CN104894176B - 一种调控裂殖壶菌油脂中dpa/dha比例的调控因子及其调控方法 - Google Patents

一种调控裂殖壶菌油脂中dpa/dha比例的调控因子及其调控方法 Download PDF

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    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone

Abstract

本发明涉及微生物发酵领域技术领域，特别涉及一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子，该调控因子为碘乙酰胺。该因子首次被应用到调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA的比例中，并且调节效果显著。本发明还公开了一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，将碘乙酰胺加入到裂殖壶菌发酵培养基中进行充分发酵，其中，保持发酵培养基中碘乙酰胺的浓度与发酵培养基中碳源的浓度的比例为0.2‑10umol/g。本发明提供的调控因子的调控方法是根据裂殖壶菌PUFA途径的特点，在裂殖壶菌发酵过程中，通过添加外源调控因子对PUFA途径进行调控，从而提高DPA的产量，并提高油脂中DPA/DHA比例。本发明方法简单易行，效果明显，可大幅提高菌体油脂中的DPA含量，可应用于大规模生产。

Description

一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子及其调控 方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子及其调控方法。
背景技术
裂殖壶菌(Schizochytrium)，属于破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)，是一种生产包括DHA、DPA在内的多不饱和脂肪酸的海洋真菌，生长周期短，培养简单，且胞内不饱和脂肪酸含量高。裂殖壶菌所生产的DHA(二十二碳六烯酸)属于n-3多不饱和脂肪酸系列，具有促进脑部发育，促进视觉系统发育的作用。裂殖壶菌所生产的DPA(二十二碳五烯酸)属于n-6多不饱和脂肪酸系列。大脑和视网膜中DPA/DHA比例的提高能够缓解DHA含量过低带来的损伤；此外，这种n-6DPA还是一种潜在的能够穿透血脑屏障的药物。鉴于DPA的药用效果和市场需求量的不断扩大，亟待有一种能提高裂殖壶菌中油脂中DPA产量的方法的出现，以提高DPA在油脂中的浓度，降低潜在的DPA纯化过程的难度和生产成本。
发明内容
针对现有技术中利用裂殖壶菌进行发酵生产提取DPA产量低，占总油脂的比例低的特点，本发明提供了一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子，该因子首次被应用到调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA的比例中，并且调节效果显著；
本发明还针对现有技术缺陷，提供一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法根据裂殖壶菌PUFA途径的特点，在裂殖壶菌发酵过程中，通过添加外源调控因子对PUFA途径进行调控，从而提高DPA的产量，并提高油脂中DPA/DHA比例。
为了实现上述目的，本发明通过对潜在的PUFA途径的调控物和作用因子进行筛选，发现PUFA途径β-酮酯酰-ACP合成酶的抑制剂碘乙酰胺能够调控PUFA途径产物间的比例。具体来说，加入外源调控因子碘乙酰胺之后，裂殖壶菌油脂中DPA/DHA的比例提高，相应的，DPA的产量也得到提高。
本发明提供的技术方案为：
一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子，所述调控因子为碘乙酰胺。
一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，将碘乙酰胺加入到裂殖壶菌发酵培养基中进行充分发酵，其中，保持发酵培养基中碘乙酰胺的浓度与发酵培养基中碳源的浓度的比例为0.2-10umol/g。
优选的是，其中，保持发酵培养基中碘乙酰胺的浓度与发酵培养基中碳源的浓度的比例为0.38-6.25umol/g。
优选的是，其中，保持发酵培养基中碘乙酰胺的浓度与发酵培养基中碳源的浓度的比例为6.25umol/g。
优选的是，其中，所述碳源为葡萄糖、果糖或者甘油中的一种或者多种的组合物。
优选的是，其中，还包括以下步骤：
1)将活化后的裂殖壶菌培养成裂殖壶菌种子液；
2)将裂殖壶菌种子液按照体积百分比4％-14％接入到发酵培养基中进行充分发酵，最终将发酵培养基中的碳源消耗完全之后，发酵结束，其中，在发酵开始时或者发酵过程中向发酵培养基中加入碘乙酰胺。
优选的是，其中，步骤2)中向发酵培养基中加入碘乙酰胺的方式为一次性加入、分次加入或者流加。
本发明的有益效果是：
本发明提供的调控因子有效调控了裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例，并提高DPA的产量；
本发明方法通过添加外源调控因子对裂殖壶菌PUFA途径进行调控，改变其PUFA途径产物的比例，提高DPA产量和DPA/DHA比例，使用该方法，可使最终DPA的产量提高69％，DPA/DHA比例(气相峰面积比例)由0.20提高到0.39；
本发明通过向裂殖壶菌发酵培养基中加入外源调控因子对PUFA体系进行调节，改变其PUFA途径产物的比例，从而提高DPA/DHA比例；由于碘乙酰胺处理对裂殖壶菌总油脂产量和多不饱和脂肪酸产量(即DPA和DHA产量之和)影响不大，因此DPA/DHA比例的提高，不仅意味着DPA产量的提高，也意味着DPA在油脂中浓度的提，DPA在油脂中浓度的提高有利于降低潜在的DPA纯化过程的难度和成本；
综上所述，本发明方法简单易行，效果明显，可大幅提高菌体油脂中的DPA含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子，其特征在于，所述调控因子为碘乙酰胺。
本发明根据裂殖壶菌体内PUFA途径的特点，通过调控因子对PUFA途径的调控，可有效促进DPA的生产。
实施例2
一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，其特征在于，将碘乙酰胺加入到裂殖壶菌发酵培养基中进行充分发酵，其中，保持发酵培养基中碘乙酰胺的浓度与发酵培养基中碳源的浓度的比例为0.2-10umol/g，其中，具体方法包括以下步骤：
1)将低温保存的裂殖壶菌(Schizochytrium)菌种活化；其中，活化培养所采用的活化培养基可以采用现有技术提供的各种组分，其优选的组分(g/L)为：碳源15.0-45.0，酵母浸提物1.0-5.0，大豆蛋白胨1.0-5.0，海水晶10.0-30.0；
2)将活化的裂殖壶菌(Schizochytrium)菌种培养成裂殖壶菌(Schizochytrium)种子液；种子液培养所采用的培养基可以采用现有技术提供的各种组分，其优选的组分(g/L)为：碳源15.0-45.0，酵母浸提物1.0-5.0，大豆蛋白胨1.0-5.0，海水晶10.0-30.0；
3)将裂殖壶菌(Schizochytrium)种子液按照体积百分比4％-14％接入发酵培养基中进行培养；发酵培养基可以采用现有技术提供的各种组分，如发酵培养基组分(g/L)：碳源50.0-100.0，酵母浸提物2.0-8.0，大豆蛋白胨2.0-8.0，海水晶10.0-30.0，MgSO4·7H2O1.0-10.0，MgCl2·6H2O 1.0-10.0，CaCl2·2H2O 1.0-10.0，KCl 1.0-10.0，KH2PO4 0.1-10.0；
4)在培养基灭菌后或者在培养过程中，加入除菌的碘乙酰胺；可以采用现有的各种除菌、灭菌方式处理碘乙酰胺，使之无菌，如将碘乙酰胺溶解于乙醇中，然后过滤除菌，然后将此溶液作为母液添加到发酵培养基中。添加的碘乙酰胺/碳源比例为0.2-8umol/g；其中，碘乙酰胺的加入方式既可以为分次加入，也可以是匀速或非匀速的流加。
在实际生产中，待结束发酵后，收集湿菌体进行干燥并萃取干燥菌体中的油脂以用于提取DPA和DHA；
其中，步骤1、2、3中所指的碳源为葡萄糖、甘油或者果糖的一种或集中的组合物。
实施例3
本发明申请人应用上述方法在实验室中进行小规模试验进行专利效果验证，首先，选择葡萄糖为碳源，其具体试验步骤为：
1)在250mL摇瓶中装入50mL种子液培养基，接入活化过的裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1菌种，在温度25℃，摇床转速180rpm条件下培养48h，作为种子液。种子液培养基组分(g/L)为：葡萄糖30.0，酵母浸提物2.0，大豆蛋白胨2.0，海水晶15.0；
2)在250mL摇瓶中装入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1种子液以10％的接种量接入到发酵培养基，在温度25℃，摇床转速180rpm条件下培养。发酵培养基组分(g/L)为：葡萄糖80.0，酵母浸提物4.0，大豆蛋白胨4.0，海水晶15.0，MgSO4·7H2O 5，MgCl2·6H2O 3，CaCl2·2H2O 1，KCl 2.0，KH2PO4 0.1；每种不同的培养基配制4个平行，115℃灭菌20min，冷却后备用；
3)在发酵开始时，加入过滤除菌的外源调控因子碘乙酰胺；添加的碘乙酰胺/碳源浓度比例分别为0.38、1.25、3.75、5.00、6.25umol/g；
4)发酵开始后，检测葡萄糖含量的变化，待葡萄糖耗尽时，结束培养；
5)将结束培养的发酵液进行8000rpm离心10min，并用蒸馏水洗2次，再次离心，收集湿菌体置于真空冻干机内，干燥24h；
6)对真空冻干的菌体进行酸热破壁，加入正己烷振荡萃取油脂，转移油脂的正己烷溶液至干净的试管，氮气保护下加热挥发正己烷，得到裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1油脂，将油脂进行甲酯化后，进行气相检测分析。
发酵结果如下表1所示：
表1表示对照组和试验组中发酵培养中含有不同碘乙酰胺/葡萄糖浓度比例的情况下，裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1的油脂产量和DPA产量
结果表明，碘乙酰胺处理裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1后，裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1的生物量和油脂产量仅有较小的影响，但是DPA的产量却得到了大幅的提升；
其中，DPA产量在发酵培养中含有不同碘乙酰胺/葡萄糖浓度比例为6.25umol/g时达到最高，相较于对照组提高了69％。
实施例4
本发明申请人应用上述方法在实验室中进行小规模试验进行专利效果验证，选择甘油为碳源，其具体试验步骤为：
1)在250mL摇瓶中装入50mL种子液培养基，接入活化过的裂殖壶菌(Schizochytrium)STA-M-3菌种，在温度25℃，摇床转速180rpm条件下培养48h，作为种子液；种子液培养基组分(g/L)为：甘油30.0，酵母浸提物2.0，大豆蛋白胨2.0，海水晶15.0；
2)在250mL摇瓶中装入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌(Schizochytrium)STA-M-3种子液以10％的接种量接入到发酵培养基，在温度25℃，摇床转速180rpm条件下培养；发酵培养基组分(g/L)为：甘油80.0，酵母浸提物4.0，大豆蛋白胨4.0，海水晶15.0，MgSO4·7H2O5，MgCl2·6H2O 3，CaCl2·2H2O 1，KCl 2.0，KH2PO4 0.1；培养基115℃灭菌20min，冷却后备用；
3)在发酵开始时，加入过滤除菌的外源调控因子碘乙酰胺；添加的碘乙酰胺/碳源比例分别为0.38、1.25、3.75、5.00、6.25umol/g；
4)发酵培养；待甘油耗尽时，结束培养；
5)将结束培养的发酵液进行8000rpm离心10min，并用蒸馏水洗2次，再次离心，收集湿菌体置于真空冻干机内，干燥24h；
6)对真空冻干的菌体进行酸热破壁，加入正己烷振荡萃取油脂，转移油脂的正己烷溶液至干净的试管，氮气保护下加热挥发正己烷，得到裂殖壶菌(Schizochytrium)STA-M-3油脂，将油脂进行甲酯化后，经行气相检测分析。
发酵结果如下表2所示：
表2表示对照组和试验组中发酵培养中含有不同碘乙酰胺/甘油浓度比例的情况下，气相检测后，用峰面积归一法计算的裂殖壶菌(Schizochytrium)STA-M-3油脂中脂肪酸的组。
结果表明，在发酵液中添加了碘乙酰胺后，显著提高了DPA在总脂肪酸中的比例，并将DPA/DHA的比例由0.21提高到0.39。
本发明方法适用于各种裂殖壶菌(Schizochytrium)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (6)

1.一种调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，其特征在于，将碘乙酰胺加入到裂殖壶菌发酵培养基中进行充分发酵，以上调裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例，其中，保持发酵培养基中碘乙酰胺的浓度与发酵培养基中碳源的浓度的比例为0.2-10umol/g。
2.根据权利要求1所述的调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，其特征在于，保持发酵培养基中碘乙酰胺的浓度与发酵培养基中碳源的浓度的比例为0.38-6.25umol/g。
3.根据权利要求2所述的调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，其特征在于，保持发酵培养基中碘乙酰胺的浓度与发酵培养基中碳源的浓度的比例为6.25umol/g。
4.根据权利要求3所述的调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、果糖或者甘油中的一种或者多种的组合物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，其特征在于，还包括以下步骤：
1)将活化后的裂殖壶菌培养成裂殖壶菌种子液；
2)将裂殖壶菌种子液按照体积百分比4％-14％接入到发酵培养基中进行充分发酵，最终将发酵培养基中的碳源消耗完全之后，发酵结束，其中，在发酵开始时或者发酵过程中向发酵培养基中加入碘乙酰胺。
6.根据权利要求5所述的调控裂殖壶菌油脂中DPA/DHA比例的调控因子的调控方法，其特征在于，步骤2)中向发酵培养基中加入碘乙酰胺的方式为一次性加入、分次加入或者流加。
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