CN104717973A - 因子vii多肽的液体药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及液体含水药物组合物，其包含因子VIIa多肽、适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂；和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂选自（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐；(R)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐；和（S）-和（R）-形式或其药学上可接受的盐的混合物。本发明进一步涉及用于治疗因子VII反应性出血性病症的所述组合物；用于制备液体组合物和用于稳定化液体组合物中因子VIIa的方法；和包含液体含水药物组合物和任选地包含惰性气体的气密性容器；以及治疗患者中因子VII反应性出血病症的方法。

Description

因子VII多肽的液体药物组合物

技术领域

本发明涉及包含因子VII（a）多肽的液体、含水药物组合物；制备和使用该组合物的方法；包含该组合物的容器和该组合物用于治疗因子VII（a）反应性病症的用途。更具体地，本发明涉及对蛋白水解、化学和/或物理降解稳定的液体组合物。

技术背景

凝血因子VIIa（FVIIa）已被证明是用于血液凝固病症诸如血友病A、血友病B、血小板无力症和FVII（a）缺乏症的治疗的重要的治疗剂。

目前市售的，重组因子VIIa制剂NovoSevenRT?（Novo Nordisk A/S，丹麦）呈现为含重组人因子VIIa、NaCl、CaCl₂(2H₂O)、GlyGly、聚山梨醇酯80、蔗糖和甘露糖醇的冷冻干燥饼的小瓶。此产品在使用前立即用组氨酸缓冲液重构至pH6.0，从而在得到的溶液中获得1.0 mg/mL的FVIIa浓度。

在液体中维持制造的蛋白药物，还是冷冻干燥它的决定通常基于该蛋白以这两种形式的稳定性。蛋白稳定性可被下列因素影响，诸如离子强度、pH、温度、冷冻和解冻的重复循环、暴露于剪切力和蛋白本身的性质。某些活性蛋白可能丢失，由于物理不稳定性导致变性和聚集（可溶性和不溶性聚集体形成两者），以及化学不稳定性导致例如，水解、脱酰胺作用和氧化作用，仅举几例。

虽然蛋白不稳定的发生被广泛认识到，但是一般不可能预测什么可能是解决具体蛋白的具体不稳定性相关问题的有效方法。不稳定可以导致具有降低的活性、增加的毒性，和/或增加的免疫原性的蛋白副产物或衍生物的形成。另外，翻译后修饰，诸如在N-末端的某些谷氨酸残基的γ-羧基化，或碳水化合物侧链的添加，在储存过程中提供潜在的修饰位点。

然而，丝氨酸蛋白酶（诸如因子VIIa多肽）的液体制剂，提示不同的稳定性问题，因为它们都经受自体溶解的降解，通过作为它们自身催化（作为生物酶和底物两者）的底物。

配制蛋白酶（诸如FVIIa多肽）对于制药业是一个重大的挑战，因为FVIIa多肽容易裂解同一制剂中的其它FVIIa多肽，使它们失活。在液体制剂中，FVIIa多肽可以在几个小时的时期内自体溶解，并且当FVIIa多肽的浓度高时问题尤为严重。因此，在FVIIa多肽液体制剂的创造中，自体溶解是要克服的最大障碍。

任何蛋白组合物的安全性和有效性直接与其稳定性相关。由于对于分子运动大大增加的潜力和因此增加的分子相互作用的可能性，维持液体中蛋白稳定性需要与用于以其冻干形式维持稳定性的方法不同的方法。由于在增加的蛋白浓度下对于聚集体形成的倾向和增加的蛋白-蛋白相互作用，在浓溶液中保持稳定性，构成单独的挑战。

当开发液体组合物时，考虑许多因素。获得短期（少于六个月）的液体稳定性一般需要避免总体结构变化，诸如变性和聚集。对于一些蛋白，这些方法描述于文献中，并且存在很多稳定剂的实例。众所周知有效地稳定一种蛋白的试剂实际上起到使另一种不稳定的作用。一旦蛋白被稳定化免于总体结构变化，对于长期稳定性（例如，大于6个月）开发液体组合物，取决于进一步稳定化蛋白免于特异性针对该蛋白的降解类型。更具体的降解类型可以包括，例如，二硫键错配（scrambling）、某些残基的氧化、脱酰胺和环化。虽然并不总是能够准确描述个别的降解种类，但是开发了测定法监测细微变化，以便监测特定赋形剂的专门稳定目的蛋白的能力。

对于注射/输注，液体组合物的pH以及离子强度还需要在生理学上适当的范围内。

因子VIIa经历几个降解途径，尤其是自体溶解切割（肽骨架的剪裁或“重链降解”）、聚集（形成二聚、寡聚和多聚形式）和氧化。此外，可发生沉淀和脱酰胺。许多这些反应可以通过从蛋白除去水而显著减缓。

然而，存在与使用保存的液体制剂而不是在注射前立即用合适的液体（例如，WFI或缓冲液）重构的冷冻干燥饼相关的几个优点。最值得注意的是，保存的液体比冷冻干燥产品更便于使用。因子VIIa多肽的液体组合物的开发可以消除重构误差，从而提高给药精度；以及简化产品的临床使用，从而增加患者的依从性。通常，更高度浓缩的溶液允许更低体积的施用，其可以提供用于除了静脉内之外的肠胃外施用的机会。在易于施用和使用方面，液体组合物从而可具有相对冷冻干燥产品的许多优点。

目前，没有市售的液体配制的FVIIa产品。本发明的目的是提供适合用于储存和递送的液体因子VIIa多肽药物组合物，并且其中化学和/或物理降解产物的量是生理上可接受的。

WO2005016365（Novo Nordisk Health Care AG）关注包括因子VIIa多肽、适于保持pH在4-9范围内的缓冲剂和至少一种包含-C(=NZ1R1)(-NZ2R2)基序的稳定剂的液体含水药物组合物。

EP1299354（Aventis）描述了据称可用作因子VIIa的抑制剂，用于抑制或减少在例如心血管疾病的治疗中的凝血或炎症反应的脲和硫脲衍生物。

WO2004050637（Pharmacyclics）描述了据称可用作丝氨酸蛋白酶（包括因子VIIa）的抑制剂，用于治疗或预防血栓栓塞性病症、癌症或类风湿性关节炎的苯并咪唑-5-甲脒衍生物。

发明概述

本发明人已经创造了表现出改进的稳定性的因子VII（a）多肽的液体药物组合物。在这些组合物中，因子VIIa多肽与选自下列的活性位点稳定剂配制在一起：（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸；（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸；以及（S）-和（R）-形式的混合物。

从而，本发明的一个方面涉及液体含水药物组合物，所述液体含水药物组合物包含因子VIIa多肽、适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂；和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及用于治疗因子VIIa反应性出血性病症的液体药物组合物，所述液体药物组合物包含因子VIIa多肽、适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂；和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及用于制备液体组合物的方法，其包括提供在溶液中的因子VIIa多肽的步骤，所述溶液包含适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及用于稳定化液体含水组合物中因子VIIa的方法，其包括提供在溶液中的因子VIIa多肽的步骤，所述溶液包含适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及包含本发明的液体含水药物组合物以及任选地包含惰性气体的气密性容器。

在另一方面，本发明涉及治疗在需要该治疗的患者中因子VII反应性出血性病症的方法，包括向患者施用治疗有效量的如上述的液体药物组合物和药学上可接受的载体。

描述

因子VIIa是具有自体溶解性质的丝氨酸蛋白酶，即通过自体溶解遭受降解。尤其是，氨基酸残基315-316和290-291之间的肽键在溶液中储存期间容易被切割（编号指人野生型FVIIa，SEQ ID NO 1的序列）。此切割称为“重链降解”。因子VIIa在pH7.5具有其最佳酶活，并且在低于5.5的pH具有低活性。

除了自体溶解切割，因子VIIa经过几个一般性的降解途径，尤其是聚集（形成二聚、寡聚和多聚形式）、脱酰胺和氧化。

在液体组合物中配制FVIIa是困难的，特别是由于自体溶解性质。然而，也是额外的，当在溶液中储存FVIIa时应当考虑更一般的降解途径；例如，可能需要通过包含抗氧化剂或通过覆盖氮气或惰性气体降低氧分压来解决氧化问题。

防止液体组合物中FVIIa的自体溶解切割的一种方法是通过向包含FVIIa的溶液引入以FVIIa抑制剂形式的活性位点稳定剂的活性位点的非共价抑制。但是，这种活性位点稳定剂，在注射后必须从所述的FVIIa分子释放，由此将有活性的FVIIa释放到血流中。而且，活性位点稳定剂应是以具有期望的安全性的浓度存在，并且它在给药方案中施用的浓度下，应该优选本身不具有生物学效应（如对于赋形剂的特征）。

高度期望鉴定和引入满足下列期望的液体组合物概念的FVIIa的活性位点稳定剂：

(i)保持FVIIa分子的稳定性（尽量减少自体溶解和一般性蛋白降解）， 和

(ii)保持FVIIa分子的生物活性（保持与未结合活性位点稳定剂的FVIIa类似的生物活性，包括PK值）， 和

(iii)保证活性位点稳定剂的适当的安全性（牢记此试剂本身是生物活性分子）。

因此，一个主要的挑战在于鉴定活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂平衡所有三个“因素”，即同时优化FVIIa稳定性、FVIIa生物活性和活性位点稳定剂的安全性。

因此，高度期望鉴定和引入满足下列条件的活性位点稳定剂（即FVIIa的酶促活性的抑制剂）：

a) 当FVIIa组合物储存在小瓶中时，在（活性位点稳定剂的）非毒性浓度以足够低的解离常数结合FVIIa（“强结合”），以使游离的FVIIa形式和结合的FVIIa的形式之间的平衡（FVIIa+活性位点稳定剂                                                FVIIa：活性位点稳定剂）移向完全的复合物形成，和

b) 当体内注射时，在相同的给定浓度和解离常数释放FVIIa，即，使平衡移向游离形式的FVIIa和活性位点稳定剂。

在生物化学和药理学中，解离常数（K_d）是平衡常数的特定类型，其测量较大种类可逆地分开（解离）成较小的组分的性质，如当通过非共价力结合在一起的两个分子散开成组分分子时。解离常数是缔合常数（结合常数）的倒数。

解离常数是蛋白-抑制剂复合物的解离常数Ki=[P][I]/[C]，其中[P]、[I]和[C]分别代表蛋白、抑制剂和复合物的摩尔浓度。K_i常用来描述配体（L）和蛋白（P）之间亲和力，即配体如何紧密地结合特定蛋白。配体-蛋白亲和力受两个分子之间的非共价分子间相互作用的影响，诸如氢键、静电相互作用、疏水和范德华力。它们也可以受高浓度的其它大分子的影响。

配体-蛋白复合物（C）的形成可以通过双态过程CP+ L进行描述。相应的解离常数定义为Kd=[P][L]/[C]， 其中，[P]、[L]和[C]分别代表蛋白、配体和复合物的摩尔浓度。解离常数具有摩尔单位（M）。Kd值对应配体的浓度，在该浓度下一半的蛋白分子结合到配体，例如这样的配体浓度，在该浓度下，结合有配体的蛋白的浓度[C]，等于没有结合配体的蛋白的浓度[P]。解离常数越小，配体结合越紧密，或配体与蛋白之间的亲和力越高。例如，具有纳摩尔（nM）解离常数的配体比具有微摩尔（M）解离常数的配体更紧密地结合特定蛋白。

此外，施用的FVIIa的浓度应为允许对于给定的施用途径以所希望的体积施用有效剂量用于治疗血友病的浓度，所述体积诸如，例如，对于成人静脉注射为1-20毫升体积，优选1-5毫升或甚至2-3毫升。

即用制剂的储存温度可以在2和45℃之间变化。尤其是在高于或等于例如20℃的储存温度，增加了如何制造稳定的液体制剂的挑战。

本发明在于新的稳定化的含有因子VIIa多肽的液体含水药物组合物的开发。更具体地，液体含水药物组合物包括选自下列的活性位点稳定剂：

（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸；（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸；（S）-和（R）-形式的混合物；和其药学可接受的盐。

这些活性位点稳定剂满足对于用于FVIIa的液体制剂的非共价稳定剂的上述要求，即使在等于或高于20℃的储存温度下持续1个月或以上。

活性位点稳定剂

在本发明的一个实施方案中，所述活性位点稳定剂是（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸（式I），或其药学上可接受的盐。

　　　　　　　　　　　(I)。

在另一实施方案中，所述活性位点稳定剂是（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸（式II），或其药学上可接受的盐。

　　　　　　　　　　　　　(II)。

在又一个实施方案中，所述活性位点稳定剂是（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸或其药学上可接受的盐，和（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸或其药学上可接受的盐的混合物。

药学上可接受的盐包括存在的酸性或碱性基团的盐。药学上可接受的酸加成盐包括，但不限于，盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐，糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。

合适的碱性盐包括，但不限于，钙、镁、钾、钠和锰盐。

一种或多种活性位点稳定剂的浓度依赖于组合物中所需的因子VIIa的浓度（[FVIIa]）。该活性位点稳定剂应优选相比因子VIIa少量过量存在。有限过量的活性位点稳定剂是避免稳定剂的不希望的副作用所需的。因此，活性位点的稳定剂应相比因子VIIa浓度过量5μM以上存在于组合物中，即，[活性位点稳定剂]≥[FVIIa]+5μM。

活性位点稳定剂的浓度应优选不超过存在的FVIIa的浓度的2.5倍。

在不同的实施方案中，所述活性位点稳定剂相比因子VIIa的浓度过量5.5-100 μM、或6-100 μM、或6-75 μM、或6-50 μM、或6-30 μM、或6-10 μM、或10-100 μM、或10-75 μM、或10-50 μM、或10-30 μM、或30-50 μM、或20-40 μM存在，或者所述活性位点稳定剂相比因子VIIa的浓度过量≥6 μM、或≥7 μM、或≥10 μM、或≥20 μM、或≥30 μM、或≥40 μM、或≥50 μM存在。在一个系列实施方案中，所述因子VIIa是rhFVIIa或SF-rhFVIIa，并且所述活性位点稳定剂相比因子VIIa的浓度过量5.5-50 μM、或5.5-40 μM、或5.5-30 μM、或5.5-10 μM、或6-50 μM、或6-40 μM、或6-30 μM、或6-10 μM存在。

一种或多种活性位点稳定剂相对于因子VIIa的浓度也可以通过活性位点稳定剂和FVIIa的浓度（μM）之间的比率给出，但是条件是所述活性位点稳定剂的浓度相比FVIIa的浓度过量5 μM以上。

因此，在各种实施方案中，活性位点稳定剂和FVIIa多肽之间的摩尔比（[活性位点稳定剂]：[FVIIa]）为：≥1.1、或≥1.25、或≥1.5、或≥1.75、或在1.1-10的范围内、或在1.25-10的范围内、或在1.5-10的范围内、或在1.75-10的范围内、或在1.1-5的范围内、或在1.25-5的范围内、或在1.5-5的范围内、或在1.25-2的范围内、或在1.75-5的范围内、或约1.25、或约1.5、或约1.75、或约2、或约2.5。在某些实施方案中，活性位点稳定剂和FVIIa多肽之间的摩尔比（[活性位点稳定剂]：[FVIIa]）为≥1.5或≥1.75。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含以40 μM浓度的FVIIa和以60 μM浓度的活性位点稳定剂（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以40 μM浓度的FVIIa和以60 μM浓度的活性位点稳定剂（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以40 μM浓度的FVIIa和以75 μM浓度的活性位点稳定剂（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以40 μM浓度的FVIIa和以75 μM浓度的活性位点稳定剂（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在其它实施方案中，本发明的组合物包含40 μM浓度的FVIIa和（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐，和（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐的混合物；其中所述混合物的浓度分别是60 μM或75 μM。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以40 μM浓度的FVIIa和以70 μM浓度的活性位点稳定剂（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以40 μM浓度的FVIIa和以70 μM浓度的活性位点稳定剂（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在其它实施方案中，本发明的组合物包含40 μM浓度的FVIIa和（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐，和（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐的混合物；其中所述混合物的浓度分别是60 μM或70 μM。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以100 μM浓度的FVIIa和以150 μM浓度的活性位点稳定剂（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以100 μM浓度的FVIIa和以150 μM浓度的活性位点稳定剂（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以100 μM浓度的FVIIa以及（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐和（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐的混合物；其中所述混合物的浓度是150 μM。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以200 μM浓度的FVIIa和以210-350 μM浓度的活性位点稳定剂（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以200 μM浓度的FVIIa和以210-350 μM浓度的活性位点稳定剂（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含以200 μM浓度的FVIIa以及（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐和（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐的混合物；其中所述混合物的浓度是210-350 μM。

除了因子VIIa和活性位点稳定剂之外，所述液体含水药物组合物还可以包含对于组合物的制备、配制、稳定性或施用有益的额外的组分。

二价金属离子

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含选自Ca²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺的二价金属离子。所述金属离子可以是，例如，以选自下列的盐形式提供：氯化钙、乙酸钙、葡糖酸钙、戊酮酸钙（calcium laevulate）、氯化锰（II）、氯化镁、乙酸镁、葡糖酸镁、戊酮酸镁以及强酸的镁盐。

在不同的实施方案中，所述二价金属离子以≥ 2 mM、或≥5 mM、或≥ 10 mM、或2-100 mM的范围内、或2-50 mM的范围内、或2-20 mM的范围内、或5-15 mM的范围内、或6-10 mM的范围内的浓度存在。

在一个实施方案中，所述二价金属离子是Ca²⁺。在不同的进一步的实施方案中，液体组合物中钙离子的浓度是：≥ 2 mM、或≥5 mM、或≥ 10 mM、或以2-100 mM的范围、或以2-50 mM的范围、或以10-50 mM的范围、或以2-20 mM的范围、或以5-10 mM的范围、或以5-15 mM的范围。

在不同的实施方案中，液体组合物的pH是在下列范围：5.5-8.5、或6.0-8.5、或6.0-7.5、或6.5-7.5、或6.5-7.0、或6.7-7.0、或7.0-7.5。

因子VII多肽

因子VII（FVII）是主要在肝脏中产生的糖蛋白。成熟蛋白由406个氨基酸残基组成并且包括通过同源性定义的4个结构域。存在一个N-末端Gla结构域随后是两个表皮生长因子（EGF）样结构域和一个C-末端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII作为单结构域分子在血浆中循环。被活化成有活性的FVII（FVIIa）后，该分子在残基Arg152和Ile153之间切割，获得通过二硫键连接在一起的两链蛋白。轻链包含Gla和EGF-样结构域，而重链是蛋白酶结构域。FVIIa需要结合到其细胞表面辅因子组织因子以变得有生物学活性。

术语“因子VII（a）”涵盖未切割的酶原，因子VII，以及切割和因此活化的蛋白酶，因子VIIa。“因子VII（a）”包括FVII（a）的天然等位变体，所述变化可以在一个个体到另一个之间存在和发生。野生型人因子VIIa序列在SEQ ID NO: 1中提供，以及在Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83:2412-2416中提供。

因子VII（a）可以是血浆衍生的或重组生产的，使用众所周知的生产和纯化方法。糖基化、γ-羧基化和其它翻译后修饰的程度和位置可以取决于所选宿主细胞和其生长条件而变化。

术语“因子VII（a）多肽”在本文中指野生型因子VIIa分子以及FVII（a）变体、FVII（a）衍生物和FVII（a）缀合物。这些变体、衍生物和缀合物可以展示相对于野生型人因子VIIa基本上相同或改善的生物学活性。

如本文所用术语“FVII（a） 变体”意图指定具有SEQ ID NO: 1的序列的因子FVII，其中亲本蛋白的一个或多个氨基酸已被另一种氨基酸取代和/或其中亲本蛋白的一个或多个氨基酸已被缺失和/或其中一个或多个氨基酸已被插入到亲本蛋白和/或其中一个或多个氨基酸已被添加到亲本蛋白。这种添加可以在亲本蛋白的N-末端或C-末端或两端发生。在该定义中“类似物”在其活化形式仍然具有FVII活性。在一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的序列至少90%相同。在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的序列至少95%相同。如本文所用，对具体位置的任何引用都指在SEQ ID NO: 1中的相应位置。

相比重组野生型人因子VII（a）具有基本上相同或增加的蛋白水解活性的FVII（a）变体的非限制性实例包括在下列公开的那些：WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO 03/027147、WO 03/037932、WO 04/029090、WO 05/024006、和EP 05108713.8、US 7173000 B2；和JP4451514 B2。

如本文所用术语“因子VII（a）衍生物”意图指定相对野生型因子VIIa展示基本上相同或改善的生物学活性的FVII多肽，其中亲本肽的一个或多个氨基酸已被基因地和/或化学地和/或酶学地修饰，诸如烷基化、糖基化、PEG化、酰基化、酯形成、二硫键形成或酰胺形成。

术语“PEG化的人因子VII（a）”指PEG分子已被缀合到其上的人因子VII（a）多肽。这样的PEG分子可以连接到因子VIIa多肽的任意部分，包括因子VIIa多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。这包括但不限于PEG化的人因子VIIa、半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa和其变体。因子VII衍生物的非限制性实例包括如WO 03/031464和WO 04/099231和WO 02/077218中公开的糖基PEG化的FVII（a）衍生物。

术语“半胱氨酸-PEG化的人因子VII（a）”指这样的因子VII（a）多肽，其中PEG分子缀合到已引入所述人因子VIIa的半胱氨酸的巯基上。

术语“改善的生物学活性”指这样的FVII（a）多肽：其展示i）在存在和/或不存在组织因子的情况下相比重组野生型人因子VIIa基本上相同或增加的蛋白水解活性，或指ii）相比重组野生型人因子VIIa具有基本上相同或增加的TF亲和性的FVII（a）多肽，或指iii）相比重组野生型人因子VIIa具有基本上相同或增加的血浆半衰期的FVII（a）多肽，或指iv）对于活化的血小板具有基本上相同或增加的亲和性的FVII（a）多肽。

血液凝固中因子VIIa的生物学活性来源于其下列能力：（i）结合组织因子（TF）和（ii）催化因子IX或因子X的蛋白水解切割以产生活化的因子IX或X（分别是因子IXa或Xa）。

对于本发明的目的，因子VII多肽的生物学活性（“因子VII生物学活性”）可以通过测量制备物促进血液凝固的能力加以定量，参见本文所述测定1。或者，因子VIIa生物学活性可以通过如下定量：（i）测量因子VIIa或因子VII相关多肽在包含嵌入脂质膜的TF和因子X的系统中产生活化的因子X（因子Xa）的能力(Persson等, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；或（ii）使用基于表面等离子共振的设备测量因子VIIa或因子VII相关多肽对TF的物理结合(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)。

SEQ ID NO 1: 野生型人凝血因子VII

(γ指γ-羧基谷氨酸(Gla)）。

在不同实施方案中，因子VIIa多肽是：人因子VIIa（hFVIIa）、重组制备的人因子VIIa（rhFVIIa）、重组制备的无血清因子VIIa（sf-rFVIIa）、重组制备的无血清人因子VIIa (sf-rhFVIIa)（“无血清”：在无血清培养条件下重组制备）。

在一些实施方案中，因子VIIa通过任何合适的制造方法制备。在一个实施方案，通过根据美国专利号6903069（通过引用整体并入）的无血清制造方法制备因子VII多肽。

在一些实施方案中，所述因子VIIa多肽是“因子VIIa序列变体，因子VIIa衍生物。

在野生型因子VIIa的不同实施方案中，所述多肽是：人因子VIIa（hFVIIa）、重组制备的人因子VIIa（rhFVIIa）、重组制备的无血清因子VIIa（sf-rFVIIa）、重组制备的无血清人因子VIIa (sf-rhFVIIa)（“无血清”：在无血清培养条件下重组制备）。

在不同的实施方案中，所述因子VIIa多肽以下列浓度存在于液体组合物中：约0.3-200 mg/mL、或约0.3–120 mg/mL、或约0.5-100 mg/mL、或约0.5-20 mg/mL、或约1-10 mg/mL、或约1-5.5 mg/mL、或约2-20 mg/mL、或约2-15 mg/mL、或约2-10 mg/mL、或约2-5.5 mg/mL、或约5-15 mg/mL、或约2 mg/mL、或约5 mg/mL、或约10 mg/mL。

因子VIIa浓度方便地表示为mg/mL或IU/mL，并且1 mg通常表示43,000–56,000 IU或更多。因子VIIa具有约52kDa的分子量。因此，FVIIa的1 mg/mL的浓度对应约20 μM FVIIa的摩尔浓度。

药物组合物的生物学效应主要归因于因子VIIa多肽的存在，尽管可以包括与因子VIIa多肽组合的其它活性成分。

缓冲剂

为了获得可用于向哺乳动物诸如人直接胃肠外施用的液体含水药物组合物，通常需要组合物的pH值保持在特定限制内，诸如从约5.5-8.5。

为了在给出的条件下保证合适的pH值，所述药物组合物还包含适合用于保持pH在从约5.5-8.5的范围内的缓冲剂。

术语“缓冲剂”包括维持溶液pH在从约5.5-8.5范围的那些试剂或试剂的组合。

在一个实施方案中，所述缓冲剂是选自下列的酸和盐的至少一种组分：MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、组氨酸（例如L-组氨酸）、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺、磷酸（如磷酸钠或钾）、乙酸（例如乙酸铵、钠或钙）、乳酸、戊二酸、柠檬酸（如柠檬酸钠或钾）、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸。应当理解，缓冲剂可以包含两种或更多种组分的混合物，其中所述混合物能够提供和维持pH在特定范围内。

选择缓冲剂的浓度以便维持溶液的优选pH。在不同实施方案中，缓冲剂的浓度是1-100mM；1-50 mM；1-25 mM；或2-20 mM。

在不同的实施方案中，组合物的pH保持在：从5.5-8.5、或6.0-8.5、或6.0-7.5、或6.5-7.5、或7.0-7.5、或6.5-7.0、或6.7-6.9。

在不同实施方案中，缓冲剂包含组氨酸和/或甘氨酰甘氨酸。

如本文所用，指定为“约”的pH值理解为± 0.1，例如约pH 8.0包括pH 8.0± 0.1。

表面活性剂

药物组合物还可以包括非离子表面活性剂。表面活性剂（也称为去垢剂）通常包括那些试剂，其保护蛋白免于空气/溶液界面诱导的应力和溶液/表面诱导的应力（例如导致蛋白聚集）。

非离子表面活性剂的典型类型是聚山梨醇酯、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚乙烯/聚丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇（PEG）、聚氧乙烯硬脂酸酯（polyxyethylene stearates）和聚氧乙烯蓖麻油。

非离子表面活性剂的说明性实例是Tween^?、聚山梨酸酯20、聚山梨醇酯80、Brij-35（聚氧乙烯十二烷基醚）、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、PEG8000、Pluronic?多元醇、聚氧-23-月桂基醚、Myrj49和Cremophor A。

在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.005-2.0重量%的量存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆。在另一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，表面活性剂是聚泊洛沙姆188。

张力调节剂

此外，组合物可以进一步包含张力调节剂。如本文所用，术语“张力调节剂”包括有助于溶液渗透压的试剂。所述张力调节剂包括选自下列的至少一种试剂：中性盐、氨基酸、2-5个氨基酸残基的肽、单糖、二糖、寡糖和多糖，以及糖醇。在一些实施方案中，组合物包含组合的两种或更多种这些试剂。

“中性盐”指当溶解在含水溶液中时既不是酸也不是碱的盐。中性盐的非限制性实例包括钠盐、钾盐、钙盐和镁盐、诸如，例如氯化钠、氯化钾、氯化钙、乙酸钙、葡糖酸钙、戊酮酸钙（calcium laevulate）、氯化镁、乙酸镁、葡萄糖酸镁及戊酮酸镁。

可以用作张力调节剂的糖类的非限制性实例是：蔗糖、甘露糖醇、葡萄糖（右旋糖）和环糊精。

在不同的实施方案中、所述张力调节剂选自：氯化钠、氯化钙、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、环糊精，以及两种或多种这些物质的组合。

在一个实施方案中，所述张力调节剂是氯化钠，或氯化钠和一种或多种额外试剂的组合，所述一种或多种额外试剂选自：氯化钙、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和环糊精。

在不同的实施方案中，张力调节剂以至少至少5 mM、或至少10 mM、或至少20 mM、或至少50 mM、或至少100 mM的浓度，或在10-200 mM、或10-150 mM、或30-150 mM、或50-140 mM的范围的浓度存在。

在一个实施方案中，所述张力调节剂是50-140 mM氯化钠。在另一个实施方案中，所述张力调节剂是以20-40 mM浓度的蔗糖和/或甘露醇。

在一个实施方案中，所述组合物是等渗的；在另一个，其是高渗的。

术语“等渗”是指“与血清等渗”（即，约300±50毫渗量/千克）。张力指在施用前溶液的摩尔渗透压浓度的量度。术语“高渗”意在指定高于血清的生理水平的摩尔渗透压浓度水平，诸如高于300±50毫渗量/千克的水平。

抗氧化剂

具有式I和II的活性位点稳定剂可以本身表现出抗氧化作用，因为化合物能够经受氧化。结果是，所用的活性位点稳定剂可因此保护因子VIIa分子免于氧化。然而，在本发明的进一步的实施方案中，组合物进一步包含抗氧化剂。在不同的实施方案中，抗氧化剂选自：L-甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、甲硫氨酸类似物、包含甲硫氨酸的肽、甲硫氨酸同系物、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、酪氨酸、胱氨酸和胱硫醚（cysstathionine）。在不同的实施方案中，抗氧化剂为L-甲硫氨酸、谷胱甘肽、酪氨酸或这些的两种或更多种的混合物。

抗氧化剂的浓度通常为0.1-5.0 mg/mL，诸如0.1-4.0 mg/mL、0.1-3.0 mg/mL、0.1-2.0 mg/ml或0.5-2.0 mg/mL。

对于其中氧气进入降解反应的产品，抗氧化效果可以通过取代氧气（空气）与产品接触来实现。在具体实施方案中，组合物不包括抗氧剂；作为替代，因子VII多肽对氧化的敏感性通过排除大气或通过取代氧气（空气）与产品接触加以控制。这可以例如通过用氮气或氩气饱和液体和在用气体取代产品上方的空气后密封最终容器来实现。

当然抗氧化剂也可与大气的排除结合使用。此外，组合物可避光保护；当然所述保护可以结合大气的排除和抗氧化剂的使用任一或两者。

因此，本发明还提供了气密容器（例如，小瓶或药筒（诸如，用于笔涂抹器的药筒）），所述气密容器含有如本文定义的液体含水药物组合物，和任选地含惰性气体。惰性气体可以选自氮气和氩气。所述容器（例如小瓶或药筒或注射器）通常由玻璃或塑料，特别是玻璃制成，任选通过橡胶隔膜或其它封闭件封闭，允许渗透并保存药物组合物的完整性。在进一步的实施方案中，容器是封闭在密封的袋中的小瓶或药筒，所述密封的袋例如密封的塑料袋，诸如层压的（例如金属（诸如铝）层压塑料袋）。

增溶剂

本发明的组合物可以含有增溶剂，以有利于稳定剂的溶液。例如，在因子VIIa的较高浓度和由此随后稳定剂的较高浓度，包括这样的试剂可被证明是有益的。特别是，具有低于6.5的pH的组合物可受益于包含增溶剂。

增溶剂的非限制性实例是：环糊精、二甲亚砜（DMSO）、2-羟丙基-β-环糊精（HPβCD）。

环糊精是一组在纤维素的细菌消化过程中形成的结构相关的天然产物。这些环状低聚糖由（α-1,4）-连接的α-D-吡喃葡萄糖单元组成，并且包含某种程度上亲脂性中心腔和亲水的外表面。天然α-、β-和γ-环糊精（αCD、βCD和γCD）分别由六、七和八个吡喃葡萄糖单元组成。商业利益的水溶性环糊精衍生物包括βCD和γCD的羟丙基衍生物，随机甲基化的β环糊精（RMβCD），和磺丁基醚β-环糊精钠盐（SBEβCD）。

环糊精的非限制性实例包括：α-环糊精（αCD）、β-环糊精（βCD）、2-羟丙基-β-环糊精（HPβCD）、磺丁基醚β-环糊精钠盐（SBEβCD）、随机甲基化的β-环糊精（RMβCD），和2-羟丙基-γ-环糊精（HPγCD）。在一个实施方案中，环糊精是HPβCD和/或HPγCD。

在一个实施方案中，增溶剂以5％（重量/体积）的浓度存在。

防腐剂

防腐剂可以包括在该组合物中以阻碍微生物的生长，并从而允许因子VIIa多肽的“多次使用”包装。防腐剂的实例包括苯酚、苯甲醇、沃尔托甲酚（orto-cresol）、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和苄索氯铵。防腐剂通常以0.1-20 mg/mL的浓度被包括，取决于pH范围和防腐剂的类型。

根据本发明的组合物可用作因子VII多肽稳定的和优选即用的组合物。当储存在从2℃至8℃的温度范围时，组合物通常稳定至少六个月，并且优选至多达36个月。在一个实施方案中，当储存在从2℃至8℃的温度范围时，组合物稳定24个月。在另一个实施方案中，当储存在从2℃至8℃的温度范围时，组合物稳定24个月，并且当储存在从25℃至30℃的温度范围时，稳定至少额外4周。当在2℃到8℃储存至少6个月时，组合物化学和/或物理稳定，特别是化学稳定。

术语“稳定”意在指（i）在2℃到8℃储存6个月或在20℃或更高储存2周后，组合物保留至少50%的其初始生物活性，如通过基本上如本说明书的测定1所述一阶段凝血测定所测量的，或（ii）在2℃到8℃储存6个月后，重链降解产物的含量增加是因子VIIa多肽初始含量的最多40%（w/w）。

术语“初始含量”指制备组合物时添加到组合物的因子VIIa多肽的量。

术语“组合物”和术语“制剂”在本专利申请全文中互换使用。

在一个实施方案中，在2到8℃储存6个月后，稳定的组合物保留其初始生物活性的至少70%，诸如，例如至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。

在本发明的不同实施方案中，在储存至少30天，诸如60天或90天后，稳定的组合物进一步保留其初始生物活性的至少50%，如通过基本上如本说明书的测定1所述一阶段凝血测定所测量。

在不同实施方案中，在稳定的组合物中重链降解产物的含量的增加不多于约10%，不多于约8%，不多于约5%，或不多于约3%的因子VIIa多肽的初始含量。重链降解产物的含量如下面测定2中所述测量。

术语因子VII多肽的“物理稳定性”涉及以因子VII多肽的二聚体、寡聚体和多聚体形式以及该分子的任何结构变形和变性的形式的不溶和/或可溶的聚集体的形成。物理稳定的组合物涵盖保持目测清澈的组合物。组合物的物理稳定性通常是组合物在不同温度下存储不同时间段后通过目视检查和浊度进行评价。组合物的目视检查在具有黑暗背景的强烈集中的光中进行。当组合物显示目视混浊的时候，其被分类为物理不稳定的。

术语“化学稳定性”意在指在溶液中在加速的条件下储存后，因子VII多肽中任何化学变化的形成。实例是导致因子VII多肽的片段形成的水解、脱酰胺和氧化以及酶促降解。具体而言，含硫的氨基酸倾向于氧化形成相应的亚砜。

术语“化学稳定的”意在指在2到8℃储存6个月后保留其初始生物学活性的至少50%的组合物，如通过一阶段凝血测定（测定1）所测量。

在不同实施方案中，在稳定的组合物中氧化/降解产物的含量的增加不多于约10%(w/w)，不多于约8%(w/w)，不多于约5%(w/w)，或不多于约3%的因子VIIa多肽的初始含量。氧化/降解产物的含量如下面测定2中所述测量。

不同实施方案

在一个实施方案中，所述FVIIa组合物包含2-5mg/ml FVIIa、相对FVIIa过量10-100μM的稳定剂、5-20 mM Ca²⁺、甲硫氨酸0.1-2.0 mg/mL，pH 6.5-7.0。在一个实施方案中，在储存期间保护组合物免于空气氧和/或避光保护组合物。保护免于氧可以例如通过用氧密封件封闭小瓶，或在密封前用氮气或惰性气体填充小瓶，或两者来完成。在进一步的实施方案中，组合物进一步包含聚山梨醇酯或泊洛沙姆。

在一系列实施方案中，本发明的液体组合物包含：

1-10 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基- 联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.1 μM-2.5 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca²⁺、0.1-2.0 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

1-10 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.1 μM-2.5 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca²⁺、0.25-5 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

1-10 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.1 μM-2.5 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca²⁺、0.5-1.50 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

2-5 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.1 μM-2.5 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca²⁺、0.1-2.0 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

2-5 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.1 μM-2.5 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca²⁺、0.25-5 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

2-5 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.1 μM-2.5 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca²⁺、0.5-1.50 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

1-10 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.75 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca²⁺、0.1-2.0 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

1-10 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.75 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca2+、0.25-5 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

1-10 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.75 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca2+、0.5-1.50 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

2-5 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.75 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca2+、0.1-2.0 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

2-5 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.75 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca2+、0.25-5 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

2-5 mg/mL因子VIIa、（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯-3-基]乙酰氨基}-琥珀酸（式I）或其药学上可接受的盐，以1.75 μM/1μM存在的因子VIIa的比例；6-50 mM Ca2+、0.5-1.50 mg/mL的甲硫氨酸、pH 6.5-7.5；

1.0-5.0 mg/mL 因子VIIa、30μM - 160μM 式I的活性位点稳定剂、1.47 mg/mL CaCl2.2H2O、7.50 mg/mL NaCl、0.5 mg/mL 甲硫氨酸、0.07 mg/mL 聚山梨醇酯、1.55 mg/mL 组氨酸、1.32 mg/mL 甘氨酰甘氨酸，pH 6.5-7.5；

1.0-5.0 mg/mL 因子VIIa、30μM - 160μM 式II的活性位点稳定剂、1.47 mg/mL CaCl2.2H2O、7.50 mg/mL NaCl、0.5 mg/mL 甲硫氨酸、0.07 mg/mL 聚山梨醇酯、1.55 mg/mL 组氨酸、1.32 mg/mL 甘氨酰甘氨酸，pH 6.5-7.5；

2.0 mg/mL 因子VIIa、70μM (0.04179 mg/mL; MW=596.57)式I的活性位点稳定剂、(MW=596.57 g/mol)、1.47 mg/mL CaCl2.2H2O、7.50 mg/mL NaCl、0.5 mg/mL 甲硫氨酸、0.07 mg/mL 聚山梨醇酯、1.55 mg/mL 组氨酸、1.32 mg/mL 甘氨酰甘氨酸，pH 6.5-7.5；

2.0 mg/mL 因子VIIa、70μM (0.04179 mg/mL; MW=596.57)式I的活性位点稳定剂、1.47 mg/mL CaCl2.2H2O、7.50 mg/mL NaCl、0.5 mg/mL 甲硫氨酸、0.07 mg/mL 聚山梨醇酯、1.55 mg/mL 组氨酸、1.32 mg/mL 甘氨酰甘氨酸，pH 6.8；

在上述具体实施方案中，所列的示例性组合物进一步包含聚山梨醇酯或泊洛沙姆和，任选地，环糊精。在其进一步的具体实施方案中，因子VIIa是人重组FVIIa（rhFVIIa）或无血清人重组FVIIa（sf-rhFVIIa）。

在进一步的具体实施方案中，在储存期间保护所述示例性组合物免于空气氧和/或避光保护组合物。保护免于氧可以例如通过用氧密封件封闭小瓶，或在密封前用氮气或惰性气体填充小瓶，或两者来完成。

制备组合物的方法

在进一步的方面，本发明还提供了用于制备因子VII多肽的液体含水药物组合物的方法，其包括提供在溶液中的因子VIIa多肽的步骤，所述溶液包含适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

使用方法

如将要理解的，本文中定义的液体含水药物组合物可以在医药领域中使用。因此，本发明特别提供了用作药物的，更具体为用作用于治疗因子VII反应性病症的药物的本文所定义的液体含水药物组合物。

因此，本发明还提供了如本文所定义的液体含水药物组合物在用于制备用于治疗因子VII反应性病症的药物中的用途，以及用于治疗因子VII反应性病症的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的如本文所定义的液体含水药物组合物。

本发明的制备物可用于治疗任何因子VII-反应性病症，诸如，例如出血性病症，包括那些由凝血因子缺乏引起的病症（如血友病A、血友病B、凝血因子XI缺乏症、凝血因子VII缺乏症）；由血小板减少症或血管性血友病引起的病症，或者由凝血因子抑制剂（例如凝血因子VIII或IX的抑制剂）引起的病症，和脑内出血，或任何原因的大量出血。该制备物也可施用到与外科手术或其它创伤相关的患者，或接受抗凝治疗的患者。本发明的制备物可用于与凝血因子缺乏（如血友病A、血友病B、凝血因子XI缺乏症、凝血因子VII缺乏症）；血小板减少症、血管性血友病、血小板无力症或者凝血因子抑制剂（例如凝血因子VIII或IX的抗体）相关或由其引起的出血的治疗。

术语“有效量”是由合格的医生确定的有效剂量，其可以调整剂量以实现所希望的患者应答。用于剂量考虑的因素包括效价、生物利用度、所希望的药代动力学/药效学概况、治疗条件、患者相关的因素（例如体重、健康、年龄等）、共施用的药物的存在（例如抗凝剂）、施用时间或医生所知的其它因素。

术语“治疗”定义为对象（例如哺乳动物，特别是人）的管理和护理，出于预防、缓解或治愈疾病或疾病、状况或病症的症状的目的。这包括施用因子VII多肽以预防症状或并发症的发作，或缓解所述症状或并发症，或消除疾病、状况或病症。根据本发明的包含因子VII的药物组合物可以胃肠外施用给需要该治疗的对象。这些胃肠外施用的非排除性实例是皮下、肌内、皮内或静脉内注射，任选地通过笔样装置、注射器，例如以预装注射器或输注泵的形式。

实施方案列表：

1.液体药物组合物，其包含：

因子VIIa多肽；

适合用于保持pH在约5.5-约8.5的范围内的缓冲剂；和

活性位点稳定剂，其是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

2.根据实施方案1的组合物，其中所述活性位点稳定剂是（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

3.根据实施方案1的组合物，其中所述活性位点稳定剂是（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

4.根据实施方案1的组合物，其中活性位点稳定剂是下列的混合物：

(S)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐；和

(R)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

5.根据实施方案1-4任一项的组合物，其中所述活性位点稳定剂的浓度相比FVIIa多肽的浓度（μM）过量>5 μM。

6.根据实施方案1-5任一项的组合物，其中所述活性位点稳定剂的浓度从比FVIIa多肽的浓度（μM）过量>5 μM到FVIIa多肽的浓度（μM）的2.5倍。

7.根据实施方案1-6任一项的组合物，其中所述活性位点稳定剂以相比因子VIIa的浓度过量5.5-100 μM、或5.5-50 μM、或5.5-30 μM、或5.5-10 μM、或6-50 μM、或6-30 μM、或6-10 μM存在；或所述活性位点稳定剂相比因子VIIa的浓度过量≥20 μM、或≥30 μM、或≥40 μM、或≥50 μM存在。

8.根据实施方案1-4任一项的组合物，其中活性位点稳定剂和FVIIa多肽之间的摩尔比（[活性位点稳定剂]：[FVIIa]）为：≥1.1、或≥1.25、或≥1.5、或在1.1-10的范围内、或在1.25-10的范围内、或在1.5-10的范围内、或在1.1-5的范围内、或在1.25-5的范围内、或在1.5-5的范围内、或约1.25、或约1.5、或约2、或约2.5。

9.根据实施方案1-5任一项的组合物，其中活性位点稳定剂和FVIIa多肽之间的摩尔比（[活性位点稳定剂]：[FVIIa]）为≥1.25或≥1.5。

10.根据实施方案1-9任一项的组合物，其中所述因子VIIa多肽以下列浓度存在：约0.3-200 mg/mL、或约0.3–120 mg/mL、或约0.5-100 mg/mL、或约0.5-20 mg/mL、或约1-10 mg/mL、或约1-5.5 mg/mL、或约2-20 mg/mL、或约2-15 mg/mL、或约2-10 mg/mL、或约2-5.5 mg/mL、或约2 mg/mL、或约5 mg/mL。

11.根据实施方案1-9任一项的组合物，具有从6.0-8.5、或6.0-7.5、或6.5-7.5、或7.0-7.5、或6.5-7.0的pH值。

12.根据实施方案1-11任一项的组合物，其中所述缓冲剂包含选自下列的酸和盐的至少一种组分：MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、组氨酸、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺、磷酸、乙酸、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸。

13.根据实施方案1-12任一项的组合物，其中所述制剂包含选自下列的二价金属离子：Ca²⁺, Mg²⁺和/或Mn²⁺。

14.根据实施方案13的组合物，其中所述二价金属离子是Ca²⁺。

15.根据实施方案1-14任一项的组合物，其中所述制剂是抗氧化剂。

16.根据实施方案15的组合物，其中所述抗氧化剂是甲硫氨酸。

17.根据实施方案1-16任一项的组合物，其中所述制剂包含张力调节剂。

18.根据实施方案17的组合物，其中所述张力调节剂选自：NaCl、甘露醇、蔗糖或这些的两种或更多种的混合物。

19.根据实施方案1-18任一项的组合物，其中所述制剂包含表面活性剂。

20.根据实施方案19的组合物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯或泊洛沙姆。

21.根据实施方案1-20任一项的组合物，其中所述制剂包含增溶剂。

22.根据实施方案21的组合物，其中所述增溶剂是环糊精。

23.根据实施方案1-22任一项的组合物，其中因子VII多肽是人因子VIIa或重组人因子VIIa或无血清重组人FVIIa。

24.根据实施方案1-23任一项的组合物，其中所述因子VII多肽是因子VII序列变体或因子VII衍生物。

25.治疗在需要该治疗的患者中因子VII反应性出血性病症的方法，包括向患者施用治疗有效量的根据实施方案1-26任一项的液体药物组合物和药学上可接受的载体。

26.根据实施方案1-24用于治疗因子VII反应性出血病症的液体药物组合物。

27.根据实施方案26的液体药物组合物，其中所述出血性病症选自：血友病A、血友病B、凝血因子XI缺乏症、凝血因子VII缺乏症、血小板减少和血管性血友病。

28.用于制备根据实施方案1-24的液体药物组合物的方法，包含步骤：

提供在溶液中的因子VIIa多肽，所述溶液包含适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

29.稳定化液体含水组合物中因子VIIa的方法，包含步骤：

提供在溶液中的因子VIIa多肽，所述溶液包含适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

30.包含如实施方案1-24所定义的液体含水药物组合物和任选地包含惰性气体的气密性容器。

31.根据实施方案30的气密性容器，包含选自氮气和氩气的惰性气体。

实施例

材料和方法

缩写

FVII = 凝血因子VII

FVIIa = 以其活化的、双链（切割的）形式的凝血因子VII

rFVIIa = 重组活化的因子VII

rhFVIIa = 活化形式的重组人因子VII

PEG = 聚乙二醇

sf-rFVIIa (SF-rFVIIa) = 活化形式的无血清重组因子VII

sf-rhFVIIa (SF-rhFVIIa) = 活化形式的无血清重组人因子VII

wt-FVII = 野生型因子VII

HPLC = 高效液相色谱

RP = 反相

SE = 大小排阻。

因子VII多肽的制备和纯化

适合用于本发明的人纯化的因子VIIa优选通过例如如Hagen 等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986, or as described in European Patent No. 0 200 421 (ZymoGenetics, Inc.)所述的DNA重组技术制备。在一些实施方案中，因子VIIa通过任何合适的制造方法制备。在一个实施方案，通过根据美国专利号6,903,069（通过引用整体并入）的无血清制造方法制备因子VII多肽。

因子VII还可以通过由Broze和Majerus, J.Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980以及Hedner和Kisiel, J.Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983所述的方法生产。这些方法获得无可检测量的其它凝血因子的因子VII。可以通过包括额外的凝胶过滤作为最终纯化步骤获得甚至进一步纯化的因子VII制备物。因子VII然后通过已知手段，例如通过几种不同的血浆蛋白，诸如因子XIIa、IX a或Xa转化成活化的因子VIIa。或者如Bjoern 等(Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)所述，因子VII可以通过将其经过离子交换色谱柱，诸如Mono Q (Pharmacia fine Chemicals)等，或通过在溶液中自活化来进行活化。

可以通过野生型因子VII或通过重组技术生产因子VII变体。可以通过修饰编码野生型因子VII的核酸序列生产相比野生型因子VII具有改变的氨基酸序列的因子VII变体，所述修饰通过已知手段，例如通过位点特异性诱变在编码天然因子VII的核酸中通过改变氨基酸密码子或通过去除一些氨基酸密码子。

本领域技术人员明白，可以在对因子VIIa分子功能至关重要的区域之外制造取代并仍然导致有活性的多肽。因子VII多肽的活性必需的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基可以根据本领域已知的方法鉴定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（参见，例如Cunningham 和 Wells, 1989, Science 244: 1081-1085）。在后者技术，在分子中每个带正电的残基处引入突变，并且分别对于凝结剂，交联活性测试所得到的突变分子，以鉴定对分子的活性至关重要的氨基酸残基。也可以通过三维结构的分析来确定底物-酶相互作用位点，所述三维结构如由诸如下列技术所确定：核磁共振分析、结晶学或光亲和标记（参见，例如de Vos 等, 1992, Science 255: 306-312; Smith 等, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver 等, 1992, FEBS Letters 309: 59-64）。

向核酸序列引入突变以交换一个核苷酸为另一个核苷酸可使用任何本领域已知的方法通过定点诱变来完成。特别有用的是利用具有目的插入物的超螺旋双链DNA载体和含有所需突变的两个合成引物的方法。寡核苷酸引物，每个与载体的相反链互补，通过Pfu DNA聚合酶在温度循环期间延伸。掺入引物后产生突变的包含交错切口的突变质粒。温度循环后，产物用DPNI处理（所述DPNI对于甲基化和半甲基化的DNA是特异性的），以消化亲本DNA模板，并选择包含突变的合成的DNA。也可使用本领域已知的用于创建、鉴定和分离变体的其它方法，诸如，例如，基因改组或噬菌体展示技术。

多肽从它们的起源细胞的分离可通过本领域已知的任何方法来实现，包括，但不限于，去除含有来自贴壁细胞培养物的所需产物的细胞培养基；离心或过滤以去除非粘附细胞，等等。

任选地，因子VII多肽可以被进一步纯化。可以使用本领域中已知的任何方法实现纯化，包括，但不限于，亲和色谱，诸如，例如，在抗因子VII抗体柱上（参见，例如，Wakabayashi等，J. Biol. Chem. 261:11097, 1986；和Thim 等, Biochem. 27:7785, 1988）；疏水性相互作用色谱法；离子交换色谱法；尺寸排阻色谱法；电泳方法（例如，制备型等电聚焦（IEF），差别溶解度（例如，硫酸铵沉淀），或萃取等。参见，通常，Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982；和Protein Purification, J.C. Janson和Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989。纯化后，制备物优选包含少于10重量%，更优选少于5%和最优选少于1%的衍生自宿主细胞的非因子VII多肽。

可以通过蛋白水解切割活化因子VII多肽，使用因子XIIa或具有胰蛋白酶样特异性的其它蛋白酶，诸如，例如因子IXa、激肽释放酶、因子Xa和凝血酶。参见，例如Osterud 等, Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, 美国专利号4,456,591；和Hedner 等, J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)。可选地，因子VII多肽可以通过使其经过离子交换色谱柱，诸如Mono Q? (Pharmacia)等或通过在溶液中自活化加以活化。所得的活化的因子VII多肽可以然后如本申请所述配制和施用。

因子VII衍生物诸如糖PEG化的FVIIa可以例如通过肽的重塑和糖缀合制成，例如，如WO 03/031464和WO 04/099231和WO 02/077218中所公开。

适合用于确定因子VII多肽生物学活性的测定法

根据本发明有用的因子VII多肽可以通过合适的测定法进行选择，可以如体外测试中简单的预备进行所述测定

一阶段凝血测定（凝血测定）（测定1）

凝血测定用于评价因子VIIa多肽制造血凝块的能力。为此目的，待测试的样品稀释在50 mM PIPES-缓冲剂, pH 7.2, 1% BSA或具有类似性质的其它相关缓冲剂中，并且40 μl与40 μl因子VII缺陷或缺失的血清和80 μl含10 mM Ca2+和合成磷脂的人重组组织因子一起孵育。测量凝固时间（凝血时间）并与在平行线测定中使用参考标准品的标准曲线进行比较。

适合用于测量因子VII多肽的降解的测定法

rFVIIa片段化和氧化产物的测量（测定2）

rFVIIa的重链片段化和氧化产物通过反相HPLC确定。RP-HPLC在专有的具有5μm粒径和300?孔径的4.5x250 mm丁基键合硅胶柱上运行。柱温：70℃。A-缓冲液：0.1% v/v 三氟乙酸。B-缓冲液：0.09% v/v 三氟乙酸，80% v/v 乙腈。柱用在30分钟内X至(X+13)% B的洗脱梯度进行洗脱。调节X使得FVIIa洗脱物具有约26分钟的保留时间。流速：1.0 mL/min。检测：214 nm。载荷：20-25 μg FVIIa。

rFVIIa聚集产物的测量（测定3）

为了确定聚集的rFVIIa种类（二聚体，寡聚体）的含量，使rFVIIa样品进行分析型SE-HPLC。使用Waters Protein Pack 300 SW (80013) (7.5 mm × 300 mm)柱进行分析型SE-HPLC。柱温：23°-25℃。流动相是流速为0.5 mL/min的0.2M硫酸铵，5％（V / V）2-丙醇缓冲液。柱载荷：10 μg – 25 μg SF-FVIIa。UV-检测在215 nm。

rFVIIa脱酰胺产物的测量（测定4）

在下面的工作实施例中的脱酰胺的rFVIIa产物的含量通过肽图描述。报告的绝对值可以仅用作指标和大约的评价，因为还没有开发准确定量此杂质的方法。

在天然蛋白上进行胰蛋白酶消化，并且消化后所获得的肽通过RP-HPLC分析。最初，样品使用NAP5 柱(GE Healthcare)脱盐进入含有2 M尿素、50mM Tris、2 mM CaCl₂和8 mM甲胺的消化缓冲液。使用消化缓冲液将缓冲液交换的rFVIIa稀释到0.15 mg/mL。溶解在重悬缓冲液（Promega）中的胰蛋白酶用于rFVIIa的消化，具有1:10 (w/w)的胰蛋白酶对rFVIIa的比值。样品在40℃孵育6小时。孵育后，向样品添加三氟乙酸到2%（v/v）的终浓度。立即冷冻样品以停止酶促反应或通过RP-HPLC直接分析。

对于RP-HPLC，由胰蛋白酶消化产生的肽使用Jupiter C18 (3μm, 2 x 150 mm, Phenomenex)柱分离。柱温是45℃，流速0.25 mL/min，在215 nm检测肽。注射18 μL体积的样品。溶剂是：A-缓冲液：0.06% 三氟乙酸水溶液，和B-缓冲液：0.055%三氟乙酸溶于90%乙腈。使用2.0-29.0% B-缓冲液经过82分钟、29.0-43.0 B-缓冲液经过14分钟、43.0-78.0 B-缓冲液经过35分钟的线性梯度随后使用100% B-缓冲液5分钟进行分离。

稳定剂的合成

用于制备充当根据本发明的稳定剂的化合物的方法，包括合适的起始材料，描述于美国专利号US 7,479,502 B2 (在2004年6月17日公布为WO 2004/050637)；参见特别是实施例17（109-113栏）具体指111栏，第8-15行中的化合物。此外，WO 2005/118554（在2005年12月15日公布）描述了用于制造该化合物的方法，参见实施例，第36-54页，具体是实施例1和2（第48-54页）。

化合物（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸具有式I：

　　　　　　　　　　　　(I)。

化合物（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸具有式II：

　　　　　　　　　　　　(II)。

工作实施例

实施例1——（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸 (18)的合成

（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸 (18)的总合成如US2008/0275250 A1第16-23页所述并如方案1所示完成。

方案1：

参考 F (4)

参考 E (8) (方法 A)

来自 US2008/0275250的实施例1

。

实施例2——（R）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸 (20)的合成

R-对映体 (20)如方案2所示合成，从化合物（16）开始并使(L)-H-Asp-(OBn)-OBn).TsOH与相应的(D)-H-Asp-(OBn)-OBn.TsOH (Bachem)交换，但应用用于合成化合物（17）的类似反应条件。

化合物（19）的合成：

化合物 (16) (65.2 g)溶解在DMF (650 g)中，并且溶液冷却到‐5℃。添加(D)‐Asp(OBn)₂*p‐TsOH (64.1 g, 1.05 eq.) 和 N‐甲基‐吗啉(51.1 g, 4.0 eq.)。在5℃搅拌悬浮液直至获得溶液，并且添加HATU (50.0 g, 1.05 eq.)。将反应混合物在-5℃下搅拌1小时，转移到在45℃下MeCN（425g），2-丙醇（628g）和软化水（3117g）的混合物中。将澄清的溶液中加入晶种，在35-40℃下搅拌3小时，并冷却至10℃。将悬浮液在10℃搅拌过夜，并过滤。将滤饼用软化水洗涤（355g）和在25℃下在真空中干燥，得到作为R-异构体的72.1g化合物（19）。

收率：73.8 %

纯度(HPLC230 nm): 89.3 %。

化合物（20）的合成：

化合物(19) (69.9 g)悬浮在乙酸(1417 g)和软化水(720 g)中。将该悬浮液加热到45℃，添加催化剂（1.97g，20％ Pd（OH）₂），并将该混合物在1150‐1200 mbar氢化1小时，以形成透明的溶液。过滤去除催化剂并浓缩滤液至干燥。粗产物悬浮在乙酸（1084g）和水（824g）中并加热到80℃以形成溶液。缓慢加入软化水(3275 g)。添加1.0L后，向混合物加入晶种（T =62℃），并将剩余的水加入，同时保持温度在55℃。将悬浮液冷却至0℃超过6小时，并在0℃下搅拌过夜。将产物通过过滤分离，将滤饼用软化水（314g）洗涤和在25℃下在真空中干燥，得到39.3g化合物（20）（R-异构体），作为黄色结晶固体。

收率：73.1%

纯度(HPLC230 nm): 97.7%。

方案2：

。

实施例3-FVIIa的降解

测试了5℃、25℃和30℃下储存在环境湿度和黑暗中的药筒中的包括活性位点稳定剂的不同液体制剂的实时稳定性。实时稳定性研究表明，当储存在5℃，和在25℃或30℃下短时间储存时，可能获得稳定的液体的rFVIIa或液体的rFVIIa类似物产品。重链片段化被活性位点稳定剂有效地抑制。在5℃没有观察到重链片段增加，并且在25℃或30℃2个月期间观察到只有很轻微的增加。当足量的抗氧化剂被添加到制剂中时，在5℃没有观察到氧化并且在25℃或30℃观察到有限的氧化。观察到rFVIIa的脱酰胺，并观察到随pH值和温度增加而增加。稳定性研究表明，效价不受脱酰胺形式的水平增加的影响。

制备下列7种组合物：

A：1 mg/mL (=20 μM) rFVIIa、30μM 活性位点稳定剂、128.3 mM NaCl、8 mM CaCl₂.2H₂O、10 mM 组氨酸、3.4 mM 甲硫氨酸、10 mM 甘氨酰甘氨酸、0.07 mg/mL Tween80，pH 6.7。

B：4.5 mg/mL (=20 μM) rFVIIa、30μM 活性位点稳定剂、128.3 mM NaCl、8.7 mM CaCl2.2H2O、10 mM 组氨酸、3.4 mM 甲硫氨酸、10 mM 甘氨酰甘氨酸、0.07 mg/mL Tween80，pH 6.7。

C：1 mg/mL (=20 μM) rFVIIa、40μM 活性位点稳定剂、128.3 mM NaCl、8 mM CaCl₂.2H₂O、10 mM 组氨酸、6.8 mM 甲硫氨酸、10 mM 甘氨酰甘氨酸、0.5 mg/mL 泊洛沙姆188，pH 6.7。

D：1 mg/mL (=20 μM) SF-rFVIIa、30μM 活性位点稳定剂、128.3 mM NaCl、8 mM CaCl₂.2H₂O、10 mM 组氨酸、3.4 mM 甲硫氨酸、10 mM 甘氨酰甘氨酸、0.07 mg/mL Tween80、pH 6.7。

E：1 mg/mL (=20 μM) SF-rFVIIa、128.3 mM NaCl、10 mM CaCl₂.2H₂O、10 mM 组氨酸、3.4 mM 甲硫氨酸、10 mM 甘氨酰甘氨酸、0.07 mg/mL Tween80、pH 6.5。

F：1 mg/mL (=20 μM) rFVIIa类似物(V158D/E296V/M298Q-FVIIa)、25μM 活性位点稳定剂、128.3 mM NaCl、10 mM CaCl₂.2H₂O、10 mM 组氨酸、3.4 mM 甲硫氨酸、10 mM 甘氨酰甘氨酸、0.07 mg/mL Tween80，pH 6.5。

G：1 mg/mL (=20 μM) rFVIIa类似物(V158D/E296V/M298Q-FVIIa)、50μM 活性位点稳定剂、128.3 mM NaCl、10 mM CaCl₂.2H₂O、10 mM 组氨酸、3.4 mM 甲硫氨酸、10 mM 甘氨酰甘氨酸、0.07 mg/mL Tween80，pH 6.5。

组合物在5℃，25℃和30℃进行储存。在选定的时间间隔取出储存的样品，并如测定2所述测试重链片段化（表示为“HC片段”）和氧化形式，如测定3中所述测试聚集（表示为“二聚体/寡聚体”），和如测定4所述测试脱酰胺形式。

实施例4-FVIIa的效价

如实施例3中所述构成的7种制剂A、B、C、D、E、F和G在40℃下存储14天。每天将样品取出储存并测试效价（FVIIa活性）。通过凝血测定显示效价（如测定1所述）。

实验表明在存在具有式I的活性位点稳定剂的情况下维持了FVIIa活性（效价）。

实施例5——在存在具有式II（R-异构体）的活性位点稳定剂的情况下rFVIIa的降解

分别测试rFVIIa在包含式II（R-异构体）所述活性位点稳定剂的不同的液体制剂中在25℃和40℃的加速稳定性。在储存在环境湿度和黑暗下的1 mL HPLC小瓶中进行测试。

制备下列组合物：

H. 1 mg/mL SF-rFVIIa、50 μM 活性温度稳定剂 (R-异构体)、10 mM CaCl₂.2H₂O、128.3 mM NaCl、10 mM 甘氨酰甘氨酸、3.4 mM L-甲硫氨酸、10 mM L-组氨酸、0.07 mg/mL tween 80、0.5% (v/v) 二甲亚砜，pH 6.0。

I. 1 mg/mL SF-FVIIa、150 μM 活性温度稳定剂 (R-异构体)、10 mM CaCl₂.2H₂O、128.3 mM NaCl、10 mM 甘氨酰甘氨酸、3.4 mM L-甲硫氨酸、10 mM L-组氨酸、0.07 mg/mL tween 80、0.5% (v/v) 二甲亚砜，pH 6.0。

组合物H在25℃和40℃进行存储，而组合物I在40℃进行存储。在选定的时间间隔（0、1、7和14天）将样品取出储存，并如测定2中所述测试重链片段化和氧化，和如测定3所述测试聚集。

研究表明，在25℃或40℃短时间内存储期间使用活性位点稳定剂赋形剂有可能获得稳定的液体rFVIIa产物。在25℃或40℃的14天期间没有观察到重链片段化或聚集的增加。当将不充分的量的抗氧化剂加入到制剂中时，在25℃没有观察到氧化，但在40℃观察到氧化。

实施例6——在存在活性位点稳定剂的情况下rFVIIa的降解

分别在25℃和40℃测试了在包含S-2-[3-（4-脒基苯基）脲基]-N-[1-（3-甲氧基苯基）-乙基]-乙酰胺（式A）（指定为“008”）的不同液体制剂中rFVIIa的加速的稳定性。在储存在环境湿度和黑暗下的1 mL HPLC小瓶中进行测试。

S-2-[3-（4-脒基苯基）脲基]-N-[1-（3-甲氧基苯基）-乙基]-乙酰胺：

。

制备下列组合物：

J. 1 mg/mL SF-rFVIIa、50 μM S-2-[3-（4-脒基苯基）脲基]-N-[1-（3-甲氧基苯基）-乙基]-乙酰胺、10 mM CaCl₂.2H₂O、128.3 mM NaCl、10 mM 甘氨酰甘氨酸、3.4 mM L-甲硫氨酸、10 mM L-组氨酸、0.07 mg/mL tween 80、0.5% (v/v) 二甲亚砜，pH 6.0。

K. 1 mg/mL SF-rFVIIa、500 μM S-2-[3-（4-脒基苯基）脲基]-N-[1-（3-甲氧基苯基）-乙基]-乙酰胺、10 mM CaCl₂.2H₂O、128.3 mM NaCl、10 mM 甘氨酰甘氨酸、3.4 mM L-甲硫氨酸、10 mM L-组氨酸、0.07 mg/mL tween 80、0.5% (v/v) 二甲亚砜，pH 6.0。

分别在25℃和40℃储存组合物J和K。在选定的时间间隔（0、1、7和14天）将样品取出储存，并如测定2中所述测试重链片段化和氧化。先前在测定2（= RP-HPLC）中未鉴定的降解产物的出现在40℃储存时明显。如测定3所述分析聚集。

研究表明，在25℃或40℃短时间储存期间，在条件J和K，从150 μM到500 μM的浓度范围内，相比使用式A赋形剂的液体rFVIIa产品，含有式Ⅱ（R-形式）所示化合物的液体rFVIIa产品获得了更好的稳定性。在40℃下14天期间，观察到rFVIIa重链片段，不明的降解产物，氧化形式和聚集的增加。除了重链片段的所有降解产物在25℃增加较少。

实施例7——在存在活性位点稳定剂的情况下rFVIIa的生物活性

在FVIII敲除（F8-KO）小鼠(Bi L, Sarkar R, Naas T, Lawler AM, Pain J, Shumaker SL 等 Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood 1996;88:3446-)的尾部出血实验中研究了与具有式I的活性位点稳定剂以1：1.75的摩尔比共同配制的重组凝血因子VIIa（rFVIIa）相比rFVIIa在剂量1.25、2.5、5、10和12.5 mg/kg的生物体内效力和效价。

rFVIIa、rFVIIa：活性位点稳定剂（1：1.75）或媒介物在小鼠尾静脉中给药5分钟后，通过在尾部尖端4毫米横切，在异氟醚麻醉的F8-KO小鼠中起始尾部出血实验。如在别处所述在37℃盐水中测量30分钟时间的出血时间和失血(Elm T; Karpf DM; ?vlisen K; Pelzer H; Ezban M; Kjalke M; Tranholm M. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia, 2012;18 (1), 139-145.)。失血ED50分别对于rFVIIa计算为 2.12 mg/kg (95%CI 1.28-3.53)和对rFVIIa:活性位点稳定剂(1:1.75)计算为2.05 mg/kg (95%CI 0.92-4.53)，p=0.94。rFVIIa和rFVIIa：活性位点稳定剂（1：1.75）的出血时间相对剂量显示出非常相似的剂量应答曲线。

结论是，在F8-KO小鼠急性尾部出血实验中在rFVIIa和与活性位点稳定剂共配制的rFVIIa之间在剂量反应方面无显著差异。

实施例8——在存在活性位点稳定剂的情况下SF-rFVIIa的生物活性

以1、2.5、5、10和15 mg/kg的浓度用与F8-KO小鼠尾部出血模型相同的设计，研究了无血清重组FVIIa（SF-rFVIIa），和与式I所示活性位点稳定剂以1：2.5的摩尔比共配制的SF-rFVIIa的体内作用。在本研究中失血ED₅₀对于SF-rFVIIa和SF-rFVIIa：活性位点稳定剂（1：2.5）分别计算为2.1mg/kg和2.6 mg/kg，p=0.53（数据未显示）。出血时间相对剂量和失血，以及出血时间相对SF-FVIIa和SF-rFVIIa：活性位点稳定剂的暴露，显示非常相似的剂量应答曲线。如通过ELISA和凝块活性测量的SF-rFVIIa的暴露的平均值指示当与活性位点稳定剂共同配制时，显著增加的SF-rFVIIa的暴露（双因素ANOVA P <0.01）。最高剂量（15 mg/kg）后在血浆中测量的抗原浓度对于SF-rFVIIa和具有活性位点稳定剂的SF-rFVIIa分别为1168±50 nm和1365±152 nM（P = NS）。在相同剂量，凝血活性对于SF-rFVIIa是1195 nM，并且对于当与活性位点稳定剂共配制时的SF-rFVIIa是1735 nM（P <0.001）。尽管这增加了暴露，但是没有鉴定到活性位点稳定剂对EC₅₀估测值有统计学显著的影响。

总之，在血友病A小鼠的尾出血模型中对单独SF-rFVIIa或与活性位点稳定剂共配制的SF-rFVIIa（1：2.5）展示了相当的剂量应答关系。在单独和与活性位点稳定剂共配制的15 mg/kg SF-rFVIIa中观察到了出血的正常化。当SF-rFVIIa与活性位点稳定剂共施用时，观察到了SF-rFVIIa增加的暴露（ELISA和凝血活性）。尽管在更高的血浆水平也没有检测到EC₅₀的显著的差异。

实施例9——FVIIa序列变体V158D/E296V/M298Q-FVIIa在存在活性位点稳定剂的情况下的生物活性

在相同的F8-KO小鼠尾部出血模型中，我们研究了当与SF-rFVIIa共配制时使用活性位点稳定剂的S或R形式的作用，和rFVIIa变体（V158D/ E296V/M298Q-FVIIa）（Vatreptacog Alfa）单独或与式I所示活性位点稳定剂组合（1：2.5）给药的作用（表13）。

Vatreptacog Alfa是FVIIa序列变体V158D/E296V/M298Q-FVII（编号指人野生型FVIIa的序列SEQ ID NO：1），其中野生型人序列的三个氨基酸已经被替换。

相比正常的C57BL小鼠在媒介物给药的F8-KO小鼠中失血时间显著更长（P <0.001）。10 mg/kg的SF-rFVIIa或与式I（S-形式）所示活性位点稳定剂以1：1或1：2.5的比例或与式II（R-形式）（1：1）活性位点稳定剂一起的SF-rFVIIa的施用显著减少在F8-KO小鼠中的失血（P <0.001，相比F8-KO对照小鼠）。3 mg/kg的Vatreptacog Alfa或Vatreptacog Alfa：活性位点稳定剂（1：2.5）的施用显著减少在F8-KO小鼠中的失血（P <0.001，相比F8-KO对照小鼠）。来自化合物给药组的失血并与媒介物处理的C57BL对照组没有显著不同。

总之，单独或与活性位点稳定剂至多达1：2.5的摩尔比共同配制的SF-FVIIa和Vatreptacog Alfa使F8-KO小鼠中的失血正常化。在R和S形式的活性位点稳定剂之间没有发现显著差异。

通过切割尾部4毫米尖端注射诱导出血前5分钟给予静脉注射。相比F8-KO小鼠（P <0.0001），所有组均显著不同，在给药组或C57BL对照小鼠（单因素ANOVA）之间没有发现显著不同。

总之，这些实验表明，在F8-KO小鼠尾部出血模型中，式I和II（以S或R形式）所示活性位点稳定剂不损害rFVIIa、SF-FVIIa或Vatreptacog Alfa的生物活性。

实施例10——活性位点稳定剂对rFVIIa多肽的结合

所有蛋白酶在结合缓冲液：10mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl，0.005％v/v表面活性剂P20，5mM的CaCl₂中充分透析。所有结合实验在结合缓冲液中进行，除非另有说明。式I所示活性位点稳定剂溶解在50mM Tris，pH8.0到9 mM的终浓度，给出黄色。选择等温滴定量热法（iTC₂₀₀，来自GE healthcare）作为用于确定结合参数的所选方法。每次iTC₂₀₀运行涉及用蛋白酶（约200μL）填充小池，并用活性位点稳定剂填充（约40μL）注射器。如所需设置温度，并允许蛋白酶在给定的实验条件下（约10分钟）达到平衡。通常向含有蛋白酶的小池中进行17-20次活性位点稳定剂的注射（2-2.5 μL）。第一次注射总是0.2 μL，并且从最终数据分析中去除。搅拌速率设置在700-1000rpm之间。对于数据采集的筛选阶段是5秒，具有高反馈模式设置。每次滴定间隔120秒。加工原始数据以设置基线，对每个峰积分以获得最终等温线。将此等温线拟合到单位点模式以获得K_d、化学计量(n)、ΔH和ΔSz值来完成活性位点稳定剂与蛋白酶的结合的表征。每个结合实验重复至少两次。表14、15和16总结了活性位点稳定剂与SF-FVIIa和Vatreptacog alfa在如下所示的不同溶液条件下的结合。

表14：使用iTC200对于不同活性位点稳定剂与SF-FVIIa结合的解离常数K _d 的总结。在结合缓冲液中和在20℃进行测量。式A赋形剂以1.78uM的亲和力结合SF-FVIIa。具有式II（R-形式）的活性位点稳定剂结合到SF-rFVIIa，具有12nM的亲和力，并且具有式I（S-形式）的活性位点稳定剂结合到SF-rFVIIa，具有20nM的亲和力。

表15：使用iTC₂₀₀对于具有式I（S-形式）的活性位点稳定剂与SF-rFVIIa, rFVIIa和V158D/E296V/M298Q-FVIIa结合的解离常数K _d 的总结。如表中所示，在不同温度（20℃和37℃）在结合缓冲液中进行测量。观察到具有式I（S-形式）的活性位点稳定剂与SF-rFVIIa、rFVIIa和Vatreptacog alfa的结合在较高的温度下较弱。对于SF-FVIIa、rFVIIa和V158D/E296V/M298Q-FVIIa在20℃和37℃的结合的倍数差异分别是17倍、23倍和21倍。

表16：使用iTC₂₀₀对于具有式I（S-形式）的活性位点稳定剂与SF-rFVIIa和V158D/E296V/M298Q-FVIIa结合的解离常数K _d 的总结。在结合缓冲液中但用不同的pH进行测量。对于具有式I（S-形式）的活性位点稳定剂，两种蛋白酶均在pH7-7.5显示最高的亲和力。相比SF-rFVIIa，V158D/E296V/M298Q-FVIIa显示较少依赖pH。

实施例11——通过X-射线晶体学描述的（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸对FVIIa的活性位点的稳定作用

材料

以7 mg/mL的蛋白浓度在由10mM 2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇、100 mM NaCl、100 mMCaCl₂ pH 7.4组成的缓冲液中的人FVIIa（SEQ ID NO：1的氨基酸残基46-406）的Gla结构域截短形式和浓度超过140 μM的（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸。

方法

蛋白结晶

与（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸复合的FVIIa的Gla-结构域截短形式在坐式蒸汽扩散试验中在20℃结晶，通过由100 nL蛋白溶液和100 nL储集溶液组成的液滴相对由15％（w/v）聚乙二醇20000、100mM 2-[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸 pH 7.0构成的储集溶液的平衡。晶体在2周后出现并进行生长额外2周。晶体和结晶滴覆盖有1μL 4M三甲胺N-氧化物二水合物并且将晶体通过三甲胺N-氧化物二水合物拖动并封固在0.06 mm直径的litholoop中（Molecular Dimensions Limited），随后晶体在液氮中通过闪蒸冷却用于衍射分析。

X-射线衍射数据收集，结构确定和细化

在1.000?的波长操作的Maxlab II同步加速器的MX波束线收集衍射数据，具有198.15mm的晶体与检测器距离和0.5度的每框架振荡幅度。利用mosflm程序(Leslie和Powell, NATO Science Series, 245, 41-51 (2007))和scala程序(Potterton 等, Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))对原始数据图像进行索引、整合和缩放。晶体的空间群是P2(1)2(1)2(1)，具有晶胞参数，a = 94.1 ?, b = 94.2 ?, c = 107.3 ?, α = 90°, β = 90°, γ = 90°。收集数据到1.90 ?的分辨率。数据用双操作器（K,H,-L）和0.495的孪晶分数（twin fraction）进行孪晶化。使用Molrep软件(Vagin and Teplyakov, J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997))如CCP4i程序包(Potterton 等, Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))中所实施的通过分子替换解析结构。检索模型是Banner等 (Nature 380, 41-46 (1996))所述的人FVIIa的结构。两个拷贝的Gla-结构域截短的FVIIa位于非对称单元中。使用来自CCP4i程序包的Refmac5 (Murshudov 等, Acta Crystallogr. D53, 240-255 (1997))进行结构细化，并且使用Coot version 7 (Emsley 等, Acta Crystallogr. D66, 486-501 (2010))用于手工结构重建和验证。

结果和讨论

Gla-结构域截短的FVIIa和（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸之间的复合物的晶体结构坐标，包括来自不对称单元中FVIIa分子的一个拷贝的氨基酸残基L89-R144, I153-P406 (SEQ ID NO: 1)和来自不对称单元中FVIIa分子的另一个拷贝的氨基酸残基L89-K143, I153-K316, P321-P406 (SEQ ID NO: 1)。细化的结构的总体R-因子是18.0%并且自由R-因子是20.6%。总体相关系数是0.96，并且衍射分量精度指数DPI = 0.02 ? (Cruickshank, Acta Crystallogr. D55, 583-601 (1999))。结构中键长与理想键长的均方根偏差=0.0044?，并且与理想键角的均方根偏差=1.1246°(Engh 和 Huber, Acta Crystallogr. A47, 392-400 (1991))。在Gla-结构域截短的FVIIa分子和（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸之间展示小于等于4 ?的分子间距离的氨基酸残基被指定为（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸相互作用氨基酸残基（SEQ ID NO: 1）。使用CCP4 程序包(Potterton et al., Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))中的程序Contact进行分子间距离的分析，并且显示表17所列氨基酸残基包含不对称单元中两个FVIIa分子中的（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸相互作用氨基酸残基。

在原子水平，FVIIa的活性位点和（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸之间的相互作用涉及表18所列的原子。

下式（I-NO）显示对于化合物(S)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸在表18中使用的原子编号：

该例子证实(S)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸通过与包括催化氨基酸残基His193和Ser344（SEQ ID NO: 1）和相邻活性位点口袋的FVIIa活性位点相互作用来稳定化因子FVIIa。

上述例子阐释了本发明的实施。这些实施例被包括仅用于说明性目的并且不意在以任何方式限制要求保护的发明的范围。

尽管本文已阐释并描述了本发明的某些特征，但是很多修饰、替换、改变和等价物将对于那些本领域技术人员是会想到的。因此，应当理解，所附的权利要求意在涵盖所有这些修饰和变化，如同落入本发明的真实精神内。

　　　　　　　　　　　　　　　　序列表

<110> Novo Nordisk A/S

<120> 因子VII多肽的液体药物组合物

<130> 8602WO01

<160> 1

<170> BiSSAP 1.0

<210> 1

<211> 406

<212> PRT

人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..406

<223> /分子_类型="蛋白"

          /注释=“野生型人凝血因子VII”

          /生物=“人工序列”

<220>

<221> MOD_RES

<222> 6,7,14,16,19,20,25,26,29,35

<223> γ-羧基谷氨酸

          /

<400> 1

Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa

1               5                   10                   15

Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys

            20                   25                  30

Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp

        35                   40                  45

Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln

    50                   55                  60

Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65                   70                  75                  80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly

                85                   90                  95

Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys

            100                  105                110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr

        115                  120                125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg

    130                  135                140

Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro

145                  150                155                  160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln

                165                  170                175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala

            180                  185                190

His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu

        195                  200                205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg

    210                  215                220

Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn

225                  230                235                  240

His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp

                245                  250                255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr

            260                  265                270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu

        275                  280                285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg

    290                  295                300

Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser

305                  310                315                  320

Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser

                325                  330                335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr

            340                  345                350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys

        355                  360                365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile

    370                  375                380

Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu

385                  390                395                  400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro

                405

Claims (14)

1.液体药物组合物，其包含：

因子VIIa多肽；

适合用于保持pH在约5.5-约8.5的范围内的缓冲剂；和

选自下列的活性位点稳定剂：

(S)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸（式I），或其药学上可接受的盐；

(R)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸（式II），或其药学上可接受的盐；

(S)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸或其药学上可接受的盐；和(R)-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸或其药学上可接受的盐的混合物。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述活性位点稳定剂是（S）-2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述活性位点稳定剂相比因子VIIa的浓度过量5.5-100 μM、或5.5-50 μM、或5.5-30 μM、或5.5-10 μM、或6-50 μM、或6-30 μM、或6-10 μM存在；或所述活性位点稳定剂相比因子VIIa的浓度过量≥20 μM、或≥30 μM、或≥40 μM、或≥50 μM存在。

4.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述活性位点稳定剂和FVIIa多肽之间的摩尔比（[活性位点稳定剂]：[FVIIa]）是在1.25-1.75的范围，或1.5，或1.75。

5.根据权利要求1-4任一项的组合物，其中所述因子VIIa多肽以下列浓度存在：约0.3-200 mg/mL、或约0.3–120 mg/mL、或约0.5-100 mg/mL、或约0.5-20 mg/mL、或约1-10 mg/mL、或约1-5.5 mg/mL、或约2-20 mg/mL、或约2-15 mg/mL、或约2-10 mg/mL、或约2-5.5 mg/mL、或约2 mg/mL、或约5 mg/mL。

6.根据权利要求1-5任一项的组合物，具有从6.0-8.5、或6.0-7.5、或6.5-7.5、或7.0-7.5、或6.5-7.0、或6.7-6.9的pH值。

7.根据权利要求1-6任一项的组合物，其中所述制剂包含抗氧化剂、张力调节剂、表面活性剂的一种或多种。

8.根据权利要求1-7任一项的组合物，其中因子VII多肽是人因子VIIa或重组人因子VIIa或无血清重组人FVIIa。

9.根据权利要求1-7任一项的组合物，其中所述因子VII多肽是因子VII序列变体或因子VII衍生物。

10.治疗在需要该治疗的患者中因子VII反应性出血性病症的方法，包括向患者施用治疗有效量的根据权利要求1-9任一项的液体药物组合物和药学上可接受的载体。

11.根据权利要求1-9用于治疗因子VII反应性出血病症的液体药物组合物。

12.用于制备根据权利要求1-9的液体药物组合物的方法，包含步骤：

提供在溶液中的因子VIIa多肽，所述溶液包含适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

13.稳定化液体含水组合物中因子VIIa的方法，包括步骤：

提供在溶液中的因子VIIa多肽，所述溶液包含适合用于保持pH在约5.5-约8.5范围内的缓冲剂和活性位点稳定剂，所述活性位点稳定剂是2-{2-[5-（5-脒基-1H-苯并咪唑-2-基）-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]乙酰基氨基}-琥珀酸，或其药学上可接受的盐。

14.包含如权利要求1-9所定义的液体含水药物组合物和任选地包含惰性气体的气密性容器。