CN108070677B

CN108070677B - 一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN108070677B
Application number: CN201711334284.8A
Authority: CN
Inventors: 王建昌; 刘立兵; 王金凤; 石蕊寒
Original assignee: Inspection And Quarantine Testing Center Of Hebei Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection And Quarantine Testing Center Of Hebei Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2037-12-07
Also published as: CN108070677A

Abstract

本发明涉及用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，其中所述RPA引物包括FMDV‑nfo‑F和FMDV‑nfo‑R，所述nfo探针为FMDV‑nfo‑P；所述检测方法以口蹄疫病毒3D基因为靶基因，以O型口蹄疫病毒RNA为模板进行RT‑RPA扩增，在反应体系中加入M‑MLV反转录酶和RNA酶抑制剂，用侧流层析试纸条进行检测。本发明建立的RT‑RPA法可以在较大的温度范围内操作，扩增时间短，显色反应肉眼可见，能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖。

Description

一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明关于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)属于小RNA病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，存在O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3 7个血清型，血清型间无交叉免疫现象。我国主要流行O型和A型，Asia 1型自2009年后未见临床病例报道。

对口蹄疫的早期预防和控制口蹄疫疫情传播所必须的重要手段。目前对口蹄疫病毒的检测主要依赖于分子检测方法，如RT-PCR和实时荧光RT-PCR，主要应用于装备良好的实验室，并需要配备精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员，因此不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，更不适用于野外和现场检测。等温扩增方法不需要昂贵的精准扩增设备、连续的电力供应和复杂的样品处理，已经用于多种传染病包括动物疫病的快速检测，尤其是现场检测。近年来，针对口蹄疫病毒的系列等温检测方法主要包括反转录绝缘等温PCR(RT-iiPCR)、环介导等温扩增(RT-LAMP)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、解旋酶恒温扩增(RT-HDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)等。RT-iiPCR依赖于专门的检测设备(POCKITTM Analyser)，反应时间为60min；RT-LAMP需要6条引物，设计复杂，反应时间一般需要60min；NASBA和RT-HAD反应时间更长，分别需要90min和120min。上述等温检测方法反应时间较长，对检测结果的判定依赖于检测设备或琼脂糖凝胶电泳，因此，在野外现场应用时存在一定的限制，难以有效展开。RPA是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高，并且成本较低的等温扩增技术，但现有技术中针对口蹄疫病毒建立的实时RT-RPA方法多依赖于昂贵的特异性荧光检测设备，不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，也不适用于野外现场的应用。如果样品需要在一定的冷链条件下运输到实验室检测，则需要较长的时间，从而造成检测结果的推迟，进而影响对发生的FMD疫情采取进一步的有效措施。

发明内容

针对现有技术中检测口蹄疫病毒所需反应时间长、需要使用昂贵设备进行检测、不适用于野外现场应用的技术问题，本发明提供了一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，扩增片段大小为258bp，其中所述RPA引物包括FMDV-nfo-F和FMDV-nfo-R，所述FMDV-nfo-F的序列为5′-3′TTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTC-3′，所述FMDV-nfo-R的序列为5′-Biotin-AACGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGGAAT-3′；所述nfo探针为FMDV-nfo-P，所述FMDV-nfo-P的序列为5′-FAM-GCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGAT(THF)TCCGTGGCAGGACTCG-C3-spacer-3′。

该试剂盒中的引物和nfo探针对其他小RNA病毒扩增具有特异性，可以提高检测结果的准确性。

以及，本发明还提供了一种口蹄疫病毒的可视化快速检测方法，以口蹄疫病毒3D基因为靶基因，以O型口蹄疫病毒RNA为模板进行RT-RPA扩增，在反应体系中加入M-MLV反转录酶和RNA酶抑制剂，用侧流层析试纸条进行检测。

相对于现有技术而言，本发明由于以FMDV RNA作为模板直接进行扩增的RT-RPA，不需要进行将RNA反转录为cDNA的步骤，从而极大地节省了反应时间，简化了操作步骤。

附图说明

图1为本发明所建立的LFS RT-RPA方法反应时间的优化；

图2为本发明所建立的LFS RT-RPA方法的特异性结果；

图3为本发明所建立的LFS RT-RPA方法的灵敏性结果；

图4为本发明所建立的LFS RT-RPA方法对部分临床样品的检测结果；

附图说明：

11加热5分钟的显色反应

12加热10分钟的显色反应

13加热15分钟的显色反应

14加热20分钟的显色反应

21O型FMDV的检测结果

22A型FMDV的检测结果

23Asia1型FMDV的检测结果

24水泡性口炎病毒的检测结果

25猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测结果

26猪瘟病毒的检测结果

27猪脑心肌炎病毒的检测结果

28伪狂犬病毒的检测结果

29猪圆环病毒2型的检测结果

31 RNA浓度为1.0×10⁷copes/μL的检测结果

32 RNA浓度为1.0×10⁶copes/μL的检测结果

33 RNA浓度为1.0×10⁵copes/μL的检测结果

34 RNA浓度为1.0×10⁴copes/μL的检测结果

35 RNA浓度为1.0×10³copes/μL的检测结果

36 RNA浓度为1.0×10²copes/μL的检测结果

37 RNA浓度为1.0×10¹copes/μL的检测结果

38 RNA浓度为1.0×10⁰copes/μL的检测结果

41对O型FMDV无细胞病毒液的检测结果

42对A型FMDV无细胞病毒液的检测结果

43对Asial型FMDV无细胞病毒液的检测结果

44随机抽取的对O型FMDV模拟血清样品的检测结果

45随机抽取的对O型FMDV模拟血清样品的检测结果

46随机抽取的对O型FMDV模拟血清样品的检测结果

47健康血清样品与FMDV按200：1混合所得血清样品的检测结果

48健康血清样品与FMDV按400：1混合所得血清样品的检测结果

49随机抽取的健康血清样品的检测结果

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

进一步优选地，所述FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R和FMDV-nfo-P的浓度均为10μmol/L，所述FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R的用量均为2.1μL，所述FMDV-nfo-P的用量为0.6μL。

进一步优选地，所述的用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒还包括Trizol试剂、M-MLF反转录酶、RNA酶抑制剂、O型口蹄疫病毒RNA、nfo-RPA反应重悬缓冲液、冻干酶制剂、醋酸镁、双蒸水、侧流层析试纸条反应缓冲液。

在反应体系中加入M-MLV和RNase抑制剂，从而可以实现以FMDV RNA作为模板直接进行扩增的LFS RT-RPA方法，而不需要额外的将RNA反转录为cDNA的步骤，简化了操作步骤，节省了反应时间。

具体地，所述M-MLV反转录酶的浓度为200U/μL，用量为1μL；所述RNA酶抑制剂的浓度为40U/μL，用量为1μL；所述O型口蹄疫病毒RNA用量为1μL；所述nfo-RPA反应重悬缓冲液为20％聚乙二醇，用量为29.5μL；所述双蒸水的用量为10.2μL；所述醋酸镁浓度为280mmol/L，用量为2.5μL；所述冻干酶制剂中包括dNTP、单链结合蛋白、recA重组酶、Bsu DNA聚合酶、内切核酸酶IV，三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。

以及，本发明实施例还提供一种口蹄疫病毒的可视化快速检测方法，以口蹄疫病毒3D基因为靶基因，以O型口蹄疫病毒RNA为模板进行RT-RPA扩增，在反应体系中加入M-MLV反转录酶和RNA酶抑制剂，用侧流层析试纸条进行检测。

相对于现有技术，本发明不需要进行将RNA反转录为cDNA的步骤，进而极大地节省了反应时间，简化了操作步骤。

进一步地，所述口蹄疫病毒的可视化快速检测方法包括以下步骤：

步骤a、设计所述3D基因的引物对3D-F和3D-R，以O型FMDV病毒RNA为模板，进行RT-PCR扩增，收集扩增产物；利用所述扩增产物经体外转录获得口蹄疫病毒RNA；以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R和nfo探针FMDV-nfo-P；

步骤b、将步骤a所得所述RPA引物FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R和探针FMDV-nfo-P与M-MLF反转录酶、RNA酶抑制剂、O型口蹄疫病毒RNA、nfo-RPA反应重悬缓冲液、双蒸水混匀后，与冻干酶制剂在反应容器中混合至溶解；

步骤c、向步骤b所述反应管中加入醋酸镁，离心，涡旋，加热至30～45℃并保持15～20分钟后，滴加到侧流层析试纸条上进行显色反应，100～140s后将显色反应的结果与质控线对比，即可得到检测结果。

相对于现有技术而言，本发明极大地节省了反应时间，简化了操作步骤，扩增时间短，显色反应肉眼可见，能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖，在基层兽医部门尤其是野外及疫情现场检测中具有极大的应用潜力。

具体的，上述步骤a中，所述经体外转录获得口蹄疫病毒RNA包括以下具体步骤：使用DNA纯化试剂盒对RT-PCR扩增产物进行纯化，连接到pGEM-T Easy载体并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中；挑取转化的阳性克隆，提取质粒，获得重组质粒pGEM-T-FMDV-3D；使用限制性内切酶NdeI对重组质粒进行线性化，并使用Wizard SV凝胶及PCR纯化试剂盒进行纯化，使用体外转录试剂盒进行体外转录，获得体外转录的FMDV RNA。

上述步骤c中，向步骤b所述反应管中加入醋酸镁，离心，涡旋，加热至30～45℃并保持15～20分钟后，滴加到侧流层析试纸条上进行显色反应，100～140s后将显色反应的结果与质控线对比，即可得到检测结果。该反应加热温度范围较大，不需要精准的温度控制，当操作人员在野外环境或其他不具备加热工具的环境中时，可以通过手握反应容器即可进行加热，加热后进行扩增，操作方面快捷；加热时间为15～20min时，在侧流层析试纸条上均可观察到明显的扩增条带，并且两个反应时间的扩增产物条带没有明显区别，如图1所示；扩增后在侧流层析试纸条上进行显色，通过肉眼即可直接判定检测结果、操作简单，反应快速，能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖，在基层兽医部门，尤其在野外及疫情现场检测中具有极大的实用性。

进一步优选的，所述质控线为侧流层析试纸条反应缓冲液的显色线，侧流层析试纸条反应缓冲液与待测样品滴于同一侧流层析试纸条，通过显色线易于判断结果。

进一步优选的，所述离心为离心1～2s，可以使不溶物或杂质沉淀，以免杂质干扰显色结果。

为了更好的说明本发明实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

本发明实施例提供了一种口蹄疫病毒的可视化快速检测方法，具体如下：

(1)RNA提取

根据Trizol试剂使用说明，使用Trizol试剂(Invitrogen,Waltham,USA)提取FMDVRNA以及待测血清样品中的FMDV RNA，并将提取病毒RNA溶解于20μL无RNase的ddH2O中，保存于-80℃。

(2)FMDV 3D基因的制备

设计所述3D基因的引物对3D-F和3D-R(3D-F的序列为：5′-CCCATTGAGTATCTACGAGG-3′；3D-R的序列为：5′-CAACGCAGGTAAAGTGATC-3′)，以3D-F和3D-R作为引物，以O型FMDV病毒RNA作为模板进行反转录PCR，获得FMDV 3D基因，全长1104bp。RT-PCR的反应体系为50μL，包括2×一步法Buffer 25μL，一步法酶混合物2μL，FMDV-nfo-F(20μmol/L)0.5μL，FMDV-nfo-R(20μmol/L)0.5μL，FMDV RNA 5μL，ddH2O 17μL。RT-PCR反应条件为：50℃，30min，1个循环；94℃，2min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃60s，32个循环。

(3)体外转录FMDV RNA的制备

使用DNA纯化试剂盒(Tiangen,Beijing,China)对RT-PCR产物进行纯化，然后连接到pGEM-T Easy载体(Promega,Madison,USA)并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中(Dingguo,Beijing,China)。挑取转化的阳性克隆，提取质粒并测序，通过测序方法确认转化的阳性克隆，获得重组质粒pGEM-T-FMDV-3D。使用限制性内切酶NdeI(Takara,Dalian,China)对重组质粒进行线性化，并使用Wizard SV胶及PCR纯化试剂盒(Promega,Madison,USA)进行纯化，然后使用RiboMAX大量RNA生产体系-T7试剂盒(Promega,Madison,USA)进行体外转录，以获得体外转录的FMDV RNA。使用无RNase的RQ1DNase对体外转录的FMDV RNA进行消化，并通过RNA琼脂糖凝胶电泳确定获得体外转录RNA的大小及完整性。使用ND-2000c核酸浓度测定仪测定体外转录RNA的浓度，并通过下列公式计算体外转录RNA的拷贝数：RNA浓度(拷贝/μL)＝[RNA浓度(g/μL)/(体外转录RNA长度×340)×6.02×1023。

(4)RPA引物和nfo探针的设计

将3D基因确定为RPA扩增的靶基因，根据FMDV 3D基因设计RPA的引物和nfo探针(上游引物FMDV-nfo-F的序列为：5′-3′TTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTC-3′；下游引物FMDV-nfo-R的序列为：5′-Biotin-AACGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGGAAT-3′；nfo探针FMDV-nfo-P的序列为：5′-FAM-GCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGAT(THF)TCCGTGGCAGGACTCG-C3-spacer-3′)，扩增片段大小为258bp。

(5)LFS RT-RPA方法

使用Twist公司的TwistAmpTM nfo kit(TwistDX，Cambridge，UK)建立RPA方法，反应体系为50μL，其中10μmol/L的FMDV-nfo-F和FMDV-nfo-R各2.1μL(终浓度0.42μmol/L)，10μmol/L FMDV-nfo-P 0.6μL(终浓度0.12μmol/L)，200U/μL的M-MLV反转录酶1μL(终浓度4U/μL)，40U/μL的RNA酶抑制剂1μL(终浓度0.8U/μL)，模板(O型FMDV病毒RNA)1μL，nfo-RPA反应重悬缓冲液(20％聚乙二醇)29.5μL，ddH₂O 10.2μL。将上述47.5μL体系混匀后加入到装有冻干酶制剂(1mmol/L的dNTP、90ng/μL的单链结合蛋白、120ng/μL的recA重组酶、30ng/μL的Bsu DNA聚合酶、30ng/μL的内切核酸酶IV，100mmol/L的三(羟甲基)甲基甘氨酸、20％的聚乙二醇、5mmol/L的二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶)的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反应管中加入2.5μL醋酸镁(280mmol/L)，离心1s并涡旋后，将反应管紧握在不同技术人员的手中，室温下分别反应15min和20min。取出10μL反应产物，滴加到侧流层析试纸条(LFS，优思达生物技术有限公司，杭州，中国)样品垫上，然后滴加三滴(约90μL)侧流层析试纸条反应缓冲液到样品垫位置，室温放置2min。若在侧流层析试纸条质控线和检测线位置均出现红色条带，判为阳性；仅在质控线位置出现红色条带，判为阴性；质控线位置没有出现红色条带，则无论检测线位置是否出现红色条带，均判为无效。

(6)LFS RT-RPA的特异性和灵敏性

使用10ng病毒RNA或DNA作为模板，对本发明所建立的RT-RPA方法的特异性分析。特异性实验中包括O型、A型和Asia1型FMDV、VSV、PRRSV、CSFV、EMCV、PRV和PCV2病毒。特异性分析由3名不同技术人员进行3次重复。结果如图2所示，本发明所建立的RT-RPA方法对O型、A型和Asia1型FMDV均呈现特异性扩增，而对其他常见的猪重要病原，VSV、PRRSV、CSFV、EMCV、PRV和PCV2没有任何扩增，三次试验结果一致，说明本发明所建立的RT-RPA方法具有良好的特异性。

制备体外转录RNA，并对其进行10倍系列稀释，使RNA浓度在1.0×10⁷至1.0×10⁰copes/μL之间，并以之作为RT-RPA灵敏性分析的模板。在LFS RT-RPA反应体系中，加入1μL不同浓度的体外转录RNA作为模板进行扩增，以确定所建立方法的检出限。同时用荧光PT-PCR方法进行灵敏度检测。灵敏性分析由3名不同技术人员进行3次重复。结果如图3所示，本发明所建立的FMDV RT-RPA方法的检出限为1.0×10²拷贝，同本研究使用的实时荧光RT-PCR方法检出限一致，三次试验结果一致，说明本发明所建立的RT-RPA方法具有良好的灵敏度。

(7)临床样品的检测结果

使用1.0×10⁵copies体外转录RNA作为模板，如图1所示，加热时间为5min时，在侧流层析试纸条上没有观察到扩增产物；加热时间为10min时，可以观察到较弱的扩增条带；加热时间为15min和20min时，在侧流层析试纸条上均可观察到明显的扩增条带，并且两个反应时间的扩增产物条带没有明显区别。

使用本发明所建立的LFS RT-RPA方法对16份O型FMDV的模拟猪、牛血清样品、24份健康猪、牛血清样品和3份FMDV病毒液(O型、A型和Asia1型)进行FMDV RNA检测。如图4所示，在16份混合O型FMDV的模拟血清中，经RT-RPA方法检测为FMDV阳性。在混合比例为1:200和1:400的血清，以及24份健康猪、牛血清，在RT-RPA中均为FMDV RNA阴性。在灭活的O型、A型和Asia1型FMDV无细胞病毒液中，FMDV RNA在RT-PCR中均为阳性。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省检验检疫科学技术研究院；河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法

<130> 20171129

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 3D-F

<400> 1

cccattgagt atctacgagg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 3D-R

<400> 2

caacgcaggt aaagtgatc 19

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> FMDV-nfo-F

<400> 3

ttggtcactc cattaccgat gtcactttcc tc 32

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> FMDV-nfo-R

<400> 4

aacgcaggta aagtgatctg tagcttggaa t 31

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> FMDV-nfo-P

<400> 5

gcacgccgtg ggaccataca ggagaagttg attccgtggc aggactcg 48

Claims

1.一种用于口蹄疫病毒的可视化检测的检测试剂盒，其特征在于，包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，扩增片段大小为258bp，其中

所述RPA引物包括FMDV-nfo-F和FMDV-nfo-R，所述FMDV-nfo-F的序列为5′-TTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTC-3′，所述FMDV-nfo-R的序列为5′-Biotin-AACGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGGA AT-3′；所述nfo探针为FMDV-nfo-P，所述FMDV-nfo-P的序列为5′-FAM-GC ACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGAT(THF)TCCGTGGCAGGACTCG-C3-spacer-3′。

2.根据权利要求1所述的用于口蹄疫病毒的可视化检测的检测试剂盒，其特征在于，所述FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R和FMDV-nfo-P的浓度均为10μmol/L，所述FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R的用量均为2.1μL，所述FMDV-nfo-P的用量为0.6μL。

3.根据权利要求1或2所述的用于口蹄疫病毒的可视化检测的检测试剂盒，其特征在于，还包括Trizol试剂、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、O型口蹄疫病毒RNA、nfo-RPA反应重悬缓冲液、冻干酶制剂、醋酸镁、双蒸水、侧流层析试纸条反应缓冲液。

4.根据权利要求3所述的用于口蹄疫病毒的可视化检测的检测试剂盒，其特征在于：

所述M-MLV反转录酶的浓度为200U/μL，用量为1μL；

所述RNA酶抑制剂的浓度为40U/μL，用量为1μL；

所述O型口蹄疫病毒RNA用量为1μL；

所述nfo-RPA反应重悬缓冲液为20％聚乙二醇，用量为29.5μL；

所述双蒸水的用量为10.2μL；

所述醋酸镁浓度为280mmol/L，用量为2.5μL；

所述冻干酶制剂中包括dNTP、单链结合蛋白、recA重组酶、Bsu DNA聚合酶、内切核酸酶IV，三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。