BRPI0607798A2 - método para prognosticar uma responsividade do paciente a um inibidor de chk1, uso de um inibidor de chk1, e, kit para prognosticar uma resposta do paciente a um inibidor de chk1 - Google Patents

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Abstract

A invenção está direcionada a um método para prognosticar uma responsividade do paciente a um inibidor de CHK1. O método inclui fornecer uma amostra de um paciente de teste que está sendo tratado com um agente prejudicial ao DNA; e determinar quanto a presença de uma molécula do trajeto de transduçáo de sinal de CHK1 ativada, em que a presença de uma molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada é indicativa de que um inibidor de CHK1 deve ser administrado ao paciente.

Description

"MÉTODOS PARA PROGNOSTICAR UMA RESPONSIVIDADE DOPACIENTE A UM INIBIDOR DE CHK1 E PARA TRATAR UMPACIENTE TENDO LEUCEMIA, E, KIT PARA PROGNOSTICAR UMARESPOSTA DO PACIENTE A UM INIBIDOR DE CHK1"
Campo da invenção
A presente invenção diz respeito ao uso de um biomarcadorcomo um indicador de uma atividade do agente terapêutico dentro de umpaciente com câncer de teste. O biomarcador da presente invenção pode serusado, por exemplo, para determinar quando administrar um agenteterapêutico ou selecionar uma dose terapeuticamente eficaz de um agenteterapêutico a um paciente.
Fundamentos da invenção
A quimioterapia e a exposição à radiação são correntemente asopções principais para o tratamento de câncer, mas a utilidade de ambosdestes métodos é severamente limitada pelos efeitos colaterais drásticos sobreo tecido normal e o desenvolvimento freqüente de resistência à célula detumor. É portanto altamente desejável melhorar a eficácia de tais tratamentosem uma maneira que não aumente a toxicidade associada com eles. Um modopara se obter isto é pelo uso de agentes potenciadores específicos.Tipicamente, estes agentes são designados para serem usados em combinaçãocom agentes existente ou novos.
Uma célula individual duplica fabricando uma cópia exata dosseus cromossomas e depois segregando estes em células separadas. Este ciclode duplicação de DNA, a separação do cromossoma e a divisão são reguladospelos mecanismos dentro da célula que mantêm a ordem das etapas egarantem que cada etapa seja precisamente realizada. A chave para estesprocessos são os pontos de checagem do ciclo celular (Hartwell et ai,Science, (1989) 246(4930): 629-34) onde células podem parar para garantirque os mecanismos de reparo do DNA tenham tempo para operar antes decontinuar através do ciclo na mitose. Existem três de tais pontos de checagemno ciclo celular - o ponto de checagem Gl/S que é regulado pelo p53, a faseS e o ponto de checagem G2/M que é monitorado pela cinase do ponto dechecagem a cinase Ser/Thr 1 (CHK1).
A CHK1 é ativada através da fosforilação de Ser 317 e/ou Ser345 pela ataxia-Xelangiectasia (ATR) e/ou ataxia-Xelangiectasia mutada(ATM) a seguir do dano ao DNA induzido pela quimioterapia ou terapia deradiação (Zhao, H. et ai, (2001) Molecular Cell Biology 21, 7239-7249).CHK1 por sua vez fosforila numerosos substratos incluindo cdc25A, cdc25Ce TLK (em desordem como a cinase). A fosforilação de cdc25A e cdc25Cpela CHK1 leva à sua inativação através da degradação e relocalização,respectivamente. A inativação de cdc25A e cdc25C depois leva à parada dociclo celular nas fases S e G2 do ciclo celular, respectivamente. Além daCHK1 que medeia a parada do ciclo celular a seguir do dano ao DNA, estãoemergindo dados da literatura de que a CHK1 esteja envolvida também nosprocessos de reparo de DNA (Sengupta et ai., Journal of Cell Biology, 166, 6:801-813, 2004). Além disso, os dados também tem sugerido um papelputativo para a CHK1 na divisão celular. Especificamente a CHK1 parece terum papel na regulagem da entrada na mitose pela prevenção da ativaçãoprematura de B-Cdkl da ciclina através da regulagem de cdc25B (Kramer etai, Nature Cell Biology, 6; 9; 884-891, 2004) e na regulagem do início dereplicação.
Visto que a parada do ciclo celular induzida por estes pontosde checagem é um mecanismo crucial pelo qual as células podem superar odano resultante da radio- ou quimioterapia, a sua anulação pelos novosagentes deve aumentar a sensibilidade de células de tumor às terapiasprejudiciais ao DNA. Adicionalmente, a anulação específica de tumor doponto de checagem Gl/S pelas mutações p53 na maioria dos tumores pode serexplorada para fornecer agentes seletivos de tumor. Um método para oplanejamento de quimiossensibilizadores que anulam o ponto de checagemG2/M é desenvolver inibidores da cinase CHK1 reguladora de G2/M chave eeste método mostrou funcionar em várias provas de estudos conceituais.(Koniaras et al., Oncogene, 2001, 20: 7453; Luo et al., Neoplasia, 2001, 3:411; Busby et al., Câncer Res., 2000, 60: 2108; Jackson et al., Câncer Res.,2000, 60: 566).
Um biomarcador é uma característica que é objetivamentemedida e avaliada como um indicador de processos biológicos normais,processos patogênicos, ou respostas farmacológicas a uma intervençãoterapêutica (Atkinson et al, Clin. Pharmacol. Ther., 69: 89-95 (2001)).Acredita-se que o desenvolvimento de novos biomarcadores validados levaráa reduções significantes nos custos tanto do na assistência médica quanto nodesenvolvimento de medicamento e a melhoras significantes no tratamentopara uma ampla variedade de doenças e condições.
De modo a planejar otimamente testes clínicos e obter omáximo de informação destes testes, um biomarcador é requerido. Omarcador precisa ser mensurável em tecidos substitutos e de tumor e devecorrelacionar-se com a inibição do trajeto. Além disso, o biomarcador devedemonstrar ativação do trajeto a montante e a inativação do trajeto a jusante.
Idealmente estes marcadores também correlacionar-se-ão com a eficácia eassim basicamente podem ser usados para a seleção de paciente.
Sumário da invenção
A presente invenção está fundamentada, em parte, nosmétodos que podem ser usados para determinar uma responsividade dopaciente a um inibidor de CHK1 incluindo determinar se é para administrarum inibidor de CHK1, quando administra um inibidor de CHK1 e paradeterminar uma dose terapeuticamente eficaz de um inibidor de CHK1.Especificamente, os métodos da presente invenção incluem a determinação deuma ou mais moléculas de transdução de sinal de CHK1 ativadas tais comoCHK1 fosforilada. A presença de uma molécula de transdução de sinal deCHK1 ativada indica que um inibidor de CHK1 deve ser administrado. Emum outro método da invenção, o método inclui a determinação quanto apresença de H2AX fosforilado como um indicador de se uma dose apropriadade um inibidor de CHK1 foi administrada a um paciente.
Os biomarcadores da presente invenção podem ser usados notratamento ou profilaxia de doenças neoplasticas tais como câncer cervical,câncer da cabeça e pescoço, carcinoma da mama, ovário, pulmão (célula nãopequena), pâncreas, esofágico, gástrico, do intestino delgado, hepático,colônico, prostático ou outros tecidos, assim como leucemias e linfomas,incluindo a leucemia linfocítica crônica, tumores do sistema nervoso central eperiférico e outros tipos de tumor tais como melanoma e sarcomas incluindofibrossarcoma, mesotelioma e osteossarcoma e tumores endócrinos tais comotumores de célula da ilhota e tumores da tireóide.
Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção inclui ummétodo para prognosticar uma responsividade do paciente a um inibidor deCHK1. O método inclui (a) fornecer uma amostra de um paciente de teste queestá sendo tratado com um agente prejudicial ao DNA tal como um agentealquilante, um agente de platina, um anti-metabólito, um inibidor datopoisomerase I ou topoisomerase II ou agentes intercalantes, umradiomimético ou radiação gama e outros agentes tais como anticorpos quepodem causar o estresse celular e (b) determinar quanto a presença de umamolécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada, em que apresença de uma molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativadaé indicativa de que um inibidor de CHK1 deve ser administrado ao paciente.
O método pode incluir ainda (c) administrar um inibidor de CHK1.
A amostra da invenção pode ser qualquer amostra apropriadatal como um tumor, sangue periférico, uma raspagem de célula, um folículocapilar, uma punção de pele ou uma amostra bucal.A molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativadapode ser CHK1 fosforilada, Cdc25A fosforilada, Cdc25C fosforilada, ciclinaB fosforilada, Aurora B fosforilada, H2AX fosforilada ou fosfoistona H3. ACHK1 fosforilada pode ser determinada por um anticorpo de CHK1, porexemplo, um anticorpo fosfoespecífico.
Em um outro aspecto, a invenção inclui um método paraprognosticar uma responsividade do paciente a um inibidor de CHK1. Ométodo inclui (a) fornecer uma amostra de um paciente de teste que estásendo tratado com um agente prejudicial ao DNA; (b) determinar quanto apresença de uma molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada,em que a presença de uma molécula do trajeto de transdução de sinal deCHK1 ativada é indicativa de que um inibidor de CHK1 deve seradministrado ao paciente; e (c) administrar um inibidor de CHK1 ao paciente.O método pode incluir ainda (d) fornecer uma segunda amostra do paciente deteste; e (e) determinar quanto a presença de um aumento na quantidade deuma molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada, em que umaumento na presença da molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1ativada comparado a (b) é indicativo de que uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um inibidor de CHK1 foi administrada ao paciente.
Em um outro aspecto, a invenção inclui um método paraprognosticar uma responsividade do paciente a um inibidor de CHK1. Ométodo inclui fornecer uma amostra de um paciente com câncer de teste edeterminar quanto a presença de uma molécula do trajeto de transdução desinal de CHK1 ativada, em que a presença de uma molécula do trajeto detransdução de sinal de CHK1 ativada é indicativa de. que um inibidor deCHK1 deve ser administrado ao paciente. Em um exemplo a amostra é umaamostra de sangue com células de tumor circulante. A molécula do trajeto detransdução de sinal de CHK1 ativada pode ser uma CHK1 fosforilada ou umaH2AX fosforilada. A CHK1 fosforilada pode ser determinada usandoqualquer método apropriado incluindo um anticorpo de CHK1. O câncer podeser um tumor não sólido, tal como leucemia, mieloma múltiplo ou linfoma, ouum tumor sólido.
Em um outro aspecto, a invenção inclui um método para tratarum paciente tendo leucemia que compreende determinar quanto a presença deuma CHK1 ou pH2AX fosforiladas a partir de uma amostra de um pacientecom leucemia; e administrar um inibidor de CHK1 na determinação de queuma molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada está presentena amostra.
Em um outro aspecto, a invenção inclui um método paradeterminar se deve se administrar a um paciente um inibidor de CHK1. Ométodo inclui fornecer uma amostra de um paciente de teste que esteja sendotratado com um agente prejudicial ao DNA ou um anticorpo indutor doestresse celular e um inibidor de CHK1; e determinar quanto a presença deuma H2AX fosforilada comparada a um controle (uma amostra tratada apenascom agente prejudicial ao DNA), em que a presença da H2AX fosforilada éindicativa de que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor deCHK1 foi administrada ao paciente.
Em um outro aspecto, a invenção inclui um kit paraprognosticar uma resposta do paciente a um inibidor de CHK1, o dito kitcompreendendo (a) um ou mais anticorpos fosfo-específicos contra umamolécula de transdução de sinal de CHK1 e (b) um reagente adequado paradetectar a ligação dos ditos anticorpos à molécula de transdução de sinal deCHK1.
Descrição resumida dos desenhos
A Fig. 1 representa um diagrama de barras mostrando que agencitabina (Gem) resulta na fosforilação de CHK1.
As Figs. 2A a B representam um diagrama de barrasmostrando a fosforilação de CHK1 a seguir do tratamento de combinação degencitabina (Gem) e inibidor de CHK e apenas gencitabina.
A Fig. 3 representa um diagrama de barras mostrando afosforilação de CHK1 de seções de tumor de camundongo de XenoenxertoH460 a seguir do tratamento com gencitabina (Gem), inibidor de Chk (Chki)e uma combinação de ambos.
A Fig. 4 representa um diagrama de barras mostrando aquantificação da fosforilação de CHKI em folículos capilares de biópsias depele de camundongo - a seguir do tratamento com gencitabina (Gem), inibidorde Chk (Chki) e uma combinação de ambos.
A Fig. 5 representa um diagrama de barras mostrando aquantificação de 53BP1 em Células Hela com quantidades diferentes decloridreto de doxorrubicina (Dox) e um inibidor de CHKI (Chki).
A Fig. 6 representa um diagrama de barras mostrando aquantificação de fosfo-H2AX de células SW620 tratadas com gencitabina(Gem) e um inibidor de CHK (Chki).
A Fig. 7 representa um diagrama de barras mostrando a % decélulas positiva em fosfo-H2AX quando as células são tratadas comquantidades variáveis de gencitabina (Gem) e um inibidor de CHK (Chki).
A Fig. 8 representa um diagrama de barras mostrando a % decélulas positivas em fosfo-H2AX quando as células são tratadas com acombinação de cloridreto de doxorrubicina (dox) e um inibidor de CHK.
Descrição Detalhada
A presente invenção fornece biomarcadores para prognosticaruma resposta do paciente a um inibidor de CHKI. Os biomarcadorespreditivos podem ser usados para indicar, por exemplo, quando administrarum inibidor de CHKI ou para determinar a quantidade de um inibidor deCHKI que pode ser usado para tratar eficazmente um paciente com câncer.
Biomarcadores
A presente invenção inclui vários biomarcadores diferentesque podem ser usados para prognosticar uma responsividade dos pacientes aum inibidor de CHK1. Os biomarcadores da invenção incluem moléculas detransdução de sinal de CHK1 ativadas. Uma molécula de transdução de sinalde CHK1 ativada é qualquer molécula que é direta ou indiretamentemodificada, por exemplo ativada ou desativada, como um resultado daativação de CHK1. Por exemplo, uma molécula de transdução de sinal deCHK1 ativada pode ser CHK1 fosforilada. Outras moléculas que servemcomo uma molécula de transdução de sinal de CHK1 ativada incluem TLK1/2fosforilada, CDC25, ciclina B, Aurora B ou fosfoistona H3. Além disso, umaMolécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 inclui uma molécula queé ativada por ATR ou ATM tal como H2AX.
Em um exemplo, o biomarcador é H2AX. A presença deH2AX fosforilada (também conhecida como H2AX gama) a seguir daadministração tanto de um agente prejudicial ao DNA quanto de um inibidorde CHK1 comparada a um controle (uma amostra tirada do paciente antes daadministração de CHK1 e um agente prejudicial ao DNA ou antes daadministração de um agente prejudicial ao DNA) é indicativa de que umadose apropriada de um inibidor de CHK1 foi administrada.
Em um outro exemplo, o biomarcador é um foco nuclear. Apresença de focos em uma amostra tirada de um paciente que recebe umagente prejudicial ao DNA é indicativa de que uma dose mais alta de uminibidor de CHK1 precisa ser administrada.
Ensaios
A presente invenção fornece vários biomarcadores que podemser usados para prognosticar uma responsividade do paciente a um inibidor deCHK1. Um método exemplar para detectar a presença de um biomarcadorinclui obter um tumor ou amostra de tecido substituta de um objeto de teste naausência de tratamento com um agente prejudicial ao DNA ou agente indutorde estresse celular e determinar quanto a presença do biomarcador. Em umoutro método exemplar, o método para detectar a presença de umbiomarcador inclui obter um tumor ou amostra de tecido substituta a partir deum objeto de teste que recebeu um agente prejudicial ao DNA e determinarquanto a presença do biomarcador.
Agente Prejudicial ao DNA
Tipicamente, um agente prejudicial ao DNA é administrado aum paciente com câncer de teste. Um agente prejudicial ao DNA é um agenteextremamente tóxico que induz, por exemplo, a ruptura do DNA de filamentoduplo. Embora não se deseje estar ligado pela teoria, acredita-se que uma vezque uma quantidade suficiente de um agente prejudicial ao DNA foiadministrada a um paciente com câncer, as células reagem pela ativação dostrajetos de resposta ao dano no DNA incluindo a ativação de pontos dechecagem do ciclo celular. Acredita-se que a cinase do ponto de checagem dociclo celular, CHK1, pare as células possibilitando assim o reparo do DNA e asua inibição leva às células de tumor que são sensibilizadas pelos agentescancerosos.
Os agentes prejudiciais ao DNA que podem ser usados napresente invenção incluem qualquer agente prejudicial ao DNA apropriado.
Os exemplos de agentes prejudiciais ao DNA incluem agentes alquilantes taiscomo ciclofosfamida; outros agentes que produzem as rupturas de DNA defilamento único ou duplo tais como os agentes de platinização, incluindocisplatina, carboplatina e oxaliplatina; anti-metabólitos tais como 5-fluorouracila, fludarabina e gencitabina; inibidores da topoisomerase I ou IIItais como doxorrubicina, etoposida e topotecan; e agentes indutores deestresse tais como anticorpos para as proteínas de superfície celular tais comorituximab, cetuximab ou trastuzumab, radiomiméticos tais como bleomicina eradiação gama.
Amostras
Qualquer amostra apropriada pode ser usada para determinarquanto a presença de um biomarcador da invenção. Em um exemplo aamostra é uma amostra de tecido substituta, por exemplo, a amostra pode sersangue periférico, saliva, uma raspagem de célula, uma amostra bucal,folículo capilar, punção de pele ou escarro.
Alternativamente, as amostras de tumor podem ser tiradas dequalquer paciente que receba um agente prejudicial ao DNA. Por exemplo, otumor pode ser um tumor não sólido tal como leucemia, mieloma múltiplo oulinfoma, ou pode ser um tumor sólido, por exemplo duto biliar, osso, bexiga,cérebro/CNS, mama, ovário, intestino delgado, colorretal, cervical,endometrial, gástrico, cabeça e pescoço, hepático, pulmonar, muscular,neuronal, esofágico, ovariano, pancreático, membranas pleurais/peritoneais,prostático, renal, pele, testicular, tireóide, uterino, tumores vulvais e outrostipos de tumor tais como melanoma e sarcomas incluindo fibrossarcoma,mesotelioma e osteossarcoma e tumores endócrinos tais como tumores decélula da ilhota e tumores da tireóide.
Detecção de uma molécula do trajeto de transdução de sinalde CHK1 ativada
Em um exemplo, o método inclui determinar a partir de umaamostra de um paciente de teste quanto a presença de uma molécula do trajetode transdução de sinal de CHK1 ativada. Em um outro exemplo, o métodoinclui determinar a partir de uma amostra de um paciente de teste que estásendo tratado com um agente prejudicial ao DNA quanto a presença de umamolécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada. A presença deuma molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada tal comoCHK1 fosforilada, TLK1/2 fosforilada, CDC25 fosforilada, ciclina Bfosforilada, Aurora B fosforilada, H2AX fosforilada ou fosfoistona H3 éindicativa de que um inibidor de CHK1 deve ser administrado ao paciente.
Os requerentes determinaram ainda que a seguir daadministração de um inibidor de CHK1 é possível prognosticar ainda se uminibidor de CHK1 está inibindo o seu alvo molecular. O método inclui tiraruma segunda amostra do paciente de teste que tenha recebido um inibidor deCHK1 e determinar quanto a CHK1 fosforilada. Tipicamente a amostra étomada de 4 a 24 horas depois da administração do inibidor de CHK1. Ospacientes que receberam uma dose terapeuticamente eficaz de um inibidor deCHK1 terão uma quantidade aumentada (por exemplo, pelo menos umas duasvezes) de CHK1 fosforilada por um período mais longo de tempo, porexemplo, em um período de 24 horas, comparado com a quantidade de CHK1fosforilada determinada a partir da primeira amostra. Embora não se desejeestar ligado pela teoria, Os requerentes acreditam que a quantidade aumentadade CHK1 fosforilada a seguir da administração de um inibidor de CHK1 éporque a seguir da inibição das moléculas a jusante de CHK, as células tentamcompensar pelo aumento da ativação de moléculas a jusante de CHK1.
A determinação quanto a presença de uma molécula do trajetode transdução de sinal de CHK1 ativada da invenção pode ser realizadausando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, CHK1fosforilada, TLK1/2 fosforilada, CDC25 fosforilada, ciclina B fosforilada,Aurora B fosforilada, H2AX fosforilada ou fosfoistona H3 podem servisualizadas reagindo-se as proteínas com anticorpos tais como anticorposmonoclonais direcionados contra os aminoácidos serina, treonina ou tirosinafosforilados que estão presentes nas proteínas. Por exemplo, anticorposmonoclonais úteis para isolar e identificar proteínas contendo fosfotirosinasão descritas na Pat. U.S. N2 4.543.439.
Os procedimentos e reagentes necessários para determinar umaproteína CHK1 ativada pode ser facilmente realizados por uma pessoa-dehabilidade na técnica. Um agente de interesse que pode ser usado paradetectar uma molécula de transdução de sinal de CHK1 ativada incluiqualquer molécula tal como um peptidomimético, proteína, peptídeo, ácidonucléico, molécula pequena, um anticorpo ou outro candidato a medicamento,que possa ligar a proteína. Em um exemplo, anticorpos que sãocomercialmente disponíveis podem ser usados para detectar uma molécula detransdução de sinal de CHK1 ativada. Por exemplo, anticorpos contra CHK1e CDC2 fosforiladas são disponíveis da Cell Signaling (Beverly, MA),anticorpos contra CDC25A Ab-3 fosforilada são disponíveis da Lab-vision(Fremont, CA); anticorpos contra Aurora B são disponíveis da Abcam(Cambridge, MA); anticorpos contra H2AX fosforilada são disponíveis daUpstate Biotechnology (Upstate, NY).
Tipicamente, os anticorpos usados para visualizar umamolécula de transdução de sinal de CFDC1 ativada podem ser rotulados porqualquer procedimento conhecido na técnica, por exemplo, usando umamolécula repórter. Uma molécula repórter, como aqui usada, é uma moléculaque fornece um sinal analiticamente identificável possibilitando a uma pessoahabilitada na técnica identificar quando um anticorpo ligou-se a uma proteínaque o mesmo está direcionado contra. A detecção pode ser qualitativa ouquantitativa. As moléculas repórter habitualmente usadas incluem fluoróforos,enzimas, biotina, moléculas quimioluminescentes, moléculasbioluminescentes, digoxigenina, avidina, estreptavidina ou radioisótopos. Asenzimas habitualmente usadas incluem rábano peroxidase, fosfatase alcalina,glicose oxidase e beta-galactosidase, entre outras. Os substratos a seremusados com estas enzimas são no geral escolhidos para a produção, nahidrólise pela enzima correspondente, de uma mudança de cor detectável. Porexemplo, o fosfato de p-nitrofenila é adequado para o uso com moléculasrepórter da fosfatase alcalina; para a rábano peroxidase, 1,2-fenilenodiamina,o ácido 5-aminossalicílico ou a toluidina são habitualmente usados. Aincorporação de uma molécula repórter em um anticorpo pode ser porqualquer método conhecido pelo técnico habilitado.
Depois da separação e visualização das proteínas, a quantidadede cada espécie de proteína pode ser avaliada pelos procedimentos facilmentedisponíveis. Por exemplo, usando-se a análise de Western blot que incluiseparar eletroforeticamente proteínas em um gel de poliacrilamida e depoisdetectar as proteínas separadas, a quantidade relativa de cada proteína podeser quantificada pela determinação da sua densidade ótica. Alternativamente,outros métodos tais como FACS, imuno-histoquímica, ELISA, etc, podemser usados.
Nos métodos da invenção uma ou mais moléculas do trajeto detransdução de sinal de CHK1 ativadas podem ser detectadas. Por exemplo,um sistema de ensaio pode ser ajustado de modo que possa detectar quanto apresença de moléculas do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativadasmúltiplas.
Detecção de H2AXfosforilada
O método da presente invenção também inclui identificarquanto a presença de H2AX fosforilada (também conhecida como H2AXgama) a seguir da administração tanto de um agente prejudicial ao DNAquanto de um inibidor de CHK1 a um paciente com câncer de teste. Naescolha do agente prejudicial ao DNA, a capacidade do agente prejudicial aoDNA para fosforilar H2AX na presença ou ausência de um inibidor de CHK1deve ter sido anteriormente determinada. Em um exemplo, o método dainvenção usa um agente prejudicial ao DNA que se administrado sozinho semCHK1 resulta em um aumento modesto ou nenhum aumento na fosforilaçãode H2AX. Os exemplos de tais agentes prejudiciais ao DNA incluemGencitabina e dox. Neste exemplo, a combinação do inibidor de Chkl e oagente prejudicial ao DNA produz um aumento grande, por exemplo, umaresposta sinergística, na fosforilação de H2AX. De acordo com o método dainvenção, um aumento na presença de H2AX fosforilada comparado com umcontrole (o controle pode ser uma amostra tirada do paciente antes daadministração do agente prejudicial ao DNA e inibidor de CHK1) indica queo inibidor de CHK.1 foi administrado em uma dose terapeuticamente eficaz.A H2AX fosforilada pode ser detectada usando qualqueragente tal como um peptidomimético, proteína, peptídeo, ácido nucléico,molécula pequena, um anticorpo ou outro candidato a medicamento, quepossam ligar a proteína. Os anticorpos que ligam a H2AX fosforilada sãoconhecidos na técnica, por exemplo, os anticorpos contra H2AX fosforiladasão disponíveis da Upstate Biotechnology (Upstate, NY).
Focos
O método da presente invenção pode ser usado paradeterminar se uma dose eficaz de um inibidor de CHK1 foi administrada a umpaciente de teste. O método inclui detectar quanto a presença de um foco.Neste exemplo, o método inclui (i) administrar a um paciente de teste umagente prejudicial ao DNA; (ii) determinar quanto a presença de um foco emuma primeira amostra do paciente, em que a presença dos focos é indicativade que um inibidor de CHK1 deve ser administrado ao paciente; (iii)administrar ao paciente de teste um inibidor de CHK1; e (iv) determinarquanto a presença de um foco em uma segunda amostra do paciente, em queuma diminuição na presença de focos é indicativa de que um inibidor deCHK1 é terapeuticamente eficaz.
Os focos se formam quando algumas proteínas que estãoenvolvidas no reparo ou controle do ponto de checagem são relocalizadas aofoco nuclear depois do dano ao DNA. Para determinar quanto a presença deum foco, as proteínas dentro dos focos podem ser detectadas. Os exemplos deproteínas que complexam em um foco incluem MRE11, BRCA1, RAD51,53BP1 e NBS1. Como descrito acima, as proteínas de interesse podem serdetectadas usando-se um agente capaz de detectar as proteínas de fococonhecidas usando por exemplo, imunofluorescência ou IHC. Para ajudar nadetecção, os agentes podem ser rotulados.
A presença de um foco é indicativa de que uma doseterapeuticamente eficaz de um inibidor de CHK1 não foi ainda administrada.Portanto uma outra dose ou uma dose diferente, tal como uma dose mais alta,de um inibidor de CHK1 precisa ser administrada. É considerado que ométodo da presente invenção pode ser realizado em amostras subseqüentestiradas do paciente de teste de modo a determinar que uma dose eficaz de uminibidor de CHK1 foi administrada.
Inibidores de CHK1
Os inibidores de CHK1 são conhecidos na técnica, porexemplo, o inibidor de CHK1 pode incluir, por exemplo, um peptídeo, umanticorpo, uma molécula de anti-sentido ou uma molécula pequena. Osinibidores de CHK1 úteis na presente invenção incluem mas não sãolimitados àqueles descritos ou reivindicados nas seguintes publicações asdivulgações inteiras das quais são aqui incorporadas por referência. Osexemplos de inibidores de CHK1 de molécula pequena incluem compostos 2-ureidotiofeno, que são descritos na WO03029241, compostos de 3-ureidotiofeno, descritos na WO03028731 e inibidor de Chkl, XL844(Exilixis, CA). Outros inibidores de CHK1 são descritos naPCT/GB2004/005400, US 20050256157, US 20050245563, US20050245525, WO 2002070494, US 20040014765 e US 2003199511. Osoligonucleotídeos de CHK1 de anti-sentido são descritos na WO 200157206 ePatente US 6.211.164. os ácidos nucléicos de CHK1 interferentes (siNA) eRNA interferente curto (siRNA) são descritos na US 20050196765.
Exemplos
Exemplo 1: Demonstração da ativação de CHK1 a seguir dodano ao DNA em linhagens de célula de tumor e amostras de Xenoenxerto
A. Estudos In vitro:
Em resumo, 3 X IO6 células SW620 e ou HT29 foramplaqueadas em placas de cultura de tecido de 10 cm e deixadas aderir por 24horas a 37° C. As células foram depois tratadas com uma titulação de agentesprejudiciais ao DNA (SN-38 (CQ International, China), doxorrubicina(Sigma-Aldrich, MO) ou gencitabina (CQ International, China)). As célulasforam depois colhidas depois de uma incubação de 8 horas com agentesprejudiciais ao DNA em tampão de lise Onyx còm inibidores da protease efosfatase (20 mM de Tris, 137 mM de NaCl, 1 mM de EGTA, 1 % de TritonX, 10 % de glicerol, 1,5 mM de MgCl2, diluição 1:100 de conjunto II deCoquetel Inibidor da Fosfatase da Calbiochem, 10 mM de P-glicerofosfato, 1mM de DTT, 7 p.g/ml de PMSF, 20 KlU/ml de aprotinina, 1 mM de Pefabloc,0,1 mg/ml de leupeptina). Os Usados de proteína foram depois gerados, aconcentração de proteína determinada e igual à proteína carregada e analisadapela análise de Western blot usando uma diluição 1:100 de anticorpomonoclonal de coelho fosfo-CHK (Ser 345) (133D3) adquirido da CellSignaling (Beverly, MA). A análise de Western blot demonstrou uma super-regulagem dependente da dose de fosfo-CHK a seguir do dano ao DNA. Paracaracterizar ainda mais a ativação de CHK1, as células SW620 e HT29 foramtratadas com gencitabina (100 nM) ou SN38 (100 nM) e as células colhidasem tempos diferentes (de 30 minutos a 24 horas). A análise de Western blotdemonstrou uma ativação dependente do tempo de fosfo-CHK com ativaçãode pico entre 4 e 8 horas. Um painel de linhagens de célula de tumor foidepois examinado para determinar quão amplamente nas células de tumor aCHK foi ativada e se a situação de p53 impactou a ativação de CHK. O painelde linhagens de célula foi plaqueado e tratado por 8 horas com 100 nM degencitabina. Os Usados de célula foram colhidos e avaliados quanto a superregulagem de fosfo-CHK. A análise de Western blot demonstrou que a fosfo-CHK é super regulada em um painel de linhagens de célula de tumor, se bemque em níveis diferentes.
A regulagem de fosfo-CHK também foi examinada pelaimuno-histoquímica (IHC). Em resumo, as células HeLa ou A549 foramplaqueadas em lamínula e deixada aderir por 24 horas a 37° C. As célulasforam depois tratadas por 5 horas com 100 nM de gencitabina. As célulasforam fixadas com 4 % de PFA em PBS (8 minutos na temperatura ambiente),permeabilizadas com 0,5 % de Triton-X em PBS, lavadas com PBS e lavadascom 0,05 % de Tween 20 em PBS. As células foram depois bloqueadas com10 % de soro de cabra por 1 hora na temperatura ambiente, incubadas comdiluição 1:50 de anticorpo monoclonal de coelho fosfo-CHK (Ser 345)(133D3) adquirido da Cell Signaling (Beverly, MA) em 10 % de soro decabra por 90 minutos, lavadas duas vezes com PBS e uma vez com 0,5 % deTween 20 em PBS. As células foram depois incubadas por 60 minutos comdiluição 1:300 de IgG anti-coelho Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, OR)em 10 % de soro de cabra, lavado duas vezes com PBS, os núcleosmanchados com solução Hoescht (2 ug/ml) por 5 minutos e as célulasenxaguadas com PBS. O manchamento com fosfo-CHK foi depoisquantificado usando a análise Metamorph (Universal Imaging Corp,Dowington, PA). A área de sinal de fosfo-CHK relativa à área nuclear foimedida como mostrado na Fig. 1. Resultados similares foram obtidos usandomedições de intensidade. Os dados demonstram um aumento grande na fosfo-CHK a seguir do tratamento com gencitabina.
B. Estudos In vivo:
1 X 10' células H460 que expressam o p53 negativo dominanteforam injetadas no flanco direito de ratos nus machos que foram irradiadoscom radiação 5 Gy, 6 dias antes da implantação. No dia 20 quando os tumoresatingiram um tamanho de 8 gramas, os animais foram dosado IV com 20mg/kg de gencitabina em 0,9 % de solução salina. Os tumores foram depoiscolhidos em pontos de tempo variáveis incluindo 1,5, 2, 2,5, 4, 6, 8 e 24 horasa seguir da dosagem de gencitabina. Uma seção do tumor foi depoishomogeneizada em tampão de lise sueco (20 mM de Tris pH 8,0, 150 mM deNaCl, 1 % de NP-40 substituição e 1 mM de Vanadato de Sódio cominibidores de protease como recomendado (Roche Applied Science, IN) eInibidores de Fosfatase I e II como recomendado (Sigma-Aldrich, MO). OsUsados de proteína foram depois gerados, a concentração de proteínadeterminada e proteína igual carregada e analisada pela análise de Westernblot usando um anticorpo monoclonal de coelho fosfo-CHK (Ser 345)(133D3) adquirido da Cell Signaling (Beverly, MA). A análise de Westernblot demonstrou a ativação de CHK em 2 horas com uma ativação máximaem 8 horas. Em 24 horas a fosfo-CHK é significantemente infra-regulada.
Exemplo 2: Demonstração de fosfo-CHK aumentada a seguirdo tratamento de combinação de gencitabina e inibidor de CHK1 emlinhagens de célula de tumor, amostras de Xenoenxerto e tecidos substitutos
A. Estudos In vitro
Em resumo, 3 X IO6 SW620 foram plaqueadas em placas decultura de tecido de 10 cm e deixado aderir por 24 horas a 37° C. As célulasforam depois tratadas com 100 nM de gencitabina ou 30 nM, 100 nM ou 500nM de inibidor de CHK ou uma combinação de 100 nM de gencitabina e 30nM, 100 nM ou 500 nM por 8 horas. Um conjunto de células foram depoiscolhidas para a análise de Western blot. Os meios contendo os compostosforam removidos das células remanescentes e meio de cultura de tecido frescoadicionado de volta. As células foram depois colhidas 22 horas mais tarde, osUsados de proteína gerados como descrito acima e analisados pela análise deWestern blot usando o anticorpo fosfo-CHK. A análise de Western blotdemonstrou um aumento em fosfo-CHK a seguir do tratamento comgencitabina sozinha e um aumento dependente da dose em relação àgencitabina sozinha em fosfo-CHK a seguir do tratamento de combinação.Nenhum aumento em fosfo-CHK foi observado a seguir do tratamento decélulas com inibidor de CHK sozinho.
A regulagem de fosfo-CHK também foi examinada pela IHCcomo descrito acima no Exemplo 1 usando células HeLa e A549. A Fig. 2A e2B demonstra um aumento maior em fosfo-CHK a seguir do tratamento decombinação de gencitabina e inibidor de CHK como comparado a gencitabinasozinha.
B. Estudos In vivo
3 X IO6 células H460 que expressam p53 dominante negativoforam injetados no flanco direito de camundongos nus machos. No dia 25quando os tumores atingiram um tamanho de 0,6 a 0,8 gramas, os animaisforam dosados IV com gencitabina (30 ou 60 mg/kg), inibidor de Chk (5, 20ou 40 mg/kg) ou a combinação. Sete horas mais tarde, os tumores foramdepois colhidos, fixados e manchados quanto à CHK1 fosforilada (CellSignalling 2345)-DAB com contra-manchamento de verde de metila. Asseções foram depois quantificadas pela análise de classificação H. Aclassificação H é calculada classificando-se a intensidade das células (0, 1,2ou 3) e multiplicando-se pela classificação que representa o número de célulaspositivas (0, 1 (1 a 25 %), 2 (26 a 50 %), 3 (51 a 75 %) e 4 (76 a 100 %). Aanálise mostrada na Figura 3 demonstrou um aumento no manchamento defosfo-Chk quando comparado com cada agente sozinho. Estudos decombinação similares foram completados com irinotecan e inibidor de Chk.Mais uma vez os dados demonstraram um aumento no manchamento fosfo-Chk quando comparado com cada agente sozinho (dados não mostrados).
C. Tecidos substitutos
Camundongos nus foram dosados IV com gencitabina (30 ou60 mg/kg), inibidor de Chk (5, 20 ou 40 mg/kg) ou a combinação como naseção acima. Sete horas mais tarde, as biópsias de pele contendo folículoscapilares foram depois colhidas, fixadas e manchadas quanto a CHK1fosforilada (Cell Signalling 2345)-DAB com contra-manchamento com verdede mètila. Os resultados mostraram manchamento positivo (marrom) nascélulas basais de folículo capilar em camundongos tratados. O manchamentofoi específico para os núcleos de célula. Manchamento raro ou ocasionalocorreu nos grupos tratados com inibidor de Chk. Nenhum manchamento foiobservado nos grupos tratados com gencitabina. As seções foram depoisquantificadas pela análise de classificação H. A classificação H é calculadaclassificando-se a intensidade das células (0, 1, 2 ou 3) e multiplicando-sepela classificação que representa o número de células positivas (0, 1 (1 a 25%), 2 (26 a 50 %), 3 (51 a 75 %) e 4 (76 a 100 %). A análise mostrada naFigura 3 demonstra que o manchamento de folículos capilares é enormementeaumentado nos grupos de combinação comparados com outros grupos detratamento. Além disso, uma resposta de dose do inibidor de Chk foiobservada com os aumentos maiores atingidos nas doses eficazes.
Estudos de combinação similares foram completados comirinotecan e inibidor de Chk. Mais uma vez os dados demonstraram umaumento no manchamento de fosfo-Chk quando comparados com cada agentesozinho (dados não mostrados).
Exemplo 3: Demonstração de focos de dano de DNAdiminuídos a seguir da inibição da CHK1 cinase
A. Estudos In vitro:
As células HeLa foram plaqueadas em lamínulas e deixadasaderir por 24 horas a 37° C. As células foram depois tratadas por 5 horas com100 nM de Adriamicina® e 500 nM de inibidor de CHK. As células foramdepois tratadas como descrito no Exemplo 1. O anticorpo primário usado paraos estudos foi uma diluição 1:120 de anticorpo anti-53BPl policlonal decoelho (Novus, CO) e o anticorpo secundário foi uma diluição 1:300 de IgGanti-coelho Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, OR). Os focos foramquantificados medindo-se a intensidade fluorescente por número de núcleos(determinada por manchamento Hoescht) usando análise Metaphorph. AFigura 5 demonstra uma diminuição na intensidade fluorescente quando oinibidor de CHK é combinado com cloridreto de doxorrubicina(Adriamicina®).
Exemplo 4: Demonstração de fosfo-H2AX aumentada a seguirdo tratamento de combinação de gencitabina e inibição de CHK1A. Estudos In vitro
Em resumo, 3 X IO6 células SW620 e ou A549 foramplaqueadas em placas de cultura de tecido de 10 cm e deixadas aderir por 24horas a 37° C. As célula foram depois tratadas com veículo, 100 nM degencitabina, ou 100 nM de gencitabina e 500 nM de inibidor de CHK. Ascélulas foram depois colhidas depois de uma incubação de 5 horasdiretamente em tampão de amostra SDS (NuPAGE #NP007). As amostrasforam depois sonicadas, passadas através de uma agulha de calibre 21,aquecidas a 100° C por 5 minutos, microcentrifugadas e analisadas pelaanálise de Western blot. Os lisados de proteína foram depois gerados, aconcentração de proteína determinada e proteína igual carregada e analisadapela análise de Western blot usando uma diluição de 1:5000 de um anti-fosfoH2AX Serina 139 monoclonal de camundongo (Upstate, NY). Os dadosdemonstraram um aumento grande em fosfo-H2AX quando as células foramtratadas em combinação com gencitabina e inibidor de CHK e nenhumamudança ou uma mudança muito modesta quando cada composto foi usadosozinho.
Fosfo-H2AX também foi examinada por um ensaio de ELISAquantitativo. Em resumo, 3 X IO6 SW620 foram plaqueadas em 10 cm deplacas de cultura de tecido e deixadas aderir por 24 horas a 37° C. As célulasforam depois tratadas com veículo, 100 nM de gencitabina, 30, 50, 100 e 500nM de inibidor de Chk ou a combinação de gencitabina e todas asconcentrações de inibidor de Chk por 7 horas e depois colhidas em tampão delise (20 mM de Tris HC1, 28 mM de base Tris, 0,4 % de LDS, 2 % deGlicerol, 0,10 mM de EDTA) contendo inibidores da fosfatase (CalbiochemCat. #534625, CA).
As concentrações de proteína foram determinadas e os níveisde p-H2AX quantificados pelo ensaio de ELISA usando anticorpo H2AXtotal (Novus Biologicals, Cat #NB 100-383, CO) para capturar anticorpo anti-fosfo-histona H2AX (Ser 139) rotulado com Eu H2AX e LANCE total(Upstate, Cat#05-636, NY) para detectar a H2AX fosforilada. Como mostradona Figure 6, um aumento grande em fosfo-H2AX foi observado no tratamentode combinação.
Fosfo-H2AX também foi examinado por IHC como descritoacima no Exemplo 1 exceto com as seguintes mudanças. Células HeLa ouA549 foram plaqueadas em placas de 96 reservatórios e tratadas com ou sem100 nM de gencitabina e concentrações crescentes de inibidor de CHK (0 a 1uM) por 5 horas antes da fixação e manchamento. Uma diluição 1:400 de umanti-fosfo H2AX Serina 139 monoclonal de camundongo (Upstate, NY)seguido por uma diluição 1:300 de IgG anti-camundongo Alexa Fluor 594(Molecular Probes, OR) foi incubada em células fixas. A quantificação foirealizada usando algoritmos Cellomics Cell Health e reportada como % decélulas positivas em fosfo-H2AX. A Fig. 7 mostra a quantificaçãodemonstrando um aumento dependente da dose robusto em % de célulaspositivas em fosfo-H2AX quando as células são tratadas com a combinaçãode gencitabina e inibidor de CHK. Foi observado usando imunomanchamentoque H2AX fosforilada está presente por todo o núcleo, não limitada aos focos.
Exemplo 5: Demonstração de fosfo-H2AX aumentada a seguirdo tratamento de combinação de doxorrubicina e inibição de CHK1
Estudos In vitro
A fosfo-H2AX também foi examinada pelo IHC como descritoacima no Exemplo 1 exceto com as seguintes mudanças. As células HeLa ouA549 foram tratadas com ou sem 100 nM de doxorrubicina (Adriamicina®) econcentrações crescentes de inibidor de CHK (0 a 1 uM) por 5 horas antes dafixação e manchamento. Uma diluição 1:400 de um anti-fosfo H2AX Serina139 monoclonal de camundongo (Upstate, NY) seguido por uma diluição1:300 de IgG anti-camundongo Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, OR) foiincubada em células fixas. A luantificação foi realizada usando algoritmosCellomics Cell Health e reportadas como % de células positivas em fosfor-H2AX. A Fig. 8 é a quantificação demonstrando um aumento dependente dadose robusto em % de células A549 positivas em fosfo-H2AX quando ascélulas são tratadas com a combinação de Adriamicina® e inibidor de CHK.

Claims (17)

1. Método para prognosticar uma responsividade do paciente aum inibidor de CHK1, caracterizado pelo fato de que compreende:fornecer uma amostra de um paciente de teste que esteja sendotratado com um agente prejudicial ao DNA; edeterminar quanto a presença de uma molécula do trajeto detransdução de sinal de CHK1 ativada, em que a presença de uma molécula dotrajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada é indicativa de que uminibidor de CHK1 deve ser administrado ao paciente.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que ainda compreende administrar um inibidor de CHK1.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a amostra é um tumor, sangue periférico, uma raspagem de célula,um folículo capilar, uma punção de pele ou uma amostra bucal.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada éCHK1 fosforilada.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que a CHK1 fosforilada é determinada por um anticorpo de CHK1.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada éCdc25A fosforilada, Cdc25C fosforilada, ciclina B fosforilada, Aurora Bfosforilada, H2AX fosforilada ou fosfoistona H3.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente prejudicial ao DNA é um agente alquilante, um anti-metabólito, um inibidor da topoisomerase, um radiomimético ou radiaçãogama.
8. Método para prognosticar uma responsividade do paciente aum inibidor de CHK1, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) fornecer uma amostra de um paciente de teste que estejasendo tratado com um agente prejudicial ao DNA;(b) determinar quanto a presença de uma molécula do trajetode transdução de sinal de CHK1 ativada, em que a presença de uma moléculado trajeto de transdução de sinal de CHK1 ativada é indicativa de que uminibidor de CHK1 deve ser administrado ao paciente; e(c) administrar um inibidor de CHK1 ao paciente.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que ainda compreende:(d) fornecer uma segunda amostra do paciente de teste; e(e) determinar quanto a presença de um aumento naquantidade de uma molécula do trajeto de transdução de sinal de CHK1ativada, em que um aumento na presença da molécula do trajeto detransdução de sinal de CHK1 ativada comparada com (b) é indicativa de queuma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de CHK1 foiadministrada ao paciente.
10. Método para determinar se foi administrado a um pacienteum inibidor de CHK1, caracterizado pelo fato de que compreende:fornecer uma amostra de um paciente de teste que esteja sendotratado com um agente prejudicial ao DNA e um inibidor de CHK1; edeterminar quanto a presença de uma H2AX fosforilada, emque um nível aumentado de H2AX fosforilada comparado a um controle éindicativo de que a dose terapeuticamente eficaz do inibidor de CHK1 foiadministrada ao paciente.
11. Método para prognosticar uma responsividade do pacientea um inibidor de CHK1, caracterizado pelo fato de que compreende:fornecer uma amostra de um paciente com câncer de teste; edeterminar quanto a presença de uma CHK1 fosforilada ouuma H2AX fosforilada, em que a presença da CHK1 fosforilada ou da H2AXfosforilada é indicativa de que um inibidor de CHK1 deve ser administrado aopaciente.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue com células de tumorcirculante.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a fosforilada CHK1 é determinada por um anticorpo deCHK1.
14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o câncer é um tumor não sólido ou um tumor sólido.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o tumor é leucemia, mieloma múltiplo ou linfoma.
16. Método para tratar um paciente tendo leucemia,caracterizado pelo fato de que compreende:determinar quanto a presença de uma CHK1 fosforilada ouH2AX fosforilada a partir de uma amostra de um paciente; eadministrar um inibidor de CHK1 na determinação de que aCHK1 fosforilada ou a H2AX fosforilada estão presentes na amostra.
17. Kit para prognosticar uma resposta do paciente a uminibidor de CHK1, caracterizado pelo fato de que compreende (a) um ou maisanticorpos fosfo-específicos contra uma molécula de transdução de sinal deCHK1 e (b) um reagente adequado para detectar a ligação dos ditosanticorpos à molécula de transdução de sinal de CHK1.
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