CN104498635A - 一种登革热病毒荧光pcr 检测试剂盒 - Google Patents

一种登革热病毒荧光pcr 检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种登革热病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于检测靶核苷酸的一对引物序列和四条探针序列的PCR反应液和含磁珠的RNA提取溶液，且所述探针序列为：探针1：5’FAM-CTCAGAGACATATCAAAGATTCCCGGG-BHQ1 3’；探针2：5’FAM-TAAGAGACGTGAGCAAGAAAGAGGGAGGAG-BHQ1 3’；探针3：5’FAM-ACATTTCCAAGATACCCGGAGGAG-BHQ1 3’；探针4：5’FAM-CCTAGAGGACATAGACAAAAAGGAAGGAGACC-BHQ1 3’。本发明提供的试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高(可达50copie/ml)、检测范围宽，并且能检出登革热病毒的4个血清型。

Description

一种登革热病毒荧光PCR 检测试剂盒
技术领域
本发明提供一种登革热病毒荧光PCR检测试剂盒，具体是一种登革热病毒通用型荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
登革热(Dengue fever，DF)是由1～4型登革热病毒(Dengue fever virus,DENV)引起、经伊蚊传播的急性传染病，按照《中华人民共和国传染病防治法》的规定其为乙类传染病。登革热临床表现复杂多样，具有传播迅猛、发病率高及严重类型(登革出血热、登革休克综合征)病死率较高、人群普遍易感等特点，加上登革热的输入性、突发性，易致误诊、漏诊，造成传染源“逍遥”传播，而致疫情报告、调查处理不及时从而造成疫情蔓延。亚洲、大洋洲、美洲和非洲均有本病发生，是热带、亚热带地区的一个非常严重的公共卫生问题。早发现、早隔离、早就地治疗是登革热病毒临床诊疗的关键。关于登革热病毒的详细情况如下：
(一)病原学
登革热病毒为黄病毒科(F1aviviridae)黄病毒属(F1avivirus)，共有四种血清型(DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4)和多种生物型。成熟的病毒颗粒核心直径约30nm，由单股正链RNA与壳蛋白C构成，外包一层厚约10nm的脂质包膜，包含膜蛋白E和膜蛋白M。RNA有一个开放性阅读框架，约含11000个核苷酸序列，编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白。结构蛋白包括核壳蛋白C，包膜蛋白E和M。包膜蛋白E诱导生成血凝抑制抗体，中和抗体和保护性抗体。抗E的抗体具有抗体依赖感染增强作用。最外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有型和群特异性抗原，用中和试验可鉴定其型别。登革病毒结构与其它黄病毒相近，4个血清型可与其他B组虫媒病毒如乙型脑炎病毒可交叉免疫反应。
登革病毒不耐热，60度30min，100度2min均可使之灭活，但可耐低温及干燥，对寒冷的低抗力强，在人血清中贮存于普通冰箱可保持传染性数周，-70℃可存活8年之久；不耐酸、不耐醚。用乙醚、紫外线或0.05％福尔马林可以灭活。
(二)流行病学特征
传染源：患者和隐性感染者为主要传染源，未发现健康带病毒者。患者在发病前6～8小时至病程第6天，具有明显的病毒血症，可使叮咬伊蚊受感染。流行期间，轻型患者数量为典型患者的10倍，隐性感染者为人群的1/3，可能是重要传染源，丛林山区的猴子和城市中某些家畜虽然有感染登革病毒的血清学证据，但作为传染源，尚未能确定。
传播媒介：已知有12种伊蚊可传播本病，但最主要的是埃及伊蚊和白纹伊蚊。在不同地区中不同蚊种所起的作用不一样，如在太平洋岛国及我国的广东、广西，白纹伊蚊是主要传播媒介，而雷州半岛、广西沿海、海南省和东南亚地区以埃及伊蚊传播为主。伊蚊只要与有传染性的液体接触一次，即可获得感染，病毒在蚊体内复制8～14天后即具有传染性，传染期长者可达174日。具有传染性的伊蚊叮咬人体时，即可将病毒传播给人。因在捕获伊蚊的卵巢中检出登革病毒颗粒，推测伊蚊可能是病毒的储存宿主。
易感人群：在新疫区各年龄均普遍易感，但青壮年的临床表现较明显。1980年在广东流行中，最小年龄3个月，最大86岁，但以青壮年发病率最高。在地方性流行区，20岁以上的居民，100％在血清中能检出抗登革热病毒的中和抗体，因而发病者多为儿童。
目前确认有四种型别的登革热病毒，由于对不同型别毒株感染无交叉免疫力，因此可以发生二次感染。感染一种病毒型产生的免疫对同型病毒免疫力可持续1～4年，而对异型病毒的免疫则短暂且不可靠。
流行特性：一是地方性；凡有伊蚊孳生的自然条件及人口密度高的地区，均可发生地方性流行，在城市中流行一段时间之后，可逐渐向周围的城镇及农村传播，在同一地区，城镇的发病率高于农村。二是季节性；发病季节与伊蚊密度、雨量相关。在气温高而潮湿的热带地区，蚊媒常年繁殖，全年均可发病。我国广东、广西为5～10月，海南省3～10月。三是突然性；流行多突然发生，不少国家在本病消慝十余年之后突然发生流行，我国40年代在东南沿海曾有散发流行，至1978年在广东佛山突然流行。四是传播迅速，发病率高，病死率低，疫情常由一地向四周蔓延。如1978年5月广东省佛山市石湾镇首先发生登革热，迅速波及几个市、县。1980年3月海南省开始流行，很快席卷全岛，波及广东内陆几十个省、市。病死率0.016％～0.13％。本病可通过现代化交通工具远距离传播，故多发生在交通沿线及对外开放的城镇。
(三)临床表现
登革热潜伏期为3～14天，一般5～7天。按世界卫生组织标准分为典型登革热、登革出血热和登革休克综合征3型。我国近年来所见的登革热可分为典型登革热、轻型登革热和重型登革热。
1.典型登革热
1.1发热所有患者均发热。起病急，先寒战，随之体温迅速升高，24小时内可达40℃。一般持续5～7d，然后骤降至正常，热型多不规则，部分病例于第3～5d体温降至正常，1日后又再升高，称为双峰热或鞍型热。儿童病例起病较缓、热度也较低。
1.2全身毒血症状发热时伴全身症状，如头痛、腰痛，尤其骨、并节疼痛剧烈，似骨折样或碎骨样，严重者影响活动，但外观无红肿。消化道症状可有食欲下降，恶心、呕吐、腹痛、腹泻。脉搏早期加快，后期变缓。严重者疲乏无力呈衰竭状态。
1.3皮疹于病程3～6日出现，为斑丘疹或麻疹样皮疹，也有猩红热样皮疹，红色斑疹，重者变为出血性皮疹。皮疹分布于全身、四肢、躯干和头面部，多有痒感，皮疹持续5--7日。疹退后无脱屑及色素沉着。
1.4出血25～50％病例有不同程度出血，如牙龈出血、鼻衄、消化道出血、咯血、血尿等。
1.5其他多有浅表淋巴结肿大。约1/4病例有肝脏肿大及ALT升高，个别病例可出现黄疸，束臂试验阳性。
2.轻型登革热：表现类似流行性感冒，短期发热，全身疼痛较轻，皮疹稀少或无疹，常有表浅淋巴结肿大。因症状不典型，容易误诊或漏疹。
3.重型登革热：早期具有典型登革热的所有表现，但于3～5病日突然加重，剧烈头痛、呕吐、谵妄、昏迷、抽搐、大汗、血压骤降、颈强直、瞳孔散大等脑膜脑炎表现。有些病例表现为消化道大出血和出血性休克。
4.并发症和少见临床表现
4.1脑病：东南亚等多国均有神经系统病变引起死亡的病例报告。中枢神经系统异常表现有抽搐，痉挛，意识改变，轻瘫。婴幼儿在发热期可出现细小发作的惊厥。过量补液治疗DHF/DSS时导致水中毒，低钠血症进而引起脑病。颅内出血可引起脑水肿或脑疝形成。
4.2肝衰竭：初次或二次感染的病例均有肝衰竭发生，这些病例出现大片状肝细胞坏死。DF抗原可在肝细胞，Kuffer细胞和急性炎症细胞中检出。
4.3急性肾功能衰竭：常见于终末期的病人。
4.4容血尿毒综合征：多发生于G-6-PD缺乏的病人。
4.5.医源性合并症：败血病，肺炎，伤口感染，水分过多引起心肺功能衰竭。
(四)诊断和治疗
依据患者的流行病学资料、临床表现及实验室检查结果综合判断进行登革热的临床诊断。治疗原则为早发现、早隔离、早就地治疗。具体治疗措施包括对症支持治疗、抗病毒治疗及预防性治疗(预防出血、休克、感染等)。
(五)实验室检测
目前实验室检测有以下几种方法：
1血清学检测
1.1补体结合试验和血凝抑制试验：单份血清补体结合试验效价超过1：32，血凝抑制试验效价超过1：1280者有诊断意义。双份血清恢复期抗体效价比急性期高4倍以上者可以确诊。
1.2免疫层析法和ELISA方法检测DEV-IgM和IgG。具有简便，快速，敏感特异等优点。阳性率可在85％～100％。IgM抗体在发病后5～10天出现，检测其有早期诊断价值。
1.3免疫荧光法：检测血清，肝组织及尸解组织的病毒抗原。
2病原学检测
病原学检测主要为病毒分离，将急性期患者(起病1～5天)血清，采用白纹伊蚊细胞株C6/36进行病毒分离，阳性率高达70％，第1病日阳性率可达40％，以后逐渐减低，最长在病程第12d仍可分离出病毒。分离出的病毒可进行血清型别鉴定。
3核酸检测
采用RT-PCR等核酸扩增方法检测。一般发病后一周内的病人血清或血浆中可检测到病毒核酸。
登革热病毒血清学检测、病原学检测检测时间长，灵敏度低；病毒的分离培养是诊断的金标准，分离培养的病毒可用于其它研究，但是分离培养的过程耗时长，且需要严格的实验条件。对暴发疫情来讲，急需尽早查清病因，以采取相应的公共卫生应急举措，对疫情快速采取应对措施，对疑似病例做出快速准确的诊断对保护人类自身的健康有重要意义。因此开展登革热病毒的快速准确诊断是很有必要的。近年发展的逆转录PCR(RT-PCR)，巢式PCR(nested PCR)技术将病毒RNA检测的特异性和灵敏度大大提高，而实时荧光PCR的出现又将此检测技术推向了另一台阶。实时荧光PCR作为一种现代分子生物学基因诊断技术，具有高度敏感性和特异性，能在数小时内检出痕量病原，为登革热病毒早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。
通过荧光PCR的方法直接检测登革热病毒RNA，大大提高登革热病毒感染的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，荧光PCR方法与其它检测方法相比具有以下优势：(1)与免疫学检测比较，具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。(2)根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。(3)能对病毒进行定量或定性检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。(4)可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对登革热病毒这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。(5)将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤。(6)全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。(7)实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中微弱信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。
结合目前现状，在临床登革热病毒感染的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，但是缺乏完善的质控体系及检测的全面性，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。
国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测登革热病毒的方法，这些试剂盒所提供的DENV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。但酚-氯仿法操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；而柱提取方法虽无需高速离心，但是需频繁更换离心管，且提取用时长，特异性较差。另外，受限于其引物探针序列，其检测灵敏度欠佳，且对4种登革热血清型的覆盖性欠佳，可能出现漏检现象，本领域还需开发出一种检测登革热病毒特异性好且综合性能优良的PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于解决现有登革热病毒荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽并且能检测4个血清型的登革热病毒荧光PCR检测试剂盒。
因此，本发明提供一种登革热病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于检测靶核苷酸的一对引物序列和四条探针序列的PCR反应液和含磁珠的RNA提取溶液，且所述引物探针序列为：
上游引物：5’-GGAAGGAGAAGGACTGCACA-3’；
下游引物：5’-ATTCTTGTGTCCCATCCTGCT-3’；
探针1：5’FAM-CTCAGAGACATATCAAAGATTCCCGGG-BHQ13’；
探针2：5’FAM-TAAGAGACGTGAGCAAGAAAGAGGGAGGAG-BHQ13’；
探针3：5’FAM-ACATTTCCAAGATACCCGGAGGAG-BHQ13’；
探针4：5’FAM-CCTAGAGGACATAGACAAAAAGGAAGGAGACC-BHQ13’。
本发明提供的试剂盒在登革热病毒四种血清型中的任意一种或多种感染时检测结果为阳性。因为对登革热病毒四种血清型的临床用药没有显著区别，因此本发明提供一种通用型登革热病毒荧光PCR检测试剂盒。
在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含内标序列，以及在所述PCR反应液中还包含检测内标的引物探针序列，
内标序列为：5’-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3’；
内标上游引物：5’-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3’；
内标下游引物：5’-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3’；
内标探针：5’HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13’。
优选地，所述试剂盒中还包含如下组分，RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠；RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油。
在另一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含如下组分，RNA洗脱液：含Tris-HCl和EDTA；RT-PCR增强剂：浓度为100～500mmol/L的Mn(OAc)2水溶液。
在另一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含登革热阳性对照和登革热阴性对照。
本发明提供的试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高(可达50copie/ml)、检测范围宽，并且能检出登革热病毒的4个血清型。应用本发明提供的试剂盒，可以对血清、血浆样品中的登革热病毒核酸进行快速检测，为诊断登革热病毒感染提供可靠的实验依据。此外，对于已暴发的疫情，应用本发明提供的试剂盒检测可尽早查清病因，以便采取相应的公共卫生应急举措。该试剂盒在对疫情快速采取应对措施，对疑似病例做出快速准确的诊断以及对保护人类自身的健康等方面均有重要意义。
具体实施方式
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。本发明通过下述实施例进一步说明本发明，但实施例并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种登革热病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含如下独立存在的组分：
①RNA提取溶液I：由十二烷基硫酸钠0.2％～1.0％(质量/体积)、曲拉通1.0％～4.0％(体积/体积)，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L、100～400μg/ml的磁珠组成；
②RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠100～300mmol/L；
③RNA提取溶液III：曲拉通0.1％～1.0％(体积/体积)、氯化钠100～300mmol/L；
④RNA提取溶液IV：矿物油；
⑤RNA洗脱液：Tris-HCl 0.8～1.2mol/L、EDTA0.1～1.0mol/L；
⑥RT-PCR增强剂：将一定量的Mn(OAc)2与纯化水充分混匀，Mn(OAc)2终浓度为100～500mmol/L。
⑦内标(阳性内对照)：为插入pUC18T载体的一段长为128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.00E+04copies/ml～5.00E+04copies/ml copies/ml；128碱基对的序列如下所示：5’-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3’；
⑧PCR反应液：主要成分为：5×PCR反应缓冲液，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，1U/μl～5U/μl Tth DNA聚合酶，1U/μl～5U/μl H-Taq DNA聚合酶，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针，0.1μmol/L～0.2μmol/L用于扩增内标的上游引物以及下游引物，0.05μmol/L～0.2μmol/L用于检测内标的探针，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物：5’-GGAAGGAGAAGGACTGCACA-3’；
下游引物：5’-ATTCTTGTGTCCCATCCTGCT-3’；
探针1：5’FAM-CTCAGAGACATATCAAAGATTCCCGGG-BHQ13’；
探针2：5’FAM-TAAGAGACGTGAGCAAGAAAGAGGGAGGAG-BHQ13’；
探针3：5’FAM-ACATTTCCAAGATACCCGGAGGAG-BHQ13’；
探针4：5’FAM-CCTAGAGGACATAGACAAAAAGGAAGGAGACC-BHQ13’；
针对128碱基对的序列设计了非竞争性内标的引物探针，其碱基对序列分别为：
上游引物：5’-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3’；
下游引物：5’-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3’；
探针：5’HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13’；
⑨登革热阳性对照：为登革热病毒基因体外转录RNA，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml；
⑩登革热阴性对照：为阴性人造血清。
实施例2
本实施例中提供实施例1中所述登革热病毒核酸检测试剂盒用于检测血浆、血清等样本中DENV-RNA的操作方法。
1试剂准备：
1)按比例(RNA提取溶液I为200μl～1ml/人份+内标0.4μl/人份)取相应量的RNA提取溶液I及内标，充分混匀成RNA提取溶液1-mix，瞬时离心后备用。
2)根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例(PCR反应液49μl/人份+增强剂1μl/人份)取登革热PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
2RNA提取操作
1)裂解病毒：每管加入200μl～1ml RNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本(血浆、血清等待测样本)，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心(登革热病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；
2)磁珠吸附核酸：每管加入50μl～400μl RNA提取溶液2，震荡混匀10秒钟后，室温静置10～30分钟；
3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出；
4)洗涤：每管加入400μl～1ml RNA提取溶液3和100μl～500μl RNA提取溶液4，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
5)2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。
6)加入10μl～100ul RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中。
7)根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，向八联管中加入45μlPCR-mix。吸取已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖。
3荧光PCR反应与结果分析(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)检测DENV；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标。
3)荧光定量PCR反应条件为：
4)结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。对于测定Ct值≤38的样本，报告为DENV-RNA阳性；对于测定无Ct值的样本，同时内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为EBOV-RNA阴性。若内标Ct值>38或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。对于测定Ct值>38的样本，同时内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为低于检测下限。
本发明对Genbank中检索到的登革热病毒各型别基因组序列进行同源性比较，找出保守的区段，设计了多对通用引物，并分别针对登革热病毒四种血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4型)各设计了多条探针，经优化，筛选出了扩增效果最好的本发明中的引物和探针。其仅能检测出4种血清型的登革热病毒RNA，不能检测出其他病原体RNA，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。
本发明还对DENV-RNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性。本发明中含磁珠的RNA提取溶液结合PCR的靶核苷酸引物探针序列，使得本发明试剂盒的检测灵敏度可达50copie/ml，检测范围为5.00E+01～5.00E+09copies/ml。本发明还在反应体系中增加了内标，利用内标监控PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本因抑制而检测为假阴性。荧光PCR扩增结束后，经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可为灵敏、早期诊断登革热病毒感染提供可靠的实验证据。
本发明提供的试剂盒对登革热4个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)均检测为阳性，阳性符合率为100％。本发明提供的试剂盒对正常人血清样本、或者HAV、HBV、HCV、HEV、HIV-1、EBV、HCMV感染样本，检测结果均为阴性，阴性符合率为100％。
登革热病毒样本梯度稀释试验表明：本发明提供的试剂盒的线性范围为5.00E+09～5.00E+01copies/ml，检测下限可达50copies/ml。本发明中使用磁珠法提取纯化DENV RNA，血浆、血清样本的DENV检测和内标检测的结果均有Ct值(即都为阳性)，体系中没有PCR抑制物的存在。本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血浆、血清样本的RNA提取和PCR检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种登革热病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括用于检测靶核苷酸的一对引物序列和四条探针序列的PCR反应液和含磁珠的RNA提取溶液，且所述引物探针序列为：
上游引物：5’-GGAAGGAGAAGGACTGCACA-3’；
下游引物：5’-ATTCTTGTGTCCCATCCTGCT-3’；
探针1：5’FAM-CTCAGAGACATATCAAAGATTCCCGGG-BHQ1 3’；
探针2：5’FAM-TAAGAGACGTGAGCAAGAAAGAGGGAGGAG-BHQ1 3’；
探针3：5’FAM-ACATTTCCAAGATACCCGGAGGAG-BHQ1 3’；
探针4：5’FAM-CCTAGAGGACATAGACAAAAAGGAAGGAGACC-BHQ1 3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含内标序列，以及在所述PCR反应液中还包含检测内标的引物探针序列，
内标序列为：5’-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3’；
内标上游引物：5’-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3’；
内标下游引物：5’-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3’；
内标探针：5’HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ1 3’。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含如下组分，
RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠；
RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；
RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；
RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含如下组分，
RNA洗脱液：含Tris-HCl和EDTA；
RT-PCR增强剂：浓度为100～500mmol/L的Mn(OAc)2水溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含登革热阳性对照和登革热阴性对照。
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