KR20020097234A - Ｅｄｇ8 수용체, 이의 제법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새로이 동정된 EGD8 수용체, 당해 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 제법 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규 동정된 EGD8 수용체, 당해 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 제법 및 용도에 관한 것이다.
EDG(내피 분화 유전자) 계열의 신규 G-단백질 커플링 수용체를 동정하기 위한 노력을 통해, EDG 계열의 G-단백질 커플링 수용체의 신규 구성원인 사람 EDG8을 동정하였다. 전장(full-lenth) 클론을 분리하고 염색체 맵핑 및 조직 발현에 관한 연구를 수행하여 스핑고신 1-포스페이트에 대한 기능성 세포 수용체로서 동정하게 되었다. 이들 연구 모두를 고려한 데이타는 EDG8이 전적으로 말초 조직에서 발현되는, 스핑고신 1-포스페이트에 대한 5번째 수용체이고 내피 세포내에 존재하여 이들이 광범위한 조직 분배에 관여하고 있음을 확실히 입증하고 있다.
리소지질 포스페이트 매개체인 리소포스패티드산(LPA) 및 스핑고신 1-포스페이트(S1P)는 다양한 중요 생물학적 기능의 조절제로서 나날이 주목을 받아왔고[문헌참조: Moolenaar et al., 1997; Morris, 1999; Lynch and Im, 1999] 이의 생물학적 활성에 관한 정보가 계속적으로 증가 추세에 있다. LPA에 대한 생물학적 반응중에서 혈소판 응집(문헌참조: Jalink et al., 1994; Siess et al., 1999; Gueguenet al., 1999), 평활근 수축(문헌참조: Tokumura et al., 1980), 생체내 혈관활성 효과(문헌참조: Tokumura et al., 1995), 화학주성(문헌참조: Jalink et al., 1993), 접착 분자의 발현(문헌참조: Lee et al., 1998b; Rizza et al., 1999), 내피세포의 단단한 접합부에 대한 침투성의 증가(문헌참조: Schulze et al., 1997), 스트레스 섬유의 유도(문헌참조: Gohla et al., 1998) 및 기타(문헌참조: Moolenaar et al., 1997)가 있다. LPA의 세포 효과를 매개하는 생화학적 시그날 전달 반응은 포스포리파제의 자극, 세포내 Ca2+의 이동, 아데닐릴 사이클라제의 억제, 포스패티딜이노시톨 3-키나제의 활성화, Ras-Raf-MAP 키나제 연쇄 반응의 활성화 및 Rho-GTPase(문헌참조: Moolenaar et al., 1997)의 자극을 포함한다. 특히, S1P는 세포 증식, 세포 운동의 조절(문헌참조: Hla et al., 1999), 어팝토시스의 유도/억제(문헌참조: Hisano et al., 1999; Xia et al., 1999), 맥관형성(문헌참조: Lee et al., 1999), 종양 침투(문헌참조: Sadahira et al., 1992), 혈소판 활성화(문헌참조: Gueguen et al., 1999) 및 신경돌기 함몰(문헌참조: Postma et al., 1996)에 관여하고 있다. S1P에 의한 세포 시그날 전달은 PLCβ의 활성화 및 이에 따른 세포내 Ca2+방출(문헌참조: van Koppen et al., 1996; Meyer zu Heringdorf et al., 1997; Yatomi et al., 1997a; Noh et al., 1998; Ancellin and Hla, 1999), MAP-키나제의 활성화(문헌참조: Wu et al., 1995; Lee et al., 1996; An et al., 2000), 내부 방향으로 개질된 K+채널의 활성화(문헌참조: van Koppen et al., 1996; Bunemann et al., 1996) 및 아데닐릴 사이클라제의 억제 및/또는 활성화(문헌참조: Lee et al., 1996)을 포함한다. LPA 및 S1P 둘다는 EDG(내피 분화 유전자) 수용체로서 공지된 일련의 G-단백질 커플링 수용체(GPCR)을 통해 세포에 시그날을 전달하는 것으로 인지되고 있다. 현재, EDG 계열의 GPCR은 활성화 지질-리간드에 대한 선호도에 따라 2개의 주요 그룹으로 분류되는 7개의 사람 구성원(EDG 1 내지 7)을 포함한다: 우선적으로 S1P와 반응하는 EDG1, 3, 5 및 6(문헌참조: Yatomi et al., 1997b; Lee et al., 1998a,b; Ancellin and Hla, 1999; Yamazaki et al., 2000; Van Brocklyn et al., 2000), LPA와 우선적으로 반응하는 EDG2, 4 및 7(문헌참조: An et al., 1998; Im et al., 2000). EDG 수용체가 중복적인 양상으로 발현되고(문헌참조: Rizza et al., 1999; Lee et al., 1999), 이들이 다중으로 및 부분적으로 잔여 시그날 전달 경로를 활성화시키고(문헌참조: Lee et al., 1996; Ancellin and Hla, 1999; Kon et al., 1999; An et al., 2000), 이들의 활성화 리간드에 대한 특이성이 절대적이지 않고(문헌참조: Lee et al., 1998b) 각각의 서브타입에 대한 약리 작용을 분석하기 위한 특이적 길항제가 아직 유용하지 못하다는 점에서 의학 화학이 단지 미약하다는 사실때문에 특이적 생물학적 기능을 특정 수용체 서브타입으로 부여하기가 힘들다. 각각의 수용체 서브타입의 생물학적 역할에 보다 큰 실마리를 제공하는 중요한 단계는 인지질 매개체 S1P 및 LPA에 응답하는 완전한 세트의 수용체를 동정하는 것이다.
본 발명은 신규 동정된 EGD8 수용체, 당해 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 이의 제법 및 용도에 관한 것이다.
본 발명은 서열 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상응하는 단편과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
바람직하게, 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA이다. 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 서열 1에 포함되는 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타낸다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 2의 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화한다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 1의 대립인자이다. 바람직하게, 폴리뉴클레오타이드는 사람 EDG8과 동일한 필수 성질 및/또는 생물학적 기능을 갖는다. 하나의 특징적인 기능은 폴리뉴클레오타이드가 S1P 수용체를 암호화하고 이것이 S1P 및 또한 임의로 DMS 1P 또는 LPA와 같은 관련 인지질에 응답한다는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 EDG8의 발현을 위한 발현 시스템에 관한 것이다. EDG8 DNA 또는 RNA 분자는 서열 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖고 발현 시스템이 양립가능한 숙주 세포에 존재하는 경우, 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 생산할 수 있는 발현 시스템을 포함한다. 바람직하게 발현 시스템은 벡터이다. 본 발명은 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포를 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 생산하기에 충분한 조건하에서 배양하여 EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 세포의 표면에 발현된다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조되는 세포에 관한 것이다.
상기 방법은 바람직하게 배양물로부터 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 회수함을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적당한 배양 조건하에서 숙주 세포가 EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 생산하도록 숙주 세포를 발현 시스템으로 형질전환시키거나 형질감염시킴을 포함하는, EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 발현하는 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열 또는 서열 2의 일부 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 갖는 EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 서열 1에 의해 암호화된 폴리펩타이드 또는 서열 1과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 바람직하게, 당해 폴리펩타이드는 사람 EDG8과 거의 동일한 성질, 예를 들어, 동일한 생물학적 기능을 갖는다. 사람 EDG8의 하나의 특징적인 기능은 폴리펩타이드가 S1P 수용체이고 이것이 S1P와 임의로 DMS1P 또는 LPA와 같은 관련 인지질에 응답한다는 것이다.
추가로 본 발명은,
a) 피험자의 게놈중에 당해 EDG8 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열중의 돌연변이 존재 유무를 결정하는 단계 및/또는
b) 당해 피험자로부터 유래된 샘플중에 EDG8 폴리펩타이드의 존재 또는 양을 분석하는 단계를 포함하는, EDG8 폴리펩타이드의 발현 또는 활성과 관련된 질환을 진단하거나 질환에 대한 감수성을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은,
a) 발현 시스템을 포함하는 세포 또는 당해 세포의 일부를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및
b) 당해 세포에 결합하는 후보 화합물의 능력을 평가하는 단계를 포함하는, EDG8 폴리펩타이드와 결합하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 화합물을 동정하는 방법은 후보 화합물이 세포 표면에 EDG8 폴리펩타이드의 활성화에 의해 발생되는 시그날에 영향을 미치는지의 여부를 추가로 결정하는 방법을 포함하고, 이때, 시그날 발생에 영향을 미치는 후보 화합물이 효능제로서 동정된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 화합물을 동정하는 방법은 후보 화합물이 세포 표면에 EDG8 폴리펩타이드의 활성화에 의해 발생되는 시그날에 영향을 미치는지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하고 이때, 당해 시그날의 발생에 영향을미치는 후보 화합물이 길항제로서 동정된다.
본 발명은 또한 당해 방법에 의해 동정되는 효능제 또는 길항제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 특정 양태에서, 당해 방법은 세포를, 당해 EDG8 폴리펩타이드에 대해 공지된 효능제와 접촉시키고 당해 효능제에 의해 발생되는 시그날이 후보 화합물의 존재하에 감소되는지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하고 당해 시그날을 감소시키는 후보 화합물은 EDG8 폴리펩타이드의 길항제로서 동정된다. 공지된 효능제는 예를 들어, S1P, LPA 및/또는 DHS1P이다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 동정되는 길항제에 관한 것이다.
본 발명은 추가로,
a) EDG8의 효능제 또는 길항제인 화합물을 동정하는 단계,
b) 당해 화합물을 제조하는 단계 및
c) 임의로 화합물을 적합한 첨가제와 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 당해 방법에 의해 제조된 약제학적 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 활성 성분으로서, 예를 들어, 동정된 화합물, EDG8 폴리펩타이드 또는 EDG8을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 포함하는 약제에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 EDG8/S1P 시그날 전달과 관련된 질환, 예를 들어, 내피 기능부전과 관련된 질환(예를 들어, 아테롬성경화증, 쇼크, 긴장과도, 관상 증후군,암, 혈전용해 질환, 상처 치유 및 증가된 세포사를 수반하는 질환)을 예방하고/하거나 치료하는데 사용될 수 있는 약제에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 약제는 맥관형성의 조절 기능부전과 관련된 질환(예를 들어, 종양 성장, 류마티스 관절염 및 당뇨 망막증)의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 연구는 스핑고신 1-포스페이트의 5번째 기능성 수용체로서 신규 GPCR인 EDG8에 대한 클로닝, 염색체 맵핑, 조직 발현 및 기능 동정에 대해 보고한다.
EDG 계열의 신규 G-단백질 커플링 수용체를 동정하고자 하는 노력의 일환으로 사람 EDG1 내지 EDG7 서열 및 제노푸스 및 제브라다니오 기원의 추정된 EDG를 포함하여 현재 공지된 당해 수용체 계열의 18개 구성원을 정렬하여 데이타베이스 검색을 수행한다. 이들 서열의 다중 정렬은 CLUSTALW에 의해 수행되고 PSI-BLAST 검색에 사용되어 상이한 EMBL 섹션에서 대중에게 개방되어 있는 해독된 버젼의 사람 게놈 DNA 서열을 스캐닝한다. DNA를 단백질 서열로 해독하기 위해 2개의 각각의 종료 코돈내에서 각각의 단백질 파일을 만들고 50개 미만의 짧은 아미노산으로 이루어진 모든 단백질을 무시한다. 대다수의 GPCR이 스플라이싱되지 않음으로써 게놈 서열내에서 GPCR에 대한 검색은 신규 수용체 단백질에 대한 것이다. PSI-BLAST 검색을 수행하여 사람 EDG1 내지 EDG7 수용체 각각에 대한 다양한 cDNA 및 게놈 콘티그를 동정하고 사람 EDG5와 고도로 상동성(50% 상동성)인 추가의 게놈 hit를 EDG8로 명명한다. 신규 추정된 GPCR의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도 1A에 나타낸다.
수친화도(hydropathy) 분석(소수성 플롯은 나타내지 않음)은 GPCR에 공통된헵타헬릭스 구조인 것으로 추정되는 3개의 반복되는 세포외 및 세포내 루프를 갖는 7회 막통과 단백질임을 제안한다. EDG 수용체 계열의 분자학적 진화에 연루된 관계에 대한 실마리를 제공하기 위해, 인접 연결 방법(neighbor joining method)(GCG 소프트웨어)을 사용하여 성장 나무 필로그람을 작제한다(도 1B)(아미노산 서열 비교). 당해 필로유전학적 나무에 따라, 사람 EDG 계열은 2개의 특징적인 그룹으로 분류될 수 있다: EDG1, 3, 5 및 6을 포함하는 그룹 및 EDG2, 4 및 7을 포함하는 또 다른 그룹. 이들 2개의 그룹은 상이한 지질 리간드에 대한 이의 선호도에 따라 구분된다. EDG1, 3, 5 및 6은 우선적으로 스핑고신 1-포스페이트(S1P)에 의해 자극되고(문헌참조: Yatomi et al., 1997b; Lee et al., 1998a,b; Ancellin and Hla, 1999; Yamazaki et al., 2000; Van Brocklyn et al., 2000) EDG2, 4 및 7은 리소포스패티드산(LPA)에 의해 자극된다(문헌참조: Hecht et al., 1996; An et al., 1998; Im et al., 2000). 신규 동정된 EDG8은 rat nrg 1-단백질과 가장 유사한 상동성(86.8% 아미노산 상동성)을 나타내고(도 1B) 최근에 래트 PC12 세포 라이브러리로부터 EST-발현 프로파일링에 의해 GPCR이 클로닝되었고(Glickman et al., 1999) 이것은 아마도 사람 EDG8의 래트 동족체를 나타낸다. 그러나 글릭맨(Glickman)의 보고에서, 연구자들은 당해 수용체에 대한 활성화 리간드의 의문점을 해결하지 못하였다. EDG8과 공지된 스핑고신 1-포스페이트(S1P) 수용체인 EDG1, 3 및 5간의 고도의 유사성(48% 내지 51%)(도 1C)은 EDG8이 S1P에 대한 기능성 수용체일 수 있다는 가설을 입증하기 위한 실험을 유도하였다. S1P 수용체 활성에 대한 입증 시험에서, EDG8 cDNA는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로 순간적인 형질감염에 의해 도입되었다. CHO 세포는 이들이 1μM 이하의 농도에서 스핑고신 1-포스페이트에 대해서 최소 반응을 나타내지만 S1P 선호 수용체인 EDG1, 3 및 5로 형질감염시킨후 S1P에 응답함으로써 선택되었다(문헌참조: Okamoto et al., 1998, Kon et al., 1999). 기능성 수용체 활성을 시험하기 위해, [Ca2+]i의 이동을 3가지 이유때문에 모니터하였다: 1) S1P는 많은 세포 유형에서 Ca2+를 증가시키는 것으로 보고되었다(문헌참조: Ghosh et al., 1990; Zang et al., 1991; Durieux et al., 1993; Chao et al., 1994; Gosh et al., 1994; Mattie et al., 1994; Meyer zu Heringdorf et al., 1996; Okajima et al., 1996; van Koppen et al., 1996; Tornquist et al., 1997; Yatomi et al., 1997; Noh et al., 1998; An et al., 1999), 2) S1P에 대한 수용체로서 EDG1, 3, 5 및 6의 동정은 GPCR 매개 기작에 대한 분자학적 기초를 제공하고 수용체는 PTX-민감성 Gαi단백질 또는 PTX-비민감성 Gαq/11경로(문헌참조: Okamoto et al., 1998; Kon et al., 1999; Gonda et al., 1999)를 통해 세포내 C2+방출을 매개하는 것으로 공지되어 있다. 3) 현재 공지된 모든 S1P 응답 EDG 수용체(EDG6 제외)가 내피 세포에 존재하고(문헌참조: A. Niedernberg et al., submitted) 여기서, 세포내 Ca2+방출은 혈관 생물학에서 중요한 인자인 NO의 발생에 주요 경로이다. 따라서, 세포내 Ca2+이동에 관여하는 완전한 세트의 S1P 수용체의 동정이 내피 세포 시그날 전달에 있어서 각각의 서브타입의 역할을 규명하는데 도움이 될 수 있다.
도 2는 추정되는 S1P 수용체인 EDG8을 통해 S1P에 의해 매개되는 세포내 Ca2+농도의 측정을 도시한다. 비교하기 위해, [Ca2+]i를 이동시키는 것으로 보고된 S1P 수용체 EDG1, 3, 5 및 6이 포함된다. [Ca2+]i를 형광 플레이트 영상 판독기(FLIPR, Molecular Devices)를 사용한 실시간 측정값으로서 기록한다. 처음에, 공 벡터(empty vector) DNA로 형질감염된 CHO 세포를 상이한 농도의 S1P(10, 100, 1000nM)로 자극시킨다. 적용된 S1P 농도의 어떠한 것도 세포내 Ca2+의 상당한 증가를 유발시킬 수 없고 (도 2A) 이것은 S1P 수용체가 CHO 세포에서 발현되지 않음을 제시하거나 발현된다 하더라도 내인성 Gαq경로를 통해 시그날 전달할 수 없음을 제시한다. 이러한 쟁점을 밝히기 위해, Gi 커플링 수용체에 Gq경로를 자극하는 능력이 부여된 G 단백질 키메라 Gαqi5및 Gi- 및 Gs 커플링 수용체를 PLCβ에 연결시키고 이어서 세포내 Ca2+를 이동시키는 Gα16를 사용한다. S1P로 자극 즉시, Gqi5- 및 G16- 형질감염된 CHO 세포에서 [Ca2+]i가 상당히 증가하지 않았다(도 2A). 그러나, CHO-세포를 EDG1, 3 및 5 수용체를 암호화하는 cDNA로 순간적으로 형질감염시킴으로써 세포에 대한 S1P 응답을 부여한다. 이것은 EDG1, 3 및 5가 S1P에 대한 응답에서 [Ca2+]i를 이동시킴을 확인시켜준다(도 2B, C, D)(문헌참조: Kon et al., 1999). 대다수의 Gq 커플링 수용체에 대해 이미 공지되어 있는 바와 같이, Gαq의 동시 발현이 내인성 Gαq의 자극에 의해 유도된 Ca2+시그날과 비교하여 EDG1 및 EDG5-매개된 Ca2+반응을 증대시킨다. EDG3의 경우에, 추가로 외부로부터 첨가된 Gαq가 시그날 강도를 추가로 개선시키지 못하였다. 이들 결과는, EDG3 서브타입이 세포내 Ca2+를 가장 강하게 증대시킴을 보여준 콘(Kon et al)에 의해 보고된 사실과 일치한다. EDG6의 경우에, 야마자키(Yamazaki et al)(2000)는 S1P로 [Ca2+]i의 이동을 유도하였지만 본 발명자들은 임의의 동시 형질감염된 G-단백질 α 서브유니트의 부재하에 기본 수위 이상으로 Ca2+가 상당히 증가함을 검출하는데 실패하였다(도 2E). 이러한 모순되는 이유는 사용된 세포의 상이함(본 연구에서는 CHO 세포이고 야마자키의 연구에서는 K562 세포이다)으로 인한 것일 수 있는데 이들이 백일해 독소(PTX)-민감성 Ca2+반응을 보고한 바와 같이 Gi-유형 G-단백질이 관여하고 있음을 지적한다. 이 경우에, Ca2+시그날은 활성화된 Gαiβν 이종삼량체로부터 방출된 βν에 의해 유발된다. Gαi유도된 Ca2+시그날은 실질적으로 Gq연결된 수용체에 의해 유도된 Ca2+시그날과 비교하여 이의 강도가 보다 적은 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Kostenis et al., 1997). 당해 [Ca2+]i농도의 검출은 FLIPR 시스템의 민감성을 초과하는 것일 수 있다. EDG8은 S1P(10, 100 및 1000nM)로 자극되는 경우 [Ca2+]i를 방출시키지 않았지만(도 2F) 상이한 기능성 부류 기원의 GPCR을 Gq PLCβ 경로, 또는 Gi 연결 수용체에 Gq를 자극시킬 수 있는 능력을 부여하는 Gαqi5에 커플링시키는 것으로 공지된 Gα16인 G-단백질 α서브유니트로 동시 형질감염시키는 즉시 Ca2+를 이동시키는 능력을 획득하였다(문헌참조: Conklin et al., 1993). 이들 결과는 EDG8이 S1P에 대한 기능성 수용체이고 EDG8 유도된 Ca2+반응이 아마도 Gi 단백질의 βν 서브유니트에 의한 포스포리파제 Cβ2의 활성화를 통한 비-Gq 경로에 의한 것임을 보여준다. 추가로, 이들 결과는 S1P-우선 EDG-수용체들이 Gq 및 Gi 경로에 차등적으로 커플링된다는 추가의 증거를 제공한다. EDG3은 가장 강력한 Ca2+이동 수용체이고 Gαq의 과발현은 Ca2+시그날 전달을 추가로 개선시키지 않는다. EDG1 및 EDG5는 중간정도의 Ca2+증가를 유도하고 이것은 Gαq또는 키메릭 Gαqi5단백질의 동시 형질감염에 의해 상당히 개선될 수 있다. EDG8 매개 Ca2+반응은 Gαqi5또는 Gα16의 동시 형질감염을 요구한다. EDG8 수용체가 또한 관련 리소인지질 매개체와 반응하는지의 여부를 조사하기 위해, 본 발명자는 EDG8 수용체 및 G-단백질 α 서브유니트 Gα16및 Gαqi5로 순간적으로 형질감염된 CHO 세포에서 세포내 Ca2+를 증가시키는 리소포스패티드산(LPA), 디하이드로스핑고신 1-포스페이트(DHS1P), 스핑고실포스포릴콜린(SPC) 및 리소포스패티딜콜린(LPC)의 능력을 조사하였다(도 3). EDG8의 가장 강력한 활성화제인 S1P 뿐만 아니라 LPA 및 DHS1P는 100 및 1000nM의 농도에서 [Ca2+]i를 증가시킨다. SPC 및 LPC는 각각 1μM 농도 이하에서 어떠한 상당한 반응을 발생시키지 못한다. 이들 데이타는 S1P에 대해 높은 친화성 수용체이고 LPA에 대해서는 낮은 친화성 수용체인 EDG1에 대해 보고된 바와 같이 EDG8이 S1P 선호 수용체일 뿐만 아니라 DHS1P 또는 LPA와 같은 관련 인지질에 응답한다는 것을 보여준다(문헌참조: Lee et al., 1998b). 따라서, EDG8 수용체는 S1P, 및 DMS1P 또는 LPA와 같은 관련 인지질에 응답하는 특징적인 기능을 갖는다. S1P 및 또 다른 관련 인지질에 대한 반응은 예를 들어, 실시예 3에서 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 각각의 Gα를 포함하는 세포는 실시예 2에 기술된 바와 같이 수득될 수 있다.
이어서, 사람 조직내 EDG8 유전자의 발현 양상은 노던 블롯 분석에 의해 조사된다(도 4). EDG8 RNA에 대해 양성인 조직은 골 근육, 심장 및 신장이고 간 및 태반에서는 RNA가 덜 풍부하며 뇌, 흉선, 폐 및 말초 혈액 백혈구에서는 어떠한 시그날도 검출되지 않는다. 모든 조직에서, DIG 표지된 EDG8 안티센스 RNA 프로브로하이브리드화시킨 후에 5.5kb의 단 하나의 RNA 전사체가 관찰된다. EDG8은 아미노산 상동성이 86.8%인 래트 nrg 1-GPCR(문헌참조: Glickman et al., 1999)과 가장 높은 유사성을 나타내는데 이것은 래트 nrg 1 단백질의 사람 동족체일 수 있음을 제안한다. 그러나, 사람 EDG8의 발현 양상은 주로 뇌에서만 거의 발견되는 래트 nrg 1-수용체와는 상당히 상이하다(문헌참조: Glickman et al., 1999). 이러한 발견은 EDG8이 사람 동족체이라기 보다는 nrg 1과는 밀접하게 관련되어 있지만 전반적으로 상이한 수용체일 수 있음을 제안한다. 그럼에도 불구하고 EDG8 및 nrg1이 전반적으로 상이한 종 의존성 발현 양상을 갖는 동족체일 가능성을 배제하지는 않는다.
EDG 계열의 GPCR의 첫번째 구성원으로서 EDG1은 본래 포르볼-미리스틱-아세테이트 처리된 분화하는 사람 내피 세포 기원의 내피 분화 유전자로서 클로닝되었고(문헌참조: Hla and Maciag, 1990) 이어서 비조절 유전자로서 유체 전단 응력에 노출된 사람 제대 정맥 내피 세포 라이브러리부터 클로닝되었는데 이를 통해 EDG 수용체가 내피세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 추정하는 것이 합당하다. 따라서, 여러 사람 내피 세포주내 EDG8 전사체의 존재가 분석되었다. 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), 사람 관상 동맥 내피 세포(HCAEC), 사람 폐의 미세혈관 내피 세포(HMVEC-L) 및 사람 폐 동맥 내피 세포(HPAEC)를 RT-PCR로 분석하여 시험된 모든 세포주에서 EDG8이 발현되는 것으로 밝혀졌다(도 5A). 도 5B에서, EDG8 특정 프라이머가 실질적으로 유일하게 EDG8의 서열을 증폭시키지만 관련 EDG1 내지 EDG7의 서열 어떠한 것도 증폭시키지 않는 것으로 나타났다. 이들 발견은 상이한 말초 기관내에 EDG8이 존재하는 것은 내피 세포에 이들이 편재되어 있기때문일 수 있음을 제안한다. 그러나 EDG8 전사체가 내피 세포이외의 세포 유형에 존재할 수 있음을 배제하지는 않는다. HUVEC 및 여러 다른 내피 세포주에서 EDG1, 3 및 5 뿐만 아니라 EDG8의 발현(문헌참조: Rizza et al., 1999)은 내피 세포 시그날 전달에 대한 S1P 효과에 관한 모든 보고서를 미루어 볼때 흥미롭다. 문헌[참조: Hisano et al. (1999)]은 S1P가 성장 인자의 고갈에 의해 유도되는 어팝토시스로부터 HUVEC을 보호하고 HUVEC DNA 합성을 자극하는 것으로 보고하였다. 연구자들은 내피 세포와 혈소판간의 세포-세포 상호작용에 대한 모델을 유추하였지만 어팝토시스로부터 HUVEC을 보호하는데 관여하는 S1P 수용체를 동정할 수 없었다. 문헌(참조: Rizza et al., 1999)은 S1P가 사람 대동맥 내피 세포에서 세포 접착 분자의 발현을 유도한다는 점에서, 내피 세포 백혈구 상호작용에 관여하여 단핵구 및 호중구가 부착할 수 있도록 한다는 것을 보고하였다. 이들 효과가 백일해 독소에 의해 차단되는 것으로 미루어 Gi 커플링 S1P 수용체가 관여함을 암시한다. 그러나, 관련 S1P 수용체 서브타입은 동정될 수 없었고 EDG8 수용체는 당해 연구시에 포함되지 않았다. 각각의 세포주에서 모든 EDG 수용체의 발현 프로필 및 EDG 수용체 서브타입 특이적 화합물의 용도가 내피 세포 시그날 전달 기작에 있어서 각각의 S1P 수용체의 역할을 결정하는데 반드시 필요하다.
최종적으로, 게놈 서열에서 EDG 수용체를 맵핑하여 당해 계열의 4개의 유전자의 염색체 위치를 밝혀낼 수 있었다(표 1). 흥미롭게도, EDG8을 포함한 4개의 EDG 수용체는 염색체 19번에 위치한다. 추가로, 게놈 서열을 통해 유전자의 구조를 밝힐 수 있었다. S1P 선호 수용체 EDG1, 3, 5 및 8은 TMV1의 개방 판독 프레임내 인트론을 포함하는 LPA 선호 서브타입 2, 4 및 7과는 반대로 인트론이 없다. 이들 데이타는 리소인지질 수용체의 2개의 아부류가, 활성화 리간드 및 상동성 정도 뿐만 아니라 이의 게놈 구조에 의해 추가로 구분될 수 있음을 제안한다. 신규 잠재적인 EDG/LPA 수용체 계열 구성원의 게놈 구조는 활성화 지질 리간드의 특성을 예상할 수 있도록 도와줄 수 있다.
결론적으로, EDG 계열의 G-단백질 커플링 수용체의 신규 구성원인 사람 EDG8을 분리하였다. 당해 수용체는 스핑고신 1-포스페이트에 대한 세포 수용체로서 작용한다. EDG8은 주로 골근육, 심장 및 신장과 같은 말초 조직 및 여러 사람 내피 세포주에서 주로 검출될 수 있다. 내피 세포내에서의 발현은 당해 수용체가 조직에 광범위하게 분포할 수 있음을 암시한다. 리소인지질에 대한 8개 이상의 EDG 수용체의 존재는 수용체 서브타입 특이적 효능제 및 길항제가 리소인지질 및 이의 각각의 수용체의 생물학적 이해를 개선하는데 필요할 수 있음을 제안한다.
도 1A: 사람 EDG8의 뉴클레오타이드 및 추정 아미노산 서열. 추정 아미노산 서열은 왼편에 나타낸 뉴클레오타이드 위치와 함께 뉴클레오타이드 서열 하단에 나타낸다.
도 1B: EDG-계열 수용체의 필로유전자 나무. 도시된 필로유전자 나무는 GCG 프로그램으로 수행되는 인접 연결 방법으로 유도된다.
도 1C: 사람 EDG8과 또 다른 EDG 계열 구성원간의 아미노산 서열 정렬. EDG8의 아미노산 서열은 EDG1 내지 EDG7 폴리펩타이드(EDG1: 승인번호 M 31210, EDG2: 승인번호 U 80811, EDG3: 승인번호 X 83864, EDG4: 승인번호 AF 011466, EDG5 승인번호 AF 034780, EDG6: AJ 000479, EDG7: 승인번호 AF 127138)와 비교된다. 추정되는 7개의 막통과 도메인의 근접 경계선을 박스로 나타낸다. 정렬을 최적화하기 위해 공백을 도입한다.
도 2A-F: 대조구로서 공 벡터 DNA 또는 지적된 G-단백질 α서브유니트로 동시 형질감염된 CHO 세포에서 EDG1, 3, 5, 6 및 8 수용체에 의해 매개되는 S1P(10, 100 및 1000nM)에 의한 Ca2+의 세포내 이동. A: 벡터 DNA 단독 또는 G 단백질 α서브유니트 Gq, G16 및 Gqi5로 형질감염된 CHO 세포에서 S1P 유도된 Ca2+반응: 지적된 EDG 수용체 서브타입으로 형질감염된 CHO 세포에서 S1P 유도된 Ca2+반응. 세포내 Ca2+의 효능제 매개된 변화는 실험 과정에서 기술된 바와 같은 Ca2+민감성 염료 FLU04를 사용하는 FLIPR로 측정한다. FLU04로 로딩된 형질감염된 세포의 형광도를 지적된 농도로 적용되는 S1P를 첨가하기 전후에 기록한다. 데이타를 1회 실험에서 4회 측정값의 평균치로서 나타낸다. 추가의 실험은 유사한 결과를 나타낸다.
도 3: 세포내 Ca2+의 EDG8 매개 증가에 대한 S1P, LPA 및 관련 리소인지질 매개체의 효과. CHO-세포를 EDG8 및 G 단백질 α서브유니트 Gqi5(상단) 및 G16(하단)으로 동시형질감염시키고 [Ca2+]i의 증가는 실험 과정에서 기술된 바와 같이 FLIPR로 기록한다. 상이한 지질을 각각 10, 100 및 1000nM의 농도로 적용한다. 데이타는 1회 실험의 4회 반복 측정값의 평균치이다. 추가로 2회 실험은 유사한 결과를 나타낸다.
도 4: 사람 조직내에서 EDG8의 노던 블롯 분석. 다양한 사람 조직 기원의 폴리(A)+ RNA(1㎍)(사람 다중 조직 노던 블롯, CLONTECH)을 나일론 막상에서 사람 EDG8(상단) 및 β-액틴(하단)에 특이적인 프로브와 하이브리드화한다. RNA 각각의 기원은 상부에 나타내고 표준 마커의 분자량(킬로베이스(kb))은 왼편에 나타낸다.
도 5A: 상이한 사람 내피 세포주(HUVEC: 사람 제대 정맥 내피 세포; HCAEC: 사람 관상 동맥 내피 세포; HMVEC-L: 사람 폐의 미세혈관 내피 세포; HPAEC: 사람 폐 동맥 내피 세포)에서 EDG8의 역 트랜스크립타제 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 분석. EDG8 특이적 전사체를 모든 내피 세포주에서 검출한다. GC 용융 키트(실험 과정에서 기술된 바와 같음)를 사용한 35회 증폭후 PCR 생성물에 대한 아가로스 겔 전기영동을 나타낸다. EDG8 특이적 프라이머를 사용하여 증폭시켜 화살표로 지적된 바와 같이 522bp의 EDG8 단편을 수득한다. 양성 대조구에 대한 주형으로서 EDG8 플라스미드를 사용하고 음성 대조구로서 플라스미드 DNA 대신에 물을 사용한다.
도 5B: EDG8 서열 증폭에 특이적인 EDG8 프라이머의 PCR 분석. EDG8 서열에 특이적인 프라이머가, 주형으로서 각각의 플라스미드를 사용하여 관련 EDG1 내지EDG7 서열을 강하게 증폭시키는지를 조사한다. GC-용융 키트(실험과정에서 기술된 바와 같음)를 사용한 35회 증폭후 PCR 생성물에 대한 아가로스 겔 전기영동을 나타낸다. EDG8 특이적 522 bp 밴드가 EDG8이 주형으로서 사용되는 경우에만 나타난다. H2O를 음성 대조구로서 플라스미드 DNA 대신에 사용한다.
도 6: 실시예 3에 따라 실험을 수행한다. 지질 대신에 지질 라이브러리를 사용한다.
도 6A + B: 래트 EDG8(rEDG8) 및 qi5를 사용한 라이브러리 작성.
도 6A: qi5 배경.
도 6B: rEDG8로 측정.
도 6C: 형광 변화 계수.
도 7: 실험을 실시예 3에 따라 수행한다. 지질 대신 지질 라이브러리를 사용한다.
도 7A + B: 사람 EDG8(hEDG8) 및 qi5를 사용한 라이브러리 작성
도 7A: q15 배경.
도 7B: hEDG8로 측정.
도 7C: 형광 변화 계수.
도 8: 래트 및 사람 EDG8에 대한 S1P 활성화의 길항작용
래트 EDG8 및 Gαqi5(A)를 발현하는 순간적으로 형질감염된 CHO 세포 및 사람 EDG8 및 Gαqi5(B)를 발현하는 HEK 293 세포를 시험 화합물, 즉, 류코트리엔 B4 0.1μM, 2-DHLA-PAF(1-O-헥사데실-2-O-디호모-γ-리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린) 1μM, C2디하이드로세라미드 1μM, 15(S) HEDE(15(S)-하이드록시에이코사-11Z, 13E-디에노산) 0.1μM, PAF C16(1-O-헥사데실-2-O-아세틸-sn-글리세로-3-포스포릴콜린) 1μM, 16,16 디메틸 PGF2(16,16-디메틸프로스타글란딘 E2) 12 1μM, (R)-HETE(12(R)-하이드록시에이코사-5Z, 8Z, 10E, 14Z-테트라에니옥산) 0.1μM, 8-에피-PGF2α(8에피-프로스타글란딘 F2α) 1μM 또는 류코톡신 A((±)9,10-EODE)로 3분동안 항온처리하거나 용매 완충액으로 3분동안 항온처리하고 이어서 S1P(스핑고신 1-포스페이트) 1μM을 투여한다. 용매 완충액으로 전처리되고 이어서 S1P 1μM로 자극된 세포의 피크 형광 계수를 100%로 설정한다. 형광 변화 계수는 실험과정에서 상세하게 기술된 바와 같이 FLIPR로 기록한다. 데이타는 2 및 3회 독립 실험에 대한 평균치 ± SE이다.
도 9: 사람 EDG8 및 Gαqi5(A), 및 래트 EDG8 및 Gαqi5(B)로 순간적으로 동시 형질감염된 세포에서 수라민 및 NF023(8,8'-(카보닐비스(이미노-3,1-페닐렌))비스-(1,3,5-나프탈렌트리설폰산))에 의한 S1P 매개 세포내 칼슘 방출의 억제. 형질감염된 세포를 먼저 지적된 농도의 억제제 또는 용매 완충액으로 3분동안 처리한다(NF023 및 수라민은 전처리 기간동안에 [Ca2+]i이동에 대해 어떠한 효과를 나타내지 않는다). 이어서 세포를 방법 섹션에서 기술된 바와 같이 S1P 1μM로 자극하고 세포내 [Ca2+]i를 FLIPR로 측정한다. 피크 형광 계수를 표준화하고 Gαqi5형질감염된 세포의 기본 반응을 공제한다. 억제제의 부재하의 S1P 매개 칼슘 방출을 100%로 설정한다. 데이타는 4 내지 7회 독립 실험의 평균치 ± SE이다.
실시예 1: 사람 EDG8 수용체의 분자 클로닝
추정 사람 EDG5 서열은 인트론이 없기때문에, 본 발명자는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 사람 게놈 DNA(CLONTECH, Palo Alto, CA, 94303-4230)로부터 수용체를 클로닝하였다. EDG8 서열을 증폭시키기 위해 설정된 PCR 조건은 GC-용융 키트(CLONTECH, Palo Alto, CA)를 사용한 94℃, 1분, 이어서 94℃, 30초, 68℃, 3분 35회이다. EDG8 서열을 증폭시키기 위해 고안된 프라이머는 각각 정배향 HindIII 부위 및 역배향 EcoRI 부위를 포함한다. 1197bp의 PCR 생성물을 pCDNA3.1(+) 포유동물 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, California)에 클로닝하고 양방향으로 서열 분석한다.
실시예 2: 세포 배양 및 형질감염
CHO-K1 세포를 10% 태아 소 혈청이 보충된 ISCOVE 기본 배지에서 37℃, 습한 5% CO2배양기에서 성장시킨다. 형질감염을 위해, 2 x 105세포를 35mm 디쉬에 분주한다. 약 24시간 후에, 세포를, 리포펙타민 형질감염 시약 및 제공된 프로토콜(GIBCO)를 사용하여 50 내지 80% 컨플루언시에서 지적된 수용체 및 G-단백질 작제물(각각 플라스미드 DNA 1㎍)로 순간적으로 형질감염시킨다. 형질감염시킨지 18 내지 24시간 후에 세포를 웰 당 50,000세포의 밀도로 96웰 플레이트에 분주하고 기능적 FLIPR 분석에 사용될때까지 18 내지 24시간동안 추가로 배양한다. Gα16에 대한 cDNA를 RT-PCR에 의해 TF1 세포로부터 클로닝하고 pCDNA1.1 포유동물 발현 벡터(Invitrogen)에 연결한다. 쥐 야생형 Gαq를 RT-PCR에 의해 세포로부터 클로닝하고 pCDNA1.1의 BamHI-Nsil 부위에 삽입한다. Gαq의 마지막 5개의 아미노산이 상응하는 Gαi서열로 대체된 C-말단 개질된 Gαqi5서브유니트를 작제하기 위해, 175bp BgIII-Nsil 단편을 2개의 단편 연결에서 목적하는 코돈이 변화된 합성DNA 단편으로 대체한다. 모든 PCR 유도 서열의 정확도는 양 방향의 서열 분석으로 확인한다.
실시예 3: 형광측정 영상 플레이트 판독기(FLIPR) 분석
형질감염시킨지 24시간후에, 세포를 웰당 50,000 세포의 밀도로 암벽 미세 플레이트(Corning)에 분주한다. 18 내지 24시간 후에, 세포에 20mM 헤페스, 2.5mM 프로베네시드, 4μM 형광 칼슘 지시약 염료 Fluo4(Molecular Probes) 및 1% 태아 소 혈청을 포함하는 HBSS 95㎕를 1시간(37℃, 5% CO2)동안 로딩한다. 세포를 세포 세척기에서 20mM 헤페스 및 2.5mM 프로베네시드를 포함하는 HBSS로 3회 세척한다. 최종 세척후에, 용액을 흡인하여 잔여 용적이 96웰당 100㎕가 되게한다. 지질 리간드를 2mM 스톡 용액으로서 DMSO중에 용해시키고(경우에 따라 초음파로 처리한다) 20mM 헤페스, 2.5mM 프로베네시드 및 0.4mg/ml의 무지방산 소 혈청 알부민을 포함하는 HBSS를 사용하여 1:100 이상으로 희석시킨다. 지질을 분석하기 전에 96웰 플레이트상으로 2 X 용액으로서 첨가한다. 형광측정 영상 플레이트 판독기(FLIPR, Molecular Devices)를 프로그램화하여 리간드 미세플레이트의 각 웰로부터 100㎕가 세포 플레이트의 각 웰로 이동하도록 하고 처음 1분동안 1초 간격으로 마지막 2분동안 3초 간격으로 총 3분동안 형광도를 기록한다. 18초 내지 37초에서의 총 형광 계수를 사용하여 효능제 활성을 결정한다. 장치 소프트웨어를 형광 판독에 대해 표준화시켜 시간 제로에서 동일한 초기 판독이 동등해지도록 한다.
실시예 4: 노던 블롯 분석
사람 다중 조직 노던 블롯을 CLONTECH(Palo Alto, CA, 94303-4230, USA)으로부터 구입하고 암호 영역의 뉴클레오타이드 279 내지 1197을 발현 벡터 PSPT18(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)의 Bam HI-Eco RI 부위로 서브클로닝하고 이어서 T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 DIG-RNA 라벨링 키트로 무작위 프라이밍하여 안티센스 RNA 프로브를 작제한다. 하이브리드화 완충액(Dig Easy Hyb Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)중에서 16시간동안 68℃에서 하이브리드화를 수행한다. 각각의 블롯을 DIG 세척 및 차단 완충액 세트(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하는 표준 프로토콜에 지적된 바와 같이 세척하고, 차단하고 검출하고 15분동안 37℃에서 준비된 1ml CSPD로 처리하고 5분동안 발광화상기(Lumiimager)(Roche)상에 현상시킨다. 최종적으로, 각각의 블롯을 제거(50% 포름아미드, 5% SDS, 50mM Tris/HCl pH 7.5; 80℃, 2 x 1시간)하고 내부 표준으로서 GAPDH 안티센스 RNA 프로브와 재하이브리드화시킨다.
실시예 5: RNA 추출 및 RT-PCR
TRIzol 시약(Hersteller, Lok)를 사용하여 상이한 내피 세포주(HUVEC, HCAEC, HMVEC-L, HPAEC)로부터 RNA를 제조한다. 간략하게, 각각의 내피 세포주에 대한 서브컨플루언트 25cm2의 조직 배양 플라스크의 세포를 2.5ml TRIzol에 수거하고 총 RNA를 제공된 프로토콜에 따라 추출한다. RNA 제제의 순도는 게놈 DNA의 부재를 확인하여 조사한다. ∼5㎍에 상응하는 RNA 분취액을 사용하여 MMLV 역 트랜스크립타제 및 STRATAGENE으로부터 구입한 RT-PCR 키트에 의해 cDNA를 합성한다.RT-PCR을 50㎕ 용적에서 수행하고 RT-PCR 조건을 5분동안 65℃, 실온에서 15분, 37℃에서 1시간, 90℃에서 5분, 빙상에서 냉각으로 설정한다. PCR 반응(30초동안 94℃, 3분동안 68℃ 35회)을 위한 cDNA 주형은 사람 내피 세포주(HUVEC, HCAEC, HMVEC-L, HPAEC)로부터 분리된 RNA의 역전사된 생성물이다. 전형적으로, 역전사된 cDNA 1 내지 5㎕를 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용한다.
실시예 6: 재료 공급
1-올레일-LPA, 스핑고신 1-포스페이트(S1P), 디하이드로스핑고신 1-포스페이트(DHS1P), 리소포스패티딜콜린(LPC), 스핑고실포스포릴콜린(SPC) 및 무지방산 BSA는 SIGMA(P.O.Box 14508, St. Louis, Missouri63178)로부터 구입하였다. CHO-K1 세포는 아메리칸 컬쳐 콜렉션(ATCC, Manassas, Virginia)로부터 구입하였고 세포 배양 배지 및 혈청은 GIBCO BRL(Gaithersburg, MD)로부터 구입하였고 Ca 형광 염료 FLUO4 및 플루론산은 Molecular devices(Sunnyvale CA 94089-1136, USA)로부터 구입하였고 사람 노던 블롯 막은 CLONTECH(1020 East Meadow Circle, Palo Alto, California 94303-4230, USA)로부터 구입하였고 시판되는 cDNA(심장, 태아 심장, 좌심방, 좌심실, 신장, 뇌, 간, 폐, 대동맥)은 Invitrogen으로부터 구입하였고 올리고뉴클레오타이드는 MWG-Biotech AG(Ebersberg, Germany)로부터 구입하였고 RT-PCR 키트는 SIGMA로부터 구입하였고 GC-용융 PCR 키트는 Clontech(Palo Alto, CA)로부터 구입하였고 EDG8에 대한 발현 플라스미드 pcDNA3.1 및 G-단백질 α 서브유니트 발현용 pCDNA1.1은 Invitrogen(Carlsbad, CA 92008)으로부터 구입하였고 컴피턴트 DH5α는 GIBCO에서 구입하였고 MC 1063은 Invitrogen으로부터 구입하였다.
표준화되지 않은 약어의 목록
S1P, 스핑고신 1-포스페이트; LPA, 리소포스패티드산; dHS1P, 디하이드로스핑고신 1-포스페이트; SPC, 스핑고실포스포릴콜린; LPC, 리소포스패티딜콜린; GPCR, G-단백질 커플링 수용체; G-단백질, 구아닌 뉴클레오타이드-결합 단백질; [Ca2+]i, 세포내 칼슘 농도; RT-PCR, 역 전사 폴리머라제 연쇄 반응; bp, 염기쌍; ORF, 개방 판독 프레임; EST, 발현된 서열 태그; FAF-BSA, 무지방산 소 혈청 알부민; HUVEC, 사람 제대 정맥 세포; HCAEC, 사람 관상 동맥 내피 세포; HMVEC-L, 사람 폐의 미세혈관 내피 세포; HPAEC, 사람 폐 동맥 내피 세포.
Claims (30)
- 서열 2의 폴리펩타이드 또는 상응하는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, DNA 또는 RNA인 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 1에 포함된 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상 상동성인 폴리뉴클레오타이드.
- 제3항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 1에 포함되는 폴리뉴클레오타이드.
- 서열 1의 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암호화 뉴클레오타이드 서열이 서열 2의 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, EDG8과 거의 동일한 생물학적 기능을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
- 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 생산할 수 있고 양립 가능한 숙주 세포에 존재하는 발현 시스템을 포함하는, 서열 2의 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 EDG8 DNA 또는 RNA 분자.
- 제8항에 기술된 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포.
- EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 생산하기에 충분한 조건하에서 제9항에 따른 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 당해 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 생산하는 방법.
- 제10항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 단편이 세포 표면에 발현되는 방법.
- 제11항에 따른 방법에 의해 제조되는 세포.
- 제10항에 있어서, 배양물로부터 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 적당한 배양 조건하에서, 숙주 세포가 EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편을생산할 수 있도록 숙주 세포를 제8항에 따른 발현 시스템으로 형질전환시키거나 형질감염시킴을 포함하는, EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 생산하는 세포를 제조하는 방법.
- 서열 2에 포함되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편.
- 제15항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제13항의 방법에 의해 제조된 EDG8 폴리펩타이드 또는 이의 단편.
- a) 환자의 게놈중에 EDG8 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열중 돌연변이의 발생 여부를 결정하는 단계 및/또는b) 환자로부터 유래하는 샘플중에 EDG8 폴리펩타이드의 발현 또는 발현양을 분석하는 단계를 포함하는, EDG8 폴리펩타이드의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 당해 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법.
- a) 제12항에 따른 세포 또는 이의 일부를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및b) 후보 화합물이 당해 세포에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함하여,EDG8 폴리펩타이드와 결합하는 화합물을 동정하는 방법.
- 제19항에 있어서, 후보 화합물이 세포 표면에서 EDG8 폴리펩타이드의 활성화에 의해 발생되는 시그날에 영향을 미치는지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 동정 방법으로서, 상기 시그날의 생성에 영향을 미치는 후보 화합물이 효능제로서 동정됨을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 후보 화합물이 세포 표면에서 EDG8 폴리펩타이드의 활성화에 의해 발생되는 시그날에 영향을 미치는지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 동정 방법으로서, 상기 시그날 생성에 영향을 미치는 후보 화합물이 길항제로서 동정됨을 특징으로 하는 방법.
- 제20항의 방법에 의해 동정된 효능제.
- 제21항의 방법에 의해 동정된 길항제.
- 제19항에 있어서, 세포와 EDG8 폴리펩타이드에 대해 공지된 효능제를 접촉시키는 단계 및당해 효능제에 의해 발생된 시그날이 후보 화합물의 존재하에 감소되는지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 동정 방법으로서, 시그날의 감소에 영향을 미치는 후보 화합물이 EDG8 폴리펩타이드의 길항제로서 동정됨을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 공지된 효능제가 S1P, LPA 및/또는 DHS1P인 방법.
- 제24항 또는 제25항에 따른 방법에 의해 동정된 길항제.
- a) EDG8의 효능제 또는 길항제인 화합물을 동정하는 단계,b) 화합물을 제조하는 단계 및c) 경우에 따라 화합물을 적합한 첨가제와 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 제조방법.
- 제27항에 따른 방법에 의해 제조된 약제학적 조성물.
- EDG8 폴리펩타이드 또는 EDG8의 기능을 갖는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
- EDG8를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 EDG8의 기능을 갖는 펩타이드를 암호화하는 당해 폴리뉴클레오타이드의 일부를 포함하는 약제학적 조성물.
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