HUT61592A - Process for producing deoxyribonucleic acid molecules and vectors for expressing zymogen forms of human c protein - Google Patents

Process for producing deoxyribonucleic acid molecules and vectors for expressing zymogen forms of human c protein Download PDF

Info

Publication number
HUT61592A
HUT61592A HU91605A HU60591A HUT61592A HU T61592 A HUT61592 A HU T61592A HU 91605 A HU91605 A HU 91605A HU 60591 A HU60591 A HU 60591A HU T61592 A HUT61592 A HU T61592A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
gly
ser
glu
asp
Prior art date
Application number
HU91605A
Other languages
English (en)
Other versions
HU910605D0 (en
Inventor
Bruce Edward Gerlitz
Brian William Grinnel
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HU910605D0 publication Critical patent/HU910605D0/hu
Publication of HUT61592A publication Critical patent/HUT61592A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya olyan uj dezoxi-ribonukleinsavak és rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok, amelyek a humán C protein uj zimogén alakjait határozzák meg. Ezeket a zimogéneket in vivő egyedül trombinnal aktiválhatjuk klinikailag jelentős mértékben, és sokkal inkább érzékenyebbek a trombin/trombomodulin aktíváéióra mint a natív C zimogén protein. A találmány szerinti expressziós vektorokkal egyszerűen és hatékonyan fejezhetjük ki a humán C protein zimogénjeit rekombináns gazdasejtekben. A natív humán C protein zimogén jei nagy koncentrációjú trombinnal, illetve trombinnal és trombomodulinnal való kezelést igényelnek, esetleg más, drágán beszerezhető enzimes emésztést aktivációjukhoz. A találmány szerinti eljárást alkalmazva olyan humán C protein zimogén alakokat állíthatunk elő, amelyek a trombin számára sokkal jobb szubsztrátokat szolgáltatnak, és ezért kisebb koncentrációjú trombinnal, trombinnal és trombomodulinnal, vagy más enzimekkel aktiválhatok. A legfontosabb tény az, hogy a találmány szerinti humán C protein zimogén alakjai fiziológiás koncentrációjú kalciumionok jelenlétében is aktiválhatok, amely ionok a természetes C protein zimogénjének trombinnal való aktivációját gátolják. A humán C protein uj zimogén alakjai különböznek a szakirodalomból ismertektől az aktivációs peptid szekvencia aminosavaiban, ezek hasadnak le a zimogén alakokról az aktivált humán C protein keletkezésekor. A C protein uj zimogén alakjai különös előnyöket reprezentálnak a keringési megbetegedések kezelésekor, ideértve a véralvadást is.
A K vitamin dependens C protein egy olyan plazma fehérje, amelynek jelentős élettani szerepe van a hemosztázis szabályozásában. A C protein inaktív molekulaként bioszintetizálódik, ezt a leírásban naszcensz C proteinnek nevezzük. A naszcensz C protein komplex átalakuláson megy át, eközben az alábbiakban részletesebben ismertetett, különböző inaktív molekulák keletkeznek. A leírásban az inaktív, szekretált C protein alakokat zimogén C proteineknek nevezzük. A C protein aktivációja a vérben egy trombomodulin-trombin komplex részvételével következik be. Az aktivált C protein, kofaktorával, az S. proteinnel együtt élettani szempontból rendkívül fontos antikoaguláns. Az aktivált C protein gátolhatja az intravaszkuláris trombózist, és szabályozza a már létező vérrögök nagyobbodását. A C protein aktivált alakjának hatásmechanizmusa és az inaktív zimogén aktív proteázzá való alakulása nem régóta ismert folyamat /lásd Gardiner és Griffin, Progress in Hematology, XIII. kötet, 265 - 278., Brown, Grune és Stratton, Inc. kiadásában (1983) ; továbbá Esmon, Prog. Hemost. Thromb., 9, 29 - 55. (1989)/.
A C protein aktivációjakor trombinra van szükség, ez a véralvadási kaszkád végső szerin proteáza, az aktivációhoz továbbá szükség van egy endotel, sejtmembránhoz kötött glikoproteinre, amit trombomodulinnak nevezünk.
A trombomodulin erős, sztöchiometrikus komplexet képez a trombinnal. A trombomodulin, amikor kötődik a trombinhoz, drámaian megváltoztatja a trombin funkcionális tulajdonságait. A trombin közönséges körülmények között kiválasztja a fibrinogént, a vérlemezkéket összecsapja, és a véralvadásban szerepet játszó V és VIII kofaktorokat aktív alakjaikká, az Va és Villa faktorokká alakítja. Végül, a trombin aktiválja a C proteint, azonban csak igen lassan és kevéssé hatékonyan, ez az aktivációs folyamat ezenkívül az élettani kalciumion koncentráció által gátolt. Ezzel szemben, a trombomodulinnal kapcsolt trombin nem választja ki a fibrinogént, nem aktiválja a vérlemezkéket, és nem alakítja át az V és VIII véralvadási faktorokat a megfelelő Va és Villa párjaikká, ugyanakkor igen hatásosan aktiválja a C protein zimogénjét fiziológiás koncentrációjú kalciumionok jelenlétében is. A trombomodulin-trombin komplex C protein zimogénjének aktivációs konstansa több mint 1000-szer nagyobb, mint a trombin reakciókonstansa.
Annak megértésére, hogy az aktivált C protein hogyan szabályozza a véralvadást, az alábbiakban röviden ismertetjük a véralvadási enzimrendszert.
A véralvadási rendszert legegyszerűbben mint egy láncreakciót kell vizsgálnunk, amely reakció során aktív szerin proteázok jönnek létre a zimogének szekvenciális aktivációja során. Ennek a láncreakciónak az eredményeképpen keletkezik a trombin enzim, amely limitált proteolizissel átalakítja a plazma fibrinogénjét az oldhatatlan fibrin géllé. A véralvadási kaszkád két kulcseseménye a X véralvadási faktor átalakulása Xa faktorrá, a reakciót a IXa véralvadási faktor szabályozza; a második fontos lépés a Xa faktor által szabályozott protrombin trombin-átalakulás. Mindkét reakció a sejt felületén zajlik, közelebbről a vérlemezke felületén, és mindkét reakció kofaktorok jelenlétét igényli. A major kofaktorok, név szerint az V és VIII faktorok viszonylag inaktív prekurzorokként keringenek a rendszerben, de amikor az első néhány trombin molekula megképződött, akkor a trombin jelenlétének hatására limitált proteolizis során aktiválódnak a kofaktorok. Az Va és Villa aktivált kofaktorok mind a protrombin trombinná alakulását, mind pedig a X faktor Xa faktorrá alakulását katalizálják, közelítően ötös reakciórendben. Az aktivált C protein hatására proteolitikusan degradálódik, hidrolizálódik és irreverzibilisen leépül az Va és Villa véralvadási faktor, azaz az V és VIII inaktív véralvadási faktorok aktív alakjai. Az V és VIII véralvadási faktorok ezzel szemben igen gyenge szubsztrátjai in vivő az aktivált C proteinnek.
Az aktivált C protein fontos kofaktora az S protein, egy másik K vitamin dependens plazma protein.
- 6 Az S protein jelentősen növeli a C protein aktivált alakja által szabályozott Va és Villa faktorok hidrolízisét, a növekedés mértéke 25-szörös.
A C protein értékes, terápiásán használható molekula /lásd például Bang és munkatársai, 4,775,624 számú amerikai szabadalmi leírás (1988. október 4.)/. Az aktivált C protein egy uj antitrombotikus szer a hozzáférhető véralvadást gátlóknál, mint például a heparinnál vagy az orálisan adagolható hidroxi-kumarin tipusu vegyületekné1 szélesebb terápiás indexszel. Sem a C protein zimogénje, sem az aktivált C protein nem hatásos mindaddig, míg trombin nem keletkezik, mivel trombin szükséges ahhoz, hogy az V, Va és a VIII, Villa faktorokká alakuljon; ezen két kofaktor aktivált alakjai az aktivált C protein előnyös szubsztrátjai. Trombin szükséges a C protein zimogénjének aktiválásához is, ugyanis trombomodulin-trombin komplex nélkül a C protein zimogénje nem alakul át aktív alakjává.
Az aktivált C protein közreműködést igénylő véralvadásgátló molekula, mivel az aktivált C protein úgy működik, hogy inaktiválja az Va és Villa kofaktorokat. Mivel trombin szükséges az V és VIII faktorok átalakítására a megfelelő Va és Villa párjaikká, a C protein antikoagulánsként csak akkor hat, ha trombin keletkezik. A konvencionális véralvadásgátlók, ellentétben az aktivált C proteinnel, konstans antikoagulációs állapotot tartanak fenn a vérkeringésben, mégpedig annyi ideig, amíg a paciens kapja őket, ily módon jelentősen növelik a komplikációk bekövetkezésének lehetőségét, szemben a C proteinnel vagy annak aktivált alakjával. Az aktivált C protein ezért egy széleskörű klinikai felhasználásra alkalmas véralvadásgátló, amelyet a heparin és a hidroxi-kumarinok kiváltására használhatunk.
Egyes betegségekben, mint például az örökletes C protein-hiányban, a C protein zimogén nagy jelentőségű terápiás szer. A kongenitális homozigózis eredetű C protein-hiányban szenvedő betegek korai gyermekkorban elhaláloznak a disszeminált intravaszkuláris koaguláció gyakran letális alakjának, a purpura fulminans-nak a jelentkezésekor. A heterozigotikus C protein-hiányban szenvedő betegek több tromboembólikus tünetben szenvednek. Klinikailag megalapozott, hogy a B hemofillában vagy IX véralvadási faktor-hiányban szenvedő betegek plazmaprotein koncentrátumokkal való kezelésekor a szer C protein-szennyezése miatt hatás mutatkozik az intravaszkuláris vérrög-képződésben a heterozigotikus C protein-hiány állapotában. A C protein koncentrációja ugyancsak abnormálisán alacsony trombotikus állapotban, mint például disszeminált intravaszkuláris koagulációkor, és olyan betegségi állapotokban, amelyek a trombózist megelőzik, mint például trauma vagy műtét után, és rákos állapotban .
A C protein aktivációjának és a találmány szerinti eljárásnak az ismertetésére és megértésére a naszcensz humán C protein kódoló szekvenciáját és a megfelelő aminosav szekvenciát az alábbiakban ismertetjük. Ezt az aminosav szekvenciát és ennek megfelelő részeit a leírásban natív humán C proteinnek is nevezzük.
• ·
10 5'-ATG η2ν-μετ TGG TRP CAG GLN 10 CTC LEU ACA THR 5 AGC SER 20 CTC LEU CTG LEU CTG LEU 30 TTC GTG PHE VAL 10 GCC ALA ACC THR 40 TGG TRP GGA GLY 15 ATT ILE
50 60 70 80 90
15 TCC GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC TCA GTG TTC TCC AGC AGC GAG CGT
SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG
20 25 30
100 110 120 130 140
20 GCC CAC CAG GTG CTG CGG ATC CGC AAA CGT GCC AAC TCC TTC CTG GAG
ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU
35 40 45
150 160 170 180 190
25 GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG ATC TGT
GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS
50 55 60
200 210 220 230 240
30 GAC TTC GAG GAG GCC AAG GAA ATT TTC CAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG
ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU
65 70 75 80
250 260 270 280
35 GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC GAC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC
ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO
85 90 95
290 300 310 320 330
40 TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG TGC ATC
LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE
100 105 110
340 350 360 370 380
GAC GGC ATC GGC AGC TTC AGC TGC GAC TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC
ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY
ς 115 120 125
390 400 410 420 430
CGC TTC TGC CAG CGC GAG GTG AGC TTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC
ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN
130 135 140
10
440 450 460 470 480
GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGC CTA GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT
GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS
15 145 150 155 160
490 500 510 520
AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG CAG TGT CAC
SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS
165 170 175
20
530 540 550 560 570
CCC GCA GTG AAG TTC CCT TGT GGG AGG CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG
PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS
180 185 190
25
580 590 600 610 620
AAG CGC AGT CAC CTG AAA CGA GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA
LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL
195 200 205
30
630 640 650 660 670
GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC
ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO
210 215 220
35
680 690 700 710 720
TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA
225 230 235 240
40
730 740 750 760
GTG CTC ATC CAC CCC TCC TGG GTG CTG ACA GCG GCC CAC TGC ATG GAT
VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
245 250 255
770 780 790 800 810
GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC
GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG
5 260 265 270
820 830 840 850 860
TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
275 280 285
10
870 880 890 900 910
CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC
PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS
290 295 300
15
920 930 940 950 960
CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC TGC CTC
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU
305 310 315 320
20
970 980 990 1000
CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC AAT CAG GCC GGC CAG GAG
PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU
325 330 335
25
1010 1020 1030 1040 1050
ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAC CAC AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA
340 345 350
30
1060 1070 1080 1090 1100
AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC TTC ATC AAG ATT CCC GTG GTC
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
355 360 365
35
1110 1120 1130 1140 1150
CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC
PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN HÉT VAL SER GLU ASN
370 375 380
40
1160 1170 1180 1190 1200
ATG CTG TGT GCG GGC ATC CTC GGG GAC CGG CAG GAT GCC TGC GAG GGC
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
385 390 395 400
GAC ASP 1210 1220 GTC GCC 1230 1240 CTG LEU
AGT GGG GGG CCC PRO ATG MET TCC SER TTC PHE CAC GGC HIS GLY ACC THR TGG TRP TTC PHE
SER GLY GLY VAL ALA
c. 405 410 415
J 1250 1260 1270 1280 1290
GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAC
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR
420 425 430
10
1300 1310 1320 1330 1340
GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG ATC CAT GGG CAC
GLY VAL TYR TKR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
435 440 445
15
11 150 1360 1370 1380
ATC AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG-
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOH
450 455 460
ahol
A dezoxi-adenil-,
G dezoxi-guanil-,
C . dezoxi-citidil-
T li imidi le söpört ,
ALA alanin,
ARG arginin,
ASN aszparagin,
ASP aszparaginsav,
-COOH karboxilesöpört
CYS cisztein,
GLN glutamin,
GLU glutaminsav,
GLY glicin,
HIS hisztidin,
h2n- aminocsoport,
ILE izoleucin,
LEU leucin,
LYS lizin,
MET metionin,
PHE fenil-alanin,
PRO prolin,
SER . szerin,
THR treonin,
TRP triptofán,
TYR tirozin, és
VAL valin.
A fentiekben ismertetett dezoxi-ribonukleinsav szekvencia a humán C proteint meghatározó humán máj m-ribonukleinsavból előállított komplementer dezoxi-ribonukleinsav klónokból származik. A témában jártas szakemberek tudják, hogy a genetikai kód degenerált volta lehetővé teszi hasonló aminosav szekvenciákat meghatározó különböző dezoxi-ribonukleinsavak előállítását. A naszcensz humán C protein fentiekben megadott komplementer dezoxi-ribonukleinsav (cDNS) szekvenciája igy csak egyike a lehetséges sok naszcensz humán protein C-t kódoló szekvenciának. A komplementer dezoxi-ribonukleinsav kiónok előállítására egy 5'-poli-guanin szekvencia, egy 3'-poli-citozin szekvencia és mind az 5'-, mind a 31-végen PstI restrikciós enzim által felismerhető hely lett kiépítve a C proteint meghatározó komplementer dezoxi-ribonukleinsav végein. Két cDNS kiónt úgy manipuláltunk, hogy az tartalmazzon egy olyan dezoxi-ribonukleinsav molekulát, amely magábafoglalja a humán C protein naszcensz alakjának kódoló szekvenciáját és a dezoxi-ribonukleinsavnak azt a részét, amely a kódoló régió 5'- és 3'-végein a nem transzlatált mRNS-t határozza meg. Ezt a dezoxi-ribonukleinsav molekulát a pBR322 jelű plazmid PstI helyére építettük be, amiután megkaptuk a pHC7 jellel • · • · · jelzett plazmidot. A pHC7 plazmid igy tartalmazza a fenti kódoló szekvenciát, és - ismét csak a molekula egyik szálát ismertetve - tartalmazza az alábbi szekvenciát is:
5'—C TGC AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG CTG TCA TGG CGG CAG GAC
GGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA CCC GCC CCT ACA GGT GCC
AGT GCC TCC AGA- 3 '
és
5'-CGA CCC TCC CTG CAG GGC TGG GCT TTT GCA TGG CAA TGG ATG GGA
CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC CCC CCC CCC CCC
CCC CCC CCT GCA G-3 '
a naszcensz humán C proteint meghatározó kódoló szekvencia sorrendben 5'- és 3'-végein. A dezoxi-ribonukleinsav komplementer bázis-párosodásának megfelelően a kétszálu dezoxi-ribonukleinsav egyik szálának szekvenciáját ismerve meghatározhatjuk a második szál szekvenciáját is. A pHC7 plazmid ismert módon izolálható az E. coli K12 RRl/pHC7 törzsből, amelyet a Northern Régiónál Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois, törzsgyüjteményében találunk meg. Az E. coli K12 RRl/pHC7 törzs tenyészetét az NRRL törzsgyüjteményéből NRRL B-15926 sorszámon megrendelhetjük. A pHC7 plazmid restrikciós térképét és funkcionális helyeit a leíráshoz mellékletként csatolt 2. ábrán adjuk meg.
A naszcensz C proteint sematikusan az alábbiak szerint is leírhatjuk:
1 42 43 197 198 199 200 211 212 461
pre-pro LC KR AP AHC
<
HCpre-pro : A naszcensz humán C protein 1 aminoLC
KR savai egy szignálpeptidet leírják a humán C protein ezek fontosak a szekréció határoznak meg, és propeptid részét, irányításában és a C protein gamma-karboxilezésében.
: A naszcensz C protein 43 - 197. aminosavai transzlációt követő módosulás után képviselik mind a kétláncu zimogén, mind pedig a
C protein aktivált alakjainak könnyű láncát (LC). A kétláncu zimogén az egyláncu zimogén alakból keletkezik úgy, hogy az ábrán szereplő KR dipeptid lehasad (lásd alább is).
: A naszcensz humán C protein 198 - 199. aminosavai, amelyek valószínűleg kétlépéses reakcióban lehasadnak (a szarvasmarha C protein analógiája szerint).
A kétlépéses reakció első lépéseként vagy a 197
198., vagy a • ·
199 - 200. aminosavak között hasad a szekvencia, majd karboxi-peptidáz vagy amino-peptidáz enzimek hatására tovább hasad, amiután létrejön a kétláncu C protein.
AP : A naszcensz C protein 200 - 211.
aminosavai az aktivációs peptidet reprezentálják, amely a C protein zimogén alakjairól lehasadva létrehozza az aktivált C proteint.
AHC : A naszcensz C protein 212 - 461.
aminosavai transzlációt követő módosulás után alkotják az aktív C protein aktivált nehéz láncát (AHC).
HC : A C zimogén protein kétláncból álló alakjának nehéz lánca, amely transzlációt követő módosulás után a
200 - 461. aminosavból áll, és az
AP és AHC szekvenciát alkotja.
4
- 18 A humán C protein zimogén egy olyan szerin proteáz prekurzor, amely a májban szintetizálódik, és a vérben van jelen. A teljes biológiai aktivitás expresszálásához a C protein poszt-transzlációs (transzlációt követő) változtatására van szükség, ez a folyamat K vitamin-igényű. A kétláncu, diszulfid-hidakkal összekapcsolt C protein zimogénje az egyláncu zimogénből keletkezik limitált proteolizist követően. A limitált proteolizis valószínűleg hasításokat hoz létre, és eltávolítja a 198. és 199. aminosavakat. A kétláncu zimogén aktivációja aktív szerin proteázzá együttjár az ARG-LEU peptidkötés proteolitikus hasításával (a 211. és a 212. aminosav). Ez utóbbi hasadást követően egy dodekapeptid (200 - 211. aminosav) keletkezik, ez az aktivációs peptid, amely a kétláncu zimogén molekula nehéz láncának aminoterminális végét tartalmazza. A C protein nagymértékben glikozilezett, a plazmában levő érett enzim 15 - 23 % szénhidrátot tartalmaz. A C protein több szokatlan aminosavat is tartalmaz, igy gamma-karboxi-glutaminsavat és béta-hidroxi-aszparáginsavat (eritro-L-béta-hidroxi-aszparaginsav). A gamma-karboxi-glutaminsav (gla) gamma-glutamil karboxilezéssel keletkezik a glutaminsavból, a reakciót a kofaktorként K vitamint igénylő májban levő mikroszómális karboxiláz katalizálja.
- 19 A humán C protein aktiválását sematikusan az alábbiak szerint is megadhatjuk. A témában jártas szakemberek tudják, hogy a sematikus ábrázolásban megadott reakciólépések sorrendje szükségszerűen nem azonos az in vivő reakciósorrenddel.
« t 4 • · · · naszcensz protein C pre-pro-LC-KR-AP-AHC
I
I
Transzlációt követő módosulás, azaz | adott glutaminsavak gamma-karboxi- j lezése és egy aszparaginsav béta- j -hidroxilezése; továbbá glikozileI ződés Ψ
Szekréció, az 1 - 42. aminosavak
I lehasadása, a lehasadás több mint '
I egy proteolitikus lépésben követ- I
I kezik beI
LC-KR-AP-AHC A 198 - 199. aminosavak lehaI sadása, az emberi vérben találtI zimogén C protein körülbelülI
I %-a kétláncu alakban van| •4/ (S-S= diszulfid kémiai kötés)LC
I
Íp-S j AHC-AP Trombin-trombomodulin aktiváció'
Ψ
LC
I s-s egyláncu zimogén kétláncu zimogén aktivált C protein
AHC
- 21 A találmány tárgya eljárás C protein újszerű zimogénjeinek rekombináns expresszálására, a találmány tárgyához tartoznak az uj vegyületek, dezoxi-ribonukleinsav vektorok, transz formánsok és az expresszié módszerei is.
*
A leírásban használt kifejezéseket az alábbiakban magyarázzuk.
Ad2LP - a 2 tipusu adenovirus nagy késői promotere .
A leírásban szereplő proteinek vagy peptidek ismertetésekor az alábbi rövidítéseket használjuk az aminosavak leírásakor:
Hárombetűs Egybetüs
Amino savak rövidítés rövidítés
PHE fenilalanin F
LEU leucin L
ILE izoleucin I
MET metionin M
VAL valin V
SER szerin S
PRO prolin P
THR , treonin T
ALA alanin A
TYR tirozin Y
Hárombetűs Egybetűs rövidítés
rövidítés Aminosavak
HIS hisztidin H
GLN glutamin Q
ASN aszparagin N
LYS lizin K
ASP aszparaginsav D
GLU glutaminsav E
CYS cisztein C
TRP triptofán w
ARG arginin R
GLY glicin G
ApR - ampicillin rezisztens fenotipus vagy az ezt a tulajdonságot meghatározó gén.
BK - BK vírusból származó dezoxi-ribonukleinsav.
Enh vagy enhancer A BK vírus enhancere.
ep vagy SV40ep A T antigén gén SV4O korai promoteréből, a T antigén kötőhelyeiből, az SV40 enhancerből és az SV4O replikációs origóból álló dezoxi-ribonuklein sav szegmens.
• · * t gamma-karboxilezés
- egy olyan reakció, amely a glutaminsav gamma-szénatomjához egy karboxil csoportot kapcsol.
gamma-karboxilezett protein egy olyan protein, amelyben egyes glutaminsavak gamma-karboxilezve vannak.
GBMT transzkripciós egység egy módosított, az alábbi részekből álló transzkripciós szabályozó egység: a BK vírusból származó P2 enhancer, amely szorosan az adenovirus nagyobb késői promoterének 5'-irányban elhelyezkedő szabályozó elemének közelében helyezkedik el; az adenovirus-2 nagyobb késői promotere, egy poli-GT elem, amely a fenti promoter működését elősegítő módon helyezkedik el, végül egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely az adenovirus módosított szignálszekvenciáját tartalmazza. A GBMT transzkripciós egység a pGT-h plazmid körülbelül 900 bázispárból álló HindlII restrikciós fragmensén helyezkedik
IVS
MMTpro naszcensz
NeoR pA
Promoter
C protein
- Intront kódoló dezoxi-ribonukleinsav, amit interveniáló szekvenciának is nevezünk.
- Az egér metallotionein-I génjének promotere. protein -
Az a polipeptid, amely egy mRNS transzkriptum transzlációjakor keletkezik, mindenféle transzlációt követő módosulás előtt. Ezt értjük ezalatt, annak ellenére, hogy a transzlációt követő módosulások, mint például a glutaminsav gamma-karboxileződése és az aszparaginsav hidroxileződése elkezdődhet már akkor, amikor a protein mRNS transzkriptumról való transzlációja teljes egészében még nem fejeződött be.
- Neomicin rezisztenciát meghatározó gén, ez a gén rezisztenciát biztosíthat a G418 antibiotikummal szemben is.
- Poliadenilezési szignált kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvencia.
- Az a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely a dezoxi-ribonukleinsav átírását biztosítja ribonukleinsavvá .
aktivitás Proteolitikus, amidolitikus, eszterolitikus és biológiai (véralvadásgátló vagy profibrinolitikus) aktivitásokért felelős humán C protein bármely tulajdonsága. A protein alvadásgátló
Rekombináns
Rekombináns
Rekombináns
Replikon
Restrikciós aktivitásának meghatározására használható módszerek jól ismertek a szakirodalomban, lásd például Grinnell és munkatársai /Biotechnology, 5, 1189. (1987)/.
dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor Bármilyen molekula, ideértve - nem limitáló jelleggel - a kromoszómába beépülőket, az autonóm replikálódó plazmidokat és a fágokat, azaz azokat a dezoxi-ribonukleinsav molekulákat, amelyekhez egy vagy több további dezoxi-ribonukleinsav szegmens kapcsolható, vagy szegmenst kapcsoltunk.
dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektor Bármely rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor, amelybe egy promotert építettünk be olyan helyre, hogy egy géntermék expresszióját irányítsa.
dezoxi-ribonukleinsav vektor Bármely rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vagy expressziós vektor.
- Az a dezoxi-ribonukleinsa\r szekvencia, amely szabályozza és lehetővé teszi egy plazmid vagy valamely más vektor autonóm replikációját.
fragmens Bármely olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely egy vagy több restrikciós endonukleáz enzim hatására keletkezett.
Érzékeny gazdasejt Olyan kiindulási sejt, amely egy adott antibiotikum vagy más, toxikus vegyület jelenlétében nem képes növekedni anélkül, hogy az adott anyagokkal szembeni rezisztenciát biztosító dezoxi-ribonukleinsav szegmenst építenénk be.
TcR - Tetraciklin rezisztens fenotipus vagy az ezt meghatározó gén.
Transz formáció - Recipiens gazdasejtbe dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása, amely után a recipiens sejt genotípusa megváltozik.
Transzformáns - Transzformált recipiens gazdasejt.
Transzlációs aktivációs szekvencia Bármely olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely riboszómális kötőhelyet kódol, és transzlációs start kodont tartalmaz, mint például 5’-ATG-3'; ezek jelenléte biztosítja egy mRNS transzkriptum transzlációját pepiiddé vagy polipeptiddé.
Zimogén - Egy proteolitikus enzim enzimatikusan inaktív prekurzora. A leírásban használt C protein zimogén kifejezés egy szekretált inaktív C protein egyik vagy mindkét láncát jelenti.
• ·
- 27 Az alábbiakban ismertetjük a leíráshoz adott ábrákat.
Az 1. ábrán megadjuk a pLPC-N plazmid restrikciós és funkcionális térképét. A leíráshoz, mivel erre nincs szükség, nem méretarányos ábrákat adunk meg.
A 2. ábrán ismertetjük a pLPC-FN plazmid restrikciós helyeit és funkcionális térképét.
A 3. ábrán megadjuk a pLPC-SC plazmid restrikciós és funkcionális térképét.
A 4. ábrán lerajzoltuk a pLPC-LIN plazmid restrikciós és funkcionális térképét.
Az 5. ábrán látható a pLPC-FLIN plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
A 6. ábrán ismertetjük a pGTC plazmid restrikciós és funkcionális térképét.
A 7. ábrán megadjuk a pGT-d plazmid restrikciós és funkcionális térképét.
A 8. ábrán megadjuk a pGT-h plazmid restrikciós és funkcionális térképét.
A találmány szerinti eljárással olyan dezoxi-ribonukleinsavakat állítunk elő, amelyek a humán C protein uj zimogén alakjainak expresszióját határozzák meg.
A természetes humán C protein zimogén és a naszcensz humán C protein előállítására vonatkozóan több módszert találunk a szakirodalomban (lásd Bang és munkatársai, 4,775,624 számú amerikai szabadalmi leírás, 1988. október 4: a leírásban megadottakat referenciaként a leírásba beépítjük). A szakirodalomban szereplő módszerek a humán C protein olyan zimogén alakjainak az expresszióját teszik lehetővé, amelyek aminosav szekvenciájukban nem különböznek a humán vérben jelenlevő zimogén alakoktól. Az ezekkel a módszerekkel előállított C protein zimogéneket bizonyos anyagokkal, például alfa-trombinnal, tripszinnel vagy trombin és trombomodulin keverékével kell kezelnünk (in vivő vagy in vitro) ahhoz, hogy aktivált C proteinhez jussunk. Ezenkívül, a természetes körülmények között az emberi vérben található humán C protein zimogén alakjaival azonos aminosav szekvenciáju, rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiával előállított humán C protein zimogén alak a testben természetes aktivációs utón csak a trombin-trombomodulin komplex működésével aktivizálódik. A természetes humán C protein zimogénje egyedül trombinnal aktiválható, az aktiváció azonban kalciumionok hiányához kötött, és ilyen nagy koncentrációjú trombin és/vagy C protein zimogén nem rendelkezik szignifikáns in vivő metabolikus úttal ahhoz, hogy C proteinné aktivizálódjon.
A találmány szerinti eljárással olyan humán
C protein zimogén alakokat állíthatunk elő, amelyek in vivő aktiválhatók egyedül trombinnal, négpedig klinikailag elfogadható mértékben. Ezenkívül, ezek a zimogén alakok érzékenyebbek a trombin/trombomodulin aktivációra, mint a természetes humán C protein zimogn. A találmány szerint előállítunk olyan dezoxi-ribonukleinsavakat, rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorokat, transzformált sejtvonalakat, amelyekkel a találmány szerinti módszereket használva a humán C protein fenti uj zimogén alakjainak expreszszióját érjük el. A humán C protein ezen zimogén alakjainak előállítására a találmány értelmében
A/ egy eukarióta gazdasejtet olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorral transzformálunk, amely vektor áll:
a) az aminoterminális végtől a karboxilterminális végig az alábbi részekből álló aminosav szek venciát kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekven ciából :
egy szignálpeptid és egy gamma-karboxi lezett propeptid, szekretált protein;
a humán C protein könnyű lánca;
III:
az LYS-ARG, ARG-LYS, LYS-LYS és ARG-ARG « ·
- 30 dipeptidek bármelyike; végül
IV: az alábbi aminosav szekvencia:
ASP THR GLU Rí r2 Rs R4 Rs Re
r7 Rs Rs Rio ΤΊ r12 GLY LYS MET THR ARG .ARG GLY ASP SER PRO
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA
VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU .ARG ARG
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU
PRO AS? SER GLY LEU AU GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR
GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOH,
• · · ·
ahol
Ri ASP vagy LEU,
R2 GLN vagy HIS,
R3 GLU vagy LYS ,
R4 ASP vagy LEU,
R5 GLN,
R6 VAL vagy THR,
R7 ASP, PHE vagy TYR,
R8 PRO,
R9 ARG,
rio LEU vagy THR,
Ru ILE vagy deléció,
R12 ASN, és
ahol
-COOH karboxil- -terminális vég; és
b)
B/ a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia expreszszióját irányító promoter; és az A) szerinti módon transz formált gazdasejtet tenyésztjük olyan körülmények között, ahol az adott dezoxi-ribonukleinsav szekven cia expressziója bekövetkezik.
• · * ·
- 32 A fenti módszert és a használt dezoxi-ribonukleinsavakat az alábbiakban részletesen ismertetjük.
A fentiekben ismertetett, uj C protein zimogén alakok előállítására dezoxi-ribonukleinsav konstrukciókat használunk. Ezek az uj molekulák olyan pre-propeptidet kódolnak, amely a szekréciót szabályozó szignálpeptidből és egy gamma-karboxilezett protein propeptid részéből (ez utóbbi a K vitamin-igényű karboxiláz hatására jön létre) áll. Ilyen propeptid szekvenciákat ismerünk a szakirodalomból: lásd például Suttie és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 634 - 637. (1987) . Előnyösen és a könnyű előállítás érdekében mind a szignálpeptidet, mind pedig a propeptidet meghatározó nukleotid szekvenciát egy gamma-karboxilezett protein pre-propeptid aminosav szekvenciájából származtatjuk. Ilyen gamma-karboxilált protein például - de nem limitálóan - a VII, IX, X faktorok, a protrombin, az S protein, a Z protein és a C protein. A találmány szerinti eljárás során a vektorokba előnyösen a humán C protein pre-propeptidjét meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát használjuk.
A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav molekulák tartalmazzák továbbá a humán C protein könnyű láncát meghatározó szekvenciát, mégpedig közvetlenül 3'-irányban, és leolvasási fázisban a pre-propeptidet kódoló szekvenciához képest. A humán C protein könnyű lánca tartalmazza a 43 - 197.
aminosavakat, ahogy azt a naszcensz C protein ismertetésekor az előzőekben megadtuk. A K vitamin dependens plazma proteinek aminoterminális részei, ahogy a C protein könnyű láncának aminoterminális része is kalciumionokat kötő helyekkel rendelkezik. Ezeknek a plazmaproteineknek, mint például a VII, IX, X faktorok, a protrombin és az S protein, kalciumion kötő doménjeit hasonlóképpen használjuk, mint a humán C protein könnyű láncának kalciumion kötő dóménjét (lásd a O215548A1 sorszámú európai szabadalmi leírás 12. és 13. oldalát) .
A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinSav molekulák tartalmazzák a LYS-ARG (KR) dipeptid kódoló szekvenciáját, mégpedig közvetlenül szomszédosán, 3'-irányban, és transzlációs leolvasási fázisban a könnyű láncot meghatározó szekvenciával. A naszcensz proteinben a dibázikus dipeptid, mint például a LYS-ARG a könnyű lánc karboxilterminális végén helyezkedik el. A LYS-ARG dipeptid orientációja az expresszált proteinben a találmány céljainak nem felel meg. A találmány céljainak szempontjaiból a LYS-LYS vagy az ARG-ARG dibázikus dipeptidek ekvivalensek a LYS-ARG dipeptiddel.
A találmány szerinti eljárásban azonban előnyösen a LYS-ARG dipeptidet használjuk, amely dipeptid jelen van a természetes humán,C proteinben.
- 34 A LYS-ARG dipeptidet meghatározó kodonoktól közvetlenül 3'-irányban helyezkedik el az aktivációs pepiidet meghatározó szekvencia. A találmány szerinti molekulákban megváltoztattuk az aktivációs peptid kódoló szekvenciáját, és a nehéz lánc első három aminosavát meghatározó szakaszt (és a megfelelő aminosav szekvenciát), és ez felelős elsősorban ezeknek az uj zimogéneknek a megnövekedett trombin érzékenységéért.
A témában jártas szakemberek felismerik, hogy a találmány szerinti zimogén alakok különböznek a humán C protein természetes zimogén alakjaitól, ahogy azt az alábbiakban ismertetjük. A természetes humán C protein molekulában az aktivációs peptid és a nehéz lánc első három aminosava az alábbi szekvenciáju:
200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 ASP-THR-GLU-ASP-GLN-GLU-ASP-GhN-VAL-ASP-PRO-ARG-LEU-ILE-ASP, ahol az aminosavak feletti számok a naszcensz humán C proteinben levő aminosav sorrendeket jelölik. A jelen leírásban megadjuk, hogy különböző aminosavak megváltoztatásával olyan megfelelő zimogén alakot kapunk, amely könnyebben hasítható, azaz érzékenyebb a trombinra, ezenkívül érzékenyebb a trombin-trombomodulin komplexszel bekövetkező hasítással szemben is.
♦ *·
A találmány szerinti különböző aminosav deléciók és helyettesítések eredményeképpen olyan mutáns alakok jönnek létre, amelyekből kapott zimogének a jelzett trombin érzékenységgel rendelkeznek. A kapott zimogének kifejezés alatt azt értjük, hogy bár a helyettesítéseket a naszcensz humán C protein aminosav szekvenciája kapcsán közöljük, ennek a naszcensz humán C proteinnek először szekretálódnia kell (amely során az 1 - 42. aminosavak lehasadnak), zimogén alak kialakulása érdekében. A 214. helyen levő aszparaginsavat (az aktivációs pepiidben) helyettesítve a naszcensz humán C protein esetén aszparaginnal megkapjuk a találmány szerinti uj zimogént. Egy aminosav deléciója (inkább, mint helyettesítése) szintén uj C protein zimogén alakokat eredményez. A jobb megértés és a számozhatóság érdekében a deléciót nullával (0) jelöljük. Timikor egy aminosav kiesik, a deléciót szenvedett szakasz mindkét végén levő aminosavak kapcsolódnak a folyamatos zimogén lánc kialakítására. Az I. táblázaton megadjuk a találmány szerinti különböző uj C protein zimogén alakokat.
C\' 0- Ζ 1 Ζ ! Ζ 1 ζ: ζ 1
«—1 ΟΟ1 οο 1 00 1 00 ι Ν X 1
<Ν < <1 < 1 <ί <ί < ί
-<
Εη
α CN 70 •—, ζχ 1 7~; -—.
r-« X X X χ ζ
Γ-J μ_1 μ_; μ—ί t—< 1 '
ζ
•γν
— 00 00 οο 00 ΟΟ 00
Cb —1 X -4 X X X r< χ
X CN < < < < < < •4
Ζ
Φ
Ο ο ο ο Ο- ο Ο Γ~Ί
C0 γ— X X Χ χ χ
ζζ CN X X X X X ι-Η
Φ
σ> X £~Ι | χ ΐ χ χ : φ
> ο 00 ΟΟ X ! >-< ί οο X 1 φ
X CN < < X 1 Η ί < X 1 Ζ
Ν
C0 ί_ς >_2 χ χ 1 ! ·) χ φ
ο ο < < < <2 < r;
X CN > > > Η’1 > > Ζ
X
Γ-« Ζ ζ ^Ζ. ζ Ζ Φ
L Ο X : X μ-2 χ X
eV CN οο 00 00 ΟΟ 00 οο χ
Φ
Ο ,· Γ-, , X 70 ; Γ: , X
Τ Ο CG 00 00 00 οο '0
X CN < < < μ-; 1 < < •Η
υ
LT' —< —S οο 1 ζ
Γ7 χ χ >^ I ____; X
X CN Ο 00 οο +4 ί 00 χ Φ
Ζ
ζζ. ζ Ζ Ζζ Φ
Ν Ο X b—r χ ι—< 1 X χ
X CN ο 00 οο “ ί ο ο φ
ζ
Γθ χ X X X X
τ—. ο 00 σ: C0 X ! C0 00 Ζ φ
χ CN < < < X | < <
ζ
φ
φ
'φ
•Η X
ω • Η
4-) ω
0 ϋ
X 4 4J
ζ: C0; η
fö Ζ 0
1—1 υ Ζ X
Φ Ζ U Μ Ζ ι—{
Φ Ζ χ ω Ζ ζ φ
C Φ Γ—
'φ -U
φ <
0 Ν
£ φ II
•Η 'Φ
Ε X
Φ
Η
A találmány szerinti humán C protein előnyös uj zimogén alakjai tehát a naszcensz humán C protein szekretálódása és processzálása révén jönnek létre, a molekula aminosav szekvenciáját az alábbiakban adjuk meg:
h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE
SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG
ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU
GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS
ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU
.ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO
LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE
ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY
ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN
GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS
SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS
PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS
LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Rí r2 Rs R4 Rs Re
r7 r8 r9 RjO Rii R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA
VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU
PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR
GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOH;
ahol
R. ASP vagy LEU,
R2 GLN vagy HIS ,
R3 GLU vagy LYS ,
R4 ASP vagy LEU,
R5 GLN,
R6 VAL vagy THR,
R7 ASP, PHE vagy TYR,
RS PRO,
R9 ARG,
rio LEU vagy THR,
R11 ILE vagy egy deléció
R12 ASN és ahol
-COOH a karboxi1terminá1is
- 39 A témában jártasak felismerik, hogy a genetikai kód degeneráltsága miatt különböző dezoxi-ribonukleinsav molekulák kódolhatják a fentiekben megadott polipeptidet. Ezért az alábbiakban leirt konstrukciókat és a példákban megadott előnyös dezoxi-ribonukleinsav szekvenciákat, vektorokat és transz formánsokat szemléltető példaként kell tekinteni, és nem limitálják a találmány oltalmi körét.
A találmány szerinti összes dezoxi-ribonukleinsav molekulát a humán C protein gén helyspecifikus mutagenezisével állítjuk elő. A mutagenizált, zimogént meghatározó molekulákat ezután eukarióta expressziós vektorokba építjük be, például úgy, hogy a zimogén gének expresszióját az adenovirus-2 nagyobb késői promotere szabályozza. A vektorok tartalmazzák a BK vírus P2 enhancerét is, mégpedig olyan elhelyezésben, hogy növelje a promoter expressziós működését. A vektorokat Escherichia coli K12 AG1 sejtekbe transzformáljuk, és a törzseket letétbe helyezzük. A letétbehelyezés az alábbi törzsgyüjteményben történt: Northern Régiónál Research Laboratories, Peoria, Illinois 61604.
A II. táblázatban megadjuk az egyes tenyészeteket, a deponálás dátumát és a deponálási sorszámot.
• ·
II. TÁBLÁZAT
- 40 Tenyészet
Letéti szám
A letét dátuma
E. coli K12 AGl/pLPC-N
E. coli K12 AGl/pLPC-FN
E. coli K12 AGl/pLPC-SC
E. coli K12 AGl/pLPC-LIN
E. coli K12 AGl/pLPC-FLIN
NRRL B-18612 1990. 01. 09 .
NRRL B-18613 1990. 01. 09 .
NRRL B-18614 1990. 01 . 13.
NRRL B-18615 1990. 01. 13.
NRRL B-18616 1990. 01 . 13.
A tenyészeteket és a plazmidokat ismert technikákat használva kaptuk, a plazmidokat közvetlenül transz formálhatjuk eukarióta gazdasejtekbe, a humán C protein zimogén alakjainak az előállítására. Előnyösen úgy járunk el, hogy a plazmidokat az adenovirus E1A azonnali-korai géntermékét expresszáló gazdasejtekbe transz formáljuk, amelyekben a BK enhancer a vektoron úgy helyezkedik el, hogy az expresszió erősítése leghatékonyabban az E1A jelenlétében történjen meg. A témában jártas szakemberek tudják, hogy több gazdasejt expresszál vagy expresszálóvá tehető egy nagyméretű dezoxi-ribonukleinsav vírus korai géntermékének a termelésére. Az előnyös sejtvonalak a humán vese 293 sejtvonal (beszerezhető az American Type Culture Collection törzsgyüjteményéből ATCC CRL 1573 sorszámon), vagy a Szíriái hörcsög sejtvonal (AV12), amelyet ATCC 9595 sorszámon • ·
- 41 helyeztek letétbe. A legelőnyösebb az embrióból nyert humán vese sejtvonal (293 számú).
Az előbbinél magasabb szintű expressziót érhetünk el, ha a C protein különböző zimogén alakjait kódoló géneket a letétbe helyezett vektorokból kivágjuk, és a GBMT transzkripciós szabályozó egységet tartalmazó vektorba ligáljuk. A GBMT egység szabályozása alatt álló nativ humán C protein szekvenciát hordozó pGTC plazmidot E. coli K12 AG1 törzsből izolálhatjuk, amit NRRL B-18593 sorszámon szerezhetünk be. A természetes gént a plazmidból vágjuk ki, ami utóbbit E. coli dam törzsből izolálunk. A kihasitás Bell enzimmel történik. Az uj zimogén gének mindegyike kihasítható a megfelelő plazmidból Bell emésztéssel. Ugyanakkor, a tisztított és defoszforilezett vektorba ezután a találmány szerinti összes uj zimogén gén Bell enzimmel beépíthető. Az uj zimogén géneket hordozó plazmidokban a gének a GBMT transzkripciós egység mögött helyezkednek el, expresszióra ezeket transzformáljuk a 293 sejtvonal sejtjeibe, a sejteket tenyésztjük, és az uj zimogéneket izoláljuk a tenyészetből, a szakemberek körében jól ismert technikákat alkalmazva. A humán C protein sejttenyészetből való izolálásának egy módszerét ismerteti a 0363126 számú, 1990. 04. 11-én közzétett európai szabadalmi leírás, amit referenciaként a leírásba beépítünk.
• · · · • · ♦ · *
A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek közé tartoznak a találmány szerinti naszcensz proteinek szekretálódásakor felszabaduló zimogén alakok is. A találmány szerinti vegyületek a C protein zimogén alakjainak aktiválásakor képződő aktivált C protein-származékok is. így a találmány szerinti vegyületek közé tartozik a kódoló szekvenciákat hordozó dezoxi-ribonukleinsav, ezeknek a szekvenciáknak a kifejezését irányitó expressziós vektorok, a kódoló szekvenciák transzkripciójakor létrejövő mRNS transzlációjakor keletkező naszcensz proteinek, ezen naszcensz proteinek szekretálódásakor képződő zimogének és bizonyos zimogének aktivált származékai. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavakat kémiailag is szintetizálhatjuk, vagy restrikciós fragmenseket kombinálhatunk, vagy kombinálhatjuk a szakterületen használatos technikákat. Dezoxi-ribonukleinsavat szintetizáló készülékek ismertek, és felhasználhatók a találmány szerinti vegyületek elkészítésére.
A találmány szerinti eljárásban használt illusztratív értékű vektorok tartalmazzák a BK enhancert, amely úgy helyezkedik el, hogy az adenovirus nagyobb késői promoterével stimulálja a találmány szerinti kódoló szekvencia transzkripcióját. A témában jártasak tudják, hogy nagyszámú eukarióta promoter, enhancer és expressziós vektor ismert és használható fel a találmány szerinti eljárásban.
• *
- 43 A témában jártas szakemberek azt is tudják, hogy az eukarióta expressziós vektor enhancer elem nélkül is működik. A találmány szerinti eljárás kulcs-felismerése nem korlátozódik egy adott enhancerre, vagy bármelyre, vagy a C protein zimogén alakjának expresszióját szabályozó promoterre, hanem elsősorban az uj kódoló szekvenciára és ezen szekvencia által meghatározottan termelődő, megfelelő proteinekre.
Ugyanakkor, az egyes vektor elemek kiválasztása, például a promoterek, enhancerek és szelektálható markerek használata nagy jelentőségű az eukarióta gazdasejt által termelt protein mennyiségére. A 0245949 számú, 1987.
11. 19-én közzétett európai szabadalmi leírásban - amit itt referenciaként említünk - több expressziós vektort ir le a természetes C protein zimogén termeléséhez, a vektorokban a naszcensz humán C protein expresszióját BK enhancer által stimulált eukarióta promoter szabályozza. Ezekkel a vektorokkal különösen magas expressziós szintek érhetők el akkor, ha olyan eukarióta sejtekbe transzformáljuk azokat, amelyek egy nagy dezoxi-ribonukleinsav vírus korai géntermékét is expresszálják, ilyen például az adenovirus E1A génterméke. Ahogy az a jelen leírásban ismertetett pGT-N, pGT-FN, pGT-SC, pGT-LIN és pGT-FLIN szemléltetésként megadott vektorokból kiderül, különösen előnyösen használható az, amelyben a géntermék expresszióját a GBMT-E1A szekvenciával oldunk meg.
A találmány szerinti eljárást nem limitáljuk egy adott eukarióta gazdasejt használatára. Jónéhány eukarióta gazdasejt áll rendelkezésre a törzsgyüjteményekben, mint például az American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD 20852, törzsgyüjteményben. Ezek a találmány szerinti vektorok felhasználására alkalmasak. Egy adott gazdasejt kiválasztása bizonyos mértékig attól függ, hogy melyik expressziós vektort használjuk a találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav kódoló szekvenciák közül a C protein expreszsziójára. Mivel a naszcensz humán C protein és a naszcensz humán C protein találmány szerinti származékai jelentős mértékű transzlációt követő módosulás révén változnak, bizonyos sejtvonalak előnyösebben használhatók a találmány szerinti vektorokkal. A 0245949 sorszámú európai szabadalmi leírásban és Grinnel és munkatársai dolgozatában /Bio/Technology, _5, 1189. (1987)/ a gamma-karboxilezett proteinek, például a humán C protein rekombináns sejtekkel való termelésére különösen előnyösen használnak adenovirussal transz formált humán embrió vesesejteket. Ilyen adenovirussal transz formált humán embrió vese sejtvonal a 293 sorszámú sejt, amit ATCC CRL 1573 sorszámon szerezhetünk be. A 293 sorszámú sejtvonal előnyösen használható fel a találmány szerinti vektorokkal is.
Ugyanakkor, a gamma-karboxilezett proteinnek, mint például a humán C protein zimogén alakjának előállítása egy adenovirussal transzformált sejtvonalban nem limitálható az adenovirussal transz formált humán embrió vesesejtekre. Tény, hogy az adenovirus transz formált sejtek általában elfogadott gazdasejtek a gamma-karboxilezett humán C protein termelésére. Egy különösen előnyös sejtvonal ezen típusok között az AV12-664 (a továbbiakban: AV12 jellel jelöljük) sejtvonal, amelyet az ATCC törzsgyüjteményből ATCC CRL 9595 sorszámon kaphatunk meg. Az AV12 sejtvonal előállítására a sziriai hörcsögöt a nyakán injekcióval humán adenovirus 12-vel fertőztük, és a kapott tumorból sejteket izolálunk. A későbbiekben megadott 3. példában ismertetjük mind a 293 sorszámú, mind pedig az AV12 sejtvonalak transzformációját a szemléltetésként megadott pGT-N vektorral.
A találmány szerinti vektorok egy sor eukarióta sejtbe transzformálhatok, ott expresszálhatók, különösen előnyös gazdasejtként az emlős sejt. A találmány szerinti, a stabil eukarióta transz formánsok izolálására és azonosítására használt szelektálható markert nem tartalmazó vektorok nemcsak közvetlen transzformációs célokra használhatók fel, de kotranszformációra is, ami utóbbi technikát a 4,399,216 számú, 1983. augusztus 26-án közzétett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek. A találmány szerinti vektorok tartalmazhatnak E. coli sejtekben replikációt megengedő szekvenciákat is, mivel általában a plazmid dezoxi-ribonukleinsav izolálása • ♦· ·
- 46 jóval hatékonyabb E. coli sejtekből, mint más gazdasejtekből .
A találmány szerinti vektorokban levő humán
C proteint meghatározó szekvencia kifejezése olyan gazdasejtekben történik meg, amelyekben promoter kapcsolódik a strukturgénhez . A találmány szerinti eljárásban használható gazdasejtek közül néhányat, a megfelelő megjegyzésekkel együtt, a III. táblázatban sorolunk fel.
a & w n co 3 te te a
►u ►Ú Φ i-3 pi te te < Φ
1—1 S te o CO n n n 1 Ό
H H P> 1 ΠΧ 1 1 l·-1 0 1
M 00 tv 2 2 0
n bJ 1—i « M Pl
co bO b-> bj N
tTl Pi
cn φ P>
N bf cn
P>' Φ Φ
K fX LJ.
1 φ rt
rt
H-
Ό te 5* ?r (D ÍÖ pl tr
P> P c H· uQ te tr l-h £
rt 3 3 y Φχ (D (D e 3
tv px px Pl i-í ω ω H· Pb
Pb 5 5 H- p C tv 5
5 (D ω ω P>
Xt 3 5 tr 3 H- 3
H- ke O: tr 3 3 Pi' M
pr 0> pj H t-f P> Pl N LJ.
φ H tv Ω H- LJ. LJ. 0:
ό O H- cn CX 0 O H tr e
Pl 3 O: 3 3 Pl Φ
(+ PJ φ P l-h Ό
θ' H· < < 3 P> φ
3 H- Ό tr Φ Φ P> Γί-
Pl rt Φ K ω ω LJ. Ο
rr rt 0 Φ Φ 0 Ο- Qi
φ (D tr 3 ι-·
1—1 l-h H ρι
o (IX pj < cn Φ
H· ω cn Φ N
Pl N N ω rt
Φ rt ro O' rt
tV 0 3
?r Pl
> > te
13 > > > > > >
0 Q t-3 t-3 f-3 i-3 te
o n 0 Q O O n o o
a O Q n 0 0 rt·
'k 'k Φ'
~k 'k 'k -k 'k 'k 'k -k rt
k 'k k 'k 'k -k H-
o n
n n n 0 O o n cn
te te n n n n n w N
te te te te te Pb
F-“ bo 00 3
LH Cb kO -~j ~j O
Ül 1—* bO • o Oh
η-1 <J1
H H H t-3
W te >' n
>
C9 1 Φ M tv cn 5 cn cn Ό krQ e H- pj
CD pi tr O: N pi N N i-( kke Pl cn
—1. N Os σ e Φ I—1 pi' Pb O 0 tv 3
rt Pl Os tv tr e e H n e Φ
CD cQ Pl 1—1 H O' 3 3 H· 0 cn pi t-í U)
Ct Φ i-· Pi Pi 5 te pj rt k£>
Pl cn Pl rt N N 1 tr < Φ ÜJ
5 N H (lb φ Φ' Φ' H· ~j cr 0 rt
H- ρχ cn Pl' l·-1 I—1 tv tv rQ pi e H- l·-1
e e Φ e LJ- Os - Pl Φ' cn s Pl U)
3 LJ. Ω pi pi' H- 3 Φ h1 Φ ÜJ
i-í P> rt 0 H Φ - LJ· 5 Pb 5
φ N < rt P> 1—1 cr p: rt Os rt- e ω
N Φ' 0 • N H- σ 3 • <e - θ' φ N
H- tV e rt Os H- o H tv •
cn 0 P> H te l-> 5 > 5 3
N tv I—* Pl rt Pl H· Pl c:
ft - tr 0 rt- Pl n l·-1 5 ω
Φ O' θ' Pi w rt cn >
5 3 H H1 • 0 o Φ 1
cn H- Pl Pl Pl 1 Pl LJ. H*
5 Pb 3 N te X N rt CD
hr| rt 1-1 tr Qj l-h I-1 < H-
> H Pl Pl le > 0
tsi Pl H· Pl cn 1 5 PX
> rt 1 Φ '0 pi ω
co re rt LJ. o 0 I—1
cQ 1 Pl H· rt X 1
Pl rí- Ό < ω
N θ' c O 1—1
Pl tv cn 1 1—1
Pl C
ι φ
lj.
Φ sP ·<
N (IX ω
I ω Q
cn 1—·
1 w 1 M
1 1 cn
to 3 H
1 Π4 ι-4
rt
1 PJ
1 3
i 3* ►ΰ 3 CD
1 O: I—1 C iQ
1 l-i P) B Ωχ
ι Ω N px H
II ω B 3
1 ο: 0 Hl
Jö ι 1X5 Ω Ό H·
o 3 1 H- I—4 tr
Ω 0 1 < rt P> H
X H ro O N O
< Ρ- ι ω B B cr
H· Ω ι ro P> P> i—*
H* PJ 1 p;
I-4 3 | ω tn
CD ro N
i-3 1 L—1. rt
rt
s 1
PJ ro |
Π
Q 1
l·-1 C
PJ Π4 1
B (t |
Cb
l-( 1
to Ω ,—.
O 1 > > > Η)
CO n 1 i-3 Ο
Ln 0 n n O Η4
kJ H 1 Q n Q
1 H rt
l·-4 ro 1 Ί. ~k PJ
Ω 1 k k rt
rt ρκ
σ> H- 1 Q Q n ω
• O . ° w -—-
3 1 f f
1 I—4 I—4 I—1
I—1 1 o ►u σι
ro CO 1—1
UJ 1 4^ σι
O 1
Π4
1
P) 1
H |
I—4 1
PJ
1
3 1
ü 1
l-i
H- 1
< |
ro 1
III. TÁBLÁZAT ι
I
I
I
I
I
I
I
I
- 49 Ahogy az a III. táblázatból kiderül, sok emlős gazdasejt rendelkezik a szükséges sejtmechanizmussal a találmány szerinti naszcensz proteinek szignálpeptidjének felismerésére és megfelelő szintézisére. Ezek a sejtek alkalmasak a transzlációt követő szükséges módosítások elvégzésére, például a glikozilezésre, gamma-karboxilezésre és béta-hidroxilezésre, ahogy ez megfigyelhető a vérplazmában jelenlevő humán C protein esetén. Ugyanakkor, ahogy azt az előzőekben jeleztük, az optimális humán C protein transzlációt követő processzálása adenovirussal transzformált sejtekben következik be. Az alábbiakban ismertetett nagyszámú vektor áll rendelkezésre ilyen eukarióta gazdasejtek transz formálására, azonban a példaként alább megadott specifikus vektorok nem korlátozzák a jelen találmányt.
A pSV2 tipusu vektorok az alábbi szegmensekből állnak: tartalmaznak egy definiált eukarióta transzkripciós egységet - promotert - (ep) tartalmazó SV40 genom szegmenst, egy köztes szekvenciát (IVS), továbbá egy poliadenil (pA) helyet. Az SV40 T-antigén hiányában a pSV2 tipusu plazmid vektorok úgy transzformálódnak az emlős és más eukarióta sejtekbe, hogy integrálódnak a gazdasejt kromoszómális dezoxi-ribonukleinsavába. Egy sorozat pSV2 tipusu plazmád vektort állítottak elő /lásd a Gluzman által szerkesztett könyvet: Eukaryotic Viral Vectors, kiadó: Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982)/, mint például a pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr, pSV2-hyg, továbbá a pSV2-béta-globin; ezekben a vektorokban a beépített gén transzkripcióját az SV40 promoter szabályozza. Ezek a vektorok alkalmasak a találmány szerinti kódoló szekvencia kifejezésére, és az alábbi törzsgyüjteményből szerezhetők be: American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, Maryland, vagy Northern Régiónál Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois.
A pSV2-dhfr plazmid (ATCC 37146) egy egér dihidrofolát reduktáz (dhfr) gént tartalmaz, amely az SV40 korai promoter szabályozása alatt áll. Megfelelő körülmények között a dhfr gén sokszorozódik, vagy beépül a gazdasejt kromoszómájába. Ez a sokszorozódás /lásd Schimke, Cell, 37, 705 - 713. (1984)/ a dhfr génnel szomszédos dezoxi-ribonukleinsav szekvenciákat is érinthet, mint például a találmány szerinti naszcensz humán C proteint kódoló szekvenciát, és igy bekövetkezhet a találmány szerinti C protein zimogénjeinek fokozott termelése. Az emlős és más eukarióta gazdasejtekben a naszcensz C protein és a C protein zimogének expressziójára felhasznált plazmidokban különböző promoterek lehetnek. A leírásban megadott eukarióta promoterek csak példaként szerepelnek, nem limitálják az oltalmi kört.
Az al'ábbi promotereket izolálhatjuk és módosíthatjuk a humán C protein zimogénjeinek eukarióta gazdasejtekben való rekombináns expressziójára: SV40 késői promoter vagy a Bucher és munkatársai által tárgyalt eukarióta promoterek /Nucl. Acids. Rés., 14 (24), 1009. (1986)/; használhatunk továbbá eukarióta géneket szabályozó promotereket, például az alábbi génekét: az ösztrogénnel indukálható csirke ovalbumin gén, az interferon gének, a glükokortikoiddal indukálható tirozin aminotranszferáz gén, a timidin-kináz gén és az adenovirus génjeinek nagyobb korai és késői promotereit. Az eukarióta promotereket tandem elrendeződésben is használhatjuk a találmány szerinti kódoló szekvencia expressziójának szabályozására. Ezenkívül nagyszámú retrovirus ismeretes, amelyek nagyszámú eukarióta gazdasejt frtőzésére képesek. A retrovirus dezoxi-ribonukleinsavának hosszú ismétlődő végei gyakran promoter-aktivitást határoznak meg, és igy a találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavban kódolt információk expressziójának szabályozására használhatók.
A pRSVcat (ATCC 37152) plazmid a Rous sarcoma vírus (RSV) hosszú végelhelyezkedésü ismétlődő szakaszát tartalmazza; ez a vírus csirke vagy más gazdasejtek fertőzésére képes. Az RSV terminális ismétlődő szekvenciákat a pRSVcat plazmid 0,76 kb nagyságú Ndel-HindlII restrikciós fragmenséről izolálhatjuk. Az RSV ismétlődő végszekvencián levő promoter /Gorman és munkatársai, P.N.A.S., 7 9 , 6777. (1982)/ előnyösen használható fel a találmány szerinti vektorokban is. A pMSVi plazmid (NRRL B-15929) az egér szarkóma vírus (MSV) hosszú ismétlődő végszekvenciáit tartalmazza, ez
a vírus egér vagy más sejteket fertőz. A találmány szerinti vektorokban ez az ismétlődő szekvencia promoterként használható fel. Az egér metallotionein (MMT) promoter szintén felhasználható eukarióta gazdasejtekben, és ezért a találmány szerinti vektorokban is előnyösen alkalmazható. Az MMT promoter a pdBPV-MMTneo plazmid (ATCC 37224) 15 kb nagyságú fragmensén található, ez kiindulási anyagként használható a találmány szerinti más plazmidok előállításakor.
A leírásban szemléltető jelleggel szereplő dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák és plazmidok számtalan módosítása és variációja lehetséges. A genetikai kód degeneráltsága például megengedi a polipeptidet kódoló régió teljes hosszában a báziscserét, ugyanez érvényes a transzlációs stop jelre. Ezeknek a változtatásoknak nincs következménye a kódolt polipeptid szekvenciára. Megfelelő, cserélhető szekvenciákat leírhatunk a humán C protein ismert aminosav vagy dezoxi-ribonukleinsav szekvenciájából kiindulva, és ezeket előállíthatjuk ismert szintetikus vagy helyspecifikus mutagenezis módszerekkel. A szintetikus módszereket lényegében Itakura és munkatársai /Science, 198, 1056. (1977)/és Crea és munkatársai /PNAS, USA, 7 5 , 5765.
(1978)/ eljárása szerint vitelezhetjük ki. Fentiek alapján a találmányt nem limitáljuk a példaként megadott dezoxi
-ribonukleinsav szekvenciákra és plazmidokra.
Miután a találmány szerinti egyik vektort eukarióta gazdasejtbe transzformáltuk, egy szelektálható fenotipus alapján transz formánsokat választhatunk ki. Ez a szelektálható fenotipus az expressziós vektorban jelenlevő szelektálható markerből eredhet, vagy a gazdasejtbe juttatott expressziós vektorral együtt transzformált, másik vektorban lehet jelen. Amiután a transz formánsokat szelektáltuk, előnyös, ha meghatározzuk, mely transz formánsok expresszálják az expressziós vektorban meghatározott, adott proteint a legnagyobb mennyiségben. Ez a mérés különösen fontos akkor, ha kotranszformációt végeztünk, ugyanis ekkor számtalan olyan transzformánst kapunk, amelyek csak a szelektálható markert hordozó plazmidot tartalmazzák, és nem hordozzák az expressziós vektort. Az alábbiakban ismertetett 3. és 4. példában megadott eljárás nemcsak arra alkalmas, hogy azonosítsuk az adott proteint expresszáló és szekretáló sejteket, de alkalmas arra is, hogy összehasonlítsuk az egyes vizsgált sejtek szekretált proteinjének mennyiségét. A megadott módszer lehetővé teszi az adott proteinből a legtöbbet termelő és szekretáló élő sejtek izolálását is.
A humán C protein zimogén alakjainak aktiválása kapcsán régóta jól ismert módszerek állnak rendelkezésünkre. A C protein egyedül trombinnal aktiválható, aktiválható trombin/trombomodulin komplexszel, a Russell-féle viperaméreggel, vagy több, más módon. A találmány szerinti zimogének különböző aktivációs fokának összehasonlítására trombint használtunk, 3 mmól kalcium-diklorid vagy 8 mmól etilén-diamino-tetraecetsav jelenlétében. A trombin aktivációt és a C protein-aktivitás mérését (amidolitikus és antikoaguláns hatás) Grinnell és munkatársai szerint végeztük /Biotechnology, 5, 1189 - 1192. (1987)/, ezt a módszert a leírásba referenciaként építjük be. A C protein aktiválásának másik módszere szerint immobilizált trombint használunk (Yan, 07/403,516 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; No. X-7307, 1989. szeptember 5.). A IV. táblázatban megadjuk az aktiválás relatív mértékeit.
IV. TÁBLÁZAT
Zimogén alak Trombin (3 mmól kalcium- -diklorid) Trombin (8 mmól EDTA)
Vad típus 1 1
F167 20 2
LIN 3 1,3
FLIN 30 3
FN ^4 50 5-6
se ^2 60 5-6
- 55 Az F167 zimogén a vad tipusu aktivációs peptidet tartalmazza, de a 209. helyen levő aminosav (aszparaginsav) fenil-alaninná cserélődött. Az F167 zimogént a 0323149 számú, 1989. julius 5-én közzétett európai szabadalmi leírásból ismerjük meg. Az F167, LIN és FLIN zimogén mutánsok funkcionális antikoaguláns aktivitása a vad tipusu kontrolihoz képest 100 - 109 %. Az FN és SC mutánsok aktivitásai a kontroll aktivitás kevesebb mint 10 %-át mutatják az alacsony amidolitikus aktivitásnak megfelelően.
Az aktivált C proteinnek jelentős antitrombotikus hatása van, ez az intravénás trombusok, az artériás trombusok keletkezésének és kiterjedésének meggátlásában jelentkezik, továbbá gátolja a Gram negatív baktériumok okozta fertőzések esetén fellépő halált, vagy a szervek sérülését, az endotoxémiát és a kiterjedt intravaszkuláris koagulációt. Állatkísérletekben a természetes C protein «
zimogénjének infúziójakor nem mutatkozott hatás a Gram negatív kórokozók okozta szeptikémia és sokk kezelésekor, nem mutatkozott hatás a kiterjedt intravaszkuláris koagulációban sem. Ezek a negatív eredmények azt jelzik, hogy a kiterjedt mikrovaszukuláris trombózisnak ebben a formájában, amikor jelentős trombin keletkezik, nem kellő mennyiségű trombomodul'in van jelen a vérben ahhoz, hogy a trombinnal komplexet képezzen, és aktiválja az infúzióval adagolt zimogént.
• *
Az aktivált C protein legnagyobb hátránya, hasonlóan más aktivált szerin proteázokhoz az, hogy fél élet időtartama (T 1/2) rövid a zimogén prekurzorokhoz képest. A T 1/2 kutyákban 11 percnek mutatkozott, majmokban 22 - 26 percet mértek. Összehasonlítva, a természetes C protein zimogén fél életideje emberben 6 óra. Az aktivált szerin proteázok, például a C protein aktivált alakja rövidebb biológiai fél élettartammal rendelkezik, mint a megfelelő zimogénjeik, ennek oka komplex és celluláris és humorális mechanizmusokra vezethető vissza. Az aktivált szerin proteázok komplexeket képeznek a plazmában normális körülmények között jelenlevő szerin proteáz inhibitorokkal is. Az aktivált C protein (APC) komplexei egy újonnan leirt APC inhibitorral, továbbá az alfa-2-makroglobulinnal komplexeket képeznek. Ugyanakkor, az inaktív zimogének, ideértve a találmány szerinti C protein zimogénjeit, a szerin proteáz inhibitorokkal nem reagálnak.
A találmány szerinti C protein zimogén alakjainak előnye az, hogy trombinnal jobban aktiválható, mint a természetes C protein zimogén, mivel kalciumionok jelenlétében ezen zimogének aktiválásához a trombin nem igényli a trombomodulinnal való komplexképzést. Ebből az következik, hogy ezek a C protein zimogének, adagolást követően, az intravaszkuláris trombinképződés helyén aktivizálódnak, azaz
- 57 mindenhol, ahol intravaszkuláris trombusképződés zajlik, így a C protein rekombináns zimogénjeit gyógyszerként használhatjuk, ezek a vegyületek a trombinképződés helyén aktivizálódnak. Mivel ezek a trombin-érzékeny zimogének zimogén alakban adagolhatok, nem képeznek komplexet a C protein inhibitoraival, és ezért a természetes C protein zimogénjeivel azonos fél életidővel rendelkeznek.
A találmány szerinti rekombináns C protein zimogének felhasználhatók több fontos betegség kifejlődésének meggátlására és kezelésére, ideértve az intravaszkuláris koagulációt, közte a mélyvénás trombózist, a tüdőembóliát, a perifériás artériás trombózist, a szívben végbemenő embóliát vagy a perifériás artériák embolitikus elváltozását, az akut miokardiális infarktust, a trombotikus sokkokat, a disseminált intravaszkuláris koagulációt. Ezeket a C protein-származékokat hatásosan használhatjuk fel azoknak a betegeknek a kezelésére, akik heterozigózisból eredő C protein-hiányban szenvednek, aminek következménye lehet a mélyvénás trombózis. A homozigózisból eredő C protein-hiányban szenvedő betegek purpura fulminans kezelésében is előnyösen alkalmazhatók a fenti származékok.
Kísérleti és klinikai adatok jelzik, hogy az ismert véralvadásgátlók, különösen a warfarin előnyösen alkalmazható egyes rákok kiterjedésének kezelésére, és ezek az anyagok gátolják vagy csökkentik a tumorok metasztázisos lézióit. Közismert, hogy gyulladásos hatások, mint például endotoxinok, a tumor nekrózis faktor és az interleukin 1 eltávolítja a trombomodulint az endotéliás sejtek felületéről, ami viszont mikrovaszkuláris és makrovaszkuláris trombózist eredményez. A találmány szerinti rekombináns C protein zimogénjei egy attraktív alternatívát képviselnek ezen klinikai szituációk konvencionális antikoagulánsokkal való kezelésének palettáján.
Az aktivált C protein látványos terápiás indikációját jelenti a mélyvénás trombózis és a tüdőembólia kezelése, ezt ma alacsony dózisu heparinokkal kezelik. A zimogének további előnye, hogy injekcióként adhatók, inkább, mint állandó intravénás infúziókként. Az aktivált C proteint folyamatos intravénás infúzióban kell adagolni, mivel ennek a proteinnek a biológiai fél élettartama rövid.
A találmány szerinti C protein zimogénjeinek infúziójakor kisebb valószínűséggel következnek be komplikációk. Ezért ezeket a zimogéneket a heparin helyett adagolhatjuk a tromboektómiával vagy embolektómiával összefüggő műtét előtti és utáni státuszokban, ezek a műtétek gyakran szükségesek akut artériás elváltozásokkor az amputáció megelőzésére. Mivel az aktivált C proteinhez • 4
- 59 képest fél életidőtartamuk hosszú, továbbá, mivel viszonylag könnyebben adagolhatok, ezeket a zimogéneket a szívből eredő artériás embóliák kezelésekor előnyösebben használhatjuk, mint az aktivált C proteint. Ezeket a zimogéneket a kialakult mélyvénás trombózis és tüdőembólia kezelésekor alkalmazott dózisban hosszú időn át adagolhatjuk a szivembólia megelőzésére és gátlására.
A találmány szerinti C protein zimogének ugyancsak felhasználhatók a perifériás artériákban megjelenő trombusok miatt fellépő embólia kezelésére, amely tüneteket a jelenleg használt szerekkel nem lehet kellő mértékben kezelni, ideértve a vérlemezkék funkcióját szuppresszáló gyógyszereket, az orális antikoagulánsokat vagy ezek kombinációit. Mint a szivembólia esetén, ezeket a zimogéneket hosszú időn át adagolhatjuk a szivartériákban keletkező trombusok miatt fellépő embólia gátlására, embóliás sokkokban.
A találmány szerinti C protein zimogénjeit előnyösen használhatjuk trombotikus vérzésekben. Manapság az agyvérzést általában nem kezelik konvencionális antikoagulánsokkal. Az agyvérzések kezelése heparinnal vagy orálisan adagolható antikoagulánsokkal, bár esetenként sikeres, azt a kockázatot hordozza magában, hogy az agy sérült területeire károsan hat, és ezzel a vérzéssel « ·
- 60 együttjáró neurológiai sérüléseket fokozza. Mivel a találmány szerinti zimogének kismértékben okoznak komplikációkat, továbbá, mert hatásuk szelektív, agyvérzést szenvedett betegeknek adagolhatok, és igen hatásosan alkalmazhatók artériás trombusok lokális kiterjedésének gátlására, ezzel pedig csökkentjük a vérzésből adódó neurológiai elváltozásokat .
A találmány szerinti zimogéneket előnyösen használhatjuk az akut miokardiális infarktus kezelésére is, ugyanis aktiválva pro-fibrinolitikus tulajdonságokkal rendelkeznek. A zimogének adhatók szöveti plazminogén aktivátorral együtt a miokardiális infarktus akut fázisaiban. Miután a koronáriás trombus szétoszlott, a zimogéneket több napon át még tovább adagolhatjuk, az akut miokardiális reinfarktus gátlására.
A C protein aktivált alakja felhasznáható a disszeminált intravaszkuláris koaguláció kezelésére. A heparinijes az orális antikoagulánsokat a disszeminált intravaszkuláris koagulációs tüneteket mutató betegeknek kiterjedt klinikai kísérletekben adagolták, az eredmények azonban kétségesek. Ebben az állapotban a C protein aktivált alakja és a találmány szerinti zimogén alakok a konvencionális antikoagulánsokkal szemben előnyökkel rendelkeznek.
• · · · > <
- 61 Ahogy azt a fentiekben megadtuk, állatkísérletekben bebizonyosodott, hogy a C protein zimogénje a Gram negatív mikroorganizmusok okozta fertőzések és a disszeminált intravaszkuláris koaguláció állapotában nem hatásos a halál és az egyes szervek sérüléseinek kezelésekor. Ezzel ellentétben, a találmány szerinti C protein zimogének, mivel igen érzékenyek a trombin-aktiválásra, hatásosan alkalmazhatók a diszszeminált intravaszkuláris koaguláció kezelésére.
A terjedő malignus tumorok kezelésekor használják az ismert antikoaguláns hatású gyógyszereket, különösen a warfarint. Sok tumor sejt olyan anyagokat termel, amelyek hatnak a koagulációs rendszer aktivációs mechanizmusára, és igy lokális fibrin-lerakódások jelentkeznek. Ezeken a fibrin-lerakódásokon a ráksejtek osztódnak, és metasztázisos állapotot okoznak. Ugyanakkor, a warfarint vagy más konvencionális antikoagulánst nem adagolhatunk intenzív és hatásos kemoterápiában, mivel ez a terápia a vörösvérsejtek számában jelentős esést okoz, és a trombocitopénia warfarin-terápiával együtt a pácienst nehéz helyzetbe hozhatja. A találmány szerinti C protein-származékok, hasonlóan a C protein aktivált alakjaihoz, szelektívebben hatnak a konvencionális antikoagulánsoknál, és sokkal jobb terápiás indexszel rendelkeznek, mint a heparin vagy más, orális antikoagulánsok. Ezért relatíve biztonságosabban adagolhatók trombocitopéniás pácienseknek, igy lehetővé válik a kiterjedő rákban szenvedő betegek kezelése hatásos és intenzív kemoterápia mellett a találmány szerinti C protein zimogénjeivel.
A találmány szerinti zimogének és ezek aktivált párjai ismert módszerekkel formulázhatók gyógyszerészeti szempontból elfogadható készítmények előállítására. A találmány szerinti humán C protein zimogének vagy aktivált C protein gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyagokkal kombinálható. Előnyös vivőanyagokat és az ezekből készült készítményeket, ideértve más, humán proteineket is, például a humán szérum albumint, például Remington's Pharmaceutical Sciences 16. kiadásából ismerhetünk meg (Mack Publishing Co., 1980, Osol és munkatársai szerkesztésében). Ezt a szakirodalmat a leírásba referenciaként építjük be. A készítmények hatásos mennyiségű C protein zimogént vagy aktivált C protein zimogént tartalmaznak, megfelelő mennyiségű vivőanyaggal együtt, a gyógyszerészeti szempontból elfogadható és hatásosan adagolható készítményekben. A C protein készítmények parenterálisan adagolhatok, vagy bármely más, olyan módon, amely a hatásos vegyületet hatásos alakban a véráramba juttatja.
Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti zimogének-et felhasználhatjuk aktivált C proteinek in vitro előállítására is. Bár eukarióta sejtekben történő aktivált
C protein direkt előállítása rekombináns módszerekkel ismert, ezek a módszerek azt igénylik, hogy az aktivált C protein hosszú időn át a tenyészetben maradjon. Mivel a C protein aktivált alakja viszonylag instabil, ezek a direkt expressziós módszerek kismennyiségü aktivált C protein előállítását teszik lehetővé. A találmány szerinti zimogének ezzel szemben a trombinnal egymagában aktiválhatok, még kalciumionok jelenlétében is, és igy jelentős előnnyel rendelkeznek az aktivált C protein előállítása kapcsán az ismert módszerekkel szemben.
Az alábbiakban szemléltető példákban adjuk meg a reprezentatív vegyületek, vektorok és transz formánsok előállítását, anélkül azonban, hogy ezzel a találmány oltalmi körét szűkítenénk.
- 64 1. példa
A pLPC-FLIN plazmád izolálása
Az E. coli K12 AG1/pLPC-FLIN fagyasztva szárított tenyészetét a Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604 törzsgyüjteményéből kaptuk
NRRL B-18616 sorszámon. A fagyasztva szárított készítményt ml alábbi összetételű LB táptalajban szuszpendáljuk:
Bacto-tripton 10 g
Bacto-élesztőkivonat 5 g nátrium-klorid 10 g víz 1 1.
A táptalaj pH-ját 7,5-re állítjuk be. A tenyészetet 2 órán át 32°C hőmérsékleten inkubáljuk, ezalatt a tenyészethez ml-enként 50/Ug ampicillint adagolunk, majd egy éjszakán át 37°C hőmérsékleten folytatjuk a tenyésztést.
Az egy éjszakán át inkubált tenyészet egy kis részét LB agarra szélesztjük, az agar az LB táptalajjal szó nos Összetételű, de 15 g/1 Bacto-agart is tartalmaz. A táp talajhoz 50 ^ug/ml ampicillint is adagolunk. A különálló telepek zset. A cillint közül izoláljuk az E. coli K12 AG1/pLPC-FLIN tor kiválasztott telepet 10 ml, ml-enként 50 ^ug ampi tartalmazó LB táptalajban tenyésztjük egy éjszakán át, 37°C hőmérsékleten, erőteljes rázás közben. 10 ml tenyé szetet 500 ml, ml-enként 50 ^ug/ml ampicillint tartalmazó
LB táptalajhoz adunk, majd erőteljes rázás közben 37°C hőmérsékleten tenyésztünk addig, mig a tenyészet eléri a stacioner fázist.
Az alábbiakat Maniatis és munkatársai szerint végezzük /Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)/.
tenyészetből centrifugálást
-vei. A felüluszót
A jük a sejteket, a percen át, 4000 g déket 100 ml jéghideg, mossuk: nátrium-klórid trisz-hidroklorid, pH = 7,8 EDTA alábbi
A mosást követően a sejteket 10 ml oldat az pendáljuk. Ennek az oldatnak glükóz trisz-hidroklorid, EDTA
Az oldatot 5 mg/ml szobahőmérsékleten adunk a lizozimmal következő: nátrium-hidroxid nátrium-lauril-szulfát pH = 8,0 lizozimmal hagyjuk kezelt centrifugálással összegyüjt4°C hőmérsékleten végezzük kiöntjük. A sejtüleösszetételü STE pufferral
Ο,1 mól mmól mmól.
1-ben újra szuszösszetétele a következő:
mmól mmól mmól.
egészítjük ki, és 10 percen át
Ezután 20 ml oldat 2-t Az oldat összetétele a
0,2 n
%.
állni .
sejtekhez.
4 . * >··· ···*
4 4 * *
- 66 A szuszpenziót enyhén, a kémcsövet forgatva összerázzuk. Ezután 10 percen át jégfürdőben tartjuk a keveréket .
A lizált sejtkeverékhez 15 ml jéghideg, mólos kálium-acetát-oldatot (pH = 4,8) adunk, és a kémcső forgatásával összekeverjük az elegyet. 10 percen át jégfürdőben inkubálunk. A fentiekben megadott 5 mólos kálium-acetát-oldatot úgy állítjuk elő, hogy 11,5 ml jégecetet adunk 28,5 ml vízhez és 60 ml 5 mólos kálium-acetáthoz.
Az igy kapott oldat a káliumra számolva 3 mólos, és az acetátra számolva pedig 5 mólos.
A lizált sejteket tartalmazó elegyet Beckman SW27 rotorban (vagy ezzel egyenértékűben) centrifugáljuk, percenkénti 20.000 fordulatszámmal, 20 percen át, 4°C hőmérsékleten. A sejtek dezoxi-ribonukleinsava és a sejttörmelék a centrifugacső alján gyűlik össze. 36 ml felüluszót elkülönítünk, 0,6 térfogat izopropanolt adunk hozzá, összekeverjük az elegyet, és 15 percen át szobahőmérsékleten hagyjuk állni. A plazmid dezoxi-ribonukleinsav összegyűjtésére 30 percen át szobahőmérsékleten centrifugálunk, 12.000 g-vel. A felüluszót kiöntjük, és a dezoxi-ribonukleinsav üledéket 70 %-os, vizes etanollal mossuk, szobahőmérsékleten. Az etanolos mosófolyadékot kiöntjük, és a csapadékot csökkentett nyomású térben szárítjuk. A száraz anyagot 8 ml alábbi összetételű TE pufferban szuszpendáljuk:
trisz-hidroklorid, pH = 8,0 mmól
EDTA 1 mmól.
A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 8 g cézium-kloridot adunk.
- 10 ml cézium-klorid dezoxi-ribonukleinsav-oldat minde gyikéhez 10 mg/ml-es oldatból 0,8 ml vizes etidium-bromid-oldatot adagolunk. Az oldat végsürüsége cézium-kloridra számítva 1,55 g/ml, az etidium-bromid végkoncentrációja peug/ml.
Az oldatot Beckman Type 50 centrifugacsőbe öntjük, a cső tetejére paraffinolajat cseppentünk, a csövet leforrasztjuk, majd ezután 24 órán át 20°C hőmérsékleten centrifugálunk, 45.000 percenkénti fordulatszámmal. A centrifugálást követően közönséges fényben két dezoxi-ribonukleinsav csikót látunk a csőben. A centrifugacső tetejének levágása után az alább elhelyezkedő dezoxi-ribonukleinsav csikót injekcióstüvel eltávolítjuk úgy, hogy az injekcióstüt a centrifugacső oldalába szúrjuk be.
Az etidium-bromid eltávolítására vízzel telített 1-butanollal többször extrahálunk. A cézium-kloridot
TE pufferral szemben végzett dialízissel távolitjuk el.
A dezoxi-ribonukleinsav kicsapására pufferozott fenollal, és ezután kloroformmal extrahálunk, majd a kicsapódott terméket 70 %-os, vizes etanollal mossuk, amiután megszáritjuk.
Ily módon 1 mg pLPC-FLIN plazmid dezoxi-ribonukleinsavat ka-
púnk, amit 4°C hőmérsékleten TE pufferban tárolunk, 1 ug/^ul
töménységben. A pLPC-FLIN plazmád restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 5. ábrán mutatjuk be. A megfelelő, a megadott NRRL sorszámon letétbe helyezett törzsekből a fentihez hasonló módon előállítjuk a pLPC-FN, pLPC-SC, pLPC-LIN és pLPC-N plazmidokat is. Ezeknek a plazmidoknak a restrikciós helyeit és funkcionális térképét a mellékelt ábrákon adjuk meg.
2. példa
A pGT-FLIN plazmid előállítása
A humán C protein zimogének nagy koncentrációban való előállítására a pLPC-N, pLPC-FN, pLPC-SC, pLPC-LIN és pLPC-FLIN plazmidokat közvetlenül eukarióta gazdasejtekbe (előnyösen 293 jelű sejtekbe) transzformálhatjuk. Még magasabb értékű expresszió és szekréció érhető el, abban az esetben, ha a mutáns zimogént kódoló gént olyan vektor dezoxi-ribonukleinsavba építjük be, amelyben a gén expresszióját a GBMT transzkripciós egység irányítja.
A pGTC plazmid ilyen vektor, amelyben a vad tipusu humán C protein zimogénjének génjét a GBMT transzkripciós egység vezérli. A vektorból a vad tipusu C proteint meghatározó gén könnyen kihasítható egy Bell restrikciós fragménsen, és egy másik Bell restrikciós fragmensen a találmány szerinti bármely gén beépíthető a vektorba. A plazmid dezoxi-ribonukleinsav Bell enzimmel történő emésztését az 5'-GATC-3' szekvenciában levő adenin metileződése gátolja. Ezért a pGTC plazmidot olyan E. coli sejtekből izoláljuk, amelyekben nincs meg az adenin metiláz enzim, azaz az úgynevezett dam gén által meghatározott fehérje, ami az 5'-GATC-3' szekvenciában levő adenint metilezi. Az E. coli K12 GM48 (NRRL B-15725) törzsben nincs meg a funkcionális dam metiláz, és igy előnyösen használhatjuk a plazmid-származékok előállítása során kiindulási dezoxi-ribonukleinsavként használt pGTC plazmid izolálására.
Az E. coli K12 GM48 sejteket tenyésztjük, transz formációra kompetenssé tesszük, és a pGTC plazmidot az 1. példában megadottak szerint eljárva transzformáljuk a sejtekbe. A transzformált sejteket ampicillint tartalmazó L-agarra szélesztjük, az E. coli K12 GM48/pGTC transz formánsok egyik telepét az 1. példában megadottak szerint eljárva felhasználjuk a pGTC plazmid dezoxi-ribonukleinsav előállítására. 1 mg pGTC plazmid dezoxi-ribonukleinsavat állítunk elő, és 1 ml TE pufferban szuszpendáljuk. Hasonlóképpen, Bell enzimmel való emésztést megengedő módon izoláljuk a pGT-h és pGT-d plazmidokat is. A pGT-d plazmid hordozza a GBMT transzkripciós egységet úgy, hogy a Bell helyen gént nem tartalmaz, igy bármely gént könnyen beépíthetünk.
• · · ·
- 70 A pGT-d plazmid tartalmazza az egér dhfr génjét, ezért a metotrexát rezisztens fenotipus alapján bármely transzformánst szelektálhatunk és szaporíthatunk. A pGT-h plazmid tartalmazza a GBMT transzkripciós egységet, tartalmazza egy gén beépítésére előnyösen használható Bell helyet, és hordozza a higromicin rezisztenciát meghatározó gént is. Az E. coli K12 AG1 törzsek hordozzák a fenti plazmidokat, és 1990. január 18-án NRRL sorszámon letétbe helyeztük őket. A törzsek az alábbi letéti számmal rendelkeznek:
E. coli K12 AGl/pGT-d: NRRL B-18591,
E. coli K12 AGl/pGT-h: NRRL B-18592,
E..CO1Í K12 AGl/pGTC: NRRL B-18593.
A plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt ábrákon adjuk meg.
Az 1. példában megadottak szerint előállított pLPC-FLIN plazmid dezoxi-ribonukleinsav 10 ^ul-ét 20 ^ul x Bell restrikciós pufferban oldunk, a puffer összetétele a következő:
trisz-hidroklorid, pH = 7,4 100 mmól kálium-klorid 1,5 mól magnézium-diklorid 100 mmól ditio-treitol mmól.
Az oldathoz
20/Ul mg/ml-es koncentrációjú borjú szérum albumint és 5
Bell restrikciós enzimet adunk (ez 50 egységnek felel meg, ahogy azt a Bethesda Research Laboratories őén esetben az
145 /U1 vízzel órán át 37°C /BRL/ megadja). A leírásban ismertetett kísérletek során minettől a cégtől vásárolt enzimeket használjuk, egészítjük ki a reakcióelegyet, majd ezután hőmérsékleten inkubáljuk. A leírásban ismer tetett összes restrikciós enzimes reakciót fenollal állítjuk le, majd kloroformmal extraháljuk a reakcióelegyet, amiután kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, etanollal mossuk, és TE pufferban szuszpendáljuk az igy kapott dezoxi-ribonukleinsavat. Az emésztett dezoxi-ribonukleinsavat ezután 1 % agarózt tartalmazó gélen elektroforézissel vizsgáljuk. Esetünkben a mutáns gént tartalmazó, 1400 bázispárból álló restrikciós fragmenst BioRad Prep-A-Gene Kit-et használva tisztítjuk, a tisztítást az előállító utasításai szerint végezve.
Ezután az 1. példában megadott módon, az
E. coli K12 AGl/pGTC (NRRL B-18593 letéti számú) törzsből izoláljuk a pGTC plazmidot, amit a 2. példában megadottak szerint GM48 sejtekből állítottunk elő. Ezután a fentiek szerint eljárva Bell restrikciós enzimmel emésztjük a pGTC plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, a nagyobb vektor fragmenst izoláljuk, és tisztítjuk. A vektor fragmenst 90 ^ul térfogatú, 8,0 pH-ju TE pufferban vesszük fel, ezután 10 ^ul
• · · · *
- 72 (0,05 egység) alkalikus foszfatázt adagolunk a vektor dezoxi-ribonukleinsav végeinek defoszforilezésére. A reakcióelegyet 30 percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 10/Ul 500 mólos EGTA oldatot adagolunk, és 45 percen át 65°C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, az enzim inaktiválására. Ezt követően fenollal és kloroformmal extraháljuk a reakcióelegyet, etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, amit mosunk, és 20/Ul vizben szuszpendálunk.
Bell enzimmel emésztett vektor fragmenst keverünk 1 ^ul (100 ng) 1400 bázispárból álló, a pLPC-FLIN plazmádból származó Bell restrikciós fragmenssel, /U1 10 X ligáz pufferral és l^ul T4 dezoxi-ribonukleinsav trisz-hidroklorid, pH = 7,6 ma gnézium-diklórid ditio-treitol borjú szérum albumin
A reakcióelegyet 12 - 16 órán báljuk. A reakció után olyan
0,5 mól
100 mmól
100 mmól
500 /Ug/ml.
át 16°C hőmérsékleten inkulazmidokat kapunk, amelyek a mutáns zimogén gént a GBMT transzkripciós egységhez képest megfelelő orientációban helyezkedik el; de kapunk olyan plazmidokat is, ahol a gén fordított irányú. A gént megfe lelő transzkripciós orientációban tartalmazó plazmidokat pGT-FLIN jellel jelöljük.
- 73 Fagyasztott, kompetens E. coli K12 AG1 sej100 /U1 kompetens sejtszuszpenzióval elegyítünk, majd 1 órán át jégfürdőben inkubáljuk a sejtek és a dezoxi-ribonukleinsav elegyet. Ezután 45 másodpercen át 42°C hőmérsékleten kezeljük
A sejt-dezoxi-ribonukleinsav elegyet ezután 1,0 ml LB táp hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészetet. 100 ul térfogatú alikvotokat ampicillint tartalmazó LB-agar táptalajra szélesztünk, és 37°C hőmérsékleten addig tenyésztünk, mig a lemezeken telepek jelennek meg.
Az egyes telepeket külön-külön tenyésztjük, és az egyes telepekből származó plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat restrikciós enzimes analízissel vizsgáljuk. A plazmid dezoxi-ribonukleinsav izolálását kis térfogatban végezzük, az 1. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különb séggel, hogy a cézium-kloridos lépést kihagyjuk mindaddig, mig a megfelelő E. coli K12 AGl/pGT-FLIN transz formánsokat azonosítjuk. Ekkor nagyléptékű, gondosan tisztított plazmid izolálást végzünk. Az 1. és a 2. példában megadottak szerint eljárva, bármely mutáns zimogén gét könnyen klónozhatunk bármely GBMT szekvenciát hordozó vektorba.
3. példa
Az adenovirussal transz formált humán 293 jelű embrió vese sejtvonal és az adenovirussal transz formált sziriai hörcsög
AV12 sejtvonal pGT-FLIN plazmid transzformánsainak előállí tása
Humán embrió 293 jelű vesesejtvonalat az
American Type Culture Collection törzsgyüjteményéből szerezhetünk be ATCC CRL 1573 letéti szám alatt. Az adenovirussal transz formált sziriai AV12 hörcsög sejtvonal szintén beszerezhető innen ATCC CRL 9595 sorszámon. Az alábbiakban megadott transzformációs eljárást a 293 jelű sejtvonalra adjuk meg, azonban az eljárás általáhos érvényű a legtöbb eukarióta sejtvonalra, ideértve az AV12 sejteket is, érvényes továbbá a találmány szerinti összes expressziós vektorra.
A 293 jelű sejtvonalat az ATCC törzsgyüjte2 ményből kaptuk (CRL 1573), 25 mm nagyságú tenyésztőedényben, amely egy átlátszatlan rétegben tartalmazott 5,5 x 10θ sejtet Eagle minimál táptalajon (Gibco) 10 % hőinaktivált lószérummal. A tenyésztőedényt 37°C hőmérsékleten tartjuk, és a táptalajt hetente kétszer cseréljük. A táptalaj DMEM (Gibco) komponensből áll nel és 10 ^ug/ml % borjú szérummal, 50
AquaMEPHYTO
fitonadion ug/ml gentamicinvitaminnal kiegészítve (Merek Sharp és Dohme, Merek and Co., Inc.,
West Point, PA 19486). A sejteket a táptalaj eltávolításával,
Hank sóoldatával (Gibco) mosva tenyésztjük, 1-2 percre
0,25 %, 0,2 g/1 etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó tripszinnel kezeljük. A sejteket friss táptalajjal mossuk, levegőztetjük, és 1 : 5 vagy 1 : 10 arányban átoltva, uj tenyészedényekre juttatjuk.
A transz formáció előtt egy nappal a sejtekg bői 0,7 x 10 darabot 100 mm-es tenyésztőedénybe juttatunk. Vízben oldott steril, etanollal kicsapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavat használunk a 2X dezoxi-ribonukleinsav-kalcium-diklorid-oldat elkészítésére amely 25
transzformálandó plazmid dezoxi-ribonukleinsavat és 250 mmól kalcium-dikloridot tartalmaz. 2X HBSS oldatot állítunk elő úgy, hogy 280 mmól nátrium-kloridot, 50 mmól Hepes-t és 1,5 mmól nátrium-foszfátot oldunk, az oldat pH-ját 7,05 - 7,15-re állítjuk be. A 2X dezoxi-ribonukleinsav-kalcium-diklorid-oldatot azonos térfogatú steril, 2X HBSS elegyhez adjuk cseppenként. 1 ml-es műanyag, steril pipettát (gyapot dugóval elzárva) merítünk a 2X HBSS elegyet tartalmazó csőbe, majd buborékoltatjuk az elegyet a dezoxi-ribonukleinsav adagolása közben. A kalcium-foszfát-dezoxi-ribonukleinsav csapadékot keverés nélkül hagyjuk kialakulni, szobahőmérsékleten, 30 - 45 percen át.
A csapadékot műanyag pipettával pipettázva enyhén kevergetjük, és egy lemezre 1 ml csapadékot adunk, közvetlenül a recipiens sejteket fedő 10 ml tápoldathoz.
C hőmérsékleten 4 órán át inkubálunk, majd friss tápoldattal cseréljük ki a régit, és a sejteket további 72 órán át inkubáljuk, a szelektív nyomás biztosítása előtt. Az eukarióta sejtekben működő, szelektálható markert nem tartalmazó plazmidok esetén, mint például a pGT-FLIN plazmidnál, a transz formáció során plazmid-keveréket használunk: használunk egy szelektálható markert nem tartalmazó, jelen találmány szerinti expressziós vektort és egy olyan expressziós vektor dezoxi-ribonukleinsavat, amely eukarióta sejtekben funkcionáló szelektálható markert hordoz. Ilyen együttes transzformációs rendszerekben használható vektorok jól ismertek, ilyen például a pSV2-dhfr plazmid (ATCC 37146), a pSV2-neo plazmid (ATCC 37149), a pSV2-gpt (ATCC 37145) és a pSV2-hyg plazmid (NRRL B-18039). A pSV2-hyg plazmid eukarióta sejtekben kifejeződő higromicin B rezisztenciát hordoz. Ez a kotranszformációs technika lehetővé teszi azoknak a sejteknek a szelekcióját, amely a szelektálható markert hordozó plazmidot tartalmazzák. Az igy kiválasztott sejteket tovább vizsgáljuk azoknak a sejteknek a kiválasztására, amely mindkét transzformálandó plazmidot hordozza. A találmány oltalmi köréhez tartoznak természetesen azok az expressziós vektorok is, amelyek eukarióta sejtekben működő szelektálható markert tartalmaznak, és ezért nem igénylik a kotranszfor mációs technikát.
• ·
Abban az esetben, ha higromicin rezisztenciát meghatározó gént hordozó plazmáddal transz formálunk, mint például a pGT-FLIN-h plazmádnál, a tápoldatba 200 /Ug/ml végkoncentrációban higromicin B antibiotikumot adagolunk. A sejteket ezután 2-4 héten át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, a tápoldatot 3-4 naponként cseréljük. A kapott, higromicinre rezisztens kolóniákat egyenként tenyésztőedényekbe juttatjuk, jellemzés céljából.
A pSV2-neo plazmid neomicinre (a neomicin helyett használható G418 antibiotikumra is) rezisztenciát biztositó gént hordoz, a G418 antibiotikumokkal szemben rezisztens kolóniák szelektálását a higromicin rezisztens sejtek kiválasztása kapcsán fentiekben megadott eljárás alapján végezzük, azzal a különbséggel, hogy G418 antibiotikumot adagolunk 400 végkoncentrációban.
A dihidrofolát reduktáz (dhfr) gén vagy a dhfr gén metotrexát rezisztenciát meghatározó származéka (dhfr-mtx) szelektálható marker akkor, ha dhfr-hiányos sejtvonalakba juttatjuk a gént vagy a gént hordozó plazmidot, és ezután metotrexátot használunk a plazmid példányszámának növelésére. Ez az eljárás az irodalomban részletesen le van Írva. A 293 jelű sejtvonal dhfr-pozitiv, igy a dhfr gént hordozó plazmidokkal transzformált sejtek dhfr-pozitiv fenotipusra, azaz hipoxantin és timin hiányban « ·
- 78 való növekedésképességre nem szelektálhatok. Azokat a sejtvonalakat, amelyek funkcionális dhfr gént nem tartalmaznak, és amelyeket dhfr gént tartalmazó plazmidokkal transzformáltunk, dhfr-pozitiv fenotipusra szelektálhatunk. Bár a dhfr karakter használata szelekcióra és plazmid-sokszorositásra nem teljesen ismert, az irodalomból nyert bizonyítékok azt sugallják, hogy a dhfr karakter dhfr termelő sejtekben használható szelektálható markerként és génamplifikációra. A találmány szerinti eljárást nem limitáljuk az expressziós vektorokban használt, szelektálható markerekre. A fentieken kívül az alábbi markerek használhatók még: metallo-tionein gének, adenozin dezamináz gének vagy többszörös rezisztenciát biztosító dezoxi-ribonukleinsav szakaszok, például a P-glikoprotein gén.
A 293 jelű és az AV12 sejtvonal pGT-FLIN plazmáddal és higromicin rezisztenciát hordozó gént tartalmazó vektorral történő együttes transzformációja és a transzformációt követő higromicin rezisztencia alapján kivitelezett szelekciót követően sok transzformánst kapunk. (Más transzformánsokat kapunk akkor, ha a pSV2-neo plazmidot használjuk, és G418 antibiotikumra való rezisztenciára szelektálunk.)
Az ebben a példában leirt eljárás a találmány szerinti összes humán C protein zimogén terméket meghatározó plazmáddal használható.
4. példa
Humán C protein zimogén mutánsokat szekretáló sejtek szelektálása
A 3. példában megadottak szerint kapott higro2 micin rezisztens transzformánsokat 100 mm nagyságú szövettenyésztő edényben növesztjük addig, mig a sejtek sűrűsége tenyésztőedényenként eléri a többszáz sejtklónt. Dekantáljuk a tápfolyadékot, és a sejteket kétszer 5 ml Hank sóoldattal (Gibco) mossuk. Ezután 0,45 % agart (Sigma Type 4 agaróz, katalógusszám: A3643, Sigma Chemical Co.,
P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178) steril oldatot készítünk úgy, hogy 1 ml 1,8 % agart tartalmazó 47°C hőmérsékletű oldatot keverünk 3 ml Dulbecco módosított Eagle (DME) sóoldattal (Gibco), amelynek a hőmérsékletét 37°C-ra állítottuk be. 2 ml ilyen, 0,45 % agart tartalmazó oldattal rétegezzük a sejttenyészetet.
Nitrocellulóz szűrőket (Schleicher és Schueel, Inc., Keene, NH 03431) forralunk vízben, és ezután 2 órán át autoklávozzuk a nedvesitőszer eltávolítására, amely a sejtekre nézve toxikus. Ezután az agarréteg tetejére helyezzük a szűrőket, és a levegőbuborékok eltávolítása után a lemezeket 1-3 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten. A szűrőket előzőleg bejelöljük úgy, hogy a tenyészeten való elhelyezkedést utólag felismerhessük, ily módon a telepeket azonosíthatjuk. Az inkubáció után leemeljük a szűrőket, és az alábbi összetételű PBS elegybe helyezzük: trisz-hidroklorid, pH = 7,2 50 mmól nátrium-klorid 150 mmól.
A szűrők analízise alatt életben tartjuk a lemezeken levő sejteket, ezt úgy érjük el, hogy a tenyészetet 8 ml alábbi összetételű eleggyel rétegezzük felül:
.2 ml, 1,8 %-os, 47°C-os agar-oldat, ml DME só-elegy (37°C hőmérsékletű), és ml, 20 % borjú szérumot tartalmazó, 37°C hőmérsékletű DME só-oldat.
A tenyészetet ezután 37°C hőmérsékletű inkubátorba helyezzük .
A szűrők mosását és a velük végzett kísérleteket rázóasztalon végezzük. A szűrőket először 5 % tejet tartalmazó PBS elegyben blokkoljuk úgy, hogy szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 5 percenként öblítve négyszer PBS oldattal öblítjük azokat. Ezután 10 /Ug/ml biotinilezett kecske anti-humán C protein poliklónozott antitestet adagolunk a szűrőkre 2,5 %-os borjú szérum albumin oldatban (a mennyiséget úgy választjuk meg, hogy az elegy elfedje a szűrőt), amiután 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubálunk.
A C proteinnel szembeni antitestek előállításához szükséges C protein tisztítását Kisiel szerint végezzük /J. Clin. Invest. , 6 4 , 761 (1979)/. A poliklónozott antitesteket Kábát szerint állíthatjuk elő /Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, Holt, Rhinehart és Winston kiadása, 1968/. A monoklónozott antitesteket, ezeket mérésre is felhasználhatjuk, Kohler és Milstein szerint állíthatjuk elő /Natúré, 256, 495. (1975); 4,696,895 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 205046 számú európai szabadalmi leírás; Laurel és munkatársai, FEBS, 191(1), 75. (1985); Suzuki és munkatársai, J. Biochem. , 97 , 127 - 138 . (1985);
138222 számú európai szabadalmi leírás/. A méréshez használt avidin D-t és a biotinilezett lóretek peroxidázt
TM (HRP) Vectastain kitből szerezzük be (Vector Laboratories, Inc., 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010). A biotint is a Vector Laboratories-tői vásároltuk.
A szűrőket négyszer PBS eleggyel öblítjük 4°C hőmérsékleten. Ezután előállítjuk az avidin D-t és a biotinilezett retek peroxidáz reakcióelegyet, és hozzáadjuk a szűrőkhöz az előállító instrukciói szerint (Vectastain ; Vector Laboratories). A szűrőket a HRP-hez kötött avidin D-vel együtt inkubáljuk 4°C hőmérsékleten, 1 órán át (hosszabb inkubációs időt, például egy éjszakán át tartó reakcióidőt is használhatunk akkor, ha kevés protein szekretálódott). A reakció lezajlása után a szűrőket négyszer PBS eleggyel mossuk 4°C hőmérsékleten, négy alkalommal .
Az indikátor szín szűrőn történő előhívásához 30 mg HRP szinelőhivó reagenst (4-klór-l-naftol, Sigma) oldunk jéghideg, 100 %-os metanolban, majd az oldatot hozzáadjuk 50 ml PBS és 30 ^ul 30 %-os hidrogén-peroxid elegyéhez. Ezt az elegyet hozzáadjuk a nitrocellulóz szűrőkhöz, majd addig inkubáljuk azokat szobahőmérsékleten, mig a szín megjelenik. A találmány szerinti legtöbb humán C proteint szekretáló kolóniák nemcsak arról ismerhetők fel, hogy a szűrőkön az elszíneződésük korán jelentkezik, hanem arról is, hogy a kolóniák színe sötétebb.
A szűrők előhívása után megállapítjuk, hogy az eredeti tenyésztőedényekben mely kolóniák azok, amelyek a szűrőn foltot adtak. A legtöbb, találmány szerinti humán C protein zimogént szekretáló kolóniát kiválasztjuk, és felhasználjuk a zimogén termelésére.
- 83 A témában jártas szakemberek tudják, hogy a fenti mérés csak szemlélteti az erősen szekretáló sejtvonalak azonosítását. A fentin kívül számtalan módszer használható sikeresen, igy például olyan kettős antitest reakciót is használhatunk, amelynek során a biotinilezett kecske anti C protein antitestet helyettesítjük egy kecske C anti-protein antitesttel (IgG), és biotinilezett anti kecske IgG antitesttel.
A zimogén mutánsokat tisztíthatjuk a sejttenyészetből. A rekombináns terméket expresszáló sejtekről eltávolítjuk a felüluszót, és Pharmacia Fastflow-Q oszlopon tisztítjuk. Úgy járunk el, hogy 1 ml gyantát 20 mmól trisz-hidroklorid (pH = 7,4), 0,15 mól nátrium-klorid, 5 mmól etilén-diamin-tetraecetsav és 4 mmól benzamidin elegyével· egyensúlyozunk ki. A tenyészet felüluszójának pH-ját 7,4-re állítjuk be 8,0 pH-ju trisz-hidroklorid-oldat adagolásával, majd 5 mmól etilén-diamin-tetraecetsavat és 4 mmól benzamidint adagolunk. A felüluszót ezután ráöntjük a gyanta tetejére, és 3 oszlop-térfogatnyi trisz-hidroklorid (pH = 7,4) és 0,15 mól nátrium-klorid elegyével mossuk. A rekombináns terméket az alábbi összetételű eluciós pufferral eluáljuk az oszlopról:
mmól kalcium-diklorid,
150 mmól nátrium-klorid és mmól trisz-hidroklorid (pH = 7,4).
A termék specifikus aktivitását Grinnell és munkatársai szerint határozzuk meg /Biotechnology, 5_, 1189 - 1192. (1987)/, az alábbiak szerint: az oszlopról eluálódó koncentrált terméket először immobilizált trombin-trombomodulin komplexszel aktiváljuk. A termék amidolitikus aktivitását az S-2366 (Helena Labs) tripeptid szubsztrát hidrolízisével mérjük. A termék antikoaguláns aktivitását a Helena Labs-től beszerzett reagenssel határozzuk meg úgy, hogy mérjük az aktivált részleges tromboplasztin idő meghosszabbodását.

Claims (4)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy összekapcsolunk
    I) egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektort, és
    II) egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát, amely az aminoterminális végtől a karboxilterminális végig az alábbi részekből álló proteint kódol:
    a/ egy szignálpeptid és egy gamma-karboxilezett propeptid, szekretált protein;
    b/ a humán C protein könnyülánca;
    c/ az alábbi dipeptidek egyikét: lizin-arginin, arginin-lizin, lizin-lizin és arginin-arginin; továbbá d/ az alábbi aminosav szekvencia:
    ASP THR GLU Rí r2 r3 r4 r5 r6 r7 r8 r9 Rio Rn R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
    PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOH;
    - 87 ahol
    Ri ASP vagy LEU , R2 GLN vagy HIS , R3 GLU vagy LYS , R . ASP vagy LEU, 4 R,_ GLN, 3 R6 VAL vagy THR, R7 ASP, PHE vagy TYR, R8 PRO, R9 ARG, R, LEU vagy THR, 10 R11 ILE vagy egy deléció R12 ASN, és ahol -COOH a karboxilterminális
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adott dezoxi-ribonukleinsav az alábbi polipeptidet kódolja·.
    h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE .ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE
    • «
    ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Ri r2 r3 r5 r6 r7 r8 Rg Rio Rn R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL .ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOHj
    • · · « *
    - 89 ahol
    Ri ASP, R2 GLN, R3 GLU, R4 ASP, R5 GLN, R6 VAL, R7 ASP, R8 PRO, R9 ARG, rio LEU, Ru egy deléció, és ahol R12 ASN.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pLPC-N vagy pGT-N plazmidok egyikét használjuk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adott dezoxi-ribonukleinsav az alábbi polipeptidet kódolja:
    MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP .ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Rí r2 r3 R4 r5 Re r7 Rg r9 Rio Rn R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
    ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH2 • · • · · · ahol
    Ri ASP , R2 GLN , R3 GLU, R4 ASP , R_ GLN, R, Ö VAL, R_ / PHE , R8 PRO , R9 ARG, rio LEU , R11 egy deléció, és ahol R12 ASN. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pLPC-FN plazmidot használjuk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adott dezoxi-rioonukleinsav az alábbi
    polipeptidet kódolja:
    h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU
    GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS • * · ·
    ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Rí r2 r3 r4 r5 Re R7 r8 Rg Rio Rll r12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOH;
    ahol
    Ri ASP, R2 GLN, R3 GLU, R4 ASP, 0 GLN, R6 VAL, R7 PHE, R8 PRO, R9 ARG, rio LEU, Ru egy deléció, és ahol R12 ASN. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pLPC-SC plazmidot használjuk. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adott dezoxi-ribonukleinsav az alábbi
    polipeptidet kódolja:
    H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE .ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Rí r2 r3 r4 Rs Re r7 Rs r9 Rio Rn R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
    PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN
    MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYH GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- COOH;
    ahol
    Ri ASP , R2 GLN, R. GLU, R4 ASP , R. D GLN, R6 VAL , R7 ASP , R8 PRO, R9 ARG, rio LEU, R11 ILE, és ahol R12 ASN. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal
    jellemezve, hogy a pLPC-LIN plazmidot használjuk.
    10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezv, hogy az adott dezox-ribonukleinsav az alábbi polipeptidet kódolja:
    h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU
    • ·
    ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Ri r2 r3 r4 R7 r8 r9 Rio Rh R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU .ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYrS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU .ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP .ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- COOHj
    ahol
    Ri ASP , R2 GLN, R3 GLU, R4 ASP, R5 GLN, R6 ' VAL, R7 PHE, R8 PRO, R9 ARG, rio LEU, Rii ILE, és ahol R12 ASN.
    11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pLPC-FLIN plazmidot használjuk.
    12. Eljárás a humán C protein zimogén alakjá- nak rekombináns előállítására eukarióta gazdasejtből történő szekrécióval, azzal jellemezve, hogy
    A) egy eukarióta gazdasejtet az alábbi szekvenciákból álló rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorral transz formálunk:
    a/ egy aminosav szekvenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely aminosav szekvencia az aminoterminális végtől a karboxilterminális végig áll:
    4 · • 4*4
    1/ egy szignálpeptid és egy gamma-karboxilezett propeptid, szekretált protein; 11/ a humán C protein könnyű lánca; III/ az alábbi dipeptidek egyike: LYS-ARG, ARG-LYS, LYS-LYS vagy ARG-ARG; továbbá IV/ az alábbi aminosav szekvencia:
    ASP THR GLU Ri r2 r3 r4 Rs Re r7 Rs Rg Rio Rll R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEL·1 ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- COOHj
    ahol • ·· ·
    Ri ASP vagy LEU, R2 GLN vagy HIS, R3 GLU vagy LYS, R4 ASP vagy LEU, R5 GLN, R6 VAL vagy THR, R7 ASP, PHE vagy TYR, R8 PRO, R9 ARG, rio LEU vagy THR, Rn ILE vagy egy deléció, és ahol R12 ASN és -( SOOH a karboxilterminális
    vég:
    b/ a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia expresszióját irányitó promoter;
    B) az A) lépésben traszformált gazdasejtet az adott dezoxi-ribonukleinsav szekvencia expreszszióját megengedő körülmények között tenyésztjük, és
    C) a tenyészetből elkülönítjük a C) protein zimogén alakj át.
    • > » • · · *
    - 100 -
    13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B) lépésben tenyésztett gazdasejtet az alábbiak közül választjuk: 293/pLPC-N, 293/pGT-N, 293/pLPC-FN, 293/pLPC-SC, 293/pLPC-LIN és 293/pLPC-FLIN.
HU91605A 1990-02-23 1991-02-22 Process for producing deoxyribonucleic acid molecules and vectors for expressing zymogen forms of human c protein HUT61592A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/484,133 US5270178A (en) 1990-02-23 1990-02-23 Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU910605D0 HU910605D0 (en) 1991-09-30
HUT61592A true HUT61592A (en) 1993-01-28

Family

ID=23922892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU91605A HUT61592A (en) 1990-02-23 1991-02-22 Process for producing deoxyribonucleic acid molecules and vectors for expressing zymogen forms of human c protein

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5270178A (hu)
EP (1) EP0443875A3 (hu)
JP (1) JPH05103678A (hu)
KR (1) KR910021476A (hu)
CN (1) CN1054798A (hu)
AU (1) AU7130891A (hu)
CA (1) CA2036915A1 (hu)
FI (1) FI910853A (hu)
HU (1) HUT61592A (hu)
IE (1) IE910610A1 (hu)
IL (1) IL97310A0 (hu)
MX (1) MX24652A (hu)
NO (1) NO910720L (hu)
NZ (1) NZ237198A (hu)
PT (1) PT96854A (hu)
YU (1) YU31791A (hu)
ZA (1) ZA911330B (hu)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL97312A (en) * 1990-02-23 1999-01-26 Lilly Co Eli A method of generating a polypeptide in an eukaryotic vector AND recombinant surrogate cell containing an enhanced transcriptional control unit based on the primary late adenovirus coefficient
IL97311A0 (en) * 1990-02-23 1992-05-25 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein c
MY110664A (en) * 1992-05-21 1999-01-30 Lilly Co Eli Protein c derivatives
DE4320294A1 (de) * 1993-06-18 1994-12-22 Immuno Ag Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen
US5585095A (en) * 1993-09-14 1996-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Method to enhance thrombomodulin APC generation using cationic proteins
AU1477000A (en) * 1998-11-13 2000-06-05 Eli Lilly And Company Method of treating heparin-induced thrombocytopenia
US6998122B1 (en) * 1999-04-30 2006-02-14 Eli Lilly And Company Protein C derivatives
US6420157B1 (en) * 1999-04-30 2002-07-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Zymogen activation system
US6485957B1 (en) 1999-04-30 2002-11-26 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. DNA encoding the human serine protease EOS
US6426199B1 (en) 1999-08-31 2002-07-30 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Dna
US6458564B1 (en) 1999-08-31 2002-10-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. DNA encoding the human serine protease T
AU1751801A (en) * 1999-11-19 2001-05-30 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
EP1255821B1 (en) 2000-02-02 2004-12-29 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
AU2001232799A1 (en) 2000-02-11 2001-08-20 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
US6933367B2 (en) * 2000-10-18 2005-08-23 Maxygen Aps Protein C or activated protein C-like molecules
KR20030060915A (ko) * 2000-10-18 2003-07-16 맥시겐 에이피에스 단백질 씨 또는 활성 단백질 씨-유사 분자
US20070142272A1 (en) * 2003-01-24 2007-06-21 Zlokovic Berislav V Neuroprotective activity of activated protein c independent of its anticoagulant activity
JP2008507561A (ja) * 2004-07-23 2008-03-13 ザ ユニバーシティ オブ ロチェスター 活性化プロテインｃによる、脳内のプラスミノゲン活性化因子の不都合な作用の阻害
CA2654761A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-13 The University Of British Columbia Interferon gamma polymorphisms as indicators of subject outcome in critically ill subjects
WO2009089620A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 The Universityof British Columbia Protein c rs2069915 as a response predictor to survival and administration of activated protein c or protein c-like compound
WO2012068519A2 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Sirius Genomics Inc. Markers associated with response to activated protein c administration, and uses thereof
WO2023119230A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 L'oreal Coagulation pathway and nicotinamide-adenine dinucleotide pathway modulating compositions and methods of their use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4775624A (en) * 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C
EP0215548B2 (en) * 1985-06-27 1998-01-07 Zymogenetics, Inc. Expression of protein C
EP0245949B1 (en) * 1986-04-09 1997-10-29 Eli Lilly And Company A method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer
US4992373A (en) * 1987-12-04 1991-02-12 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
ZA889497B (en) * 1987-12-28 1990-08-29 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein c
CA1332049C (en) * 1988-10-07 1994-09-20 Eli Lilly And Company Eukaryotic expression

Also Published As

Publication number Publication date
HU910605D0 (en) 1991-09-30
NZ237198A (en) 1993-07-27
KR910021476A (ko) 1991-12-20
ZA911330B (en) 1992-10-28
AU7130891A (en) 1991-08-29
NO910720L (no) 1991-08-26
CA2036915A1 (en) 1991-08-24
MX24652A (es) 1994-01-31
CN1054798A (zh) 1991-09-25
NO910720D0 (no) 1991-02-22
IE910610A1 (en) 1991-08-28
JPH05103678A (ja) 1993-04-27
FI910853A0 (fi) 1991-02-22
EP0443875A3 (en) 1992-07-15
YU31791A (sh) 1994-05-10
EP0443875A2 (en) 1991-08-28
PT96854A (pt) 1991-10-31
US5270178A (en) 1993-12-14
FI910853A (fi) 1991-08-24
IL97310A0 (en) 1992-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT61592A (en) Process for producing deoxyribonucleic acid molecules and vectors for expressing zymogen forms of human c protein
EP0319312B1 (en) Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
EP0191606B2 (en) Vectors and methods for expression of human protein C activity
AU744428B2 (en) Factor X analogues with a modified protease cleavage site
CA1340263C (en) Expression of protein c analogues
CA1339815C (en) Modified factor vii/viia
US5753224A (en) Hybrid protein C
Grinnell et al. Trans–Activated Expression of Fully Gamma–Carboxylated Recombinant Human Protein C, an Antithrombotic Factor
US5196322A (en) Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
US5460953A (en) Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein C
US5766921A (en) Hybrid protein C
USRE37958E1 (en) DNA sequence coding for protein C
HU225247B1 (en) Factor x deletion mutants and analogues thereof
EP0323149B1 (en) Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
USRE38981E1 (en) DNA sequence coding for protein C
JP3153236B2 (ja) 端が切り取られた軽鎖を有する組換えプロテインｃ
MXPA99007768A (en) Factor x analogues with a modified protease cleavage site

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee