CN106048086A - 风疹病毒检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种风疹病毒检测并联探针，包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3；还公开了含有上述探针的基因芯片以及该基因芯片的试剂盒；还公开了利用该试剂盒进行风疹病毒检测的方法：使用本发明风疹病毒检测试剂盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染风疹病毒；当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。本发明操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，结果准确可靠。

Description

风疹病毒检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种风疹病毒检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。

背景技术

风疹病毒(Rubella.Virus)属节肢介体病毒中的披盖病毒(togavirus)群，为风疹的病原病毒。风疹病毒是单正链RNA病毒，是限于人类的病毒。风疹病毒易发生垂直感染，孕妇妊娠早期初次感染风疹病毒后，病毒可通过胎盘屏障进入胎儿，常可造成流产或死胎，还可导致胎儿发生先天性风疹综合征，引起胎儿畸形。孕妇感染风疹病毒后，一部分人症状较轻微，但也有一些孕妇会出现典型症状。怀孕3个月以内的孕妇感染风疹病毒后，风疹病毒可通过胎盘进入胎儿体内，引起胎儿畸形。而且孕妇感染风疹病毒的时间越早，致畸的可能性越大。目前检测风疹病毒的方法比较常用的方法是ELISA法，普遍存在敏感性低、特异性差、存在假阳性的缺点。风疹病毒的感染影响着人口素质，与优生优育有重要关系。

生物芯片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术。按照检测对象来分类，可以分为基因芯片和蛋白质芯片等两大类。相较于蛋白质芯片，基因芯片利用的是核苷酸链之间的互补作用，特异性强，重现性好。基因芯片指的是将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。采用基因芯片进行检测，其检测通量大，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、结果准确、假阳性率低、检测效率高的风疹病毒检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。

本发明实现其目的的技术方案为：

一种风疹病毒检测并联探针，包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3。

一种风疹病毒检测基因芯片，包括固体相和权利要求1所述的探针组。

作为优选地，所述固相载体为氨基修饰的玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。

一种风疹病毒检测试剂盒，包括前述的基因芯片。

在上述风疹病毒检测试剂盒中，还包括风疹病毒靶基因扩增引物对，引物对序列如SEQ ID NO.4、5所示。

作为优选地，所述引物对的下游引物的5’端含有生物素标记。

作为优选地，上述风疹病毒检测试剂盒，还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、亲和素、洗涤液、TMB显色液。

在上述技术方案中，10μL的PCR反应体系包括：50～150ng/μL的扩增模板0.4μL，Premix Taq 5μL，浓度为8～12μM的上、下游引物各0.2μL。

一种风疹病毒检测方法，使用前述的风疹病毒检测试剂盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染风疹病毒；当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。

作为优选地，PCR扩增反应程序为95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环；72℃10min。

本发明的有益效果是：设计三条高特异性的探针，当3条探针均检测出阳性时才判断该项指标为阳性，能极大的提高产品的准确性和精确性，减少其它方法容易出现的假阳性问题；本发明通过PCR技术对病原体基因组进行扩增，检测的特异性高，扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过生物素标记，显色液进行显色后，可以用普通数码相机拍照或肉眼直接判读，直观的表现检测结果，检测操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，为优生优育及诊断风疹病毒感染提供可靠的实验依据。

附图说明

图1为检测风疹病毒的基因芯片示意图。

图2为待测样品风疹病毒基因扩增后PCR产物电泳条带图；Y-R：风疹病毒；M:10000bp marker。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

主要试剂及生产者：

氨基修饰的玻璃基片(武汉阳达生物科技有限公司)，病毒基因组DNA/RNA共提试剂盒(货号DP438，天根生化科技(北京)有限公司)，亲和素(辣根过氧化物酶标记)(碧云天生物技术研究所)，TMB显色液(上海生工生物工程有限公司)，Premix Taq(TAKARA公司，日本):成分为PrimeSTARHS DNA Polymerase,dNTP Mixture,PrimeSTARBuffer。

引物合成公司为英潍捷基(上海)贸易有限公司。

实施例1目的片段引物与探针设计

查找NCBI数据库中风疹病毒的基因序列，选择高特异性的基因序列作为靶序列(ID号为：AY161375.1)，设计引物与探针。靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计风疹病毒靶基因的扩增引物与探针，为了使芯片结果用显色液显色后可直接通过肉眼判读，在风疹病毒靶基因扩增引物的R引物5’端用生物素进行标记，具体序列如下：

风疹病毒(RV)靶序列扩增引物：

F引物(RV-F)：5’-TCCGGGTCAAGTTCCATACA-3’(SEQ ID NO.4)，

R引物(RV-R)：5’-biotin-GCCAACGCCATTCCCCTGAC-3’(SEQ ID NO.5)。

RV并联探针：

RV探针1：

5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCGGCGTGTCGTGCAACGT-3’(SEQ ID NO.1)，

RV探针2：

5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCC-3’(SEQ ID NO.2)，

RV探针3：

5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACATTATGAATTACACC-3’(SEQ ID NO.3)。

实施例2芯片的制备

将实施例1中RV的并联探针按照表1的顺序点样到氨基修饰的玻璃基片上，得到含有探针的基因芯片(如图1所示)。探针浓度为30μM，每个点0.2μL，然后80℃孵育1.5小时。

表1风疹病毒检测芯片探针排列顺序

实施例3检测方法

1、待测样品基因组提取

使用病毒基因组DNA/RNA共提试剂盒，按照操作说明书的步骤提取待测样品的基因组作为扩增模板。

2、PCR扩增目的片段

经过大量实验摸索，确定RV检测的靶基因PCR扩增体系和PCR反应程序。

总体积为10μL的PCR扩增体系含有如下试剂：

名称	加入量
		PremixTaq	5μL
F引物(10μM)	0.2μL
		R引物(10μM)	0.2μL
扩增模板	0.4μL
		双蒸水	4.2μL

PCR反应程序为：95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环；72℃10min。

3、PCR产物与芯片杂交

按照如下步骤操作：

a.在实施例2中制备好的基因芯片上，将待测样品的PCR扩增产物点样到3个探针的检测孔中，具体步骤为：PCR产物95℃解链5分钟，迅速置于冰上，PCR产物与杂交缓冲液(50％甲酰胺，10×SSC，0.2％SDS)等体积混合，每孔点10微升混合液，在湿盒中，于60℃杂交孵育2小时。

b.取出孵育后的基因芯片，用洗涤液(0.3×SSC缓冲液)清洗3次，晾干芯片。

c.将亲和素(辣根过氧化物酶标记)加到晾干的芯片上，室温孵育10min。

d.用洗涤液(0.3×SSC缓冲液)清洗3次后晾干；

e.在晾干的基因芯片上点样TMB显色液，反应15分钟，拍照，统计结果，检测对象为阳性的样品TMB显色反应后溶液颜色由蓝色变为黄色。

实施例4检测待测样品

从第三军医大学获取感染了风疹病毒的样本20份(阴道分泌物)，按照实施例1和3中的引物和方法分别提取待测样品的基因组，进行PCR扩增后，使用实施例2中的基因芯片进行检测。PCR扩增后的产物电泳条带表明本发明设计的风疹病毒靶序列扩增引物特异性高，能特异、灵敏地扩增出目标基因(如图2所示)。

对于感染了风疹病毒的样品，TMB显色反应后溶液颜色由蓝色变为黄色，表明样品为阳性，感染了该病原体，检测中设置阳性和阴性对照。判断检测结果时，当三个探针均显示阳性时才判断该样品感染了病原体，如果其中某一个或者两个探针显示阴性，则应对该检测样品重新检测，三个探针结果须一致才能采信该检测结果。三个探针检测结果不一致时，也可使用现有其它技术(比如Elisa方法)进一步检测验证。

使用本发明方法检测20份已知阳性样品，结果显示，19份样品的3个探针均显示阳性，即感染了风疹病毒，与实际情况吻合；而另1份样品的2个探针显示阳性、1个探针显示阴性，对该可疑样品用本发明试剂盒重新检测，结果仍为2个探针显示阳性、1个探针显示阴性，采取Elisa方法检测，Elisa检测为阳性。

本发明的探针、基因芯片、试剂盒，特异性高、结果非常准确，检测快速、工作效率高，操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，为优生优育及诊断风疹病毒感染提供可靠的实验依据。

Claims (10)

1.一种风疹病毒检测并联探针，其特征在于：包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3。

2.一种风疹病毒检测基因芯片，其特征在于：包括固体相和权利要求1所述的探针组。

3.如权利要求2所述的风疹病毒检测基因芯片，其特征在于：所述固相载体为氨基修饰的玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。

4.一种风疹病毒检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求2或3所述的基因芯片。

5.如权利要求4所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于：还包括风疹病毒靶基因扩增引物对，引物对序列如SEQ ID NO.4、5所示。

6.如权利要求5所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于：所述引物对的下游引物的5’端含有生物素标记。

7.如权利要求6所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、亲和素、洗涤液、TMB显色液。

8.如权利要求7所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于：10μL的PCR反应体系包括：50～150ng/μL的扩增模板0.4μL，Premix Taq 5μL，浓度为8～12μM的上、下游引物各0.2μL。

9.一种风疹病毒检测方法，其特征在于：使用权利要求4至8任一项所述的风疹病毒检测试剂盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染风疹病毒；当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。

10.如权利要求9所述的风疹病毒检测方法，其特征在于：PCR扩增反应程序为95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环；72℃10min。