CN105349699A

CN105349699A - 一种甲型流感h3n2型荧光pcr诊断试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN105349699A
Application number: CN201510848892.5A
Authority: CN
Inventors: 戴立忠; 范文洲; 陈晓亮
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2016-02-24

Abstract

本发明提供一种甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，包括RNA提取溶液和PCR反应液，RNA提取溶液包括：RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和磁珠组成；RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；RNA提取溶液III：曲拉通和氯化钠；RNA提取溶液IV：矿物油；PCR反应液包括：用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针。本试剂盒提供一种RNA提取率和检测灵敏度都优异的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断产品，可以对咽拭子等多种样本中的甲型流感病毒进行分型检测，以判别病人是否感染的是甲流H3N2型，以协助医生做出更好的诊断以及更精确的治疗。

Description

一种甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，更为具体地说，涉及一种甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒及其使用方法。

背景技术

流感病毒为单股负链病毒，属于正黏液病毒科，呈球形或丝状，直径病毒由三层构成，内层为病毒核衣壳，含核蛋白和中层为病毒囊膜，由一层类脂体和一层膜蛋白(M)构成，M蛋白抗原性稳定，也具有型特异性，外层为两种不同糖蛋白构成的辐射状突起，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。根据和抗原的不同，又可分为许多亚型，H可分为16个亚型，N有个9亚型(N1～N9)。其中H1N1、H2N2、H3N2和2009年流行的H1N1新甲型主要感染人类，其它亚型的自然宿主主要是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株，并且一旦感染人类也是属于高致病性的，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，也会导致人间禽流感的流行。流感病毒的抗原性变异主要是指HA和NA抗原结构的改变，在亚型内部经常发生小变异，即抗原漂移几年可发生一次大的抗原变异，出现新的亚型即抗原转换当HA和NA都发生了大的变异，并由此产生新的亚型可引起世界性大流行。

在二十世纪就有三次大流行，一是1918年西班牙流感，由H1N1亚型流感病毒所引起，这次流感造成全世界2000-4000万人死亡，成为人类传染病历史上最大的灾难。二是1957年亚洲型流感，它由H2N2亚型流感病毒所引起，是人与禽流感病毒基因重组的结果。三是1968年香港型流感，由H3N2亚型流感病毒引起，为人与禽流感病毒的重组。从近年全球及国内的流行病学调查分析可以看出，H3N2亚型在大多数国家是流感流行的优势毒株，我国也以甲型H3N2和乙型为优势株。仅1968-1992年间我国发生的10次流感小流行中就有7次都是由H3N2亚型流感病毒所引起，并且在1998年和2002年我国也都发生了较大范围的亚型流感流行，其中北京市1998年11-12月的人群总发病率高达10％，总发病人数达到了100万以上。2005年广东省流感未发生大的流行，但局部暴发疫情仍比较活跃，并且主要分布在中小学校，以A(H3N2)亚型流感病毒为优势株暴发疫情。在我国2011-2012年流感监测中，亚型流感病毒2012年在南方省份引起了小规模的暴发。我国的人口基数大，也是流感高发地区，并且流感的新变种多次均首发于华南地区，属于流感发病多发中心。广东省流感病原学监测的结果分析可发现近年的优势株均有H3N2亚型。

近年来，聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，标准PCR过程分为三步：DNA变性(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；退火(60℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；延伸(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，最终合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。荧光定量PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术。

目前，类似的甲型流感试剂盒采用的方法主要为荧光PCR法、酶联免疫法以及胶体金法。酶联免疫法与胶体金法都存在较长时间的“窗口期”，并且操作步骤较多，对实验人员的要求高，易出现交叉污染，会因为这些偶然因素出现一定的假阳性率。

荧光PCR较酶联免疫法以及胶体金法具有以下优点：1)高特异性，根据靶标基因保守区域设计的引物探针，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。2)能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。3)操作简单，更适用于大规模的筛查。4)将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤。5)实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。6)在方法学上，荧光PCR法更加简便，易操作，基本没有“窗口期”。7)由于荧光PCR是将模板信号以几何方式放大的一个过程，其灵敏度与定量准确性有着非常明显的优势，其灵敏度往往比上述的两种方法高一个数量级。

磁珠法是进年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点：提取体积可变性大、吸附核酸专一性强、纯度高、可实现自动化操作。

目前，国内少有基于实时荧光定量PCR技术定量检测甲型流感病毒的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1)检测灵敏度低，约在10000IU/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+04IU/ml～1.00E+07IU/ml之间，对于临床高值(大于5.00E+07IU/ml)和低值(小于1.00E+04IU/ml)的样本无法检测；2)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；3)无法有效去除样本中的PCR抑制物(如：黏液等)；4)国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒及其使用方法，以解决现有检测方法灵敏度低、特异性差的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒包括RNA提取溶液和PCR反应液，其中，所述RNA提取溶液包括：RNA提取溶液I：由质量/体积比为0.2％～1.0％的十二烷基硫酸钠、体积/体积比为1.0％～4.0％的曲拉通，0.2mol/L～1.0mol/L的异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠组成；RNA提取溶液II：100～300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和100～300mmol/L、pH6.5±0.2的氯化钠；RNA提取溶液III：体积/体积比为0.1％～1.0％的曲拉通和100～300mmol/L的氯化钠；RNA提取溶液IV：矿物油；所述PCR反应液包括：用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针。

优选的，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列分别为：H基因探针：5’-FAM-CTATCTACAAGGCTCCCATTGTAAATGAAGCT-BHQ1-3’；N基因探针：5’-FAM-CTCATAGCGTCTTGCATGCCTTTAGC-BHQ1-3’。

优选的，所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列分别为：H基因上游引物：5'-GGCTGCATGTTTGTATAACGG-3'；H基因下游引物：5'-CGCATTCTGACTCCTGGGT-3'；N基因上游引物：5'-GTTGTCTTATAGCATTGGTGCC-3'；N基因下游引物：5'-TCGGTTAAAGCCAATTGAGC-3'。

优选的，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括内标，所述内标序列为：5'-AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTTAGGGAAGCAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGGAAGTCTCATGGATGGACAAAGGGCGAACTTACA-3'。

优选的，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括用于内标核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于内标核苷酸检测的探针，且所述用于内标核苷酸检测的探针序列为：5'-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3'。

优选的，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括RT-PCR增强剂，所述RT-PCR增强剂为浓度为100～500mmol/L的Mn(OAc)₂。

优选的，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包括0.8～1.2mol/L的Tris-HCl和0.1～1.0mol/L的EDTA。

优选的，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

优选的，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

本发明还提供一种权利要求6-9中任意一项所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用步骤包括：S01：取1200μl～1ml/人份的RNA提取溶液I和1μl/人份的内标，混和均匀并形成RNA提取试剂I-mix，瞬时离心后备用；S02：根据待测样本、阴性对照和阳性对照的数量，按39μl/人份的PCR反应液和1μl/人份的Mn²⁺溶液的比例取相应量的PCR反应液及酶混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用；S03：每管加入200μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；S04：每管加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置10～30分钟；S05：静置结束后瞬时离心，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出；S06：每管加入400μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～500μlRNA提取溶液IV，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；S07：2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；S08：加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；S09：根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入40μlPCR-mix，吸取已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照按每个反应液点样5μl加入3种PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；S10：将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。

本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

本发明提供一种甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒包括RNA提取溶液和PCR反应液，其中，所述RNA提取溶液包括：RNA提取溶液I：由质量/体积比为0.2％～1.0％的十二烷基硫酸钠、体积/体积比为1.0％～4.0％的曲拉通，0.2mol/L～1.0mol/L的异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠组成；RNA提取溶液II：100～300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和100～300mmol/L、pH6.5±0.2的氯化钠；RNA提取溶液III：体积/体积比为0.1％～1.0％的曲拉通和100～300mmol/L的氯化钠；RNA提取溶液IV：矿物油；所述PCR反应液包括：用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针。本发明所提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒提供一种RNA提取率和检测灵敏度都优异的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断产品，可以对咽拭子等多种样本中的甲型流感病毒进行分型检测，以判别病人是否感染的是甲流H3N2型，以协助医生做出更好的诊断以及更精确的治疗。同时也能为流感爆发的控制，以及研发与选用疫苗提供直接的参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明实施例提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒的使用方法流程图；

图2是本发明实施例提供的离心柱法提取核酸的扩增曲线图；

图3是本发明实施例提供的磁珠法提取核酸的扩增曲线图；

图4是本发明实施例提供的H3N2特异性参考品N1～N8检测的扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案作进一步详细的说明。

实施例一

本发明提供一种甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒包括RNA提取溶液和PCR反应液，其中，所述RNA提取溶液包括：

(1)RNA提取溶液I：由质量/体积比为0.2％～1.0％的十二烷基硫酸钠、体积/体积比为1.0％～4.0％的曲拉通，0.2mol/L～1.0mol/L的异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠组成；

(2)RNA提取溶液II：100～300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和100～300mmol/L、pH6.5±0.2的氯化钠；

(3)RNA提取溶液III：体积/体积比为0.1％～1.0％的曲拉通和100～300mmol/L的氯化钠；

(4)RNA提取溶液IV：矿物油；

所述PCR反应液包括：0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针、0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸以及5×PCR反应缓冲液10μl(Tth聚合酶附带的)，其中，

所述用于靶多核苷酸检测的探针序列分别为：

H基因探针：5’-FAM-CTATCTACAAGGCTCCCATTGTAAATGAAGCT-BHQ1-3’；

N基因探针：5’-FAM-CTCATAGCGTCTTGCATGCCTTTAGC-BHQ1-3’。

所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列分别为：

H基因上游引物：5'-GGCTGCATGTTTGTATAACGG-3'；

H基因下游引物：5'-CGCATTCTGACTCCTGGGT-3'；

N基因上游引物：5'-GTTGTCTTATAGCATTGGTGCC-3'；

N基因下游引物：5'-TCGGTTAAAGCCAATTGAGC-3'。

本发明所提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒提供一种RNA提取率和检测灵敏度都优异的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断产品，可以对咽拭子等多种样本中的甲型流感病毒进行分型检测，以判别病人是否感染的是甲流H3N2型，以协助医生做出更好的诊断以及更精确的治疗。同时也能为流感爆发的控制，以及研发与选用疫苗提供直接的参考。

优选的，本发明所提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒进一步包括内标以及0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标核苷酸扩增的上游引物、下游引物以及0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标核苷酸检测的探针，其中，

所述内标为插入pUC18T载体的一段长为93碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.00E+04copies/ml～5.00E+04copies/mlcopies/ml；93碱基对IC-sequence的序列如下：

5'-AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTTAGGGAAGCAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGGAAGTCTCATGGATGGACAAAGGGCGAACTTACA-3'。

所述用于内标核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列分别为：

内标上游引物：5'-AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTYAG-3'；

内标下游引物：5'-TGTAAGTTCGCCCTTTGTCCAT-3'。

所述用于内标核苷酸检测的探针序列为：

5'-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3'。

优选的，本发明所提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒进一步包括RT-PCR增强剂，所述RT-PCR增强剂为浓度为100～500mmol/L的Mn(OAc)₂。

优选的，本发明所提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒进一步包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包括0.8～1.2mol/L的Tris-HCl和0.1～1.0mol/L的EDTA。

优选的，本发明所提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒进一步包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为甲型流感H3N2型病毒基因体外转录RNA，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml；阴性对照为阴性HANKS保存液。

优选的，本发明所提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒进一步包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

实施例二

请参看图1，所示为本发明所提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒的使用方法流程图。

本实施例提供上述实施例1所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒的使用方法如下：

S101：取1200μl～1ml/人份的RNA提取溶液I和1μl/人份的内标，混和均匀并形成RNA提取试剂I-mix，瞬时离心后备用；

S102：根据待测样本、阴性对照和阳性对照的数量，按39μl/人份的PCR反应液和1μl/人份的Mn²⁺溶液的比例取相应量的PCR反应液及酶混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用；

S103：每管加入200μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；

S104：每管加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置10～30分钟；

S105：静置结束后瞬时离心，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出；

S106：每管加入400μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～500μlRNA提取溶液IV，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

S107：2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；

S108：加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

S109：根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入40μlPCR-mix，吸取已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照按每个反应液点样5μl加入3种PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

S110：将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。

步骤S110所述的将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试具体为：

(1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度；

(2)选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)检测甲型流感病毒RNA；

(3)选择HEX/VIC通道(Reporter:HEX/VIC,Quencher；none)检测甲型流感病毒H3N2型的内标。3)参比荧光(ReferenceDye)：选择ROX。设置SampleVolume为50。

荧光定量PCR反应条件见表1：

表1：荧光定量PCR反应条件

结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。分析结果前，需满足质量控制的以下要求：1)H3N2阳性样本FAMCt值≤30。2)H3N2阴性样本FAM无Ct显示；甲型流感病毒H3N2型内标检测(HEX/VIC)为阳性，且Ct≤40。一次实验需同时满足质量控制下的所有要求，否则实验无效，需重新进行实验。当满足质量要求，对于测定FAMCt值≤40的样本，报告为甲型流感H3N2病毒阳性；对于测定FAMCt值>40或无FAMCt值的样本，同时，内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为甲型流感病毒阴性，低于试剂盒的检测下限。若内标Ct值>40或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

本实施例还包括RNA不同提取方法(离心柱法和磁珠法)对H3N2型检测的影响试验，试验结果如表2所示：

表2：离心柱法和磁珠法的检测结果

请参看图2和图3所示分别为离心柱法提取核酸的扩增曲线图和磁珠法提取核酸的扩增曲线图。图2和图3表明，磁珠法提取核酸的检测结果Ct值明显靠前，并且低浓度样本能检出，灵敏度高，说明磁珠法对于甲型流感H3N2型提取核酸的效率高。

本实施例还包括特异性试验，利用本方案提供的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒对8个H3N2阴性工作参考品N1-N8进行检测，检测结果如表3所示：

表3：H3N2阴性工作参考品N1-N8的检测结果

请参考图4，所示为H3N2特异性参考品N1～N8检测的扩增曲线图。由图4可知，本试剂盒能够特异性的检测甲型流感H3N2型病毒，乙型流感、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、人偏肺病毒及巨细胞病毒等其他型等样本均保持良好的阴性结果，各基因型间的交叉反应率＜10％。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒包括RNA提取溶液和PCR反应液，其中，所述RNA提取溶液包括：

RNA提取溶液I：由质量/体积比为0.2％～1.0％的十二烷基硫酸钠、体积/体积比为1.0％～4.0％的曲拉通、0.2mol/L～1.0mol/L的异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠组成；

RNA提取溶液II：100～300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和100～300mmol/L、pH6.5±0.2的氯化钠；

RNA提取溶液III：体积/体积比为0.1％～1.0％的曲拉通和100～300mmol/L的氯化钠；

RNA提取溶液IV：矿物油；

所述PCR反应液包括：用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针。

2.根据权利要求1所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列分别为：

H基因探针：5’-FAM-CTATCTACAAGGCTCCCATTGTAAATGAAGCT-BHQ1-3’；

N基因探针：5’-FAM-CTCATAGCGTCTTGCATGCCTTTAGC-BHQ1-3’。

3.根据权利要求2所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列分别为：

H基因上游引物：5'-GGCTGCATGTTTGTATAACGG-3'；

H基因下游引物：5'-CGCATTCTGACTCCTGGGT-3'；

N基因上游引物：5'-GTTGTCTTATAGCATTGGTGCC-3'；

N基因下游引物：5'-TCGGTTAAAGCCAATTGAGC-3'。

4.根据权利要求1所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括内标，所述内标序列为：

5.根据权利要求4所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括用于内标核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于内标核苷酸检测的探针，且所述用于内标核苷酸检测的探针序列为：

5'-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3'。

6.根据权利要求1所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括RT-PCR增强剂，所述RT-PCR增强剂为浓度为100～500mmol/L的Mn(OAc)₂。

7.根据权利要求6所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包括0.8～1.2mol/L的Tris-HCl和0.1～1.0mol/L的EDTA。

8.根据权利要求7所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

9.根据权利要求1所述的甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

10.一种权利要求6-9中任意一项所述甲型流感H3N2型荧光PCR诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用步骤包括：

S01：取1200μl～1ml/人份的RNA提取溶液I和1μl/人份的内标，混和均匀并形成RNA提取试剂I-mix，瞬时离心后备用；

S02：根据待测样本、阴性对照和阳性对照的数量，按39μl/人份的PCR反应液和1μl/人份的Mn²⁺溶液的比例取相应量的PCR反应液及酶混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用；

S03：每管加入200μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；

S04：每管加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置10～30分钟；

S05：静置结束后瞬时离心，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出；

S06：每管加入400μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～500μlRNA提取溶液IV，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

S07：2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；

S08：加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

S09：根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入40μlPCR-mix，吸取已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照按每个反应液点样5μl加入3种PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

S10：将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。