MXPA03002853A

MXPA03002853A - Glicoformas del factor vii.

Info

Publication number: MXPA03002853A
Application number: MXPA03002853A
Authority: MX
Inventors: Niels Kristian Klausen
Original assignee: Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-10-02
Publication date: 2005-05-16
Also published as: WO2002029045A2; US20050075289A1; US20020137673A1; JP2004510439A; ES2344887T3; WO2002029084A2; JP2004510436A; NO20031471D0; HUP0301245A3; CN1468303A; AU2001291653A1; PL361017A1; IL154879A0; CA2422216C; ATE425254T1; WO2002029084A3; KR100861470B1; CN1468303B; DE60141908D1; EP1356074A2

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden el Factor VII y otros factores de coagulacion de la sangre que tienen patrones alterados de glicosilacion ligada a asparagina.

Description

GLICOFORMAS DEL FACTOR VII Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones que comprenden el Factor VII y otros factores de coagulación sanguínea que tienen patrones alterados de glicosilación ligado a la asparagina.

Antecedentes de la Invención Las proteínas involucradas en la cascada de coagulación, que incluyen por ejemplo, el Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X y Proteina C, se proporcionan por ser agentes terapéuticos empleados para tratar una variedad de condiciones patológicas. En consecuencia, existe una necesidad creciente por formulaciones que comprenden estas proteínas que son farmacéuticamente aceptables y presentan una eficacia clínica predeterminada y uniforme. Debido a las muchas desventajas de usar plasma humano como una fuente de productos farmacéuticos, se prefiere producir estas proteínas en sistemas recombinantes . Las proteínas de coagulación sin embargo, son sometidas a una variedad de modificaciones co- y post-traduccionales que incluyen por ejemplo, glicosilación ligada a la asparagina (N- REF. : 145872 ligada) ; glicosilación O-ligada; y ?-carboxilación de residuos glu. Estas modificaciones pueden ser cualitativamente o cuantitativamente diferentes cuando las células heterólogas son usadas como hospederas para producción de las proteínas a gran escala. En particular, la producción en células heterólogas a menudo resulta en un arreglo diferente de glicoformas, los cuales son polipéptidos idénticos que tienen estructuras de oligosacéridos ligados covalentemente diferentes . En diferentes sistemas, las variaciones en la estructura de oligosacárido de proteínas terapéuticas han sido ligadas a, inter alia, cambios en la inmunogenidad y realización in vivo. De este modo, existe una necesidad en la técnica para composiciones y métodos que proporcionen preparaciones de proteínas de coagulación, particularmente preparaciones que comprenden el Factor VII humano recombinante, Factor VII modificado, o polipéptidos relacionados con el Factor VII, que contienen patrones de glico forma predeterminadas.

Sumario de la Invención La presente invención se refiere a preparaciones que comprenden los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII que presentan patrones predeterminados de glicoformas. Como se usa aqui, una preparación del Factor VII o relacionada con el Factor VII, se refiere a una pluralidad de polipéptidos del Factores VII o relacionados con el Factor VII, que incluyen variantes y formas químicamente modificadas, así como también formas que han sido proteoliticamente activadas (por ejemplo, Factor Vlla) , que han sido separadas de la célula en la cual fueron sintetizadas. Un patrón de glicoforma se refiere a la distribución dentro de la preparación de cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras variantes que están covalentemente ligadas a los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII. En un aspecto, la invención proporciona una preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde aplica uno o más de lo siguiente: (i) entre alrededor de 94-100% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de ácido siálico; (ií) entre alrededor de 0-7% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutral; (ii) menos de alrededor de 16%, tal como por ejemplo, entre alrededor de 6- 16% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de galactosa terminado; (iv) menos de alrededor de 25%, tal como por ejemplo, alrededor de 6-9% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo N-acetilgalactosamina terminal; (o) (v) menos de alrededor de 30%, tal como por ejemplo, entre alrededor de 11-23% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de galactosa terminal o N-acetilgalactosamina . En algunas modalidades, además de uno o más de (i)-(v): todos los residuos de ácido siálico en las cadenas de oligosacáridos están ligados a la galactosa via un enlace oc2->3; al menos algunos de los residuos de ácido siálico comprende ácido N-glicolilneuraminico (NeuSGc) , además del ácido N-acetilneuramínico (NeuSAc) ; y/o las cadenas de oligosacáridos que comprenden residuos de fucosa ligados a al->6 hasta un núcleo de N-acetilglucosamina . En una modalidad, la invención abarca una preparación que comprende el Factor Vlla de tipo nativo, en la cual entre alrededor de 94-100% de las cadenas de oligosacáridos tienen al menos un residuo de ácido siálico y todos los residuos de ácido siálico están ligados a la galactosa via un enlace oc2->3. En otra modalidad, la invención abarca una preparación que comprende el Factor Vlla de tipo nativo, en la cual entre alrededor de 94-100% de las cadenas de oligosacáridos tienen al menos un residuo de ácido siálico y al menos alguno de los residuos de ácido siálico son ácido N-glicolilneuramínico . En aún otra modalidad, la invención abarca una preparación que comprende un Factor VIIa del tipo nativo en el cual, entre alrededor de 94-100% de las cadenas de oligosacáridos tienen al menos un residuo de ácido siálico y al menos algunas de las cadenas contienen N-acetilgalactosamin . Las preparaciones de la presente invención de este modo, no abarcan el Factor VII de tipo nativo o Factor Vlla que ha sido aislado a partir del plasma humano y no ha sido modificado ex vivo por tratamiento de glicosidasa . En otro aspecto, la invención proporciona una preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a las asparaginas y en donde al menos alrededor de 2% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una fucosa ligada ocl->3 a un residuo de N-acetilglucosamina antenaria (es decir, un residuo de N-acetilglucosamina que está ligado ß1->2,4, ó 6 a un residuo Man) . Preferiblemente, al menos alrededor de 5% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos uno de tales residuos de fucosa antenaria; más preferiblemente al menos alrededor de 10% ó 20%; y más preferiblemente al menos alrededor de 40%. Las preparaciones de conformidad con la invención pueden comprender uno o más del Factor VII de tipo nativo no modificado; Factor VII del tipo nativo que ha sido sometido a modificación química y/o enzimática; y variantes del Factor VII que tienen una o más alteraciones en la secuencia de aminoácido con relación al Factor VII de tipo nativo. Las preparaciones de la invención pueden derivarse de células humanas que expresan el Factor VII a partir de un gen del Factor VII endógeno o de células programadas para expresar el Factor VII o un polipéptido relacionado con el Factor VII de un gen recombinante . En otro aspecto, la invención proporciona preparaciones que comprenden polipéptidos del Factor VII o relacionados con el Factor VII que presentan una o más propiedades funcionales mejoradas que incluyen, sin limitación, estabilidad incrementada de almacenamiento, biodisponibilidad, y/o vida media. En otro aspecto, la invención abarca métodos para determinar y/o optimizar el patrón de glicoforma de polipéptidos del Factor VII y relacionados con el Factor VII, los cuales se llevan a cabo por las etapas de: (a) cultivar una célula que expresa polipéptidos del Factor VII o relacionados con el Factor VII bajo una primera serie de condiciones de cultivos predeterminadas; (b) recuperar el polipéptido del Factor VII o relacionado con el Factor Vil a partir del cultivo para obtener una preparación que comprende los polipéptidos; y (c) analizar la estructura de los oligosacáridos ligados a los polipéptidos para determinar el patrón de glicoforma de la preparación. Los métodos pueden además comprender alterar las condiciones de cultivo de la etapa (a) para lograr una segunda serie de condiciones de cultivo predeterminadas; y repetir las etapas hasta que se logra un patrón de glicoforma deseado. Alternativamente, los métodos pueden además comprender tratar la preparación químicamente o enzimáticamente para alterar la estructura de oligosacárido; y repetir las etapas hasta que se logra un patrón de glicoforma deseado. Además, los métodos pueden comprender las etapas adicionales para someter preparaciones que tienen patrones de glicoformas predeterminadas al menos en una prueba de bioactividad u otra funcionalidad (tal como por ejemplo, perfil o estabilidad f rmacocinético ) , y correlacionar los patrones de glicoformas particulares ccn perfiles de bioactividad o funcionalidad particulares . En otro aspecto, la invención proporciona métodos para producir una preparación que comprende polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, que tienen un patrón predeterminado de glicosilación N-ligada. En algunas modalidades, los métodos se llevan a cabo cultivando una célula que expresa los polipéptidos bajo condiciones en las cuales al menos alrededor de 94% de los oligosacáridos ligados a la asparagina, ligados a los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII comprenden al menos un residuo de ácido siálico, por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro residuos de ácido siálico. En algunas modalidades, los métodos se llevan a cabo cultivando una célula que expresa los polipéptidos bajo condiciones en las cuales al menos alrededor de 5% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una fucosa ligada l->3 a un residuo de N-acetilglucosamina antenaria. En algunas modalidades, los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, independiente de su fuente, son sometidos a tratamientos enziméticos para lograr el patrón de glicoforma deseado. En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden las preparaciones de la invención y métodos para prevenir y/o tratar síndromes que son responsables de los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII. Los métodos comprenden administrar las formulaciones f rmacéuticas a un paciente en necesidad del tratamiento bajo condiciones que resultan en ya sea un mejoramiento o inhibición en la coagulación de la sangre. En una serie de modalidades, las preparaciones del Factor VII se administran cuando se desea mejorar la coagulación de la sangre, tal como por ejemplo, en hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del Factor XI, deficiencia del Factor VII, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand; en síndromes acompañados por la presencia de un inhibidor del factor de coagulación; antes, durante o después de la cirugía o terapia anticoagulante o después del trauma. En otra serie de modalidades, las preparaciones de polipéptidos relacionados con el Factor VII (es decir, preparaciones que tienen bioactividad reducida o modificada con relación al Factor VII del tipo nativo) , se administran para reducir la coagulación sanguínea tal como, por ejemplo, en pacientes sometidos a angioplastía o aquellos que sufren de trombosis de la vena profunda, embolia pulmonar, apoplejía, coagulación intravascular diseminada (CID) , deposición de fibrina en pulmones y ríñones asociada con endotoxemia gram-negativa o infarto miocardial. De conformidad con la invención, las preparaciones de los polipéptidos relacionados con el Factor VII pueden también ser administradas cuando se desea modificar como por ejemplo, reducir, la señalización intracelular vía una trayectoria mediada por el factor del tejido (FT), para tratar condiciones como por ejemplo, Síndrome de Angustia Respiratoria Aguda (SARA) , Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SRIS), Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), Deficiencia Múltiple de órgano (DMO), y trombocitopenia púrpura (TTP) .

Descripción Detallada de la Invención Los presentes inventores han descubierto que las preparaciones de proteínas de coagulación que tienen patrones de glicoformas predeterminados presentan propiedades funcionales mejoradas. En consecuencia, la presente invención se refiere a métodos y composiciones que proporcionan estas preparaciones de proteínas. En particular, la invención se refiere a preparaciones que comprenden polipéptidos del Factor VII y polipéptidos relacionados con el Factor VII que tienen patrones predeterminados específicos de oligosacáridos ligados a asparagina (N-ligados) . Las preparaciones de la invención presentan propiedades alteradas, que incluyen sin limitación, propiedades farmacocinéticas mejoradas y eficacia clínica mejorada. La invención también abarca formulaciones farmacéuticas que comprenden estas preparaciones, así como también métodos terapéuticos que utilizan las formulaciones.

Polipéptidos del Factor VII y Polipéptidos Relacionados con el Factor VII La presente invención abarca polipéptidos del Factor VII humano, tal como por ejemplo, aquellos que tienen la secuencia de aminoácido descrita en la Patente Estadounidense No. 4,784,950 (Factor VII de tipo nativo). Como se usa aquí, 'Factor VII" o ¾polipéptido del Factor VII" abarca el Factor VII de tipo nativo, así como también variantes del Factor VII que presentan substancialmente la misma o mejorada actividad biológica con relación al Factor VII de tipo nativo. El término "Factor VII" está propuesto para abarcar los polipéptidos del Factor VII en su forma no desdoblada (zimógeno), así como también aquellos que han sido proteolíticamente procesados para proporcionar sus formas bíoactivas respectivas, las cuales deben ser el Factor Vlla designado. Típicamente, el Factor VII es desdoblado entre los residuos 152 y 153 para proporcionar el Factor Vlla. Como se usa aquí, "polipéptidos relacionados con el Factor VII", abarca polipéptidos , incluyendo variantes, en las cuales la actividad biológica del Factor Vlla se ha modificado substancialmente o reducido con relación a la actividad del Factor Vlla de tipo nativo. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el Factor VII o Factor Vlla que ha sido químicamente modificado y las variantes del Factor VII en las cuales se han introducido las alteraciones de secuencia de aminoácido específico que modifican o alteran la bioactividad del polipéptido. La actividad biológica del Factor Vlla en la coagulación sanguínea deriva de su habilidad para (i) enlazarse al factor del tejido (FT) y (ii) catalizar el desdoblamiento proteolítico del Factor IX o Factor X para producir el Factor IX ó X activado (Factor IXa ó Xa, respectivamente). Para propósitos de la invención, la actividad biológica del Factor Vlla puede ser cuantificada midiendo la habilidad de una preparación para promover la coagulación sanguínea usando plasma deficiente del Factor VII y tromboplastina, como se describe por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5,997,864. En este ensayo, la actividad biológica está expresada como la reducción en el tiempo de coagulación con relación a una muestra de control y es convertida a "'unidades del Factor VII" por comparación con un estándar de suero humano combinado que contiene 1 unidad/ml de actividad del Factor VII. Alternativamente, la actividad biológica del Factor Vlla puede ser cuantificada (i) midiendo la habilidad del Factor Vlla para producir el Factor Xa en un sistema de ensayo que comprende el FT embebido en una membrana lipida y el Factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) midiendo la hidrólisis del Factor X en un sistema acuoso (véase, Ejemplo 5 abajo) ; (iii) midiendo su enlace fisico a TF usando un instrumento a base de una resonancia de plasmon de superficie (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997) (iv) midiendo la hidrólisis de un substrato sintético (véase, Ejemplo 4 abajo); y (v) midiendo la generación de trombina en un sistema in vitro independiente del FT. Variantes del Factor VII que tienen substancialmente la misma o mejorada actividad biológica con relación al Factor Vlla del tipo nativo, abarcan aquellos que presentan al menos alrededor de 25%, preferiblemente al menos alrededor de 50%, más preferiblemente al menos alrededor de 75% y más preferiblemente al menos alrededor de 90% de la actividad especifica del Factor Vlla de tipo nativo que se ha producido en el mismo tipo celular, cuando se somete a prueba en uno o más ensayos de coagulación, ensayos de proteólisis, o ensayos de enlace al FT como se describe anteriormente. Las variantes del Factor VII que tienen substancialmente actividad biológica reducida con relación al Factor Vlla de tipo nativo, son aquellas que presentan menos de alrededor de 25%, preferiblemente menos de alrededor de 10%, más preferiblemente menos de alrededor de 5% y más preferiblemente menos de alrededor de 1% de la actividad especifica del Factor VI la del tipo nativo que se ha producido en el mismo tipo celular cuando se somete a prueba en uno o más de los ensayos de coagulación, ensayos de proteólisis o ensayo de enlace del FT como se describe anteriormente. Las variantes del Factor VII que tienen una actividad biológica substancialmente modificada con relación al Factor VII del tipo nativo incluyen, sin limitación, variantes del Factor VII que presentan actividad proteolitica del Factor X independiente de FT y aquellos que se enlazan al FT pero no desdoblan el Factor X. Las variantes del Factor VII, si presentan substancialmente la misma o mejor bioactividad que el Factor VII del tipo nativo o, alternativamente, que presentan bioactividad relativa substancialmente modificada o reducida al Factor VII de tipo nativo, incluyen sin limitación, los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido que difiere de la secuencia del tipo Factor VII de tipo nativo por inserción, supresión o substitución de uno o más aminoácidos. Los ejemplos no limitantes de las variantes del Factor VII que tienen substancialmente la misma actividad biológica como el Factor VII de tipo nativo incluyen S52A-FVlla, S60A-FVIIa (lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998); Las variantes FVIIa que presentan estabilidad proteolítica plegada como se describe en la Patente Estadounidense No. 5, 580, 560; el Factor Vlla que se ha desdoblado proteolíticamente entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); y formas oxidadas del Factor Vlla (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999). Ejemplos no limitantes de las variantes del Factor VII que tienen actividad biológica substancialmente reducida o modificada al Factor VII de tipo nativo incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 25:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y Factor Vlla que carece del dominio Gla, (Nico-laisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993). Ejemplos no limitantes de los polipéptidos del Factor VII químicamente modificados y variantes de secuencia se describen por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5, 997, 864.

Glicosilación Ligada a la Asparagina La presente invención proporciona preparaciones de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII que comprenden un espectro particular de glicoformas del Factor VII, es decir, polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII que tienen patrones predeterminados de cadenas de oligosacáridos ligados a la asparagina (N-ligados). Como se usa aqui, un ¾patrón" de glicosilación N-ligada o un 'patrón" de glicoforma, T distribución" o ¦"espectro", se refiere a la representación de estructuras de oligosacáridos particulares dentro de una población dada de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII. Los ejemplos no limitantes de tales patrones incluyen proporción relativa de cadenas de oligosacáridos que (i) tienen al menos un residuo de ácido siálico; (ii) carecen de alguno de los residuos de ácido siálico (es decir, son neutrales en carga) ; (iii) tienen al menos un residuo de galactosa terminal; (iv) tienen al menos un residuo de acetilgalactosamina N-terminal; (v) tienen la menos una antena "no cubierta", es decir, tienen al menos un residuo de galactosa terminal o N-acetilgalactosamina; o (iv) tienen al menos una fucosa ligada ocl->3 a un residuo de N-acetilglucosamina antenaria. Como se usa aquí, una cadena de oligosacárido se refiere a la estructura completa de oligosacárido que está covalentemente ligado a un residuo de asparagina único. El Factor VII es normalmente glicosilado en Asn 145 y Asn 322. Una cadena de oligosacárido N-ligada presente en el Factor VII producido en un humano in situ, puede ser bi, tri o tetraantenario, con cada antena que tiene la estructura Neu5Ac (a2->3 ó ot2->6) Gal (ß1->4) GlcNAc ligada (ß1->2, 4 ó 6) a un residuo Man el cual está ligado (al->3 o 6) a Man (ß1->4) GlcNAc (ß1->4) GlcNAc-Asn. (Neu5Ac significa ácido N~ acetilneuramínico (ácido siálico) , Gal significa galactosa, GlcNAc significa N-acetilglucosamina y Man significa mañosa) . Las cadenas de oligosacáridos pueden también comprender residuos de fucosa, los cuales pueden estar ligados l->6 a GlcNAc. Cuando el Factor VII se produce en un humano in situ, algunas de las cadenas de oligosacáridos carecen de residuos de fucosa nuclear; todas las cadenas carecen de residuos de fucosa antenaria; y todas las cadenas son casi completamente síaliladas, es decir, el azúcar terminal de cada cadena es el ácido N-acetilneuramínico ligado a la galactosa vía un enlace a2->3 ó 2->6. Cuando se producen en otras circunstancias sin embargo, el Factor VII puede contener cadenas de oligosacáridos que tienen diferentes estructuras terminales en una o más de sus antenas, tal como por ejemplo, que carecen de residuos de ácido siálico; que contienen residuos de ácido N-glicolilneuraminico (Neu5Gc) ; que contienen un residuo de N-acetilgalactosamina terminal (GalNAc) en lugar de galactosa; y similares. Cuando se producen en por ejemplo, células BHK cultivadas en la presencia de suero bovino, las preparaciones del Factor VII presentan los siguientes patrones de oligosacáridos: - 87-93% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo único de ácido siálico; 7-13% son neutrales (carecen de cualquier ácido siálico) ; - 9-16% contienen al menos un residuo galactosa terminal; 19-29% contienen al menos un residuo N-acetilgalactosamina terminal; y - 30-39% contienen al menos una antena no cubierta, es decir, contienen al menos un residuo de galactosa o N-acetilgalactosamina terminal. Los presentes inventores han producido las preparaciones del Factor VII que contienen patrones de oligosacáridos predeterminados específicos que difieren de aquellos descritos previamente. La presente invención abarca preparaciones que comprenden los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII que presentan uno o más de los patrones de glicoformas siguientes: (i) Entre alrededor de 94-100% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico, tal como por ejemplo, entre alrededor de 94-99%, entre alrededor de 95-98%, o entre alrededor de 96-97%. En diferentes modalidades, al menos alrededor de 94%, 95%, 96% o 97% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico. (ii) 6% o menos de las cadenas de oligosacáridos son neutrales, tal como por ejemplo, entre alrededor de 1.5-6% o entre alrededor de 2-4%. (iii) Menos de alrededor de 16%, preferiblemente, menos de alrededor de 10% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una galactosa terminal, tal como por ejemplo, entre alrededor de 6-10% o entre alrededor de 8-9%. (iv) Menos de alrededor de 25%, preferiblemente menos de alrededor de 10% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo GalNAc terminal tal como por ejemplo, entre alrededor de 6-9% o entre alrededor de 7-8%; (v) Menos de alrededor de 30, preferiblemente menos de alrededor de 25% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una antena no cubierta, tal como por ejemplo, entre alrededor de 11-23% o entre alrededor de 12-18%; y (vi) Al menos alrededor de 2%, preferiblemente al menos alrededor de 5%, más preferiblemente al menos alrededor de 10% o 20%; y más preferiblemente, al menos alrededor de 40%, de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una fucosa ligada otl->3 a un residuo de N-acetilglucosamina antenario (es decir, un residuo de N-acetilglucosamina que está ligado ß1->2,4 ó 6 a un residuo Man) . Se entenderá que cada uno de (i) -(vi) puede representar un patrón de glicoforma distinto que está abarcado por la presente invención, es decir, una preparación de conformidad con la invención puede ser descrita solamente por uno de (i) -(vi). Alternativamente, dependiendo del patrón de glicoforma particular, una preparación abarcada por la invención puede ser descrita por más de uno de (i)-(iv) . Además, una preparación abarcada por la invención puede ser descrita por uno o más de (i) -(vi) en combinación con uno o más de otras características estructurales. Por ejemplo, la invención abarca preparaciones que comprenden los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII en los cuales, los residuos de ácido siálico (NeuSAc o Neu5Gc) están ligados a la galactosa exclusivamente en una configuración a2->3. La invención también abarca preparaciones que comprenden los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII que contienen fucosa ligada a ->6 a un núcleo de N-acetilglucosamina y/o fucosa ligada a al->3 a una N-acetilglucosamina antenaria. En una serie de modalidades, las preparaciones de la invención abarcan polipéptidos del Factor VII o relacionados con el Factor VII en el cual, más de 99% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico y (a) los residuos de ácido siálico están ligados exclusivamente en una configuración a2->3 y/o (b) hay residuos de fucosa ligados a núcleos de N-acetilglucosaminas y/o (c) un número detectable de antena termina en N-acetilgalactosamina . En una modalidad, la invención abarca preparaciones que comprenden el Factor Vlla de tipo nativo en el cual, más de 99% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico y los residuos de ácido siálico están ligados a galactosa exclusivamente en una configuración a2->3. En otra modalidad, la invención abarca preparaciones que comprenden el Factor Vlla de tipo nativo, en el cual, más del 99% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico y al menos alguna de las cadenas de oligosacáridos comprende N-acetilgalactosamina . La presente invención no abarca el Factor VII de tipo nativo o Factor Vlla de tipo nativo que está aislado del plasma humano y no es modificado ex vivo por el tratamiento con glicosidasas . En una modalidad, la preparación del Factor Vlla comprende cadenas de oligosacáridos que tienen una sola fucosa ligada l->3 a una N-acetilglucosamina antenaria. En otra modalidad, la preparación del Factor Vlla comprende cadenas de oligosacáridos que tienen residuos de fucosa ligados <xl>3 a cada una de las N-acetilglucosaminas antenarias de un oligosacárido biantenario (Estructura Le is X de Sialilo) . En otra modalidad, la preparación del Factor Vlla comprende cadenas de oligosacáridos que tienen (i) una fucosa ligada a un núcleo de N-acetilglucosamina y (ii) una fucosa única ligada l->3 a una N-acetilglucosamina antenaria. En otra modalidad, la preparación del Factor Vlla comprende cadenas de oligosacáridos que tienen (i) una fucosa ligada a un núcleo de N-acetilglucosamina y (ii) residuos de fucosa ligados l->3 a cada N-acetilglucosamina antenaria de un oligosacárido biantenario . En la práctica de la presente invención, el patrón de oligosacáridos N-ligados puede ser determinado usando cualquier método conocido en la técnica, que incluye sin limitación: cromatografía liquida de alta resolución (CLAR) ; electrofóresis capilar (EC) ; resonancia magnética nuclear (RMN) ; espectrometría de masas (EM) , usando técnicas de ionización tal como bombardeo rápido de átomos, electrorocio o desorpción láser asistida por matriz (MALDI) cromatografía de gas (CG) ; y tratamiento con exoglicosidasas en conjunto con intercambio aniónico (IA)-CLAR, cromatografía de exclusión de tamaño (CET) , o EM. Véase por ejemplo, Weber et al., Anal . Biol. Chem. 225:135 (1995); Klausen et al., J. Chromatog. 718:195 (1995); Morris et al., en Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen et al., eds . , Marcel Dekker, (1990), pp 137-167; Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990); Sutton et al., Anal Biochem. 318:34 (1994); Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994) . Después de la resolución de las cadenas de oligosacáridos derivadas del Factor VII usando cualquiera de los métodos anteriores (o cualquier otro método que resuelve las cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras diferentes), son asignadas las especies resueltas, por ejemplo, a uno de los grupos (i)-(v) . El contenido relativo de cada uno de (i)-(v) es calculado como la suma de los oligosacáridos asignados a tal grupo con relación al contenido total de las cadenas de oligosacáridos en la muestra. Por ejemplo, usando AI-CLAR, 13 ó más picos de oligosacáridos N-ligados pueden ser resueltos a partir de una preparación del Factor VII recom inante producido en las células BHK. Véase por ejemplo, Klausen et al., Mol . Biotechnol. 9:195, 1998. Cinco de los picos (designados 1-5 en Klausen et al.) no contienen ácido siálico, mientras ocho de los picos (designados 6, 7 y 10-15) no contienen ácido siálico . Se entenderá que, en análisis dados, el número y distribución de cadenas que carecen de ácido siálico y que contienen ácido, pueden depender (a) del polipéptido a ser expresado; (b) el tipo celular y condiciones de cultivo; y (c) el método de análisis que es empleado y que los patrones resultantes pueden en consecuencia, variar. En cualquier caso, una vez que los oligosacáridos que contienen ácido siálico han sido resueltos a partir de los oligosacáridos que no contienen ácido siálico, son usados los programas de análisis de datos convencionales para calcular el área bajo cada pico; el área de pico total; y el porcentaje del área de pico total representado por un pico particular. De esta manera, para una preparación dada, la suma de las áreas de picos que contienen ácido siálico/área total de pico X 100 proporciona el % del valor de sililación para la preparación de conformidad con la presente invención (es decir, la proporción de cadenas de oligosacáridos que tienen al menos un residuo de ácido siálico) . De una manera similar, se puede calcular el ¾ de cadenas sin ácido siálico o al menos una galactosa o N-acetilglucosamin .

Métodos para Producir las Preparaciones del Factor VII Que Tienen un Patrón Predeterminado de Oligosacáridos N-ligados Las preparaciones del Factor VII, variantes del Factor VII, o polipéptidos relacionados con el Factor VII, cado uno que tiene un patrón predeterminado de oligosacáridos N-ligados, puede ser producido usando cualquiera de las células hospederas apropiadas que expresan el Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII. Células Hospedantes: En algunas modalidades, las células hospedantes son células humanas que expresan un gen endógeno del Factor VII. En estas células, el gen endógeno puede estar intacto o puede haber sido modificado in situ, o una secuencia fuera del gen del Factor VII puede haber sido modificada in situ para alterar la expresión del gen endógeno del Factor VII. Se puede usar cualquier célula humana capaz de expresar un gen endógeno del Factor VII. En otras modalidades, las células hospedantes heterólogas son programadas para expresar el Factor VII humano a partir de un gen recombinante . Las células hospedantes pueden ser células de vertebrado/ de insecto o fúngicas. Preferiblemente, las células son células de mamífero capaces del espectro completo de glicosilación de mamífero N-ligada; glicosilación O-ligada; y ?-carboxilación . Véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 4,784,950. Las líneas celulares de mamífero preferidas incluyen líneas celulares CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), riñon de cría de hámster (BHK) y HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) . Una línea celular BHK preferida es la tk"tsl3 BHK (Waechter y Baserga, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), posteriormente referida como células BHK 570. La línea celular BHK 570 es disponible de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, bajo el número de acceso ATCC CRL 10314. Una línea celular tk~tsl3 BHK es también disponible del ATCC bajo el número de acceso CRL 1632. Además, puede ser usado un número de otras líneas celulares, incluyendo células de Rat Hep I (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Rat Hep 11 (Hepatoma de Rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y DUKX (linea de células CHO) (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4216-4220, 1980). (células DUKX también referidas como células CBX11), y DG44 (línea de células CHO) (Ceii, 33:405, 1983, y So atic Cell and Molecular Genética 12:555, 1986). También son empleadas células 3T3, célula Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras células. En una modalidad particularmente preferida, las células hospedantes son células BHK 21 que han sido adaptadas para crecer en la ausencia de suero y han sido programadas para expresar el Factor VII. En algunas modalidades, las células pueden ser células mutantes o recombinantes que expresan un espectro cualitativamente o cuantitativamente diferente de enzimas de glicosilación (tal como por ejemplo, glicosil transferasas y/o glicosidasas) que el tipo celular a partir del cual se derivan. Las células pueden también ser programadas para expresar otros péptidos o proteínas heterólogos, incluyendo por ejemplo, formas truncadas del Factor VII. En una modalidad, las células hospedantes son células CHO que han sido programadas para co-expresar tanto el polipéptido de Factor VII de interés (es decir, el Factor VII o polipéptido relacionado con el Factor VII) y otro péptido o polipéptido heterólogo tal como por ejemplo, una enzima de modificación o un fragmento del Factor VII. Métodos : La presente invención abarca métodos para producir una preparación que comprende cualquiera de los patrones de glicoformas descritos anteriormente (i) -(vi) y en modalidades adicionales, métodos para optimizar la distribución de glicoforma de polipéptidos del Factor VII o relacionado con el Factor VII. Estos métodos se llevan a cabo por las etapas de: (a) cultivar una célula que expresa polipéptidos del Factor VII o relacionados con el Factor VII bajo una primera serie de condiciones de cultivo predeterminadas; (b) recuperar los polipéptidos del Factor VII o relacionados con el Factor VII, a partir del cultivo para obtener una preparación que comprende los polipéptidos; y (c) analizar la estructura de oligosacáridos ligados a los polipéptidos para determinar un patrón de glicoforma. Los métodos pueden además comprender: (di) alterar las condiciones de cultivo de la etapa (a) para lograr una segunda serie de condiciones de cultivo predeterminadas; (el) repetir las etapas (b)-(dl) hasta que se logra un patrón de glicoforma deseado. Alternativamente, los métodos pueden además comprender (d2) tratar la preparación químicamente y/o enzimáticamente para alterar la estructura de oligosacárido; y (e2) repetir las etapas (b)-(d2) hasta que se logra un patrón de glicoforma deseado. Estos métodos pueden además comprender la etapa de someter preparaciones que tienen patrones de glicoformas predeterminadas por al menos una prueba de bioactividad (incluyendo por ejemplo, coagulación, proteólisis del Factor X o enlace al FT) u otra funcionalidad (tal como por ejemplo, perfil o estabilidad farmacocinética) , y correlacionar patrones de glicoformas particulares con bioactividad particular o perfiles de funcionalidad para identificar un patrón de glicoforma deseado. Las variables en las condiciones de cultivo que pueden ser alteradas en la etapa (di) incluyen sin limitación: la célula de origen tal como por ejemplo, una célula derivada de especies diferentes que las usadas originalmente; o una célula mutante o recombinante que tiene alteraciones en una o más glicosiltransferasas o glicosidasas u otros componentes del aparato de glicosilación (véase Grabenhorst et al., GlycoconjugatG J. 16:81, 1999; Bragonzi et al., Biochem. Biophys. Acta 1474:273, 2000; Weikert, Natuze Biotechnol . 17:1116, 1999); el nivel de expresión del polipéptido; las condiciones metabólicas como por ejemplo, concentración de glucosa o concentración; la ausencia o presencia de suero; la concentración de vitamina K; hidrolizados de proteina, hormonas, micro metales, sales, asi como también parámetros de procesos como temperatura, nivel de oxigeno disuelto y pH. Los tratamientos enzimáticos que pueden ser usados en la etapa (d2) para modificar el patrón de oligosacárido de una preparación incluyen sin limitación, tratamiento con uno o más de sialidasa (neuraminidasa) , galactosidasa, fucosidasa; galactosiltransferasa, fucosiltransferasa, y/o sialiltrans ferasa, en una secuencia y bajo condiciones que logran una modificación deseada en la distribución de cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras terminales particulares. Las glicosiltransferasas son comercialmente disponibles de Calbiochem (La Jolla, CA) y las glicosidasas son comercialmente disponible de Glyko, Inc., (Novato, CA) . En una serie de modalidades, las células hospedantes que expresan el polipéptido del Factor VII o relacionado, son sometidas a condiciones de cultivo especificas en las cuales secretan los polipéptidos del Factor VII glicosilado que tienen el patrón deseado de estructuras de oligosacáridos descritas anteriormente como cualquiera de (i) -(vi). Tales condiciones de cultivo incluyen sin limitación, una reducción en, o completa ausencia de suero. Preferiblemente, las células hospedantes son adaptadas para crecer en la ausencia de suero y son cultivadas en la ausencia de suero tanto en la fase de crecimiento como en la fase de producción. Tales procedimientos de adaptación se describen por ejemplo, en S argenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21"L' Century, E. C. Beuvery et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, pp. 619-623, 1995 (células BHK y CHO) ; Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120, 1997 (células de insecto); Keen, Cytotechnol . 17:203-211, 1995 (células de mieloma) ; Berg et al., Biotechniques 14:972-978, 1993 (células de riñón 293 humano) . En una modalidad preferida, el medio de crecimiento que es agregado a las células no contiene proteina u otro componente que se aisló de un tejido animal o un cultivo de células animal. Véase por ejemplo, el Ejemplo 1 de abajo. Típicamente, además de los componentes convencionales, un medio adecuado para producir el Factor VII contiene la Vitamina K a una concentración entre 0.1-50 mg/litro, el cual es requerido para la ?-carboxilación de residuos de glutamina en el Factor VII. En otra serie de modalidades, las glicoformas de la invención son producidas sometiendo una preparación del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII modificación enzimátíca y/o química de los oligosacáridos ligados contenidos aquí.

Preparaciones del Factor VII Como se usa aquí, una "preparación del Factor VII", se refiere a una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor Vlla o polipéptidos relacionados con el Factor VII, que incluyen variantes y formas químicamente modificadas, que han sido separadas de la célula en la cual fueron sintetizados. La separación de polipéptidos a partir de su célula de origen puede ser logrado por cualquier método conocido en la técnica que incluye sin limitación, remoción del medio de cultivo celular que contiene el producto deseado a partir de un cultivo celular adherente centrifugación o filtración para remover las células no adherentes; y similares. Opcionalmente, los polipéptidos del Factor VII pueden ser además purificados. La purificación puede ser lograda usando cualquier método en la técnica que incluye sin limitación, cromatografía de afinidad, tal como por ejemplo, en una columna de anticuerpo anti-Factor VII (véase por ejemplo, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de exclusión de tamaño; procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfocamiento isoeléctrico preparativo (EIP) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio), o extracción y similares. Véase de manera general, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, Nueva York, 1982; y Protein Purification, J. C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989. Después de la purificación, la preparación preferiblemente contiene menos de alrededor de 10% en peso, más preferiblemente menos de alrededor de 5% y más preferiblemente menos de alrededor de 1% de las proteínas sin el Factor VII derivadas de las células hospedantes. Los polipéptidos del Factor VII y relacionados con el Factor VII pueden ser activados por desdoblamiento proteolítico usando el Factor Xlla u otras proteasas que tienen especificidad similar a la tripsina, tal como por ejemplo, el Factor IXa, kallikrein, Factor Xa, y trombina. Véase por ejemplo, Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, Patente Estadounidense No. 4,456,591; y Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983) . Alternativamente, el Factor VII puede ser activado pasándolo a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal como Mono Q® (Pharmacia) o similares. El Factor VII activado resultante puede entonces ser formulado y administrado como se describe aba o .

Propiedades Funcionales de las Preparaciones del Factor VJI Las preparaciones de los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII que tienen patrones predeterminados de oligosacáridos de conformidad con la invención, presentan propiedades funcionales mejoradas con relación a las preparaciones de referencia. Las propiedades funcionales mejoradas pueden incluir sin limitación, a) propiedades físicas tal como por ejemplo, estabilidad de almacenamiento; b) propiedades farmacocinéticas tal como por ejemplo, biodisponibilidad y vida media; y c) inmunogenidad en humanos . Una preparación de referencia se refiere a una preparación que comprende un polipéptido que es idéntico a aquél contenido en la preparación de la invención a la cual está siendo comparado (tal como por ejemplo, el Factor VII de tipo nativo o una variante particular o forma químicamente modificada) , excepto por presentar un patrón diferente de glicosilación ligada a la asparagina. Por ejemplo, las preparaciones de referencia típicamente comprenden uno o más de los siguientes patrones de glicoformas : (i) menos de alrededor de 93% (tal como por ejemplo, menos de alrededor 92% o menos de alrededor de 90%) de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico; (ii) al menos alrededor de 6% (tal como por ejemplo, al menos alrededor de 7.5% o al menos alrededor de 10%) de las cadenas de oligosacáridos carecen de cualquier ácido siálico (es decir, son neutrales); (iii) al menos alrededor de 10% (tal como por ejemplo, al menos alrededor de 12.5% o al menos alrededor de 15%) de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo galactosa terminal; (iv) al menos alrededor de 15% (tal como por ejemplo, al menos alrededor de 20% o al menos alrededor de 25%) de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo N-acetilgalactosamina terminal; (v) al menos alrededor de 25% (tal como por ejemplo, al menos alrededor de 30% o al menos alrededor de 35%) de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una antena no cubierta (es decir, contienen al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosamina) ; o (vi) niveles esencialmente no detectables (tal como por ejemplo, menos de alrededor de 0.2%) de residuos de fucosa antenarios . La estabilidad de almacenamiento de la preparación del Factor VI puede ser valorada midiendo (a) el tiempo requerido para el 20% de la bioactividad de una preparación para descomponerse cuando se almacena como un polvo seco a 25°C y/o (b) el tiempo requerido para doblar la proporción de los agregados del Factor Vlla en la preparación. En algunas modalidades, las preparaciones de la invención presentan un incremento de al menos alrededor de 30%, preferiblemente al menos alrededor de 60% y más preferiblemente al menos alrededor de 100%, en el tiempo requerido para el 20% de bioactividad para descomponerse con relación al tiempo requerido por el mismo fenómeno en una preparación de referencia, cuando ambas preparaciones son almacenadas como polvos secos a 25°C. Las mediciones de bioactividad se pueden realizar usando cualquier ensayo de coagulación, ensayo de proteólisis, ensayo de enlace al FT o ensayo de generación de trombina independiente del FT . En algunas modalidades, las preparaciones de la invención presentan un incremento de al menos alrededor de 30%, preferiblemente al menos alrededor de 60%, y más preferiblemente al menos alrededor de 100%, en el tiempo requerido para doblar los agregados con relación a una preparación de referencia, cuando ambas preparaciones se almacenan como polvos secos a 25°C. El contenido de agregados se determina por CLAR en permeación en gel en una columna Protein Pack 300 S (7.5 x 300 mm) (Waters, 80013) como sigue. La columna es equilibrada con el Eluente A (0.2 de sulfato de amonio, 5% de isopropanol, pH ajustado a 2.5 con ácido fosfórico, y posteriormente el pH se ajusta a 7.0 con trietilamina) , después de lo cual, se aplican 25 µg de la muestra a la columna. La elución es con el Eluente A a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min por 30 minutos, y la detección se logra midiendo la absorbancia a 215 nm. El contenido de los agregados se calcula como el área de pico de los agregados del Factor Vil/área total de picos del Factor VII (monómero y agregados) . *Biodisponibilidad" se refiere a la proporción de una dosis administrada de una preparación del Factor VII o relacionada con el Factor VII que puede ser detectada en el plasma a tiempos predeterminados después de la administración. Típicamente, la biodisponibilidad es medida en animales de prueba administrando una dosis de entre alrededor de 25-250 µg/kg de la preparación; obteniendo muestras de plasma a tiempos predeterminados después de la administración; y determinando el contenido de polipéptidos del Factor VII o relacionados con el Factor VII en las muestras usando uno o más de los ensayos de coagulación (cualquier bioensayo) , un inmunoensayo o un equivalente. Los datos son típicamente exhibidos gráficamente como [Factor VII] contra tiempo y la biodisponibilidad es expresada como el área bajo la curva (ABC) . La biodisponibilidad relativa de una preparación de prueba se refiere a la relación entre el ABC de la preparación de prueba y aquella de la preparación de referencia. En algunas modalidades, las preparaciones de la presente invención presentan una biodisponibilidad relativa de al menos alrededor de 110%, preferiblemente al menos alrededor de 120%, más preferiblemente al menos alrededor de 130% y más preferiblemente al menos alrededor de 140% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia. La biodisponibilidad puede ser medida en cualquiera de las especies de mamíferos, preferiblemente perro, y los tiempos determinados usados para calcular el ABC pueden abarcar diferentes incrementos de 10 minutos hasta 8 horas. "Vida media" se refiere al tiempo requerido para la concentración de plasma de los polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII para disminuir de un valor particular a la mitad de aquel valor. La vida media puede ser determinada usando el mismo procedimiento como para la biodisponibilidad. En algunas modalidades, las preparaciones de la presente invención presentan un incremento en la vida media de al menos aproximadamente 0.25 horas, preferiblemente al menos alrededor de 0.5 horas, más preferiblemente al menos alrededor de 1 hora, y más preferiblemente al menos alrededor de 2 horas, con relación a la vida media de una preparación de referencia. 'Inmunogenidad" de una preparación se refiere a la habilidad de la preparación, cuando se administra a un humano, para estimular una respuesta inmune perjudicial, sea humoral, celular o ambas. Los polipéptidos del Factor Vlla y polipéptidos relacionados con el Factor Vlla no se conocen por estimular respuestas inmunes detectables en humanos. Sin embargo, en cualquier sub-población humana, pueden existir individuos quienes presentan sensibilidad a proteinas particulares administradas. La inmunogenidad puede ser medida cuanti ficando la presencia de anticuerpos del Factor VII y/o células T responsables del Factor VII en un individuo sensible, usando métodos convencionales conocidos en la técnica. En algunas modalidades, las preparaciones de la presente invención presentan un decremento en inmunogenidad en un individuo sensible de al menos alrededor de 10%, preferiblemente al menos alrededor de 25%, más preferiblemente al menos alrededor de 40% y más preferiblemente al menos alrededor de 50¾, con relación a la inmunogenidad para tal individuo de una preparación de referencia.

Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Uso Las preparaciones de la presente invención pueden ser usadas para tratar cualquier síndrome responsable del Factor VII, tal como por ejemplo, trastornos de sangrado incluyendo sin limitación, aquellos causados por deficiencias del factor de coagulación (por ejemplo, hemofilia A y B o deficiencia de factores de coagulación XI o VII); por trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand, por inhibidores del factor de coagulación, o sangrado excesivo a partir de cualquier causa. Las preparaciones pueden también ser administradas a pacientes en asociación con cirugía u otro trauma o a pacientes que reciben terapia anticoagulante. Las preparaciones comprenden los polipéptidos relacionados con el Factor VII de conformidad con la invención, los cuales tiene bioactividad substancialmente reducida con relación al Factor VII de tipo nativo, pueden ser usados como anticoagulantes tal como por ejemplo, en pacientes que se someten a angioplastia u otros procedimientos quirúrgicos que pueden incrementar el riesgo de trombosis u oclusión de los vasos sanguíneos como ocurre, por ejemplo, en restenosis. Otras indicaciones médicas para las cuales los anticoagulantes se prescriben incluyen, sin limitación, trombosis de la vena profunda, embolia pulmonar, apoplejías, coagulación intravascular diseminada (CID) , deposición de fibrina en pulmones y ríñones asociada con la endotoxemia gram-negativa, infarto al miocardio; Síndrome de Angustia Respiratoria Aguda (SARA) , Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SRIS) , Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) , DMO, y TTP . Las composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones del Factor VII y relacionadas con el Factor VII de conformidad con la presente, están principalmente propuestas para administración parenteral por tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, es decir, intravenosamente, subcutáneamente, o intramuscularmente . Pueden ser administradas por infusión continua o pulsátil. Las composiciones o formulaciones farmacéuticas comprenden una preparación de conformidad con la invención en combinación con, preferiblemente disueltas en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador o diluyente acuoso. Se pueden usar un variedad de portadores acuoso, tal como agua, agua amortiguada, 0.4% de salina, 0.3% de glicina y similares. Las preparaciones de la invención pueden también ser formuladas en preparaciones de liposomas para suministrar o localizar los sitios de lesión. Las preparaciones de liposomas se describen de manera general en por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 4,837,028, 4,501,728, y 4,975,282. Las composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización bien conocidas, convencionales . Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación liofilizada es combinada con una solución acuosa estéril previo a la administración. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables o adyuvantes incluyendo sin limitación, ajuste de pH y agentes amortiguadores y/o agentes ajustadores de la tonicidad, tal como por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. La concentración del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII en estas formulaciones puede variar ampliamente, es decir, desde menos de alrededor de 0.5% en peso, usualmente en o al menos alrededor de 1% en peso a tanto como 15 ó 20% en peso y será seleccionado principalmente por volúmenes fluidos, viscosidades, etc., de conformidad con el modo particular de administración seleccionado. De este modo, una composición farmacéutica típica para infusión intravenosa podría elaborarse hasta contener 250 mi de solución Ringer estéril y 10 mg de la preparación. Los métodos actuales para preparar composiciones parenteralmente administrables serán conocidos o aparentes para aquellos expertos en la técnica y son descritos en más detalle en por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18th. Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990) . Las composiciones que contienen las preparaciones de la presente invención pueden ser administradas por tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un sujeto que ya sufre de una enfermedad, como se describe anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o parcialmente arrestar la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para cumplir esto se define como * cantidad terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para cada propósito dependerán de la severidad de la enfermedad o lesión, así como también el peso y estado general del sujeto. En general, sin embargo, la cantidad eficiente variará desde alrededor de 0.05 mg hasta 500 mg de la preparación por día por un sujeto de 70 kg, con dosificaciones desde alrededor de 1.0 mg hasta alrededor de 200 mg de la preparación por día siendo más comúnmente usada. Se entenderá que determinar una dosificación apropiada puede lograrse usando experimentación de rutina, construyendo una matriz de valores y valorando diferentes puntos en la matriz. El suministro local de las preparaciones de la presente invención, tal como por ejemplo, aplicación tópica, puede llevarse a cabo por ejemplo, por medio de un roció, perfusión, catéteres de doble balón, stent, incorporadas en injertos vasculares o stents, hidrogeles usados para cubrir catéteres de balón, u otros métodos bien establecidos. En cualquier evento, las composiciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad de la preparación suficiente para tratar efectivamente el sujeto. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden además comprender otros agentes bioactivos, tal como por ejemplo, coagulantes o anticoagulantes no relacionados con el Factor VII. Los siguientes ejemplos están propuestos como ilustraciones no limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1: Producción y Análisis de una preparación del Factor VII que presenta un patrón de glicoforma alterado Se realizó el siguiente experimento para producir la preparación del Factor VII que tiene un patrón de glicoforma alterado . I. Producción: Una linea de células BHK transformada con un plásmido que codifica el Factor VII, se adaptó para crecer en un cultivo de suspensión en la ausencia de suero. Las células se propagaron secuencialmente en cultivos giratorios y como el número celular incrementó, el volumen fue gradualmente incrementado por la adición de nuevo medio. Finalmente, 6 1 del cultivo sembrado se inocularon en un bioreactor de producción de 100 litros que contiene portadores macroporos Citoporo 1 (Pharmacia) , después de lo cual las células de suspensión llegaron a ser inmovilizadas en los portadores. El cultivo se mantuvo a 36°C a pH de 6.7-6.9 y a DO de 50%. El volumen en el bioreactor de producción fue gradualmente incrementado por adición de nuevo medio como el número celular se incrementó. Cuando la densidad celular alcanzó aproximadamente 2 x 106 células/ml, la fase de producción se inició y se realizó un cambio de medio cada 24 horas: La agitación se detuvo para permitir la sedimentación de los portadores que contienen las células, y 80% del sobrenadante del cultivo entonces se cosechó y reemplazó con nuevo medio. El sobrenadante del cultivo cosechado se filtró para remover las células no atrapadas y los desechos celulares y fue entonces transferido para procesamiento adicional. Durante la fase de producción, las células alcanzaron 3-6 x 106 células/ml y un titulador de 2-7 mg del Factor Vil/litro.

II. Análisis del patrón de glicofor a del Factor VII recombinante Fueron comparados los patrones de oligosacáridos de las siguientes preparaciones: (a) preparaciones del Factor VII recombinante producidas como se describe en la parte I (n=7) ; y dos preparaciones de referencia; (b) preparaciones del Factor VII recombinante producidas en células BHK en la presencia de suero bovino (n=10) ; y (c) una preparación del Factor VII purificada del plasma humano. Los oligosacáridos N-lígados se liberaron de los polipéptidos por desdoblamiento química (hidrazinólisis, en un GlycoPrep 1000 unit, Oxford GlycoSciences) o por desdoblamiento enzimático (N-glucosidasa F de por ejemplo, Boehringer Mannheim) . Los oligosacáridos liberados se etiquetaron con 2-aminobenzamida (usando un equipo de etiquetación de señal, K-404, Oxford GlycoSciences o Glyko) . Los oligosacáridos etiquetados se analizaron usando CLA de intercambio de aniones en una columna CarboPac PA 100 (4x250 nrai, Dionex, P/N 43055) , con una columna Guard (4x50 mm, Dionex, P/N 43054) . La columna se equilibró con 150 mM de hidróxido de sodio y se eluyó con un gradiente de 0-150 mM de acetato de sodio, 150 mM de hidróxido de sodio. Los oligosacáridos se detectaron usando fluorescencia, con excitación a 330 nm y emisión a 420 nm. Los contenidos relativos de las varias estructuras de oligosacáridos del Factor VII (Klausen et al., 1998), se calcularon como las áreas de pico relativas para los picos de carbohidratos en el análisis de CLAR por intercambio aniónico . Basados en los elementos estructurales de cada oligosacárido, fue asignado uno de los siguientes: (i) cadenas que contienen al menos un ácido siálico; (ii) cadenas que carecen de algún ácido siálico (es decir, neutral); (iii) cadenas que contienen al menos un residuo de galactosa terminal; (iv) cadenas que contienen al menos un residuo N-acetilgalactosamina terminal; y (v) cadenas que contienen al menos una antena no cubierta (es decir, al menos una galactosa terminal o residuo N-acetilgalactosamina) . Finalmente, la suma de los contenidos relativos de las cadenas de oligosacáridos asignadas a cada grupo fue calculada como un porcentaje de las cadenas de oligosacáridos totales. La desviación estándar de esta determinación se calculó por ser 0.08% (variación entre días); 0.7% (variación dia a día); y 0.5% (intervalo 1-100 µg) - Los patrones de glicoformas resultantes son ilustrados en la siguiente tabla: a 93.1-98. 7 1.3-6.9 5. 9-16.4 5 9-8.7 11 .7-23 .9 b 88.3-92. 5 7.5-12.9 9. 4-16.8 19 0-28.6 30 .1-39 .0 c 99.5% <0.5% 2-3% 0% 2-3% Las preparaciones recombinantes del Factor VII producidas de conformidad con este Ejemplo (es decir , en la ausencia de suero) , presentan un patrón de glicoforma que difiere de tanto el patrón de glicoforma del Factor VII recombinante producido en la presencia de suero como del Factor VII nativo aislado del plasma humano. Los oligosacáridos del Factor VII recombinante producidos en la ausencia de suero son sialilado a una extensión superior que aquellos producidos en la presencia de suero y contienen menos cadenas neutrales y menos cadenas que terminan en su galactosa o N-acetilgalactosamina .

III. Biodisponibilidad: Se realizó el siguiente experimento para comparar la biodisponibilidad de dos preparaciones del Factor VII producido como anteriormente (I y II) con aquél de dos preparaciones del Factor VII de referencia (es decir, producido en la presencia del suero) (A y B) . Los grupos de 8 ratas se administraron ya sea una preparación de prueba o una preparación de referencia a una dosis de 25 ?/^ (¾ 100 µg/r t) en amortiguador de glicilglicina (pH 7.4) que contiene cloruro de sodio (7.87 mg/ml), dihidrato de cloruro de calcio (1.48 mg/ml) , manitol (2.5 mg/ml) y polisorbato 80. Las muestras de sangre se retiraron a 10 minutos y 30 minutos después de la administración inicial. El plasma se obtuvo de las muestras y el Factor VII se cuantificó por ELISA. La biodisponibilidad de cada muestra está expresada como el área ajustada de dosis bajo la curva de concentración de plasma para el Factor VII basada en las muestras de 10 y 30 minutos (ABC:0-3o/dosis) . La biodisponibilidad relativa es expresada como la relación entre la media de ABCi0-3o/dosis de la prueba y las muestras de referencia X 100. Los limites de 90¾ de confidencia para la biodisponibilidad relativa se calcularon a partir de los limites del 90% de confidencia para diferencias entre preparaciones .

Los resultados se resumen en la Tabla de abajo (El ¾ de sialilación de cada preparación el cual se midió como se describe anteriormente, está indicado en paréntesis) .

Los resultados indican que aún diferencias relativamente pequeñas en la proporción de cadenas de oligosacáridos que tienen al menos un residuo de ácido siálico tal como por ejemplo, entre 93% y 96 ó 97%, pueden tener un impacto marcado en la biodisponibilidad (incremento de 20-30%) . Un incremento del 10% en el % de sialilación, sin embargo, causa un incremento del 40-50% en la biodisponibilidad.

Ejemplo 2: Análisis de las preparaciones del Factor VII que presentan un patrón de glicoforma alterado El factor VII se produjo como se describe en el Ejemplo 1 anterior, con excepción de que el Factor VII se cosechó de cultivos de 50O-1. El análisis de glicoforma se realizó como se describe en el Ejemplo 1. Se analizaron tres preparaciones independientes (A, B y C) y se compararon con una preparación de referencia (D) . La biodisponibilidad se midió en un modelo de perro como sigue: El experimento se realizó como un estudio de cuatro columnas cruzadas en 12 perros Beagle divididos en cuatro grupos. Todos los animales recibieron cada una de las tres preparaciones de pruebas A, B, y C y la preparación de referencia D a una dosis de ¾90 µ?/kg en un amortiguador de glicilglicina (pH 5.5) que contiene cloruro de sodio (2.92 (mg/ml) , dihidrato de cloruro de calcio (1.47 mg/ml) , manitol (30 mg/ml) y polisorbato 80. Las muestras de sangre se retiraron a 10, 30, y 60 minutos y 2, 3, 4, 6 y 8 horas siguiendo la administración inicial. El plasma se obtuvo de las muestras y el Factor VII se cuantificó por ELISA. La biodisponibilidad de cada muestra está expresada como el área ajustada de dosis bajo la curva de concentración de plasma para el Factor VII (ABC/dosis) . La biodisponiblidad relativa es expresada como la relación entre la media ABC/dosis de la prueba y la preparación de referencia X 100 y se calculó el 90% de limites de confidencia para la biodisponbilidad relativa.

Los resultados se resumen en la Tabla de abajo. El ¾ de sialilación de cada preparación el cual se midió como se describe en el Ejemplo 1 anterior, está indicado en paréntesis .

Los resultados indican que pequeñas diferencias en la proporción de cadenas de oligosacáridos que tienen al menos un residuo de ácido siálico tienen un impacto marcado en la biodisponibilidad del Factor VII. Un 10% de incremento en el % de sialilación causa un 30-50% de incremento en la biodisponibilidad con una relación cerrada a lineal para las tres preparaciones de prueba y la preparación de referencia.

Ejemplo 3: Preparaciones del Factor VII que presentan un patrón de glicoforma alterado Se realizó el siguiente experimento para producir una preparación del Factor VII que tiene un patrón de glicoforma alterado.

I. Construcción de la linea celular y producción del Factor VII: Se ha descrito un vector plásmido pLNl74 para expresión del FVII humano (Person y Nielsen. 1996. FEBS Lett. 385:241-243) . Brevemente, se llevó la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica el FVII humano incluyendo el propéptido bajo el control de un promotor de metalotioneina de ratón para transcripción del ADNc insertado, y el ADNc reductasa hidrofolato de ratón bajo el control de un promotor temprano SV40 para uso como un marcador seleccionable . Para construcción de un vector de plásmido que codifica una secuencia de reconocimiento gama-carboxilación, se usó un vector de clonación (pBluescript II KS+, Stratagene) , que contiene el ADNc que codifica FVII que incluye su propéptido (pLN171). (Persson et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:19919-19924). Una secuencia de nucleótido que codifica un codón de detención se insertó en el ADNc que codifica el FVII después el propéptido de FVII por mutagénesis mediada por PCR inverso usando este vector de clonación. El plásmido de plantilla se desnaturalizó por tratamiento con NaOH, seguido por PCR con polimerasas Pwo (Boehringer-Mannheim) y Taq (Perkin-Elmer ) con los siguientes cebadores: a) 5'-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3' b) 5'-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG GGG CC-3' La mezcla resultante se digirió con Dpnl para digerir el ADN de plantilla residual y se transformó Escheríchia coli con el producto de PCR. Los clones se seleccionaron por la presencia de la mutación por secuenciamiento . El ADNc de un clon correcto se transfectó como un fragmento de BamHI-EcoRI al plásmido de expresión pcDN3 ( Invitrogen) . El plásmido resultante se llamó pLN329. Células CHO Kl (ATCC CCI61) se trans fectaron con cantidades iguales de pLN174 y pLN329 con el método Fugene6 (Boehriner-Mannheim) . Los trans fectantes se seleccionaron por la adición de metotrexato a 1 µ? y G-418 a 0.45 mg/ml . La combinación de transfectantes se clonó limitando la dilución y se midió la expresión FVII de los clones. Un clon de alta producción se subclonó además y se seleccionó un clon Ell con una expresión FVII especifica de 2.4 pg/cel/dia en medio de Eagle modificado de Dulbeco con 10% de suero bovino fetal. El clon se adaptó al cultivo de suspensión libre de suero en un medio CHO cornercialmente disponible (JRH Bioscience) libre de componentes derivados de animales .

Las células adaptadas se propagaron secuencialmente en cultivo giratorios y como el número celular se incrementó, el volumen fue gradualmente incrementado por adición de nuevo medio. Después de 25 días, se inocularon 6 1 del cultivo giratorio en un bioreactor de 50 litros. Las células se propagaron en el bioreactor y como el número celular se incrementó/ el volumen se incrementó gradualmente por adición de nuevo medio. Finalmente, 50 L de cultivo sembrado se inocularon en un bioreactor de producción de 500 litros que contiene portadores macroporos Citoporo 1 (Pharmacia) , después de lo cual las células de suspensión llegaron a ser inmovilizadas en los portadores. El cultivo se mantuvo a 36°C a pH de 7.0-7.1 y una Tensión de Oxigeno Disuelto (TOD) de 50% de saturación. El volumen en el bioreactor de producción fue gradualmente incrementado por adición de nuevo medio como el número celular se incrementó. Cuando la densidad celular alcanzó aproximadamente 10-12 x 105 células/ml, la fase de producción se inició y se realizó un cambio de medio cada 24 horas: la agitación se detuvo para permitir la sedimentación de los portadores que contienen las células, y 80% del sobrenadante del cultivo entonces se cosechó y reemplazó con nuevo medio. El sobrenadante del cultivo cosechado se filtró para remover las células no atrapadas (es decir, las células que no fueron inmovilizadas en portadores) y los desechos celulares y fue entonces transferido para procesamiento adicional. Durante la fase de producción, las células alcanzaron 2-3 x 107 células/ml y un titulador de 8 rag del Factor Vil/litro.

II. Análisis de Glicoformas A. El patrón de oligosacárido de una preparación del Factor VII producida como se describe anteriormente (a) se comparó con aquellas de (b) preparaciones del Factor VII recombinante producidas en células BHK en la presencia de suero bovino y (c) una preparación del Factor VII purificada de plasma humano. Los métodos usados fueron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 1 abajo. Las asignaciones de oligosacáridos son como sigue: (i) cadenas que contienen al menos un ácido siálico; (ii) cadenas que carecen de algún ácido siálico (es decir, neutral); (iii) cadenas que contienen al menos un residuo de galactosa terminal; (iv) cadenas que contienen al menos un residuo N-acetilgalactosamina terminal; y (v) cadenas que contienen al menos una antena no cubierta (es decir, al menos una galactosa terminal o residuo N-acetilgalactosamina) . (i) (ü) (iü) (iv) (v) a 95.2 4.8 22.9 0.1 23.0 b 88.3-92.5 7.5-12.9 9.4-16.8 19.0-28 6 30.1-39.0 c 99.5% <0.5% 2-3% 0% 2-3% B. Se compararon los patrones de oligosacáridos de cinco preparaciones del Factor VII independiente producidos como se describe en este Ejemplo (a) , con aquellos de (b) preparaciones recombinantes del Factor VII producidas en células BHK en la presencia de suero bovino y (c) preparación de un Factor VII purificado de plasma humano, usando los métodos analíticos descritos en el Ejemplo 1. Basados en los elementos estructurales de cada oligosacárido, se asignó uno de los siguientes: (i) cadenas que contienen al menos un ácido siálico; (ii) cadenas que carecen de algún ácido siálico (es decir, neutral); (iii) cadenas que contienen al menos una fucosa ligada a la antena. Finalmente, la suma de los contenidos relativos de las cadenas de oligosacáridos asignadas a cada grupo fue calculada como un porcentaje de las cadenas de oligosacáridos totales. La desviación estándar de esta determinación se calculó por ser 0.08% (variación entre dias); 0.7% (variación día a día); y 0.5% (intervalo 1-100 µg) . Los patrones de glicoformas resultantes ilustrados en la siguiente tabla: (i) (ü) (Üi) a 89 .0-97. 9% 2 .1-11.0% 6.3-21.3% b 88 .3-92. 5% 7 .5-12.9% 0% c 99.5% <0.5% 0% Las preparaciones recombinantes del Factor VII producidas de conformidad con el Ejemplo 1 (es decir, producidas en la ausencia de suero por la linea de células CHO) , presentan un patrón de glicoforma que difiere tanto del patrón de glicoforma del Factor VII recombinante producido en la presencia de suero como del Factor VII nativo aislado del plasma humano. Los oligosacáridos del Factor VII recombinante producidos en la ausencia de suero por la linea celular 282.4 CHO, incluyen estructuras con fucosa ligada a la antena, la cual está ausente de ambas preparaciones de referencia. Dos de las estructuras han sido purificadas y caracterizadas por espectrometría de masa de ionización de desorpción láser asistida por matriz, por tratamiento con enzimas de fucosidasa especificas del enlace y por CLAR de intercambio aniónico como se describe anteriormente. Las dos estructuras se han mostrado por contener la estructura Lewis x sialilo, es decir, la fucosa ligada a al->3 a un N-acetilgalactosamina antenaria en un oligosacárido sialilado.

III. Bioactividad: Cinco preparaciones del Factor VII producidas como se describe en este Ejemplo se analizaron por (a) generación de trombina y (b) enlace al factor del tejido (TT) y se compararon con el Factor VII recombinante producido en las células BHK en la presencia de suero (referencia) . La siguiente Tabla correlaciona los patrones de glicoforma (% de cadenas de oligosacáridos que contienen ácido siálico y el % que contiene antena fucosilada) y las dos bioactividades.

Los resultados indican que las preparaciones del Factor VII que tienen antenas fucosiladas presentan actividad del Factor VII independiente de FT superior (exhibida por ejemplo, por generación de troiabina) que las preparaciones del Factor VII que carecen de antena fucosilada.

Ejemplo 4: Ensayo de Hidrólisis in vitro Se puede usar el siguiente método para ensayar la bioactividad del Factor Vlla. El ensayo se llevó a cabo en una placa microtituladora (MaxiSorp, Nunc, Denmark) . El substrato cromogénico D-lle-Pro-Arg-p-nitroanilido (S-2288, Chromogenix, Suecia) , a una concentración final de 1 mM se agregó al Factor Vlla (concentración final de 100 mM) en 50 mM Hepes, pH 7.4 que contiene 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl2, y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 450 nm se midió continuamente en un lector de placa SpectraMax 340 (Molecular Devices, USA) . Se usó la absorbencia desarrollada durante una incubación de 20 minutos, después de la substracción de la absorbencia en un manto también que no contiene enzima, para calcular la relación entre las actividades de una prueba y un Factor Vlla de referencia.

Ejemplo 5: Ensayo de Proteólisis In vitro Se puede usar el siguiente método para ensayar la bioactividad del Factor Vlla. El ensayo se lleva a cabo en una placa microtituladora (MaxiSorp, Nunc, Denmark) . El factor Vlla (10 nM) y Factor X (0.8 microM) en 100 µ? 50 mM de Hepes, pH 7.4, que contiene 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2 y 1 mg/ml de albúmina de suero bovina, se incuban por 15 minutos. El desdoblamiento del Factor X es entonces detenido por la adición de 50 µ? de 50 mM Hepes, pH 7.4 que contiene 0,1 M NaCl, 20 mM de EDTA y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La cantidad de Factor Xa generado se mide por adición del substrato cromogénico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilido (S-2765, Chromogenix, Suecia) , concentración final 0.5 mM. La absorbencia a 405 nm se midió continuamente en un lector de placa SpectraMax™ 3430 (Molecular Devices, USA) . Se usó la absorbencia desarrollada durante 10 minutos, después de la substracción de la absorbancia en un blanco también que no contiene FVIIa, para calcular la relación entre las actividades proteoliticas de una prueba y un Factor Vlla de referencia .

Todas las patentes, solicitudes de patentes y referencias de literatura referidas aqui están con ello incorporadas por referencia en su totalidad. Muchas variaciones de la presente invención sugerirán ellas mismas a aquellos expertos en la técnica en vista de la descripción detallada anterior. Tales variaciones obvias están dentro del ámbito propuesto completo de las reivindicaciones adjuntas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, caracterizada porque los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a asparagina y donde entre alrededor del 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de ácido siálico.

2. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, caracterizada porque los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a asparagina y donde entre alrededor del 1-7% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutral.

3. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, caracterizada porque los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a asparagina y donde entre alrededor del 6-16% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de galactosa terminal.

4. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, caracterizada porque los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a asparagina y donde entre alrededor del 6-9% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo N-acetilgalactosamina terminal.

5. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor vil, caracterizada porque los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a asparagina y donde entre alrededor del 11-23% de cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo N-acetilgalactosamida o galactosa terminal .

6. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, caracterizada porque el polipéptido comprende cadenas de oligosacáridos ligadas a asparagina y en donde al menos alrededor del 2% de cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de fucosa ligada a al?3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

7. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracte izada porque los residuos siálicos en las cadenas de oligosacáridos están ligadas a galactosa vía enlace a2-»3.

8. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque los residuos del ácido siálico comprenden ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N-glicolilneuraminico (NeuSGc) .

9. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque los oligosacáridos comprenden fucosa ligada de al->6 hasta un núcleo de N-acetilglucosamin .

10. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque entre alrededor del 95-98% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo del ácido siálico.

11. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque entre alrededor del 96-97% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico.

12. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque entre alrededor del 2-4% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutral .

13. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque entre alrededor del 8-12% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de galactosa terminal.

14. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada porque entre alrededor del 7-8% de las cadenas de oligosacárido contienen al menos un residuo N-acetilgalactosamina terminal.

15. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque alrededor del 12- 18% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de N-acetilgalactosamina o galactosa terminal.

16. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque al menos alrededor del 5% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de fucosa ligada a al-3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

17. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque al menos alrededor del 10% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de fucosa ligada a al—>3 hasta una N-acetilglucosamina antenaria.

18. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque al menos alrededor del 20% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de fucosa ligada a al—>3 hasta una N-aceti lglucosamina antenaria.

19. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada porque al menos alrededor del 40¾ de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de fucosa ligada a al—3 hasta una N-acetilglucosamina antenaria.

20. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque los polipéptidos tienen la secuencia de aminoácido del Factor VII de tipo nativo ,

21. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque los polipéptidos son el Factor Vlla de tipo nativo.

22. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque los polipéptidos del Factor VII se seleccionan del grupo que consiste de: Factor VII-S52A, Factor VII-S60A, Factor VII que ha sido desdoblado proteoliticamente entre residuos 290 y 291; Factor VII que ha sido desdoblado proteolíticamente entre residuos 315 y 316; y el Factor VII que ha sido oxidado.

23. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque los polipéptidos relacionados con el Factor VII se seleccionan del grupo que consiste de: Factor VII-R152E, Factor VII-S344A, Factor VII FFR y Factor Vlla que carece del dominio Gla.

24. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII, caracterizada porque los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacárido ligados a asparagina y en donde (i) entre alrededor del 94-100% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de ácido siálico y (ii) entre alrededor del 6-9% de las cadenas de oligosacárido que comprenden al menos un residuo N-acetilgalactosamina terminal.

25. Preparación como se define en la reivindicación 24, caracterizada porque los polipéptidos del Factor VII tienen la secuencia del Factor VII de tipo nativo.

26. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor Vlla que tiene la secuencia del Factor VII de tipo nativo, caracterizada porque los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a asparagina y donde entre alrededor del 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de ácido siálico .

27. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor Vlla que tienen la secuencia del Factor VII de tipo nativo, caracterizada porque los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a asparagina y en donde al menos alrededor del 2% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una porción de fucosa ligada a al—3 hasta un N-acetilglucosamina antenaria.

28. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizada porque los polipéptidos se producen en una célula hospedante seleccionada del grupo que consiste de células fúngicas, de insectos y vertebrados.

29. Preparación como se define en las reivindicación 28, caracterizada porque la célula hospedante es una célula de mamífero .

30. Preparación como se define en la reivindicación 29, caracterizada porque la célula de mamífero se deriva de un hámster .

31. Preparación como se define en la reivindicación 30, caracterizada porque la célula de hámster se selecciona del grupo que consiste de células CHO y células BHK.

32. Preparación como se define en la reivindicación 29, caracterizada porque la célula de mamífero se deriva de un humano .

33. Preparación como se define en la reivindicación 32, caracterizada porque la célula humana es una célula HEK.

34. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizada porque la preparación presenta una biodisponibilidad que es al menos alrededor del 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde alrededor del 93% o menos de las cadenas de oligosacárido en la preparación de referencia comprende al menos una porción de ácido siálico.

35. Preparación como se define en la reivindicación 34, caracterizada porque la preparación presenta una biodisponibilidad que es al menos alrededor del 120% de la biodisponibilidad de la preparación de referencia.

36. Preparación como se define en la reivindicación 35, caracterizada porque la preparación presenta una biodisponibilidad que es al menos alrededor del 130% de la biodisponibilidad de la preparación de referencia.

37. Preparación como se define en la reivindicación 36, caracterizada porque la preparación presenta una biodisponibilidad que es al menos alrededor del 140% de la biodisponibilidad de la preparación de referencia.

38. Método para determinar el patrón de glicoforma de polipéptidos de Factor VII o relacionados con el Factor VII, caracterizado porque el método comprende: (a) cultivar una célula que expresa polipéptidos del Factor VII o relacionados con el Factor VII bajo una primera serie de condiciones de cultivo predeterminadas. (b) recuperar polipéptidos de Factor VII o relacionados con el Factor VII a partir del cultivo para obtener una preparación que comprende los polipéptidos; y (c) analizar la estructura de los oligosacáridos ligados a los polipéptidos para determinar el patrón de glicoforma de la preparación.

39. Método como se define en la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende (di) alterar las condiciones de cultivo de la etapa (a) para lograr una segunda serie de condiciones de cultivo predeterminadas ; (el) repetir las etapas (b)-(dl) hasta que se logre el patrón de glicoforma deseado.

40. Método como se define en la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende: (d2) tratar la preparación químicamente o enzimáticamente para alterar la estructura del oligosacárido y (e2) repetir las etapas (b)-(d2) hasta que se logre el patrón de glicoforma deseado.

41. Método para producir una preparación que comprende polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor-VII que tienen un patrón predeterminado de glicosilación N-ligada, el método se caracteriza porque comprende cultivar una célula que expresa los polipéptidos bajo condiciones en las cuales al menos alrededor del 94% de los oligosacáridos ligados a asparagina presentes en los polipéptidos comprenden al menos un residuo de ácido siálico.

42. Formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende una preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-37 y un portador o adyuvante f rmacéuticamente aceptable.

43. Método para tratar un síndrome responsable del Factor VII, caracterizado porque el método comprende administrar una formulación farmacéutica como se define en la reivindicación 42 a un paciente en necesidad del tratamiento, bajo condiciones que resultan en un decremento en sangrado y/o un incremento en la coagulación de la sangre, en donde la formulación comprende polipéptidos de Factor VII.

44. Método como se define en la reivindicación 43, caracterizado porque el sindrome se selecciona del grupo que consiste de hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del Factor XI, deficiencia del Factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand, presencia de un inhibidor del factor de coagulación, cirugía, trauma y terapia anticoagulante.

45. Método para prevenir el sangrado indeseado, caracterizado porque el método comprende administrar una formulación farmacéutica como se define en la reivindicación 42 a un paciente en necesidad del tratamiento, bajo condiciones que resultan en un decremento del sangrado y/o un incremento en la coagulación de la sangre, en donde la formulac-ón comprende polipéptidos del Factor VII.

46. Método para prevenir la coagulación de sangre indeseada, caracterizado porque el método comprende administrar una formulación farmacéutica como se define en la reivindicación 42 a un paciente en necesidad del tratamiento, bajo condiciones efectivas para inhibir la coagulación, en donde la formulación comprende polipéptidos relacionados con el Factor VII.

47. Método para prevenir las reacciones mediadas del factor del tejido, caracterizado porque el método comprende administrar una formulación farmacéutica como se define en la reivindicación 42 a un paciente en necesidad del tratamiento, bajo condiciones efectivas para inhibir la coagulación, en donde la formulación comprende polipéptidos relacionados con el Factor VII.

48. Método como se define en la reivindicación 46, caracterizado porque la coagulación de sangre indeseada está asociada con una condición seleccionada del grupo que consiste de: angioplastia, trombosis de la vena profunda, embolia pulmonar, apoplejía, coagulación intravascular diseminada (CID) , deposición de fibrina en pulmones y riñon asociada con endotoxemia gram-negativa e infarto miocardial.

49. Método como se define en la reivindicación 47, caracterizado porque las reacciones mediadas del factor del tejido están asociadas con una condición seleccionada del grupo que consiste de SRIS, SARA, DMO, SUH y TTP.

50. Uso de una preparación que comprende polipéptidos de Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII como se define en cualquiera de las rei indicaciones 1-37 para la preparación de un medicamento para tratar un síndrome en respuesta al Factor VII.

51. Uso como se define en la reivindicación 50, en donde el síndrome se selecciona del grupo que consiste de hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del factor XI, deficiencia del Factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von illebrand, presencia de un inhibidor del factor de coagulación, cirugía, trauma y terapia anticoagulante.

52. Uso de una preparación que comprende polipéptidos de Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-37 para la preparación de un medicamento para prevención de un sangrado indeseado.

53. Uso de una preparación que comprende polipéptidos de Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-37 para la preparación de un medicamento para prevención de una coagulación de sangre indeseada.

54. Uso como se define en la reivindicación 53, en donde la coagulación de sangre indeseada está asociada con una condición seleccionada del grupo que consiste de: angioplastía, trombosis de la vena profunda, embolia pulmonar, apoplejía, coagulación intravascular diseminada (CID), deposición de fibrina en pulmones y riñón asociada con endotoxemia gram-negativa e infarto miocardial.

55. Uso de una preparación que comprende polipéptidos de Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-37 para la preparación de un medicamento para prevenir reacciones mediadas por el factor del tejido.

56. Uso como se define en la reivindicación 55, en donde las reacciones mediadas por el factor del tejido están asociadas con una condición seleccionada del grupo que consiste de SRIS, SARA, D O, SUH, y TTP.