JP2011504477A - アルデヒド含有化合物による液体製剤化第ＶＩＩ（ａ）因子ポリペプチドの安定化 - Google Patents

アルデヒド含有化合物による液体製剤化第ＶＩＩ（ａ）因子ポリペプチドの安定化 Download PDF

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Abstract

本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する、化学的及び／又は物理的分解に対して安定化した液状の水性製薬用組成物、このような組成物を調製及び使用するための方法、並びにこのような組成物を収容するバイアル、及び第ＶＩＩ因子-反応性症候群の処置におけるこのような組成物の使用を指向する。主な実施態様は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチド(ｉ)；約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを維持するのに適した緩衝剤(ｉｉ)；及びＲ-ＣＨＯモチーフを有する少なくとも一の安定剤(ｉｉｉ)、例えばベンズアルデヒド、３-ヒドロキシベンズアルデヒド、４-ヒドロキシベンズアルデヒド、又は５-ホルミル-４-メチルイミダゾールを含有する液状の水性製薬用組成物により表される。

Description

本発明は、第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドを含有する液状の水性製薬用組成物；このような組成物を調製及び使用するための方法；このような組成物を収容する容器、及び第ＶＩＩ(ａ)因子-反応性疾患を処置するためのこのような組成物の使用に関する。特に、本発明は化学的／物理的分解に対して安定化された液状組成物に関する。
血液凝固第ＶＩＩａ因子は、血友病Ａ、血友病Ｂ、グランツマン血小板無力症、及びＦＶＩＩ(ａ)欠乏症等の、血液凝固疾患を処置するための重要な治療剤であることが証明されている。また、生死にかかわる、びまん性又は外科的にアクセスできない出血を患ってはいるが、その他の点では血液凝固疾患ではないヒトにおいて、血液凝固性を高めるのに使用されている。現在、商業的に入手可能な組換え第ＶＩＩａ因子製剤であるノボセブン(NovoSeven)(登録商標)(Novo Nordisk A/S, Denmark)は、１．２ｍｇの組換えヒト第ＶＩＩａ因子、５．８４ｍｇのＮａＣｌ、２．９４ｍｇのＣａＣｌ２.２Ｈ２Ｏ、２．６４ｍｇのＧｌｙＧｌｙ、０．１４ｍｇのポリソルバート８０、及び６０．０ｍｇのマンニトールのフリーズドライケーキを含有するバイアル(約３．０ｍＬの容器容量)として提供されている。この生成物は、使用直前に、２．０ｍＬの注射用水(ＷＦＩ)を添加することにより、ｐＨ５．５に再構成され、よって約０．６ｍｇ／ｍＬのＦＶＩＩａ濃縮物が生じる。
製造されたタンパク質剤を液体に保持するか、又はフリーズドライするかの決定は、通常は、それら２つの形態でのタンパク質剤の安定性に基づいてなされる。タンパク質安定性は、とりわけ、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結及び解凍の繰り返しサイクル、剪断力への暴露、及びタンパク質それ自体の性質等の要因に影響を受ける可能性がある。活性タンパク質のいくつかは、例えば変性及び凝集(溶解性及び不溶解性の凝集体形成)に帰する物理的不安定性、並びに、例えば２〜３例を挙げると、加水分解、脱アミド化及び酸化に帰する化学的不安定性の結果として失われる可能性がある。タンパク質医薬品の安定性の一般的レビューについて、例えばManningら, Pharmaceutical Research 6:903-918(1989)が参照される。
タンパク質の不安定性が発生する可能性は広く認識されており、特定のタンパク質に特異的な不安定さに関連した問題を予測することは困難である。不安定なことで、活性度が低下し、毒性が増加し、及び／又は免疫原性が増加したタンパク質副産物、又は誘導体の形成に至る可能性がある。さらに、翻訳後修飾、例えばＮ末端におけるある種のグルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化及び炭水化物側鎖の付加は、保存時に修飾の潜在的部位を提供する。
さらに、第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチド等、セリンプロテアーゼの液体製剤は、それら自体が生体酵素及び基質であるため、自己分解を受けてしまう。第ＩＩ(ａ)因子、第ＶＩＩ(ａ)因子、第ＩＸ(ａ)因子、第Ｘ(ａ)因子及び第ＸＩ(ａ)因子は、セリンプロテアーゼの４つの具体例である。プロテアーゼ、例えばＦＶＩＩポリペプチドの処方は、ＦＶＩＩ(ａ)ポリペプチドが、同じ製剤において、他のＦＶＩＩポリペプチドに容易に切断され、それら自体が不活性になるため、製薬工業にとっては大きな挑戦である。液体製剤において、ＦＶＩＩ(ａ)ポリペプチドは数時間内に自己分解してしまうおそれがあり、ＦＶＩＩ(ａ)ポリペプチドの濃度が高い場合は、特に深刻な問題となる。よって、ＦＶＩＩ(ａ)ポリペプチドの液体製剤の製造において、自己分解は、克服するための最も大きな障害である。
よって、任意のタンパク質組成物の安全性及び効能は、その安定性に直接関連している。分子運動の可能性が極めて増加しており、よって分子相互作用の可能性が増加することから、液体における安定性の維持には、凍結乾燥形態での安定性の維持とは異なるアプローチが必要となる。タンパク質濃度が増加することで凝集体が形成される傾向にあるために、濃縮溶液における安定性の維持は、上述したものとはさらに異なる。
液状組成物を開発する場合は、多くの要因が考慮される。短期間(６ヶ月未満)の液体安定性を得るには、全体的な構造的変化、例えば変性及び凝集を回避することが必要となる。これらのプロセスは、多くのタンパク質に関する文献に記載されており、安定剤の多くの具体例が存在している。一つのタンパク質の安定化に効果的な薬剤は、実際には、他のものを不安定にさせるように作用することはよく知られている。タンパク質が全体的な構造変化に対して安定であると、長時間(例えば６ヶ月以上)安定している液状組成物の開発は、そのタンパク質に特異的な分解タイプから、タンパク質をさらに安定化させることに依存している。より特異的な分解タイプには、例えば、ジスルフィド結合のスクランブル、所定残基の酸化、脱アミド、環化が含まれ得る。個々の分解種を正確に突き止めることは、常に可能であるわけではないが、関心あるタンパク質のみを安定化させる、特定の賦形剤の能力をモニターするための、わずかな変化をモニターするアッセイが開発されている。
組成物のｐＨは、注射／注入時に、生理学的に適した範囲にあることが望ましい。タンパク質組成物の一般的レビューとして、例えばClelandら: The development of stable protein compositions: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10(4): 307-377;及びWangら, Parenteral compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology 1988 (Supplement), 42 (2S)を参照のこと。
第ＶＩＩａ因子はいくつかの分解経路、特に凝集(二量体化)、酸化及び自己分解的切断(ペプチド骨格のクリッピング又は「重鎖分解」)を受ける。さらに、沈殿が生じる可能性もある。これらの反応の多くは、タンパク質から水分を除去することにより、かなり遅延化することができる。
注射の直前に、ＷＦＩを用いて再構成されるフリーズドライされた固形物よりも、保存液体製剤の使用に関連して、いくつかの利点がある。最も顕著には、保存液はフリーズドライされた生成物よりも、さらに簡便に使用される。第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの液体製剤を開発することで、再構成エラーが無視でき、よって投与精度が増し；さらに生成物の臨床的使用が簡略化され、ひいては患者のコンプライアンスが向上する。理想的には、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの組成物は、広範囲のタンパク質濃度で６ヶ月以上安定しているべきであり、投与経路に関してはフレキシブルであってよい。一般的に、さらに高度に濃縮された溶液により、低用量での投与が可能となり、静脈以外の非経口投与にとっては、有利な条件が提供されることになる可能性がある。よって、液状組成物は、投与及び使用の容易性に関して、フリーズドライ生成物よりも多くの利点を有することができる。
現在、液体製剤化ＦＶＩＩａ生成物は商業的に入手できない。この発明の目的は、保存と送達の双方に適切であり、化学的及び／又は物理的分解生成物の量が、生理学的に許容可能な程度である、第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドの液状の製薬用組成物を提供することにある。
図１は、ＦＶＩＩａアミド分解活性におけるアルデヒドの効果を示す。実験された全てのアルデヒドは、アミド分解活性を阻害する。 図２は、第ＶＩＩａ因子の融点(変性温度)における、アルデヒドの効果を示す。３-ヒドロキシベンズアルデヒド、４-ヒドロキシベンズアルデヒド及びベンズアルデヒドは、高濃度で変性温度に影響を及ぼす。５-ホルミル-４-メチルイミダゾールは、約１００ｍＭの濃度まで、変性温度に影響を及ぼさない。 図３は、アルデヒド溶液における、１４日後のＦＶＩＩａの断片化を示す。実験された全てのアルデヒドは、ＦＶＩＩａ断片化の量を低下させる。 図４は、ＦＶＩＩａ／アルデヒド製剤の希釈時における、プロテアーゼ活性の回復度を示す。プロテアーゼ活性の回復度は、アルデヒドを含有しないＦＶＩＩａ溶液の新鮮なサンプルのプロテアーゼ活性度と比較される。 図５は、種々の濃度のベンズアルデヒド溶液における、４週間後のＦＶＩＩａ断片化を示す。ベンズアルデヒド濃度が増加すると。ＦＶＩＩａ断片化のパーセンテージが低下する。
本発明者は、改善された安定性を示す第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドの液状製薬用組成物を作製した。これらの組成物において、第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドは、Ｒ-ＣＨＯモチーフを有する少なくとも一の安定剤と共に製剤化される。本発明者は、前記Ｒ-ＣＨＯモチーフを有する少なくとも一の安定剤が、他のセリンプロテアーゼ、すなわちＦＩＩ(ａ)、ＦＩＸ(ａ)、ＦＸ(ａ)、ＦＸＩ(ａ)プロテインＣ及びプロテインＳを安定化するのに使用可能であることを予期している。
よって、本発明の一態様は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチド(ｉ)；約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを維持するのに適した緩衝剤(ｉｉ)；及び一般式Ｒ-ＣＨＯの安定剤を含む少なくとも一の安定剤(ｉｉｉ)を含有する、液状の水性製薬用組成物であって、該Ｒが、ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいアリール；ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいヘテロアリール；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、アミノ、ジメチルアミノ、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６-アルコキシ、Ｃ１−６-アルキルアミノ、又はＣ２−６-ジアルキルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す組成物に関する。
本発明の第２の態様は、約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを維持するのに適した緩衝剤(ｉｉ)；及びＲ-ＣＨＯモチーフを有する少なくとも一の安定剤(ｉｉｉ)を含有する溶液に、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬ濃度で、第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチド(ｉ)を提供する工程を含む、第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドの液状の水性製薬用組成物を調製する方法であって、該Ｒが、ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいアリール；ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいヘテロアリール；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、アミノ、ジメチルアミノ、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６-アルコキシ、Ｃ１−６-アルキルアミノ、又はＣ２−６-ジアルキルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す組成物を調製する方法に関する。
本発明の第３の態様は、医薬として使用される、液状の水性製薬用組成物に関する。
本発明の第４の態様は、第ＶＩＩ(ａ)因子反応性疾患を処置する医薬を製造するための、液状の水性製薬用組成物の使用に関する。
本発明の第５の態様は、第ＶＩＩ(ａ)因子反応性疾患を処置するための方法であって、該方法が、有効量の液状の水性製薬用組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む方法に関する。
本発明の第６の態様は、液状の水性製薬用組成物、場合によっては不活性ガスを収容する気密容器に関する。
不活性ＦＶＩＩａ及び活性ＦＶＩＩａとして公知の、セリンプロテアーゼ第ＶＩＩａ因子には、２つの既知の自然に生じる立体構造が存在する。不活性ＦＶＩＩａは、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子又は第ＦＶＩＩａ因子のいずれか一つにより、１５３位{１６}(角括弧内はトリプシノーゲンナンバリング)の前のペプチド結合で切断され、３次元の不活性立体構造を維持している、静脈内プロテアーゼである。活性ＦＶＩＩａは、血管壁損傷において、組織因子(ＴＦ)により主としてインビボで誘発される、３次元の活性立体構造を表す。トリプシンにおいて、新規に形成されたＮ-末端は、活性化ポケットと称される腔に自発的に挿入し、Ａｓｐ３４３{１９４}への塩橋が形成される。塩橋の形成により、触媒装置の成熟に至り、すなわち、基質が、間隙及びオキシアニオンホールに結合する。これと同様のメカニズムが全てのセリンプロテアーゼに適用されるが、活性時、ＦＶＩＩａは、Ｎ-末端挿入性に乏しいため、非常に低い触媒活性しか有さない。ＴＦは、このプロセスをアロステリックに容易にし、その生理学的基質へのＦＶＩＩａの活性を、際だって促進させる。しかしながら、ＴＦが存在しない場合でさえ、静脈内不活性ＦＶＩＩａと活性ＦＶＩＩａとの間に平衡は存在し、約９５％のＦＶＩＩａが、通常、不活性立体構造で存在し、約５％のＦＶＩＩａが、通常、活性立体構造で存在する。
不活性ＦＶＩＩａ立体構造が製薬用製剤中で保持され、血流に放出されるまで、有用な活性ＦＶＩＩａに転換することが非常に難しいが、最も所望もされている。
いくつかのアルデヒドはアミンと化学的に反応し、イミン類(シッフ塩基)を形成することは公知である(Dohnoら, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 16681-16684; Geら, J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 1619-1623):
Figure 2011504477
本発明に関し、Ｒ'-ＮＨ２は不活性ＦＶＩＩａポリペプチドのアミン末端を表し、Ｒ-ＣＨＯはアルデヒド含有安定剤を表す。プロトン化していないアミン[末端]のみがアルデヒドに付加可能である場合、アミン及びイミン(シッフ塩基)は双方とも塩基であるが、異なる塩基度を有しているため、イミン形成の速度及び全ての成分の平衡濃度は、反応混合物のｐＨに依存する(Sayerら, J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 4277-4287; Garcia del Vadoら, J. Mol. Catal. A: Chem. 1996, 111, 193-201)。
通常、シッフ塩基は、僅かに酸性の条件下、例えば酢酸の存在下で調製される。しかしながら、プロトン化していない形態のアミンだけは、アルデヒドと反応する。よって、非常に強い酸性条件下では、遊離のアミノ基の濃度は律速となり(すなわち、アミン形成が律速の最も遅い工程になる)、イミン形成速度が再度低下するであろう。様々に異なるアミンが反応混合物に存在する場合、わずかに酸性の条件下では、より高い割合の、より低い塩基度のアミンが、そのプロトン化していない形態で存在しているため、最も塩基度の低いアミンが、まずアミン又はイミンに転換されるであろう。
タンパク質においては、通常、Ｎ-末端アミノ基とリジンの側鎖アミノ基の２種類のアミノ基が存在する。Ｎ-末端アミノ基は、カルボニル基に隣接して位置しているため、リジンの側鎖アミノ基より、塩基度は低い。タンパク質へのアルデヒドの添加時、このわずかに異なる塩基度により、側鎖アミノ基との場合よりも、Ｎ-末端アミノ基との方が、より素早いイミン形成に至る。
過度のアルデヒドと一緒の場合、ほとんどのアミノ基はアミン又はイミンとして存在し、遊離のアミノ基はほとんど残っていないであろう。他方、イミンが多量の水に溶解し、別のアミンが存在しているならば、イミンの加水分解が生じ、当初のイミンのアミン成分が遊離になる可能性がある。
本発明の発明者は、わずかに酸性の条件下で１当量のアルデヒドがタンパク質に添加された場合、主としてＮ-末端アミノ基と共に、アミン又はイミンが形成されるであろうと予期している。従って、ＦＶＩＩａ中のＮ-末端アミノ基が、プロテアーゼの３次元活性化に重要であるため、可逆的イミン形成が可能なアルデヒドの添加は、ＦＶＩＩａの水溶液の安定性を高めるであろう。このような安定化溶液の哺乳動物への注射時、すなわち希釈時及び多くの他のアミンの存在下で、ＦＶＩＩａのイミンは加水分解され、このプロテアーゼの活性は回復するであろう。
よって、本発明は、ＦＶＩＩａポリペプチドのアミン末端に可逆的に結合する、低分子量のアルデヒド含有化合物の使用を含む。高濃度では、アルデヒド含有化合物は、表面接触可能な遊離のアミン、特にＮ-末端のアミンに結合し、よってＦＶＩＩａポリペプチドのアミン末端の、その活性化ポケットへの挿入を防止する。しかしながら、血流への注射時、製薬用製剤は希釈されている。よって、ＦＶＩＩａポリペプチドのアミン末端は、アルデヒドからは解離しており、その活性化ポケットへの挿入が可能で、活性化３次元立体構造の形をとることのできるＦＶＩＩａポリペプチドに至る。
最初のスクリーニングにおいては、ベンズアルデヒド、３-ヒドロキシベンズアルデヒド、４-ヒドロキシベンズアルデヒド、５-ホルミル-４-メチルイミダゾールの４つのアルデヒド含有化合物がテストされる。
上述したように、本発明は、第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドを含有する、新規の安定した液状の水性製薬用組成物の開発にある。特に、液状の水性製薬用組成物は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチド(ｉ)；約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを維持するのに適した緩衝剤(ｉｉ)；及びＲ-ＣＨＯモチーフを有する少なくとも一の安定剤(ｉｉｉ)を含有し、ここで、該Ｒは、ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいアリール；ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいヘテロアリール；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、アミノ、ジメチルアミノ、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６-アルコキシ、Ｃ１−６-アルキルアミノ、又はＣ２−６-ジアルキルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す。
「Ｃ１−６-アルキル」なる用語は、１〜６の炭素原子を有する、分枝状又は直鎖状であってよい、非環式及び環式の飽和した炭化水素基を含むことを意図している。特定の例は、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロプロピルメチル、ｎ-ペンチル、イソペンチル、ｎ-ヘキシル等が含まれる。同様に、「Ｃ１−４-アルキル」なる用語は、１〜４の炭素原子を有する、分枝状又は直鎖状であってよい、非環式及び環式の飽和した炭化水素基を含む。
同様に、「Ｃ２−６-アルケニル」なる用語は、２〜６の炭素原子と一の不飽和結合を有する、分枝状又は直鎖状であってよい、非環式及び環式の炭化水素基を含むことを意図している。Ｃ２−６-アルケニル基の例は、ビニル、アリル、ブト-１-エン-１-イル、ブト-２-エン-１-イル、ペント-１-エン-１-イル、及びヘキセ-１-エン-１-イルである。
Ｃ１−６-アルキル及びＣ２−６-アルケニル基に関連して、「置換されていてもよい」なる用語は、当該問題の基が、１又は複数回、好ましくは１-３回、ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ(すなわちＣ１−６-アルキル-オキシ)、Ｃ２−６-アルケニルオキシ、オキソ(ケト又はアルデヒド官能性を形成)、アリール、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルカルボニル、アミノ、モノ-及びジ(Ｃ１−６-アルキル)アミノ、ハロゲンから選択される基(類)で置換されていてもよいことを意味することを意図しており、ここで任意のアリール及びヘテロシクリルは、置換されていてもよいアリール及びヘテロシクリルについて、特に以下に記載されるように置換されていてもよい。
「ハロゲン」には、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードが含まれる。
ここで使用される場合、「アリール」なる用語は、完全又は部分的に芳香族の炭素環又は環系、例えばフェニル、ナフチル、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、アントラシル(anthracyl)、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニル、及びキサンセニル(xanthenyl)を示すことを意図しており、フェニルが好ましい実施例である。
「ヘテロシクリル」及び「複素環」なる用語は、一又は複数の炭素原子が、ヘテロ原子、例えば窒素(=Ｎ-又は-ＮＨ)、硫黄(-Ｓ-)、及び／又は酸素(-Ｏ-)原子で置き換えられた、飽和、部分的に不飽和、部分的に芳香族又は完全に芳香族の炭素環又は環系を示すことを意図している。このようなヘテロシクリル基の例は、オキサゾリル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサジアゾリル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、クマリル、フリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾオキソゾリル、ジアゾリル、ジアゾリニル、ジアゾリジニル、トリアゾリル、トリアゾリニル、トリアゾリジニル、テトラゾール等である。好ましいヘテロシクリル基は、５-、６-又は７-員の単環基、例えばイソオキサゾリル、イソオキサゾリニル、オキサジアゾリル、オキサジアゾリニル、ピロリル、ピロリニル、ジアゾリル、ジアゾリニル、トリアゾリル、トリアゾリニル、イミダゾリル、イミダゾリニル等である。
「アリール」、「ヘテロシクリル」及び「複素環」なる用語に関連して、「置換されていてもよい」なる用語は、当該問題の基が、１又は複数回、好ましくは１-３回、ヒドロキシ(エノール系に存在する場合、互変異性ケト型で表され得る)、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、フェニル、ベンジル、Ｃ１−６-アルコキシ、オキソ(互変異性エノール型で表され得る)、カルボキシ、Ｃ１−６-アルコキシカルボニル、Ｃ１−６-アルキルカルボニル、アミノ、モノ-及びジ(Ｃ１−６-アルキル)アミノ、ジハロゲン-Ｃ１−４-アルキル、トリハロゲン-Ｃ１−４-アルキル、及びハロゲンから選択される基(類)で置換されていてもよいことを意味することを意図している。置換基の最も典型的な例は、ヒドロキシル、Ｃ１−４-アルキル、オキソ、アミノ、モノ-及びジメチルアミノ、及びハロゲンである。
Ｒ-ＣＨＯモチーフは、安定剤の安定化効果にとって特に重要であると考えられており、ここで、該Ｒは、ヒドロキシ、メトキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、メチル、エチル、イソプロピル、又はシアノで一回又は複数回置換されていてもよいアリール；ヒドロキシ、メトキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、メチル、エチル、イソプロピル、又はシアノで一回又は複数回置換されていてもよいヘテロアリール；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、メチル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、アミノ、ジメチルアミノ、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、メトキシ、エトキシ、メチルアミノ、又はジメチルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す。
他の実施態様において、Ｒ-ＣＨＯモチーフのＲは、ヒドロキシ、カルボキシル、又はヒドロキシメチルで一回又は複数回置換されていてもよいフェニル；ヒドロキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、又はメチルで一回又は複数回置換されていてもよいイミダゾリル；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、メチル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、メトキシ、エトキシ、メチルアミノ、又はジメチルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す。
特定の一実施態様において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一は水素である。
他の実施態様において、安定剤(ｉｉｉ)は、ベンズアルデヒド、アセトアルデヒド、ピバル酸アルデヒド(トリメチルアセトアルデヒド)、イソブチルアルデヒド、４-メチル-５-ホルミルイミダゾール、３-ヒドロキシベンズアルデヒド、ヒドロキシピバアルデヒド(hydroxypivaldehyde)、３-ジメチルアミノ-２,２-ジメチルプロピオンアルデヒド、サリチルアルデヒド、４-ヒドロキシベンズアルデヒド、２,３-ジヒドロキシベンズアルデヒド、２,４-ジヒドロキシベンズアルデヒド、２,５-ジヒドロキシベンズアルデヒド、３,４-ジヒドロキシベンズアルデヒド、２-カルボキシベンズアルデヒド、４-カルボキシベンズアルデヒド、２-ホルミルピリジン、３-ホルミルピリジン、４-ホルミルピリジン、２-ホルミルイミダゾール、４-ホルミルイミダゾール、及び２-ヒドロキシメチル-４-ホルミルイミダゾールからなる群から選択される少なくとも一である。
本発明の化合物は、一又は複数の不斉中心を有していてよく、特に示されない限りは、分離して、立体異性体(光学異性体)、純粋な又は部分的に精製された立体異性体又はそれらのラセミ混合物が、本発明の範囲に含まれる。
安定剤(又は安定剤類)(ｉｉｉ)の濃度は、典型的には少なくとも１μＭである。所望する(又は必要な)濃度は、典型的には、選択された安定剤(又は安定剤類)、特に第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドに対する選択された安定剤の結合親和性に依存する。
種々の実施態様において、安定剤(ｉｉｉ)は、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、例えば１-１００００μＭ、１０-１００００μＭ、２０-１００００μＭ、５０-１００００μＭ、１０-５０００μＭ、１０-２０００μＭ、２０-５０００μＭ、２０-２０００μＭ、５０-５０００μＭ、０．１-１００ｍＭ、０．１-７５ｍＭ、０．１-５０ｍＭ、０．１-１０ｍＭ、０．２-７５ｍＭ、０．２-５０ｍＭ、０．２-２０ｍＭ、０．５-７５ｍＭ、０．５-５０ｍＭ、０．５-１００ｍＭ、０．５-２００ｍＭ、１-２００ｍＭ、１５０-２００ｍＭ、１-１００ｍＭ、５-１００ｍＭ、１０-１００ｍＭ又は５-８０ｍＭの範囲の濃度で存在する。
一実施態様において、安定剤(ｉｉｉ)は、ベンズアルデヒド、３-ヒドロキシベンズアルデヒド、４-ヒドロキシベンズアルデヒド、及び５-ホルミル-４-メチルイミダゾールから選択されるアルデヒドであり；該薬剤の濃度は、少なくとも１ｍＭ、例えば少なくとも２ｍＭであるが、置換されたアルデヒド類が低濃度で添加可能であるという理由でも、さらに強力になるように考慮される。
一実施態様において、安定剤(ｉｉｉ)はベンズアルデヒドである。さらなる実施態様において、(ｉｉｉ)は、約０．５-１００ｍＭ、例えば約１-１００ｍＭ；例えば約５-１００ｍＭ；例えば約１０-１００ｍＭ；例えば約５-８０ｍＭの濃度のベンズアルデヒドである。
一実施態様において、安定剤(ｉｉｉ)は３-ヒドロキシベンズアルデヒドである。
一実施態様において、安定剤(ｉｉｉ)は４-ヒドロキシベンズアルデヒドである。
一実施態様において、安定剤(ｉｉｉ)は５-ホルミル-４-メチルイミダゾールである。さらなる実施態様において、(ｉｉｉ)は、約０．５−２００ｍＭ；例えば約１−２００ｍＭ；例えば約１５０−２００ｍＭの濃度の５-ホルミル-４-メチルイミダゾールである。
種々の実施態様において、安定剤(ｉｉｉ)とＦＶＩＩ(ａ)ポリペプチドとのモル比(薬剤(ｉｉｉ)：ＦＶＩＩ(ａ))は、０．１以上、０．５以上、１以上、２以上、５以上、１０以上、２５以上、１００以上、２５０以上、１０００以上、２５００以上、又は５０００以上、例えば０．１−１００００、０．１−５０００、０．１−２５００、０．１−１０００、０．１−２５０、０．１−１００、０．１−２５、０．１−１０、０．５−１００００、０．５−５０００、０．５−２５００、０．５−１０００、０．５−２５０、０．５−１００、０．５−２５、０．５−１０、１−１００００、１−５０００、１−２５００、１−１０００、１−２５０、１−１００；１−２５；１−１０、１０−１００００、１０−５０００、１０−２５０、１０００−１００００、又は１０００−５０００の範囲内である。
所望する濃度は、典型的には、選択された安定剤(又は安定剤類)、特に第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドに対する選択された安定剤の結合親和性に依存する。
製薬用組成物の生物学的効果は、主として第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドの存在によるものであるが、他の活性成分も、第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチドと組合せて含まれてよい。
ここで使用される場合、「第ＶＩＩ(ａ)因子ポリペプチド」又は「ＦＶＩＩ(ａ)ポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列１-４０６(すなわち、米国特許第4,784,950号に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド)、そのアミノ酸配列変異体を含む任意のタンパク質、並びに第ＶＩＩ(ａ)因子誘導体、及び任意のＦＶＩＩ(ａ)野生型又はＦＶＩＩ(ａ)配列変異体の第ＶＩＩ(ａ)因子コンジュゲートを意味する。これには、ＦＶＩＩ(ａ)変異体、第ＶＩＩ(ａ)因子-関連ポリペプチド、第ＶＩＩ(ａ)因子誘導体、及び第ＶＩＩ(ａ)因子コンジュゲートで、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と実質的に同様又は改善された生物活性を示すものが含まれる。
ここで使用される場合、「野生型ヒトＦＶＩＩａ」とは、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、その活性形態である。
「第ＶＩＩ因子」なる用語は、それらの未切断(チモーゲン)形態にある第ＶＩＩ因子ポリペプチド、並びに第ＶＩＩａ因子と命名される、それぞれの生物活性形態が生じるようにタンパク質分解的にプロセシングされたものを含むことを意図している。典型的には、第ＶＩＩ因子は残基１５２と１５３の間が切断されて、第ＶＩＩａ因子を生じる。「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語には、第ＶＩＩａ因子の生物活性が実質的に修飾されている、又は野生型第ＶＩＩａ因子の活性に対して低下している変異体を含むポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、限定されるものではないが、ポリペプチドの生物活性を修飾又は破壊する、特定のアミノ酸配列の変化が導入された、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子が含まれる。
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物活性は、(ｉ)組織因子(ＴＦ)へ結合、及び(ｉｉ)第ＩＸ因子又は第Ｘ因子のタンパク質分解的切断を触媒し、活性化した第ＩＸ因子又は第Ｘ因子(それぞれ第ＩＸａ因子又は第Ｘａ因子)を生成する能力に由来する。
本発明の目的について、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性(「第ＶＩＩ因子の生物活性」)は、例えばここに記載されるアッセイ３等、血液凝固を促進させる調製物の能力を測定することにより定量化されてよい。このアッセイにおいて、生物活性は対照サンプルに対する凝固時間の低減度合いとして表され、１単位／ｍＬの第ＶＩＩ因子活性を有するプールされたヒト血清標準体と比較することにより、「第ＶＩＩ因子単位」に転換される。また、第ＶＩＩａ因子の生物活性は、(ｉ)第Ｘ因子、及び脂質膜に包埋したＴＦを含む系において、活性化した第Ｘ因子(第Ｘａ因子)を生成する、第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチドの能力を測定し(Perssonら, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ｉｉ)水系における第Ｘ因子の加水分解度を測定し(「インビトロタンパク質分解アッセイ」、以下のアッセイ２を参照)；(ｉｉｉ)表面プラズモン共鳴をベースにした装置を使用し、ＴＦに対する第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチドの物理的結合度を測定し(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)；又は(ｉｖ)第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解度を測定する(「インビトロ加水分解アッセイ」、以下のアッセイ１を参照)ことにより定量化されてよい。
野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に同等又は改善された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、一又は複数の上述した凝血アッセイ(アッセイ３)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)、又はＴＦ結合アッセイでテストされる場合、同じ細胞系で生成される第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９０％を示すものが含まれる。野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に低減した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体は、一又は複数の上述した凝血アッセイ(アッセイ３)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)、又はＴＦ結合アッセイでテストされる場合、同じ細胞系で生成される野生型第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約２５％未満、例えば約１０％未満、又は約５％未満のものである。野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に修飾された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、限定されるものではないが、ＴＦ-独立性第Ｘ因子タンパク質分解活性を示す、第ＶＩＩ因子変異体、及びＴＦに結合するが、第Ｘ因子を切断しないものが含まれる。
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同等又は良好な生物活性を示すかどうか、又は野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に変化又は低減した生物活性を示すかどうかにかかわらず、第ＶＩＩ因子変異体には、、限定されるものではないが、一又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換による、野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同等の生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、Ｓ５２Ａ-ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ-ＦＶＩＩａ(Linoら, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第5,580,560号に開示されたような、増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１の間、又は残基３１５と３１６の間が、タンパク質分解的に切断された第ＶＩＩａ因子(Mollerupら, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第ＶＩＩａ因子の酸化形態(Kornfeltら, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；PCT/DK02/00189に開示されているＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第02/38162号(Scripps Research Institute)に開示されたような、増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩ変異体；国際公開第99/20767号(ミネソタ大学)に開示されたような、高められた膜結合性を示し、修飾されたＧｌａ-ドメインを有するＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第01/58935号(Maxygen ApS)に開示されたようなＦＶＩＩ変異体が含まれる。
野生型ＦＶＩＩａと比較して増加した生物活性を有するＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、国際公開第01/83725号、国際公開第02/22776号、国際公開第02/077218号、国際公開第03/027147号、国際公開第03/37932号；国際公開第02/38162号(Scripps Research Institute)に開示されているようなＦＶＩＩ変異体；及び日本国特許第2001061479号(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示されているような高められた活性を有するＦＶＩＩａ変異体が含まれる。
野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に低減した又は変化した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、Ｒ１５２Ｅ-ＦＶＩＩａ(Wildgooseら, Biochem 29:3413-3420、1990)が含まれる。
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの例には、限定されるものではないが、野生型第ＶＩＩ因子、Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ-ＦＶＩＩ、及びＳ３３６Ｇ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３
７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｓ５２Ａ-第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ-第ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ-第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ-第ＶＩＩ因子、Ｇｌａが欠失した第ＦＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ-ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ；３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ；及びＩｌｅ１５３-Ａｒｇ２２３のアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩが含まれる。
いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはヒト第ＶＩＩａ因子(ｈＦＶＩＩａ)、好ましくは組換え的に作製されたヒト第ＶＩＩａ因子(ｒｈＶＩＩａ)である。
他の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ(ａ)因子配列変異体である。
いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩ因子とは異なるグリコシル化を有する。
他の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ因子誘導体である。ここで使用される場合「第ＶＩＩ因子誘導体」なる用語は、親ペプチドの一又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、グリコシル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により、遺伝的及び／又は化学的及び／又は酵素的に修飾されている、野生型第ＶＩＩ因子に対して、実質的に同等又は改善された生物活性を示す、ＦＶＩＩポリペプチドを称することを意図している。これには、限定されるものではないが、ペグ化したヒト第ＶＩＩａ因子、システイン-ペグ化されたヒト第ＶＩＩａ因子、及びそれらの変異体が含まれる。第ＶＩＩ因子誘導体の非限定的例には、国際公開第03/31464号及び米国特許出願第20040043446号、米国特許第20040063911号、米国特許第20040142856号、米国特許第20040137557号、米国特許第20040132640号、国際公開第2007022512号、及び米国特許第20070105755号(Neose Technologies, Inc.)に開示されたグリコペグ化されたＦＶＩＩ誘導体；国際公開第01/04287号、米国特許出願第20030165996号、国際公開第01/58935号、国際公開第03/93465号(Maxygen ApS)、及び国際公開第02/02764号、米国特許出願第20030211094号(ミネソタ大学)に開示されているＦＶＩＩコンジュゲート；国際公開第2008127702号(Catalyst Biosciences, Inc.)、国際公開第2005024006号(Novo Nordisk Health Care AG)に開示されている修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド；国際公開第2007031559号、国際公開第2007039475号及び国際公開第2007115953号(Novo Nordisk Health Care AG)、国際公開第2004029090号、国際公開第2003037932号、国際公開第2003027147号、国際公開第02077218号、国際公開第200222776号及び国際公開第200183725号(Novo Nordisk A/S)にッＫ委細の第ＶＩＩ因子変異体；国際公開第08025856号、国際公開第05014035号及び国際公開第2006035057号(Novo Nordisk A/S)に開示されているもののような修飾された糖タンパク質；及び国際公開第2005014049号(Novo Nordisk A/S)に開示されているもののようなコンジュゲートが含まれる。
様々な実施態様、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＶＩＩ(ａ)因子配列変異体である実施態様において、本出願に記載されたような「インビトロタンパク質分解アッセイ」(アッセイ２)でテストされる場合、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子(野生型ＦＶＩＩａ)の活性との比率は、少なくとも約１．２５、好ましくは少なくとも約２．０又は４．０、最も好ましくは少なくとも約８．０である。
いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチド、特に変異体であり、ここで、「インビトロ加水分解アッセイ」(アッセイ１)でテストされる場合、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子(野生型ＦＶＩＩａ)の活性との比率は少なくとも約１．２５であり；他の実施態様において、該比率は少なくとも約２．０であり；さらなる実施態様において、該比率は少なくとも約４．０である。
製薬用組成物において、多くの場合、活性成分の濃度は、単位用量の適用が、患者に不必要な不快感を生じさせないようにされることが望ましい。よって、約２-１０ｍＬ以上の単位用量は、多くの場合は所望されない。よって、本発明の目的にとって、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの濃度は少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬである。別の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、約０．０１-３０ｍｇ／ｍＬ；例えば約０．１-３０．０ｍｇ／ｍＬ；例えば約０．０１-２０ｍｇ／ｍＬ；例えば約０．１-２０ｍｇ／ｍＬ；例えば約１０ｍｇ／ｍＬ；例えば約１５-２０ｍｇ／ｍＬ；例えば０．１-１５ｍｇ／ｍＬ；例えば１０-１５ｍｇ／ｍＬ；例えば０．１-１０ｍｇ／ｍＬ；例えば０．５-５．０ｍｇ／ｍＬ；例えば０．６-４．０ｍｇ／ｍＬ；例えば１．０-４．０ｍｇ／ｍＬ；例えば０．１-５ｍｇ／ｍＬ；例えば０．１-４．０ｍｇ／ｍＬ；例えば０．１-２ｍｇ／ｍＬ；又は０．１-１．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在している。
第ＶＩＩａ因子の濃度は、便宜的にｍｇ／ｍＬ又はＩＵ／ｍＬとして表され、通常、１ｍｇは４３０００−５６０００ＩＵ又はそれ以上を表す。
液状にするために、哺乳動物、例えばヒトへの直接的非経口投与に有用な液状の水性製薬用組成物は、通常、組成物のｐＨ値が所定の限界内、例えば約４．０〜約９．０で保持されることが必要である。付与された条件下で、適切なｐＨ値を確実にするために、製薬用組成物は、約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを維持するのに適切な緩衝剤(ｉｉ)をさらに含有する。
「緩衝剤」なる用語には、約４．０〜約９．０の許容範囲に、溶液のｐＨを維持する薬剤又は薬剤の組合せを含む。
一実施態様において、緩衝剤(ｉｉ)は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、ヒスチジン(例えばＬ-ヒスチジン)、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸(例えば、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム)、酢酸(例えば、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム又は酢酸カルシウム)、乳酸、グルタル酸、クエン酸(例えば、クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム)、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、及びコハク酸等の酸及びその塩からなる群から選択される、少なくとも一の成分である。緩衝剤は、２又はそれ以上の成分の混合物を含んでいてもよく、ここで該混合物は、特定の範囲のｐＨ値を提供可能なものであると理解されるべきである。包括例として、酢酸及び酢酸ナトリウム等を挙げることができる。
緩衝剤の濃度は、溶液が好ましいｐＨを維持できるように選択される。種々の実施態様において、緩衝剤の濃度は、１−１００ｍＭ；１−５０ｍＭ；１−２５ｍＭ；又は２−２０ｍＭである。
一実施態様において、組成物のｐＨは、約４．０〜約９．０；例えば約４．０〜約８．０；例えば約５．０〜約８．０；例えば約４．０〜約７．０；例えば約５．０〜約７．５；例えば約５．０及び約７．０；例えば約５．０〜約６．５；例えば約５．０〜約６．０；例えば約５．５〜約７．０；例えば約５．５〜約６．５；例えば約６．０〜約７．０；例えば約６．０〜約６．５；例えば約６．３〜約６．７；例えば約５．２〜約５．７；例えば約４．０〜約５．２で維持されている。
３つの必須の成分に加えて、液状の水性製薬用組成物は、組成物の調製、処方、安定化、又は投与に有益なさらなる成分を含有していてもよい。
よって、製薬用組成物は、非イオン性界面活性剤をさらに含有していてもよい。界面活性剤(洗浄剤としても公知)には、空気／溶液界面誘発性のストレス、及び溶液／表面誘発性のストレス(例えば、タンパク質凝集に至る)からタンパク質を保護する薬剤が含まれる。
典型的な種類の非イオン性界面活性剤は、ポリソルバート(polysorbates)、ポロキサマー(poloxamers)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレン／ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリオキシエチレンステアラート、及びポリオキシエチレンヒマシ油である。非イオン性界面活性剤の例証例は、トゥイーン(Tween)(登録商標)、ポリソルバート２０、ポリソルバート８０，ビリジ(Brij)-３５(ポリオキシエチレンドデシルエーテル)、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ＰＥＧ８０００、プルロニック(Pluronic)(登録商標)ポリオール類、ポリオキシ-２３-ラウリルエーテル、ミリジ(Myrj)４９、及びクレモポア(Cremophor)Ａである。
一実施態様において、非イオン性界面活性剤は、０．００５-２．０重量％の量で存在している。
組成物は浸透圧修正剤(ｖ)をさらに含有していてもよい。ここで使用される場合、「浸透圧修正剤」なる用語には、溶液の浸透圧に寄与する薬剤が含まれる。浸透圧修正剤(ｖ)には、中性塩、アミノ酸、２〜５のアミノ酸残基のペプチド、単糖類、二糖類、多糖類、及び糖アルコールからなる群から選択される、少なくとも一の薬剤が含まれる。いくつかの実施態様において、組成物は、２又はそれ以上のこのような薬剤の組合せを含有する。 「中性塩」とは、水溶液に溶解したときに、酸でも塩基でもない塩を意味する。
一実施態様において、少なくとも一の浸透圧修正剤(ｖ)は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、カルシウムラエブラート(laevulate)、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、及びマグネシウムラエブラートからなる群から選択される中性塩である。
さらなる実施態様において、浸透圧修正剤(ｖ)には、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム、及び酢酸マグネシウムからなる群から選択される少なくとも一と組合せて、塩化ナトリウムを含有する。
さらなる実施態様において、浸透圧修正剤(ｖ)は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、スクロース、グルコース、及びマンニトールからなる群から選択される少なくとも一である。
種々の実施態様において、浸透圧修正剤（ｖ）は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、少なくとも１２００ｍＭ、少なくとも１５００ｍＭ、少なくとも１８００ｍＭ、少なくとも２０００ｍＭ、又は少なくとも２２００ｍＭの濃度で存在している。
一連の実施態様において、浸透圧修正剤（ｖ）は、５−２２００ｍＭ、例えば２５−２２００ｍＭ、５０−２２００ｍＭ、１００−２２００ｍＭ、２００−２２００ｍＭ、４００−２２００ｍＭ、６００−２２００ｍＭ、８００−２２００ｍＭ、１０００−２２００ｍＭ、１２００−２２００ｍＭ、１４００−２２００ｍＭ、１６００−２２００ｍＭ、１８００−２２００ｍＭ、又は２０００−２２００ｍＭ；５−１８００ｍＭ、２５−１８００ｍＭ、５０−１８００ｍＭ、１００−１８００ｍＭ、２００−１８００ｍＭ、４００−１８００ｍＭ、６００−１８００ｍＭ、８００−１８００ｍＭ、１０００−１８００ｍＭ、１２００−１８００ｍＭ、１４００−１８００ｍＭ、１６００−１８００ｍＭ；５−１５００ｍＭ、２５−１４００ｍＭ、５０−１５００ｍＭ、１００−１５００ｍＭ、２００−１５００ｍＭ、４００−１５００ｍＭ、６００−１５００ｍＭ、８００−１５００ｍＭ、１０００−１５００ｍＭ、１２００−１５００ｍＭ；５−１２００ｍＭ、２５−１２００ｍＭ、５０−１２００ｍＭ、１００−１２００ｍＭ、２００−１２００ｍＭ、４００−１２００ｍＭ、６００−１２００ｍＭ、又は８００−１２００ｍＭの濃度で存在している。
本発明の一実施態様において、少なくとも一の浸透圧修正剤(ｖ)は、イオン強度修正剤(ｖ／ａ)である。
ここで使用される場合、「イオン強度修正剤」なる用語には、溶液のイオン強度に寄与する薬剤が含まれる。前記薬剤には、限定されるものではないが、中性塩、アミノ酸、２〜５のアミノ酸残基のペプチドが含まれる。いくつかの実施態様において、組成物は、２又はそれ以上のこのような薬剤の組合せを含有する。
イオン強度修正剤(ｖ／ａ)の非限定的例には、中性塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムである。一実施態様において、前記薬剤(ｖ／ａ)は塩化ナトリウムである。
「イオン強度」なる用語は、等式：μ＝１／２ Σ(［ｉ］(Ｚｉ ２))で定められる、溶液のイオン強度(μ)であり、ここでμはイオン強度であり、[ｉ]はイオンのミリモル濃度であり、Ｚｉはそのイオンの電荷(＋又は−)である(例えば、Solomon, Journal of Chemical Education, 78(12):1691-92, 2001;James Fritz and George Schenk: Quantitative Analytical Chemistry, 1979を参照)。
本発明の種々の実施態様において、組成物のイオン強度は、少なくとも５０ｍＭ、例えば少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも６５０ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、少なくとも１２００ｍＭ、少なくとも１６００ｍＭ、少なくとも２０００ｍＭ、少なくとも２４００ｍＭ、少なくとも２８００ｍＭ、又は少なくとも３２００ｍＭである。
いくつかの特定の実施態様において、浸透圧修正剤（ｖ）とイオン強度修正剤（ｖ／ａ）の全濃度は、１−１０００ｍＭ、例えば１−５００ｍＭ、１−３００ｍＭ、１０−２００ｍＭ、又は２０−１５０ｍＭ；又は例えば１００−１０００ｍＭ、２００−８００ｍＭ、又は５００−８００ｍＭの範囲であり、浸透圧及びイオン強度を有し得る、任意の他の成分の影響にも依存する。
一実施態様において、組成物は等張であり；また他では高張である。「等張」なる用語は「血清で等張」、すなわち約３００±５０ミリオスモル／ｋｇであることを意味する。浸透圧は、投与前の溶液の浸透圧を測定することを意味する。「高張」なる用語は、血漿の生理的レベル以上の浸透圧レベル、例えば３００±５０ミリオスモル／ｋｇ以上のレベルを称することを意味する。
さらに、本発明の特定の実施態様は、極めて高濃度のイオン強度修正剤(ｖ／ａ)と安定剤(ｉｉｉ)との組合せに関する。その一実施態様において、イオン強度修正剤(ｖ／ａ)は、ナトリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩からなる群から選択される。この実施態様において、イオン強度修正剤(ｖ／ａ)、すなわちナトリウム塩、カルシウム塩及び／又はマグネシウム塩は、１５−１５００ｍＭ、例えば１５−１０００ｍＭ、２５−１０００ｍＭ、５０−１０００ｍＭ、１００−１０００ｍＭ、２００−１０００ｍＭ、３００−１０００ｍＭ、４００−１０００ｍＭ、５００−１０００ｍＭ、６００−１０００ｍＭ、７００−１０００ｍＭ；１５−８００ｍＭ、２５−８００ｍＭ、５０−８００ｍＭ、１００−８００ｍＭ、２００−８００ｍＭ、３００−８００ｍＭ、４００−８００ｍＭ、５００−８００ｍＭ；１５−６００ｍＭ、２５−６００ｍＭ、５０−６００ｍＭ、１００−６００ｍＭ、２００−６００ｍＭ、３００−６００ｍＭ；１５−４００ｍＭ、２５−４００ｍＭ、５０−４００ｍＭ、又は１００−４００ｍＭの濃度で存在する。
これらの実施態様において、ナトリウム塩は塩化ナトリウムであってよく、カルシウム塩は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、及びカルシウムラエブラートからなる群から選択されてよく、マグネシウム塩は、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、マグネシウムラエブラート、及び強酸のマグネシウム塩からなる群から選択されてよい。さらなる特定の実施態様において、カルシウム塩及び／又はマグネシウム塩は、塩化ナトリウムと組合せて使用される。
一実施態様において、組成物は、カルシウム(Ｃａ２＋)塩及びマグネシウム(Ｍｇ２＋)塩からなる群から選択される一又は複数のイオン強度修正剤、、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、カルシウムラエブラート、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、マグネシウムラエブラート、強酸のマグネシウム塩からなる群から選択される一又は複数の塩を含有する。
一実施態様において、カルシウム(Ｃａ２＋)及び／又はマグネシウム(Ｍｇ２＋)は、少なくとも約０．１μＭ、例えば少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、又は少なくとも約１０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施態様において、組成物は少なくとも２ｍＭのＣａ２＋を含有する。
種々の実施態様において、カルシウム(Ｃａ２＋)及び／又はマグネシウムイオン(Ｍｇ２＋)とＦＶＩＩポリペプチドとのモル比は：０．００１−７５０；０．００１−２５０；０．００１−１００；０．００１−１０；０．００１−１．０；０．００１−０．５；０．５−７５０；０．５−２５０；０．５−１００；０．５−１０；０．５−１．０；０．００１−０．４９９９；０．００５−０．０５０である。
本発明の一実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する非錯化のカルシウム(Ｃａ２＋)及び／又はマグネシウム(Ｍｇ２＋)のモル比は、０．５未満、例えば０．００１−０．４９９、例えば０．００５−０．０５０の範囲、又は０．０００−０．４９９の範囲、例えば０．０００−０．０５０の範囲、又は約０．０００である。本発明の一実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する非錯化のカルシウム(Ｃａ２＋)のモル比は、０．５未満、例えば０．００１−０．４９９、例えば０．００５−０．０５０の範囲、又は０．０００−０．４９９の範囲、例えば０．０００−０．０５０の範囲、又は約０．０００である。
ここで使用される場合、「非錯化のカルシウム及び／又はマグネシウムイオンの濃度」なる用語は、カルシウム及び／又はマグネシウムイオンの全濃度と、カルシウム及び／又はマグネシウムキレート剤に結合したカルシウム及び／又はマグネシウムの濃度との差異意味することを意図している。この点に関し、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、「カルシウム／マグネシウムキレート剤」としてはみなされないが、カルシウム及び／又はマグネシウムは、所定の条件下で、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに結合する、又は会合することが予期される。
他の実施態様において、 第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する非錯化のカルシウム及び／又はマグネシウムイオンのモル比は０．５以上である。他の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する非錯化のカルシウムイオンのモル比は０．５以上である。
カルシウム及び／又はマグネシウムイオン(Ｃａ２＋)と第ＶＩＩ因子ポリペプチドとの間を、比較的低い比率にするためには、例えばＣａ２＋及び／又はＭｇ２＋を除去するのに適した条件下、イオン交換物質と組成物とを接触させることにより、又は過度のカルシウム及び／又はマグネシウムイオンと結合(錯化)させるため、カルシウム／マグネシウムキレート剤を添加することにより、過度のカルシウム及び／又はマグネシウムイオンを除去することが必要又は望ましい。このことは、特に、処方工程に先行するプロセシング工程から、溶液における、カルシウム及び／又はマグネシウムイオンと第ＶＩＩ因子ポリペプチドとの間の比率が、上述した限界を超えている場合に関連している。「カルシウム／マグネシウムキレート剤」の例には、ＥＤＴＡ、クエン酸、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、ＨＩＭＤＡ、ＡＤＡ及び同様の化合物が含まれる。
さらなる実施態様において、組成物は酸化防止剤(ｖｉ)をさらに含有する。種々の実施態様において、酸化防止剤は、Ｌ-メチオニン、Ｄ-メチオニン、メチオニン類似体、メチオニン含有ペプチド、メチオニン-ホモログ、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン、及びシススタチオニン(cysstathionine)からなる群から選択される。好ましい実施態様において、酸化防止剤はＬ-メチオニンである。酸化防止剤の濃度は、典型的には０．１-５．０ｍｇ／ｍＬ、例えば０．１-４．０ｍｇ／ｍＬ、０．１-３．０ｍｇ／ｍＬ、０．１-２．０ｍｇ／ｍｌ、又は０．５-２．０ｍｇ／ｍＬである。
特定の実施態様において、組成物は酸化防止剤を含有しないが、その代わり、酸化に対する第ＶＩＩ因子ポリペプチドの感受性を、大気を除去することによりコントロールする。もちろん、酸化防止剤の使用を、大気の除去と組合せてもよい。
よって、本発明は、ここで定められる、液状の水性製薬用組成物と、場合によっては不活性ガスを収容する、気密容器(例えばバイアル又はカートリッジ(例えば、ペン状アプリケータ用のカートリッジ))を提供する。不活性ガスは、窒素又はアルゴンからなる群から選択されてよい。容器(例えばバイアル又はカートリッジ)は、典型的にはガラス又はプラスチック、特にガラスで作製され、場合によってはゴム隔膜、又は製薬用組成物全体を保存しながら貫通を可能にする他の閉塞手段により閉塞されていてもよい。さらなる実施態様において、容器は、シールされたバッグ、例えばシールされたプラスチックバッグ、特にラミネートされたもの(例えば、金属(特にアルミニウム)でラミネートされたプラスチックバッグ)に封入されるバイアル又はカートリッジである。
必須の成分、非イオン性界面活性剤(ｉｖ)、浸透圧修正剤(ｖ)及び任意の酸化防止剤(ｖｉ)に加えて、製薬用組成物は、防腐剤(ｖｉｉ)をさらに含有していてよい。
防腐剤は、微生物の成長を遅らせるために組成物に含有せしめられ、よってＦＶＩＩポリペプチドの「多用途」包装を可能にする。防腐剤の例には、フェノール、ベンジルアルコール、オルト-クレゾール、メタ-クレゾール、パラ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。防腐剤は、通常は、ｐＨの範囲及び防腐剤の種類に応じて、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有される。
さらに、組成物は、脱アミド化及び異性体化を阻害可能な、一又は複数の薬剤を含有する。
ここで使用される場合、「約」として特定されるｐＨ値は、±０．１であると理解され、例えば約ｐＨ８．０はｐＨ８．０±０．１を含む。
パーセンテージは、溶液に溶解した固体、及び溶液に混合された液体を言及する場合、双方とも(重量／重量)である。例えば、トゥイーン(登録商標)については、１００％ストックの重量／溶液の重量である。
本発明の組成物は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの安定した、好ましい使用準備が整った組成物として有用である。さらに、ここで付与される原則、指針及び特定の実施態様は、変更すべきところは変更して、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの大量保存に、等しく適用されると考えられる。組成物は、２℃〜８℃の範囲の温度で保存される場合、典型的には少なくとも６ヶ月、好ましくは３６ヶ月まで安定している。また組成物は、２℃〜８℃で、少なくとも６ヶ月保存された場合、化学的及び／又は物理的に安定、特に化学的に安定している。
「安定」なる用語は、(ｉ)２℃〜８℃で６ヶ月保存した後、組成物が、本質的に本明細書のアッセイ３に記載したような、一工程の凝血アッセイで測定した場合に、最初の生物活性の少なくとも５０％を保持している、又は(ｉｉ)２℃〜８℃で６ヶ月保存した後、重鎖分解生成物の含有量の増加度が、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの最初の含有量の、最大４０％(ｗ／ｗ)であることを示すことを意図している。
「最初の含有量」なる用語は、組成物の調製時、組成物に添加される第ＶＩＩ因子ポリペプチドの量に関する。
一実施態様において、安定化組成物は、２〜８℃で６ヶ月保存した後、最初の生物活性の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持している。
本発明の種々の実施態様において、安定化組成物は、少なくとも３０日、例えば６０日、又は９０日保存した後、本質的に本明細書のアッセイ３に記載したような、一工程の凝血アッセイで測定した場合に、最初の生物活性の少なくとも５０％を保持している。
種々の実施態様において、安定化組成物における重鎖分解生成物の含有量の増加度は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの最初の含有量の、約３０％(ｗ／ｗ)以下、約２５％(ｗ／ｗ)以下、約２０％(ｗ／ｗ)以下、約１５％(ｗ／ｗ)以下、約１０％(ｗ／ｗ)以下、約５％(ｗ／ｗ)以下、又は約３％(ｗ／ｗ)以下である。
重鎖分解生成物の含有量を測定する目的で、粒子径５μｍ及び孔サイズ３００Åを有する、私有の４．５×２５０ｍｍのブチル結合シリカカラムにおいて、逆相ＨＰＬＣを実施した。カラム温度：７０℃。Ａバッファー：０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸。Ｂバッファー：０．０９％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸、８０％ｖ／ｖのアセトニトリル。３０分、Ｘから(Ｘ＋１３)％Ｂの直線状勾配を用い、カラムを溶出させた。約２６分の保持時間で、ＦＶＩＩａが溶出されるように、Ｘを調節した。流量：１．０ｍＬ／分。検出：２１４ｎｍ。充填：２５μｇのＦＶＩＩａ。
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの「物理的安定性」なる用語は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドのダイマー、オリゴマー及びポリマー形態での、不溶性及び／又は溶解性の凝集体の形成、並びに分子の任意の構造的変形及び変性に関する。物理的に安定した組成物には、視覚的に透明性を保持している組成物が含まれる。多くの場合、組成物の物理的安定性は、組成物を種々の時間、異なる温度で保存した後の濁度及び視覚検査で評価される。組成物の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライトにおいて実施される。組成物は、視覚的濁りを示す場合に、物理的に不安定であると分類される。
「化学的安定性」なる用語は、加速条件下で、溶液での保存時、第ＶＩＩ因子ポリペプチドにおける任意の化学的変化の形成に関連していることを意図している。具体例は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの断片形成に至る、加水分解、脱アミド化、及び酸化、並びに酵素的分解である。特に、硫黄含有アミノ酸は、対応するスルホキシドの形成を伴い酸化する傾向にある。
「化学的安定性」なる用語は、一工程の凝血アッセイ(アッセイ３)で測定した場合に、２〜８℃で６ヶ月保存した後、その最初の生物活性の少なくとも５０％を保持している組成物を称することを意図している。
さらなる態様において、本発明は、約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを維持するのに適した緩衝剤(ｉｉ)；及びＲ-ＣＨＯモチーフを有する少なくとも一の安定剤(ｉｉｉ)を含有する溶液に、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬ濃度で第ＶＩＩ因子ポリペプチド(ｉ)を提供する工程を含む、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液状の水性製薬用組成物を調製する方法であって、該Ｒが、ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいアリール；ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいヘテロアリール；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、アミノ、ジメチルアミノ、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６-アルコキシ、Ｃ１−６-アルキルアミノ、又はＣ２−６-ジアルキルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す組成物を調製する方法を提供する。
使用方法
理解されるように、ここで定められた液状の水性製薬用組成物は、医薬の分野で使用することができる。よって、特に本発明は、薬剤、特に第ＶＩＩ因子-反応性疾患を処置する薬剤として使用される、ここで定められた液状の水性製薬用組成物を提供する。
従って、本発明は、第ＶＩＩ因子-反応性疾患を処置する薬剤を調製するための、ここで定められた液状の水性製薬用組成物の使用、並びに第ＶＩＩ因子-反応性疾患を処置するための方法、ここで定められた液状の水性製薬用組成物を有効量、それを必要とする被験者に投与することを含む方法を提供する。
本発明の調製物は、任意の第ＶＩＩ因子-反応性疾患、例えば凝固因子欠乏症(例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、第ＸＩ凝固因子欠乏症、第ＶＩＩ凝固因子欠乏症)、血小板減少症又はフォン・ヴィルブランド病、又は凝固因子インヒビターに起因するものを含む出血性疾患、及び脳内出血、又は任意の原因による過度の出血はの処置に使用されてよい。また調製物は、手術又は他の外傷のある患者、又は抗凝固治療を受けている患者に投与されてよい。
「有効量」なる用語は、所望する患者応答を達成するための用量を調節する有資格者により決定される有効な用量である。用量を考慮するための要因には、有効性、生物学的利用能、所望する薬物動態／薬力学的プロフィール、処置状況、患者関連の要因(例えば、体重、健康状態、年齢等)、同時投与される薬物(例えば、抗凝固剤)の存在、投与時間、又は医療実施者に公知の他の要因が含まれる。
「処置」なる用語は、病気、病状又は疾患の徴候を予防、軽減又は治癒することを目的として、被験者、例えば哺乳動物、特にヒトを管理及び世話することとして定義される。これには、徴候又は合併症の発症を予防し、又は徴候又は合併症を軽減し、又は病気、病状又は疾患を排除するために、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを投与することを含む。第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する本発明の製薬用組成物は、このような処置を必要とする被験者に、非経口的に投与されてよい。このような非経口的投与の非限定的例は、場合によってはペン様装置又は注入ポンプ等の手段により、皮下、筋肉又は静脈注射である。
一般的方法
本発明での使用に適した精製されたヒト第ＶＩＩａ因子は、好ましくは、例えばHagenら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986に記載されたような、又は欧州特許第0200421号(ZymoGenetics, Inc.)に記載されたような、ＤＮＡ組換え技術により作製される。
また第ＶＩＩ因子は、Broze及びMajerus, J. Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980、及びHedner及びKisiel, J. Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983により記載されているような方法により生成されてよい。これらの方法により、検出可能な量の他の血液凝固因子を用いることなく、第ＶＩＩ因子が生じる。さらに精製された第ＶＩＩ因子調製物でさえ、最終精製工程として、付加的なゲル濾過を含むことにより得られる。ついで、第ＶＩＩ因子は、公知の手段、例えばいくつかの異なる血漿タンパク質、特に第ＸＩＩａ因子、第ＩＸ因子又は第Ｘａ因子により、活性化した第ＶＩＩａ因子に転換される。また、Bjoernら(Research Disclosure, 269 9月, 1986, pp. 564-565)により記載されているように、第ＶＩＩ因子は、イオン交換クロマトグラフィー用カラム、例えばモノＱ(登録商標)(Pharmacia fine Chemicals)等に通すことにより、又は溶液における自己活性化により活性化されてもよい。
第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子を修飾、又は組換え技術により生成されてもよい。野生型第ＶＩＩ因子と比較した場合、変化したアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチドは、公知の手段、例えば部位特異性突然変異生成により、天然の第ＶＩＩ因子をコードする核酸中のアミノ酸コドンのいくつかを除去することにより、又はアミノ酸コドンを変化させることにより、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾することで生成され得る。
置換が、第ＶＩＩａ因子分子の機能にとって重要な領域外でなされ、さらに活性化ポリペプチドに至ることは、当業者には明らかであろう。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性化に必須であり、よって好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、当該問題で公知に手順、例えば部位指向性突然変異生成又はアラニン-スキャンニング突然変異生成(例えば、Cunningham及びWells, 1989, Science 244:1081-1085)により同定されてよい。後者の技術において、突然変異は、分子の全ての正に帯電した残基に導入され、得られた突然変異分子は、血液凝固性、それぞれの架橋結合活性についてテストされ、分子の活性に対して重要なアミノ酸残基が同定される。また、基質-酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学、又は光親和性標識等の技術により決定される三次元構造を分析することで、決定することができる(Vosら,1992, Science 255:306-312; Smithら, 1992, Journal of Molecular Biology 224:899-904; Wlodaverら, 1992, FEBS Lett. 309:59-64を参照)。
一つのヌクレオチドを別のヌクレオチドに交換するために、核酸配列に変異を導入することは、当該技術で公知の任意の方法を使用する、部位指向性突然変異生成により達成される。特に有用なのは、関心ある挿入物、及び所望の突然変異を有する２つの合成プライマーと共に、スーパーコイル状(super-coiled)の二本鎖ＤＮＡベクターを利用する手順である。それぞれベクターの他方のストランドを補完する、オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの手段により、温度サイクルの間、伸長する。プライマーの導入において、ねじれ型ニックを有する突然変異プラスミドが生じる。温度サイクルに続き、メチル化、及びヘミメチル化されたＤＮＡに特異的なＤｐｎＩを用いて、生成物を処理し、親ＤＮＡテンプレートを消化させ、突然変異含有の合成ＤＮＡについて選択する。変異体の生成、同定及び単離について、当該技術で公知の他の手順、例えば遺伝子シャッフリング又はファージディスプレイ技術を使用してもよい。
起源となる細胞からのポリペプチドの分離は、限定されるものではないが、接着細胞培養からの、所望の生成物を含有する細胞培養培地の除去；非接着細胞を除去する遠心分離又は濾過を含む、当該技術で公知の任意の方法により達成される。
場合によっては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはさらに精製されてよい。精製は、限定されるものではないが、例えば、抗-第ＶＩＩ因子抗体カラムにおけるアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Wakabayashiら, J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; 及びThimら, Biochem. 27:7785, 1988を参照)；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手順(例えば調製用の電点電気泳動(ＩＥＦ)、微分溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈降)、又抽出等を含む、当該技術で公知の任意の方法を使用して達成され得る。一般的には、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; 及びProtein Purification, J.C. Janson及びLars Ryden,編, VCH Publishers, New York, 1989を参照。精製後、調製物は、好ましくは約１０重量％未満、さらに好ましくは約５重量％未満、最も好ましくは約１重量％未満の、宿主細胞から誘導された非-第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する。
第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＸＩＩａ因子、又はトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子、及びトロンビンを使用し、タンパク質分解的切断により活性化させてもよい。例えば、Osterudら, Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, 米国特許第4,456,591号;及びHednerら, J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)を参照。また、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばモノＱ(登録商標)(Pharmacia)等に通すことにより、又は溶液における自己活性化によって活性化されてもよい。ついで、得られた活性化した第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、本出願に記載するように製剤化され、投与されてよい。
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性を測定するのに適したアッセイ
本発明で有用な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、インビトロテストにおけるサンプルの予備試験として実施することが可能な、適切なアッセイにより選択され得る。
インビトロ加水分解アッセイ(アッセイ１)
インビトロ加水分解アッセイは、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの、他のペプチド又はタンパク質を切断する能力を評価数するために使用される。
天然(野生型)第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩａ因子ポリペプチド(双方とも、以後「第ＶＩＩａ因子」と称する)は、活性についてアッセイされてよい。またそれらは平行にアッセイされて、それらの活性と直接比較されてもよい。アッセイはマクロタイタープレート(Max-iSorp, Nunc, Denmark)において実施される。発色基質Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２２８８、Chromogenix, Sweden)、最終濃度１ｍＭを、２０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する、２０ｍＭのイミダゾールバッファー、ｐＨ６．５に第ＶＩＩａ因子(最終濃度２００ｎＭ)が入ったものに添加する。４０５ｎｍでの吸光度を、スペクトラマックスＴＭ３４０プレートリーダー(Molecular Devices, USA)にて、連続的に測定する。酵素を含有しないブランクウェルにおける吸光度を減算した後、３０分のインキュベートの間に発生した吸光度の勾配を使用し、第ＶＩＩａ因子活性の相対的測定値として使用する。
一工程の凝固アッセイ(凝血アッセイ)(アッセイ３)
凝結アッセイは、第ＶＩＩａポリペプチドの血栓を作製する能力を評価するのに使用される。この目的のために、テストされるサンプルは、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ-バッファー(ｐＨ７．２)、０．１％のＢＳＡで希釈され、４０μｌが、４０μｌの第ＶＩＩ因子欠損血漿、及び１０ｍＭのＣａ２＋と合成リン脂質を含有する８０μｌのヒト組換え組織と共にインキュベートされる。凝固時間(凝血時間)を測定し、平行線アッセイにおいて参照標準体を使用し、標準体曲線と比較する。
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの分解度を測定するのに適したアッセイ
ｒＦＶＩＩａ重鎖分解生成物の測定(アッセイ４)
以下の実施例において、第ＶＩＩａ因子の重鎖断片化生成物の含有量は、以下に記載するようにして、ＲＰ-ＨＰＬＣにより測定される：
粒子径５μｍ及び孔サイズ３００Åを有する、私有の４．５×２５０ｍｍのブチル結合シリカカラムにおいて、逆相ＨＰＬＣを実施した。カラム温度：７０℃。Ａバッファー：０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸。Ｂバッファー：０．０９％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸、８０％ｖ／ｖのアセトニトリル。３０分、Ｘから(Ｘ＋１３)％Ｂの直線状勾配を用い、カラムを溶出させた。約２６分の保持時間で、ＦＶＩＩａが溶出されるように、Ｘを調節した。流量：１．０ｍＬ／分。検出：２１４ｎｍ。充填：２５μｇのＦＶＩＩａ。
４０Ｋ-ＰＥＧ-ｒＦＶＩＩａ重鎖断片化生成物の測定(アッセイ５)
４０Ｋ-ＰＥＧ-ｒＦＶＩＩａの重鎖断片化生成物の含有量を測定する目的で、ＡＣＥ３μｍＣ４、３００Åの４．６×１００ｍｍカラム(Advanced Chromatography Technologies, part. no. ACE-213-1046)において、逆相ＨＰＬＣを実施した。カラム温度：６０℃。Ａバッファー：０．０５％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸。Ｂバッファー：０．０６％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸、８０％ｖ／ｖのアセトニトリル。変性バッファー：６Ｍの塩酸グアニジン、５０ｍＭのトリス、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５。５０μｌの分析用サンプル＋５０μｌの変性バッファー＋５μｌのＤＴＴ＋１μｌの酢酸からサンプルを調製し、６０℃で１５分インキュベートする。
３０分、３５から８０％Ｂの直線状勾配を用い、カラムを溶出させた。流量：０．７ｍＬ／分。検出：２１４ｎｍ。充填：２５μｇのＦＶＩＩａ。重鎖分解生成物の最初の含有量を、重鎖分解生成物の測定された含有量から引き、すなわち重鎖分解生成物の最初の含有量を０％にセットする。ついで、ｘ時での重鎖分解生成物の含有量を算出する：
％＝(ＨＣＤＰ(ｘ)−ＨＣＤＰ(０))／(ＨＣＤＰ(ｘ)−ＨＣＤＰ(０)＋ＦＶＩＩ(ｘ))ｘ１００％
＝(ＨＣＤＰ(ｘ)−ＨＣＤＰ(０))／(ＦＶＩＩ(０))ｘ１００％
ここでＨＣＤＰ(ｘ)は、ｘ時での、重鎖分解生成物の測定された含有量であり、ＨＣＤＰ(０)は重鎖分解生成物の測定された最初の含有量であり、ＦＶＩＩ(ｘ)は、ｘ時での、無傷第ＶＩＩ因子ポリペプチドの含有量である。
実施例
以下の実施例は、本発明の実施を例証するものである。これらの実施例は、例証目的のみを含み、何らの方法においても、請求された本発明の範囲を限定することを意図しているわけではない。
実施例１
第ＶＩＩａ因子のアミド分解活性におけるアルデヒドの影響を、インビトロ加水分解アッセイ(２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＣａＣｌ２)において示し、その結果を図１に例証する。アミド分解活性の明確な阻害が観察された。しかしながら、ＦＶＩＩａ変性による、見かけ阻害の可能性もある。この点に対処するために、ＦＶＩＩａの変性温度を、アルデヒドの存在下で測定した。測定を、本質的に、Loら, Analytical Biochemistry 332, 153-159 (2004)に記載されている熱シフトアッセイのような、温度-蛍光により実施した。変性温度を、蛍光強度曲線の最大勾配の点として測定した。種々の濃度のアルデヒド(２５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＣａＣｌ２、６０ｍｇ／ｍｌのスクロース)での変性温度を、図２に示す。３-ヒドロキシベンズアルデヒド、４-ヒドロキシベンズアルデヒド及びベンズアルデヒドのケースにおいては、高濃度のアルデヒドで、変性温度が大幅に低下することが示されている。よって、これら３つの化合物の阻害活性は、変性により引き起こされ得る。しかしながら、５-ホルミル-４-メチルイミダゾールのケースにおいて、変性温度は約約１００ｍＭの濃度まで影響を受けず、第ＶＩＩａ因子の構造的完全性を示唆している。
ＦＶＩＩａポリペプチドにおけるアルデヒドの影響をさらに調査するために、ある分解生成物(１-２９０の断片)を、５℃で２週間保存した後(１５ｍｇ／ｍｌのｒＦＶＩＩａ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６，５、２０ｍＭのＣａＣｌ２、２４ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．２ｍｇ／ｍｌのメチオニンのバッファーにおいて)(「標準体」として使用され、溶解直後に分析されるノボセブン(登録商標)(Novo Nordisk A/S, Denmark)測定した。２９０位での切断を含む断片のパーセンテージ含有量を、図３において、種々のアルデヒド濃度にて示す。分析された全てのアルデヒドにおいて、ＦＶＩＩａ断片化の量の低下が見られた。
活性回復の重要な点に対処するために、第ＶＩＩａ因子(１７ｍｇ／ｍｌ)を、７ｍＭのベンズアルデヒド(１時間、１０ｍＭのイミダゾール、３５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．５)とインキュベートし、ついで０．１ｍｇ／ｍｌの第ＶＩＩａ因子まで希釈した。ついで、アミド分解活性を測定した。図４には、ＦＶＩＩａ／ベンズアルデヒド溶液を０．１ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩａに希釈した後(「Ｆ７希釈ベンズアルデヒド有り」)、時間に対して、基質Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(S-2288, Chromogenix,Sweden)をプロセシングすることにより生じた吸光度を示す。結果を、アルデヒドを含有しない(「Ｆ７ ｗ／ｏ 希釈されたベンズアルデヒド」)希釈されたＦＶＩＩａ溶液(ノボセブン(登録商標)(Novo Nordisk A/S, Denmark)の蓄積活性と比較した。
実施例２
ｒＦＶＩＩａの安定性におけるアルデヒド化合物の影響を調査するために、次の初稿物を調製する：
製剤１：
１．０ｍｇ／ｍＬ ｒＦＶＩＩａ
１０ｍＭ ヒスチジン
１０ｍＭ 酢酸ナトリウム
１０ｍＭ グリシルグリシン
５０ｍＭ 塩化ナトリウム
１０ｍＭ 塩化カルシウム
５０ｍＭ ５-ホルミル-４-メチルイミダゾール
ｐＨ＝６．５
製剤２：
１．０ｍｇ／ｍＬ ｒＦＶＩＩａ
１０ｍＭ ヒスチジン
１０ｍＭ 酢酸ナトリウム
１０ｍＭ グリシルグリシン
５０ｍＭ 塩化ナトリウム
１０ｍＭ 塩化カルシウム
５０ｍＭ ５-ホルミル-４-メチルイミダゾール
ｐＨ＝７．０
製剤３：
１．０ｍｇ／ｍＬ ｒＦＶＩＩａ
１０ｍＭ ヒスチジン
１０ｍＭ 酢酸ナトリウム
１０ｍＭ グリシルグリシン
５０ｍＭ 塩化ナトリウム
１０ｍＭ 塩化カルシウム
ｐＨ＝６．５
製剤４：
１．０ｍｇ／ｍＬ ｒＦＶＩＩａ
１０ｍＭ ヒスチジン
１０ｍＭ 酢酸ナトリウム
１０ｍＭ グリシルグリシン
５０ｍＭ 塩化ナトリウム
１０ｍＭ 塩化カルシウム
ｐＨ＝７．０
製剤を、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び５０ｍＭの５-ホルミル-４-メチルイミダゾール(製剤１及び２のみ)を、上述した濃度でグリシルグリシン、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムを既に含有している、１．０ｍｇ／ｍＬのｒＦＶＩＩａのバルク溶液に添加することにより調製する。１Ｍの水酸化ナトリウム及び１Ｍの塩酸を用い、ｐＨを、最終的にそれぞれ６．５及び７．０に調節する。
製剤を５℃及び３０℃の温度で保存し、重鎖分解生成物の形成についての分析を実施する。
実施例３
次の液状の水性製薬用組成物の製剤を考慮する：
Ａ) ｒｈＦＶＩＩａ １ｍｇ／ｍＬ(約５００００ＩＵ／ｍＬ)
ＰＩＰＥＳ １５．１２ｍｇ／ｍＬ(５０ｍＭ)
５-ホルミル-４-メチルイミダゾール １０−５０ｍＭ
ポロキサマー１８８ ０．５ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム ２．９２ｍｇ／ｍＬ(５０ｍＭ)
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ １．４７ｍｇ／ｍＬ(１０ｍＭ)
メチオニン ０．５ｍｇ／ｍＬ
１ＭのＮａＯＨ／１ＭのＨＣｌ ｐＨが６．５になるまで添加
Ｂ) ｒｈＦＶＩＩａ １ｍｇ／ｍＬ(約５００００ＩＵ／ｍＬ)
ＰＩＰＥＳ １５．１２ｍｇ／ｍＬ(５０ｍＭ)
ベンズアルデヒド １０−５０ｍＭ
ポロキサマー１８８ ０．５ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム ２．９２ｍｇ／ｍＬ(５０ｍＭ)
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ １．４７ｍｇ／ｍＬ(１０ｍＭ)
メチオニン ０．５ｍｇ／ｍＬ
１ＭのＮａＯＨ／１ＭのＨＣｌ ｐＨが６．５になるまで添加
Ｃ) ｒｈＦＶＩＩａ １ｍｇ／ｍＬ(約５００００ＩＵ／ｍＬ)
ＰＩＰＥＳ １５．１２ｍｇ／ｍＬ(５０ｍＭ)
３-ヒドロキシベンズアルデヒド １０−５０ｍＭ
ポロキサマー１８８ ０．５ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム ２．９２ｍｇ／ｍＬ(５０ｍＭ)
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ １．４７ｍｇ／ｍＬ(１０ｍＭ)
メチオニン ０．５ｍｇ／ｍＬ
１ＭのＮａＯＨ／１ＭのＨＣｌ ｐＨが６．５になるまで添加
Ｄ) ｒｈＦＶＩＩａ １ｍｇ／ｍＬ(約５００００ＩＵ／ｍＬ)
ＰＩＰＥＳ １５．１２ｍｇ／ｍＬ(５０ｍＭ)
４-ヒドロキシベンズアルデヒド １０−５０ｍＭ
ポロキサマー１８８ ０．５ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム ２．９２ｍｇ／ｍＬ(５０ｍＭ)
塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ １．４７ｍｇ／ｍＬ(１０ｍＭ)
１ＭのＮａＯＨ／１ＭのＨＣｌ ｐＨが６．５になるまで添加
続いて、製薬用組成物Ａ-Ｄは、窒素又はアルゴンでフラッシュした滅菌バイアル又はカートリッジに移され、ついで、気密性のアルミニウムラミネートされたプラスチックバッグに包装することができる。
実施例４：
ＦＶＩＩａを含有する液体製剤を用いた安定化実験を実施した。全てのサンプルの条件を、１０ｍＭのＨｉｓ、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＣａＣｌ２、６％のスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのメチオニン、１２．５ｍｇ／ｍｌのｒＦＶＩＩａとした。５００μｌのクリオチューブ(cryotubes)に、０、１０、２０、４０及び８０ｍＭのベンズアルデヒドが入った５０μｌ溶液を調製し、５℃で４週間インキュベートし、ついで、−８０℃で凍結させた。さらに、ベンズアルデヒドを含有しない参照サンプルを調製し、すぐに−８０℃で凍結させた。分析用に、全てのサンプルを解凍し、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．５において、１ｍｌ容量まで希釈し、重鎖断片化について分析した。図５には、全第ＶＩＩａ因子含有量のパーセンテージとしての断片化(「％断片化」)が示されている。断片化は、ベンズアルデヒドの存在下、特に１０ｍＭ以上の濃度でかなり低下することは明らかである。
実施例５
４０Ｋ-ＰＥＧ-ｒＦＶＩＩａを含有する液体製剤を用いた安定化実験を実施した。製剤は以下の組成を有する：
Figure 2011504477
ＰＥＧ部分を、４０Ｋ-ＰＥＧ-ｒＦＶＩＩａ濃縮物の記述において削除する。全てのサンプルにおいて、ｐＨは６．５であった。０、１／２、１及び２ヶ月において、７０μｌのアリコートを安定化サンプルから取り出し、１ｍｇ／ｍｌの４０Ｋ-ＰＥＧ-ｒＦＶＩＩａに希釈し、凝血活性(Δ活性度)、ＦＶＩＩａポリペプチド断片化(Δ断片)、ダイマー／２-ＰＥＧ、及び高分子量のタンパク質についてアッセイした。いずれのサンプルも、ダイマー／２-ＰＥＧ又は高分子量のタンパク質において、何の増加も見られなかった。表２は、３つの製剤について、５℃で２ヶ月後の、ＦＶＩＩポリペプチド断片化における変化、及び凝血活性における相対的変化を示す。
Figure 2011504477
結果には、２８ｍＭのベンズアルデヒドを添加することにより、参照製剤と比較して、断片化が少々低下し、活性の喪失に至ったことが示されている。他方、１８０ｍＭの５-ホルミル-４-メチルイミダゾールは、断片化を大幅に低下させ、ＦＶＩＩａポリペプチドの安定性をかなり改善した。

Claims (15)

  1. (ｉ)少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチド；
    (ｉｉ)約５．０〜約７．０の範囲のｐＨを維持するのに適した緩衝剤；及び
    (ｉｉｉ)Ｒ-ＣＨＯモチーフを有する少なくとも一の安定剤を含有し、該Ｒが、ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいアリール；ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、シアノ、又はハロゲンで一回又は複数回置換されていてもよいヘテロアリール；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、アミノ、ジメチルアミノ、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６-アルコキシ、Ｃ１−６-アルキルアミノ、又はＣ２−６-ジアルキルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す、液状の水性製薬用組成物。
  2. Ｒが、ヒドロキシ、メトキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、メチル、エチル、イソプロピル、又はシアノで一回又は複数回置換されていてもよいアリール；ヒドロキシ、メトキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、メチル、エチル、イソプロピル、又はシアノで一回又は複数回置換されていてもよいヘテロアリール；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、メチル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、アミノ、ジメチルアミノ、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、メトキシ、エトキシ、メチルアミノ、又はジメチルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す、請求項１に記載の組成物。
  3. Ｒが、ヒドロキシ、カルボキシル、又はヒドロキシメチルで一回又は複数回置換されていてもよいフェニル；ヒドロキシ、カルボキシル、ヒドロキシメチル、又はメチルで一回又は複数回置換されていてもよいイミダゾリル；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、メチル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、又はジメチルアミノメチルを表すＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ-；Ｒ４がメチル、エチル、ヒドロキシ、アミノ、メトキシ、エトキシ、メチルアミノ、又はジメチルアミノを表すＲ４Ｃ(=Ｏ)-を示す、請求項１に記載の組成物。
  4. 安定剤(ｉｉｉ)が、ベンズアルデヒド、アセトアルデヒド、ピバル酸アルデヒド(トリメチルアセトアルデヒド)、イソブチルアルデヒド、４-メチル-５-ホルミルイミダゾール、３-ヒドロキシベンズアルデヒド、ヒドロキシピバアルデヒド、、３-ジメチルアミノ-２,２-ジメチルプロピオンアルデヒド、サリチルアルデヒド、４-ヒドロキシベンズアルデヒド、２,３-ジヒドロキシベンズアルデヒド、２,４-ジヒドロキシベンズアルデヒド、２,５-ジヒドロキシベンズアルデヒド、３,４-ジヒドロキシベンズアルデヒド、２-カルボキシベンズアルデヒド、４-カルボキシベンズアルデヒド、２-ホルミルピリジン、３-ホルミルピリジン、４-ホルミルピリジン、２-ホルミルイミダゾール、４-ホルミルイミダゾール、及び２-ヒドロキシメチル-４-ホルミルイミダゾールからなる群から選択される少なくとも一である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 安定剤(ｉｉｉ)の濃度が、少なくとも１μＭ、例えば少なくとも１ｍＭ；例えば少なくとも２ｍＭである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドがヒト第ＶＩＩ(ａ)因子である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドがペグ化又はグリコペグ化されている、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ(ａ)因子配列変異体である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子(野生型ＦＶＩＩａ)の活性との間の比率が、ここに記載の「インビトロタンパク質分解アッセイ」(アッセイ２)でテストした場合に、少なくとも１．２５である、請求項８に記載の組成物。
  10. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、約０．０１−３０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在している、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 約５．０〜約７．０；例えば約５．０〜約６．５；例えば約５．０〜約６．０；例えば約５．５〜約７．０；例えば約５．５〜約６．５；例えば約６．０〜約７．０；例えば約６．０〜約６．５；例えば約６．３〜約６．７；又は約５．２〜約５．７の範囲のｐＨ値を有する、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 緩衝剤(ｉｉ)が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、及びコハク酸からなる群から選択される少なくとも一の成分を含む、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 緩衝剤(ｉｉ)の濃度が１−１００ｍＭである、請求項１２に記載の組成物。
  14. (ｉｉｉ)が、約０．５-２００ｍＭの濃度の５-ホルミル-４-メチルイミダゾールである、請求項７に記載の組成物。
  15. (ｉｉｉ)が、約０．５−１００ｍＭの濃度のベンズアルデヒドである、請求項７に記載の組成物。
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