PT1853721E - Método para determinar a sensibilidade a inibidores de chk1 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA DETERMINAR A SENSIBILIDADE A INIBIDORES DE CHKl"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à utilização de um biomarcador como um indicador de uma actividade terapêutica de um agente num doente com cancro em teste. 0 biomarcador da presente invenção pode ser utilizado, por exemplo, para determinar quando administrar, a um doente, um agente terapêutico ou para seleccionar uma dose terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico.

Antecedentes da Invenção A exposição a quimioterapia e radiação são normalmente as principais opções para o tratamento de cancro, mas a utilidade de ambas estas abordagens é severamente limitada por efeitos adversos drásticos em tecido normal e o desenvolvimento frequente de resistência em células de tumor. É, deste modo, altamente desejável melhorar a eficácia destes tratamentos numa forma que não aumenta a toxicidade associada com estes. Uma forma de o conseguir, é pela utilização de agentes potenciadores específicos. Tipicamente, estes agentes são idealizados para serem utilizados em combinação com agentes existentes ou novos.

Uma célula individual replica ao fazer uma cópia exacta dos seus cromossomas e segregando-os depois, em células separadas. 1

Este ciclo de replicação de ADN, separação de cromossomas e divisão é regulado por mecanismos na célula que mantêm a ordem dos passos e asseguram que cada passo é efectuado com precisão. A chave destes processos são os pontos de controlo do ciclo celular (Hartwell et al., Science, (1989) 2 46 (4930):629-34), em que as células podem parar para assegurar que os mecanismos de reparação do ADN tenham tempo para operar antes de continuar o ciclo até à mitose. Existem três destes pontos de controlo no ciclo celular - o ponto de controlo Gl/S que é regulado por p53, a fase S e o ponto de controlo G2/M que é monitorizado pelo ponto de controlo cinase 1 (CHK1) da cinase de Ser/Thr. A CHK1 é activada através de fosforilação de Ser 317 e/ou Ser 345 por ataxia-xelangiectasia (ATR) e/ou ataxia- xelangiectasia mutada (ATM) após lesões no ADN induzidas por quimioterapia ou terapia de radiação (Zhao, H. et al., (2001)

Molecular Cell Biology 21, 7239-7249). A CHK1 por sua vez, fosforila numerosos substratos incluindo cdc25A, cdc25C e TLK (cinase do tipo tousled) . A fosforilação de cdc25A e cdc25C por CHK1 leva à sua inactivação através de degradação e relocalização, respectivamente. A inactivação de cdc25A e cdc25C leva, depois, à interrupção do ciclo celular nas fases S e G2 do ciclo celular, respectivamente. Em adição à paragem do ciclo celular mediada por CHK1 após lesão do ADN, estão a emergir dados na literatura em que CHK1 está também envolvida em processos de reparação de ADN (Sengupta et al., Journal of Cell Biology, 166,6:801-813, 2004). Além disso, os dados também sugeriram um papel putativo para CHK1 na divisão celular. Especificamente a CHK1 parece ter um papel na regulação da entrada em mitose, evitando a activação prematura da ciclina B-Cdkl através da regulação de cdc25B (Kramer et al., Nature 2

Cell Biology, 6; 9;884-891, 2004) e na regulação da iniciaçao da replicação.

Como a interrupção do ciclo celular induzida por estes pontos de controlo é um mecanismo crucial pelo qual as células podem ultrapassar os danos resultantes de radio- ou quimioterapia, a sua anulação pelos novos agentes deve aumentar a sensibilidade das células tumorais a terapias de lesões do ADN. Adicionalmente, a anulação especifica pelo tumor do ponto de controlo Gl/S por mutações p53 na maioria dos tumores, pode ser explorada para proporcionar agentes selectivos tumorais. Uma abordagem para a concepção de quimiossensibilizadores que anulam o ponto de controlo G2/M é desenvolver inibidores da cinase CHK1 reguladora de G2/M chave e verificou-se que esta abordagem funcionava em vários estudos para prova do conceito. (Koniaras et al., Oncogene, 2001, 20:7453; Luo et al., Neoplasia, 2001, 3:411; Busby et al., Câncer Res., 2000, 60 :2108; Jackson et al., Câncer Res., 2000, 60: 566) .

Um biomarcador é uma caracteristica que é objectivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos normais, processos patogénicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica (Atkinson et al, Clin. Pharmacol. Ther., 69: 89-95 (2001)). Crê-se que o desenvolvimento de novos biomarcadores validados conduzirá a reduções significativas nos cuidados de saúde e nos custos de desenvolvimento de fármacos e a melhorias significativas no tratamento para uma vasta variedade de doenças e estados.

De modo a conceber ensaios clínicos em condições óptimas e a ganhar a maior informação possível a partir destes ensaios, é necessário um biomarcador. O marcador precisa de ser mensurável 3 em tecidos de substituição e tumorais e deve estar correlacionado com a inibição da via. Em adição, o biomarcador deve demonstrar activação da via a montante e a inactivação da via a jusante. Idealmente, estes marcadores estarão também correlacionados com a eficácia e, por isso, podem vir a ser utilizados para a selecção de doentes.

Sumário da Invenção A presente invenção é baseada, em parte, nos métodos que podem ser utilizados para determinar uma capacidade de resposta do doente a um inibidor de CHK1 incluindo determinar se se administra um inibidor de CHK1, quando se administra um inibidor de CHK1 e determinar uma dose terapeuticamente eficaz de um inibidor de CHK1. Especificamente, os métodos da presente invenção incluem a determinação de uma ou mais moléculas de transdução de sinal de CHK1 activadas, tal como CHK1 fosforilado. A presença de uma molécula de transdução de sinal de CHK1 activada indica que deve ser administrado um inibidor de CHK1. Noutro método da invenção, o método inclui a determinação da presença de H2AX fosforilada como um indicador da necessidade de administrar uma dose apropriada de um inibidor de CHK1 a um doente.

Os biomarcadores da presente invenção podem ser utilizados no tratamento ou profilaxia de doenças neoplásicas, tais como cancro cervical, cancro da cabeça e pescoço, carcinoma da mama, ovário, pulmão (célula não pequena), pâncreas, esófago, gástrico, bexiga pequena, hepático, do cólon, da próstata ou de outros tecidos, assim como leucemias e linfomas, incluindo leucemia linfocítica crónica, tumores do sistema nervoso central 4 e periférico e outros tipos de tumor, tais como melanoma e sarcomas incluindo fibrossarcoma, mesotelioma e osteossarcoma, e tumores endócrinos, tais como tumores de célula de ilhéu e tumores da tiróide.

Consequentemente, a invenção proporciona um método de acordo com as reivindicações. A amostra da invenção pode ser qualquer amostra apropriada, tais como um tumor, sangue periférico, uma raspagem celular, um foliculo de cabelo, uma perfuração de pele ou uma amostra bocal. A molécula da via de transdução de sinal de CHK activada pode ser CHK1 fosforilada ou H2AX fosforilada. A CHK1 fosforilada pode ser determinada por um anticorpo contra CHK1, por exemplo, um anticorpo fosfoespecífico.

Breve descrição dos desenhos A Fig. 1 representa um gráfico de barras que mostra que a gemcitabina (Gem) resulta na fosforilação de CHKl. A Fig. 2A-B representa um gráfico de barras que mostra a fosforilação de CHKl após tratamento de combinação da gemcitabina (Gem) e inibidor de CHK e gemcitabina isoladamente. A Fig. 3 representa um gráfico de barras que mostra a fosforilação de CHKl a partir de secções tumorais de murganhos H460 Xenoenxerto após tratamento com gemcitabina (Gem), inibidor de Chk (Chki), e uma combinação de ambos. 5 A Fig. 4 representa um gráfico de barras que mostra a quantificação da fosforilação de CHK1 nos foliculos do cabelo a partir de biopsias de pele de murganho - após tratamento com gemcitabina (Gem), inibidor de Chk (Chki) e uma combinação de ambos. A Fig. 5 representa um gráfico de barras que mostra a quantificação de 53BP1 em células Hela com diferentes quantidades de cloridrato de Doxorrubicina (Dox) e um inibidor de CHKI (Chki). A Fig. 6 representa um gráfico de barras que mostra a quantificação de fosfo-H2AX de células SW620, células tratadas com gemcitabina (Gem) e um inibidor de Chk (Chki). A Fig. 7 representa um gráfico de barras que mostra a % de células positivas para fosfo-H2AX quando as células são tratadas com quantidades variáveis de gemcitabina (Gem) e um inibidor de Chk (Chki). A Fig. 8 representa um gráfico de barras que mostra a % de células positivas para fosfo-H2AX, quando as células são tratadas com a combinação de Cloridrato de Doxorrubicina (dox) e um inibidor de CHK.

Descrição Detalhada A presente invenção proporciona biomarcadores para prever a resposta de um doente a um inibidor de CHKI. Os biomarcadores previstos podem ser utilizados para indicar, por exemplo, quando 6 se deve administrar um inibidor de CHK1 ou determinar a quantidade de um inibidor de CHK1 que pode ser utilizado para tratar eficazmente um doente com cancro.

Biomarcadores 0 presente pedido divulga vários biomarcadores diferentes que podem ser utilizados para prever a capacidade de resposta dos doentes a um inibidor de CHK1. Os biomarcadores da invenção incluem moléculas de transdução de sinal de CHK1 activada. Uma molécula de transdução de sinal de CHK1 activada é qualquer molécula que é directamente ou indirectamente modificada, por exemplo, activada ou desactivada, como resultado da activação de CHK1. Por exemplo, uma molécula de transdução de sinal de CHK1 activada pode ser CHK1 fosforilada. Outras moléculas que servem como uma molécula de transdução de sinal de CHK1 activada incluem TLK1/2 fosforilada, CDC25, ciclina B, Aurora B ou fosfo-histona H3. Além disso, uma molécula da via de transdução de sinal de CHK1 inclui uma molécula que é activada por ATR ou ATM, tal como H2AX.

Num exemplo, o biomarcador é H2AX . A presença de H2AX fosforilada (também conhecida como H2AX gama) após a administração de um agente causador de dano de ADN e de um inibidor de Chk comparado com um controlo (uma amostra retirada de um doente antes da administração de CHK1 e um agente causador de dano de ADN ou antes da administração de um agente causador de dano de ADN) é indicativo que tenha sido administrada uma dose apropriada de um inibidor de CHK1. 7

Ensaios A presente invenção proporciona vários biomarcadores que podem ser utilizados para prever a capacidade de resposta de um doente a um inibidor de CHK1. Um método exemplificativo para detectar a presença de um biomarcador inclui obter uma amostra de tumor ou tecido de substituição de um indivíduo de teste na ausência de tratamento com um agente causador de dano de ADN ou agente de indução de stresse celular e determinar a presença do biomarcador. Noutro método exemplificativo, o método para detectar a presença de um biomarcador inclui obter uma amostra de tumor ou tecido de substituição de um indivíduo de teste que tenha recebido um agente causador de dano de ADN e determinar a presença do biomarcador.

Agente causador de dano de ADN

Tipicamente, um agente causador de dano de ADN é administrado a um doente com cancro em teste. Um agente causador de dano de ADN é um agente extremamente tóxico que induz, por exemplo, quebra da cadeia dupla do ADN. Embora não seja desejável estar limitado pela teoria, crê-se que uma vez que tenha sido administrada uma quantidade suficiente de um agente causador de dano de ADN a um doente com cancro, as células reagem através da activação de vias de resposta à causa do dano do ADN, incluindo a activação de pontos de controlo do ciclo celular. Crê-se que a cinase do ponto de verificação do ciclo celular, CHK1, pára as células permitindo, assim, a reparação do ADN e a sua inibição conduz a células tumorais que são sensibilizadas por agentes cancerígenos. 8

Agentes causadores de dano de ADN que podem ser utilizados na presente invenção incluem qualquer agente causador de dano de ADN apropriado. Exemplos de agentes causadores de dano de ADN incluem agentes alquilantes, tal como ciclofosfamida; outros agentes que produzem quebras de ADN de cadeia simples ou de cadeia dupla, tais como agentes de platina, incluindo cisplatina, carboplatina e oxaliplatina; anti-metabolitos, tais como 5-fluorouracilo, fludarabina e gemcitabina; inibidores de topoisomerase I ou III, tais como doxorrubicina, etopósido e topotecano; e agentes indutores de stresse, tais como anticorpos contra proteínas da superfície celular, tais como rituximab, cetuximab ou trastuzumab, radiomiméticos, tais como bleomicina e radiação gama.

Amostras

Qualquer amostra apropriada pode ser utilizada para determinar a presença de um biomarcador da invenção. Num exemplo, a amostra é uma amostra de tecido de substituição, por exemplo, a amostra pode ser sangue periférico, saliva, uma raspagem de células, uma amostra bocal, foliculo de cabelo, perfuração de pele ou expectoração.

Alternativamente, as amostras de tumor podem ser retiradas a partir de um doente que recebe um agente causador de dano de ADN. For exemplo, o tumor pode ser um tumor não sólido, tais como leucemia, mieloma múltiplo ou linfoma, ou pode ser um tumor sólido, por exemplo, tumores do dueto biliar, osso, bexiga, cérebro/SNC, mama, ovário, intestino delgado, colorrectal, cervical, endométrico, gástrico, da cabeça e pescoço, hepático, do pulmão, músculo, neuronal, esofageal, ovárico, pancreático, 9 das membranas pleural/peritoneal, da próstata, renal, pele, testicular, da tiróide, uterino, vulvar e outros tipos de tumor, tal como melanoma e sarcomas incluindo fibrossarcoma, mesotelioma e osteossarcoma, e tumores endócrinos, tais como tumores de células de ilhéu e tumores da tiróide

Detecção de uma molécula da via de transdução de CHKl activada

Num exemplo, o método inclui determinar, a partir de uma amostra de um doente em teste, a presença de uma molécula da via de transdução de CHKl activada. Noutro exemplo, o método inclui determinar, a partir de uma amostra de um doente em teste que está a ser tratado com um agente causador de dano de ADN, a presença de uma molécula da via de transdução de CHKl activada. É determinada a presença de uma molécula da via de transdução de CHKl activada, tais como CHKl fosforilada ou H2AX fosforilada. A requerente determinou que após a administração de um inibidor de CHKl é possível prever se um inibidor de CHKl inibe o seu alvo molecular. 0 método inclui retirar uma segunda amostra do doente em teste que recebeu um inibidor de CHKl e determinar a CHKl fosforilada. Tipicamente, a amostra é retirada 4 a 24 horas após a administração do inibidor de CHKl. Doentes que tenham recebido uma dose terapeuticamente eficaz de um inibidor de CHKl terão uma quantidade acrescida (por exemplo, pelo menos, duas vezes) de CHKl fosforilada durante um período de tempo mais prolongado, e. g., durante um período de 24 horas, em comparação com a quantidade de CHKl fosforilada, determinada a partir da primeira amostra. Embora não seja desejável estar limitado pela teoria, a requerente crê que a quantidade 10 aumentada de CHK1 fosforilada após a administração de um inibidor de CHK1 é porque após a inibição das moléculas a jusante de CHK, as células tentam compensar através do aumento da activação de moléculas a montante de CHK1. A determinação da presença de uma molécula da via de transdução de sinal de CHK1 activada da invenção pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, CHK1 fosforilada ou H2AX fosforilada pode ser visualizada fazendo reagir as proteínas com anticorpos, tais como anticorpos monoclonais dirigidos contra os aminoácidos serina, treonina ou tirosina fosforilados que estão presentes nas proteínas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis para isolar e identificar proteínas que contêm fosfotirosina são descritos na Pat. U.S. N° 4543439.

Os processos e reagentes necessários para determinar se uma proteína de CHK1 activada podem ser rapidamente realizados por um especialista na técnica. Um agente de interesse que pode ser utilizado para detectar uma molécula de transdução de sinal de CHK1 activada inclui qualquer molécula, tais como um peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequena, um anticorpo ou outro fármaco candidato, que se pode ligar à proteína. Num exemplo, os anticorpos que estão disponíveis comercialmente podem ser utilizados para detectar uma molécula de transdução de sinal de CHK1 activada. Por exemplo, os anticorpos contra CHK1 e CDC2 fosforiladas estão disponíveis a partir de Cell Signaling (Beverly, MA) , anticorpos contra CDC25A fosforilada Ab-3 estão disponíveis de Lab-vision (Fremont, CA); anticorpos contra Aurora B estão disponíveis de Abeam (Cambridge, MA) ; anticorpos contra H2AX fosforilada estão disponíveis de Upstate Biotechnology (Upstate, NI). 11 visualizar a

Tipicamente, os anticorpos utilizados para molécula de transdução de sinal de CHK1 activada podem ser marcados por qualquer processo conhecido na técnica, por exemplo, utilizando uma molécula repórter. Uma molécula repórter, como aqui utilizado, é uma molécula que proporciona um sinal analiticamente identificável permitindo ao especialista da técnica identificar quando um anticorpo se liqou a uma proteína para a qual é dirigido. A detecção pode ser qualitativa ou quantitativa. As moléculas repórter normalmente utilizadas incluem fluoróforos, enzimas, biotina, moléculas quimioluminescentes, moléculas bioluminescentes, digoxigenina, avidina, estreptavidina ou radioisótopos. As enzimas normalmente utilizadas incluem a peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, glucose oxidase e beta-galactosidase, entre outros. Os substratos a ser utilizados com estas enzimas são geralmente seleccionadas para a produção, após hidrólise, pela enzima correspondente, com uma alteração de cor detectável. Por exemplo, o p-nitrofenilfosfato é adequado para utilização com moléculas repórter de fosfatase alcalina; para peroxidase de rábano, 1,2-fenilenodiamina, ácido 5-aminosalicílico ou toluidina são normalmente utilizados. A incorporação de uma molécula repórter num anticorpo pode ser efectuada por qualquer método conhecido do especialista na técnica.

Após separação e visualização das proteínas, a quantidade de cada espécie de proteína pode ser avaliada através de processos prontamente disponíveis. Por exemplo, utilizando análise de transferência de Western que inclui a separação electroforeticamente das proteínas num gel de poliacrilamida e após detecção das proteínas separadas, a quantidade relativa de cada proteína pode ser quantificada por avaliação da sua 12 densidade óptica. Alternativamente, podem ser utilizados outros métodos, tais como FACS, imuno-histoquímica, ELISA, etc.

Nos métodos da invenção, podem ser detectadas uma ou mais das moléculas da via de transdução de sinal da CHK1 activada. Por exemplo, pode ser estabelecido um sistema de ensaio que pode detectar a presença de múltiplas moléculas da via de transdução de sinal da CHK1 activada.

Detecção da H2AX fosforilada 0 método da presente invenção também inclui a identificação para a presença de H2AX fosforilada (também conhecida como H2AX gama) após a administração de um agente causador de dano de ADN e um inibidor de CHK1 a um doente com cancro em teste. Ao seleccionar o agente causador de dano de ADN, a capacidade do agente causador de dano de ADN fosforilar H2AX na presença ou ausência de um inibidor de CHK1 tem de ser previamente determinada. Num exemplo, o método da invenção utiliza um agente causador de dano de ADN que, se administrado isolado sem CHK1 resulta num aumento modesto ou inexistente da fosforilação de H2AX. Os exemplos destes agentes causadores de dano de ADN incluem a Gemcitabina e dox. Neste exemplo, a combinação do inibidor de Chk 1 e o agente causador de dano de ADN produz um grande aumento, e. g., uma resposta sinergistica, na fosforilação de H2AX. De acordo com o método da invenção, um aumento na presença de H2AX fosforilada em comparação com um controlo (o controlo pode ser uma amostra retirada do doente antes da administração do agente causador de dano de ADN e o inibidor de CHK1) indica que o inibidor de CHK1 tem sido administrado numa dose terapeuticamente eficaz. 13 A H2AX fosforilada pode ser detectada utilizando qualquer agente, tais como um peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequena, um anticorpo ou outro candidato a fármaco, que se pode ligar à proteína. Os anticorpos que se ligam a H2AX fosforilada são conhecidos na técnica, por exemplo, anticorpos contra H2AX fosforilada. Estão disponíveis de Upstate Biotechnology (Upstate, NI).

Inibidores de CHK1 os inibidores de CHK1 são conhecidos na técnica, por exemplo, o inibidor de CHK1 pode incluir, por exemplo, um péptido, um anticorpo, uma molécula anti-sentido ou uma molécula pequena. Os inibidores de CHK1 úteis na presente invenção incluem, mas não são limitados aos, descritos ou reivindicados nas publicações que se seguem, cujas revelações integrais são aqui incorporadas por referência. Os exemplos de moléculas pequenas inibidoras de CHK1 incluem compostos de 2-ureidotiofeno, que são descritos no documento W003029241, compostos de 3-ureidotiofeno, descritos no documento W003028731 e inibidor de Chkl XL844 (Exilixis, CA) . Outros inibidores de CHK1 são descritos nos documentos PCT/GB2004/005400, US 20050256157, US 20050245563, US 20050245525, WO 2002070494, US 20040014765 e US 2003199511. Os oligonucleótidos anti-sentido de CHK1 são descritos no documento WO 200157206 e Patente US 6211164. Os ácidos nucleicos de interferência (siNA) de CHK1 e ARNs curtos de interferência (siRNA) são descritos no documento US 20050196765. 14

Exemplos

Exemplo 1: Demonstração da activação de CHKl após dano do ADN em linhas de células tumorais e amostras de Xenoenxertos A. Estudos in vitro:

Resumidamente, 3 X 106 células SW620 e ou HT29 foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm e deixadas a aderir durante 24 horas a 37 °C. As células foram então tratadas com uma titulação dos agentes causadores de dano de ADN (SN-38 (CQ International, China), doxorrubicina (Sigma-Aldrich, MO) ou gemcitabina (CQ International, China)). As células foram então recolhidas após uma incubação de 8 horas com os agentes causadores de dano de ADN em tampão de lise Onyx com inibidores de protease e fosfatase (20 mM de Tris, 137 mM de NaCl, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X, 10% de glicerol, 1,5 mM de MgCl2, diluição 1:100 de Calbiochem Phosphatase Inhibitor Cocktail set II, 10 mM de β-glicerofosfato, 1 mM de DTT, 7 pg/mL de PMSF, 20 KIU/mL de aprotinina, 1 mM de Pefabloc, 0,1 mg/mL de leupeptina) . Os lisados de proteína foram então produzidos, a concentração da proteína determinada e igual proteína foi aplicada e analisada por análise de transferência de Western utilizando uma diluição 1:100 de anticorpo monoclonal de coelho para fosfo-CHK (Ser 345) (133D3) adquirido a Cell Signaling (Beverly, MA). A análise de transferência de Western demonstrou uma sobre-regulação dependente da dose da fosfo-CHK após dano do ADN. Para caracterizar ainda mais a activação de CHKl, as células SW620 e HT29 foram tratadas com gemcitabina (100 nM) ou SN38 (100 nM) e as células foram recolhidas em diferentes tempos (de 30 minutos a 24 horas). A análise de transferência de Western demonstrou uma activação de fosfo-CHK dependente do tempo com o pico de 15 activação entre as 4 e 8 horas. Um painel de linhas de células de tumor foi então examinado para determinar quão vastamente a CHK foi activada nas células tumorais e se o estado de p53 tinha impacto na activação de CHK. 0 painel de linhas de células foi plaqueado e tratado durante 8 horas com 100 nM de gemcitabina. Os lisados de células foram recolhidos e avaliados quanto a sobre-regulação de fosfo-CHK. A análise de transferência de Western demonstrou que a fosfo-CHK é sobre-regulada num painel de linhas de células de, embora a diferentes níveis. A regulação de fosfo-CHK foi também examinada por imuno-histoquímica (IHC). Resumidamente, as células HeLa ou A549 foram plaqueadas em lamelas e deixadas a aderir durante 24 horas a 37 °C. As células foram então tratadas durante 5 horas com 100 nM de gemcitabina. As células foram fixas com 4% de PFA em PBS (8 minutos à temperatura ambiente), permeabilizadas com 0,5% de Triton-X em PBS, lavadas com PBS e lavadas com 0,05% de Tween 20 em PBS. As células foram então bloqueadas com 10% de soro de cabra durante 1 hora a temperatura ambiente, incubadas com uma diluição 1:50 de anticorpo monoclonal de coelho para fosfo-CHK (Ser 345) (133D3) adquirido a Cell Signaling (Beverly, MA) em 10% de soro de cabra durante 90 minutos, lavados duas vezes com PBS e uma vez com 0,5% de Tween 20 em PBS. As células foram então incubadas durante 60 minutos com uma diluição 1:300 de anti-IgG de coelho Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, OR) em 10% de soro de cabra, lavadas duas vezes com PBS, coradas nos núcleos com solução de Hoescht (2/pg/ml), durante 5 minutos e as células lavadas com PBS. A coloração de fosfo-CHK foi então quantificada utilizando análise Metamorph (Universal Imaging Corp, Dowington, PA) . A área do sinal de fosfo-CHK em relação à área nuclear foi medida como apresentado na Fig. 1. Foram obtidos resultados semelhantes utilizando medidas de 16 intensidade. Os dados demonstram um grande aumento em fosfo-CHK após tratamento com gemcitabina. B. Estudos in vivo: 1 x 107 células H460 que expressam p53 negativa dominante foram injectadas no flanco direito de ratos nude machos que tinham sido irradiados com 5 Gy de radiação 6 dias antes da implantação. No dia 20 quando os tumores atingiram um tamanho de 8 gramas, os animais foram doseados a IV com 20 mg/kg gemcitabina em 0,9% de solução salina. Os tumores foram então recolhidos em vários pontos de tempo, incluindo 1,5, 2, 2,5, 4, 6, 8 e 24 horas a seguir à dose de gemcitabina. Uma secção do tumor foi então homogeneizada em tampão de lise Swedish (20 mM de Tris pH 8,0,150 mM de NaCl, 1% de NP-40 substituição e 1 mM de Vanadato de Sódio com inibidores de protease como recomendado (Roche Applied Science, IN) e Inibidores de Fosfatase I e II como recomendado (Sigma-Aldrich, MO). Os lisados de proteína foram então produzidos, a concentração de proteína determinada e igual proteína foi aplicada e analisada por análise de transferência de Western utilizando um anticorpo monoclonal de coelho para fosfo-CHK (Ser 345) (133D3) adquirido a Cell

Signaling (Beverly, MA) . A análise de transferência de Western demonstrou a activação de CHK por 2 horas com a activação máxima às 8 horas. Às 24 horas a fosfo-CHK é significativamente subregulada. 17

Exemplo 2: Demonstração do aumento de fosfo-CHK após tratamento de combinação com gemcitabina e inibidor de CHKl em linhas de células de tumor, amostras de xenoenxertos e tecidos de substituição A. Estudos in vitro

Resumidamente, 3 X 106 SW620 foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm e deixadas a aderir durante 24 horas a 37 °C. As células foram então tratadas com 100 nM de gemcitabina ou 30 nM, 100 nM ou 500 nM inibidor de CHK ou a combinação de 100 nM gemcitabina e 30 nM, 100 nM ou 500 nM durante 8 horas. Um conjunto de células foi então recolhido para análise de transferência de Western. Os meios contendo os compostos foram removidos das restantes células e foi adicionado mais meio fresco de cultura de tecido. As células foram então recolhidas 22 horas depois, os lisados de proteína foram produzidos como descrito acima e analisados por análise de transferência de Western utilizando o anticorpo para fosfo-CHK. A análise de transferência de Western demonstrou um aumento em fosfo-CHK após tratamento com gemcitabina isolada e um aumento em fosfo-CHK dependente da dose acima da gemcitabina isolada seguindo o tratamento de combinação. Não foi observado aumento de fosfo-CHK a seguir ao tratamento das células com o inibidor de CHK isolado. A regulação de fosfo-CHK foi também examinada por IHC como descrito acima no Exemplo 1 utilizando células HeLa e A549. A Fig. 2A e 2B demonstra um grande aumento em fosfo-CHK após o tratamento de combinação com gemcitabina e inibidor de CHK em comparação com a gemcitabina isolada. 18 B. Estudos ίη vivo 3 X ΙΟ6 células Η460 que expressam p53 negativa dominante foram injectadas no flanco direito de murganhos nude machos. No dia 25, quando os tumores atingiram um tamanho de 0,6 - 0,8 gramas, os animais foram doseados a IV com gemcitabina (30 ou 60 mg/kg) , inibidor de Chk (5, 20 ou 40 mg/kg) ou a combinação. Sete horas depois, os tumores foram então recolhidos, fixos e corados para CHK1 fosforilada (Cell Signalling 2345)-DAB com o contraste de verde de metilo. As secções foram então quantificadas por análise de classificação de Η. A classificação de H é calculada por classificação da intensidade das células (0, 1, 2 ou 3) e multiplicando pela classificação que representa o número de células positivas (0, 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) e 4 (76-100%). A análise apresentada na Figura 3 demonstrou um aumento na coloração de fosfo-Chk em comparação com qualquer agente isolado. Estudos de combinação semelhantes foram completados com irinotecan e o inibidor de Chk. De novo, os dados demonstraram um aumento na coloração de fosfo-Chk em comparação com qualquer dos agentes isolado (dados não apresentados). C. Tecidos substitutos

Os murganhos nude foram doseados a IV com gemcitabina (30 ou 60 mg/kg), inibidor de Chk (5, 20 ou 40 mg/kg) ou a combinação como na secção acima. Sete horas depois, as biopsias de pele contendo foliculos de cabelo foram então recolhidos, fixos e corados para a CHK1 fosforilada (Cell Signalling 2345)-DAB com o contraste de verde de metilo. Os resultados mostraram coloração positiva (castanho) em células basais de foliculo de cabelo em 19 murganhos tratados. A coloração foi específica para o núcleo da célula. A coloração ocorreu de forma rara ou ocasional em grupos tratados com inibidor de Chk. Não foi observada coloração nos grupos tratados com gemcitabina. As secções foram então quantificadas por análise de classificação de H. a classificação de H é calculada pela classificação da intensidade das células (0, 1, 2 ou 3) e multiplicando pela classificação que representa o número de células positivas (0,1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) e 4 (76-100%). A análise apresentada na Figura 4 demonstra que a coloração de folículos de cabelo é fortemente aumentada em grupos de combinação em comparação com os outros grupos de tratamento. Além disso, foi observada uma resposta à dose do inibidor de Chk com os maiores aumentos atingidos em doses eficazes.

Estudos de combinação semelhantes foram completados com irinotecan e inibidor de Chk. De novo os dados demonstraram um aumento na coloração de fosfo-Chk como comparado com qualquer dos agentes isolados (dados não apresentados).

Exemplo 3: Demonstração da diminuição do foco da lesão de ADN após inibição da cinase CHKl A. Estudos in vitro:

As células HeLa foram plaqueadas em lamelas e deixadas a aderir durante 24 horas a 37 °C. As células foram então tratadas durante 5 horas com 100 nM de Adriamycin™ e 500 nM de inibidor de CHK. As células foram então tratadas como descrito no Exemplo 1. o anticorpo primário utilizado para os estudos foi uma diluição 1:120 de anti-53BPl policlonal de rato (Novus, CO) 20 e o anticorpo secundário foi uma diluição de 1:300 de anti-IgG de coelho Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, OR). Os focos foram quantificados através da medição da intensidade de fluorescência por número de núcleos (determinadas por coloração com Hoescht) utilizando análise Metaphorph. A Figura 5 demonstra um decréscimo na intensidade de fluorescência quando o inibidor de CHK é combinado com cloridrato de Doxorrubicina (Adriamycim ™).

Exemplo 4: Demonstração do aumento de fosfo-H2AX depois do tratamento de combinação de gemcitabina e inibição de CHK1 A. Estudos in vitro

Resumidamente, 3 X 106 SW620 e ou células A549 foram plaqueadas em 10 cm de placas de cultura de tecido e deixadas aderir durante 24 horas a 37 °C. As células foram, então, tratadas com veículo, 100 nM de gemcitabina ou 100 nM de gemcitabina e 500 nM de inibidor de CHK. As células foram, então, recolhidas após uma incubação de 5 horas directamente em tampão de amostra com SDS (NuPAGE N° NP007) . As amostras foram, então, sonicadas, passadas através de uma agulha de calibre 21, aquecidas a 100 °C durante 5 minutos, microcentrifugadas e analisadas por análise de transferência de Western. Os lisados de proteína foram, então, produzidos, a concentração de proteína determinada e igual carga de proteína foi aplicada e analisada por análise de transferência de Western utilizando uma diluição 1:5000 de um monoclonal anti-fosfo H2AX Serina 139 de murganho (Upstate, NI). Os dados demonstraram um grande aumento em fosfo—H2AX quando as células foram tratadas em combinação com gemcitabina e inibidor de CHK e nenhuma alteração ou uma muito pequena alteração quando um dos compostos foi utilizado isolado. 21 A fosfo-H2AX foi também examinada através de um ensaio de ELISA quantitativo. Resumidamente, 3 X 106 SW620 foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm e foram deixadas aderir durante 24 horas a 37 °C. As células foram, então, tratadas com veiculo, 100 nM de qemcitabina, 30, 50, 100 e 500 nM de inibidor de Chk ou a combinação de qemcitabina e todas as concentrações do inibidor de Chk durante 7 horas e depois recolhidas em tampão de lise (20 mM de Tris HC1, 28 mM de Tris base, 0,4%LDS, 2% de

Glicerol, 0,10 mM de EDTA) contendo inibidores de fosfatase (Calbiochem Cat. N° 534625, CA).

As concentrações de proteína foram determinadas e níveis de p-H2AX quantificados por ensaio de ELISA utilizando o anticorpo H2AX total (Novus Biologicals, N° Cat NB100-383, CO) para capturar H2AX total e anticorpo LANCE antifosfo-histona H2AX marcado Eu (Ser 139) (Upstate, N° Cat 05-636, NI) para detectar a H2AX fosforilada. Como mostrado na Figura 6, foi observado um grande aumento na fosfo-H2AX no tratamento de combinação. A fosfo-H2AX foi também examinada por IHC como descrito acima no Exemplo 1, excepto com as seguintes alterações. As células HeLa ou A549 foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas com ou sem 100 nM de gemcitabina e concentrações crescentes de inibidor de CHK (0 a 1 μΜ) durante 5 horas antes da fixação e coloração. Uma diluição 1:400 de uma anti-fosfo H2AX Serina 139 monoclonal de murganho (Upstate, NI) seguido por uma diluição 1:300 de anti-IgG de murganho Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, OR) foi incubada em células fixas. A quantificação foi efectuada utilizando algoritmos Cellomics Cell Health e reportados como % de células positivas para fosfo-H2AX. A Fig. 7 mostra a quantificação demonstrando um aumento robusto 22 dependente da dose na % de células positivas para fosfo-H2AX quando as células são tratadas com a combinação de gemcitabina e inibidor de CHK. Foi observado utilizando imunocoloração que a H2AX fosforilada está presente através do núcleo, não limitado ao foco.

Exemplo 5: Demonstração do aumento de fosfo-H2AX após tratamento de combinação de doxorrubicina e inibição de CHKl

Estudos in vitro A fosfo—H2AX foi também examinada como IHC como descrito acima no Exemplo 1, excepto com as seguintes alterações. As células HeLa ou A549 foram tratadas com ou sem 100 nM de doxorrubicina (Adriamycin™) e concentrações crescentes de inibidor de CHK (0 a 1 μΜ) durante 5 horas antes da fixação e coloração. Uma diluição de 1:400 de um monoclonal anti-fosfo H2AX Serine 139 de murganho (Upstate, NI) seguido por uma diluição 1:300 de anti-IgG Alexa Fluor 594 de murganho (Molecular Probes, OR) foi incubada em células fixas. A quantificação foi efectuada utilizando algoritmos Cellomics Cell Health e reportada como % de células positivas para fosfo-H2AX. A Fig. 8 é a quantificação que demonstra um robusto aumento dependente da dose em células A549 positivas para a % de células positivas para fosfo-H2AX quando as células são tratadas com a combinação de Adriamycin™ e inibidor de CHK.

Lisboa, 31 de Maio de 2010 23

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinar se um inibidor de CHK-1 está a inibir o seu alvo molecular CHK-1, o método compreendendo: (a) determinar a presença de um molécula CHK-1 fosforilada numa primeira amostra a partir de um doente com cancro em teste que recebeu um agente causador de dano de ADN, e (b) determinar a presença de uma CHK-1 fosforilada numa segunda amostra do doente com cancro em teste que recebeu um agente causador de dano de ADN e um inibidor de CHK-1, em que um aumento na quantidade de CHK-1 fosforilada na segunda amostra em comparação com a primeira amostra é indicadora de que o inibidor de CHK-1 está a inibir o seu alvo molecular CHK-1.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a amostra é um tumor, sangue periférico, uma raspagem de células, um foliculo de cabelo, uma amostra de pele ou uma amostra bucal.
3. 3. Método de qualquer uma das reivindicações 1-2, em que a CHK1 fosforilada é determinada por um anticorpo CHK1.
4. 4. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a CHK1 fosforilada é fosforilada na Ser 345.
5. 5. Método para determinar se um inibidor de CHK-1 está a inibir o seu alvo molecular CHK-1, o método compreendendo: 1 (a) determinar a presença de H2AX fosforilada numa primeira amostra de um doente com cancro em teste que recebeu um agente causador de dano de ADN; e (b) determinar a presença de H2AX fosforilada numa segunda amostra do doente com cancro em teste que recebeu um agente causador de dano de ADN e um inibidor de CHK-1, em que um aumento na presença de H2AX fosforilada na segunda amostra, em comparação com a primeira amostra, é indicadora de que um inibidor de CHK1 está a inibir o seu alvo molecular CHK-1.
6. 6. Método da reivindicação 5, em que a amostra é uma amostra de sangue com células tumorais circulantes.
7. 7. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o cancro é um tumor não sólido ou um tumor sólido.
8. 8. Método da reivindicação 7, em que o tumor é leucemia, mieloma múltiplo ou linfoma.
9. 9. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o agente causador de dano de ADN é um agente alquilante, um anti-metabolito, um inibidor de topoisomerase, uma radiação radiomimética ou gama.
10. 10. Método da reivindicação 9, em que o anti-metabolito é 5- fluorouracilo, fludarabina ou gemcitabina. Lisboa, 31 de Maio de 2010 2 1/5 Quantificação de fosfo-Chk de

    Veículo de controlo 0,1 μΜ de Gem Fig.l Quantificação de fosfo-Chk de células A549 tratadas com gemcitabina & inbidor de Chk CC _CD O c CC CD òb LL CD Ό CC CD CC T3

    Veículo de controlo 0,1 μΜ de Gem 0,1 M de inibidor de Chk + 0,1 μΜ de Gem Fig. 2A 2/5 cd ω ο Quantificação de fosfo-Chk de células HeLa tratadas com gemcitabina e inbidor de Chk cd CD Ò CD "O cd CD 'cd cd Ό 5040302010 0

    Veículo de controlo 0,1 μΜ de Gem 0,1 M de inibidor de Chk + 0,1 μΜ de Gem Fig. 2B Classificação H de IHC de pChk em Xenoenxertos em Murganhos

    Tratamento Fig. 3 3/5 Classificação H de IHC de pCHK em pele de murganho o icd o cd o c/) (/) _ctí O 14 1210 8 64 2 0 . · ' v.‘ r - \ r" i 1 y ύ ·’* · t v·* T " \V.' "ϊ· ϊ : i, ; ? -L l ... ’ - ·· ' v S5’ ·«. j T . * :*? -1-· ·»* - r-j * ·» . ,<<t r /1 .,··!..W; , À M 1 f / 0 3 o co s m *s o CM S IO 2 £ o CM o *» IO O § O E E JC £ 2 2 2 2 JC JC JC £ 2 2 2 ‘1 0) O Φ O O £ O £ O O o JC CD £ O § £ CD § £ co o co E Φ O O CO <D E φ O o co E Φ O E φ <D E 0) O E φ CD § E φ CD s E φ CD Dose Fig. 4 cd 0) o Quantificação de 53BP1 de células HeLa tratadas com Dox e Chk. cd CD ^cdÒ CD Ό cd CD _ 'CO CO Ό 1.6 1.41.2 10.80.Θ 0.4 0.2 0 Fig. 5 % ' í' Λ · -¾ t :¾ í'. ' · V D.: \ , ? i.-JS·' >>· ·:? Λ. ?> :4 è' :<g ·&· • "Ç.· * r/·'· Controlo 0,5 μΜ Chkl 0,1 μΜ Dox 0,5 μΜ Chkl 0,1 μΜ Dox Tratamento 4/5 Quantificação de fosfo-H2AX de células SW620 tratadas σ' com Gem e inibidor de Chk Ό

    O Q_ CD Ό O” O· K. O’ O· / o· / j· / Cf cf / Cr / cf / Cr Fig. 6

    5/5 Quantificação de fosfo-H2AX de células A549 tratadas com Dox e inibidor de Chk

    □Dox: O Dox 0.1 uM Inbidor de Chk Fig.8