol/L的β-巯基乙醇和质量浓度为0.4～0.6％的N-十二烷基肌氨酸钠；
所述柠檬酸钠的摩尔浓度优选为25mmol/L；
所述β-巯基乙醇的摩尔浓度优选为100mmol/L；
所述N-十二烷基肌氨酸钠的质量浓度优选为0.5％。
在本发明中，所述柠檬酸钠的作用为：控制反应体系的离子强度，同时还有一定的缓冲作用，保证体系pH的相对稳定状态；
所述N-十二烷基肌氨酸钠的作用为：离子去污剂，破坏组织细胞超微结构，抑制核酸酶活性；
所述β-巯基乙醇的作用为：促进蛋白质变性。
在本发明中，所述异硫氰酸胍水溶液的pH为6.9～7.1，优选为7.0。
在本发明中，所述纯化试剂包括乙酸钾水溶液、Tris乙醇溶液、异丙醇、酚/氯仿/异戊醇抽提液、质量浓度为100％的乙醇、TE和ddH2O中的一种或几种；
所述乙酸钾水溶液的质量浓度为490～510g/L，优选为500g/L；
每升所述的乙酸钾水溶液中还包括9～11mL乙酸，优选为10mL乙酸；
所述Tris乙醇溶液的配制方法为：每升质量浓度为70～80％的乙醇中溶解28～32gTris得到；
所述乙醇的质量浓度优选为75％；
所述Tris的加入量优选为30g。
在本发明中，所述试剂盒中还包括硅酸纤维离心柱、Ep管、生物安全自封袋。
本发明还提供了所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：将待测样品放于经裂解液处理后的滤纸上，纯化，得到核酸样品。
在本发明中，还包括如下步骤：将待测样品放于经裂解液处理后的滤纸上后再次进行裂解处理的步骤。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
实施例1试剂盒中溶液的配制方法：
质量浓度为2.5％的SDS水溶液：在质量浓度为2.5％的SDS水溶液中，加入摩尔浓度为210mmol/L的Tris-Cl和摩尔浓度为0.5mmol/L的EDTA，得到。经测定所述SDS水溶液的pH为7.42。
乙酸钾水溶液：50g乙酸钾溶于100mL水中，溶解后加入1mL乙酸得到。
Tris乙醇溶液：将32g Tris溶于80％的乙醇中得到。
将以上配制的SDS水溶液、乙酸钾水溶液、Tris乙醇溶液、蛋白酶K、异丙醇、ddH2O、1.5mL Ep管、生物安全自封袋、硅酸纤维离心柱和whatman3mm滤纸组装成实施例1的试剂盒。
实施例1的试剂盒的使用方法如下：
将whatman 3mm滤纸浸泡于SDS水溶液中2h，烘干得到处理后的滤纸。将待测样品涂抹于处理后的滤纸上，晾干，得到携带样品的滤纸。将携带样品的滤纸剪出一个直径为1cm的圆片，放置于1.5mL Ep管中，在管中加入20μL蛋白酶K和480μLddH2O，盖住管盖，上下颠倒20次混匀，50℃温浴5min之后，加入100μL乙酸钾水溶液，混匀，冰上放置3min，10000r/min离心5min，将上清液转移至硅酸纤维离心柱中，加入上清液体积0.6倍的异丙醇回收核酸。使用方法如图1所示。
实施例2
实施例2试剂盒中溶液的配制方法：
摩尔浓度为3.8mmol/L的异硫氰酸胍水溶液中含有摩尔浓度为25mmol/L的柠檬酸钠、摩尔浓度为98mmol/L的β-巯基乙醇和质量浓度为0.4～0.6％的N-十二烷基肌氨酸钠。经测定所述异硫氰酸胍水溶液的pH为7.1。
乙酸钾水溶液：49g乙酸钾溶于100mL水中，溶解后加入1mL乙酸得到。
酚/氯仿/异戊醇抽提液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。
将以上配制的异硫氰酸胍水溶液、乙酸钾水溶液、酚/氯仿/异戊醇抽提液、异丙醇、ddH2O、1.5mL Ep管、生物安全自封袋、硅酸纤维离心柱和whatman 3mm滤纸组装成实施例2的试剂盒。
实施例2的试剂盒的使用方法如下：
将whatman 3mm滤纸浸泡于异硫氰酸胍水溶液中2h，烘干得到处理后的滤纸。将待测样品涂抹于处理后的滤纸上，晾干，得到携带样品的滤纸。将携带样品的滤纸剪出一个直径为1cm的圆片，放置于1.5mL Ep管中，在管中加入500μLddH2O，盖住管盖，旋涡振荡5min后，加入酚/氯仿/异戊醇抽提液，混匀，冰上放置15min，离心分相，取上清液转移至硅酸纤维离心管中，加入上清液体积0.75倍的异丙醇回收核酸。使用方法如图2所示。
实施例3
实施例3试剂盒中溶液的配制方法：
质量浓度为2％的SDS水溶液：在质量浓度为2％的SDS水溶液中，加入摩尔浓度为200mmol/L的Tris-Cl和摩尔浓度为0.6mmol/L的EDTA，得到。经测定所述本实施例SDS水溶液的pH为7.5。
乙酸钾水溶液：51g乙酸钾溶于100mL水中，溶解后加入1mL乙酸得到。
Tris乙醇溶液：将28gTris溶于70％的乙醇中得到。
将以上配制的SDS水溶液、乙酸钾水溶液、Tris乙醇溶液、蛋白酶K、质量浓度为100％的乙醇、ddH2O、1.5mL Ep管、生物安全自封袋和whatman Grade GF/F:0.7μm滤纸组装成实施例3的试剂盒。
实施例3的试剂盒的使用方法如下：
将whatman Grade GF/F:0.7μm滤纸浸泡于SDS水溶液中2h，烘干得到处理后的滤纸。将待测样品涂抹于处理后的滤纸上，晾干，得到携带样品的滤纸。将携带样品的滤纸剪出一个直径为1cm的圆片，放置于1.5mL Ep管中，在管中加入20μL蛋白酶K和480μLddH2O，混匀，静置5min后，加入100μL乙酸钾溶液，充分混匀后静置2min，移去溶液；加入500μLTris乙醇溶液洗涤，移去溶液后，再加入500μLTris乙醇溶液洗涤1次，洗涤完成后，移去溶液加入500μL100％的乙醇再洗涤一次。之后移去溶液，室温待乙醇完全挥发，盖上离心管盖，备用。使用方法如图3所示。
应用实施例1
将实施例1～3的试剂盒分别按照各自试剂盒的使用方法采集全血样品和唾液样品中的核酸，各8次，检测各实施例的试剂盒对样本采集的核酸中的CT值。结果见表1～3。
表1采用实施例1的试剂盒分别采集全血样品和唾液样品的CT值
表2采用实施例2的试剂盒分别采集全血样品和唾液样品的CT值
表3采用实施例3的试剂盒分别采集全血样品和唾液样品的CT值
表1～3显示，CV值均小于5％，说明采用本实施例1～3的试剂盒采集得到的全血和唾液中核酸值均稳定。
应用实施例2
将实施例1～3的试剂盒分别按照各自试剂盒的使用方法采集全血和唾液样品中的核酸，分别与柱提法和磁珠提取法做对照，比较不同方法采集得到的核酸的纯度、浓度和回收率。结果见表4。
表4不同方法采集得到的核酸的性能
| 全血样本 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 柱提 | 磁珠提取 |
| 核酸纯度 | 1.80 | 1.79 | 1.82 | 1.81 | 1.85 |
| 核酸浓度 | 70.30ng/μL | 67.21ng/μL | 58.23ng/μL | 72.11ng/μL | 68.42ng/μL |
| 回收率 | 89.02％ | 76.35％ | 72.94％ | 88.27％ | 85.22％ |
| 唾液样本 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 柱提 | 磁珠提取 |
| 核酸纯度 | 1.81 | 1.78 | 1.76 | 1.87 | 1.79 |
| 核酸浓度 | 62.31ng/μL | 68.52ng/μL | 68.14ng/μL | 62.98ng/μL | 65.70ng/μL |
| 回收率 | 81.42％ | 83.54％ | 86.55％ | 82.60％ | 83.41％ |
表4显示：对200μL样本提取核酸，得到核酸的浓度＞20ng/μL，总核酸量＞2μg；得到核酸OD260/280的值满足1.7±0.1～2.0±0.1，回收率≥70％，符合标准。
由以上实施例可知，本发明提供了一种核酸采集试剂盒及其使用方法，本发明的核酸采集试剂盒较现有技术具有如下优点：
(1)以特殊植物纤维载体作为存储核酸的新型介质，优化了样品吸收和洗脱指标；保障有效的核酸样本量；
(2)采用科学的裂解液浸泡载体，使核酸样品细胞膜快速溶解，改变蛋白质特性，释放核酸；
(3)采用本发明的试剂盒采集得到的核酸样品可直接进行PCR、SNP分析；
(4)本发明的试剂盒采集核酸能够阻止细菌、真菌和其他微生物的生长，保护检验人员安全；
(5)本发明的试剂盒具有方便、快捷、安全和稳定的特性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种核酸采集试剂盒，其特征在于，包括如下组分：滤纸、裂解液、纯化试剂；
所述滤纸为：whatman 3mm滤纸或whatman Grade GF/F:0.7μm滤纸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解剂为：SDS水溶液、异硫氰酸胍水溶液和蛋白酶K中的一种或多种；
所述SDS水溶液的质量浓度为1.5～2.5％；
所述异硫氰酸胍水溶液的摩尔浓度为3.5～4.5mol/L。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述SDS水溶液中还包括摩尔浓度为190～210mmol/L的Tris-Cl和摩尔浓度为0.4～0.6mmol/L的EDTA。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述SDS水溶液的pH为7.4～7.6。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸胍水溶液中还包括摩尔浓度为24～26mmol/L的柠檬酸钠、摩尔浓度为95～105mmol/L的β-巯基乙醇和质量浓度为0.4～0.6％的N-十二烷基肌氨酸钠。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸胍水溶液的pH为6.9～7.1。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述纯化试剂包括乙酸钾水溶液、Tris乙醇溶液、异丙醇、酚/氯仿/异戊醇抽提液、质量浓度为100％的乙醇、TE和ddH2O中的一种或几种；
所述乙酸钾水溶液的质量浓度为490～510g/L；
每升所述的乙酸钾水溶液中还包括9～11mL乙酸；
所述Tris乙醇溶液的配制方法为：每升质量浓度为70～80％的乙醇中溶解28～32gTris得到。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括硅酸纤维离心柱、Ep管、生物安全自封袋。
9.权利要求1～8任意一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：将待测样品放于经裂解液处理后的滤纸上，纯化，得到核酸样品。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，还包括如下步骤：将待测样品放于经裂解液处理后的滤纸上后再次进行裂解处理的步骤。
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