JP2003531177A

JP2003531177A - マダニセメントタンパク質を含むワクチン

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Publication number: JP2003531177A
Application number: JP2001577978A
Authority: JP
Inventors: アダマロゼアンヌトリムネル，; グイドクリスティアンパーセン，; パトリシアアンナットール，
Original assignee: Evolutec Ltd
Current assignee: Evolutec Ltd
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2003-10-21
Anticipated expiration: 2021-04-25
Also published as: ATE551068T1; GB0010068D0; CU23358B7; CN101406696A; GB0028606D0; JP4925236B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、吸血外寄生生物の咬傷、ならびにウイルス、細菌、および外寄生生物による他の病原体の伝染から、動物を保護するためのワクチンの産生におけるマダニセメントタンパク質の利用に関する。本発明に従って、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、免疫原性ダニセメントタンパク質、そのフラグメント、またはその機能的等価物を含むワクチン組成物が提供される。本発明のマダニセメントタンパク質がワクチン成分として用いられる場合、外寄生生物の様々な種に対する広範な交差反応性が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、吸血外寄生生物の咬傷に対して、ならびにウイルス、細菌およびこ
のような外寄生生物による他の病原因子の伝播に対して動物を防御するためのワ
クチンの生成におけるダニセメントタンパク質（ｔｉｃｋｃｅｍｅｎｔｐｒ
ｏｔｅｉｎ）の使用に関する。

【０００２】吸血外寄生生物（例えば、蚊およびダニ）は、疾患の伝達者として非常に有効
である。例えば、ダニ種であるＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓは、致死的な
東海岸熱を通常引き起こす原虫寄生生物であるＴｈｅｉｌｅｒｉａｐａｒｖａ
を伝播して、いくつかのサハラ周辺の地域で家畜の成育に対して主な障害を示す
。この疾患はしばしば、ウシの最も重要な疾患であると考えられる（Ｎｏｒｖａ
ｌら、１９９２ａ；Ｎｏｒｖａｌら、１９９２ｂ）。このダニはまた、ナイロビ
病（ヒツジおよびヤギを無力化し、そしてしばしば致死的な疾患である）を生じ
るウイルスの主要なベクターである（Ｄａｖｉｅｓ、１９８８）。さらに、Ｒ．
ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓおよび他のダニ害虫はまた、動物の皮膚にかなり
の傷害を生じ、これによって皮革産業に悪影響を及ぼす。

【０００３】慣習的に、ダニ集団をコントロールするための技術は、ダニ駆除薬（ａｃａｒ
ａｃｉｄｅ）のような化学物質による動物の処置を用いてきた。このストラテジ
ーは、耐性ダニの発生を生じる。すなわち、新しいクラスの化学物質が導入され
なければならない。さらに、化学物質は、残留効果が乏しく、すなわち、頻繁に
適用しなければならない。第二のアプローチは、ダニ耐性の動物を産むことであ
るが、生じる耐性の程度は理想とはかけ離れている。

【０００４】寄生生物伝達疾患と戦う労力において、ダニ全体またはダニの腸の抽出物を用
いて、ダニに対して動物を免疫するために多数の試みがなされてきた。ある報告
では、組み換えダニタンパク質を用いていた（例えば、国際特許出願ＷＯ８８
／０３９２９を参照のこと）。しかし、このような開発にかかわらず、市販され
ている唯一のダニワクチンは、Ｂ．ｍｉｃｒｏｐｌｕｓダニの成体段階に対して
しか活性でなく、そしてこの種の地理学的位置に依存して有効性の変化が見られ
る。

【０００５】ワクチン接種された動物の集団全体にわたって、またはそれらの動物の生活サ
イクルのあらゆる段階の寄生生物体に対して耐性を提供するワクチンはまだ開発
されていない。従って、吸血外寄生生物によって伝達される疾患と戦うための有
効なワクチンの必要性は大きい。驚くべきことに、ダニセメントタンパク質はワ
クチン成分として有用であることが、この度発見された。

【０００６】（発明の要旨）本発明に従って、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、免疫原性ダニセ
メントタンパク質、そのフラグメント、またはその機能的等価物を含むワクチン
組成物が提供される。このようなワクチンを用いた動物の免疫は、広範な種々の
外寄生生物種に対して有効である抗体の生成を生じることが本明細書において示
されている。

【０００７】世界の様々な地方に多数の外寄生生物種が存在するが、それらの頻度は、熱帯
および亜熱帯に集中される傾向である。そこでは、外寄生生物種およびそれによ
って運ばれる疾患は固有である。これらの種は、タイプが非常に様々であり、そ
して広く異なる摂食戦略に適合し、ヒルおよびダニにいたるまで、一過性の摂食
者（例えば、蚊、アブ（ウマバエ）、ツェツェバエ、ノミ、シラミおよびダニ（
ｍｉｔｅ））にわたり、そのいくつかは長期間摂食する。これらの外寄生生物の
全てが、本発明のワクチンの適切な標的である。

【０００８】本発明のワクチンは、ダニ種に対して特に有効である。このような標的された
ダニ種の例は、以下：

【０００９】

【化１】である。

【００１０】上記の外寄生生物の全ての間で共通のものは、それらの寄生生物が血液、リン
パを摂取するか、またはそれらが宿主皮膚産物上で摂食する、すなわち、その宿
主に存在する任意の抗体がその外寄生生物内に自動的に内在化されるということ
のいずれかである。これによって抗体の投与の有利でかつ自動的な経路が提供さ
れる。そして抗体が外寄生生物のタンパク質に対して反応性であれば、このこと
は、十分組織化された免疫レジメンが、意図される領域内で寄生生物の完全な根
絶を生じ得ることを意味する。血液を摂食する外寄生生物は、本発明のワクチン
の特に好ましい標的である。

【００１１】本発明は、多数の異なるダニセメントタンパク質を発見した。そして多くの場
合、そのコード遺伝子をクローニングした。例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ
９８／０３３９７（その内容は本明細書において参考として援用されている）は
、多数の組織セメントタンパク質の単離を記載しており、そして皮膚手術および
創傷治癒における使用のための組織セメントの成分としての医薬におけるそのタ
ンパク質の使用、ならびにお互いに対するまたは他の生体物質に対するヒトまた
は動物組織の一過性または永続的な結合について考察している。

【００１２】マダニ（硬性）ダニは、ダニ唾液腺のＩＩ型腺房およびＩＩＩ型腺房に起源す
る、「セメント円錐体（セメントコーン）（ｃｅｍｅｎｔｃｏｎｅ）」によっ
て、自分自体を脊椎動物宿主に付着させる吸血性寄生生物である（Ｋｅｍｐら、
１９８２；Ｗａｌｋｅｒら、１９８５）。

【００１３】円錐（コーン）（ｃｏｎｅ）を形成するセメントは、乳白色の分泌物であり、
これはこれらの寄生生物が摂食する動物の皮膚中に注入される。このセメントは
多数の相互作用するタンパク質および炭水化物成分を含む。このセメントは咬傷
部位に広がり、そして皮膚にまたがり、そして硬化の際、口器が摂食期間（これ
は代表的には４〜８日続く）の間、宿主に固く固定されたままであることを確実
にする。このセメント円錐（セメントコーン）は、さらにガスケットとして機能
して、摂食の間、咬傷部位からの液体の漏出を防ぐ。

【００１４】マダニのセメント円錐は、２つの主要な型のセメントからなる、層状構造であ
る。セメントの第１の型は、咬傷部位の樹立のほんの数分後に生成され、そして
迅速に固化して、円錐の剛性の「コア」を形成する。セメントの第２の型は、後
に（付着の約２４時間後）分泌され、そしてよりゆっくりと固化して、より可撓
性の「皮質」を形成する。成虫のマダニにおいて、セメントの生成は、代表的に
、付着の３日後または４日後まで継続する（Ｋｅｍｐら、１９８２；Ｓｏｎｎｅ
ｎｓｈｉｎｅら、１９９１）。

【００１５】マダニセメントの組成は、異なるマダニ（Ｉｘｏｄｉｄ）のマダニ種の間で類
似するようである。例えば、ブラウンイヤーマダニ（ｂｒｏｗｎｅａｒｔｉ
ｃｋ）（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）の９０
ｋＤの唾液タンパク質に対して惹起される抗血清は、唾液腺由来のポリペプチド
、ならびにアメリカイヌカクマダニ（Ａｍｅｒｉｃａｎｄｏｇｔｉｃｋ）（
Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｅｒｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ローンスターマダニ（ｌｏ
ｎｅｓｔａｒｔｉｃｋ）（Ａｍｂｌｙｏｍｍａａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、
およびクリイロコイタマダニ（ｂｒｏｗｎｄｏｇｔｉｃｋ）（Ｒ．ｓａｎｇ
ｕｉｎｅｕｓ）のセメントタンパク質を認識することが示された（Ｊａｗｏｒｓ
ｋｉら、１９９２）。

【００１６】精製されていないセメント成分は、宿主耐性の誘発因子として以前に試験され
た（Ｂｒｏｗｎら、１９８６；Ｓｈａｐｉｒｏら、１９８９）が、これらのタン
パク質に基づく信頼性のあるワクチンは、開発されていない。ある意味では、こ
のことは驚くことではない。なぜなら、配列の関係は、最もありそうには宿主の
天然の免疫防御機構による皮膚のマダニの付着に対する拒絶を回避する目的で、
セメントタンパク質が宿主の皮膚タンパク質に類似して設計されたことを示すか
らである。特定のマダニタンパク質の、それらの周囲の組織との組成的類似はま
た、セメント円錐と周囲の皮膚組織との間の密接な結合を容易にし得る。

【００１７】本発明のワクチンへの組み込みに適切なマダニセメントタンパク質は、任意の
適切なマダニ種（例えば、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌ
ａｔｕｓ、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｅｒｒｅｔｉｃｕｌａｔ
ｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｅｒｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ
ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、
Ａｍｂｌｙｏｍｍａｖａｒｉｅｇａｔｕｍ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏ
ｐｌｕｓ、およびＨａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓｌｅａｃｈｉｉ種）由来であり
得る。好ましい実施形態において、マダニセメントタンパク質は、マダニＲ．ａ
ｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ由来である。

【００１８】本発明のワクチンへの含有に特に適したマダニセメントタンパク質の例は、本
明細書中およびまた特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３３９７に与えられる。これ
らのセメントタンパク質としては、クローン２１、クローン３３、ＣｅｍＡ、ク
ローン２４、クローン６８、クローン６４、およびクローンＩと称されるタンパ
ク質が挙げられる。これらのタンパク質の推定アミノ酸配列を、本明細書中の図
１に同定する。

【００１９】好ましくは、本発明のワクチン組成物において使用されるマダニセメントタン
パク質、そのフラグメントまたはその機能的等価物は、免疫原性セメントタンパ
ク質、フラグメントまたは機能的等価物が由来するマダニ種以外の吸血性（ｂｌ
ｏｏｄ−ｆｅｅｄｉｎｇ）外寄生生物種の１つ以上の定向進化タンパク質に存在
する、免疫原性エピトープを含むべきである。このことは、単一のワクチン組成
物が、共通のエピトープを含むタンパク質を産生する外寄生生物種の全てに対す
る広範なスペクトルのワクチンとして有効であり得ることを意味する。例えば、
特定の地域においては、多数の異なるマダニ種が地方病性であり、そして農産業
に対して重大なペストの問題を引き起こす。多数の異なるマダニ種に対して有効
な単一のワクチンのアベイラビリティは、そのワクチンを投与する費用を削減し
、従って、現在利用可能なワクチンより有利である。

【００２０】従って、本発明のこの局面のワクチンは、特に有利である。なぜなら、炎症応
答が刺激され、これは、ワクチン接種された動物の免疫状態をブーストし、そし
てさらに、隠蔽された抗原を標的化し、これによってマダニ自体の損傷を生じる
からである。

【００２１】特定のマダニセメントタンパク質、およびこれらのタンパク質のフラグメント
は、本発明の１つの局面に従って、外寄生生物種の腸および血液リンパに存在す
るタンパク質にもまた存在するエピトープを含むことが発見された。この交差反
応性は、本発明のこの実施形態のワクチンを特に有利にする。なぜなら、血液、
および従って宿主抗体の、外寄生生物への摂取は、この寄生生物への活性薬剤の
送達を保証するからである。この様式で、本発明のワクチンは、一時的に食餌す
る種（例えば、カおよびウマバエ）を、それらの宿主に十分な時間付着したまま
である種（例えば、マダニ）と同程度に効率的に標的化する。

【００２２】本発明によるワクチンへの含有に特に適切なタンパク質は、例えば、Ｒ．ａｐ
ｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ以外の種から単離された、クローン６４タンパク質（
本明細書中以下において６４Ｐ）、そのフラグメント、またはその機能的等価物
である。このタンパク質は、構造的タンパク質に代表的な配列を有し、そしてマ
ダニの唾液中に分泌されるようである。このセメントタンパク質の最初の４０ア
ミノ酸を含む配列は、非常にコラーゲン様であり、一方でこの配列の残りの部分
は、ケラチンに類似する。このタンパク質の配列に対して実施された相同性検索
は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ）において検索された全ての配列に対する相同性の最高のレベル
が、マウス表皮ケラチンサブユニットＩに対する５１％であったことを明らかに
する。

【００２３】このタンパク質はグリシンリッチであり、そしてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅ
ｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（クチクラタンパク質）および他の昆虫卵殻由来の構造的
タンパク質、ならびに脊椎動物サイトケラチン（哺乳動物ケラチン複合体２基本
タンパク質、マウスケラチン、ヒトケラチン、コラーゲンＩＶα型、およびＩＰ
ＩＢ２前駆体が挙げられる）に類似のモチーフ（Ｃ／Ｓ）１−４（Ｙ／Ｆ）のい
くつかの反復を含む。

【００２４】本発明の１つの実施形態において、マダニタンパク質の機能的等価物は、ワク
チン組成物に含まれ得る。用語「機能的等価物」とは、本明細書中において、ク
ローン２１、クローン３３、ＣｅｍＡ、クローン２４、クローン６８、クローン
６４、およびクローンＩと称されるセメントタンパク質に類似の機能を有するタ
ンパク質を記載するために使用される。機能的に等価なタンパク質は、これらの
タンパク質と同じタンパク質ファミリーに属し得る。タンパク質ファミリーとは
、共通の機能を共有し、そしてポリペプチド配列に存在するモチーフ間で共通の
配列相同性を示す、ポリペプチドの群を意味する。

【００２５】「配列相同性」とは、ポリペプチド配列が共通の祖先からの発散によって関連
することを意味する。特に、本明細書中において同定されるタンパク質および部
分タンパク質はこのタンパク質の配列にわたって数回反復される特定の配列を、
共通して有する。好ましくは、同じタンパク質ファミリーにおけるポリペプチド
配列間の相同性は、このタンパク質のアミノ酸配列全体にわたって少なくとも３
０％である。より好ましくは、相同性は、このタンパク質のアミノ酸配列全体に
わたって、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％であ
る。なおより好ましくは、相同性は、このタンパク質配列全体にわたって、８０
％より大きく、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９
％である。

【００２６】「類似の機能」とは、第１に、少なくとも他のセメントタンパク質と共に存在
する場合に、タンパク質がセメントを形成する能力を維持していることを意味す
る。従って、他の必要なセメント構築物と組み合わせると、このようなタンパク
質は、経時的に硬化して、固体の塊または接着剤を形成し得る。第２に、この用
語は、セメントタンパク質に構造的に類似しており、従って類似かまたは同一の
エピトープを含む、タンパク質をいい得る。

【００２７】組織セメントタンパク質の機能的等価物は、野生型配列からのアミノ酸の置換
、挿入、または欠失を含む（但し、免疫原性は維持される）、変異を含む。野生
型タンパク質配列の免疫原性から改善された免疫原性を有する機能的等価物はま
た、タンパク質配列における特定の残基の合成または指向された変異を介して設
計され得る。

【００２８】機能的等価物としては、タンパク質の機能または活性に不利な様式で影響を及
ぼさない、保存的アミノ酸置換を含むタンパク質が挙げられる。この用語はまた
、天然の生物学的改変体（例えば、組織セメントタンパク質が由来する種におけ
る対立遺伝子改変体または地理的な改変体）を含むことが意図される。

【００２９】本発明によれば、マダニセメントタンパク質のフラグメントもまた、ワクチン
組成物への含有に適した成分として意図される。例えば、マダニセメントタンパ
ク質の免疫原性部分由来のペプチドの短い伸長は、免疫原として特に有用であり
得る。このようなポリペプチド配列の短い伸長は、合成的にかまたは組換え手段
を介してかのいずれかで、多量に産生することが簡単である。タンパク質フラグ
メントは、多くの例において、本発明のワクチンにおける使用に適切であり得る
。なぜなら、これらのフラグメントは、全長野生型配列によって採用されないコ
ンホメーションに折り畳まれるようであるからである。いくらかのセメントタン
パク質は、宿主の皮膚の組織に類似するように、従ってマダニに対する宿主の免
疫応答を誘発することを回避するように、進化したようであるので、このような
マダニセメントタンパク質の非天然の形態は、本発明のワクチンにおいて特に有
用であるようである。

【００３０】本発明のワクチン組成物における封入のために有用なマダニセメントタンパク
質のフラグメントの例としては、本発明者らによって組換え産生された６４Ｐタ
ンパク質の種々のフラグメント、およびこれらのフラグメントの機能的等価物（
例えば、上に議論される種類の密接なホモログおよび変異体）が挙げられる。当
業者に明らかなように、本明細書中に明確に開示されるタンパク質に類似のフラ
グメントは、マダニ種Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ以外の外寄生生物種か
ら調製され得る。

【００３１】本明細書中に記載されるＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓフラグメントの詳
細は、以下の通りである。

【００３２】６４ｔｒｐ１と呼ばれるフラグメントは、約３０ｋＤａの分子量を有するグル
タチオン−ｓ−タランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク質
としてクローン化される２９アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質の小さなＣ末端
フラグメントである。

【００３３】６４ｔｒｐ２と呼ばれるフラグメントとは、約３３ｋＤａの分子量を有するグ
ルタチオン−ｓ−タランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク
質としてクローン化される５１アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質の小さなＮ末
端フラグメントをいう。

【００３４】６４ｔｒｐ３と呼ばれるフラグメントとは、約３６ｋＤａの分子量を有するグ
ルタチオン−ｓ−タランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク
質としてクローン化される７０アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質のより大きな
Ｎ末端フラグメントをいう。

【００３５】６４ｔｒｐ６と呼ばれるフラグメントとは、グルタチオン−ｓ−タランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク質としてクローン化される１３
３アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質の全長クローンをいう。このフラグメント
は、約４２ｋＤａの分子量を有する。

【００３６】６４ｔｒｐ４と呼ばれるフラグメントとは、約３５ｋＤａの分子量を有するグ
ルタチオン−ｓ−タランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ヒスチジンタグ融合タンパク
質としてクローン化される６３アミノ酸からなる６４Ｐタンパク質のＣ末端フラ
グメントをいう。

【００３７】６４ｔｒｐ５と呼ばれるフラグメントとは、ＧＳＴ融合タンパク質（すなわち
、ヒスチジンタグを欠く）としてクローン化される１３３アミノ酸からなる６４
Ｐタンパク質の全長クローンをいう。このタンパク質は、４１ｋＤａの分子量を
有する。

【００３８】これらのタンパク質フラグメント、およその機能的等価物は、本発明のワクチ
ンに組み込むために特に好ましい成分である。これらのフラグメントは、可溶性
タンパク質として発現され得るか、あるいは、封入体において発現され得、そし
て変性条件下で精製され得る。例えば、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓから
単離されるような構築物６４ｔｒｐ６は、封入体において発現される変性タンパ
ク質として調製されており、この形態で免疫原性であることが実証されている。

【００３９】これらのタンパク質フラグメントを用いる免疫化、続く外寄生生物の付着は、
付着部位での炎症を生じ、続いて、外寄生生物の死を生じる。当業者は、異種Ｇ
ＳＴおよびＨＩＳｔａｇ配列の存在が、純粋にタンパク質産生の便宜のためで
あることを理解する。これらの配列のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）は、本発明
のこの局面に対して必須であるとは考えられない。

【００４０】便利には、本発明に従うワクチンは、組換え形態で発現される、マダニセメン
トタンパク質、そのフラグメントまたはその機能的等価体を含む。組換え的に発
現されるタンパク質は、産生が安価であり、遺伝子工学の現在の標準技術を使用
して、遺伝子配列の単純な操作により所望のタンパク質産物を与えることを可能
にする。

【００４１】本発明のワクチンが、外寄生生物の成体形態および未熟形態の両方に対して効
果的であることが好ましい。用語「未熟」とは、外寄生生物の若虫形態および幼
虫形態の両方を含むことを意味する。これは、外寄生生物集団全体がワクチンを
使用して標的化され得、外寄生生物根絶の効率を増加することを意味する。

【００４２】ワクチンは、外寄生生物の成体形態または未熟形態を特異的に標的化し得るが
、好ましくは、ライフサイクルの全ての寄生的段階を標的化する。従って、本明
細書中に具体的に例示されるフラグメントのうち、マダニの種類およびこれらの
フラグメントに依存して、マダニ若虫または成体マダニあるいは若虫および成体
の両方において有意な死亡率をもたらす、６４ｔｒｐ２−、６４ｔｒｐ３−、６
４ｔｒｐ５−、および６４ｔｒｐ６−免疫動物は、特に好ましい。６４ｔｒｐ２
＋６４ｔｒｐ６のカクテルは、マダニ外寄生生物の成体形態および未熟形態の両
方に対して効果的であった；従って、組み合わせて使用される特定のフラグメン
トは、本発明に従ってワクチンに封入するために特に好ましい。

【００４３】本発明のさらなる実施形態に従って、２つ以上のマダニセメントタンパク質、
フラグメント、または機能的等価体、を必要に応じてアジュバントと組み合わせ
て含む、カクテルワクチンが提供される。任意の２つの免疫原性マダニセメント
タンパク質、タンパク質フラグメントまたは機能的等価体は、カクテルワクチン
のような成分として使用され得、そして異なるかマダニ種由来かまたは同じマダ
ニ種由来であり得る。例えば、１つより多くの外寄生生物を特異的に標的化する
か、または同じ外寄生生物由来の異なるタンパク質を標的化するワクチンを作製
することが望ましくあり得る。この様式において、より広い種の範囲を有するよ
り効率的なワクチンを作製することが可能であり得る。成分の特に好ましい組み
合わせとしては、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３、６４ｔｒｐ５、および６４ｔｒ
ｐ６の組み合わせ、６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ６の組み合わせ、ならびに６
４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ６の組み合わせが挙げられる。これらの組み合わせ
は、成体マダニおよび未熟マダニの両方を標的化する際、および交差種耐性を与
える際に特定の効力を有することが本明細書中において実証される。

【００４４】本発明に従うワクチン組成物はまた、さらなる因子（例えば、外寄生生物が、
病原体伝達を促進するために使用する分子（例えば、インターフェロン調節因子
、補体インヒビター、ケモカイン調節因子および免疫グロブリン結合タンパク質
））を含み得る。このように、外寄生生物の唾液腺から放出される他の生物活性
な分子は、宿主免疫系によって外来として認識され得、免疫応答が生じ得る。

【００４５】本発明のさらなる局面は、別の分子（例えば、標識、毒素または他の生物活性
分子または免疫原性分子）に融合されたマダニセメントタンパク質を含むワクチ
ンを含む。融合のための特に適切な候補は、グルタチオン−ｓ−トランスフェラ
ーゼまたはヒスチジンタグのような分子であり得るが、ルシフェラーゼ、緑色蛍
光タンパク質または西洋ワサビペルオキシダーゼがまた適切であり得る。ストレ
プトアビジンまたはビオチンのようなリンカー分子もまた、例えば、セメントタ
ンパク質の精製を促進するために使用され得る。

【００４６】融合タンパク質は、化学的架橋のような方法を使用して化学的に作製され得る
。このような方法は、当業者に周知であり、例えば、システイン残基のチオール
基の架橋を含み得る。化学的架橋は、ほとんどの場合、組織セメントタンパク質
を非タンパク質分子（例えば、標識）に融合するために使用される。

【００４７】組織セメントタンパク質を別のタンパク質分子に融合することが望ましい場合
、選択方法は、一般的に、分子を遺伝的に融合することである。組換え融合タン
パク質を産生するために、目的のタンパク質またはタンパク質フラグメントをコ
ードする遺伝子または遺伝子部分は、２つの遺伝子配列がインフレームで転写さ
れるように配置された１つの連続した遺伝子を形成するように、操作される。

【００４８】特定の抗原をコードする裸のプラスミドＤＮＡを用いる免疫化は、最近、哺乳
動物の免疫系に抗原を提示し、強力な体液性免疫応答および細胞免疫応答を生じ
る有効な方法として認識されている（Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３
、２５９、１７４５〜１７４９）。この技術（ＤＮＡワクチン化（ｖａｃｃｉｎ
ａｔｉｏｎ）とも呼ばれる）は、以下のウイルス、寄生虫、および細菌由来の数
種のタンパク質に対して指向される抗体を産生するために首尾良く適用されてい
る：ウイルス（Ｕｌｍｅｒら、ｌｏｃｃｉｔ．；Ｃｏｘら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
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ａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３、２、１８４７−１８５１
；Ｘｉａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９９４、１９９、１３２−１４０；Ｘｉ
ａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９９５、２０９、５６９−５７９；およびＪｕ
ｓｔｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５、６９、７７１２−７７１７）；
寄生虫（Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
１９９４、９１、９８６６−９８７０；Ｍｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９
５、１５５、２０３９−２０４６；およびＹａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９５、２１２、１０２９−１０３９）、ならびに
細菌（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９６、６４、３１
６８−３１７３）。いくつかの場合において、有意な保護応答は、宿主によって
惹起される。これらのＤＮＡワクチンは、連続的に、免疫応答を刺激し、免疫を
増幅し、これにより、追加免疫注入を必要としないので、産生および送達の費用
が抑えられる。

【００４９】利用可能な証拠に基づいて、ウイルスマダニセメントタンパク質をコードする
プラスミドＤＮＡを用いる刺激は、それらの抗マダニワクチン効果をさらに改善
するための有用な技術であるようである。この方法は、真核生物発現ベクターを
含む宿主の直接的な注入を包含し、１種以上のセメントタンパク質は、ワクチン
化した宿主（ヒト、家畜、または他の動物）内の対応する配列のインビボ転写、
続く翻訳により発現される。

【００５０】本発明の上記の局面のいずれか一つのワクチンは、さらにアジュバンドを含み
得る。本発明に従う免疫原性タンパク質の効果を増強するための適切なアジュバ
ンドとしては、例えば、（ａ）ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７に記載され
る処方物のような、水中油エマルジョン処方物（必要に応じて、ムラミルペプチ
ドまたは細菌の細胞壁の成分のような他の特定の免疫刺激因子を含む）が挙げら
れるが、これらに限定されない。他の適切なアジュバンドは、当該分野で公知で
あり、Ｓａｐｏｎｉｎアジュバンド（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ））、ＩＳＡ
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ５０、サイトカイン（例えば、インターロイキン、インタ
ーフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）または腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ））を含む。

【００５１】本発明にさらなる実施形態に従って、マダニセメントタンパク質と反応性であ
るモノクローナル抗体を提供する。「反応性（の）」とは、少なくとも１０^−８Ｍ、好ましくは、少なくとも１０^−９Ｍ、より好ましくは、少なくとも１０^−１ ^０Ｍの親和性で、抗体が１以上のマダニエピトープと結合することを意味する。
本発明のこの局面の好ましい実施形態に従って、抗体または抗血清は、具体的に
上に記載されている、セメントタンパク質、フラグメント、または機能的等価物
の任意の１以上に対して反応性である。本発明のこの局面は、抗体または抗血清
を産生する方法を含み、この方法は、本発明の上記の局面のいずれか１つに列挙
されるような、マダニセメントタンパク質、そのフラグメント、またはその機能
的等価物を用いて動物を刺激する工程を包含する。

【００５２】本発明のなおさらなる局面に従って、ワクチン組成物の処方のためのプロセス
を提供し、このプロセスは、マダニタンパク質、そのフラグメント、またはその
機能的等価物を、必要に応じてアジュバンドと共に薬学的キャリアと会合させる
工程を包含する。

【００５３】本発明のなおさらなる局面に従って、外寄生生物伝達疾患、または血液供給外
寄生生物に対して哺乳動物を免疫化する方法を提供し、この方法は、本発明の上
記の局面のいずれか１つに従うワクチンを動物に投与する工程を包含する。

【００５４】本発明はまた、マダニセメントタンパク質、そのフラグメント、またはその機
能的等価物を、ワクチンの使用のために提供する。本発明は、ワクチンの成分と
して、マダニセメントタンパク質の使用をさらに提供する。

【００５５】ここで、本発明の種々の局面および実施形態を、特に、マダニから単離された
マダニセメントタンパク質、そして特に、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐ
ｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓから単離されたマダニセメントタンパク質に関して、例
示によってより詳細に記載している。細部の改変は、本発明の範囲から逸脱する
ことなく達成され得ることが、理解される。

【００５６】（実施例）（実施例１：細菌中での短縮セメントタンパク質（６４ＴＲＰ）の発現）バキュロウイルス系での６４Ｐの全長クローンを発現するための試みが失敗し
たので、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細菌細胞中での６４Ｐの短縮バージ
ョンの発現のために、いくつかの戦略を研究した。

【００５７】Ｅ．ｃｏｌｉＡＤ４９４細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でのこのタンパク質の発
現のために、ｐＥＴ２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐ
ｈａｍａｒｃｉａ）原核生物発現ベクター中にセメントタンパク質（シグナル配
列を含まない、すなわち１４４アミノ酸長）（６４Ｐと名付ける）の全コード領
域を挿入するための、いくつかの失敗した試みがなされた。この構築物の構造が
、細菌細胞に対して毒性であり得ると結論付けられた。

【００５８】従って、Ｎ末端領域で開始する、６４Ｐクローンの短縮領域の連続的クローニ
ングを含むクローニング戦略を採用した（図２）。オリゴヌクレオチドを、この
ｃＤＮＡ由来の６４Ｐの異なるフラグメントのＰＣＲクローニングを可能にする
ように、適切な制限酵素部位と共に設計した。これらの構築物は、以下の通りで
ある：６４ｔｒｐ１＝２９アミノ酸Ｃ末端フラグメント６４ｔｒｐ２＝５１アミノ酸Ｎ末端フラグメント６４ｔｒｐ３＝７０アミノ酸Ｎ末端フラグメント６４ｔｒｐ４＝６３アミノ酸Ｃ末端フラグメント６４ｔｒｐ５＝９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを有さない１３３アミノ酸フラグメントこの配列の末端の３アミノ酸を含まない全長６４Ｐクローン６４ｔｒｐ６＝９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを有する１３３アミノ酸。

【００５９】製造者の指示に従って、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）にこのプラスミドを形質転換した。ＧＳＴ−融合／ヒスチジン−タグ
化された発現された６４ＴＲＰタンパク質を、製造者の指示に従って、ＧＳＴ精
製方法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって精製した。封入体として発現され得る６
４ＴＲＰタンパク質の精製の容易さのために、この９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを含めた
（なぜなら、このＧＳＴ精製方法は、溶解性タンパク質のみに適用可能であるた
めである）。

【００６０】他のＧＳＴ／９ＸＨＩＳ．ＴＡＧ化された短縮６４Ｐタンパク質（すなわち、
６４ｔｒｐ１、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ４）とは異なり、
６４ｔｒｐ６タンパク質（９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを有する１３３アミノ酸）は、溶
解性タンパク質の代わりに封入体の形成を生じた。従って、６４ｔｒｐ６タンパ
ク質を、製造者の推奨に従って、ＴＡＬＯＮ金属親和性ビーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）を使用して、変性条件下で精製した。

【００６１】６４ＴＲＰタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥＴｒｉｓ．Ｂｉｓ４〜１２％勾配の
クマシーブルー染色ゲル（Ｎｏｖｅｘ）によって、製造者の推奨に従って分析し
た（図３Ａ）。図３Ｂおよび３Ｃは、製造者の指示に従って、１：５００希釈の
ＧＳＴモノクローナル抗体（ＧＳＴｍＡｂ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および１：
２，０００希釈の６ＸＨＩＳ．ＴＡＧモノクローナル抗体（６ＸＨＩＳ．ＴＡＧｍＡｂ／ＡＰＣ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する、図３Ａからの同様のゲルの
ウエスタンブロットである。

【００６２】推定６４ＴＲＰタンパク質バンドを、以下の分子量で、クマシーブルー染色ゲ
ル（図３Ａ）において観察した：６４ｔｒｐ１＝３０ｋＤａ；６４ｔｒｐ２＝３
３ｋＤａ；６４ｔｒｐ３＝３６ｋＤａ；６４ｔｒｐ４＝３５ｋＤａ；６４ｔｒｐ
５＝４１ｋＤａ；６４ｔｒｐ６＝４２ｋＤａ。

【００６３】発現を、ウエスタンブロットで確認した（図３Ｂおよび３Ｃ）。２６ｋＤａの
ＧＳＴタンパク質バンドを、コントロールマーカーとして使用した。

【００６４】予期されるように、各々が９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを欠いた６４ｔｒｐ５およびＧ
ＳＴタンパク質のバンドは、６ＸＨＩＳ．ＴＡＧｍＡｂとの反応物を与えなか
った（図３Ｃ、それぞれレーン７および２）。

【００６５】６４Ｐクローンのフラグメントまたは完全Ｎ末端配列のいずれかを含む６４Ｔ
ＲＰ構築物（すなわち、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ５）は、
Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞中で発現される場合、分解産物を生じる（
図３Ａ、レーン４、５および７）。これを、分解したタンパク質バンドのアミノ
末端配列分析（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，（１９８７）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２６２：１００３５−１００３８）
によって確認した。産物の分解の問題を試みそして解決するために、この構築物
を、プロテアーゼをコードするｏｍｐＴ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉＢＬ２
１菌株に形質転換した。

【００６６】予想したように、６４ｔｒｐ６タンパク質の分解は、６４ｔｒｐ５タンパク質
と比較して、より少なかった。なぜなら、６４ｔｒｐ６タンパク質は、封入体と
して発現され、それによって、細胞性プロテアーゼによる分解から保護されたか
らである。

【００６７】（実施例２：６４ＴＲＰに対する抗血清を用いた免疫組織化学的研究）個々の精製組換え６４ｔｒｐタンパク質を用いて、ＤｕｎｋｉｎＨａｒｔｌ
ｅｙモルモットへの等容量の各タンパク質およびＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ
５０の皮下注射によってポリクローナル抗血清を惹起させた。

【００６８】６つの異なる抗６４ｔｒｐ抗血清を用いて免疫組織化学的研究を行った。この
抗血清を、正常なハムスターの皮膚の切片（マダニに暴露されていない動物由来
）およびＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニに感染させたハムスターのセ
メントコーン（ｃｅｍｅｎｔｃｏｎｅ）および周囲の皮膚を通った切片の両方
と反応させた。免疫組織化学的方法は、以前（Ｃｏｌｉｇａｎら，１９９１）に
記載された通りであった。

【００６９】これらの研究のうちの２つ（抗６４ｔｒｐ２血清および抗６４ｔｒｐ３血清を
用いた場合）の結果は、以下を示す。

【００７０】（２．１正常な皮膚）抗６４ｔｒｐ２血清または抗６４ｔｒｐ３血清のいずれかで処理した正常な皮
膚切片の比較は、抗６４ｔｒｐ３血清が、表皮組織および真皮組織（特に、表皮
のケラチノサイトおよび角質層ならびに真皮の膠原線維）と強く反応することを
明らかにした（図４Ａ）。比較によって、抗６４ｔｒｐ２血清で処理した切片は
、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で処理したコントロール切片と区別できな
かった（それぞれ、図４Ｂおよび図４Ｃ）。

【００７１】６４ｔｒｐ２タンパク質配列および６４ｔｒｐ３タンパク質配列は両方とも、
６４Ｐタンパク質のコラーゲン様領域を含む。しかし、６４ｔｒｐ３タンパク質
はまた、６４Ｐタンパク質のケラチン様配列のうちのいくつかを含む。従って、
抗６４ｔｒｐ３抗血清と抗６４ｔｒｐ２抗血清との間での、ハムスター皮膚切片
との免疫反応性の差は、それぞれのタンパク質配列フラグメント内の反応性エピ
トープの利用可能性におそらく関連する。このことはさらに、６４Ｐセメントタ
ンパク質が、特定のその宿主組織（例えば、表皮および真皮のコラーゲン、特に
ケラチン様タンパク質）の構造を模倣するという仮説を確認する。

【００７２】（２．２マダニ感染皮膚）Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニを飼育したハムスターの皮膚におい
て、個々のセメントコーンの切片は、抗６４ｔｒｐ３血清と反応した。この反応
は主に、表皮に付着したセメントコーンの最も外側の層および内層との反応であ
った（図５Ａ）。反応は、抗６４ｔｒｐ２血清で処理した切片（図５Ｃ）におい
ても、一次抗体の代わりにコントロールとしてＰＢＳを用いた切片（図５Ｂ）に
おいても、観察されなかった。

【００７３】セメントコーンとの抗６４ｔｒｐ３血清の反応パターンは、６４Ｐが、おそら
く、セメントコーンを周囲の表皮組織および真皮組織へと付着させる接着剤とし
て作用する、セメントコーンを並べるセメントタンパク質であることを示し得る
。セメントコーン内に染色が存在しないことは、抗６４ｔｒｐ３血清（およびお
そらく抗６４ｔｒｐ２抗血清）によって認識されるエピトープが、セメントコー
ン内に露出していないことを示し得る。このことは、６４Ｐタンパク質が重合し
てセメントコーンを形成する場合に生じ得る。

【００７４】宿主の皮膚に埋め込まれるのと同様に、セメントコーンの最も外側の層もまた
、先細りになり、そして宿主皮膚の表皮に融合し（データは示さず）、その結果
、マダニセメントコーンがどこで終わるかおよび宿主組織がどこで始まるかを識
別することは困難である。この観察はさらに、セメントタンパク質が、宿主の皮
膚上の付着セメントコーンを介したマダニの拒絶を回避するために、宿主の真皮
および表皮の皮膚タンパク質（すなわち、コラーゲンおよびケラチン）に似るよ
うに設計されているという仮説を支持する。

【００７５】（実施例３：ワクチン接種試行）Ｄｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモットを、免疫および抗原投与（ｃｈａｌ
ｌｅｎｇｅ）試行のために用いた。使用した１０匹のモルモットのうち、各々２
匹を、６４ｔｒｐ１、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ６で免疫し
、そして２匹をコントロールタンパク質ＧＳＴで免疫した。各群の免疫モルモッ
トをさらに、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニの成虫飼育段階および若
虫飼育段階当り、各々１匹のモルモットに分けた。約５０ミリグラムの各６４Ｔ
ＲＰタンパク質（依然としてＧＳＴビーズに付着している、すなわち、溶出して
いない）またはコントロールのＧＳＴタンパク質を、ＩＳＡＭｏｎｔａｎｉｄ
ｅアジュバントと混合し、そして皮下注射した；第一および第二の追加免疫注射
をそれぞれ、２週間の間隔で与えた。

【００７６】免疫に対する宿主の免疫応答を、ＧＳＴタンパク質および個々の６４ＴＲＰタ
ンパク質の免疫ブロットに対する、６４ＴＲＰおよびＧＳＴ免疫モルモット抗血
清の反応性によって決定した。

【００７７】抗血清力価が１：５，０００に到達した場合、モルモットに成虫段階または若
虫段階のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニで抗原投与した。抗原投与感
染のために、所定数のマダニ（１匹のモルモットあたり、５０〜２００匹の若虫
マダニまたは２０匹の成虫マダニ）を、各モルモットの背中上の保持チャンバ内
に入れ（図７）、１週間後、二回目の追加免疫注射を行った。

【００７８】６４ＴＲＰ誘導免疫の効果を分析するために、毎日の目視試験を、モルモット
のマダニ感染の２４時間後に開始して行った。付着率、飼育持続期間、付着部位
での炎症反応、および取り外した満腹雌性マダニの卵の孵化能力（ｈａｔｃｈａ
ｂｉｌｉｔｙ）を記録した。成虫雌性マダニの満腹重量（ｅｎｇｏｒｇｅｍｅｎ
ｔｗｅｉｇｈｔ）、ならびに成虫段階および若虫段階の両方のマダニの死亡率
を、実験の終了後に決定した。

【００７９】表１は、モルモットにおけるマダニ飼育に対する６４ＴＲＰタンパク質のワク
チン効果の結果をまとめる。コントロールのＧＳＴ免疫群および６４ＴＲＰ免疫
群の付着率に差は存在しなかった；同様に、飼育持続期間は、成虫段階および若
虫段階の両方のマダニについて同様であった。

【００８０】沈静化前に２４時間〜４８時間持続した炎症反応が、飼育の後期段階（６日目
〜７日目）の間に、６４ＴＲＰ免疫モルモットの皮膚上の、若虫が付着した部位
で観察された。この反応は、紅斑、浮腫、リンパ節腫脹および嗜眠を含んでいた
（図６）。

【００８１】

【表１】（表１の注）ｉ＝炎症−および＋は、それぞれ、炎症がマダニの付着部位に存在しないこと
または存在することを示す；炎症の程度は、以下によって示される：＋＝軽度、
＋＋＝中程度および＋＋＋＝重度；^１および^２＝外寄生前および外寄生後の抗体
力価；ｎｄ＝行わず；ｎ／ａ＝該当なし；ｈ＝孵化した；^＊は、６４ｔｒｐ２タ
ンパク質で免疫したモルモットで飼育したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマ
ダニ群由来の２匹の成虫雌性マダニによって産卵された、孵化しなかった２／９
バッチの卵をいう；^δは、一元分割表を用いるχ二乗検定によって決定され、６
４ｔｒｐ６免疫モルモットで飼育したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫マ
ダニの群からの、より高い死亡率を示す（χ^２，_６＝９６．５、ｐ＜０．００１
）；^§は、Ｇ検定によって決定され、６４ｔｒｐ２タンパク質、６４ｔｒｐ３タ
ンパク質および６４ｔｒｐ５タンパク質で免疫されたモルモットで飼育したＲ．
ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニの群からの成虫雌性マダニにおいて観察さ
れた死亡率は、他の群由来のマダニについてよりも有意に高かった（Ｇ，_６，＝
３３、ｐ＜０．００１）；^εは、Ｆ比によって決定され、６４ｔｒｐ２、６４ｔ
ｒｐ４および６４ｔｒｐ５で免疫されたモルモットで飼育したＲ．ａｐｐｅｎｄ
ｉｃｕｌａｔｕｓマダニ群由来の成虫雌性マダニについての平均満腹重量は、他
の群由来のマダニについての満腹重量によりも有意に少なかった（Ｆ，_ｌ，６２＝１５．８８、ｐ＜０．００１）；^‡は、Ｆ比によって決定され、他の群由来の
雌性マダニと比較して、６４ｔｒｐ５免疫モルモットで飼育した雌性Ｒ．ａｐｐ
ｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニについての有意に低い平均卵塊重量を示す（Ｆ，_ｌ，４４＝５．６４６、ｐ＜０．０２２）。

【００８２】（３．１若虫マダニ）分離された若虫は、みかけは正常であった。炎症は、ＧＳＴ免疫モルモットの
皮膚の若虫接着部位において明らかではなかった。

【００８３】分離された若虫を、Ｊｏｎｅｓら（１９８８）ＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ３９，９９−１０６に従って、培養した。コントロールタンパク質免疫
モルモット（６．７％）と比較した場合、１８％および４８％の比較的高い死亡
率が、６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ６で免疫したモルモットを摂食した分離さ
れた若虫について観察された。これらの結果は、２×２分割表を使用するカイ２
乗試験によって決定されるように、それぞれ統計学的に有意なｐ＜０．０１およ
びｐ＜０．００１であった。

【００８４】６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ６免疫モルモットを摂食した若虫の死は、若虫
段階のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓダニが６４ＴＲＰ免疫モルモットを摂
食した場合に、免疫応答が刺激されたことを示唆する。この応答は、摂食には直
接影響しないが、若虫の生存に影響する。免疫保護エピトープが、６４ｔｒｐ２
タンパク質（６４Ｐタンパク質の小さいＮ末端フラグメント）ならびに６４ｔｒ
ｐ６タンパク質（６４Ｐタンパク質の１３３アミノ酸フラグメント、変性された
抗原のような）（これらは、若虫の関連したセメントタンパク質において保存さ
れ得る）中に存在することは可能である。このことは、若虫組織抽出物に対する
抗６４ｔｒｐ抗血清を使用する免疫ブロッティングによってさらに調査される。

【００８５】（３．２成虫ダニ）死亡率はまた、６４ｔｒｐ２（死亡率５５．５％）タンパク質および６４ｔｒ
ｐ３（死亡率７０％）タンパク質で免疫したモルモットを摂食した成虫雌性ダニ
の間で、有意であった。図７Ａ（１）は、６４ｔｒｐ２免疫モルモットを摂食し
た成虫ダニのいくつかを示す。これらは、他の６４ｔｒｐおよびＧＳＴ免疫モル
モットと比較してより低いうっ積重量を有した（表２；平均重量＝３３６ｍｇ）
。さらに、この群由来の二匹のダニは、孵化しない少量の卵を産み；そして摂食
の後期の間に、充分摂食した分離された成虫ダニのいくつかは、分離の２日後に
死亡した。

【００８６】同様に、６４ｔｒｐ３免疫モルモット由来の十分にうっ積した摂食後の成体ダ
ニは、分離後最初の週内に死亡した（図７Ｂ）。これらのダニは、コントロール
のダニと比較して、血粉で膨張し、色が暗く、そして死亡において強い一貫性を
発生する。ダニに対するこのワクチン効果は、ダニの腸に対する損傷ならびにダ
ニ唾液腺の機能である浸透圧調整の妨害を示す。

【００８７】コントロールタンパク質免疫モルモット由来の全ての正常な成虫ダニは、正常
のようであり、そして生存して卵を産んだ（図７Ｃ）。

【００８８】剖検研究を、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ成体ダニでの摂食後に、６４
ＴＲＰタンパク質で免疫したモルモット由来の皮膚生検から行なった。コントロ
ールタンパク質免疫モルモット由来の皮膚生検（図８ＤおよびＥ）と比較して、
紅斑性丘疹状外傷を、ダニ接着部位において観察した（図８Ａ、ＢおよびＣ、番
号３）。

【００８９】皮膚および壊死外傷の肥厚によって示されるように、６４ｔｒｐ２免疫モルモ
ット由来の生検中に、外傷を標識した（図８Ｃ）。

【００９０】これらの結果は、６４ＴＲＰ免疫モルモットに対する摂食後の成虫ダニにおい
て観察される高い死亡率と相関する。従って、ダニ摂食は、成虫ダニの摂食の後
期段階に対する６４ＴＲＰワクチン接種モルモットによる免疫応答を刺激したよ
うである。

【００９１】これらの知見を確かめるために、組織学的研究を、ヘマトキシリンおよびエオ
シン染色を使用する皮膚生検由来の切片に関して行なった（Ｂａｎｃｒｏｆｔ
Ｊ．Ｄ．およびＳｔｅｖｅｎｓ，Ａ．編（１９９０）．Ｔｈｅｏｒｙａｎｄ
ＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＨｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．
第３版）。結果は、コントロールタンパク質免疫モルモットの成虫ダニの摂食後
由来の皮膚生検切片で予期された正常な組織学的プロフィールを示す（図９．１
）。

【００９２】対照的に、６４ＴＲＰ免疫モルモット由来の皮膚生検切片の組織学的研究は、
特に、表皮の以前のダニ接着部位に近い真皮における白血球浸潤の存在（これは
、低い拡大率（図９．２および９．３）ならびに高い拡大率（図９．７および９
．８）の両方において観察された）によって見られるように、成虫ダニの摂食に
対する免疫学的応答を確かめる。慢性炎症反応の証拠である表皮の肥厚もまた、
存在する。

【００９３】さらなる組織学的研究を、製造業者の指示に従って、Ｈｅｍａ「Ｇｕｒｒ」Ｒ
ａｐｉｄＢｌｏｏｄＳｍｅａｒ染料（ＢＤＨ）（すなわち、ライト染料）を
使用して、これらの同一の切片ならびにコントロールサンプルに対して行なった
。結果は、６４ｔｒｐ免疫モルモット由来の皮膚生検切片における好酸球および
好塩基球多型である白血球浸潤（図９．５および９．６）（これは、コントロー
ルサンプルにおいて存在しない（図９．４））を確認した。

【００９４】（３．３卵生産および生存度）Ｆ比によって決定される卵生産の統計学的分析は、他の群の雌性ダニと比較し
て、６４ｔｒｐ５免疫モルモットを節食した雌性Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔ
ｕｓダニについて有意に低い平均卵重量（Ｆ，_１，４４＝５．６４６，ｐ＜０．
０２２）を示した。さらに、９分の２の卵が孵化しなかった。これらは、６４ｔ
ｒｐ２タンパク質で免疫したモルモットを節食したＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａ
ｔｕｓダニの群由来の二匹の雌性成虫ダニによって産まれた。この結果により、
特定の構築物が、免疫動物を節食する雌性成虫ダニの生殖生産量に有意な影響を
与えたことが示される。これは、所望されるワクチン効果である。

【００９５】ワクチン試験の結果により、成虫および若虫のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔ
ｕｓダニに対するワクチンとしての６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３、６４ｔｒｐ５
および６４ｔｒｐ６タンパク質の使用が支持される。

【００９６】観察された免疫炎症性応答は、放棄されたダニ摂食部位において激しい紅斑、
浮腫（ｅｏｄｅｍａ）、壊死、肥厚および紅斑性丘疹を含む二次ダニ侵襲（Ｂｒ
ｏｗｎおよびＡｓｋｅｎａｓｅ，１９８１Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：２１
６３−２１６７；ＢｒｏｗｎおよびＡｓｋｅｎａｓｅ，１９８３Ｆｅｄｅｒａ
ｌＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ４２，１７４４−１７４９）と共に検出される免
疫応答を思い起こさせる。二次侵襲における局在化した細胞応答（好塩基球およ
び好酸球多型）および組織応答は、細胞媒介性免疫として公知であり、そしてダ
ニ免疫動物における拒絶の主要な機構であると広範に見なされている。従って、
接着部位における局在化した細胞媒介性応答ならびに体液性エフェクター機構お
よび補体依存エフェクター機構を含む、複雑な免疫機構が存在する。

【００９７】抗体の力価を、それぞれ６４ｔｒｐまたはＧＳＴ抗原で免疫したモルモット由
来の抗６４ｔｒｐ血清または抗ＧＳＴ血清を用いて、ＥＬＩＳＡにより決定した
（Ｄｅｓａｉｅｔａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２２
，１０９−１１６）。マダニ外寄生の前後の力価の比較は、６４ｔｒｐ１、６４
ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３、６４ｔｒｐ５、または６４ｔｒｐ６で免疫したモルモ
ットの抗体力価において一貫した増加を示した。観察された増加は、免疫された
動物のマダニ侵入がブースター効果を有しており、既往性応答を誘導することを
示す。この応答は、天然のマダニ侵入がさらなる免疫に対する必要性を取り除く
ことを示す。なぜならば、マダニの摂食は、ワクチン防御を維持するために必要
な免疫刺激を提供するからである。従って、１度の免疫のみを必要とする単発ワ
クチン（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｈｏｔｖａｃｃｉｎｅ）が、適切なアジュバントお
よび単一６４ｔｒｐ構築物またはそれらのカクテルを用いて調製され得る。

【００９８】（６４Ｐセメントタンパク質についての研究の要旨）Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓにより産生され
るセメントコーンは、アンカーとして作用し、その宿主の皮膚の表皮および真皮
にマダニの口部（ｍｏｕｔｈｐａｒｔ）を固定する。セメントコーンと周囲の宿
主組織との間の連結は、漏出耐性シール（ｌｅａｋ−ｐｒｏｏｆｓｅａｌ）を
形成する。マダニに対する宿主の拒絶応答を引き起こすことを回避するために、
セメントタンパク質は、コラーゲンおよびケラチンの構造に類似する構造を取り
入れている。セメントタンパク質（６４Ｐ）の短縮形態は、Ｅ．ｃｏｌｉにおい
て発現され、そして抗血清がこのタンパク質に対して惹起された。この結果の要
約を、以下の表２に示す。

【００９９】（表２：６４ＴＲＰタンパク質の性質の要約）

【０１００】

【表２】ワクチン効果：＋＝６４ｔｒｐ１免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐ
ｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫マダニに対する穏やかな強度の
効果；＋＋＋＝６４ｔｒｐ２免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐｈａ
ｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫マダニおよび成虫マダニに対する非
常に強力な効果；＋＋^ａ＝６４ｔｒｐ３免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉ
ｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ成虫マダニに対する非常に強
力な効果；＋＋^ｎ＝６４ｔｒｐ６免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐ
ｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫マダニに対する非常に強力な効
果；６４ｔｒｐ４免疫モルモットでの摂食後のＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａ
ｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ成虫マダニおよび若虫マダニに対して効果なし^＊融合タンパク質の分子量（すなわち、２６ｋＤＧＳＴタンパク質＋１ｋＤ
９ＸＨＩＳ．ＴＡＧを含む） φ融合タンパク質の分子量（すなわち、２６ｋＤＧＳＴタンパク質を含む）（実施例４：Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセ
メントタンパク質６４ｔｒｐに対して惹起された抗血清の交差反応性）（４．１マダニセメントワクチンの作用機構）実施例３で試みられたように、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ６４ｔｒ
ｐの特定のフラグメントを用いたモルモットの免疫は、マダニが摂食を完了した
後に成虫雌マダニおよび若年マダニにおいて高い死亡率を生じた。マダニは黒変
し、硬直したが、これはマダニの内臓に対する損傷および内臓から体腔への乾燥
血液（ｂｌｏｏｄｍｅａｌ）の漏出を示す。

【０１０１】この仮説を試験するために、免疫ブロットを実施して、マダニセメントフラグ
メントに対する抗体が内臓の中の抗原および成虫マダニの血リンパと交差反応す
るか否か、ならびに若虫および幼虫の全体抽出物中の抗原と交差反応するか否か
を決定した。

【０１０２】（４．２結果）抗６４ｔｒｐ２血清は、セメントコーン抽出物中の２２ｋＤおよび２５ｋＤの
タンパク質バンドと反応した（図１０Ａ）。この抗血清は、唾液腺（２２、２５
ｋＤ）、血リンパ（２２、５２ｋＤ）、若虫抽出物（５２、９８ｋＤ）および幼
虫抽出物（５２ｋＤ）（図１０Ａ）、ならびに中腸抽出物（５２ｋＤ）（図１１
Ｂ）におけるタンパク質バンドと交差反応性を示した。

【０１０３】抗６４ｔｒｐ５血清は、セメントコーン抽出物中の３１ｋＤおよび４８〜７０
ｋＤのタンパク質バンドと反応した（図１１Ｄ）。この抗血清は、食事を与えら
れていないマダニの唾液腺抽出物（１５、２２、および３１；図１１Ｃ）および
２日間食事を与えられたマダニの唾液腺抽出物（２５、３１ｋＤ；図１１Ｄ）中
のタンパク質バンドと交差反応した。交差反応性はまた、中腸（５２〜７０ｋＤ
；図１１Ｃ）および血リンパ（３１、４８ｋＤ；図１１Ｄ）のタンパク質バンド
を用いても検出されたが、若虫および幼虫抽出物を用いて検出されなかった（図
１１Ｄ）。同様の交差反応が、抗６４ｔｒｐ３血清を用いて観察された（示して
いない）。

【０１０４】抗６４ｔｒｐ６血清は、セメントコーン抽出物中の２２、２５ｋＤおよび４８
〜７０ｋＤのタンパク質バンドと反応した（図１０Ｂ）。この抗血清は、唾液腺
（２２、２５ｋＤ）、血リンパ（２２、４８ｋＤ）、および幼虫抽出物（１２０
ｋＤ）におけるタンパク質バンド（図１０Ｂ）と、および中腸抽出物（６５〜７
０ｋＤ；図１０Ａ）と交差反応したが、若虫抽出物との明らかな交差反応は示さ
なかった（図１０Ｂ）。

【０１０５】（４．３結論）ケラチン様タンパク質、６４ｔｒｐ、のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマ
ダニセメントフラグメントに対して惹起された抗体は、成虫雌Ｒ．ａｐｐｅｎｄ
ｉｃｕｌａｔｕｓの唾液腺、中腸、および血リンパ中の抗原性エピトープと明ら
かな交差反応をする。免疫された動物に対して摂取されたマダニの乾燥血液中の
抗体によるこれらのエピトープとの反応は、おそらく、中腸に対する損傷を引き
起こし、マダニの死の原因となる。冒された雌マダニの中の１匹の解剖は、体腔
内に分散した凝血を明らかにした（これは中腸の破裂に一致する）。従って、こ
のワクチンは、マダニの分泌タンパク質（すなわち、「曝露された」抗原）を含
むが、中腸（ならびに血リンパおよび唾液腺も可能性がある）における「潜伏し
た」抗原を標的化する（すなわち、正常な生理学的機能に影響をおよぼす）こと
により、高い死亡率を引き起こす。従って、このセメントフラグメントは：（ｉ）ワクチン接種した動物の免疫状態をブーストする炎症応答を刺激し、そ
して（ｉｉ）潜伏性の抗原を標的化してマダニに対する損傷を引き起こす二重作用ワクチンを提供する。

【０１０６】（実施例５：免疫ブロットを用いた他のマダニ種との交差反応性）Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質に対して惹起された抗
体が、他のマダニ種の抗原性エピトープと反応するか否かを決定するために、Ｒ
ｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（イヌのマダニ）、Ａｍｂｌ
ｙｏｍｍａｖａｒｉｅｇａｔｕｍ（アフリカ、南アメリカ、およびカリブのウ
シの経済的に重要なペスト）およびＩｘｏｄｅｓｒｉｃｉｎｕｓ（欧州におい
てヒトにライム病およびダニ性脳炎を伝染するヒツジまたは木のマダニ）の組織
抽出物を用いて免疫ブロットを実施した。

【０１０７】（５．１結果）抗４ｔｒｐ５血清は、Ａ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ唾液腺（１８０ｋＤ）および
中腸（２５、５２ｋＤ）抽出物ならびに血リンパ（８５ｋＤ）のタンパク質バン
ドと交差反応した（図１２Ａ）。Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ唾液腺、血リンパま
たは中腸を用いて検出された交差反応はなかった（示されていない）。

【０１０８】抗６５ｔｒｐ６血清は、Ａ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ血リンパの５０ｋＤバンド
と交差反応したが、唾液腺および中腸調製物との活性は示さなかった（図１２Ｂ
）。Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓを用いると、数種の唾液腺タンパク質バンド（５
１、５３〜５５、６５、１２０ｋＤ）および中腸（２５、５２、および５５ｋＤ
）と交差反応が生じたが、血リンパとは交差反応を生じなかった（図１２Ｃ）。
不鮮明に現れた交差反応するバンドはおそらくグリコシル化タンパク質である。

【０１０９】６４ｔｒｐ３抗血清（図１３Ａ）を使用して、２つの明白なバンド（ａおよび
ｂ）および１つのかすかなバンド（ｃ）を、若虫（ｎｙｍｐｈａｌ）抽出物中で
検出し、そして成熟血リンパ、中腸および唾液腺との交差反応性もまた存在した
。

【０１１０】６４ｔｒｐ２に対する抗血清（図１３Ｂ）は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ抽出
物中でいくらかのバンド（全抽出物中に存在する１つの強力なバンド（ｊ）を含
む）を検出した。

【０１１１】ＧＳＴに対して惹起されるコントロール抗血清は、セメントコーンおよび唾液
腺において交差反応バンドを検出した（図１４）。唾液腺における交差反応は、
Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓについて報告されるように、Ｒ．ｓａ
ｎｇｕｉｎｅｕｓＧＳＴを示し得、そしてセメントコーンにおける交差反応は
、部分的に食物を与えられたマダニから得られた宿主タンパク質ヘモグロビン／
ＩｇＧ汚染セメントコーン抽出物との非特異的反応におそらく起因する。

【０１１２】６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ５の各々に対する抗血清は、セメントコーン、
腸およびＩ．ｒｉｃｉｎｕｓの全若虫抽出物と交差反応した。対照的に、非交差
反応は、抗６４ｔｒｐ３を用いて検出された。この観察は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎ
ｅｕｓおよびＡ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍの組織抽出物を用いて観察された交差反
応とは異なった。抗６４ｔｒｐ６血清のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓの腸および若虫との
交差反応もまた存在した。

【０１１３】これらの結果を、表３に要約する。

【０１１４】（５．２結論）Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質６４ｔｒｐ構築物に対
して惹起される抗体は、３つの他のマダニ種の唾液腺、中腸および血リンパ中で
抗原性エピトープと交差反応した。これらの結果は、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌ
ａｔｕｓセメント由来の候補ワクチンが、多数の異なるマダニ種に対して有効な
広範なスペクトルワクチンを提供することを示唆する。

【０１１５】観察された高さ反応に基づいて、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓの６４ｔ
ｒｐ６を、ワクチン試行のための免疫原として選択した。上記のように、Ｒ．ａ
ｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓを用いたワクチン試行において（表２を参照のこと
）、６４ｔｒｐ６は、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫に対して有効であ
ったが、成熟に対しては有効でなかった。従って、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓを
用いたワクチン試行において、成熟Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓに対して
有効な２つの構築物のうちの一方（６４ｔｒｐ３または６４ｔｒｐ２のいずれか
）は、以下の節に記載されるように、６４ｔｒｐ６と共に含まれた。表３：６４ｔｒｐ組換え抗原で免疫化されたモルモット由来の血清を用いた、Ｒ
．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓとＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓとＡｍｂｌｙｏｍ
ｍａｖａｒｉｅｇａｔｕｍとＩｘｏｄｅｓｒｉｃｉｎｕｓマダニ抗原との間
の交差反応についての結果の要約。

【０１１６】

【表３】（表３について使用されるコード）ＣＣ＝マダニセメントコーン抽出物、ＳＧ＝（食物を与えられていないマダニ
由来の）唾液腺抽出物、ｇｕｔ＝中腸抽出物、Ｈ＝血リンパ、Ｎ＝若虫マダニ抽
出物、Ｌ＝幼生マダニ抽出物。

【０１１７】免疫ブロットにおいて使用される抗血清に対して、それぞれ、＋＝陽性反応、
および−＝陰性反応、ａｂ’＝抗血清；ｎｄ＝なされない。

【０１１８】＋^＊および＋^δ＝１００℃でＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解したＣＣ抽出物お
よびＳＧ抽出物の不溶性画分由来の抗ＧＳＴ抗血清に対する陽性反応。

【０１１９】＋^＊（部分的に食物を与えられたマダニ由来のＣＣ）＝免疫陽性バンドは、抗
ＧＳＴａｂ’のセメントコーンに結合された宿主ＩｇＧ／ヘモグロビン（ｈａｅ
ｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）画分との非特異的結合におそらく起因する。＋^δ＝（食
物を与えられていないマダニ由来のＳＧ）＝免疫陽性バンドは、抗ＧＳＴａｂ’
の等価ＧＳＴタンパク質との特異的結合におそらく起因する（Ｒｅｆ．Ｂｏｏｐ
ｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓＧＳＴタンパク質）。

【０１２０】＋^∞ ＳＤＳ／２メルカプトエタノールサンプル緩衝液中に可溶化された、Ａ
．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ不溶性腸抽出物、−^＊若虫マダニ抽出物抗原のＧＳＴ
抗血清との非特異的結合に起因する非常にかすかな免疫陽性バンド。

【０１２１】（実施例６：交差保護性ワクチン試行：Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐ
ｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質６４ｔｒｐ構築物で免疫化され、か
つＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ成熟でチャレンジされたモルモット）（６．１ワクチン試行のための処置）１群：組換え６４ｔｒｐ６＋６４ｔｒｐ２＋ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ（４
匹のモルモット）２群：組換え６４ｔｒｐ６＋６４ｔｒｐ３＋ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ（４
匹のモルモット）３群：ＧＳＴ（コントロール）（２匹のモルモット）全動物数＝１０経路および用量：抗原を単一部位内へか、または各抗原を異なる部位内へかのいずれかに結合さ
せるような前肩甲骨領域における皮下接種。

【０１２２】用量：５０μｇ抗原／動物ワクチン接種スキーム：１．プライマー接種２．第一ブースト３．接種後１０〜１２日後に試験出血４．２回目のブースト（抗体力価が１／５０００未満の場合）５．接種後１０〜１２日後に試験出血６．抗体力価が１／５０００より大きい：１０対のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ
成体でチャレンジ７．マダニの摂食効率、生存、生殖結果を評価。

【０１２３】（６．２結果）この結果を表４にまとめる。全体的に、この結果は、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕ
ｌａｔｕｓのセメントタンパク質６４ｔｒｐに対して誘導された推定ワクチンは
、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの成体および若虫と交差保護性であったことを示す
。以前のＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓの観察とは著しい差異があった。

【０１２４】

【表４】表４注＊は、６４ｔｒｐタンパク質カクテル（すなわち、６４ｔｒｐ２／６または６
４ｔｒｐ３／６の組合わせ）のいずれかを組合わせた抗原として、単一の皮下部
位（Ｃ）か、または別々の皮下部位（Ｓ）へ、個々に免疫したモルモットを示す
。Ｉは、マダニ摂食部位での、紅斑、浮腫、引っかき、およびリンパ節腫脹とし
て観察された局所炎症皮膚反応（一過性、２〜３日）事象をいう。ｎｄは、行っ
ていないことをいう。ＭおよびＦは、それぞれオス成体マダニおよびメス成体マ
ダニをいう。Ｅは、孵化した卵を示す。†は、この群において生存していた、産
卵しなかった２匹のメスを示す。

【０１２５】（（ｉ）付着に対する効果）Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓとは違って、試験（しかし、コントロール
ではない）Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの成虫の付着速度は影響を受けた。外寄生
の２４時間後、４つの試験動物上のこのマダニの殆どが、付着しておらず、そし
て保持しているガーゼ上を宿主から離れるように這うところを観察した。続いて
、飼育の初期（第１日目〜第５日目）の間、８１のうちの１６体の死んだ成虫（
１２体のメスと４体のオス）の全体を、この試験動物から取り除いた；これらの
マダニのうち１体を除いた全ては、食物を与えられていないようであった（図１
５）。コントロール動物上にいる、１８のマダニの全ては、外寄生から２４時間
以内に付着した。

【０１２６】（（ｉｉ）オスに対する効果）再度、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓとは違って、オスの生存に関する効
果を観察した。上述のように、４体の死んだオスを飼育の初期で除去した。

【０１２７】（（ｉｉｉ）炎症応答）全ての８匹の試験モルモットが、抗原播種部位において炎症応答を示し、そし
てまたマダニの生息領域において炎症応答を示した。炎症を、外寄生後６〜７日
間で初めて観察し、そして飼育の第９〜１０日目までには小康状態となった。コ
ントロール動物において、炎症は、観察されなかった。

【０１２８】（（ｉｖ）飼育後の致死率）Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓで観察されるように、殆どのメス（２９／
４１）は充血を完遂した。しかし、これらのうちで、７体は離れてから２日以内
で死んだ。これらは、腸に対する損傷および破裂と相反しない、Ｒ．ａｐｐｅｎ
ｄｉｃｕｌａｔｕｓに対する類似の効果（過度の膨張および黒色化）を示した（
図１６）。試験動物からの若虫で観察される、中程度の致死率は、コントロール
の場合に匹敵した。

【０１２９】（（ｖ）再現的な出力）試験動物からの、２２体の生き残った充血したメスのうち、１９体は産卵した
。これらの統計的な解析が、目下決定される。

【０１３０】（６．３結論）１．６４ｔｒｐタンパク質に対して惹起された抗体は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅ
ｕｓマダニの唾液腺および中腸中の、免疫原性エピトープとイムノブロットに
おいて、交差反応する。

【０１３１】２．マダニＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ由来の分泌されたセメントタン
パク質（すなわち、「露出された」抗原）から構築された異なった６４ｔｒｐタ
ンパク質を含むワクチンのカクテルは、別のマダニの種Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅ
ｕｓに対する交差保護（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を、高い致死率を
生じる、成虫のマダニの中腸および唾液腺に「潜伏した（ｃｏｎｃｅａｌｅｄ）
」抗原を標的化することによって、提供した。

【０１３２】３．カクテルワクチンは、ワクチン接種した動物の免疫状態をブーストする局
所的な炎症性免疫応答を刺激する。

【０１３３】（実施例７：Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質６４ｔ
ｒｐ構築物に対する抗血清を使用した、イムノブロットによって検出された、Ｒ
ｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓとＢｏｏｐｈｉｌｕ
ｓｍｉｒｏｐｌｕｓとの間の抗原性交差反応性）（７．１Ｂ．ｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抽出物の調製）Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓの成虫および若虫を、ウシから採取
した。若虫を飼育し、従って、宿主タンパク質に起因する非特異的交差反応性の
増大したレベルを示し得る。

【０１３４】（７．２結果）（７．２．１６４ｔｒｐ２抗血清および６４ｔｒｐ３抗血清との交差反応性
）イムノブロッティングを使用した６４ｔｒｐ３抗血清との交差反応研究（図１
７Ａ）は、いくつかのＢ．ｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーンタンパク質（ｃ，ｉ、ｊ、ｋおよびｌ）を検出した；類似サイズの２つのバンド（ｃおよびｈ）
を、中腸および唾液腺で検出した。多くのバンドを、飼育した若虫の抽出物中で
検出し、そのいくつかは、おそらく非特異的であった（以下を参照のこと）。

【０１３５】６４ｔｒｐ２抗血清（図１７Ｂ）を使用して、１つの明確なバンド（ｏ）を、
全ての抽出物中で検出した。このバンドは、６４ｔｒｐ３抗血清を用いる全ての
サンプル中で検出されたバンドｃと類似のサイズ（６２ｋＤ）であるが、バンドｃは明確ではなかった。バンドｃ／ｏを、ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ染色ゲ
ル（図１７Ｃ）中で僅かに検出可能であった。このことは、６４ｔｒｐ２抗血清
または６４ｔｒｐ３抗血清との交差反応性が特異的である可能性があり、そして
非特異的結合に起因しないことを示す。また、この解釈と一貫性があるのは、６
４ｔｒｐ２タンパク質および６４ｔｒｐ３タンパク質が、重複したＮ末端配列を
伴う関連した構築物であるという事実である（図２を参照のこと）。

【０１３６】６４ｔｒｐ２抗血清を用いて、淡いバンド（ｑ）を全てのサンプルで検出した
。セメントコーン（レーン５）および若虫抽出物（レーン２）は、共通の明確な
バンド（ｎおよびｐ）を有し、一方でバンドｒを、全ての成虫抽出物中で検出し
た。

【０１３７】ｅとして記されるイムノポジティブバンドは、マダニ組織抽出物中に存在する
、宿主タンパク質（ヘモグロビン／ＩｇＧ）との、抗ＧＳＴ抗血清の非特異的結
合に最も起因しやすい。イムノポジティブバンドｆは、中腸、唾液腺、およびマ
ダニの組織抽出物の全体の中にあるタンパク質バンド（これは、Ｂｏｏｐｈｉｌ
ｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓ幼虫２６ｋＤＧＳＴタンパク質を表す）との、抗
ＧＳＴ抗血清の特異的結合（図１８Ｃを参照のこと）におそらく起因する（Ｈｅ
ら、（１９９９）、Ｉｎｓｃｅｃｔ−Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｍｏｌ−Ｂｉｏｌ．２９
（８０）：７３７〜４３を参照のこと）。

【０１３８】（７．２．２６４ｔｒｐ５抗血清および６４ｔｒｐ６抗血清との交差反応性
）６４ｔｒｐ５抗血清および６４ｔｒｐ６抗血清の両方を、若虫抽出物中でいく
つかのバンドで検出したが、成虫マダニ抽出物との明確な交差反応性は無かった
（図１８Ａおよび１８Ｂ）。６４ｔｒｐ５抗血清は、セメントコーンとの優勢な
バンド（ｂ）を生成するが、交差反応性は、６４ｔｒｐ６とセメントコーン抽出
物との間に検出されなかった。

【０１３９】ａおよびｅとして記されるイムノポジティブバンドは、セメントコーン抽出物
および飼育したマダニの若虫抽出物全体の中にそれぞれ存在する、宿主タンパク
質（ヘモグロビン／ＩｇＧ）との、抗ＧＳＴ抗血清の非特異的結合に、おそらく
起因する（図１８Ｃ）。イムノポジティブバンドｆは、中腸、唾液腺、およびマ
ダニの組織抽出物の全体の中にあるタンパク質バンド（おそらく、Ｂｏｏｐｈｉ
ｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓ幼虫の２６ｋＤであるＧＳＴタンパク質）との、
抗ＧＳＴ抗血清の特異的結合に、おそらく起因する。

【０１４０】（７．３結論）結果を、表５に要約した。

【０１４１】Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓおよびＩｘｏ
ｄｅｓｒｉｃｉｎｕｓを用いた本発明者らのワクチン試験は、免疫ブロッティ
ングのデータが、効果的なワクチン免疫原の良い指標を提供することを示した。
このことに基づいて、この実施例に表されるこの結果は、以下を示唆する：（ｉ）６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ３は、Ｂ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓ成体お
よびＢ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓ若虫を制御するための候補ワクチン免疫原である；（ｉｉ）６４ｔｒｐ５構築物は、Ｂ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓ若虫に対して効果
的であり得、そして成体に対して少なくとも部分的に効果的であり得る；（ｉｉｉ）６４ｔｒｐ６は、Ｂ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓ若虫に対して効果的で
あり得るが、成体に対して効果的であり得ない；（ｉｖ）免疫原のカクテル（６４ｔｒｐ２＋６４ｔｒｐ５または６４ｔｒｐ
３＋６４ｔｒｐ５のいずれか）は、Ｂ．ｍｉｃｏｒｐｌｕｓを制御するための最
も効果的な戦略であり得る。

【０１４２】（表５：６４ｔｒｐ組換え抗原で免疫したモルモット由来の血清を使用したＲ
．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマイクロカプセルマダニ抗原とＢｏｏｐｈｉｌ
ｕｓマイクロカプセルマダニ抗原との間の交差反応性）

【０１４３】

【表５】ＣＣ＝マダニセメントコーン抽出物（ｔｉｃｋｃｅｍｅｎｔｃｏｎｅ）、
ＳＧ＝唾液腺抽出物、ｇｕｔ＝中腸抽出物、Ｈ＝血液リンパ、Ｎ＝若虫マダニ抽
出物、Ｌ＝幼生マダニ抽出物それぞれ、免疫ブロットにおいて使用した抗血清に対する、＋＝陽性反応およ
び−＝陰性反応。ａｂ’＝抗血清；ｎｄ＝測定せず＋^＊および＋^δ＝ＳＤＳサンプル緩衝液に１００℃で可溶化したマダニ組織抽
出物の不溶性画分由来の抗ＧＳＴ抗血清に対する陽性反応。

【０１４４】＋^＊（部分的に肥育されたマダニ由来のＣＣ）免疫陽性バンドは、おそらくセ
メントコーンに結合する宿主ＩｇＧ／ヘモグロビン画分および肥育されたマダニ
の全若虫由来の宿主ＩｇＧ／ヘモグロビン画分との抗ＧＳＴａｂ’の非特異的
結合が原因である＋^δ（肥育されていないマダニ由来のＳＧ）免疫陽性バンドは、おそらく等価
のＧＳＴタンパク質^１との抗ＧＳＴａｂ’の特異的な結合が原因である。

【０１４５】（実施例８：交差反応性ワクチン試験：Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ．ａｐｐ
ｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓセメントタンパク質６４ｔｒｐ構築物で免疫され、そし
てＩ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫でチャレンジされたモルモット）（８．１免疫原の選択）Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ６４ｔｒｐのセメント構築の要約を、図２
に示す。候補の免疫原を、構築物に対する抗血清が、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓサンプ
ルの抽出物における特異的な交差反応抗原を検出したかどうかの根拠において同
定した。

【０１４６】６４ｔｒｐ抗血清を用いた免疫ブロッティングを使用した交差反応研究は、幾
つかのＩ．ｒｉｃｉｕｓ全若虫抽出タンパク質および幼虫抽出タンパク質（図１
９）ならびにセメントコーンの成体調製物および中腸抽出物（示さず）の検出を
示した。

【０１４７】６４ｔｒｐ２抗血清（図１９Ａ（ｉｉｉ））を使用して、２つの主要なバンド
（ａおよびｂ）を、若虫抽出物において検出し、そしてまた、成体セメントコー
ンおよび中腸抽出物と交差反応を示した（表３を参照のこと）。

【０１４８】６４ｔｒｐ５および６４ｔｒｐ６に対する抗血清（それぞれ、図１９Ａ（ｉｖ
）および（ｖ））は、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ全若虫抽出物において幾つかのバンド
を検出した。６４ｔｒｐ６に対する抗血清はまた、全幼虫抽出物において５つの
優性なバンドを検出した（図１９Ｂ（ｉｉ））。

【０１４９】ＧＳＴに対して惹起されたコントロール抗血清は、おそらく宿主タンパク質ヘ
モグロビン／ＩｇＧを使用する非特異的反応の原因である、全若虫抽出物、セメ
ントコーン抽出物および中腸抽出物において非常に弱いバンドを検出した。

【０１５０】観察した交差反応に基づいて、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓの６４ｔｒ
ｐ２、６４ｔｒｐ５および６４ｔｒｐ６を、ワクチン試験のための免疫原とし選
択した。これらを、単独でまたはカクテルとして使用した。

【０１５１】（８．２ワクチン試験のための処置）・群１：組換え体６４ｔｒｐ６＋６４ｔｒｐ２＋ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ（
１匹のハムスター）・群２：組換え体６４ｔｒｐ６＋６４ｔｒｐ５＋ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ（
１匹のハムスター）・群３：ＧＳＴ（コントロール）（１ハムスター）・群４：組換え体６４ｔｒｐ２＋ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ（１匹のハムスタ
ー）・群５：組換え体６４ｔｒｐ５＋ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ（１匹のハムスタ
ー）・群６：組換え体６４ｔｒｐ６＋ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ（１匹のハムスタ
ー）総動物数＝６匹。

【０１５２】（８．３経路および用量）肩甲骨前（ｐｒｅｓｃａｐｕｌａｒ）領域における、単一の部位への単一の抗
原または組み合わせとしての抗原のいずれかの皮下接種。１匹の動物当たり、用量２５μｇ抗原。

【０１５３】（８．４ワクチン接種スキーム）１．プライマー接種２．最初のブースト３．接種後１０〜１２日目での試験採血４．第二のブースト（抗体力価＜１／５０００の場合）５．接種後１０〜１２日目での試験採血６．抗体力価＞１／５０００：５０〜１００のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫でのチャ
レンジ７．ダニの食餌成績、ダニの食餌に対する局所的な炎症性免疫応答、生存および
成虫への成功した脱皮の評価。

【０１５４】（８．５結果）結果を表６に要約する。全体的に、これらは、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔ
ｕｓのセメント質に対して誘導された推定ワクチンが、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫
に対して交差反応することを示す。

【０１５５】（（ｉ）付着に対する効果）Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓのように、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ若虫の試験
動物に対する付着の割合は、影響されなかった。

【０１５６】（（ｉｉ）炎症性応答）４匹のハムスターは、ダニの食餌の部位での炎症性応答を示し、３匹のハムス
ターは、重篤な反応を有した（図２０）。この結果は、インビトロのアッセイ（
すなわち、ウェスタンブロット）と相関する。炎症は、外寄生後３〜５日目に観
察され、そしてダニの離脱の時点にまだ存在した（食餌の５日目）。コントロー
ルの動物では、炎症は観察されなかった。

【０１５７】（（ｉｉｉ）食餌後の死亡率）インビトロアッセイとの関係における交差防御を、食餌した若虫が脱皮して成
虫になったときに評価する。

【０１５８】（８．６結論）１．６４ｔｒｐタンパク質に対して惹起された抗体は、イムノブロットにおいて
、Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニの若虫、幼虫および成虫のセメントコーンならびに
中腸における抗原性エピトープと交差反応する。２．宿主応答は、６４ｔｒｐ免疫原で免疫したハムスターにおいて観察された（
以前はモルモットにおいてのみ観察された）。３．種々の程度の炎症性応答が、６４ｔｒｐ構築物で免疫された動物上のＩ．ｒ
ｉｃｉｎｕｓ若虫マダニ食餌部位で観察され、最も重篤な応答は、６４ｔｒｐ６
／５のカクテルで免疫されたハムスターにおいて観察された。４．免疫原は、免疫応答をブーストする局所的炎症性免疫応答を刺激する。

【０１５９】（表６．６４ＴＲＰタンパク質およびＧＳＴタンパク質で免疫したハムスター
上のＩｘｏｄｅｓｒｉｃｉｎｕｓマダニ食餌についての、食餌パラメーターの
比較）

【０１６０】

【表６】ｉ＝炎症：−および＋は、それぞれ、食餌の間のマダニ付着部位での炎症の非存
在または存在を意味する；炎症の程度は、以下によって示される：＋＝軽度、＋
＋＝中程度、および＋＋＋＝重篤。^＊は、若虫Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニのコン
トロールハムスター上のダニ食餌をいい、６４ｔｒｐ免疫ハムスター上で食餌し
たマダニ食餌と比較して、６時間延長された。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、推定セメントタンパク質の７種のクローンのヌクレオチドおよび推定
アミノ酸配列である。クローン２１：クローン２１の部分ｃＤＮＡ配列および転写産物。ｃＤＮＡ推定
タンパク質は、セメントタンパク質であると予測される：可能であれば、シグナ
ル配列、代表的に、分泌産物を構築する疎水性Ｎ末端領域を含み、そして構造タ
ンパク質、特に、ケラチンと非常に類似している。グリコサミノグリカン基の翻
訳後結合のための認識配列に、下線を付す。クローン３３：融合タンパク質発現ベクター（ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ））へのＰＣＲ−クローン化産物（ｃＤＮＡライブラリ由来）の推定タンパ
ク質配列。推定シグナル配列を、太字で示す。多くの構造タンパク質と同様に、
このタンパク質は、グリシンリッチおよびプロリンリッチである。このタンパク
質は、ケラチンといくらか類似性を有する。^＊は、停止コドンを示す。クローンｃｅｍＡ：ｃｅｍＡｃＤＮＡおよびタンパク質（推定リーディングフ
レーム）の部分的な配列。このタンパク質は、非常に反復性であり、配列ＫＧＡ
ＬＬＱＱＱＱＡＳＱＶＫＧＡＬＫＡＩまたはそのわずかな改変体を有し、数回繰
り返される。クローン２４：クローン２４の不完全なｃＤＮＡおよびｃＤＮＡ推定配列。この
タンパク質は、構造タンパク質（特に、コラーゲン）に対して類似性を有し、そ
して繰り返し配列を含む。多くの関連のクローンは、このライブラリー中に見出
される。このｃＤＮＡはまた、グルテニン（自己アセンブリタンパク質）との共
通の領域を含む。クローン６８：クローン６８の部分的なｃＤＮＡおよびｃＤＮＡ推定配列。この
ライブラリーは、類似のクローンのファミリーを含む。このコードされたタンパ
ク質は、構造タンパク質（例えば、ケラチン）と類似している。一連の可能なグ
リコサミノグリカン結合部位に、下線を付す。クローン６４：クローン６４の不完全ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ推定タンパク
質配列。この推定シグナル配列を、太字で示す。可能なグリコサミノグリカン結
合部位に下線を付す。成熟タンパク質の最初の４０個のアミノ酸断片は、コラー
ゲン様であり、この配列の残りは、ケラチンに類似している。このタンパク質は
、グリシンリッチであり、そしてモチーフ（Ｃ／Ｓ）１−４（Ｙ／Ｆ）の数回繰
り返しを含み、これはまた、昆虫の卵の殻由来の構造タンパク質において見出さ
れる。このチロシンは、フェノロキシダーゼによるジチロシン−架橋の形成によ
る架橋に関与し得る。類似のタンパク質は、クローンＩ（以下を参照のこと）に
よりコードされる。^＊は、停止コドンを示す。クローンＩ：クローンＩの不完全なｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ推定タンパク質
配列。この推定タンパク質は、グリシンリッチおよびチロシンリッチであり、そ
してリーフ構築物（ｒｅｅｆ−ｂｕｉｄｉｎｇ）の多毛類Ｐｒａｇｍａｔｏｐｏ
ｍａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのセメントタンパク質（これらの海洋寄生虫によ
って構築された管中のキノン黄渇色セメントの成分）に類似している。

【図２】図２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおいて発現される６４Ｐタンパ
ク質フラグメント（６４ＴＲＰ）のアミノ酸配列。Ｐ１／Ｐ２、Ｐ１／Ｐ３、Ｐ
４／Ｐ５、Ｐ６／Ｐ５、Ｐ１／Ｐ５およびＰ７／Ｐ５は、６４Ｐタンパク質の短
縮型バージョン（すなわち、それぞれ、６４ｔｒｐ２（５１アミノ酸）、６４ｔ
ｒｐ３（７０アミノ酸）、６４ｔｒｐ１（２９アミノ酸）、６４ｔｒｐ４（６３
アミノ酸）、６４ｔｒｐ５（１３３アミノ酸（ＨＩＳタグを含まない））、およ
び６４ｔｒｐ６（１３３アミノ酸（ＨＩＳタグを含む）））としてのＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞における発現について、６４Ｐアミノ酸配列からプ
ラスミドｐＧＥＸ−２ＴへＰＣＲ産物をサブクローニングするために使用される
プライマーを表す。予測される可能な切断シグナルペプチド（アミノ酸１〜１８
）は、緑色の下線が付されている。

【図３】図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥである：（Ａ）ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅで染
色した、４〜１２％の勾配のＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルであり、（Ｂ
）および（Ｃ）は、それぞれ、マダニ構造タンパク質ならびにベクター−ＧＳＴ
タンパク質、６４Ｐの組換え短縮型バージョン（ｔｒｐ）（すなわち、ｔｒｐ１
、ｔｒｐ２、ｔｒｐ３およびｔｒｐ４）を発現するＩＰＴＧ誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ
細胞の、ＧＳＴモノクローナル抗体（１：５００希釈）およびＨＩＳ−タグモノ
クローナル抗体アルカリホスファターゼ結合体（１：２０００希釈）を使用する
、ウエスタンブロットである。レーン：１＝分子量マーカー、２＝２６ｋＤベク
ター−ＧＳＴタンパク質、３＝３０ｋＤのｔｒｐ１タンパク質、４＝３３ｋＤの
ｔｒｐ２タンパク質、および５＝３６ｋＤのｔｒｐ３タンパク質、６＝３５ｋＤ
のｔｒｐ４タンパク質、７＝４１ｋＤのｔｒｐ５タンパク質（ＨＩＳタグなし）
、および８＝４２ｋＤのｔｒｐ６タンパク質（ＨＩＳタグ化）。サンプルは、ゲ
ルを充填する前に、ＳＤＳ中１００℃で可溶化した。矢印：ａ＝４２ｋＤのｔｒ
ｐ６タンパク質、ｂ＝３５ｋＤのｔｒｐ４タンパク質、ｃ＝３３ｋＤのｔｒｐ２
タンパク質、ｄ＝３０ｋＤのｔｒｐ１タンパク質、およびｅ＝２６ｋＤのベクタ
ーＧＳＴ−タンパク質。

【図４】図４は、ハムスターの薄い皮膚部分についての抗６４ｔｒｐ抗血清を使用する
免疫ペルオキシダーゼの研究である。ＡおよびＣ＝一次抗体として、それぞれ抗
６４ｔｒｐ抗血清：６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ２と共にインキュベートした
ハムスターの薄い皮膚部分；Ｂ＝一次抗体として、すなわちコントロールサンプ
ルとしてＰＢＳ（生理食塩溶液）と共にインキュベートしたハムスターの薄い皮
膚部分。１＝表皮の角質化層（角質層）、２＝表皮および３＝真皮；Ｋ＝ケラチ
ノサイトおよびＣＦ＝コラーゲン繊維は、抗６４ｔｒｐ３抗血清とのポジティブ
な反応（黄色／褐色）を与えた。倍率＝２０×。

【図５】図５は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓを供給
した後のハムスターの薄い皮膚部分についての、抗６４ｔｒｐ抗血清を使用する
免疫ペルオキシダーゼ研究である。ＡおよびＣ＝一次抗体として、それぞれ、抗
６４ｔｒｐ抗血清：６４ｔｒｐ３および６４ｔｒｐ２と共にインキュベートした
ハムスターの薄い皮膚部分；およびＢ＝一次抗体の代わりに、すなわちコントロ
ールサンプルとしてＰＢＳ（生理食塩溶液）と共にインキュベートしたハムスタ
ーの皮膚部分。矢印：１＝表皮；２＝真皮；３＝浅在筋膜；４＝マダニセメント
錐体；および＊＝抗６４ｔｒｐ３抗血清と共にインキュベートした場合、ポジテ
ィブな反応を与えるセメント錐体およびハムスター皮膚の部分。倍率＝１０×。

【図６】図６は、６４Ｐタンパク質の短縮型バージョン（６４ＴＲＰ）で免疫したモル
モットを摂食するＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ
若虫の影響を示す。Ａ＝ＧＳＴで免役したコントロールモルモットを摂食するＲ
ｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫を含む細胞；Ｂ
、ＣおよびＤ＝６４ｔｒｐタンパク質で免役したモルモットを摂食するＲｈｉｐ
ｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫を含む細胞。＊＝Ｒｈ
ｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ若虫が摂食した免役し
たモルモットＢ、ＣおよびＤの皮膚上の炎症（すなわち、紅斑、浮腫、リンパ節
腫脹、および接触すると熱い）の部位を示す矢印。

【図７】図７は、６４ｔｒｐタンパク質で免疫したモルモットを摂食した後の、Ｒｈｉ
ｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ雌性成体マダニに対する
効果を示す。ＡおよびＢ＝それぞれ、６４ｔｒｐタンパク質および６４ｔｒｐ３
タンパク質で免役したモルモットを摂食した後の、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ
ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ雌性マダニ；およびＣ＝ＧＳＴで免役したコン
トロールモルモットを摂食した後の、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎ
ｄｉｃｕｌａｔｕｓ雌性マダニ。１＝生きた雌性マダニ、２＝卵、および３＝死
亡した雌性マダニ。

【図８】図８は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ
を供給した後の、６４ｔｒｐタンパク質で免役したモルモットの皮膚生検の剖検
研究を示す。Ａ、ＢおよびＣ＝それぞれ、６４ｔｒｐ１タンパク質、６４ｔｒｐ
６タンパク質および６４ｔｒｐ２タンパク質で免役したモルモットの皮膚生検、
ならびにＤおよびＥ＝Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔ
ｕｓマダニを供給した後の、ＧＳＴで免役したコントロールモルモットの皮膚生
検；１＝表皮、２＝真皮／浅在筋膜、３＝以前のマダニ付着部位、４＝壊死外傷
。

【図９】図９は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ
を供給した後の、６４ｔｒｐタンパク質で免役したモルモットの皮膚部分（ヘマ
トキシリンおよびエオシン、ならびにライト染料で染色）の組織学的研究を示す
。１＝ＧＳＴで免役したコントロールモルモットの皮膚の組織学的部分、ならび
に２、３、４、５、６、７および８＝Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎ
ｄｉｃｕｌａｔｕｓ成体マダニを供給した後の、６４ｔｒｐタンパク質で免役し
たモルモットの皮膚の組織学的部分、染色：ヘマトキシリンおよびエオシン染色
＝部分１、２、３、７および８、ならびにライト染色＝部分４、５および６；部
分１、２および３の倍率＝１０×；部分７および８の倍率＝２０×；部分４、５
および６の倍率＝１００×。矢印：Ａ＝表皮、Ｂ＝真皮、ｃｃ＝Ｒｈｉｐｉｃｅ
ｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニセメント錐体が以前に付着
した領域、ＣＦ＝コラーゲン繊維、Ｄ＝デンドロサイト（ｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ
）、Ｆ＝線維芽細胞、ＥＰ＝好酸球多型、ＢＰ＝好塩基球多型。

【図１０】図１０は、６４ｔｒｐ組換えタンパク質で免役したモルモット由来の血清を使
用する、Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の可溶性画分間の交差反
応性を示す。図１０Ａ：抗６４ｔｒｐ２血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕ
ｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１およびＡ／２セメント錐体；レー
ンＡ／３およびＡ／４唾液腺；レーンＡ／５およびＡ／６血リンパ；レーン
Ａ／７若虫；レーンＡ／８幼生；レーンＡ／９分子量マーカー^＊。図１０Ｂ：抗６４ｔｒｐ６血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕ
ｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＢ／１およびＢ／２セメント錐体；レー
ンＢ／３およびＢ／４唾液腺；レーンＢ／５およびＢ／６血リンパ；レーン
Ｂ／７若虫；レーンＢ／８幼生；レーンＢ／９分子量マーカー^＊。図１０Ｃ：Ｒ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原（雌性および雄性）の
クマシーブルーで染色した４〜１２％勾配のゲル。レーンＣ／１分子量マーカ
ー^＊＊；レーンＣ／２およびＣ／３セメント錐体；レーンＣ／４およびＣ／５唾液腺抽出物；レーンＣ／６およびＣ／７血リンパ；レーンＣ／８およびＣ
／９中腸；レーンＣ／１０若虫；レーンＣ／１１幼生。図１０Ｄ：抗６４ｔｒｐ６抗血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔ
ｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１分子量マーカー^＊；レーンＡ／
２およびＡ／３給餌されていないマダニの唾液腺；レーンＡ／４、Ａ／５中
腸。図１０Ｅ：抗６４ｔｒｐ２抗血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔ
ｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＢ／１およびＢ／２給餌されていない
マダニの唾液腺；レーンＢ／３およびＢ／４中腸；レーン５分子量マーカー^＊。図１０Ｆ：抗６４ｔｒｐ５を使用するＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ
抗原の免疫ブロット。レーンＣ／１分子量マーカー^＊；レーンＣ／２およびＣ
／３給餌されていないマダニの唾液腺；レーンＣ／４およびＣ／５中腸。図１０Ｇ：抗６４ｔｒｐ５抗血清を使用するＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ
マダニ抗原の免疫ブロット。レーンＤ／１およびＣ／２セメント錐体；レーン
Ｄ／３およびＤ／４部分的に給餌された（２日目）マダニの唾液腺；レーンＤ
／５およびＤ／６血リンパ；レーンＤ／７若虫；レーンＤ／８幼生；レー
ンＤ／９分子量マーカー^＊。

【図１１】図１１は、６４ｔｒｐ組換えタンパク質で免役したモルモット由来の血清を使
用するＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の不溶性画分間の交差反応
性を示す。図１１Ａ：抗６４ｔｒｐ３血清でプローブした成体雌性組織抽出物由来のＲ．ａ
ｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１マーカ
ー^＊＊＊；レーンＡ／２セメント錐体（モルモットを部分的に摂食した雌性由
来）；レーンＡ／３給餌していないマダニ唾液腺；レーンＡ／４給餌してい
ないマダニ血リンパ；レーンＡ／５給餌していないマダニ中腸。図１１Ｂ：抗６４ｔｒｐ２血清でプローブした成体雌性組織抽出物由来のＲ．ａ
ｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＢ／１、Ｂ／２
、Ｂ／３およびＢ／４は、レーンＡ／２〜５の通り。図１１Ｃ：抗６４ｔｒｐ６血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕ
ｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＣ／１全若虫；レーンＣ／２全幼生。
図１１Ｄ：抗６４ｔｒｐ２血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕ
ｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＤ／１全若虫；レーンＤ／２全幼生；
レーンＤ／３マーカー^＊＊＊。図１１Ｅ：コントロール抗ＧＳＴ血清でプローブしたＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌ
ａｔｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーンＥ／１マーカー^＊＊＊；レーンＥ
／２セメント錐体（レーンＡ／２と同様）；レーンＥ／３唾液腺（レーンＡ
／３と同様）；レーンＥ／４血リンパ（レーンＡ／４と同様）、レーンＥ／５中腸（レーンＡ／５と同様）；レーンＥ／６若虫（レーンＣ／２およびＤ／
２と同様）；レーンＥ／７幼生（レーンＣ／１、Ｃ／２と同様）。図１１Ａ〜Ｅのマーカー^＊＊＊ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭＰｌｕｓ２タンパク質
分子量マーカー：１８８ｋＤ＝ミオシン、９８ｋＤ＝ホスホリラーゼＢ、６２ｋ
Ｄ＝ウシ血清アルブミン、４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３８ｋＤ
＝アルコールデヒドロゲナーゼ、２８ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ、１７
ｋＤ＝ミオグロビンレッドおよび１４ｋＤ＝リゾチーム。図１１ＦＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓマダニ抗原のＣｏｏｍａｓｓ
ｉｅＢｌｕｅ染色４〜１２％勾配ゲル。レーンＦ／１マーカー^＊＊、レーンＦ／２部分的に飼育された雄性のセメン
トコーン、レーンＦ／３部分的に飼育された雌性のセメントコーン、レーンＦ
／４飼育されていない雄性の唾液腺、レーンＦ／５飼育されていない雌性の
唾液腺、レーンＦ／６雄性血リンパ、レーンＦ／７雌性血リンパ、レーンＦ／
８雄性中腸、レーンＦ／９雌性中腸、レーンＦ／１０全若虫、レーンＦ／１
１全幼虫。２６ｋＤのバンドｆ（これは、唾液線における交差反応）は、Ｂｏ
ｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓについて報告されたものに等しいＲ．ａ
ｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓＧＳＴを表し得る（Ｈｅら，（１９９９）．Ｉｎ
ｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：７３７−７４３）。図１１Ａ〜Ｆ。標識されたバンドの分子量：ａ＝２００ｋＤ、ｂ＝１２０〜１
８８ｋＤ、ｃ＝８０〜９８ｋＤ、ｄ＝５５〜６２ｋＤ、ｅ＝４９〜５５ｋＤ、ｆ
＝２６ｋＤ、ｇ＝１７ｋＤ、ｈ＝１５Ｋｄ、ｉ＝１２０ｋＤ、ｊ＝６０〜６２ｋ
Ｄ、ｋ＝３６ｋＤ、１＝１４ｋＤ、ｍ＝１８８ｋＤ、ｎ＝９８〜１２０ｋＤ、ｏ
＝５５〜６２ｋＤ、ｐ＝２００ｋＤ、ｑ＝１８８ｋＤ、ｒ＝１５０ｋＤおよびｓ
＝５０〜６２ｋＤ。

【図１２】図１２は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ６４ｔｒｐタンパク質
で免疫されたモルモット由来の抗血清と、Ａｍｂｌｙｏｍｍａｖａｒｉｅｇａ
ｔｕｍおよびＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原と
の交差反応性を示す。Ａ抗６４ｔｒｐ５血清を用いてプローブされたＡ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍマ
ダニ抗原の免疫ブロット。レーンＡ／１血リンパ；レーンＡ／２中腸；レー
ンＡ／３唾液腺；レーンＡ／４分子量マーカー^＊。Ｂ抗６４ｔｒｐ６血清でプローブされたＡ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍマダニ抗
原の免疫ブロット。レーンＡ／１分子量マーカー^＊；レーンＡ／２唾液腺；
レーンＡ／３中腸；レーンＡ／４血リンパ。Ｃ抗６４ｔｒｐ６血清でプローブされたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗
原の免疫ブロット。レーンＡ／１分子量マーカー^＊；レーンＡ／２唾液腺；
レーンＡ／３中腸；レーンＡ／４血リンパ。図１０〜１２について、^＊は、ＭｕｌｔｉＭａｒｋＴＭタンパク質分子量マー
カー（ＮＯＶＥＸ）を表す：９８ｋＤａ＝ホスホリラーゼＢ、５２ｋＤａ＝グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ、３１ｋＤａ＝カルボニックアンヒドラーゼ、１９／
１７ｋＤａ＝ミオグロビンＲｅｄ／Ｂｌｕｅ、１１ｋＤａ＝リゾチーム、６ｋＤ
ａ＝アプロチニン、３ｋＤａ＝インスリン。 ^＊＊は、Ｍａｒｋ１２ＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）を表す
：２００ｋＤａ＝ミオシン、１１６．３ｋＤａ＝βカラクトシダーゼ、９７．４
ｋＤａ＝ホスホリラーゼｂ、６６．３ｋＤａ＝ウシ血清アルブミン、５５．４
ｋＤａ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３６．５ｋＤａ＝乳酸デヒドロゲナー
ゼ、３１ｋＤａ＝カルボニックアンヒドラーゼ、２１．５ｋＤａ＝トリプシンイ
ンヒビター、１４．４ｋＤａ＝リゾチーム、６ｋＤａ＝アプロチニン、３．５ｋ
Ｄａ＝インスリンＢ鎖および２．５ｋＤａ＝インスリンＡ鎖。

【図１３】図１３は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ６４ｔｒｐタンパク質
で免疫されたモルモット由来の抗血清を使用するＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ
ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原間の交差反応性を示す。ＡおよびＢ各々、抗６４ｔｒｐ３抗血清および抗６４ｔｒｐ２抗血清を使用
するＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。ＣＣｏｏｍａｓｓ
ｉｅＢｌｕｅ染色された４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（ＮｕＰＡＧ
Ｅ−ＮＯＶＥＸ）。レーンＡ／１およびＢ／１：ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭＰｌｕｓ２タンパク質分子
量マーカー（ＮＯＶＥＸ）１８８ｋＤ＝ミオシン；９８ｋＤａ＝ホスホリラー
ゼＢ；６２ｋＤ＝ＢＳＡ；４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ；３８ｋＤ
＝アルコールデヒドロゲナーゼ；２８ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ；１７
ｋＤ＝ミオグロビンレッド；１４ｋＤ＝リゾチーム；６ｋＤ＝アプロチニン。レーンＣ／１：Ｍａｒｋ１２^ＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）
２００ｋＤ＝ミオシン；１１６．３ｋＤ＝β−ガラクトシダーゼ；９７．４ｋ
Ｄ＝ホスホリラーゼｂ；６６．３ｋＤ＝ウシ血清アルブミン；５５．４ｋＤ＝グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼ；３６．５ｋＤ＝乳酸デヒドロゲナーゼ；３１ｋＤ
＝カルボニックアンヒドラーゼ；２１．５ｋＤ＝トリプシンインヒビター；１４
．４ｋＤ＝リゾチーム；６ｋＤ＝アプロチニン。レーン：Ａ／２、Ａ／３、Ａ／４、Ａ／５、Ａ／６、Ａ／７およびＡ／８：各
々、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ全若虫抽出物、血リンパ、雄性中腸抽出物、雌性
中腸抽出物、雄性唾液腺抽出物、雌性唾液腺抽出物、ならびに組み合わせた雄性
および雌性セメントコーン抽出物（モルモットの部分的に存在するマダニ由来）
であり、これらの免疫陽性バンドは、抗６４ｔｒｐ３抗血清を使用して、ａ＝６
ｋＤ、ｂ＝１７ｋＤ、ｃ＝１８８ｋＤ、ｄ＝２６ｋＤ、ｅ＝２８ｋＤ、ｆ＝６０
ｋＤおよびｇ＝８０ｋＤとして観察された。レーン：Ｂ／２、Ｂ／３、Ｂ／４、Ｂ／５、Ｂ／６、Ｂ／７およびＢ／８：Ａ
と同様に、これらの免疫陽性バンドを、抗６４ｔｒｐ２抗血清を使用して、ｈ＝
１２０ｋＤ、ｉ＝６２ｋＤおよびｊ＝６０ｋＤとして観察した。レーン：Ｃ／２、Ｃ／３、Ｃ／４、Ｃ／５、Ｃ／６、Ｃ／７およびＣ／８：Ａ
におけるように、タンパク質バンドａ〜ｊは、免疫ブロットＡおよびＢからの免
疫陽性バンドに対応する。矢印^＊＝抗ＧＳＴ血清と結合するバックグラウンドに
起因する免疫陽性バンド−図１４を参照のこと。

【図１４】図１４は、抗ＧＳＴ抗血清を使用するＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ抗原の
免疫ブロットを示す。レーン８：Ｍａｒｋ２^ＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）２００
ｋＤ＝ミオシン；１１６．３ｋＤ＝β−ガラクトシダーゼ；９７．４ｋＤ＝ホス
ホリラーゼｂ；６６．３ｋＤ＝ウシ血清アルブミン；５５．４ｋＤ＝グルタミン
酸デヒドロゲナーゼ；３６．５ｋＤ＝乳酸デヒドロゲナーゼ；３１ｋＤ＝カルボ
ニックアンヒドラーゼ；２１．５ｋＤ＝トリプシンインヒビター；１４．４ｋＤ
＝リゾチーム；６ｋＤ＝アプロチニン。レーン７、６、５、４、３、２および１
：各々、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ全若虫抽出物、血リンパ、雄性中腸抽出物、
雌性中腸抽出物、雄性唾液腺抽出物、雌性唾液腺抽出物、および組み合わせた雄
性および雌性セメントコーン抽出物（モルモットの部分的に存在するマダニ由来
）である。免疫陽性バンドＩ^＊およびＫ１およびＫ２^＊は、各々、雄性唾液線抽
出物、雌性唾液腺抽出物およびセメントコーン抽出物に存在するタンパク質バン
ド（２５ｋＤ、４８ｋＤおよび２６ｋＤ）を有する抗ＧＳＴ抗血清との非特異的
結合をいう。

【図１５】図１５は、６４ｔｒｐタンパク質の異なるカクテルで免疫されたモルモットで
の初期飼育の間の、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの雄性
および雌性の成虫マダニに対する効果を示す。（Ａ）６４ｔｒｐ６／３免疫モルモット（異なる部位に注射された）からのの
死亡した雌性マダニ；（Ｂ）６４ｔｒｐ６／３免疫モルモット（１つの部位に組み合わせて注射した
）からの死亡した雌性マダニ；（Ｃ）６４ｔｒｐ６／２免疫モルモット（異なる部位に注射した）からの死亡
した雌性（ｎ＝３）および雄性（ｎ＝２）マダニ；（Ｄ）６４ｔｒｐ６／２免疫モルモット（１つの部位に組み合わせて注射した
）からの死亡した雌性マダニ

【図１６】図１６は、６４ｔｒｐ免疫モルモットで後飼育されたＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌ
ｕｓｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ成虫マダニに対する６４ｔｒｐタンパク質のワクチ
ン効果を示す。（Ａ）：生存する成虫雌性Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ（免疫原としての
６４ｔｒｐ２／６タンパク質カクテルで免疫されたモルモット上で後飼育された
）。２／１０マダニのみが生存した；マダニは、卵を産まず、そして完全には充
血しなかった（Ｂ）：死亡した成虫雌性Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓマダニ（免疫原としての
６４ｔｒｐ２／６および６４ｔｒｐ３／６カクテルで免疫されたモルモットで後
飼育された）。このマダニは、茶色／黒に変わり、そして脱離後２〜５日間乾燥
一貫性を発展させた。（Ｃ）：正常な成虫Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ雌性マダニ（このマダニは、産
卵し、そしてＧＳＴ調節タンパク質で免疫されたモルモット上で、その後飼育さ
れた（ｐｏｓｔ−ｆｅｅｄｉｎｇ））。

【図１７】図１７は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ６４ｔｒｐ２および６
４ｔｒｐ３タンパク質で免疫されたモルモット由来の抗血清を使用するＢｏｏｐ
ｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原間の交差反応性を示す。ＡおよびＢ各々、６４ｔｒｐ２および６４ｔｒｐ３抗血清を使用するＢｏｏ
ｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原の免疫ブロット；ＣＣｏｏｍａ
ｓｓｉｅＢｌｕｅ染色された４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（ＮｕＰ
ＡＧＥ−ＮＯＶＥＸ）。レーン：Ａ／１およびＢ／１：ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭＰｌｕｓ２タンパク質
分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）１８８ｋＤ＝ミオシン、９８ｋＤ＝ホスホリラ
ーゼＢ、６２ｋＤ＝ＢＳＡ、４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３８ｋ
Ｄ＝アルコールデヒドロゲナーゼ、２８ｋＤ＝カルボニックアンヒドラーゼ、１
７ｋＤ＝ミオグロビンレッド、１４ｋＤ＝リゾチーム、６ｋＤ＝アプロチニン。
レーンＣ／１：Ｍａｒｋ１２^ＴＭタンパク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）：２
００ｋＤ＝ミオシン、１１６．３ｋＤ＝β−ガラクトシダーゼ、９７．４ｋＤ＝
ホスホリラーゼｂ、６６．３ｋＤ＝ウシ血清アルブミン、５５．４ｋＤ＝グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ、３６．５ｋＤ＝乳酸デヒドロゲナーゼ、３１ｋＤ＝カ
ルボニックアンヒドラーゼ、２１．５ｋＤ＝トリプシンインヒビター、１４．４
ｋＤ＝リゾチームおよび６ｋＤ＝アプロチニン。レーンＡ／５、Ａ／４、Ａ／３およびＡ／２：各々、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍ
ｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液線抽出物、中腸抽出物および全若
虫（飼育されたマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドを、６４ｔｒｐ
２抗血清を使用して、ａ＝１２０〜２００ｋＤ、ｂ＝８０ｋＤ、ｃ＝６２ｋＤ、
ｄ＝４９ｋＤ、ｅ＝４０ｋＤ、ｆ＝１７ｋＤ、ｇ＝８ｋＤおよびｈ＝２００ｋＤ
、Ｉ＝６０ｋＤ、ｊ＝５５ｋＤ、ｋ＝４９ｋＤおよび１＝１８ｋＤとして観察し
た。レーンＢ／５、Ｂ／４、Ｂ／３およびＢ／２：各々、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍ
ｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液線抽出物、中腸抽出物および全若
虫（飼育されたマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドを、６４ｔｒｐ
３抗血清を使用して、ｍ＝１２０ｋＤ、ｎ＝３５ｋＤ、ｏ＝６２ｋＤ、ｐ＝５９
ｋＤ、ｑ＝４９ｋＤおよびｒ＝２６ｋＤとして観察した。レーンＣ／５、Ｃ／４、Ｃ／３およびＣ／２：それぞれ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液腺抽出物、中腸抽出物および
全若虫抽出物（肥育したマダニ）であり、これらのタンパク質のバンドａ〜ｒは
、免疫ブロットＡおよびＢからの免疫陽性バンドに対応する。

【図１８】図１８は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ６４ｔｒｐ５および６
４ｔｒｐ６タンパク質で免疫したモルモット由来の抗血清を使用する、Ｂｏｏｐ
ｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原間の交差反応性である。ＡおよびＢ：それぞれ、抗６４ｔｒｐ５おおよび抗６４ｔｒｐ６抗血清を使用
する、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原の免疫ブロット；Ｃ
：組換えＧＳＴタンパク質で免疫したモルモット由来の抗血清を使用する、Ｂｏ
ｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓマダニ抗原の免疫ブロット。レーン：Ａ／５、Ｂ／５およびＣ／５＝ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭおよび２つのタン
パク質分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）：１８８ｋＤ＝ミオシン、９８ｋＤ＝ホス
ホリラーゼＢ、６２ｋＤ＝ＢＳＡ、４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
３８ｋＤ＝アルコールデヒドロゲナーゼ、２８ｋＤ＝炭酸脱水酵素、１７ｋＤ＝
ミオグロビンレッド、１４ｋＤ＝リゾチーム、６ｋＤ＝アプロチニン。レーン：Ａ／１、Ａ／２、Ａ／３およびＡ／４：それぞれ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕ
ｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液腺抽出物、中腸抽出物お
よび全若虫（肥育したマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドは、抗６
４ｔｒｐ５抗血清を使用して、ａ＝５０〜５５ｋＤ、ｂ＝３２ｋＤ、ｃ＝１７ｋ
Ｄ、ｄ＝７０ｋＤ、ｅ＝４８ｋＤ、ｆ＝２６ｋＤ、ｇ＝４０ｋＤおよびｈ＝３０
ｋＤであると観察された。レーン：Ｂ／１、Ｂ／２、Ｂ／３およびＢ／４：それぞれ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕ
ｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液腺抽出物、中腸抽出物およ
び全若虫（肥育したマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドは、抗６４
ｔｒｐ６抗血清を使用して、ｅ＝４８ｋＤ、ｉ＝１８０ｋＤ、ｊ＝７５ｋＤ、ｋ
＝１２ｋＤであると観察された。レーン：Ｃ／１、Ｃ／２、Ｃ／３およびＣ／４：それぞれ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕ
ｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓセメントコーン抽出物、唾液腺抽出物、中腸抽出物およ
び全若虫（肥育したマダニ）抽出物であり、これらの免疫陽性バンドは、ａ＝５
０〜５５ｋＤ、ｅ＝４８であると観察された。

【図１９】図１９は、組換えＲ．ａｐｐｅｎｌｄｉｃｕｌａｔｕｓ６４ｔｒｐタンパク
質で免疫したモルモット由来の抗血清を使用する、Ｉｘｏｄｅｓｒｉｃｉｎｕ
ｓマダニ抗原間の交差反応性である。Ａ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）：それぞれＧＳＴ、６４ｔｒ
ｐ２、６４ｔｒｐ５および６４ｔｒｐ６抗血清を使用する、Ｉｘｏｄｅｓｒｉ
ｃｉｎｕｓ非肥育マダニの全若虫抽出物の免疫ブロット；Ａ（ｉ）：同じ抽出物
の、クマシーブルー染色した４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（ＮｕＰＡ
ＧＥ−Ｎｏｖｅｘ）。Ｂ（ｉ）および（ｉｉ）：それぞれ、クマシーブルー染色した４〜１２％のＢ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（ＮｕＰＡＧＥ−Ｎｏｖｅｘ）、および６４ｔｒｐ６抗
血清を使用した、Ｉｘｏｄｅｓｒｉｃｉｎｕｓマダニの全幼虫抽出物の免疫ブ
ロット。レーン：Ａ／（ｉ）／１およびＢ／（ｉ）／１：Ｍａｒｋ１２^ＴＭタンパク質
分子量マーカー（ＮＯＶＥＸ）：２００ｋＤ＝ミオシン、１１６．３ｋＤ＝β−
ガラクトシダーゼ、９７．４ｋＤ＝ホスホリラーゼｂ、６６．３ｋＤ＝ＢＳＡ、
５５．４Ｋｄ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３６．５ｋＤ＝乳酸デヒドロゲ
ナーゼ、３１ｋＤ＝炭酸脱水酵素、２１．５ｋＤ＝トリプシンインヒビター、１
４．４ｋＤ＝リゾチーム、および６ｋＤ＝アプロチニン。レーン：Ａ／（ｉｉ）
、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）／３：ＳｅｅＢｌｕｅ^ＴＭおよび２つの
タンパク質分子量マーカー（Ｎｏｖｅｘ）：９８ｋＤ＝ホスホリラーゼＢ、６２
ｋＤ＝ＢＳＡ、４９ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３８ｋＤ＝アルコー
ルデヒドロゲナーゼ、２８ｋＤ＝炭酸脱水酵素、１７ｋＤ＝ミオグロビンレッド
、１４ｋＤ＝リゾチーム。レーン：Ｂ／（ｉｉ）／３：ＭｕｌｔｉＭａｒｋ^ＴＭタンパク質分子量マーカー（Ｎｏｖｅｘ）：９８ｋＤ＝ホスホリラーゼＢ、５２
ｋＤ＝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３１ｋＤ＝炭酸脱水酵素、１９ｋＤ＝ミ
オグロビンレッド、１７ｋＤ＝ミオグロビンブルー、および１１ｋＤ＝アプロチ
ニン。レーン：Ａ／（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）／４＝Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ全
若虫抽出物であり、この免疫陽性バンドは、それぞれ、ａ＝１５０ｋＤおよびｂ
＝６２ｋＤ、ｃ＝１００Ｋｄ、ｄ＝９８Ｋｄ、ｅ＝６２Ｋｄ、ｆ＝５０ｋＤおよ
びｇ＝４２ｋＤ、ｈ＝１９０ｋＤ、ｉ＝１５０ｋＤ、ｊ＝８０、ｋ＝６２ｋＤ、
ｌ＝５５ｋＤ、ｍ＝３２ｋＤ、ｎ＝１７ｋＤならびにｏ＝１２ｋＤであると観察
された。レーン：Ａ／（ｉｉ）／４＝Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ全若虫抽出物であり、
＊として観察されたこの非常わずかな免疫陽性バンドは、マダニ抗原とＧＳＴ抗
血清との非特異的交差反応性に起因する。レーン：Ｂ／（ｉｉ）／４＝Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ全幼虫抽出物であり、この免
疫陽性バンドは、ａ＝１１６ｋＤ、ｂ＝８０ｋＤ、ｃ＝６２ｋＤ、ｄ＝３４ｋＤ
、およびｅ＝２８ｋＤであると観察された。

【図２０】図２０は、６４ｔｒｐタンパク質の異なるカクテルで免疫したハムスターに対
する、Ｉｘｏｄｅｓｒｉｃｉｎｕｓマダニの若虫への肥育の影響である。ＧＳＴコントロールタンパク質（Ａ）、６４ｔｒｐ６タンパク質（Ｂ）、６４
ｔｒｐ５タンパク質（Ｃ）、および６４ｔｒｐ６／５のカクテル（Ｄ）で免疫し
たハムスター上のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニの若虫の、肥育の間［（ｉ）−解剖
前］および肥育後［（ｉｉ）−解剖後］のハムスターの皮膚の研究。マダニ肥育後の発毛は、コントロールハムスターＡにおいては正常であり、そ
して６４ｔｒｐ免疫ハムスターにおいては非常に遅く、矢印ａによって示される
脱毛領域を有する。これは、６４ｔｒｐ免疫ハムスター上のＩ．ｒｉｃｉｎｕｓ
マダニの肥育の間に生じる局所的な炎症性免疫応答に起因し、これは矢印ｃ、ｄ
およびｅによって示される；ｃ＝解剖された皮膚の皮下組織において紅斑として
見られる種々の程度の炎症を示す、放置されたマダニ肥育部位；ｄ＝拡大した前
肩甲骨リンパ節；ｅ＝放置されたマダニ肥育部位での血清の浸出；ｆ＝コントロ
ールハムスターの放置されたマダニ肥育部位であり、この皮下組織および前肩甲
骨リンパ節は、正常のようである。ｂ＝肥育したＩ．ｒｉｃｉｎｕｓマダニの若
虫；コントロールハムスター上でのマダニの肥育は、６４ｔｒｐ免疫ハムスター
での肥育と比較して、６時間延長した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者パーセン，グイドクリスティアンイギリス国オーエックス２６ディービーオックスフォード，ジェリコー，キングストリート１，ガイコート，フラット２ (72)発明者ナットール，パトリシアアンイギリス国オーエックス14 ４エヌピーオクソン，カラム，マナーファーム１Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA04 CA05 CA09 DA06 EA02 EA04 GA11 GA19 HA03 HA14 4C085 AA03 BB11 CC05 CC21 DD61 EE01 EE06 4H045 AA10 AA11 BA10 CA51 DA75 EA29 FA71

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、免疫原性マダニ
セメントタンパク質、該タンパク質のフラグメント、またはそれらの機能的等価
物を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】請求項１に記載の組成物であって、ここで前記マダニセメン
トタンパク質、該タンパク質のフラグメント、またはそれらの機能的等価物が、
免疫原性エピトープを含み、該免疫原性エピトープが、該免疫原性セメントタン
パク質、該フラグメント、または該機能的等価物が由来する、マダニ種以外の吸
血外寄生生物種の１つ以上のオーソロガスセメントタンパク質に存在する、組成
物。
【請求項３】請求項１または２に記載の組成物であって、ここで前記マダ
ニセメントタンパク質が、免疫原性エピトープを含み、該免疫原性エピトープが
また、吸血外寄生生物の腸タンパク質に存在する、組成物。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物であって、ここ
で前記吸血外寄生生物が、マダニ、蚊、ヒル、アブ、ツェツェバエ、ノミ、シラ
ミ、またはダニである、組成物。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物であって、該組
成物が前記吸血外寄生生物の成体形態および未熟な形態の両方に対して効果的で
ある、組成物。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物であって、ここ
で前記マダニセメントタンパク質が、マダニ種Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓａ
ｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ
ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓ、Ｂ．ａｎ
ｎｕｌａｔｕｓ、Ｉｘｏｄｅｓｒｉｃｉｎｕｓ、Ｉ．ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ
、およびＩ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓのいずれか１つに由来する、組成物。
【請求項７】前記マダニセメントタンパク質が、マダニＲ．ａｐｐｅｎｄ
ｉｃｕｌａｔｕｓに由来する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物であって、該組
成物が、クローン２１、クローン３３、ＣｅｍＡ、クローン２４、クローン６８
、クローン６４、およびクローンＩタンパク質、またはこれらのフラグメントの
いずれか１つを活性成分として含む、組成物。
【請求項９】請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物であって、該組
成物が、６４ｔｒｐセメントタンパク質、または該タンパク質のフラグメント、
またはこれらの機能的等価物を活性成分として含む、組成物。
【請求項１０】請求項９に記載の組成物であって、ここで前記フラグメン
トが、６４ｔｒｐ１、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ３、６４ｔｒｐ４、６４ｔｒｐ
５、または６４ｔｒｐ６、あるいはこれらの機能的等価物のいずれか１つである
、組成物。
【請求項１１】前記フラグメントが、６４ｔｒｐ２、６４ｔｒｐ６、また
はこれらの機能的等価物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】前記マダニセメントタンパク質が、組換え形態において発
現される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】第２の活性因子をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか
１項に記載の組成物。
【請求項１４】請求項１３に記載の組成物であって、ここで前記第２の活
性因子が、吸血外寄生生物に由来する第２の免疫原性タンパク質、またはタンパ
ク質フラグメントである、組成物。
【請求項１５】アジュバントをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１
項に記載の組成物。
【請求項１６】マダニセメントタンパク質と反応する、抗体また抗血清。
【請求項１７】請求項１３に記載の抗体また抗血清であって、ここで前記
マダニセメントタンパク質が、請求項１〜１２のいずれか１つに挙げられる、セ
メントタンパク質、フラグメント、または機能的等価物のいずれかである、抗体
また抗血清。
【請求項１８】請求項１６または１７のいずれかに記載の抗体また抗血清
の産生方法であって、該方法が請求項１〜１５のいずれか１つに挙げられるワク
チン組成物で動物を免疫する工程を包含する、方法。
【請求項１９】吸血外寄生生物に対して動物を免疫する方法であって、請
求項１〜１５のいずれか１つに挙げられるワクチン組成物を前記動物に投与する
工程を包含する、方法。
【請求項２０】ワクチンにおける使用のためのマダニセメントタンパク質
、該タンパク質のフラグメント、またはこれらの機能的等価物。
【請求項２１】ワクチンの成分としてのマダニセメントタンパク質の使用
。