CN108315482A - 用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途 - Google Patents

用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于犬瘟热病毒检测的侧流层析试纸条RT‑RPA引物和探针组合，其F引物、R引物及探针序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明还公开了利用所述引物和探针组合，不依赖于检测设备对犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法。本发明的引物和探针特异性强，仅对犬瘟热病毒检测呈阳性，对其它病毒均呈阴性，灵敏度高，检出限为9.4×101拷贝。本发明方法可以有效应用于犬瘟热疫情的现场诊断，操作简单，反应时间短，对于经济欠发达地区装备较差的实验室，对于犬瘟热疫情现场和野外现场诊断中，将具有非常光明的应用前景。

Description

用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途。
背景技术
犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一种感染犬科动物的高度传染性疾病，主要表现为呼吸道症状、胃肠炎、皮炎、神经症状等。犬瘟热导致的临床症状非常广泛，和其他疫病导致的临床症状相似，从而难以从临床症状上对犬瘟热进行有效诊断。因此，对犬瘟热的有效快速诊断对于专业人员及时采取有效措施，及时控制疫情和防止疫情扩散具有重要意义。
CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属，是一种不分节段的无囊膜负链RNA病毒。目前已经建立了一系列基于CDV RNA检测的犬瘟热诊断方法，如RT-PCR、巢氏RT-PCR、实时荧光RT-PCR、RT-LAMP和RT-iiPCR方法等。上述方法具有不同的检测灵敏性，也在犬瘟热的有效控制中发挥了重要作用。RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法主要应用于装备良好的实验室，需要精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员，因此不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，更不适用于野外现场检测。相比较于PCR方法，等温扩增方法不需要昂贵的精准扩增设备，也不需要连续的电力供应和复杂的样品处理，已经在多种传染病包括动物疫病的快速检测，尤其是现场检测中发挥了重要作用。RT-iiPCR依赖于专门的检测设备(POCKITTMAnalyser)，反应时间为60min；RT-LAMP需要6条引物，设计复杂，而犬瘟热病毒变异性强，反应时间一般需要60min。上述等温检测方法反应时间较长，一般需要60min，同时需要专门的检测设备或水浴锅，对检测结果的判定依赖于检测设备或琼脂糖凝胶电泳。因此，上述针对犬瘟热病毒的等温扩增方法在野外现场应用存在一定的限制，难以有效展开。对于没有PCR仪的实验室，以及处于现场诊断的需要，一种反应迅速、操作方便的CDV检测技术对于犬瘟热的有效诊断依然具有重要意义。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高，并且成本较低的等温扩增技术。RPA技术一般在15-20min内完成扩增，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号检测或侧流层析试纸条(LFS)等不同方式实现对RPA结果的检测。对RPA扩增结果的实时检测一般基于反应体系中的exo探针和Exonuclease III，以及能够实时监测扩增荧光信号的设备，而对RPA结果的不依赖于检测设备的直接肉眼观察则需要使用nfo探针、Endonuclease IV和LFS。目前尚未有基于nfo探针、LFS和RPA的犬瘟热病毒检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对上述技术现状，提供一种用于犬瘟热病毒检测的引物和探针，并提供其在建立不依赖检测设备的犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法中的应用。
为达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：
一种用于犬瘟热病毒检测的引物和探针组合，其特征在于：
F引物序列如SEQ ID NO:1所示，R引物序列如SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQID NO:3所示。
进一步地，本发明还提供了上述引物和探针组合在LFS RT-RPA(侧流层析试纸条实时RPA)法检测犬瘟热病毒中的用途。
更进一步地，本发明还提供了利用上述引物和探针组合而建立的不依赖于检测设备的犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法，其包括如下步骤：从待测样品中提取病毒的RNA为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合在RPA反应体系中进行扩增，用侧流层析试纸条对扩增结果进行检测，若质控线和检测线位置均出现红色条带，则样品中含有犬瘟热病毒，若仅在质控线位置出现红色条带，则样品中不含犬瘟热病毒，若质控线位置没有出现红色条带，则检测结果无效。
更进一步地，所述RPA反应体系中包括反转录酶、RNA酶抑制剂、重悬缓冲液、ddH2O、醋酸镁溶液和冻干酶制剂，所述冻干酶制剂包括dNTP、单链结合蛋白、recA重组酶、DNA聚合酶、内切核糖核酸酶、三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。
具体地，本发明所述的不依赖于检测设备的犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法如下：将所述引物和探针组合、RNA模板、反转录酶、RNA酶抑制剂、重悬缓冲液和ddH2O混匀，加入到装有所述冻干酶制剂的反应管中，吹吸至完全溶解，再加入醋酸镁溶液，盖紧管盖，离心并涡旋后，30-45℃下进行扩增，扩增反应产物用侧流层析试纸条对扩增结果进行检测，若质控线和检测线位置均出现红色条带，则样品中含有犬瘟热病毒，若仅在质控线位置出现红色条带，则样品中不含犬瘟热病毒，若质控线位置没有出现红色条带，则检测结果无效。
优选地，采用手握反应管进行扩增，扩增时间为15min。
本发明还提供了一种用于犬瘟热病毒检测的试剂盒，其包括前述的引物和探针组合。
具体地，该试剂盒还包括反转录酶、RNA酶抑制剂、重悬缓冲液、ddH2O、醋酸镁溶液和冻干酶制剂，所述冻干酶制剂包括dNTP、单链结合蛋白、recA重组酶、DNA聚合酶、内切核糖核酸酶、三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。
与现有技术相比，本发明所取得的积极效果如下：
目前已建立的LFS RPA方法，多针对DNA病毒；对于RNA病毒，则首先将病毒RNA反转录为cDNA，然后以之作为模板进行检测。截至目前，尚未见直接以病毒RNA作为模板进行检测的LFS RT-RPA方法的报道。本发明中，在反应体系中加入4U/μL的MMLV和0.8U/μL的RNase抑制剂，从而建立了能够以CDV RNA作为模板直接进行扩增的LFS RT-RPA方法，而不需要额外的将RNA反转录为cDNA的步骤，进而极大的节省了反应时间，简化了操作步骤。
在对临床样品的检测中，CDV LFS RT-RPA方法能够对样品中CDV RNA实现有效的检测，检测结果同CDV real-time RT-PCR方法一致，表明了所建立的LFS RT-RPA方法的良好的实用性。就检测时间和设备的依赖性方面，LFS RT-RPA方法比实时荧光RT-PCR方法具有显著的优势。
在不同基因型的CDV中，核衣壳基因(N基因)高度保守，本发明将N基因作为RPA的靶基因，设计特异性的引物和nfo探针，并通过建立LFS RPA方法，利用体温短时间内即可实现扩增，操作简单，反应快速，能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖，在基层兽医部门，尤其在野外及疫情现场检测中具有极大的应用潜力。本发明的引物和探针特异性强，仅对CDV呈现阳性结果，对其他病毒均呈阴性，灵敏度高，检出限为9.4×101拷贝。
附图说明
图1为本发明实施例3中不同扩增时间的检测结果。
图2为本发明实施例4中特异性试验检测结果。
图3为本发明实施例5中灵敏性试验检测结果。
图4为本发明实施例6中部分样品的LFS RT-RPA检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1引物及探针序列
本发明所设计的引物及探针序列如表1所示。
表1实验所用引物及探针
注：FAM：羧基荧光素标记；THF：四氢呋喃；C3-spacer：聚合酶延伸阻断物。
实施例2 LFS RT-RPA方法的建立
该方法的步骤如下：
1、提取待测菌株的RNA；
2、将步骤1提取的RNA以及本发明设计的引物和探针加入RPA体系中进行扩增，并用LFS检测扩增结果。
具体步骤为：
1、RNA的提取
根据Trizol试剂使用说明，使用Trizol试剂(Invitrogen,Waltham,USA)提取CDV病毒的RNA。
2、LFS RT-RPA检测
使用Twist公司的TwistAmpTM nfo kit(TwistDX,Cambridge,UK)建立RPA方法，反应体系为50μL，其中10μmol/L的CDV-nfo-F和CDV-nfo-R各2.1μL(终浓度0.42μmol/L)，10μmol/L CDV-nfo-P 0.6μL(终浓度0.12μmol/L)，200U/μL的M-MLV反转录酶1μL(终浓度4U/μL)，40U/μL的RNA酶抑制剂(TAKARA公司)1μL(终浓度0.8U/μL)，模板1μL，反应重悬Buffer(20％聚乙二醇)29.5μL，ddH2O 10.2μL。将上述47.5μL体系混匀后加入到装有冻干酶制剂(1mmol/L的dNTP、90ng/μL的单链结合蛋白、120ng/μL的recA重组酶、30ng/μL的Bsu DNA聚合酶、30ng/μL的内切核酸酶IV，100mmol/L的三(羟甲基)甲基甘氨酸、20％的聚乙二醇、5mmol/L的二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶)的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反应管中加入2.5μL醋酸镁(280mmol/L)，瞬时离心并涡旋后，将反应管紧握在不同技术人员的手中，室温下分别反应5、10、15、和20min。取出10μL反应产物，滴加到侧流层析试纸条(LFS，优思达生物技术有限公司，杭州，中国)样品垫上，然后滴加三滴(约90μL)LFS Buffer到样品垫位置，室温放置2min。若在LFS质控线和检测线位置均出现红色条带，判为阳性；仅在质控线位置出现红色条带，判为阴性；质控线位置没有出现红色条带，则无论检测线位置是否出现红色条带，均判为无效。
实施例3反应时间优化
为了确定CDV LFS RT-RPA的最佳反应时间，使用9.4×103copies体外转录RNA作为模板，室温下，在三个不同技术人员手中紧握5、10、15、和20min。
其中，CDV体外转录RNA的制备方法如下：
以N-F和N-R作为引物(N-F：5′-ATGGCCAGCCTTCTTAAG-3′；N-R：5′-TTAATTGAGTAGCTCTCTATCA-3′)，以CDV病毒HB/BD-2017株基因组RNA作为模板进行RT-PCR，获得CDV N基因，全长1572bp。RT-PCR的反应体系为50μL，包括2×一步法Buffer 25μL，一步法酶混合物(Takara,Dalian,China)2μL,N-F(20μmol/L)0.5μL，N-R(20μmol/L)0.5μL,CDVRNA 5μL，ddH2O 17μL。RT-PCR反应条件为：50℃，30min，1个循环；94℃，2min，1个循环；94℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s，32个循环。
使用DNA纯化试剂盒(Tiangen,Beijing,China)对RT-PCR产物进行纯化，然后连接到pGEM-T Easy载体(Promega,Madison,USA)并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中(Dingguo,Beijing,China)。挑取转化的阳性克隆，提取质粒并测序，通过测序方法确认转化的阳性克隆，获得重组质粒pGEM-T-CDV-N。使用限制性内切酶NdeI(Takara,Dalian,China)对重组质粒进行线性化，并使用Wizard SV胶及PCR纯化试剂盒(Promega,Madison,USA)进行纯化，然后使用RiboMAX大量RNA生产体系-T7试剂盒(Promega,Madison,USA)进行体外转录，以获得体外转录的CDV RNA。使用无RNase的RQ1DNase对体外转录的CDV RNA进行消化，并通过RNA琼脂糖凝胶电泳确定获得体外转录RNA的大小及完整性。在pGEM-T Easy载体中，从T7启动子到NdeI酶切位点相距97bp，因此体外转录CDV RNA的大小为1669bp。使用ND-2000c核酸浓度测定仪测定体外转录RNA的浓度，并通过下列公式计算体外转录RNA的拷贝数：RNA浓度(拷贝/μL)＝[RNA浓度(g/μL)/(体外转录RNA长度×340)]×6.02×1023。
LFS RT-RPA结果如图1所示，手中紧握5min时，在LFS上没有观察到扩增产物；10min时，可以观察到较弱的扩增条带。当反应时间为15min和20min时，在LFS上均可观察到明显的扩增条带，并且两个反应时间的扩增产物条带没有明显区别。在三个不同试验中，结果相同。因此，CDV LFS RT-RPA的最佳反应时间确定为15min。
为验证反应的稳定性，使三个不同技术人员手中紧握CDV LFS RT-RPA反应管，分别在实验室内、办公室内或野外进行扩增反应，均获得了良好的实验结果。实验室、办公室和野外的环境温度分别为24.4℃,22.5℃和17.0℃，而三名技术人员手中的温度分别是37.0℃,37.5℃和35.7℃。
实施例4特异性试验
根据Trizol试剂使用说明，使用Trizol试剂(Invitrogen,Waltham,USA)提取CDV,CCoV,和CPIV病毒RNA，根据TIANamp病毒DNA提取试剂盒(Tiangen,Beijing,China)使用说明，提取PRV和CPV-2DNA。以10ng上述RNA或DNA为模板，按照实施例2的方法分别进行LFSRT-RPA检测。实验由3名不同技术人员进行3次重复。
LFS RT-RPA检测结果如图2所示。检测结果表明，本发明所建立的LFSRT-RPA方法仅对CDV呈现特异性扩增，而对其他常见的犬重要病原，CPV-2、CPIV、CCoV和PRV没有任何扩增。三次试验结果一致，说明本发明所建立的CDV LFS RT-RPA方法具有良好的特异性。
实施例5灵敏性试验
对实施例3制备的CDV体外转录RNA，进行10倍系列稀释，使RNA浓度在9.4×104到9.4×10-1拷贝/μL之间，并以之作为CDV LFS RT-RPA灵敏性分析的模板。在LFS RT-RPA反应体系中，加入1μL不同浓度的体外转录RNA作为模板进行扩增，以确定所建立方法的检出限。灵敏性分析由3名不同技术人员进行3次重复。
LFS RT-RPA检测结果如图3所示。检测结果表明，本发明所建立的CDV LFS RT-RPA方法的检出限为9.4×101拷贝，同本研究使用的实时荧光RT-PCR方法检出限一致。三次试验结果一致。
实施例6临床样品CDV的检测
从具有犬瘟热临床症状的犬和貉子上收集32份鼻咽拭子，置于1mL无菌PBS中充分浸泡和涡旋混匀，然后4℃，10000rpm离心10min。取200μL上清液，使用Trizol试剂进行样品RNA的提取。所提取RNA溶解于20μL无RNase的ddH2O中。使用ND-2000c(NanoDrop,Wilmington,USA)对所有的病毒RNA进行浓度测定并将之保存于-80℃备用。
使用实施例2的LFS RT-RPA方法对32份临床鼻咽拭子样品提取的RNA进行CDV RNA检测，同时进行real-time RT-PCR方法检测，并比较检测结果。
其中real-time RT-PCR方法如下：
使用ABI7500实时荧光PCR仪作为检测平台，使用一步法 RT-PCRKit(Takara,Dalian,China)，进行CDV real-time RT-PCR方法检测。Real-time RT-PCR(CDV-TaqMan-F：5′-AGCTAGTTTCATCTTAACTATCAAATT-3′；CDV-TaqMan-R：5’-TTAACTCTCCAGAAAACTCATGC-3′；CDV-TaqMan-P：FAM-ACCCAAGAGCCGGATACATAGTTTCAATGC-BHQ1)，扩增片段大小为154bp。Real-time RT-PCR的反应条件为：42℃ 5min，1个循环；95℃for10s，1个循环；95℃ for 5s and 60℃ for 35s，40个循环。
本发明LFS RT-RPA方法的部分检测结果如图4所示，和real-time RT-PCR方法的检测结果对比如表2所示。在32份临床鼻咽拭子样品中，20份样品经本发明LFS RT-RPA方法检测为CDV阳性，12份样品检测为CDV阴性。表2的分析表明，CDV LFS RT-PCR和real-timeRT-PCR的检测一致性为100％。20份阳性样品的Ct值在16.36到37.03之间，从而表明本发明所建立的CDV LFS RT-RPA方法能够检出较大范围内不同CDV载量的阳性样品。在CDVLFSRT-RPA方法中，在20min内即可获得对临床样品的检测结果，并且不需要任何的检测设备，而real-time RT-PCR方法则需要24-55min完成对阳性样品的检测，并且需要专门的荧光PCR设备。
表2 CDV LFS RT-RPA方法和real-time RT-PCR对临床鼻咽拭子检测结果比较
注：+:阳性；-:阴性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心；河北省检验检疫科学技术研究院
<120> 用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途
<130> 2018.03.19
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
GCTTACTTCA GACTCGGGCA AGAAATGGTT A 31
<210> 2
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
CAGTAGCTCG AATTGTCCGG TCCTCTGTTG T 31
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CTTGGCATCA CCAAGGAGGA AGCTCAGCTG GTTCAGAAAT AGCATCCA 48

Claims (8)

1.用于犬瘟热病毒检测的引物和探针组合，其特征在于：
F引物序列如SEQ ID NO:1所示，R引物序列如SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ IDNO:3所示。
2.权利要求1所述的引物和探针组合在LFS RT-RPA法检测犬瘟热病毒中的用途。
3.一种不依赖于检测设备的犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法，其特征在于：从待测样品中提取病毒的RNA为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合在RPA反应体系中进行扩增，用侧流层析试纸条对扩增结果进行检测，若质控线和检测线位置均出现红色条带，则样品中含有犬瘟热病毒，若仅在质控线位置出现红色条带，则样品中不含犬瘟热病毒，若质控线位置没有出现红色条带，则检测结果无效。
4.根据权利要求3所述的不依赖于检测设备的犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法，其特征在于：所述RPA反应体系中包括反转录酶、RNA酶抑制剂、重悬缓冲液、ddH2O、醋酸镁溶液和冻干酶制剂，所述冻干酶制剂包括dNTP、单链结合蛋白、recA重组酶、DNA聚合酶、内切核糖核酸酶、三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。
5.根据权利要求4所述的不依赖于检测设备的犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法，其特征在于：将所述引物和探针组合、RNA模板、反转录酶、RNA酶抑制剂、重悬缓冲液和ddH2O混匀，加入到装有所述冻干酶制剂的反应管中，吹吸至完全溶解，再加入醋酸镁溶液，盖紧管盖，离心并涡旋后，30-45℃下进行扩增，扩增反应产物用侧流层析试纸条对扩增结果进行检测，若质控线和检测线位置均出现红色条带，则样品中含有犬瘟热病毒，若仅在质控线位置出现红色条带，则样品中不含犬瘟热病毒，若质控线位置没有出现红色条带，则检测结果无效。
6.根据权利要求5所述的不依赖于检测设备的犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法，其特征在于：手握反应管扩增15min。
7.一种用于犬瘟热病毒检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和探针组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、重悬缓冲液、ddH2O、醋酸镁溶液和冻干酶制剂，所述冻干酶制剂包括dNTP、单链结合蛋白、recA重组酶、DNA聚合酶、内切核糖核酸酶、三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。
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