CN105349706A - 一种柯萨奇病毒ca6型荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

一种柯萨奇病毒ca6型荧光定量pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、RT-PCR增强剂、内标、PCR反应液、CA6阳性对照品、CA6阴性对照品；本发明提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒仅仅能检测出CA6-RNA，而不能检测出其他病原体RNA，并且检测灵敏度、准确度和稳定性高，检测灵敏度可达50copie/ml，检测范围为5.00E+01～5.00E+09copies/ml，为早期诊断柯萨奇病CA6型感染提供可靠的实验证据。

Description

一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。
背景技术
手足口病(hand.foot-mouthdisease)是世界范围内流行的儿童常见病，主要发生于3岁以下儿童，但偶有成人发病的报告，是由多种肠道病毒引起的，以发热和手、足、口腔等部位出现疱疹为主要特征的疾病，少数患病儿童可出现脑炎，急性弛缓性麻痹，心肌炎，脑水肿等严重并发症，病情进展快，严重者可导致死亡。近些年来，手足口病在许多国家，特别是亚太地区发生过多次的爆发或流行，越来越受到各国的关注。引起手足口病的病原体多样，但都为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科的肠道病毒。到目前为止，有文献报道的20多个血清型可引起手足口病，主要有CAl6、CA6、CA7、CA9、CAl0、CB2、CB5、CBl3、ECH019以及EV71型等。最近，由于在世界范围的不同国家，CA6已经逐渐成为导致手足口病的主要致病原，该病毒受到了越来越多的关注。
在2013年夏天，中国长春市爆发了手足口病，总共有1125例病人确诊为手足口病患者，大部分均为5岁以下，总共220份手足口病样本被收集并进行检测，有101份(66.9％)为CA6感染，其他感染的肠道病毒包括CA2(1.3％)，CA10(1.9％)，CA14(0.6％)，CAl6(5.9％)，CB4(1.3％)，EV71(19.2％)和EC30(0.6％)。在2012年，该城市的EV71阳性率占检测样本的25.5％，CAl6则占到55.5％，但是在2013年，长春市CA6已经取代EV71和CVAl6成为新的手足口病主要致病原。同样在2013年，中国的深圳也爆发了手足口病，在201份肠道病毒阳性标本中，CA6感染率变成第一(47.8％)，其次是EV71(18.9％)，再次是CAl6(i.5％)。其他的肠道病毒也被检测到。在2013年，深圳市CA6取代TEV71成为手足口病的主要致病原。
柯萨奇病毒CA6型与其他柯萨奇病毒一样，属于小RNA病毒科，肠道病毒属(Enterovirus)，致病谱广，是多种人类疾病的致病原。CA6病毒现在已经成为引起儿童HFMD的主要病原之一。CA6病毒颗粒为二十面体对称球形，由核酸和蛋白质组成，无包膜和突起。病毒颗粒核心含一开放阅读框架，编码的多聚蛋白经过自身蛋白酶水解，分为Pl、P2和P3三种前体蛋白。P1区前体蛋白又可编码病毒的结构蛋白P1～VP4，组成病毒衣壳。目前常用的诊断方法为：病毒分离方法、血清学方法、PCR方法。
其中，病毒分离方法利用组织培养、分离肠道病毒是目前诊断手足口病病原的金标准，但是由于任何一种细胞都不可能对引起手足口病所有肠道病毒进行培养，所以，虽然病毒培养技术是检测诊断肠道病毒的金标准，但此方法操作繁琐，分离率不高，在手足口病的流行爆发期间，难以推广应用；血清学方法最常用的方法是酶联免疫吸附实验(ELISA)，这种方法可以对单份血清或急性期和恢复期的双份血清进行检测，简单、快速，不需要特别的仪器，非常适合基层医疗单位，但由于肠道病毒共同抗原表位的存在，所以均有不同程度的交叉反应性；PCR(polymerasechainfaction，聚合酶链式反应)，是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制，即使采集的标本中含有微量的病毒RNA或是失活病毒，也能经过PCR扩增后检测出来。与病毒分离以及血清学检测相比，RT-PCR具有特异、简单、快速、敏感等优点，并且，扩增产物可以通过测序之后用于分子流行病学分析。但是PCR也存在许多不足之处，PCR消耗试剂大、操作步骤多、容易造成PCR污染，并且，PCR一次性检测的样本数有限，大规模检测时耗时耗力。
结合国内情况，在临床HFM诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，目前只有极少量荧光PCR诊断试剂盒在CA6诊断中使用，缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。
临床上检测CA6-RNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测柯萨奇病毒CA6型的方法，这些试剂盒所提供的CA6-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法，但是，有以下不足之处：(1)酚-氯仿法虽然是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法虽然无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；(2)无法有效去除样本中的PCR抑制物；(3)没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性；(4)一般没有预防PCR产物污染的措施；(5)现有方法检测灵敏度欠佳，可能出现漏检现象。
发明内容
本发明的目的在于解决现有柯萨奇病毒CA6型核酸荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种具有操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的柯萨奇病毒CA6型核酸荧光定量PCR检测试剂盒，本试剂盒可以柯萨奇病毒CA6型RNA核酸片段进行快速荧光PCR检测，并且可以对人血清或咽拭子或疱疹渗出液等标本中的柯萨奇病毒CA6型进行定量分析，检测结果可用于柯萨奇病毒CA10型感染的辅助诊断和疾病监控。
本发明实施例中提供了一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、RT-PCR增强剂、内标、PCR反应液、CA6阳性对照品、CA6阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物以及下游引物，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物：5'-CTGCAGAAACGGGAGCAAG-3'；
下游引物：5'-GAGTAAAAGTGTTCCACACTCGC-3'；
探针1：5'FAM-ACCCCGTTTCGATTCATCACACA-BHQ13'。
优选的，上述检测试剂盒，其中，所述内标为插入pUC18T载体的长为128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+04copies/ml～5.00E+04copies/ml；所述128碱基对的序列如下所示：
5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3'。
优选的，上述检测试剂盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下组分：
RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.2％～1.0％、曲拉通，体积/体积1.0％～4.0％，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L、100μg/ml～400μg/ml的磁珠；
RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L～300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠100mmol/L～300mmol/L；
RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.1％～1.0％、氯化钠100mmol/L～300mmol/L；
RNA提取溶液IV：矿物油。
优选的，上述检测试剂盒，其中，所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.8mol/L～1.2mol/L、EDTA0.1mol/L～1.0mol/L。
优选的，上述检测试剂盒，其中，所述RT-PCR增强剂为Mn(OAc)2，其浓度为100mmol/L～500mmol/L。
优选的，上述检测试剂盒，其中，所述PCR反应液还包括5×PCR反应缓冲液，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，1U/μl～5U/μlTthDNA聚合酶，1U/μl～5U/μlH-TaqDNA聚合酶，0.1μmol/L～0.2μmol/L用于扩增内标的上游引物以及下游引物，0.05μmol/L～0.2μmol/L用于检测内标的探针。
优选的，上述检测试剂盒，其中，所述用于扩增内标的上游引物以及下游引物以及用于检测内标的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物：5'-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3'；
下游引物：5'-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3'；
探针：5'HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13'。
优选的，上述检测试剂盒，其中，所述CA6阳性对照品为CA6病毒基因体外转录RNA，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml。
优选的，上述检测试剂盒，其中，所述CA6阴性对照品为经过灭菌处理的生理盐水。
本发明实施例还提供了使用上述的检测试剂盒检测样本中CA6-RNA的方法，其包括如下步骤：
(1)试剂准备；
按照提取溶液I200μl～1ml/人份，CA6-内标1μl/人份的比例，取相应量的RNA提取溶液I及CA6-内标，充分混匀得提取溶液1-mix，瞬时离心后备用；
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液49μl/人份，RT-PCR增强剂1μl/人份的比例，取相应量的PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混匀，得PCR-mix，瞬时离心后备用；
(2)RNA提取：磁珠法提取CA6-RNA；
S01裂解病毒：准备无核酸酶的1.5mL离心管，每管加入200μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀，瞬时离心后备用；
S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后备用的溶液中加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀，室温静置10～30分钟；
S03去除杂质：静止结束，瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；
S04洗涤：在步骤S03备用的磁珠内加入400μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～500μlRNA提取溶液IV，震荡混匀，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
S05静止2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠保留备用；
S06在步骤S05保留备用磁珠中加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；
S07根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个0.2mLPCR反应管加入45μlPCR-mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
(3)荧光PCR反应和结果分析：
选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测CA6；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标；利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值结果，根据各样本Ct值大小，判断检测结果。
本发明的磁珠法提取纯化CA6RNA，待检样本的CA6检测和内标检测的结果均有Ct值(即都为阳性)，体系中没有PCR抑制物的存在；而目前常用的TRIZOL法和柱提取法中，均存在低浓度咽拭子样本的CA6检测无Ct值(Undet)的情况(即为阴性)，而此时内标也检测为阴性(Undet)，由于3种提取方法使用的是同一种PCR扩增体系，由此说明，TRIZOL法和柱提取法提取的RNA中有PCR抑制物存在，可能导致CA6阳性样本检测为阴性，即为假阴性，提示应该进行重新检测或者改进方法进行检测。因此，本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血浆、血清，拭子样本的RNA提取和PCR检测。同时也说明，体系中加入内标，可以有效预防假阴性结果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明对CA6病毒各型别基因组序列进行同源性比较，找出保守的区段，设计了特异性引物和特异性荧光探针，经引物探针筛选，获得了检出率、特异性较好的引物探针，仅能检测出CA6-RNA，而不能检测出其他病原体RNA，本发明试剂盒具有良好的特异性；
(2)对CA6-RNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，检测灵敏度可达50copie/ml，检测范围为5.00E+01～5.00E+09copies/ml；
(3)反应体系中增加了内标，利用内标监控PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本因抑制而检测为假阴性，荧光PCR扩增结束后，经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可为灵敏、早期诊断柯萨奇病CA6型感染提供可靠的实验证据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.本发明实施例提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒中特异定量参考品A(5.00E+06copies/ml)、B(5.00E+05copies/ml)、C(5.00E+04copies/ml)和D(5.00E+03copies/ml)的扩增曲线图；
图2.本发明实施例提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒中定量分析浓度-Ct值的线性关系图；
图3.本发明实施例提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒的特异性检测曲线图；
图4.本发明实施例提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒的内标扩增曲线图；
图5.本发明实施例提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒的标本稀释扩增曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中提供了一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、RT-PCR增强剂、内标、PCR反应液、CA6阳性对照品、CA6阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物以及下游引物，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物：5'-CTGCAGAAACGGGAGCAAG-3'；
下游引物：5'-GAGTAAAAGTGTTCCACACTCGC-3'；
探针1：5'FAM-ACCCCGTTTCGATTCATCACACA-BHQ13'。
所述内标为插入pUC18T载体的长为128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+04copies/ml～5.00E+04copies/ml；所述128碱基对的序列如下所示：
5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3'。
所述RNA提取溶液包括如下组分：
RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.2％～1.0％、曲拉通，体积/体积1.0％～4.0％，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L、100μg/ml～400μg/ml的磁珠；
RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L～300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠100mmol/L～300mmol/L；
RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.1％～1.0％、氯化钠100mmol/L～300mmol/L；
RNA提取溶液IV：矿物油。
所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.8mol/L～1.2mol/L、EDTA0.1ol/L～1.0mol/L。
所述RT-PCR增强剂为Mn(OAc)2，其浓度为100mmol/L～500mmol/L。
所述PCR反应液还包括5×PCR反应缓冲液，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，1U/μl～5U/μlTthDNA聚合酶，1U/μl～5U/μlH-TaqDNA聚合酶，0.1μmol/L～0.2μmol/L用于扩增内标的上游引物以及下游引物，0.05μmol/L～0.2μmol/L用于检测内标的探针。
所述用于扩增内标的上游引物以及下游引物以及用于检测内标的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物：5'-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3'；
下游引物：5'-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3'；
探针：5'HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13'。
所述CA6阳性对照品为CA6病毒基因体外转录RNA，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml。
所述CA6阴性对照品为经过灭菌处理的生理盐水。
使用高浓度CA6病毒保存液，按照10倍使用TE溶液梯度稀释四个梯度，即A(5.00E+06copies/ml)、B(5.00E+05copies/ml)、C(5.00E+04copies/ml)和D(5.00E+03copies/ml)，并以此四个样本作为定量参考品进行试验。
(1)试剂准备；
按照提取试剂1200μl～1ml/人份，CA10-内标1μl/人份的比例，取相应量的RNA提取溶液I及CA6-内标，充分混匀得提取溶液1-mix，瞬时离心后备用；
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液49μl/人份，RT-PCR增强剂1μl/人份的比例，取相应量的PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混匀，得PCR-mix，瞬时离心后备用；
(2)RNA提取：磁珠法提取CA6-RNA；
S01裂解病毒：准备无核酸酶的1.5mL离心管，每管加入200μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心后备用；
S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后备用的溶液中加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟，室温静置10～30分钟；
S03去除杂质：静止结束后瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，保留磁珠备用；
S04洗涤：在备用的磁珠内加入400μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～500μlRNA提取溶液IV，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
S05静止2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠保留备用；
S06在上述保留备用磁珠中加入10μl～100μlRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；
S07根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个0.2mLPCR反应管加入45μlPCR-mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
(3)荧光PCR反应和结果分析：
荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)检测CA6；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标。
荧光定量PCR反应条件为：
结果分析：
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果，判断依据如下：
对于测定Ct值≤38的样本，报告为CA6-RNA阳性；
对于测定无Ct值的样本，同时，内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为CA6-RNA阴性；
若内标Ct值>38或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验；
对于测定Ct值>38的样本，同时，内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为低于检测下限；
若内标Ct值>40或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
荧光PCR扩增结束后，输入CA6定量参考品A-D的浓度，通过软件自助分析可以得知各样本的荧光扩增曲线以及各样本的定值结果(浓度值)。阳性对照和阴性对照的结果能够验证实验的有效性，CA6定量参考品A-D的扩增曲线和定量分析浓度-Ct值的线性关系图如图1和图2所示。
通过对图1和图2的分析可知，本实施例中提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒的、反应体系的扩增曲线一致性较好，且线性相关系数为-0.999，扩增效率为97.2％，所以本实施例柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒检测效率良好，具有显著的线性范围，同时也能够说明本试剂盒的线性范围为5.00E+01～5.00E+09copies/ml。
实施例2
本实施例提供一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其组成同实施例1的试剂盒相同，检测步骤和方法也与实施例1相同，用于检测检测其他手足口病毒和肠道病毒，其结果如图3所示，图中所示为扩增非CA6病毒之背景噪音峰。
由图3分析可知，本试剂盒对正常人咽拭子样本、或者CAl6、CA10、CA7、CA9、CB2、CB5、CBl3、ECH019以及EV71感染样本并无扩增曲线，检测结果均为阴性，阴性符合率为100％，说明该试剂盒具有良好的特异性以及具有很高的准确性。
实施例3
本实施例提供一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其组成同实施例1的试剂盒相同，检测步骤和方法也与实施例1相同，本试剂盒的内标扩增曲线图如图4所示，说明本实施例提供检测试剂盒的PNA提取扩增方法不会产生抑制特异性PCR反应之物质，能有效监控反应。
实施例4
本实施例提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其组成同实施例1的试剂盒相同，检测步骤和方法也与实施例1相同，本试剂盒的标本稀释扩增曲线图如图5所示，图中所示Ct值最小为40左右，则该试剂的检测灵敏度为Ct40，所以通过实验证明，该试剂盒可以在样本浓度极低的情况下检测。
综上分析可知，本发明提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒仅能检测出CA6-RNA，而不能检测出其他病原体RNA，并且检测灵敏度、准确度和稳定性高，检测灵敏度可达50copie/ml，检测范围为5.00E+01～5.00E+09copies/ml，为期诊断柯萨奇病CA6型感染提供可靠的实验证据。

Claims (10)

1.一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、RT-PCR增强剂、内标、PCR反应液、CA6阳性对照品、CA6阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上游引物以及下游引物，用于靶多核苷酸检测的探针，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物：5'-CTGCAGAAACGGGAGCAAG-3'；
下游引物：5'-GAGTAAAAGTGTTCCACACTCGC-3'；
探针1：5'FAM-ACCCCGTTTCGATTCATCACACA-BHQ13'。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标为插入pUC18T载体的长为128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+04copies/ml～5.00E+04copies/ml；所述128碱基对的序列如下所示：
5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3'。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取溶液包括如下组分：
RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.2％～1.0％、曲拉通，体积/体积1.0％～4.0％，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L、100μg/ml～400μg/ml的磁珠；
RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L～300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠100mmol/L～300mmol/L；
RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.1％～1.0％、氯化钠100mmol/L～300mmol/L；
RNA提取溶液IV：矿物油。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.8mol/L～1.2mol/L、EDTA0.1mol/L～1.0mol/L。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR增强剂为Mn(OAc)2，其浓度为100mmol/L～500mmol/L。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括5×PCR反应缓冲液，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，1U/μl～5U/μlTthDNA聚合酶，1U/μl～5U/μlH-TaqDNA聚合酶，0.1μmol/L～0.2μmol/L用于扩增内标的上游引物以及下游引物，0.05μmol/L～0.2μmol/L用于检测内标的探针。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增内标的上游引物以及下游引物以及用于检测内标的探针，其碱基对序列分别为：
上游引物：5'-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3'；
下游引物：5'-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3'；
探针：5'HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13'。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CA6阳性对照品为CA6病毒基因体外转录RNA，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CA6阴性对照品为经过灭菌处理的生理盐水。
10.使用权利要求1-9任一项所述的检测试剂盒用于检测样本中CA6-RNA的方法，包括如下步骤：
(1)试剂准备；
按照提取溶液1200μl～1ml/人份，CA6-内标1μl/人份的比例，取相应量的RNA提取溶液I及CA6-内标，充分混匀得提取试剂1-mix，瞬时离心后备用；
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液49μl/人份，RT-PCR增强剂1μl/人份的比例，取相应量的PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混匀，得PCR-mix，瞬时离心后备用；
(2)RNA提取：磁珠法提取CA6-RNA；
S01裂解病毒：准备无核酸酶的1.5mL离心管，每管加入200μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀，瞬时离心后备用；
S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后备用的溶液中加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀，室温静置10～30分钟；
S03去除杂质：静止结束，瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，保留磁珠备用；
S04洗涤：在步骤S03备用的磁珠内加入400μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～500μlRNA提取溶液IV，震荡混匀，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
S05静止2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠保留备用；
S06在步骤S05保留备用的磁珠加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；
S07根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个0.2mLPCR反应管加入45μlPCR-mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
(3)荧光PCR反应和结果分析：
选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测CA6；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标；利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值结果，根据各样本Ct值大小，判断检测结果。
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