DE60128906T2

DE60128906T2 - Edg8-rezeptor, dessen herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60128906T2
Application number: DE60128906T
Authority: DE
Inventors: Evi Kostenis; Johann Gassenhuber
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-14
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2021-04-15
Also published as: IL152378A0; CA2406725A1; DE60128906D1; NO20025152D0; KR20020097234A; AU2001270489B2; KR100790329B1; US20030219874A1; NZ522215A; CA2406725C; WO2001081573A1; US7141383B2; EP1278850B1; US20020099191A1; EP1278850A1; NO331197B1; JP5139617B2; MXPA02010241A; IL152378A; ATE364697T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die an das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 bzw. von einer Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 codierte Polypeptid EDG8 auf antagonistische Weise in bezug auf Sphingosin-1-phosphat (S1P), Lysophosphatidinsäure (LPA) und/oder Dihydrosphingosin-1-phosphat (DHS1P) bindet, wobei man in dem Verfahren a] eine das EDG8-Polypeptid exprimierende und mit Gα₁₆ oder Gα_qi5 cotransfizierte Zelle oder einen Teil einer derartigen Zelle mit S1P und/oder LPA und/oder DHS1P sowie einer Kandidatenverbindung in Kontakt bringt und b] die Fähigkeit der Verbindung, an das EDG8-Polypeptid auf antagonistische Weise in bezug auf S1P, LPA und/oder DHS1P zu binden, beurteilt.
Beim Versuch, neue G-Protein-gekoppelte Rezeptoren der EDG (endothelial differentiation gene)-Familie zu identifizieren, wurde ein neues Mitglied der EDG-Familie G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, Human EDG8, identifiziert. Der Klon wurde in voller Länge isoliert, und es wurden Untersuchungen über die chromosomale Kartierung, Gewebeexpression sowie Identifizierung als funktionaler zellulärer Rezeptor für Sphingosin-1-phosphat durchgeführt. Zusammengenommen liefern die Daten überzeugende Beweise dafür, daß es sich bei EDG8 um den fünften Rezeptor für Sphingosin-1-Phosphat handelt, der ausschließlich in peripheren Geweben exprimiert wird und dessen Vorhandensein in Endothelzellen für die breite Gewebeverteilung verantwortlich ist.
Die Lysolipidphosphatvermittler Lysophosphatidinsäure (LPA) und Sphingosin-1-phosphat (S1P) haben eine erhöhte Aufmerksamkeit als Modulatoren verschiedener wichtiger biologischer Funktionen auf sich gezogen (Moolenaar et al., 1997; Morris, 1999; Lynch und Im 1999), wobei ihre Liste biologischer Aktivitäten ständig wächst.
Zu den biologischen Reaktionen auf LPA gehören die Blutplättchenaggregation (Jalink et al., 1994; Siess et al., 1999; Gueguen et al., 1999), die Kontraktion glatter Muskulatur (Tokumura et al., 1980), vasoaktive in-vivo-Effekte (Tokumura et al., 1995), Chemotaxis (Jalink et al., 1993), die Expression von Adhäsionsmolekülen (Lee et al., 1998b; Rizza et al., 1999), die erhöhte "tight junction"-Permeabilität von Endothelzellen (Schulze et al., 1997), die Induktion von Stressfasern (Gohla et al., 1998) und viele andere (siehe Übersichtsartikel von Moolenaar et al., 1997). Die biochemischen Signalgebungsereignisse, die die zellulären Effekte von LPA vermitteln, umfassen die Stimulierung von Phospholipasen, die Mobilisierung von intrazellulären Ca²⁺, die Hemmung der Adenylylcyclase, die Aktivierung der Phosphatidylinositol-3-Kinase, die Aktivierung der Ras-Raf-MAP-Kinase-Kaskade sowie die Stimulierung von Rho-GTPasen (Moolenaar et al., 1997).
Insbesondere wird dabei S1P mit der Zellproliferation, der Modulation der Zellmotilität (Übersichtsartikel von Hla et al., 1999), der Induktion/Suppression von Apoptose (Hisano et al., 1999; Xia et al., 1999), Angiogenese (Lee et al., 1999), Tumorinvasivität (Sadahira et al., 1992), Blutplättchenaktivierung (Gueguen et al., 1999) und Neuritenretraktion (Postma et al., 1996) in Verbindung gebracht. Die zelluläre Signalgebung durch S1P erfolgt unter Beteiligung der Aktivierung von PLCβ und anschließender intrazellulärer Ca² ⁺-Freisetzung (van Koppen et al., 1996; Meyer zu Heringdorf et al., 1997; Yatomi et al., 1997a; Noh et al., 1998; Ancellin und Hla, 1999), der Aktivierung von MAP-Kinasen (Wu et al., 1995; Lee et al., 1996; An et al., 2000), der Aktivierung von einwärtsrektifizierenden K⁺-Kanälen (van Koppen et al., 1996; Bünemann et al., 1996) sowie der Hemmung und/oder Aktivierung von Adenylylcyclase (Lee et al., 1996).
Sowohl LPA als auch S1P werden von Signalzellen über einen Satz von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR), die unter dem Namen EDG (endothelial differentiation gene)-Rezeptoren bekannt sind, erkannt. Die EDG-Familie der GPCR umfaßt zur Zeit sieben menschliche Mitglieder (EDG1-7), die je nach ihrer Präferenz für den aktivierenden Lipidliganden in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: EDG1, 3, 5 und 6 Wechselwirken vorzugsweise mit S1P (Yatomi et al., 1997b; Lee et al., 1998a, b; Ancellin und Hla, 1999; Yamazaki et al., 2000; Van Brocklyn et al., 2000) und EDG2, 4 und 7 Wechselwirken vorzugsweise mit LPA (An et al., 1998; Im et al., 2000).
Die Zuordnung spezifischer biologischer Funktionen zu bestimmten Rezeptorsubtypen wird durch die Tatsache behindert, daß EDG-Rezeptoren in einer überlappenden Art und Weise exprimiert werden (Rizza et al., 1999; Lee et al., 1999), daß sie mehrere und zum Teil redundante Signaltransduktionswege aktivieren (Lee et al., 1996; Ancellin und Hla, 1999; Kon et al., 1999; An et al., 2000), daß die Selektivität für ihre aktivierenden Liganden nicht absolut ist (Lee et al., 1998b) und daß die medizinische Chemie nur schwach entwickelt ist, und zwar dahingehend, daß spezifische Antagonisten zur genauen Analyse der Pharmakologie der einzelnen Subtypen noch nicht zur Verfügung stehen. Ein wichtiger Schritt dazu, die biologische Rolle der einzelnen Rezeptorsubtypen stärker zu beleuchten, bestünde in der Identifizierung des vollständigen Satzes von Rezeptoren, die auf die Phospholipidvermittler S1P und LPA reagieren.
Aus der WO 00/11166 ist ein Mitglied der Superfamilie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit dem Namen 14274 bekannt, bei dem es sich um ein weiteres Mitglied der EDG-Rezeptorfamilie handelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die an das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassende bzw. von einer Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 codierte Polypeptid EDG8 auf antagonistische Weise in bezug auf Sphingosin-1-phosphat (S1P), Lysophosphatidinsäure (LPA) und/oder Dihydrosphingosin-1-phosphat (DHS1P) bindet, wobei man in dem Verfahren

a] eine das EDG8-Polypeptid exprimierende und mit Gα₁₆ oder Gα_qi5 cotransfizierte Zelle oder einen Teil einer derartigen Zelle mit S1P und/oder LPA und/oder DHS1P sowie einer Kandidatenverbindung in Kontakt bringt und
b] die Fähigkeit der Verbindung, an das EDG8-Polypeptid auf antagonistische Weise in bezug auf S1P, LPA und/oder DHS1P zu binden, beurteilt.

Vorzugsweise beinhaltet das Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen ferner die Bestimmung davon, ob die Kandidatenverbindung ein durch Aktivierung des EDG8-Polypeptids erzeugtes Signal auf antagonistische Weise an der Oberfläche der Zelle herbeiführt, wobei ein die Bildung des Signals herbeiführender Kandidat als Antagonist identifiziert wird. Die Polynukleotidsequenz kann Teil eines Expressionsvektors sein.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Polynukleotid um DNA oder RNA.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung des EDG8-Polypeptids, wobei eine das Expressionssystem enthaltende Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die der Produktion des Polypeptids genügen.
Vorzugsweise wird das Polypeptid an der Oberfläche der Zelle exprimiert.
Die Beschreibung betrifft ebenso mit diesem Verfahren produzierte Zellen.
Ferner beinhaltet das Verfahren vorzugsweise die Gewinnung des Polypeptids aus der Kultur.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung einer Zelle, die das EDG8-Polypeptid produziert, wobei man eine Wirtszelle mit dem Expressionssystem so transformiert oder transfiziert, daß die Wirtszelle unter entsprechenden Kulturbedingungen das EDG8-Polypeptid produziert.
Eine charakteristische Funktionalität von menschlichem EDG8 besteht darin, daß es sich bei dem Polypeptid um einen S1P-Rezeptor handelt; dieser reagiert auf S1P und gegebenenfalls auf verwandte Phospholipide wie etwa DMS1P oder LPA.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform beinhaltet das Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen ferner die Bestimmung davon, ob die Kandidatenverbindung ein durch Aktivierung des EDG8-Polypeptids erzeugtes Signal an der Oberfläche der Zelle herbeiführt, wobei eine die Bildung des Signals herbeiführende Kandidatenverbindung als Antagonist identifiziert wird.
Darüber hinaus betrifft die Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, bei dem man

a) eine Verbindung identifiziert, bei der es sich um einen Agonisten oder einen Antagonisten von EDG8 handelt,
b) die Verbindung herstellt und
c) gegebenenfalls die Verbindung mit geeigneten Zusatzstoffen vermischt.

Die Beschreibung betrifft ein Pharmazeutikum, das als aktiven Inhaltsstoff beispielsweise eine derartige identifizierte Verbindung, ein FDG8-Polypeptid oder ein für EDG8 codierendes Polynukleotid umfaßt.
Insbesondere betrifft die Beschreibung ein Pharmazeutikum, das sich zur Vorbeugung und/oder Behandlung von mit der EDG8/S1P-Signaltransduktion assoziierten Krankheiten, beispielsweise mit einer Endothelfehlfunktion assoziierten Krankheiten, wie z.B. Arteriosklerose, "Shoke", Hypertonie, Coronarsyndrome, Krebs, thrombolytische Krankheiten, beeinträchtigte Wundheilung sowie von erhöhtem Zelltod begleiteten Krankheiten, einsetzen läßt. In einem weiteren Aspekt der Beschreibung kann ein solches Pharmazeutikum zur Vorbeugung und/oder Behandlung von mit einer Fehlregulation der Angiogenese assoziierten Krankheiten, wie beispielsweise Tumorwachstum, rheumatischer Arthritis und diabetischer Retinopathie, verwendet werden.
In der Arbeit wird über die Klonierung, die chromosomale Kartierung, die Gewebeexpression und die funktionale Identifizierung als Reporter für S1P eines neuen GPCR, EDG8, des fünften funktionalen Rezeptors für Sphingosin-1-phosphat, berichtet.
Beim Versuch, neue G-Protein-gekoppelte Rezeptoren der EDG-Familie zu identifizieren, wurde eine Datenbanksuche mit vergleichenden Gegenüberstellungen der gegenwärtig bekannten 18 Mitglieder dieser Rezeptorfamilie durchgeführt, wobei menschliche EDG1-7-Sequenzen bis zu den mutmaßlichen EDGs von Xenopus und Zebrafisch umfaßt sind. Eine mehrfache Gegenüberstellung dieser Sequenzen wurde mittels CLUSTALW erzeugt und in einer PSI-BLAST-Suche verwendet, um translatierte Versionen menschlicher genomischer DNA-Sequenzen, die in den unterschiedlichen EMBL-Sektionen allgemein zur Verfügung standen, abzusuchen. Zur Translation von DNA in Proteinsequenzen wurden individuelle Proteindateien innerhalb von jeweils zwei STOP-Codons erzeugt, wobei alle Proteine mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren ignoriert wurden. Da die Mehrzahl der GPCR ungespleißt ist, sollte die Suche nach GPCR in genomischen Sequenzen zu neuen Rezeptorproteinen führen.
Bei der Durchführung einer PSI-BLAST-Suche wurden die verschiedenen cDNAs bzw. genomischen Contigs für die menschlichen Rezeptoren EDG1-7 identifiziert, wobei ein zusätzlicher genomischer Treffer, der zu menschlichem EDG5 hoch homolog ist (51% Homologie), die Bezeichnung EDG8 erhielt. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des neuen mutmaßlichen GPCR sind in 1A dargestellt. Die Hydropathieanalyse (Hydrophobizitätsgraph nicht gezeigt) läßt ein Protein mit sieben Transmembranbereichen mit drei einander abwechselnden extra- und intrazellulären Schleifen vermuten, wobei man annimmt, daß es sich hier um die für GPCR übliche Heptahelixstruktur handelt.
Um die an der molekularen Evolution der EDG-Rezeptorfamilie beteiligten Verwandtschaftsbeziehungen stärker zu beleuchten, wurde ein "Grow Tree"-Phylogramm unter Verwendung des "neighbor joining"-Verfahrens (GCG Software) konstruiert (1B) (Vergleich von Aminosäuresequenzen). Gemäß diesem Stammbaum läßt sich die menschliche EDG-Familie in zwei verschiedene Gruppen einteilen: dabei gehören EDG1, 3, 5 und 6 zu der einen und EDG2, 4 und 7 zu der anderen Gruppe. Diese beiden Gruppen unterscheiden sich weiter hinsichtlich ihrer Präferenz für unterschiedliche Lipidliganden: EDG1, 3, 5, 6 werden vorzugsweise durch Sphingosin-1-phosphat (S1P) (Yatomi et al., 1997b; Lee et al., 1998a, b; Ancellin und Hla, 1999; Yamazaki et al., 2000; Van Brocklyn et al., 2000) und EDG2, 4 und 7 durch Lysophosphatidinsäure (LPA) (Hecht et al., 1996; An et al., 1998; Im et al., 2000) stimuliert. Das neu identifizierte EDG8 zeigte die höchste Ähnlichkeit (86,8% Aminosäureidentität) mit dem nrg1-Protein der Ratte (1B), einem kürzlich durch EST-Expressionsprofilerstellung aus einer Ratten-PC12-Zellbibliothek klonierten GPCR (Glickman et al., 1999), der vermutlich das Rattenhomolog des menschlichen EDG8 repräsentiert. In der Veröffentlichung von Glickman wurde von den Autoren allerdings die Frage nach dem aktivierenden Liganden dieses Rezeptors nicht behandelt. Die hohe Ähnlichkeit zwischen EDG8 und dem bekannten Sphingosin-1-phosphat (S1P)-Rezeptoren EDG1, 3 und 5 (48–51%) (1C) führte zum Testen der Hypothese, daß EDG8 ein funktionaler S1P-Rezeptor sein könnte.
Beim Testen auf S1P-Rezeptoraktivität wurde die EDG8-cDNA in CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellen durch transiente Transfektion eingeführt. Dabei wurden CHO-Zellen gewählt, da diese minimale Reaktionen gegenüber Sphingosin-1-phosphat in Konzentrationen von bis zu 1 μM zeigen, jedoch nach der Transfektion mit den S1P bevorzugenden Rezeptoren EDG 1, 3 und 5 auf S1P reagieren (Okamoto et al., 1998; Kon et al., 1999). Zum Testen der funktionalen Rezeptoraktivität wurde die Mobilisierung von [Ca²⁺]_i aus drei Gründen verfolgt:

1) es wurde berichtet, daß S1P Ca²⁺ in vielen Zellarten erhöht (Ghosh et al., 1990; Zang et al., 1991; Durieux et al., 1993; Chao et al., 1994; Gosh et al., 1994; Mattie et al., 1994; Meyer zu Heringdorf et al., 1996; Okajima et al., 1996; van Koppen et al., 1996; Törnquist et al., 1997; Yatomi et al., 1997; Noh et al., 1998; An et al., 1999).
2) Durch die Identifizierung von EDG1, 3, 5 und 6 als Rezeptoren für S1P wurde die molekulare Basis für einen GPCR-vermittelten Mechanismus bereitgestellt, wobei die Rezeptoren dafür bekannt sind, daß sie die intrazelluläre Ca²⁺-Freisetzung entweder über PTX-sensitive Gα_i-Proteine oder den PTX-insensitiven Gα_q/11- Weg vermitteln (Okamoto et al., 1998; Kon et al., 1999; Gonda et al., 1999).
3) Alle zur Zeit bekannten auf S1P reagierenden EDG-Rezeptoren (außer EDG6) sind in Endothelzellen vorhanden (A. Niedernberg et al., eingereicht), in denen die intrazelluläre Ca²⁺-Freisetzung einen Hauptweg bei der Erzeugung von NO, einem wichtigen Faktor in der Gefäßbiologie, darstellt. Somit könnte die Identifizierung des vollständigen Satzes von S1P-Rezeptoren, die an der intrazellulären Ca²⁺-Mobilisierung beteiligt sind, bei der Aufklärung der Rolle der einzelnen Subtypen bei der Signalgebung in Endothelzellen helfen.

In 2 ist die Messung der durch S1P über den mutmaßlichen S1P-Rezeptor EDG8 vermittelten intrazellulären Ca²⁺-Konzentration dargestellt. Aus Vergleichsgründen wurden die S1P-Rezeptoren EDG1, 3, 5, und 6, von denen berichtet wurde, daß sie [Ca²⁺]_i mobilisieren, mit einbezogen. [Ca²⁺]_i wurden als Echtzeitmessungen unter Verwendung des Fluoreszenzplatten-Bildablesegeräts (FLIPR, Molecular Devices) aufgezeichnet. Dabei wurden zunächst mit Leervektor-DNA transfizierte CHO-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an S1P (10, 100, 1000 nM) stimuliert. Keine der angewandten S1P-Konzentrationen war in der Lage, signifikante Erhöhungen des intrazellulären Ca²⁺ hervorzurufen (2A), was vermuten läßt, daß S1P-Rezeptoren in CHO-Zellen nicht exprimiert werden oder, falls sie exprimiert werden, nicht in der Lage sind, über den endogenen Gα_q-Weg zu signalisieren. Um diesen Punkt zu adressieren, wurden die G-Proteinchimäre Gα_qi5, die Gi-gekoppelten Rezeptoren die Fähigkeit zur Stimulierung des Gq-Weg verleiht, und Gα₁₆, die Gi- und Gs-gekoppelte Rezeptoren mit PLCβ und anschließender intrazellulärer Ca²⁺-Mobilisierung verknüpft, verwendet. Bei Stimulierung mit S1P ergaben mit G_gi5 und G₁₆ transfizierte CHO-Zellen keinen signifikanten [Ca²⁺]_i- Anstieg (2A). Allerdings verlieh die transiente Transfektion von CHO-Zellen mit den für die Rezeptoren EDG1, 3 und 5 codierenden cDNAs den Zellen Reaktionsfähigkeit gegenüber S1P: dabei wurde bestätigt, daß EDG1, 3 und 5 [Ca²⁺]_i als Reaktion auf S1P mobilisieren (2B, C, D) (Kon et al., 1999). Wie bereits für eine große Anzahl Gq-gekoppelter Rezeptoren bekannt ist, verstärkt die Coexpression von Gα_q die von EDG1 bzw. 5 vermittelte Ca²⁺-Antwort im Vergleich mit dem durch Stimulierung von endogenen Gα_q induzierten Ca²⁺-Signal. Im Falle von EDG3 wurde die Signalintensität durch zusätzliches von außen zugeführtes Gα_q nicht weiter verbessert. Diese Ergebnisse stimmen mit den von Kon et al. (1999) berichteten Erkenntnissen überein, bei denen gezeigt wurde, daß der EDG3-Subtyp zur stärksten Verbesserung des intrazellulären Ca²⁺ führt.
Im Fall von EDG6 erhielten Yamazaki et al. (2000) eine S1P-induzierte Mobilisierung von [Ca²⁺]_i, doch konnte von uns kein signifikanter Ca²⁺-Anstieg über den Grundniveaus in Abwesenheit irgendeiner cotransfizierten G-Protein-α-Untereinheit nachgewiesen werden (2E). Der Grund für diese Diskrepanz könnte im zellulären Hintergrund (CHO-Zellen in dieser Arbeit gegenüber K562-Zellen bei Yamazaki et al.) liegen, da von letzteren über eine Pertussis Toxin (PTX)-sensitive Ca²⁺-Antwort berichtet wurde, was auf die Beteiligung von G-Proteinen des Gi-Typs hindeutet. In diesem Fall würde das Ca²⁺-Signal von aus aktivierten Gα_iβγ--Heterotrimeren freigesetzten βγ hervorgerufen werden. Es ist bekannt, daß die Gα_i-induzierten Ca²⁺-Signale in ihrer Intensität wesentlich kleiner sind verglichen mit den durch bona fide Gq-verknüpfte Rezeptoren induzierten Ca²⁺-Signalen (Kostenis et al., 1997). Es könnte sein, daß der Nachweis derartiger [Ca²⁺]_i-Konzentrationen außerhalb der Empfindlichkeit des FLIPR-Systems liegen. EDG8 setzte bei Stimulierung mit S1P (10, 100 und 1000 nM) kein [Ca²⁺]_i frei (2F), erwarb aber die Fähigkeit zur Mobilisierung von Ca²⁺ bei Cotransfektion mit Gα₁₆, einer G-Protein-α-Untereinheit, von der bekannt ist, daß sie GPCR aus unterschiedlichen funktionellen Klassen an den Gq-PLCβ-Weg koppelt, oder Gα_qi5, einer mutanten G-Protein-α-Untereinheit, die Gi-verknüpften Rezeptoren die Fähigkeit zur Stimulierung von Gq verleiht (Conklin et al., 1993). Diese Ergebnisse zeigen, daß es sich bei EDG8 um einen funktionalen Rezeptor für S1P handelt und daß EDG8-induzierte Ca²⁺-Antworten auf einen Nicht-Gq-Weg, möglicherweise die Aktivierung von Phospholipase Cβ2 durch βγ-Untereinheiten der Gi-Proteine, zurückzuführen sind. Weiterhin liefern diese Ergebnisse zusätzliche Beweise dafür, daß die S1P bevorzugenden EDG-Rezeptoren in unterschiedlicher Weise an die Gq- und Gi-Wege koppeln: EDG3 ist der wirkungsvollste mobilisierende Rezeptor, Rezeptor, wobei eine Überexpression von Gag die Ca²⁺-Signalgebung nicht weiter verbessert; EDG1 und 5 induzieren jeweils einen mäßigen Ca²⁺-Anstieg, der durch Cotransfektion von Gα_q oder einem chimären Gα_qi5-Protein in signifikanter Weise verbessert werden kann; EDG8-vermittelte Ca²⁺-Antworten benötigen die Cotransfektion von Gα_qi5 oder Gα₁₆. Um zu überprüfen, ob der EDG8-Rezeptor auch auf verwandte Lysophospholipidvermittler reagiert, wurde die Fähigkeit von Lysophosphatidinsäure (LPA), Dihydrosphingosin-1-phosphat (DHS1P), Sphingosylphosphorylcholin (SPC) und Lysophosphatidylcholin (LPC) zur Erhöhung von intrazellulären Ca²⁺ in CHO-Zellen, die transient mit dem EDG8-Rezeptor und den G-Protein-α-Untereinheiten Gα₁₆ und Gα_qi5 transfiziert waren, untersucht (3). Neben S1P, das den wirkungsvollsten Aktivator von EDG8 darstellt, riefen LPA und DHS1P einen [Ca²⁺]_i-Anstieg bei Konzentrationen von 100 und 1000 nM hervor. SPC bzw. LPC konnten keine signifikante Reaktion bei Konzentrationen von bis zu 1 μM erzeugen. Diese Daten zeigen, daß es sich bei EDG8 um einen S1P bevorzugenden Rezeptor handelt, der jedoch auch auf verwandte Phospholipide wie etwa DHS1P oder LPA reagiert, wie auch von EDG1 berichtet wurde, bei dem es sich um einen hochaffinen Rezeptor für S1P und einen niedrigaffinen Rezeptor für LPA handelt (Lee et al., 1998b). Daher weist der EDG8-Rezeptor die charakteristische Funktionalität auf, auf S1P und verwandte Phospholipide wie etwa DMS 1P oder LPA zu reagieren. Die Reaktion auf S1P und andere verwandte Phospholipide läßt sich beispielsweise wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmen. Das entsprechende Gα enthaltende Zellen können wie in Beispiel 2 beschrieben gewonnen werden.
Als nächstes wurde das Expressionsmuster des EDG8-Gens in menschlichen Geweben durch Northern-Blot-Analyse untersucht (4). Für EDG8-RNA positive Gewebe waren Skelettmuskel, Herz und Niere, wobei eine geringere Häufigkeit der RNA in der Leber und der Plazenta beobachtet und kein Signal in Hirn, Thymus, Milz, Lunge und peripheren Blutleukozyten nachgewiesen wurde. In allen Geweben wurde nach Hybridisierung mit einer mit DIG markierten EDG8-Antisense-RNA-Sonde ein einzelnes RNA-Transkript mit einer Größe von 5,5 kB beobachtet. EDG8 zeigt die höchste Ähnlichkeit zum nrg1-GPCR der Ratte (Glickman et al., 1999) mit einer Aminosäureidentität von 86,8% (1B), was vermuten läßt, daß es sich hierbei um das menschliche Homolog des nrg1-Proteins der Ratte handelt. Allerdings unterscheidet sich das Expressionsmuster von menschlichem EDG8 ziemlich von dem des nrg1l-Rezeptors der Ratte, der fast ausschließlich im Gehirn angetroffen wird (Glickman et al., 1999). Dieses Ergebnis läßt vermuten, daß EDG8 einen nahe verwandten, jedoch vollkommen unterschiedlichen Rezeptor von nrg1 statt das menschliche Homolog repräsentieren könnte. Trotzdem wird dadurch die Möglichkeit nicht ausgeschlossen, daß es sich bei EDG8 und nrg1 um Homologe mit vollkommen unterschiedlichen, speziesabhängigen Expressionsmustern handelt.
Da das erste Mitglied der EDG-Familie von GPCR – EDG1 – ursprünglich als Endotheldifferenzierungsgen aus mit Phorbol-Myristat-Acetat behandelten diffenzierenden menschlichen Endothelzellen (Hla und Maciag, 1990) und anschließend aus einer menschlichen Nabelschnurvenenendothelzellen-Bibliothek, die einem Fluidscherstreß ausgesetzt war, als hochreguliertes Gen kloniert wurde, besteht ein sinnvoller Grund zu der Annahme, daß EDG-Rezeptoren eine wichtige Rolle bei der Regulation der Endothelfunktion spielen. Daher wurde das Vorhandensein von EDG8-Transkripten in mehreren menschlichen Endothelzellinien analysiert. Die RT-PCR-Analyse von HUVECs (human umbilical vein endothelial cells [menschliche Nabelschnurvenenendothelzellen]), HCAECs (human coronary artery endothelial cells [menschliche Coronarartherienendothelzellen]), HMVEC-L (human microvascular endothelial cells of the lung [menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge]) und HPAEC (human pulmonary artery endothelial cells [menschliche Lungenarterienendothelzellen]) zeigte eine EDG8-Expression in allen getesteten Zellinien (5A). In 5B ist gezeigt, daß EDG8-spezifische Primer tatsächlich nur EDG8-Sequenzen und keine der verwandten EDG1-7-Sequenzen amplifizieren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das Vorhandensein von EDG8 in unterschiedlichen peripheren Organen an seiner Lokalisierung in Endothelzellen liegen könnte; allerdings wird damit nicht ausgeschlossen, daß EDG8-Transkripte in anderen Zellarten als Endothelzellen vorkommen.
Die Expression von EDG8 zusätzlich zu EDG1, 3 und 5 (Rizza et al., 1999) in HUVEC und mehreren anderen Endothelzellinien ist im Hinblick auf alle Berichte bezüglich S1P-Effekten auf die Signalgebung in Endothelzellen faszinierend. Von Hisano et al. (1999) wurde berichtet, daß S1P HUVEC vor der durch Entfernung von Wachstumsfaktoren induzierten Apoptose schützt und die HUVEC-DNA-Synthese stimuliert; die Autoren leiteten ein Modell für Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Blutplättchen ab, doch konnte der für den HUVEC-Schutz vor Apoptose verantwortliche S1P-Rezeptor nicht identifiziert werden. Von Rizza et al. (1999) wurde berichtet, daß S1P eine Rolle bei der Wechselwirkung zwischen Endothelzellen und Leukozyten dahingehend spielt, daß S1P die Expression von Zelladhäsionsmolekülen in menschlichen Aortaendothelzellen induziert, was Monozyten und Neutrophilen die Anbindung gestattet. Diese Effekte wurden durch Pertussistoxin blockiert, was die Beteiligung eines Gi-gekoppelten S1P-Rezeptors vermuten läßt. Allerdings konnte der verantwortliche S1P-Rezeptorsubtyp nicht identifiziert werden, und der EDG8-Rezeptor war zum Zeitpunkt dieser Arbeit nicht mit einbezogen. Die Erstellung von Expressionsprofilen aller EDG-Rezeptoren in individuellen Zellinien sowie die Verwendung EDG-Rezeptor-Subtyp-selektiver Verbindungen ist eindeutig notwendig, um bei der Bestimmung der Rolle der einzelnen S1P-Rezeptoren bei Endothelzellensignalgebungsmechanismen zu helfen.
Schließlich gestattete die Kartierung von EDG-Rezeptoren in genomischen Sequenzen die Herleitung der chromosomalen Lokalisierung für vier Gene dieser Familie (Tab. 1). Interessanterweise sind soweit vier EDG-Rezeptoren, einschließlich EDG8, auf Chromosom 19 lokalisiert. Darüber hinaus gestattete die genomische Sequenz die Bestimmung der Struktur der Gene: Die S1P bevorzugenden Rezeptoren EDG1, 3, 5 und 8 sind intronlos, im Gegensatz zu den LPA bevorzugenden Subtypen 2, 4 und 7, die ein Intron im offenen Leseraster in TMVI enthalten. Diese Daten lassen darauf schließen, daß sich die beiden Unterklassen von Lysophospholipidrezeptoren neben dem aktivierenden Liganden und dem Grad der Homologie ferner über ihre genomische Struktur unterscheiden lassen. Die genomische Struktur neuerer potentieller EDG/LPA-Rezeptorfamilienmitglieder kann auch bei der Vorhersage der Art des aktivierenden Lipidliganden behilflich sein.
Zusammenfassend wurde ein neues Mitglied der EDG-Familie G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, menschliches EDG8, isoliert. Dieser Rezeptor fungiert als zellulärer Rezeptor für Sphingosin-1-phosphat. EDG8 konnte ausschließlich in peripheren Geweben, wie etwa Skelettmuskel, Herz und Niere sowie in mehreren menschlichen Endothelzellinien nachgewiesen werden. Es ist denkbar, daß die Expression in Endothelzellen für die breite Gewebeverteilung dieses Rezeptors verantwortlich sein kann. Die Existenz von wenigstens acht EDG-Rezeptoren für Lysophospholipide läßt vermuten, daß für ein besseres Verständnis der Biologie von Lysophospholipiden und deren jeweiliger Rezeptoren im wesentlichen Rezeptorsubtyp-selektive Agonisten und Antagonisten notwendig sind.
Figurbeschreibungen
1A: Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem EDG8. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unterhalb der Nukleotidsequenz dargestellt, wobei die Nukleotidpositionen auf der linken Seite angegeben sind.
1B: Stammbaum der EDG-Familie von Rezeptoren. Der dargestellte Stammbaum wurde mit dem mit dem GCG-Programm durchgeführten "neighbor joining"-Verfahren hergeleitet.
1C: vergleichende Gegenüberstellung der Aminosäuresequenz von menschlichem EDG8 mit den anderen EDG-Familienmitgliedern. Die Aminosäuresequenz von EDG8 wird mit den Polypeptiden EDG1-7 verglichen (EDG1: Zugangsnummer M 31210, EDG2: Zugangsnummer U 80811, EDG3: Zugangsnummer X 83864, EDG4: Zugangsnummer AF 011466, EDG5: Zugangsnummer AF 034780, EDG6: AJ 000479, EDG7: Zugangsnummer AF 127138). Die ungefähren Grenzen der sieben mutmaßlichen Transmembrandomänen sind umrandet. Zur Optimierung der Gegenüberstellung sind Lücken eingefügt.
2A–F: Mobilisierung von intrazellulären Ca²⁺ durch S1P (10, 100 und 1000 nN), vermittelt über die mit Leervektor-DNA als Kontrolle oder den angegebenen G-Protein-α-Untereinheiten cotransfizierten Rezeptoren EDG1, 3, 5, 6 und 8 in CHO-Zellen.
A: S1P-induzierte Ca²⁺-Antwort in mit Vektor-DNA allein oder den G-Protein-α-Untereinheiten G, Gq, G16 und Gqi5 transfizierten CHO-Zellen. B–F: S1P-induzierte Ca²⁺-Antwort in mit den angegebenen EDG-Rezeptor-Subtypen transfizierten CHO-Zellen. Agonistenvermittelte Änderungen von intrazellulärem Ca²⁺ wurden mit der FLIPR-Technik unter Verwendung des Ca²⁺-sensitiven Farbstoffs FLUO4, wie im Abschnitt experimentelle Vorgehensweisen beschrieben, gemessen. Die Fluoreszenz von mit FLUO4 beladenen transfizierten Zellen wurde vor und nach Zugabe von S1P, das in den angegebenen Konzentrationen eingetragen wurde, aufgezeichnet. Die Daten sind als Mittelwerte von Vielfachbestimmungen in einem einzelnen Experiment ausgedrückt. Ein zusätzliches Experiment ergab ähnliche Ergebnisse.
3: Effekte von S1P, LPA und verwandten Lysophospholipidvermittlern auf den EDG8-vermittelten Anstieg von intrazellulärem Ca²⁺. CHO-Zellen wurden mit EDG8 und den G-Protein-α-Untereinheiten Gqi5 (oberes Diagramm) und G16 (unteres Diagramm) cotransfiziert, und der [Ca²⁺]_i-Anstieg wurde mit der FLIPR-Technologie, wie im Abschnitt experimentelle Vorgehensweisen beschrieben, aufgezeichnet. Die verschiedenen Lipide wurden in Konzentrationen von 10, 100 bzw. 1000 nM eingesetzt. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte von Vierfachbestimmungen eines repräsentativen Experiments. Zwei zusätzliche Experimente ergaben ähnliche Ergebnisse.
4: Northern-Blot-Analyse von EDGB in menschlichen Geweben. Poly(A) + RNA (1 μg) aus verschiedenen menschlichen Geweben (Northern-Blots mehrerer menschlicher Gewebe, CLONTECH) wurde mit für menschliches EDG8 (oberer Teil) bzw. β-Actin (unterer Teil) spezifischen Sonden auf einer Nylonmembran hybridisiert. Der Ursprung der einzelnen RNAs ist jeweils oben angegeben, die Molmasse von Standardmarkern in Kilobasen (kB) ist links dargestellt.
5A: RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)-Analyse von EDG8 in verschiedenen menschlichen Endothelzellinien (HUVEC: menschliche Nabelschnurvenenendothelzellen; HCAEC: menschliche Coronararterienendothelzellen; HMVEC-L: menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen aus der Lunge; HPAEC: menschliche Lungenarterienendothelzellen). EDG8-spezifische Transkripte wurden in allen Endothelzellinien nachgewiesen. Dargestellt ist die Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte nach 35 Zyklen Amplifikation mit dem "GC-melt"-Kit (wie im Abschnitt experimentelle Vorgehensweisen beschrieben). Die Amplifikation mit EDG8-spezifischen Primern ergab ein 522 Bp großes EDG8-Fragment, wie durch den Pfeil angedeutet. Das EDG8-Plasmid diente als Matrize für die Positivkontrolle, wobei als Negativkontrolle H₂O anstelle von Plasmid-DNA verwendet wurde.
5B: PCR-Analyse von EDG8-Primern hinsichtlich der Spezifität der Amplifikation von EDG8-Sequenzen. Für die EDG8-Sequenz spezifische Primer wurden hinsichtlich einer möglichen Amplifikation der verwandten EDG1-7-Sequenzen überprüft, wobei die jeweiligen Plasmide als Matrizen verwendet wurden. Dargestellt ist die Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte nach 35 Zyklen Amplifikation mit dem "GC-melt"-Kit (wie im Abschnitt experimentelle Vorgehensweisen beschrieben). Die EDG8-spezifische, 522 Bp große Bande trat nur dann auf, wenn EDG8 als Matrize verwendet wurde. Als Negativkontrolle wurde H₂O anstelle von Plasmid-DNA verwendet.
6: Die Experimente wurden gemäß Beispiel 3 durchgeführt. Statt Lipiden wurde eine Lipidbibliothek verwendet.
6A + B: Bibliothekstafeln mit Ratten-EDG8 (rEDG8) und qi5.
6A: qi5-Hintergrund.
6B: Messung mit rEDG8.
6C: Zählwerte der Fluoreszenzänderung.
7: Experimente wurden gemäß Beispiel 3 durchgeführt. Statt Lipiden wurde eine Lipidbibliothek verwendet.
7A + B: Bibliothekstafeln mit menschlichem EDG8 (hEDG8) und qi5.
7A: q15-Hintergrund.
7B: Messung mit hEDG8.
7C: Zählwerte der Fluoreszenzänderung.
8: Antagonismus der S1P-Aktivierung von EDG8 der Ratte und des Menschen.
Transient transfizierte CHO-Zellen, die Ratten-EDG8 und Gα_qi5 (A) exprimieren, und HEK-293-Zellen, die menschliches EDG8 und Gα_qi5 (B) exprimieren, wurden mit Testverbindungen, nämlich 0,1 μM Leucotrien B4, 1 μM 2- DHLA-PAF (1-O-Hexadecyl-2-O-dihomo-γ-linolenoyl-sn-glycero-3-phophorylcholin), 1 μM C₂ Dihydroceramid, 0,1 μM 15(S)-HEDE (15(S)-Hydroxyeicosa-11Z, 13E-Diensäure), 1 μM PAF C16 (1-O-Hexadecyl-2-O-acetyl-sn-glycero-3-phosphorylcholin), 1 μM 16,16-Dimethyl-PGE₂ (16,16-Dimethyl-prostaglandin E₂) 12, 0,1 μM (R)-HETE (12(R)-Hydroxyeicosa-5Z,8Z,10E,14Z-tetraensäure), 1 μM 8-epi-PGF_2α (8-epi-Prostaglandin F_2α), 0,1 μM Leucotoxin A ((±) 9,10-EODE), oder mit Lösungsmittelpuffer 3 min inkubiert und dann einem Challenge mit 1 μM S1P (Sphingosin-1-phosphat) unterzogen. Die Spitzenfluoreszenzzählwerte von mit Lösungsmittelpuffer vorinkubierten und danach mit 1 μM S1P stimulierten Zellen wurden gleich 100% gesetzt. Die Zellwerte der Fluoreszenzänderung wurden mit der FLIPR-Technologie wie ausführlich im Abschnitt experimentelle Vorgehensweisen beschrieben aufgezeichnet. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SE von 2–3 unabhängigen Experimenten.
9: Hemmung von S1P-vermittelter interzellulärer Calciumfreisetzung durch Suramin und NF023 (8,8'-(Carbonylbis(imino-3,1-phenylen))bis-(1,3,5-naphthalintrisulfonsäure)) in mit menschlichem EDG8 und Gα_qi5 (A) bzw. Ratten-EDG8 und Gα_qi5 (B) transient cotransfizierten Zellen. Die transfizierten Zellen wurden zunächst mit den angegebenen Konzentrationen des Inhibitors oder Lösungsmittelpuffer 3 Minuten behandelt (NF023 und Suramin zeigten keine Wirkung auf die [Ca²⁺]_i-Mobilisierung während der Vorinkubationszeit). Anschließend wurden die Zellen mit 1 μM S1P und in [Ca²⁺]_i, gemessen mit der FLIPR-Technologie, wie im Methodenteil beschrieben, stimuliert. Die Spitzenfluoreszenzzählwerte wurden normiert und Hintergrundreaktionen von Gα_qi5-transfizierten Zellen subtrahiert. Die S1P-vermittelte Calciumfreisetzung in Abwesenheit des Inhibitors wurde gleich 100% gesetzt. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SE von 4–7 unabhängigen Experimenten.
TABELLE 1: Chromosomale Lokalisierung, Genstruktur und Zugangsnummer der jeweiligen genomischen EDG-Klone

Die Kartierung von EDG-Rezeptoren in genomischen Sequenzen gestattete die Herleitung einer vergleichenden chromosomalen Gegenüberstellung für EDG1, 2, 4–8. Die chromosomale Lokalisierung von EDG3 wurde Yamagutchi et al. (1996) entnommen. Die genomischen Sequenzen zeigten auch, daß EDG1, 3, 5, 6 und 8 ungespleißt sind, im Gegensatz zu EDG2, 4 und 7, die in ihrem offenen Leseraster (ORF) jeweils ein Intron enthalten.

EDG	Chromosomale Lokalisierung gespleißt/ungespleißt im ORF	Gemäß BAC-Zugangsnummer:
EDG1	1p21.1 21.3 ungespleißt	AL161741
EDG2	9q31.1 32/ /18p11.3 gespleißt	AL157881/ /AP000882
EDG3	9q22.1 q22.2 ungespleißt
EDG4	19p12 gespleißt	NT_000939
EDG5	19 non gespleißt	AC011511
EDG6	19p13.3 ungespleißt	AC011547
EDG7	1p22.3 31.2 gespleißt	AL139822
EDG8	19 ungespleißt	AC011461

Beispiele
Beispiel 1: molekulare Klonierung des menschlichen EDG8-Rezeptors
Da die mutmaßliche menschliche EDG8-Sequenz intronlos ist, wurde der Rezeptor von uns aus menschlicher genomischer DNA (CLONTECH, Palo Alto, CA, 94303-4230, USA) über die Polymerasekettenreaktion (PCR) kloniert. Die zur Amplifikation der EDG8-Sequenz etablierten PCR-Bedingungen bestanden aus 1 min bei 94°C und daran anschließend 35 Zyklen von jeweils 30 s bei 94°C und 3 min bei 68°C, wobei der GC-Melt-Kit (CLONTECH, Palo Alto, CA, USA) verwendet wurde. Zur Amplifikation der EDG8-Sequenz konstruierte Primer enthielten eine HindIII-Stelle im Vorwärts- bzw. eine EcoRI-Stelle im Rückwärtsprimer. Das 1197 Bp große PCR-Produkt wurde in den Säugerexpressionsvektor pCDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) kloniert und in beiden Richtungen sequenziert.
Beispiel 2: Zellkultur und Transfektion
CHO-K1-Zellen wurden in mit 10% fötalem Rinderserum supplementiertem basalem ISCOVE-Medium bei 37°C in einem luftbefeuchteten Inkubator (5% CO₂) kultiviert. Für die Transfektionen wurden 2 × 10⁵ Zellen in 35-mm-Schalen ausgesäht. Etwa 24 Std. später wurden die Zellen bei 50–80% Konfluenz mit den angegebenen Rezeptor- und G-Protein-Konstrukten (jeweils 1 μg Plasmid-DNA) unter Verwendung des Transfektionsreagens Lipofectamine und der beigelegten Vorschrift (GIBCO) transient transfiziert. 18–24 Std. nach der Transfektion wurden die Zellen mit einer Dichte von 50 000 Zellen pro Vertiefung in 96-Loch-Platen ausgesetzt und weitere 18–24 Std. bis zur Verwendung in den FLIPR-Funktionstests kultiviert.
Die cDNA für Gα16 wurde von TF1-Zellen mittels RT-PCR kloniert und in den Säureexpressionsvektor pCDNA1.1 (Invitrogen) ligiert. Das Wildtyp-Gαq der Maus wurde aus Zellen mittels RT-PCR kloniert und in die BamHI-NsiI-Stellen von pCDNA1.1 inseriert. Um die C-terminal modifizierte Gα_qi5-Untereinheit zu erzeugen, in der die letzten fünf AS des WT-Gαq durch die entsprechende Gα_i-Sequenz ersetzt sind, wurde ein 175 Bp großes BgIII-NsiI-Fragment in einer zweiteiligen Ligation durch ein synthetisches DNA-Fragment, das die gewünschten Codonänderungen enthält, ersetzt. Die Richtigkeit aller durch PCR gewonnenen Frequenzen wurde durch Sequenzierung in beiden Richtungen verifiziert.
Beispiel 3: FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader)-Test
24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen bei einer Dichte von 50 000 Zellen pro Vertiefung in 96-Loch-Mikroplatten mit schwarzer Wandung (Corning) aufgeteilt. 18–24 Std. später wurden die Zellen mit 95 μl HBSS mit 20 mM Hepes, 2,5 mM Probenecid, 4 μM fluoreszierendem Calciumindikatorfarbstoff Fluo4 (Molecular Probes) und 1% fötalem Kälberserum 1 h beladen (37°C, 5% CO₂). Die Zellen wurden dreimal mit HBSS mit 20 mM Hepes und 2,5 mM Probenecid in einem Zellwaschgerät gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Lösung bis auf ein Restvolumen von 100 μl pro Vertiefung der 96-Loch-Platte abgesaugt. Lipidliganden wurden in DMSO in Form von 2 mM-Stammlösungen (unter Behandlung mit Ultraschall, falls notwendig) gelöst und mindestens 1:100 in HBSS mit 20 mM HEPES, 2,5 mM Probenecid und 0,4 mg/ml fettsäurefreiem Rinderserumalbumin verdünnt. Vor dem Test wurden Lipide als 2X-Lösungen portionsweise in eine 96-Loch-Platte gegeben. Das FLIPR (fluorometric imaging plate reader)-Gerät (Molecular Devices) wurde so programmiert, daß von jeder Vertiefung der Liganden-Mikroplatte jeweils 100 μl auf jede Vertiefung der Zellplatte übertragen und die Fluoreszenz 3 min lang, und zwar im 1-Sekunden-Abstand während der ersten Minute und im 3-Sekunden-Abstand während der letzten beiden Minuten, aufgezeichnet wurde. Zur Bestimmung der Agonistenaktivität werden die gesamten Fluoreszenzzählwerte von den Zeitpunkten von 18 s bis 37 s verwendet. Die Software des Instruments normiert die Fluoreszenzablesung, so daß sich gleichwertige erste Ablesungswerte zum Zeitpunkt null ergeben.
Beispiel 4: Northern-Blot-Analyse
Northern-Blots mit mehreren menschlichen Geweben wurden von der Firma CLONTECH (Palo Alto, CA, 94303-4230, USA) bezogen und Antisense-RNA-Sonden durch Subklonierung der Nukleotide 279–1197 des codierenden Bereichs in die Bam HI-EcoRI-Stellen des Expressionsvektors PSPT18 (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) sowie anschließendes Zufallspriming mit einem DIG-RNA-Markierungskit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase erzeugt. Die Hybridisierung wurde im Hybridisierungspuffer (Dig Easy Hyb Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) 16 h bei 68°C durchgeführt. Jeder Blot wurde wie in der Standardvorschrift angegeben mit dem DIG Wash and Block Buffer-Set (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) gewaschen, blockiert und nachgewiesen und danach 15 min mit 1 ml CSPD ready-to-use (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) bei 37°C behandelt und 5 min am Lumiimager (Roche) entwickelt. Schließlich wurde jeder Blot gestrippt (50 Formamid, 5% SDS, 50 mM Tris/HCl pH 7,5; 80°C, 2 × 1 Stunde) und mit einer GAPDH-Antisens-RNA-Sonde als internen Standard rehybridisiert.
Beispiel 5: RNA-Extraktion und RT-PCR
RNA wurde aus unterschiedlichen Endothelzellinien (HUVEC, HCAEC, HMVEC-L, HPAEC) unter Verwendung des Reagens TRIzol (Hersteller, Lok.) hergestellt. Kurz gesagt wurden dabei für jede Endothelzellinie Zellen einer subkonfluenten Gewebekultur in einem 25-cm²-Kolben in 2,5 ml TRIzol gesammelt und Gesamt-RNAs gemäß der beiliegenden Vorschrift extrahiert. Die Reinheit der RNA-Präparation wurde durch Verifizierung der Abwesenheit von genomischer DNA überprüft. Eine Portion RNA, die ~5 μg entsprach, wurde zur Erzeugung von cDNA unter Verwendung der MMLV-reversen Transkriptase und des RT-PCR-Kits der Firma STRATAGENE verwendet. Die RT-PCR wurde in einem Volumen von 50 μl durchgeführt, und die RT-PCR-Bedingungen wurden auf 5 min bei 65°C, 15 min bei RT, 1 Stunde bei 37°C, 5 min bei 90°C und Abkühlen auf Eis eingestellt.
Bei den cDNA-Matrizen für die PCR-Reaktionen (35 Zyklen von jeweils 30 s bei 94°C, 3 min bei 68°C) handelte es sich um die reverstranskribierten Produkte von aus menschlichen Endothelzellinien (HUVEC, HCAEC, HMVEC-L, HPAEC) isolierten RNAs. Typischerweise wurden 1–5 μl reverstranskribierte cDNAs als Matrizen für die PCR-Reaktionen verwendet.
Beispiel 6: Materialquellen
1-Oleoyl-LPA, Sphingosin-1-phosphat (S1P), Dihydrosphingosin-1-phosphat (DHS1P), Lysophosphatidylcholin (LPC), Sphingosylphosphorylcholin (SPC) und fettsäurefreies RSA stammten von der Firma SIGMA (P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri, 63178). CHO-K1-Zellen wurden von der American Type culture collection (ATCC, Manassas, Virginia), Zellkulturmedien und Seren von GIBCO BRL (Gaithersburg, MD), der Ca-Fluoreszenzfarbstoff FLUO4 und Pluronsäure von der Firma Molecular Devices (Sunnyvale CA 94089-1136, USA), menschliche Northern-Blot-Membran von CLONTECH (1020 East Meadow Circle, Palo Alto, Kalifornien 94303-4230, USA), kommerziell erhältliche cDNAs (Herz, fötales Herz, linker Vorhof, linke Kammer, Niere, Hirn, Leber, Lunge, Aorta) von der Firma Invitrogen, Oligonukleotide von der Firma MWG-Biotech AG (Ebersberg, Deutschland), der RT-PCR-Kit von SIGMA, der GC-Melt-PCR-Kit von Clontech (Palo Alto, Kalifornien, USA), das Expressionsplasmid pcDNA3.1 für EDG8 und pCDNA1.1 für die Expression von G-Protein-α-Untereinheiten von Invitrogen (Carlsbad, Kalifornien 92008, USA), kompetente DH5α von GIBCO und MC 1063 von Invitrogen bezogen.
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Zhang H, Desai NN, Olivera A, Seki T, Brooker G und Spiegel S (1991), Sphingosine 1-phosphate, a novel lipid, involved in cellular proliferation. J Cell Biol 114:155–167.

Liste nicht standardgemäßer Abkürzungen:

S1P, Sphingosin-1-phosphat; LPA, Lysophosphatidinsäure; dHS1P, Dihydrosphingosin-1-phosphat; SPC, Sphingosylphosphorylcholin; LPC, Lysophosphatidylcholin; GPCR, G-Protein-gekoppelter Rezeptor; G-Protein, Guaninnukleotid bindendes Protein; [Ca²⁺]_i, intracelluläre Calciumkonzentration; RT-PCR, reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion; Bp, Basenpaar; ORF, offenes Leseraster; EST, exprimiertes Sequenz-Tag; FAF-BSA, fettsäurefreies Rinderserumalbumin; HUVEC, menschliche Nabelschnurvenenendothelzellen; HCAEC, menschliche Coronararterienendothelzellen; HMVEC-L, menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen aus der Lunge; HPAEC, menschliche Lungenarterienendothelzellen. Tabelle 2: SEQ ID NO 1: Nukleotidsequenz von menschlichem EDG8
Tabelle 3: SEQ ID NO 2: Aminosäuresequenz von menschlichem EDG8
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die an das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassende bzw. von einer Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 codierte Polypeptid EDG8 auf antagonistische Weise in bezug auf Sphingosin-1-phosphat (S1P), Lysophosphatidinsäure (LPA) und/oder Dihydrosphingosin-1-phosphat (DHS1P) bindet, wobei man in dem Verfahren c] eine das EDG8-Polypeptid exprimierende und mit Gα₁₆ oder Gα_qi5 cotransfizierte Zelle oder einen Teil einer derartigen Zelle mit S1P und/oder LPA und/oder DHS1P sowie einer Kandidatenverbindung in Kontakt bringt und d] die Fähigkeit der Verbindung, an das EDG8-Polypeptid auf antagonistische Weise in bezug auf S1P, LPA und/oder DHS1P zu binden, beurteilt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man ferner bestimmt, ob die Kandidatenverbindung ein durch Aktivierung des EDG8-Polypeptids erzeugtes Signal auf antagonistische Weise an der Oberfläche der Zelle herbeiführt, wobei ein die Bildung des Signals herbeiführender Kandidat als Antagonist identifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polynukleotidsequenz Teil eines Expressionsvektors ist.