TWI596108B - 包含新穎之基於金黃色葡萄球菌蛋白質ａ之配位子的層析基質 - Google Patents

包含新穎之基於金黃色葡萄球菌蛋白質ａ之配位子的層析基質 Download PDF

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喬 奧蘭多
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Description

包含新穎之基於金黃色葡萄球菌蛋白質A之配位子的層析基質 【相關申請案】
本申請案主張2011年6月8日申請之美國臨時專利申請案第61/494,701號之權益，該案以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於包含一或多個基於免疫球蛋白結合蛋白質(諸如金黃色葡萄球菌蛋白質A(Staphylococcus aureus Protein A，SpA))之結構域之配位子的層析基質，以及其使用方法。
親和層析中所用之配位子典型地賦予目標分子高選擇性，從而促成目標分子之高產率、高純度及快速且經濟的純化。基於金黃色葡萄球菌蛋白質A之試劑及層析基質已廣泛用於親和層析領域中，以供捕獲及純化抗體及含Fc之蛋白質；且由於其能夠結合IgG而不顯著影響免疫球蛋白對抗原之親和力，故亦用於分析級抗體偵測方法中。
因此，已研發多種包括蛋白質A-配位子之試劑及培養基且可購得，例如ProSep-vA High Capacity、ProSep vA Ultra及ProSep UltraPlus(MILLIPORE)以及Protein A SepharoseTM、MabSelectTM、MabSelect XtraTM、MabSelect SuReTM(GE HEALTHCARE)、MabSelect SuReTM LX及Poros MabCapture ATM(LIFE TECHNOLOGIES)。
為維持包含層析配位體之配位子結合固體支撐物(諸如SpA結合層析基質)的選擇性，必須清洗基質且典型地在酸性條件或鹼性條件下清洗，例如用氫氧化鈉(NaOH)清洗。舉例而言，用於清洗及復原基質之標準製程為原位清洗(cleaning-in-place，CIP)鹼性方案，其典型地涉及用濃度在0.05 M至1 M範圍內之NaOH處理配位子結合基質，使得pH值在12.7至14.0之範圍內。典型地，親和層析基質經歷重複CIP循環使得基質對目標分子之結合能力隨著時間顯著損失，從而需要在整個製程中使用較大量且通常極其昂貴的結合於基質之配位子。因為此舉導致純化製程變得更費成本且費時，故其不太經濟且不合需要。
在此項技術中先前已描述基於蛋白質A之層析基質，其似乎顯示在鹼性條件下處理後對目標分子之結合能力損失減少。參見例如美國專利公開案第20100221844號，其描述併有SpA之野生型(wt)B結構域或Z結構域(多點附著於基質)之親和層析基質，其甚至在暴露於0.5 M NaOH 5小時或超過5小時之後仍顯示高達95%的初始結合能力。又，美國專利公開案第20100048876號描述併有SpA之野生型C結構域以及含有胺基酸殘基3至胺基酸殘基6缺失之C結構域的層析基質，其似乎在暴露於0.5 M約5小時之後顯示高達95%的初始結合能力。此等配位子經由半胱胺酸引導之單點附著而固定於基質。此外，已描述併有蛋白質A結構域之層析基質，該等蛋白質A結構域含有蛋白質之一或多個天冬醯胺殘基處之突變，其中該等基質似乎顯示在暴露於鹼性條件後與野生型SpA相比結合能力損失減少，且似乎經由單點附著而固定於基質。參見例如美國專利第6,831,161號。
儘管上述親和層析基質似乎顯示在暴露於苛性條件後對目標分子之結合能力損失減少，但此等基質中之一些似乎顯示在暴露於苛性條件後配位子片段化(fragmentation)程度較大，例如使用SDS-PAGE及/或尺寸排阻層析(SEC)所觀測。該片段化不合需要，因為配位子片段化程度較大使得較小配位子片段存在，該等較小配位子片段更難以自目標分子移除及分離，從而增加該等潛在免疫原性片段與治療性目標分子共同純化的可能性。此外，片段化程度較大使得基質對目標分子之結合能力損失增加。
本發明提供親和層析配位子及併有其之基質，其中該等配位子基於一或多個金黃色葡萄球菌蛋白質A(SpA)結構域，該等結構域具有自N端之缺失(起始於結構域之1位或2位)。此等配位子及基質顯示與一些先前所述之配位子相比在純化使用期間片段化減少，如SDS-PAGE及/或SEC技術所證實，從而使其成為用於親和層析中之更具吸引力且更經濟的候選物。
在本發明之一個態樣中，提供親和層析基質，其包含一或多個SpA之具有缺失之B結構域、一或多個SpA之具有缺失之C結構域或一或多個SpA之具有缺失之Z結構域，其中一或多個結構域附著於固體支撐物。
在一個具體實例中，本發明之親和層析基質包含附著於固體支撐物之配位子，其中該配位子包括一或多個金黃色葡萄球菌蛋白質A(SpA)之B結構域，其中至少一個B結構域包括自N-之至少3個連續胺基酸缺失。在另一具體實例中，本發明之親和層析基質包括附著於固體支撐物之配位子，其中該配位子包括一或多個金黃色葡萄球菌蛋白質A(SpA)之C結構域，其中至少一個C結構域包括自N端之至少3個連續胺基酸缺失。
在另一具體實例中，本發明之親和層析基質包括附著於固體支撐物之配位子，其中該配位子包括一或多個金黃色葡萄球菌蛋白質A(SpA)之Z結構域，其中至少一個Z結構域包括自N端之至少3個連續胺基酸缺失。
在其他具體實例中，本發明之親和層析基質包括附著於固體支撐物之配位子，其中該配位子包括兩個或兩個以上B結構域、兩個或兩個以上C結構域或兩個或兩個以上Z結構域，或B結構域、C結構域及Z結構域之任何組合，其中B結構域、C結構域及Z結構域中之至少一者包括自N端之至少3個連續胺基酸缺失。
在本發明之多個具體實例中，各配位子上之一個以上位點附著於固體支撐物(亦即多點附著)。
在本發明之多個具體實例中，在配位子或含有配位子之基質暴露於0.5 M NaOH至少5小時後，配位子與其野生型對應物相比展現片段化減少，如SDS-PAGE或尺寸排阻層析(SEC)所測定。
在本發明之一些具體實例中，配位子包括自N端之3個胺基酸缺失、自N端之4個胺基酸缺失或自N端之5個胺基酸缺失，其中配位子上之一個以上位點附著於固體支撐物，從而形成親和層析基質。
在一特定具體實例中，配位子具有SEQ ID NO：13-42、SEQ ID NO：55-84及SEQ ID NO：93-94中之任一者所示之胺基酸序列。
在另一具體實例中，本發明之配位子具有以下結構：[(X)n,(Y)m]n+m，其中X表示SpA之B結構域、Z結構域或C結構域，n表示在0至(m-1)範圍內之結構域數目，Y表示SpA之自N端缺失至少3個連續胺基酸之B結構域或Z結構域或C結構域，且m表示在1至8範圍內之Y結構域數目，其中該配位子上之一個以上位點附著於固體支撐物(例如層析基質)。
在本發明之一些具體實例中，配位子包括SpA之兩個B結構域或兩個Z結構域或兩個C結構域，或一個B結構域及一個C結構域，或一個B結構域及一個Z結構域，或一個C結構域及一個Z結構域，其中至少一個B結構域或至少一個Z結構域或至少一個C結構域包含自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失。應瞭解，各個結構域可以任何次序排列。
在另一具體實例中，本發明之配位子包括3個B結構域或3個Z結構域或3個C結構域，或B結構域、C結構域或Z結構域以任何次序形成之任何組合，其中至少一個B結構域或至少一個Z結構域或至少一個C結構域包括自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失。
在另一具體實例中，本發明之配位子包括4個B結構域或4個Z結構域或4個C結構域，或B結構域、Z結構域或C結構域以任何次序形成之任何組合，其中至少一個B結構域或至少一個Z結構域或至少一個C結構域包括自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失。
在另一具體實例中，本發明之配位子包括5個B結構域或5個Z結構域或5個C結構域，或B結構域、Z結構域或C結構域以任何次序形成之任何組合，其中至少一個B結構域或至少一個Z結構域或至少一個C結構域包括自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失。
在另一具體實例中，本發明之配位子包括6個B結構域或6個Z結構域或6個C結構域，或B結構域、Z結構域或C結構域以任何次序形成之任何組合，其中至少一個B結構域或至少一個Z結構域或至少一個C結構域包括自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失。
在另一具體實例中，本發明之配位子包括7個B結構域或7個Z結構域或7個C結構域，或B結構域、Z結構域或C結構域以任何次序形成之任何組合，其中至少一個B結構域或至少一個Z結構域或至少一個C結構域包括自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失。
在另一具體實例中，本發明之配位子包括8個B結構域或8個Z結構域或8個C結構域，或B結構域、Z結構域或C結構域以任何次序形成之任何組合，其中至少一個B結構域或至少一個Z結構域或至少一個C結構域包括自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失。
另外，本文提供使用親和層析基質之方法。因此，提供一種自樣品中親和純化一或多種目標分子(例如免疫球蛋白或含Fc之蛋白質)之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)提供包括一或多種目標分子(例如免疫球蛋白或含Fc之蛋白質)之樣品；(b)使該樣品與本發明之基質在使一或多種目標分子(例如免疫球蛋白或含Fc之蛋白質)結合於基質之條件下接觸；及(c)藉由在適合條件(例如適合pH值)下洗提來回收一或多種經結合之目標分子(例如免疫球蛋白或含Fc之蛋白質)。
在一些具體實例中，本發明之親和層析基質在0.5 M NaOH中培育5小時後、或10小時後、或15小時後、或20小時後、或25小時後、或30小時後保留至少95%之其對目標分子之初始結合能力。
在一特定具體實例中，本發明之親和層析基質在0.5 M NaOH中培育5小時後保留至少95%之其初始結合能力。
在另一具體實例中，本發明之親和層析基質在0.1 M NaOH中培育25小時後保留至少95%之其對目標分子之初始結合能力；在0.3 M NaOH中培育25小時後保留至少85%之其對目標分子之初始結合能力；或在0.5 M NaOH中培育25小時後保留至少65%之其對目標分子之初始結合能力。
能夠由本文所述之各種配位子結合之免疫球蛋白包含例如IgG、IgA及IgM，或包括能夠結合於SpA之抗體及任何抗體片段的任何融合蛋白質。
本文亦提供編碼本文所述之各種配位子之核酸分子，以及包含該等核酸分子之宿主細胞。在一些具體實例中，宿主細胞為原核細胞。在其他具體實例中，宿主細胞為真核細胞。
在一些具體實例中，本發明提供基於SpA之親和層析基質，其與野生型SpA配位子相比，與免疫球蛋白之Fab部分之結合發生變化(增加或減少)，同時保留結合免疫球蛋白之Fc部分的能力。在一個具體實例中，本發明之基於SpA之基質與野生型SpA相比，與免疫球蛋白之Fab部分之結合減少。在一特定具體實例中，層析基質併有SpA配位子，該配位子在29位處包含替代甘胺酸(在SpA之B結構域及C結構域的情況下)或替代丙胺酸(在SpA之Z結構域的情況下)之離胺酸。
本發明提供併有基於一或多個SpA之結構域之配位子的親和層析基質，其中單獨或固定於基質上之該等配位子與SpA之相應野生型結構域相比，在純化製程中使用期間展示片段化減少。
先前所述之例示性的基於SpA之層析配位子包含例如美國專利公開案第20100221844號中所述之配位子，該案描述併有SpA之野生型B結構域及Z結構域之層析基質，其中配位子上之一個以上位點附著於層析基質(亦即多點附著)；美國專利公開案第20100048876號中所述之配位子，該案論述基於SpA之野生型C結構域之層析配位子，其能夠結合一些抗體之Fab部分且使用末端偶合基團在單一位點處與不可溶載體偶合；及美國專利第6,831,161號中所述之配位子，該專利論述基於SpA之鹼性基層析配位子，其中一或多個天冬醯胺胺基酸殘基已經修飾。
如上文所論述，儘管此等配位子展現在暴露於鹼性條件後結合能力之損失減少，但此等配位子中之一些在純化製程中使用期間展示極其不合需要之片段化，例如美國公開案第20100221844號中所述之配位子。另一方面，本文所述之配位子與先前所述之配位子相比，為用於蛋白質純化之更具吸引力的候選物，因為其顯示在蛋白質純化製程中常用之再生及原位清洗(CIP)方案期間在暴露於鹼性條件後片段化減少。
為使本發明更易於理解，首先定義某些術語。其他定義闡述於整個實施方式中。
I.定義
如本文所用之術語「SpA」、「蛋白質A(Protein A)」或「金黃色葡萄球菌蛋白質A(Staphylococcus aureus Protein A)」係指自細菌金黃色葡萄球菌中分離之42 Kda多結構域蛋白質。SpA經由其羧基端細胞壁結合區(稱為X結構域)結合於細菌細胞壁。在胺基端區域，SpA包含5個免疫球蛋白結合域，稱為E、D、A、B及C(Sjodhal,Eur J Biochem.九月78(2)：471-90(1977)；Uhlen等人,J Biol Chem.二月259(3)：1695-702(1984))。此等結構域中之每一者含有約58個胺基酸殘基，且其共有65%-90%之胺基酸序列一致性。
SpA之E結構域、D結構域、A結構域、B結構域及C結構域中之每一者具有不同Ig結合位點。一個位點針對Fcγ(Ig之IgG類別之恆定區)且另一個位點針對某些Ig分子之Fab部分(Ig之負責抗原識別之部分)。已報導各結構域含有Fab結合位點。SpA之非Ig結合部分位於C端且指定為X區或X結構域。
SpA之Z結構域為SpA之B結構域的經工程改造之類似物且包含替代1位處之丙胺酸的纈胺酸及替代29位處之甘胺酸殘基的丙胺酸(Nilsson等人,Protein engineering,第1卷,第2期,107-113,1987)。
編碼SpA之基因的選殖描述於美國專利第5,151,350號中，該專利之全部內容以全文引用的方式併入本文中。
本發明提供併有基於SpA之配位子的親和層析基質，其中該等配位子(自由配位子以及固定配位子)在進行蛋白質純化製程中常用之再生及CIP方案後展現片段化減少，如SDS-PAGE及SEC所觀測。
在本發明之一些態樣中，親和配位子包括一或多個B結構域或一或多個Z結構域或一或多個C結構域或其任何組合，其中至少一個B結構域或至少一個Z結構域或至少一個C結構域包括自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失(起始於1位或2位)。
在本發明之一些具體實例中，親和配位子之一個以上位點附著於層析基質(亦即多點附著)。在一特定具體實例中，本發明提供一種包括附著於層析基質之一或多個SpA之B結構域的親和層析基質，其中配位子之一個以上位點附著於基質且其中至少一個B結構域具有自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失(起始於野生型B結構域序列之1位或2位)。
在另一具體實例中，本發明提供一種包括附著於層析基質之一或多個SpA之Z結構域的親和層析基質，其中配位子之一個以上位點附著於基質且其中至少一個Z結構域具有自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失(起始於野生型Z結構域序列之1位或2位)。
在另一具體實例中，本發明提供一種包括附著於層析基質之一或多個SpA之C結構域的親和層析基質，其中配位子之一個以上位點附著於基質且其中至少一個C結構域具有自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失(起始於野生型C結構域序列之1位或2位)。
在一特定具體實例中，本發明提供一種鹼性穩定親和層析配位子，其包含SpA之5個C結構域，其中各結構域包含G29K突變以及自N端之4個胺基酸缺失(起始於1位)，且五聚形式包含額外丙胺酸作為第一胺基酸以有助於蛋白質之均質轉譯後處理。
在一些具體實例中，本文所述之SpA配位子另外包含在29位處替代甘胺酸胺基酸殘基之離胺酸胺基酸殘基(在B結構域及C結構域之情況下)或在29位處替代丙胺酸胺基酸殘基之離胺酸胺基酸殘基(在Z結構域之情況下)。
如本文所用之術語「親本分子(parental molecule)」或「野生型(wt)對應物(wild-type(wt)counterpart)」或「野生型蛋白質(wt protein)」或「野生型結構域(wt domain)」意欲指代實質上呈原生形式之相應蛋白質(SpA)或蛋白質之結構域(例如SpA之B結構域、Z結構域或C結構域)，其在本文中一般用作對照。如本文所用之野生型對應物對照(其對應於實質上呈原生形式之SpA結構域)與相應SpA結構域相比可包含一個胺基酸變化以改變Fab結合；然而，其序列在其他方面與相應野生型結構域一致。本發明之配位子與其野生型對應物(亦即完全野生型或包含用以改變Fab結合之突變)相比展現片段化減少，如本文之實施例中論述之實驗所證實。在多個具體實例中，本發明之基於B結構域或基於C結構域之配位子的野生型對應物為SpA之野生型B結構域或SpA之野生型C結構域，其胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4中。在某些具體實例中，基於Z結構域之配位子的野生型對應物為SEQ ID NO：6所示之Z結構域胺基酸序列。在某些具體實例中，B結構域、C結構域或Z結構域之野生型對應物與上文所提及之B結構域、C結構域或Z結構域之序列實質上一致，但在29位處具有用以改變結構域之Fab結合的突變。因此，在某些具體實例中，基於B結構域之配位子的野生型對應物包含SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列(G29K)，基於C結構域之配位子的野生型對應物包含SEQ ID NO：46所示之胺基酸序列(G29K)，且基於Z結構域之配位子的野生型對應物包含SEQ ID NO：48所示之胺基酸序列(A29K)。此外，在本發明之配位子包含一個以上結構域的情況下，相應野生型對應物將包含相同數目之結構域；然而，其可包含用以改變Fab結合之突變。因此，在某些具體實例中，本發明之五聚C結構域配位子之野生型對應物包含SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示之胺基酸序列。
術語「序列一致性(sequence identity)」意謂當諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用預設間隙權數(default gap weight)進行最佳比對時，兩個核苷酸或胺基酸序列共有至少70%之序列一致性、或至少80%之序列一致性、或至少85%之序列一致性、或至少90%之序列一致性、或至少95%之序列一致性、或95%以上之序列一致性。對於序列比較，典型地，一個序列充當參考序列(例如親本序列)，測試序列與其進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，視需要指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。序列比較演算法接著基於指定程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
用於比較之序列的最佳比對可例如藉由以下方法進行：Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源演算法；Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源比對演算法；Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之相似性搜尋法(search for similarity method)；此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；或目視檢查(一般參見Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology)。適於測定序列一致性百分比及序列相似性之演算法之一個實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人,J.Mol.Biol.215：403(1990)中。用於進行BLAST分析之軟體可經美國國立生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得(可經美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)NCBI網際網路伺服器公開獲得)。典型地，可使用預設程式參數進行序列比較，但亦可使用定製參數。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長(W)3、期望值(E)10及BLOSUM62計分矩陣作為預設值(參見Henikoff及Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
如本文中可互換使用之術語「E結構域(E domain)」、「SpA之E結構域(E domain of SpA)」及「金黃色葡萄球菌蛋白質A之E結構域(E domain of Staphylococcus aureus Protein A)」係指胺基酸序列示於SEQ ID NO：1中或由例如SEQ ID NO：7所示之核苷酸序列編碼之多肽。「E結構域」為摺疊成三重螺旋束結構之51個胺基酸多肽。其能夠經由螺旋1及2之表面上的殘基結合Fc，或經由螺旋2及3之表面上的殘基結合於Fab。
如本文中可互換使用之術語「D結構域(D domain)」、「SpA之D結構域(D domain of SpA)」及「金黃色葡萄球菌蛋白質A之D結構域(D domain of Staphylococcus aureus Protein A)」係指胺基酸序列示於SEQ ID NO：5中或由例如SEQ ID NO：11所示之核苷酸序列編碼之多肽。「D結構域」為摺疊成三重螺旋束結構之61個胺基酸多肽。其能夠經由螺旋1及2之表面上的殘基結合Fc，或經由螺旋2及3之表面上的殘基結合於Fab。
如本文中可互換使用之術語「A結構域(A domain)」、「SpA之A結構域(A domain of SpA)」及「金黃色葡萄球菌蛋白質A之A結構域(A domain of Staphylococcus aureus Protein A)」係指胺基酸序列示於SEQ ID NO：2中或由例如SEQ ID NO：8所示之核苷酸序列編碼之多肽。「A結構域」為摺疊成三重螺旋束結構之58個胺基酸多肽。其能夠經由螺旋1及2之表面上的殘基結合Fc，或經由螺旋2及3之表面上的殘基結合於Fab。
如本文中可互換使用之術語「B結構域(B domain)」、「SpA之B結構域(B domain of SpA)」及「金黃色葡萄球菌蛋白質A之B結構域(B domain of Staphylococcus aureus Protein A)」係指胺基酸序列示於SEQ ID NO：3中或由例如SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列編碼之多肽。「B結構域」為摺疊成三重螺旋束結構之58個胺基酸多肽。其能夠經由螺旋1及2之表面上的殘基結合Fc，或經由螺旋2及3之表面上的殘基結合於Fab。
在一些具體實例中，本發明之基於B結構域之配位子包含自N端之3個胺基酸缺失，例如具有SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列。在其他具體實例中，本發明之基於B結構域之配位子包含自N端之4個胺基酸缺失，例如具有SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列。在另一具體實例中，本發明之基於B結構域之配位子包含自N端之5個胺基酸缺失(序列未展示)。
如本文中可互換使用之術語「C結構域(C domain)」、「SpA之C結構域(C domain of SpA)」及「金黃色葡萄球菌蛋白質A之C結構域(C domain of Staphylococcus aureus Protein A)」係指胺基酸序列示於SEQ ID NO：4中或由例如SEQ ID NO：10所示之核苷酸序列編碼之多肽。「C結構域」為摺疊成三重螺旋束結構之58個胺基酸多肽。其能夠經由螺旋1及2之表面上的殘基結合Fc，或經由螺旋2及3之表面上的殘基結合於Fab。
在一些具體實例中，本發明之基於C結構域之配位子包含自N端之3個胺基酸缺失，例如具有SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列。在其他具體實例中，本發明之基於C結構域之配位子包含自N端之4個胺基酸缺失，例如具有SEQ ID NO：29所示之胺基酸序列。在另一具體實例中，本發明之基於C結構域之配位子包含自N端之5個胺基酸缺失(序列未展示)。
如本文中可互換使用之術語「Z結構域(Z domain)」、「SpA之Z結構域(Z domain of SpA)」及「蛋白質A之Z結構域(Z domain of Protein A)」係指三重螺旋之58個胺基酸多肽，其為蛋白質A之B結構域之變異體。Z結構域之胺基酸序列示於SEQ ID NO：6中且核酸序列示於SEQ ID NO：12中。例示性Z結構域描述於Nilsson等人,Protein Engr.,1：107-113(1987)中，其全部內容以引用的方式併入本文中。
在一些具體實例中，本發明之基於Z結構域之配位子包含自N端之3個胺基酸缺失，例如具有SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列。在其他具體實例中，本發明之基於Z結構域之配位子包含自N端之4個胺基酸缺失，例如具有SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列。在另一具體實例中，本發明之基於Z結構域之配位子包含自N端之5個胺基酸缺失(序列未展示)。
在一些具體實例中，本文所述之配位子之一個以上位點附著於固體支撐物(亦即多點附著)，且其中該等配位子在純化製程中使用期間展示片段化減少(在自由配位子及附著配位子兩種情況下均如此)，如SDS-PAGE或SEC所證實。
如本文所用之術語「片段化減少(reduced fragmentation)」係指與配位子之野生型對應物相比，在純化製程中自由配位子分子或固定於固體支撐物上之配位子分子暴露於鹼性條件後，配位子片段之數目減少及/或強度降低，如在SDS-PAGE凝膠上或藉由SEC所觀察。在一些具體實例中，配位子經由多點附著而固定於固體支撐物上。通常由SDS-PAGE凝膠上相對於完整分子較低之分子色帶的存在或以SEC層析圖上具有不同滯留時間之不同峰來偵測片段化。
本發明之SpA配位子展現片段化減少，其可如下偵測。舉例而言，可使自由配位子直接暴露於0.1 M NaOH、0.3 M NaOH或0.5 M NaOH 25小時，接著將pH值調節至7.0，隨後可藉由SDS-PAGE或SEC使用標準方案進行分析。或者，可使固定於層析基質上之配位子暴露於0.1 M NaOH、0.3 M NaOH或0.5 M NaOH 25小時。隨後分離苛性上清液與基質(例如樹脂)且中和至pH 7。接著可藉由SDS-PAGE或藉由SEC使用標準方案來分析此上清液。在SDS-PAGE之情況下，可目視觀測片段之相對光學強度且與適合對照進行比較(例如本文所述之SpA之野生型結構域或在29位處含有突變之SpA結構域)。在SEC之情況下，可觀測相對峰值強度且與適合對照進行比較(例如本文所述之SpA之野生型結構域或在29位處含有突變之SpA結構域)。
使用親和層析基質之典型純化製程涉及在各次使用循環後採用酸性溶液或鹼性溶液使基質再生，其中鹼性溶液較佳。另外，典型製程亦涉及CIP步驟，其採用酸性溶液或鹼性溶液清潔基質，其中鹼性溶液較佳。因此，預期親和層析基質在其使用壽命中暴露於若干次再生與CIP步驟之循環，從而導致對目標分子之結合能力隨著時間顯著損失。
併有本發明配位子之層析基質在純化製程中使用期間除了展現片段化減少以外亦為鹼性穩定的，因為其在進行再生與CIP步驟期間長期暴露於鹼性條件後對目標分子之結合能力隨著時間之損失減少。
如本文所用之術語「鹼性穩定(alkaline-stable)」、「鹼性穩定性(alkaline stability)」、「苛性穩定(caustic stable)」或「苛性穩定性(caustic stability)」一般係指單獨或固定於層析基質上之本發明親和配位子能夠耐受使用鹼洗進行之重複再生與CIP循環，而不損失其初始結合能力。一般而言，假定在0.5 M NaOH中浸泡長達30小時後，上面固定有本發明配位子之基質本身所促成的穩定性變化小於5%。舉例而言，在一些具體實例中，本發明之親和配位子能夠長期耐受習知鹼清洗，此促使配位子成為具吸引力之候選物，尤其用於免疫球蛋白及含Fc之蛋白質(其中許多為治療性分子)之成本有效性大規模純化。
在一些具體實例中，鹼性穩定性係指本發明配位子或併有本發明配位子之基質在0.05 M NaOH、0.1 M NaOH、0.3 M NaOH或0.5 M NaOH中培育5小時後、或培育10小時後、或培育15小時後、或培育20小時後、或培育25小時後、或培育30小時後，能夠保留至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%之其初始結合能力。在另一具體實例中，鹼性穩定性係指即使在用0.05 M NaOH、0.1 M NaOH、0.3 M NaOH或0.5 M NaOH處理5小時或7.5小時或10小時或15小時或20小時或25小時或30小時後，配位子之初始結合能力的下降仍小於70%、或小於60%、或小於50%、或小於40%、或小於30%。在一特定具體實例中，併有本發明配位子之層析基質在暴露於0.5 M NaOH 5小時後保留多達95%之其初始結合能力。在另一具體實例中，併有本發明配位子之層析基質在暴露於0.1 M NaOH 25小時後保留多達95%之其初始結合能力。在另一具體實例中，併有本發明配位子之層析基質在暴露於0.3 M NaOH 25小時後保留多達85%之其初始結合能力。在另一具體實例中，併有本發明配位子之層析基質在暴露於0.5 M NaOH 25小時後保留多達65%之其初始結合能力。
在一些具體實例中，本發明之基於SpA之層析基質與包含野生型SpA結構域之基質相比，展現鹼性穩定性增強或改良。然而，在其他具體實例中，本發明之基於SpA之層析基質的鹼性穩定性並不高於包含配位子之野生型對應物之基質。一個此類實例為基於SpA之五聚C結構域之配位子，其鹼性穩定性並不高於其野生型五聚C結構域對應物。應瞭解，在某些情況下，野生型SpA結構域與SpA結構域變異體均可包含用以降低Fab結合之G29K突變；然而，該突變本身不影響鹼性穩定性(資料未展示)。
鹼性穩定性可易於由一般技術者使用常規實驗及/或如本文所述來量測。
如本文所用之術語「初始結合能力(initial binding capacity)」係指在基質暴露於鹼性條件之前可由單位體積之親和層析基質(亦即包含親和配位子之基質)捕獲之目標分子(例如免疫球蛋白或含Fc之蛋白質)的量。
在本發明之一些具體實例中，如本文所述，與含有相應野生型SpA結構域對應物之親和層析基質相比，包含本文所述之配位子之親和層析基質(亦即含有一或多個本文所述之包含N端缺失之SpA B結構域、Z結構域或C結構域)之親和層析基質在長期暴露於苛性條件後，展現對目標分子之初始結合能力的損失小於5%、或小於6%、或小於7%、，或小於8%、或小於9%、或小於10%、或小於12%、或小於15%、或小於17%、或小於20%、或小於25%、或小於30%。在一些具體實例中，與含有相應野生型SpA結構域對應物之親和層析基質相比，本發明之親和層析基質在長期暴露於苛性條件後，保留至少95%、或至少90%、或至少85%、或至少80%、或至少75%、或至少70%之對目標分子之初始結合能力。然而，在一些其他具體實例中，在長期暴露於苛性條件後，本發明之層析基質與含有配位子之野生型對應物之基質展現類似結合能力。一種此類例示性層析基質包含如下配位子：其包含SpA之5個或5個以上C結構域，其中各結構域包含自N端之4個胺基酸缺失，其中該配位子之鹼性穩定性並不高於其野生型C結構域對應物。缺失形式與野生型對應物均可含有G29K突變。此外，在本文所述之多個具體實例中，SpA配位子可另外包含多聚體中之僅第一結構域之N端處之單一胺基酸，諸如丙胺酸、纈胺酸或甘胺酸，其中該額外胺基酸有助於均質轉譯後處理。
親和層析配位子對目標分子之結合能力可易於使用此項技術中已知之方法及本文所述之方法來量測，例如美國專利公開案第20100221844中所述之方法，該案以全文引用的方式併入本文中。
如本文所用之術語「層析(chromatography)」係指動態分離技術，其分離相關目標分子(例如免疫球蛋白或含Fc之蛋白質)與混合物中之其他分子且隔離該目標分子。典型地，在層析方法中，移動相(液體或氣體)將含有相關目標分子之樣品輸送穿過或通過固定相(通常為固體)介質。對固定相之分配或親和力之差異可分離不同分子，而移動相可在不同時間載運出不同分子。
如本文所用之術語「親和層析(affinity chromatography)」係指如下層析模式：其中藉由使待分離之目標分子與特定地與目標分子相互作用之分子(例如鹼性穩定之層析配位子)相互作用來隔離該目標分子。在一個具體實例中，親和層析涉及向固體支撐物中添加含有目標分子(例如免疫球蛋白或含Fc之蛋白質)之樣品，該固體支撐物上載運如本文所述之基於SpA之配位子。
如本文所用之術語「蛋白質A親和層析(Protein A affinity chromatography)」係指使用基於蛋白質A或基於SpA之配位子(諸如本文所述之配位子)分離或隔離物質，其中SpA或蛋白質A配位子固定於例如固體支撐物上。此項技術中已知之蛋白質A親和層析介質/樹脂的實例包含具有固定於受控孔玻璃基幹(backbone)上之蛋白質A的介質/樹脂，例如PROSEP ATM及PROSEP vATM介質/樹脂(MILLIPORE)；具有固定於聚苯乙烯固相上之蛋白質A的介質/樹脂，例如POROS 50ATM及Poros MabCapture ATM介質/樹脂(APPLIED BIOSYSTEMS公司)；及具有固定於瓊脂糖固體支撐物上之蛋白質A的介質/樹脂，例如rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOWTM或MABSELECTTM介質或樹脂(GE HEALTHCARE)。
除上述基質以外，蛋白質A亦可固定於親水性交聯聚合物上。參見例如美國專利公開案第20080210615號，該案以全文引用的方式併入本文中，其描述例示性親水性交聯聚合物。在不希望受理論約束下，預期本發明所涵蓋之配位子可固定於親水性交聯聚合物上，諸如美國專利公開案第20080210615號中所述之親水性交聯聚合物。
如本文中可互換使用之術語「親和基質(affinity matrix)」或「親和層析基質(affinity chromatography matrix)」係指上面附著有親和層析配位子(例如SpA或其結構域)之層析支撐物。配位子能夠經親和相互作用結合於待純化或自混合物中移除之相關分子(例如免疫球蛋白或含Fc之蛋白質)。此項技術中已知之用於基於蛋白質A之親和層析之例示性的基於蛋白質A之親和層析基質包含固定於受控孔玻璃基幹上之蛋白質A，例如PROSEP ATM及PROSEP vATM樹脂、High Capacity、Ultra及PROSEP Ultra Plus(MILLIPORE)；固定於聚苯乙烯固相上之蛋白質A，例如POROS 50ATM樹脂及POROS MabCapture ATM(APPLIED BIOSYSTEMS)；或固定於瓊脂糖固相上之蛋白質A，例如rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOWTM或MABSELECTTM樹脂(GE HEALTHCARE)。
術語「免疫球蛋白(immunoglobulin)」、「Ig」或「抗體(antibody)」(本文中可互換使用)係指具有由兩個重鏈及兩個輕鏈組成之基本四多肽鏈結構之蛋白質，該等鏈例如由鏈間二硫鍵穩定，該蛋白質具有特異性地結合抗原之能力。術語「單鏈免疫球蛋白(single-chain immunoglobulin)」或「單鏈抗體(single-chain antibody)」(本文中可互換使用)係指具有由一個重鏈及一個輕鏈組成之雙多肽鏈結構之蛋白質，該等鏈例如由鏈間肽連接子穩定，該蛋白質具有特異性地結合抗原之能力。術語「結構域(domain)」係指重鏈或輕鏈多肽之球形區域，其包括例如由β-摺疊片及/或鏈內二硫鍵穩定之肽環(例如包括3至4個肽環)。基於在「恆定」結構域之情況下各類別成員之結構域內相對缺乏的序列變化或在「可變」結構域之情況下各類別成員之結構域內的顯著變化，結構域在本文中另外稱為「恆定」或「可變」。在此項技術中，抗體或多肽「結構域」通常可互換地稱為抗體或多肽「區域」。抗體輕鏈之「恆定」結構域可互換地稱為「輕鏈恆定區」、「輕鏈恆定域」、「CL」區域或「CL」結構域。抗體重鏈之「恆定」結構域可互換地稱為「重鏈恆定區」、「重鏈恆定域」、「CH」區域或「CH」結構域。抗體輕鏈之「可變」結構域可互換地稱為「輕鏈可變區」、「輕鏈可變域」、「VL」區域或「VL」結構域。抗體重鏈之「可變」結構域可互換地稱為「重鏈可變區」、「重鏈可變域」、「VH」區域或「VH」結構域。
免疫球蛋白或抗體可為單株或多株且可以單體或聚合形式存在，例如以五聚形式存在之IgM抗體及/或以單體、二聚或多聚形式存在之IgA抗體。術語「片段(fragment)」係指抗體或抗體鏈之一部分，其與完整或完全抗體或抗體鏈相比包括較少胺基酸殘基。可經由對完整或完全抗體或抗體鏈進行化學處理或酶處理來獲得片段。亦可藉由重組手段獲得片段。例示性片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fc及/或Fv片段。
術語「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指免疫球蛋白或抗體之多肽部分，其結合抗原或與完整抗體(亦即其所來源之完整抗體)競爭性地結合抗原(亦即特異性結合)。結合片段可由重組DNA技術製備，或由完整免疫球蛋白之酶促裂解或化學裂解製備。結合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、單鏈及單鏈抗體。
亦涵蓋融合蛋白質，其包含抗體或其片段作為融合蛋白質之一部分。
本文中可互換使用之術語「聚核苷酸(polynucleotide)」及「核酸分子(nucleic acid molecule)」係指任何長度之核苷酸(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)之聚合形式。此等術語包含單股、雙股或三股DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜交體，或包括嘌呤及嘧啶鹼基之聚合物，或其他天然核苷酸鹼基、經化學修飾或經生物化學修飾之非天然核苷酸鹼基或經衍生處理之核苷酸鹼基。聚核苷酸之主鏈可包括糖及磷酸基(可典型地存在於RNA或DNA中)，或經修飾或經取代之糖或磷酸基。另外，可藉由合成互補股且在適當條件下黏接該等股，或藉由使用DNA聚合酶及適當引子重新合成互補股，自化學合成之單股聚核苷酸產物獲得雙股聚核苷酸。核酸分子可呈許多不同形式，例如基因或基因片段、一或多種外顯子、一或多種內含子、mRNA、cDNA、重組聚核苷酸、分支聚核苷酸、質體、載體、任何序列之分離DNA、任何序列之分離RNA、核酸探針及引子。聚核苷酸可包括經修飾之核苷酸(諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物)、尿嘧啶基(uracyl)、其他糖及鍵聯基團(諸如氟核糖(fluororibose)及硫代酸酯基(thioate))及核苷酸分支。如本文所用之「DNA」或「核苷酸序列(nucleotide sequence)」不僅包含鹼基A、T、C及G，而且包含其任何類似物或此等鹼基之經修飾形式，諸如甲基化核苷酸、核苷酸間修飾(諸如不帶電鍵及硫代酸酯基)、糖類似物及經修飾及/或替代性主鏈結構(諸如聚醯胺)。在一特定具體實例中，如本文所述，核酸分子包括編碼SpA變異體之核苷酸序列。
術語「Fc結合(Fc-binding)」或「結合於Fc部分(bind to an Fc portion)」係指本文所述之親和配位子結合於抗體之恆定部分(Fc)的能力。在一些具體實例中，本發明之配位子以至少10-7 M、或至少10-8 M、或至少10-9 M之親和力結合抗體(例如人類IgG1、IgG2或IgG4)之Fc部分。
如本文所用之術語「Fab結合(Fab binding)」或「結合於Fab部分(bind to a Fab portion)」係指本文所述之親和配位子結合於抗體或免疫球蛋白分子之Fab區域的能力。術語「與Fab部分之結合降低(reduced binding to a Fab portion)」係指與對照(例如野生型SpA結構域)相比，本發明之基於SpA之配位子與免疫球蛋白分子之Fab(或F(ab)2)部分之結合的任何降低，其中該配位子另外包含一或多個胺基酸之突變。在一些具體實例中，本發明之配位子及其野生型對應物(用作對照)包含在29位處替代甘胺酸殘基的除丙胺酸或色胺酸以外之胺基酸。在一特定具體實例中，本發明之配位子在29位處包含離胺酸殘基。在一特定具體實例中，使用此項技術中之習知技術及本文所述之技術不可偵測本文所述之配位子與免疫球蛋白分子之Fab部分的結合。可使用熟知技術偵測與免疫球蛋白分子之結合，該等技術包含本文所述之技術且包含(但不限於)例如親和層析及表面電漿子共振分析。在一些具體實例中，本發明所涵蓋之免疫球蛋白結合蛋白質以至少10-10 M之親和力結合免疫球蛋白分子。
如本文所用之術語「N端(N-terminus)」係指SpA結構域之胺基酸序列之胺基端，其起始於各結構域之胺基酸序列之1位或2位，如圖1中所描繪。然而，應瞭解，在序列中之第一胺基酸之前可存在甲硫胺酸胺基酸殘基或另一胺基酸(例如丙胺酸、甘胺酸或纈胺酸)以有助於蛋白質之均質轉譯後處理。本文所述之SpA配位子包含自SpA結構域之N端(起始於圖1中所示之B結構域、C結構域或Z結構域胺基酸序列之1位或2位)之至少3個、或至少4個、或至少5個連續胺基酸缺失。換言之，該等配位子包含SpA之B結構域、Z結構域或C結構域之連續胺基酸1至3、或連續胺基酸1至4、或連續胺基酸1至5等之缺失，或該等配位子包含SpA之B結構域、Z結構域或C結構域之連續胺基酸2至4、或連續胺基酸2至5、或連續胺基酸2至6等之缺失(野生型B結構域、C結構域及Z結構域之胺基酸序列描繪於圖1中，其經修飾而包含自N端之缺失)。在一特定具體實例中，本發明之配位子包含5個C結構域，其中各結構域包含自N端之4個連續胺基酸缺失(起始於1位)。
SpA之含有自N端之3個連續胺基酸缺失之B結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO：13中，且SpA之含有自N端之4個連續胺基酸缺失之B結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO：28中。另外，SpA之含有自N端之3個連續胺基酸缺失之C結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO：14中，且SpA之含有自N端之4個連續胺基酸缺失之C結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO：29中。此外，含有自N端之3個連續胺基酸缺失之Z結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO：15中，且含有自N端之4個連續胺基酸缺失之Z結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO：30中。
一般而言，在本文所述之基於SpA之配位子之多聚形式的情況下，配位子之單體形式之胺基酸序列視需要簡單地重複出現。然而，應注意，在本發明配位子之一些多聚形式的情況下，並非所有結構域均需具有自N端之缺失。舉例而言，在一些具體實例中，在配位子之多聚形式中，配位子不含第一結構域之N端中之缺失；然而，配位子中之後續結構域含有自N端之至少3個連續胺基酸缺失或自N端之至少4個連續胺基酸缺失或自N端之至少5個連續胺基酸缺失。
本發明之基於SpA之配位子具有優良且意想不到之特性，亦即在純化製程中使用期間片段化減少，如本文中之實施例所證實。值得注意的是，先前技術中之教示的教示內容似乎偏離了製備及使用該等配位子之動機。舉例而言，美國專利公開案第20100048876號論述包含SpA之C結構域之胺基酸殘基3至6之缺失的配位子；然而，基於此公開案之教示(參見例如美國專利公開案第20100048876號之圖2)，似乎其中所述之缺失突變體與SpA之野生型C結構域相比，在長期苛性暴露後在保留結合能力方面表現不佳。因此，基於此參考文獻之教示，當SpA C結構域之缺失突變體與其野生型對應物相比隨著時間之結合能力損失較大時，使用該缺失突變體不太合乎需要。
為方便起見，整個申請案中所提及之各個序列概述於下表I中。
II.產生用作層析配位子之基於SpA之分子
可使用此項技術中已知之任何適合方法製備本發明所涵蓋之基於SpA之親和層析配位子。
舉例而言，作為初始步驟，可使用標準遺傳工程改造技術(例如Sambrook,Fritsch及Maniatis之題為分子選殖(Molecular Cloning)之實驗手冊中所述之技術)產生表現本文所述之SpA配位子分子的核酸。
在一些具體實例中，可將編碼SpA之具有N端缺失之一或多個結構域的核酸分子選殖至適合載體中，以用於在適當宿主細胞中表現。適合表現載體在此項技術中為熟知的且典型地包含用於轉錄及轉譯變異型SpA編碼序列之必需要素。
亦可使用此項技術中熟知之方法自片段之胺基酸前驅體以化學方式合成本文所述之SpA分子，該等方法包含固相肽合成法，諸如Boc(第三丁氧基羰基)或Fmoc(9-茀基甲氧基羰基)方法(參見例如美國專利第6,060,596號；第4,879,378號；第5,198,531號；第5,240,680號)。
可在多種細胞類型中實現本文所述之SpA分子的表現，例如真核宿主細胞(諸如酵母細胞)、昆蟲細胞及哺乳動物細胞及原核宿主細胞(例如細菌，諸如大腸桿菌)。
在一些具體實例中，SpA分子可表現於噬菌體表面上，使得各噬菌體含有編碼呈現於噬菌體表面上之個別SpA分子之DNA序列。可使用此項技術中之標準技術及本文所述之技術來容易地分析SpA分子對免疫球蛋白之親和力，例如ELISA及BiacoreTM 2000標準配置(BIACORE AB,Uppsala Sweden)。理想的是，本發明之SpA分子對免疫球蛋白之結合親和力至少與母體分子相當，其中如本文所述，該分子在使用期間展現片段化減少。
III.用於製備層析基質之支撐物
在一些具體實例中，本發明所涵蓋之SpA配位子固定於支撐物(例如固體支撐物或可溶性支撐物)上，以產生適於分離生物分子(諸如免疫球蛋白及含Fc之蛋白質)之親和層析基質。
在一些具體實例中，本發明之配位子固定於固體支撐物上。在不希望受理論約束下，預期任何適合固體支撐物均可用於附著本發明之配位子。舉例而言，固體支撐物基質包含(但不限於)受控孔玻璃、二氧化矽、氧化鋯、氧化鈦、瓊脂糖、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚乙烯醚、聚乙烯醇及聚苯乙烯及其衍生物(例如其合金)。固體支撐物可為多孔材料或無孔材料。
在一些具體實例中，固體支撐物為多孔材料。用作固體支撐物之多孔材料可包括親水性化合物、疏水性化合物、疏油性化合物、親油性化合物或其任何組合。多孔材料可包括聚合物或共聚物。適合多孔材料之實例包含(但不限於)聚醚碸、聚醯胺(例如耐綸(nylon))、多醣(諸如瓊脂糖及纖維素)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚四氟乙烯、聚碸、聚酯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚碳酸酯、碳氟化合物之聚合物(例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯醚)))、玻璃、二氧化矽、氧化鋯、氧化鈦、陶瓷、金屬及其合金。
多孔材料可包括有機分子或無機分子或有機分子與無機分子之組合，且可包括一或多種適於進行反應(例如形成供進一步化學修飾之共價鍵)以共價結合於蛋白質之官能基，例如羥基、環氧基、硫醇基、胺基、羰基或羧酸基。在另一具體實例中，多孔材料可能不具有官能基，但可塗覆有具有諸如羥基、硫醇基、胺基酸基、羰基或羧酸基之官能基的材料層。
在一些具體實例中，使用例如具有有機性質之習知親和分離基質，且其基於使親水性表面暴露於所用水性介質之聚合物，亦即暴露其外表面上以及(若存在)內表面上之羥基(--OH)、羧基(--COOH)、羰基(--CHO或RCO-R')、甲醯胺基(--CONH2，可能呈N取代形式)、胺基(--NH2，可能呈取代形式)、寡聚伸乙氧基或聚伸乙氧基。在一個具體實例中，聚合物可例如基於多醣，諸如聚葡萄糖、澱粉、纖維素、普魯蘭(pullulan)、瓊脂糖等，該等多醣宜例如與雙環氧化物、表鹵代醇、烯丙基溴、烯丙基縮水甘油醚、1,2,3-三鹵基取代之低碳烴交聯，以提供適合孔隙率及剛性。在另一具體實例中，固體支撐物包括多孔瓊脂糖珠粒。本發明中所用之各種支撐物可根據此項技術中已知之標準方法容易地製備，諸如反相懸浮膠凝法(inverse suspension gelation)，例如Hjerten,Biochim Biophys Acta 79(2),393-398(1964)中所述。或者，基礎基質可為市售產品，諸如SepharoseTM FastFlow(GE HEALTHCARE,Uppsala,Sweden)。在一些具體實例中(尤其有利於大規模分離)，支撐物經調整以增加其剛性，且因此促使基質更適於高流動速率。
或者，固體支撐物可基於合成聚合物，諸如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚丙烯酸羥基烷酯、聚甲基丙烯酸羥基烷酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺等。在疏水性聚合物(諸如基於經二乙烯基取代之苯及經單乙烯基取代之苯之基質)的情況下，基質表面通常經親水處理以使如上文所定義之親水基團暴露於周圍水性液體。該等聚合物可根據標準方法容易地製備，參見例如Arshady,Chimica e L'Industria 70(9),70-75(1988)。或者，可使用市售產品，諸如SourceTM(GE HEALTHCARE,Uppsala,Sweden)及Poros(APPLIED BIOSYSTEMS,Foster City,CA)。
在其他具體實例中，固體支撐物包括具有無機性質之支撐物，例如二氧化矽、氧化鋯、氧化鈦及其合金。無機基質之表面通常經改質而包含適合反應基團以供與SpA及其變異體進一步反應。實例包含CM Zirconia(Ciphergen-BioSepra,CERGYPONTOISE,France)及CPG(MILLIPORE)。
在一些具體實例中，固體支撐物可例如基於呈受控孔玻璃形式之氧化鋯、氧化鈦或二氧化矽，該受控孔玻璃可經改質而含有反應基團及/或持續進行苛性浸泡以與配位子偶合。
例示性固體支撐物型式包含(但不限於)珠粒(球形或不規則形)、中空纖維、實心纖維、襯墊、凝膠、薄膜、卡匣、管柱、晶片、載片、板或單石。
對於基質型式，在一個具體實例中，其呈多孔單石形式，其可使用以下材料製成：無機材料，諸如二氧化矽；或有機材料，諸如聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚四氟乙烯、聚碸、聚酯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯醚及聚碳酸酯。在單石之情況下，其可經由聚合或藉由塗覆基板而形成。
在一替代性具體實例中，基質呈多孔或無孔珠粒或顆粒形式。顆粒可為球形或非球形以及磁性或非磁性。呈珠粒或顆粒形式之基質可以填充床或懸浮形式使用。懸浮形式包含稱為膨脹床及純懸浮液者，其中顆粒或珠粒可自由移動。在單石、填充床及膨脹床之情況下，分離程序通常遵循在濃度梯度下進行之習知層析。在純懸浮液之情況下，將使用分批模式。又，可使用呈諸如表面、晶片、毛細管或過濾器形式之固體支撐物。
基質亦可呈濾筒中之薄膜形式。薄膜可呈平坦薄片、螺旋或中空纖維型式。
在另一具體實例中，本發明之配位子附著於可溶性支撐物，例如可溶性聚合物或水溶性聚合物。例示性可溶性支撐物包含(但不限於)生物聚合物，諸如蛋白質或核酸。在一些具體實例中，可使用生物素作為可溶性聚合物，例如美國專利公開案第20080108053號中所述。舉例而言，生物素可結合於配位子，例如本發明之基於SpA之配位子，其在結合於配位子後可用於分離相關蛋白質，例如抗體或其片段(例如存在於粗混合物中)，且相關蛋白質可經由生物素-配位子-蛋白質聚合物複合物以可逆或不可逆方式沈澱而隔離或分離。聚合物亦可為合成可溶性聚合物，諸如包含(但不限於)含有帶負電基團(羧酸基或磺酸基)、帶正電基團(四級胺、三級胺、二級基團或一級基團)、疏水基團(苯基或丁基)、親水基團(羥基或胺基)或上述基團之組合的聚合物。例示性合成可溶性聚合物可見於國際PCT公開案第WO2008091740號及美國公開案第US20080255027號中，各案之全部教示以引用的方式併入本文中。此等聚合物在一或多種條件(諸如pH值、傳導性或溫度)發生特定物理變化時，可用於經由以可逆或不可逆方式沈澱來純化相關蛋白質。合成可溶性聚合物可單獨使用或可與本發明之配位子偶合且用於經由以可逆或不可逆方式沈澱來捕獲/純化相關蛋白質，諸如抗體或其片段。
在一些具體實例中，配位子附著於呈多孔板型式之薄膜。在其他具體實例中，配位子併入毛細管或微流體裝置中。
IV.用於將配位子附著於支撐物之方法
可使用任何適合技術將本文所述之配位子附著於支撐物(例如固體支撐物)，該技術包含此項技術中熟知及本文所述之技術。舉例而言，在一些具體實例中，可經由利用例如配位子中存在之胺基及/或羧基之習知偶合技術將配位子附著於支撐物。舉例而言，雙環氧化物、表氯醇、CNBr、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)等為熟知偶合試劑。在一些具體實例中，在支撐物與配位子之間引入間隔物，其改良配位子之可用性且促進配位子與支撐物之化學偶合。
在本發明所涵蓋之多個具體實例中，配位子上之一個以上位點附著於固體支撐物(亦即經多點附著)，從而產生在長期苛性暴露後展示配位子片段化減少(在自由配位子以及附著配位子兩種情況下均如此)之親和層析基質。
基於SpA之層析配位子附著於固體支撐物可經由許多不同已知方式(其中大部分在此項技術中為熟知的)以及本文所述之方式實現。參見例如Hermanson等人,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,第51-136頁(1992)。
舉例而言，蛋白質配位子可經由固體支撐物表面或蛋白質配位子表面上之活性基團與固體支撐物偶合，該等活性基團為諸如羥基、硫醇基、環氧基、胺基、羰基、環氧基或羧酸基。可使用已知化學法實現附著，包含(但不限於)使用溴化氰(CNBr)、N-羥基丁二醯亞胺酯、環氧基(雙環氧乙烷)活化及還原胺化。
舉例而言，文獻中已描述硫醇引導之蛋白質偶合。參見例如Ljungquist等人,Eur.J.Biochem.第186卷,第558-561頁(1989)。此技術先前已應用於使SpA與固體支撐物偶合。因為野生型SpA不含硫醇基，故藉由在SpA之C端以重組方式插入含硫醇之半胱胺酸來實現附著。參見例如美國專利第6,399,750號。經由此機制製備若干市售產品，諸如MabSelectTM、MabSelectTM Xtra及MabSelectTM SuRe、MabSelectTM SuRe LX。已報導此末端半胱胺酸僅與固體表面上之環氧基反應，從而使得SpA單點附著於固體支撐物。參見例如Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry,CRC Press,2006,第473頁。
在本發明之一些具體實例中，基於SpA之層析配位子上之一個以上位點經由無區別之多點附著而附著於固體支撐物。一般而言，SpA含有充足的來自各結構域中之許多離胺酸之自由胺基。SpA結構域經由多點附著而附著於固體支撐物(例如具有環氧基或醛基之層析樹脂)可藉由分別經由環氧化物開環或還原胺化使SpA上離胺酸之胺基反應來實現。在某些具體實例中，可藉由使SpA上具有自由羥基之一或多種天然存在之胺基酸(諸如絲胺酸及酪胺酸)與含有環氧基之支撐物經由開環反應而進行反應來實現多點附著。或者，可例如藉由使SpA上具有自由羧酸基之天然存在之胺基酸(諸如天冬胺酸及麩胺酸)與含有胺基之支撐物經由例如N,N'-羰基二咪唑而進行反應來實現多點附著。配位子多點附著於支撐物亦可由所有上述機制之組合來實現。
基於SpA之層析配位子亦可經由締合機制附著於固體支撐物。舉例而言，締合基團可經由離子性相互作用、疏水性相互作用或相互作用之組合與相關配位子以非共價方式發生相互作用，從而使相關配位子附著於固體表面上。此有助於配位子與固體基質之高效偶合，例如美國專利第7,833,723號及第7,846,682號中所述(該等專利以引用的方式併入本文中)，從而使得配位子密度高於無締合基團之情況。適用於本發明之締合基團包含帶電物質(諸如離子性物質)及不帶電物質(諸如疏水性物質)。締合基團可例如藉由與固體支撐物直接共價結合來對固體支撐物進行改質。離子性物質之適合實例可包含四級胺、三級胺、二級胺、一級胺、磺酸基、羧酸或其任何組合。疏水性物質之適合實例可包含苯基、丁基、丙基或其任何組合。亦預期可使用混合型物質。締合基團亦可與蛋白質配位子相互作用。因此，締合基團與蛋白質配位子之間的相互作用可包括相互作用之混合，例如離子性物質與疏水性物質。
可藉由使固體支撐物上之官能基與締合基團上之官能基反應來使締合基團與固體支撐物共價偶合。適合官能基包含(但不限於)胺、羥基、巰基、羧基、亞胺、醛、酮、烯烴、炔烴、偶氮基、腈、環氧化物、氰及活化羧酸基。舉例而言，瓊脂糖珠粒含有羥基，該等羥基可與帶正電締合基團之環氧官能基(諸如氯化縮水甘油基三甲銨)反應。熟習此項技術者應瞭解，多個締合基團可與固體支撐物偶合，其限制條件為使用至少一個雙官能締合基團。因此，締合基團可與固體支撐物串聯偶合或其可個別地與固體支撐物直接偶合。
在一些具體實例中，本發明提供可經由插入連接子(intervening linker)與固體支撐物偶合之締合基團及/或蛋白質配位子。連接子可包括至少一個與連接部分偶合之官能基。連接部分可包括任何能夠與官能基偶合之分子。舉例而言，連接部分可包含烷基、烯基或炔基中之任一者。連接部分可包括1至30個碳原子範圍內之碳鏈。在一些具體實例中，連接子可包括30個以上碳原子。連接部分可包括至少一個雜原子，諸如氮、氧及硫。連接部分可包括分支鏈、未分支鏈或環狀鏈。連接部分可經兩個或兩個以上官能基取代。
選擇用於使蛋白質配位子與固體支撐物偶合之適當緩衝條件充分處於熟習此項技術者之能力範圍內。適合緩衝液包含例如乙酸鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉等，或上述物質之任何組合，其濃度在10 mM至5 M之範圍內。在一些具體實例中，鹽濃度在0.1 M至1.5 M之範圍內。
其他適合緩衝液包含任何無胺緩衝液，諸如碳酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸鹽、磷酸鹽及乙酸鹽緩衝液，或上述物質之組合。當使用締合化學法時，緩衝液之鹽濃度將視所用締合基團而定。舉例而言，鹽濃度可在5 nM-100 mM之範圍內。當使用帶電物質時，鹽濃度可為至少5 nM但小於0.1 M，至少5 nM但小於0.01 M，至少5 nM但小於0.001 M。在某些具體實例中，鹽濃度可為0.01 M。當使用疏水性物質時，通常需要較高鹽濃度。因此，鹽濃度可大於0.001 M，大於0.01 M，或大於0.1 M。
在一些具體實例中，當使用締合化學法時，反應在0℃至99℃範圍內之溫度下進行。在某些具體實例中，反應方法在低於60℃、低於40℃、低於20℃或低於10℃之溫度下實施。在一些具體實例中，本發明之方法在約4℃之溫度下實施。在其他具體實例中，本發明之方法在20℃之溫度下實施。
V.分析配位子之片段化減少
本發明提供併有基於一或多個B結構域、Z結構域或C結構域之SpA配位子的親和層析基質，其中一或多個結構域包含自N端之3個或4個或5個連續胺基酸缺失(起始於1位或2位)。在一些具體實例中，基於SpA之配位子上之一個以上位點附著於層析基質。
本發明基於以下意想不到且令人驚訝之發現：呈自由形式以及固定於固體支撐物(例如層析基質)上之本文所述之配位子(在純化製程中使用期間在長期暴露於苛性條件後均展現片段化減少。如上文所論述，該片段化不合需要，因為其最終導致SpA結構域之潛在免疫原性片段與潛在治療性目標蛋白質一起存在。此外，片段化使得純化製程更費成本，此係因為在製程中需要使用更多配位子。
可使用此項技術中已知之方法及本文所述之方法來容易地偵測親和配位子之片段化。該等方法包含(但不限於)SDS-PAGE及SEC。
十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)通常用於蛋白質之分子量分析。SDS為解離並展開(unfold)蛋白質之清潔劑。SDS結合於多肽以形成具有相當恆定之電荷質量比的複合物。因此，僅由複合物之大小確定通過凝膠之電泳遷移率。藉由同時操作具有已知分子量之標記物蛋白質來確定分子量。典型地對凝膠進行染色且可觀測具有不同分子量之生物分子的存在。
尺寸排阻層析(SEC)為一種藉由分子尺寸來分離溶液中之分子的方法。該方法通常應用於大分子或巨分子複合物，諸如蛋白質及工業聚合物。典型地藉由UV-Vis或藉由光散射來偵測不同分子物質。在UV-Vis之情況下，選擇特定用於偵測某些物質之波長。某些分子物質之洗提次序(如層析圖上所觀測)以及相應峰之強度提供關於物質類型以及相對量之資訊。
如本文所包含之實施例所展示，本發明之SpA配位子與其野生型對應物相比，在暴露於苛性條件後展現片段化減少。在用以展示片段化減少之例示性實驗中，使本文所述之具有N端缺失之SpA配位子及其野生型對應物均暴露於0.5 M NaOH 25小時。接著用酸將溶液中和至pH 7。將中和之溶液注入SEC中或加載至SDS-PAGE凝膠上以供分析及比較。
在用以展示片段化減少之另一例示性實驗中，使本文所述之附著於固體支撐物(經由多點附著而固定)的包含具有N端缺失之配位子之親和層析基質以及附著於固體支撐物(經由多點附著而固定)的包含該配位子之野生型對應物之親和層析基質均暴露於0.5 M NaOH 25小時。分離苛性溶液與基質(例如呈樹脂形式)且立即用酸中和至pH 7。將中和之溶液注入SEC中或加載至SDS-PAGE凝膠上以供分析及比較。
VI.分析配位子之鹼性穩定性
除了在純化製程中使用期間展現片段化減少以外，本文所述之配位子亦為鹼性穩定的。在產生本文所述之併有基於SpA之配位子之層析基質後，可使用此項技術中之標準技術及本文所述之技術分析含有配位子之基質的鹼性穩定性。
舉例而言，可使用濃度為約0.5 M之NaOH進行常規處理來分析固定於基質上之配位子的鹼性穩定性，例如本文所述以及美國專利公開案第20100221844號中所述，該案之全部內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體實例中，鹼性穩定之SpA分子以及併有其之基質展現鹼性穩定性「增強」或「改良」，意謂該等分子及併有該等分子之基質與其野生型對應物相比可在鹼性條件下長期穩定。先前已報導併有基於SpA之野生型B結構域、C結構域或Z結構域之SpA配位子或具有一或多個天冬醯胺殘基之突變的層析基質在pH值高於約10(諸如高達約13或14)之條件下提供改良之鹼性穩定性。然而，此等配位子中之一些似乎在使用期間、尤其在重複CIP循環後展示片段化，如由SDS-PAGE凝膠上片段之存在或由SEC所觀測。
在一些具體實例中，本發明之配位子以及併有該等配位子之基質的鹼性穩定性並不高於其野生型對應物；儘管如此，其仍展現片段化減少。本文所述之一種此類配位子為C結構域配位子之五聚形式，其包含各結構域中之N端缺失且包含各結構域中之G29K突變。此種配位子可另外包含丙胺酸作為五聚體中之第一胺基酸以有助於均質轉譯後處理。
本發明基於以下令人驚訝且意想不到之發現：新穎SpA配位子(呈自由形式以及固定於層析基質中)與一些先前所述之配位子相比在純化製程中使用期間展現片段化減少，且在長期暴露於苛性條件(例如暴露於0.1 M NaOH 25小時或超過25小時)後保留至少95%之初始結合能力。在一些具體實例中，配位子上之一個以上位點附著於固體支撐物上且此等配位子基於SpA之B結構域、C結構域或Z結構域，其中配位子具有自N端之3個、4個或5個連續胺基酸缺失(起始於1位或2位)。
在一些具體實例中，在100次循環後(各次循環包含用0.5 M NaOH處理15分鐘)，本文所述之SpA配位子(例如包括一或多個B結構域、C結構域或Z結構域及其任何組合之配位子，其中B結構域、C結構域或Z結構域中之至少一者包含自N端之至少3個連續胺基酸缺失)所保留之結合能力百分比為野生型對應物之至少1.25倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍或3倍。
在一個具體實例中，如由隨著時間而保留之IgG結合能力所分析的經固定配位子之鹼性穩定性量測如下。，藉由獲得加載至濃度基於UV280nm下之吸光度為50%之初始IgG濃度的IgG體積來量測結合能力，稱為Qd 50%。首先量測層析基質(例如裝填於管柱中之樹脂)之初始Qd 50%。接著使層析基質(例如上文所述之樹脂)經歷約10次循環，各次循環為以0.8 mL/min暴露於0.5 M NaOH 15分鐘。再次量測Qd 50%。重複此過程直至層析基質暴露於總共約100次0.5 M NaOH循環。最後一次量測Qd 50%且將包含如本文所述之配位子之親和層析基質(例如與配位子一起固定之層析樹脂)之結果與SpA之各別野生型結構域進行比較。
在另一分析法中，藉由靜態浸泡基質來量測基質之苛性或鹼性穩定性。藉由將經量測量之親和層析基質(例如呈樹脂型式)在緩緩旋轉下浸泡於0.1 M NaOH、0.3 M NaOH或0.5 M NaOH中25小時且在NaOH浸泡之前及之後量測IgG結合能力，可依據基質所保留之對IgG之結合能力來確定鹼性穩定性。
VII.使用本發明之層析基質純化目標分子之方法
在一些具體實例中，本發明提供一種使用本文所述之親和層析基質自混合物中純化目標分子之方法。目標分子可為由本文所提供之親和配位子識別之任何分子，其中該配位子與固體支撐物(亦即層析基質)偶合。目標分子之實例包含免疫球蛋白及含Fc之蛋白質。免疫球蛋白可為多株抗體或單株抗體或其功能性片段。功能性片段包含免疫球蛋白之包括可變區之任何片段，其保持特異性地結合於其抗原，同時保留其特異性地結合於與固體支撐物偶合之蛋白質配位子的能力。
在一些具體實例中，使用本文所述之親和層析基質分離相關目標分子之方法包含以下步驟：(a)使包含胺基酸序列選自由SEQ ID NO：13-42、SEQ ID NO：55-84及SEQ ID NO：93-95組成之群的經固定之基於SpA之層析配位子之固體支撐物與包括目標分子之混合物在使目標分子特異性地結合於配位子之條件下接觸；及(b)改變條件以使得目標分子不再結合於配位子，從而分離目標分子。
在一些具體實例中，該改變步驟包含改變pH值以使得目標分子不再結合於配位子。在一特定具體實例中，以使得酸性比步驟(a)中之pH值條件更強之方式改變pH值。舉例而言，在一個具體實例中，可在中性pH值下或在約6至約8範圍內之pH值下進行步驟(a)，且可在酸性pH值(例如約1至約5範圍內之pH值)下進行步驟(b)。
在另一具體實例中，步驟(b)包括改變使用中之緩衝液之鹽濃度，使得目標分子不再結合於配位子。舉例而言，在一個具體實例中，可在步驟(a)中使用較高鹽濃度(例如>0.1 M)，且可在步驟(b)中使用較低鹽濃度(例如<0.1 M)。相反地，在一些具體實例中，可在步驟(a)中使用較低鹽濃度(例如<0.1 M)，且可在步驟(b)中使用較高鹽濃度。在其他具體實例中，可在步驟(a)與步驟(b)之間改變緩衝液之pH值與鹽濃度兩者。
熟習此項技術者可容易地確定適於使目標分子結合於配位子之條件，且從而改變該等條件以破壞分子與配位子之結合。
一般而言，預期本文所述之配位子可用於任何純化製程或一系列純化製程中，其中典型地使用原生SpA及重組SpA。換言之，一般需要用本文所述之配位子置換當前製程中之原生SpA(例如自金黃色葡萄球菌中分離)及重組SpA(例如重組表現之野生型SpA)以降低總成本以及減少潛在免疫原性SpA片段與潛在治療性分子共同純化之風險。
在一些具體實例中，本發明係關於一種藉由親和層析純化抗體之方法，其中該方法包含以下步驟：使製程進料(process feed)與本發明之親和層析基質接觸以結合進料中之一或多種抗體；視情況進行洗滌步驟；添加適合洗提緩衝液以自基質中釋放結合之抗體；及自洗提液回收該一或多種抗體。本文所述之親和層析基質亦可用於自培養液、上清液以及醱酵液中分離抗體。在醱酵液之情況下，使用親和層析基質能夠分離抗體與宿主細胞蛋白質(HCP)、DNA、病毒、內毒素、營養素、細胞培養基之一或多種組分(例如消泡劑及抗生素)及產物相關雜質(諸如摺疊異常物質及聚集體)。
在一特定具體實例中，對進料進行機械過濾，隨後使其與本文所述之親和層析基質接觸，且因此移動相為澄清之細胞培養液。用於吸附之適合條件已為熟習此項技術者所熟知。
在另一具體實例中，本發明係關於一種用於純化抗體之多步製程，該製程包括使用本文所述之親和層析基質進行之捕獲步驟，繼之以用於中間物純化及/或抗體研磨之一或多個後續步驟。在一特定具體實例中，在捕獲步驟後繼之以結合與洗提模式或順流模式進行之疏水性相互作用及/或離子交換層析及/或弱分配層析。在一替代性步驟中，在捕獲步驟後繼之以結合與洗提模式或順流模式進行之多模式陰離子或陽離子交換層析及/或弱分配層析。
在另一具體實例中，可由後續純化步驟移除任何自親和層析基質中浸出之基於SpA之配位子直至可接受程度，例如直至認為對於原生蛋白質A配位子可接受之程度。
一般而言，預期本文所述之配位子可用於任何典型地採用蛋白質A配位子之製程中。
藉由以下實施例進一步說明本發明，該等實施例不應視為構成限制。本申請案通篇所引用之所有參考文獻、專利及公開專利申請案之內容以及圖式均以引用的方式併入本文中。
實施例
實施例1：產生一或多個結構域具有N端4個連續胺基酸缺失之SpA配位子
自DNA 2.0(Menlo Park,CA)獲得編碼以下蛋白質之合成基因。含有兩個Z結構域之SpA二聚蛋白質，各結構域在29位處含有突變(A29K)以降低或消除Fab結合(SEQ ID NO：85所示之胺基酸序列)；及含有兩個Z結構域之SpA二聚蛋白質，各結構域含有A29K突變且第二個Z結構域含有缺失而自N端缺失4個連續胺基酸(SEQ ID NO：78所示之胺基酸序列)。
各合成基因之5'端包含用於起始甲硫胺酸之密碼子且3'端包含用於使用NiNTA管柱進行後續純化之6個組胺酸密碼子(SEQ ID NO：86)。各基因之5'端及3'端分別含有NdeI及BamHI限制位點。用NdeI及BamHI(NEW ENGLAND BIOLABS,Ipswich,MA)消化此等合成基因以及所用表現載體(亦即pET11a(EMD))，在0.7%瓊脂糖TAE凝膠上分離DNA片段，且切除適當DNA片段並使用來自QIAGEN(Valencia,CA)之凝膠提取套組純化。使用T4 DNA接合酶(NEW ENGLAND BIOLABS,Ipswich,MA)將經純化之插入物接合至pET11a之主鏈或任何其他適合表現載體中。
按照製造商之說明書將接合反應物轉型至DH5α勝任型大腸桿菌(INVITROGEN,Carlsbad,CA)中，且塗於含有100 μg/mL安比西林(ampicillin)之Technova LB板上且在37℃下生長隔夜。為獲得經純化之DNA，選取個別群落以供在含有100 μg/mL安比西林之LB中培養隔夜。使用來自QIAGEN(Valencia,CA)之旋轉小規模純化套組(spin mini-prep kit)純化DNA。藉由使用NdeI及BamHI(NEW ENGLAND BIOLABS,Ipswich,MA)進行限制消化分析來確認重組質體之身分。包含Z結構域二聚構築體之兩個插入基因之質體的質體圖譜展示於圖2中。
另外，產生表現以下之構築體：含有5個Z結構域之SpA配位子之五聚形式，各結構域含有A29K突變(SEQ ID NO：91所示之胺基酸序列)；以及含有5個Z結構域之SpA配位子之五聚形式，其中各結構域含有A29K突變且除第一結構域以外之所有結構域均含有自N端之4個連續胺基酸缺失(SEQ ID NO：84所示之胺基酸序列)。
此外，亦產生含有C結構域之二聚SpA配位子構築體。產生表現C結構域配位子之二聚構築體，其胺基酸序列示於SEQ ID NO：92中；且產生表現2個C結構域配位子之二聚構築體，其中僅第二個C結構域包含自N端之4個連續胺基酸缺失，其胺基酸序列示於SEQ ID NO：35中。此等C結構域二聚配位子在29位處不具有突變。
實施例2：基於SpA之配位子之表現及純化
如上文所論述，可使用任何適合細菌表現系統來表現本文所述之各種SpA配位子。舉例而言，可使用pET載體(諸如pET11a(EMD))在大腸桿菌菌株(諸如菌株BL21(DE3)(PROMEGA,Madison WI))中表現蛋白質。
自培養板選擇單一群落，且在37℃下於含有100 μg/mL安比西林之LB培養基中生長隔夜。在新鮮的含有100 μg/mL安比西林之LB培養基中將隔夜培養物稀釋100倍，且生長至在600 nm下之光密度為約0.8之細胞密度。在添加1 mM異丙基-β-D-硫哌喃半乳糖苷後，使細胞再生長2小時。藉由SDS-PAGE分析及西方墨點法確認表現。
藉由離心(4000 rpm，4℃，5分鐘)收集細胞，且再懸浮於含有20 mM咪唑之3 mL磷酸鹽緩衝鹽水中。藉由音波處理使細胞溶解，且藉由離心(4000 rpm，4℃，30分鐘)使細胞碎片粒化。使用NiNTA樹脂(QIAGEN)純化SpA配位子，每3 mL管柱施加25-30 mL細胞溶解產物。用含有20 mM咪唑之30 mL磷酸鹽緩衝鹽水洗滌管柱2次，且在3 mL份含有200 mM咪唑之磷酸鹽緩衝鹽水中洗提SpA。相繼在18兆歐姆Milli-Q水(MILLIPORE,Billerica,MA)及10 mM NaHCO3中透析SpA隔夜。使用UV光譜儀基於理論消光係數(Pace等人,Protein Science 4：2411(1995))確認蛋白質濃度。
實施例3：基於SpA之配位子附著於固體支撐物
如實施例1及2中所述，產生及表現多種配位子之後，經由多點附著將其固定於固體支撐物。
在例示性實驗中，根據先前所述之方法(Porath及Fornstedt,J.Chromatography,51：479(1979))，使用表氯醇交聯瓊脂糖樹脂(Sepharose 4B)(GE HEALTHCARE)。隨後根據以下方法使瓊脂糖樹脂與帶正電締合基團(例如陽離子)反應：向10 mL樹脂中添加5 mL 75 wt%氯化縮水甘油基三甲銨(GTMAC)、5 mL Milli-Q水(MILLIPORE,Billerica,MA)及0.258 g 50 wt%氫氧化鈉。在室溫下於Techne HB-1D雜交器(BIBBY SCIENTIFIC,Burlington,NJ)中旋轉反應小瓶隔夜。接著過濾樹脂，且用3份10 mL體積之Milli-Q水(MILLIPORE,Billerica,MA)洗滌。
將樹脂(10 mL，濾餅)添加至含有3 mL 4.6 M NaOH之瓶中。使混合物漿化，接著添加4 mL丁二醇二縮水甘油醚(BUDGE)。在35℃下旋轉此混合物約2小時。接著用5×10 mL Milli-Q水(MILLIPORE,Billerica,MA)洗滌樹脂，且用2×10 mL之10 mM NaHCO3平衡。
在上述BUDGE活化步驟後，立即向5 mL珠粒濾餅中添加10 mL 10 mM NaHCO3溶液，其含有濃度為2.5 mg/mL及2.3 mg/mL之含有A29K突變之二聚Z結構域配位子(SEQ ID：85)或在第二個Z結構域中含有N端缺失之二聚Z結構域配位子(SEQ ID：78)。將混合物密封於玻璃小瓶中，且在37℃下旋轉小瓶約2小時。2小時後，用10 mL Milli-Q水洗滌樹脂3次。將珠粒濾餅(10 mL)添加至含有10 mL溶液之瓶中，該溶液包括1 mL硫代甘油及9 mL含有0.2 M NaHCO3及0.5 M NaCl之緩衝溶液。使混合物漿化，且在室溫下旋轉隔夜。接著用10 mL如下緩衝液洗滌樹脂3次：含有0.15 M NaCl(pH 8)及50 mM乙酸(pH 4.5)之0.1 M Tris緩衝液。接著用10 mL Milli-Q水及10 mL 20%乙醇水溶液(v/v)沖洗樹脂。將最終樹脂儲存於20%乙醇水溶液(v/v)中以待進一步使用。使二聚C結構域配位子與固體支撐物偶合之方法類似於本文中關於二聚Z結構域配位子所述之方法。
使上述5個結構域之配位子(SEQ ID NO：91及84)與瓊脂糖基礎樹脂偶合之方法類似於上述製程，但其中在偶合步驟期間使用15 mg/mL配位子。Z結構域五聚配位子不含His-6標籤。
實施例4：自由配位子或固定配位子之苛性浸泡後收集之上清液的SDS-PAGE分析
可使用SDS-PAGE分析來偵測本文所述之自由配位子及固定配位子在長期苛性暴露後之片段化。下文描述SDS-PAGE方案。
用勒姆利緩衝液(Laemmli buffer；BIORAD,Hercules,CA)以1：1比率稀釋含SpA之Milli-Q水、中和之苛性浸泡之配位子溶液及中和之樹脂浸泡溶液(各含有約0.5 mg/mL蛋白質)。在70℃下培育樣品5分鐘以確保蛋白質完全變性。將10 μL各樣品加載至AnyKD凝膠(BIORAD,Hercules,CA)或15% Tris-HCl Ready凝膠(BIORAD,Hercules,CA)上。在200伏特下於1X Tris-甘胺酸-SDS電泳緩衝液(THERMOFISHER,Waltham,MA)中進行凝膠電泳，持續30分鐘。接著在Gelcode Blue染色試劑(THERMOFISHER,Waltham,MA)中將SDS-凝膠染色1小時且在Milli-Q水中去染隔夜。
實施例5：自由配位子或固定配位子之苛性浸泡後收集之上清液的SEC分析
除上述SDS-PAGE分析以外，SEC(尺寸排阻層析)亦可用於自由配位子及固定配位子在長期苛性浸泡後之片段化分析。下文描述SEC實驗。
使用Agilent 1100 HPLC系統(AGILENT,Santa Clara,CA)進行SEC。將含SpA對照之Milli-Q水、中和之苛性浸泡配位子溶液(約0.5 mg/mL)及中和之樹脂浸泡溶液以13500 RPM離心10分鐘，隨後進行SEC-HPLC分析。將20 μL樣品注射至SEC管柱(SEPAX Zenix 7.8 mm×300 mm,SEPAX TECHNOLOGIES公司,Newark,Delaware)上。使用磷酸鈉緩衝液(200 mM，pH 7.0)作為移動相，流動速率為1 mL/min。使用來自Agilent之ChemStation軟體在230 nm及280 nm下進行SEC資料擷取及分析。
實施例6：配位子之苛性浸泡
如實施例2中所述，表現配位子之後，使配位子暴露於鹼性條件。
向1 mL各上述配位子(濃度為1 mg/mL)中添加1 mL 1 M NaOH，使得最終濃度為0.5 M NaOH及0.5 mg/mL配位子。緩緩旋轉樣品25小時。接著使用32 μL冰醋酸將此溶液中和至約pH 7。
在經苛性浸泡後及未經苛性浸泡下，使用SDS-PAGE進行之Z結構域及C結構域二聚配位子之片段化分析展示於圖3中。如圖3中所觀測，二聚Z結構域配位子(A29K無缺失，示於SEQ ID NO：85中，其用作對照)在0.5 M NaOH中苛性浸泡25小時後展示顯著片段化，如由約7 KDa處污點(smear)之存在以及較小片段之存在所展示(參見泳道3)。相比之下，具有A29K突變以及第二結構域中之4個連續胺基酸缺失之二聚Z結構域配位子(SEQ ID NO：78之胺基酸序列)似乎在0.5 M NaOH中苛性浸泡25小時後基本上保持完整(參見泳道6)。
類似地，與包含自第二結構域之N端之4個連續胺基酸缺失之二聚C結構域構築體(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：35中)(參見泳道12)相比，無缺失之二聚C結構域配位子(胺基酸序列示於SEQ ID NO：92中，用作對照)在0.5 M NaOH中苛性浸泡25小時後在SDS-PAGE上約7 KDa處展示污點以及較小片段存在(參見泳道9)。
各二聚Z結構域配位子及二聚C結構域配位子另外包含His-6標籤。未暴露於苛性浸泡之配位子展示於泳道2(二聚Z結構域對照)、泳道5(具有N端缺失之二聚Z結構域配位子)、泳道8(二聚C結構域對照)及泳道9(具有N端缺失之二聚C結構域配位子)中。
SEC進一步證實具有N端缺失之二聚Z結構域配位子及二聚C結構域配位子在長期苛性浸泡後之片段化減少。代表性SEC實驗之結果以SEC層析圖之形式展示於圖4中。如圖4中所見，Z結構域配位子之對照(具有SEQ ID NO：85所示之胺基酸序列)以及C結構域配位子之對照(具有SEQ ID NO：92所示之胺基酸序列)展示顯著片段化，由圖4中層析圖上之箭頭標明。相比之下，第二結構域中具有N端缺失之二聚Z結構域配位子及二聚C結構域配位子(Z結構域配位子胺基酸序列示於SEQ ID NO：78中且C結構域配位子胺基酸序列示於SEQ ID NO：35中)展示片段化減少，如由圖4中層析圖上之方框標明。
另外，亦藉由SDS-PAGE分析上述Z結構域配位子之五聚形式(亦即具有胺基酸序列SEQ ID NO：91之五聚Z結構域配位子，其代表對照；及具有胺基酸序列SEQ ID NO：84之五聚Z結構域配位子，其代表在除第一結構域以外之所有結構域中均具有N端4個連續胺基酸缺失之五聚配位子)在0.5 M NaOH中苛性浸泡25小時後之片段化。
如圖5中所見之SDS-PAGE凝膠資料所證實，與五聚Z結構域配位子對照(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：91中)(參見泳道6)相比，在除第一結構域以外之所有結構域中均具有自N端之4個連續胺基酸缺失之Z結構域配位子之五聚形式(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：84中)在配位子於0.5 M NaOH中浸泡25小時後展示片段化少得多(參見泳道3)。如上文所論述，兩種形式之五聚配位子均具有A29K突變。未經浸泡之配位子似乎保持完整(泳道2及5)。
泳道8-10描繪以通常用於純化製程中之重組SpA配位子(rSPA)所觀測之片段化。與Z結構域對照相比，rSPA配位子似乎在0.5 M NaOH中苛性浸泡25小時後展示片段化程度甚至更大，如由SDS-PAGE上蛋白質幾乎消失所觀測(參見泳道9)。未暴露於苛性條件之rSPA配位子處於泳道8中。
此結果似乎表明與常用SpA配位子(諸如rSPA)相比，本文所述之具有N端缺失之基於Z結構域之配位子為更優良的候選物。
使用SEC進一步確認所觀測到的具有N端缺失之五聚Z結構域配位子在0.5 M NaOH中苛性浸泡25小時後之片段化減少，一個此類代表性實驗之結果展示於圖6中。
如圖6中之層析圖所展示，無胺基酸缺失之Z結構域對照之五聚形式(SEQ ID NO：91)展示在較低分子量下良好解析之峰，表明較小片段存在。相比之下，具有N端缺失之Z結構域之五聚形式(SEQ ID NO：84)在較低強度下展示顯著較少之不同峰，表明與對照相比片段化程度低得多。
常用SPA配位子(rSPA)展示最大程度之片段化或分解，其中完全不保留完整分子。值得注意的是，SEC層析圖與圖5中之SDS-PAGE分析之結果一致，進一步證實rSPA配位子在長期暴露於苛性條件(亦即於0.5 M NaOH中浸泡25小時)後之降解程度使得在SEC層析圖上觀測不到顯著片段。
實施例7：固定於樹脂上之配位子之苛性浸泡
在將先前實施例中所述之各種配位子附著於固體支撐物(例如瓊脂糖層析樹脂)之後，評估其在苛性暴露後之片段化。
對於各相關樹脂，使用Milli-Q水量測5 mL拋棄式層析管柱(EVERGREEN SCIENTIFIC,Los Angeles,CA)中之1 mL樹脂。在管柱中用2 CV(2 mL)0.5 M NaOH快速調節樹脂，再漿化且抽真空。再一次重複NaOH調節後，將抽真空之濕樹脂餅轉移至4 mL試管(THERMOFISHER,Waltham,MA)中。將2 mL 0.5 M NaOH添加至管柱中(底部封蓋)且立即與相應樹脂一起轉移至試管中。將封蓋之試管置放於旋轉器上且旋轉試管25小時。在苛性浸泡結束時，將試管中之內含物傾倒至拋棄式管柱中且收集濾液。用50 μL冰醋酸中和1.5 mL濾液且準備由SEC及SDS-PAGE進行進一步分析。
固定之二聚Z結構域配位子及二聚C結構域配位子在長期苛性浸泡(例如於0.5 M NaOH中浸泡25小時)後之SDS-PAGE分析展示於圖3中。一般而言，預期若配位子在固定於層析基質(例如瓊脂糖樹脂)上之後為苛性穩定的，則其將不會展示任何顯著片段化。
如由圖3之SDS-PAGE凝膠所觀測，二聚Z結構域配位子及二聚C結構域配位子固定對照(胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：85及92中且分別由SDS-PAGE凝膠之泳道4及10呈現)以及在第二結構域中含有N端缺失之二聚Z結構域及C結構域固定配位子(胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：78及35中且分別由泳道7及13呈現)在0.5 M NaOH中浸泡25小時後似乎均不展示任何可偵測之片段化，表明其均為苛性穩定的。
固定之五聚Z結構域配位子在長期苛性浸泡(例如於0.5 M NaOH中浸泡25小時)後之SDS-PAGE分析展示於圖5中。如由圖5中之SDS-PAGE凝膠所觀測，在除第一結構域以外之所有結構域中均含有N端缺失之五聚Z結構域配位子(胺基酸序列示於SEQ ID NO：84中且由SDS-PAGE凝膠之泳道4呈現)與其野生型五聚Z結構域對照(SEQ ID NO：91及泳道7)相比展示片段化少得多。此結果表明固定之具有N端缺失之五聚Z結構域配位子與固定之不具有該等缺失之五聚Z結構域相比苛性穩定性更高。
此外，亦藉由SDS-PAGE研究常用配位子(亦即rSPA)在固定於瓊脂糖層析樹脂上且使具有配位子之樹脂經歷於0.5 M NaOH中長期浸泡25小時後之片段化。如圖5之SDS-PAGE凝膠之泳道10中所見，與五聚Z結構域配位子(泳道4及7)相比，固定之rSPA在0.5 M NaOH中浸泡25小時後展示顯著片段化，表明其苛性穩定性不太高。
基於圖5上之SDS-PAGE凝膠結果，可推斷出固定之具有N端缺失之五聚Z結構域配位子與固定之五聚Z結構域對照配位子及固定之rSPA相比，在長期苛性暴露後具有最小片段化且因此苛性穩定性最高。
藉由SEC分析進一步確認固定之五聚Z結構域配位子及rSPA配位子之SDS-PAGE結果。代表性實驗之結果描繪於圖7所示之層析圖中。如圖7中所見，固定之SEQ ID NO：84之Z結構域配位子與其SEQ ID NO：91之野生型對應物(其在層析圖上展示解析之較低分子量峰)相比，在長期苛性浸泡後展示片段化減少，如由方框所示。此外，如預期，固定之rSPA在長期苛性浸泡後展示大量片段化，如由層析圖上之較寬且未解析之峰所觀測。
實施例8：量測暴露於0.5 M NaOH 25小時之前及之後層析基質對免疫球蛋白之靜態結合能力
進一步測試上述親和層析基質(亦即上面經由多點附著而固定有樹脂的樹脂)在暴露於0.5 M NaOH 25小時之前及之後的靜態結合能力。
在一個實驗中，將暴露於0.1、0.3或0.5 M NaOH或未暴露於NaOH之固定有上述二聚或五聚Z結構域或C結構域配位子之各層析基質(體積1 mL)在Milli-Q水(MILLIPORE,Billerica,MA)中製成10%漿料。將1 mL各漿料添加至含15 mL多株IgG(SERACARE，1 mg/mL)之10 mM磷酸鹽緩衝鹽水中，且在室溫下旋轉4小時。使用280 nm下UV之減少來計算苛性暴露之前及之後的結合能力。藉由用苛性暴露後之IgG結合能力除以未經苛性暴露之IgG結合能力來計算保留之IgG結合能力百分比。表II概述一個此類實驗之結果。如表II中所概述，SEQ ID NO：78之二聚Z結構域配位子與其野生型對應物(亦即SEQ ID NO：85之二聚Z結構域配位子)相比，在0.5 M NaOH中長期苛性浸泡25小時後似乎展現較高保留之結合能力。
類似地，亦如下表II中所概述，SEQ ID NO：35之二聚C結構域配位子與其SEQ ID NO：92之野生型對應物相比，在0.5 M NaOH中長期苛性浸泡25小時後似乎展現較高保留之結合能力。
在另一實驗中，評估五聚Z結構域配位子在0.1 M NaOH、0.3 M NaOH或0.5 M NaOH中長期苛性浸泡25小時後之IgG結合能力。一個此類實驗之結果概述於下表III中。
表III展示在將上面固定有Z結構域配位子之五聚形式之基質浸泡於0.1 M NaOH、0.3 M NaOH或0.5 M NaOH中之後，該基質所保留之IgG結合能力百分比，該Z結構域配位子之五聚形式含有A29K突變且除第一結構域以外之所有結構域均包含自N端之4個連續胺基酸缺失(SEQ ID NO：84所示之胺基酸序列)。如下文所概述，具有五聚Z結構域N端缺失配位子之基質在0.1 M NaOH中浸泡25小時後展示至多95%之初始結合能力；在0.3 M NaOH中浸泡25小時後展示至多85%之初始結合能力；且在0.5 M NaOH中浸泡25小時後展示至多65%之初始結合能力。
實施例9：暴露於0.5 M NaOH之前及之後IgG之SpA捕獲
在此實驗中，檢查使用固定有除第一結構域以外之所有結構域均具有4個連續胺基酸缺失的Z結構域配位子五聚體之基質以及具有以重組方式合成之SpA(rSPA)之基質對剔除型(null)CHO-S進料中之多株免疫球蛋白進行的純化，以展示本發明之配位子在移除雜質方面與重組SpA表現相當。
將固定有rSPA之樹脂樣品(REPLIGEN,Waltham,MA)及固定有Z結構域五聚配位子(SEQ ID NO：84所示之胺基酸序列)之樹脂樣品各自裝填至具有1 cm直徑及5 cm填充床高度之層析管柱中。在用磷酸鹽緩衝鹽水(10 mM磷酸鈉)平衡後，使填充樹脂以50 cm/h之流動速率暴露於具有多株hIgG之剔除型CHO進料(SERACARE，5 mg/mL)。在90%之5%穿透量(breakthrough)下加載後，用PBS緩衝液及50 mM NaOAc(pH 5.5)洗滌樹脂。隨後用50 mM NaOAc(pH 3)洗提結合之IgG。收集且分析洗提份以供雜質分析。接著使填充樹脂暴露於0.5 M NaOH 15分鐘(流動速率100 cm/h)，隨後再與剔除型CHO進料中之多株hIgG接觸。接著用PBS緩衝液及50 mM NaOAc(pH 5.5)洗滌樹脂且洗提IgG以供進一步分析。
重複此苛性暴露與進料操作循環以收集充足IgG以用於後續陽離子交換步驟。根據製造商之說明書，使用n-蛋白質A ELISA(REPLIGEN,Waltham,MA)定量浸出之蛋白質A。按照製造商之說明書，使用3G CHO HCP ELISA套組(CYGNUS TECHNOLOGIES,Southport,NC)偵測宿主細胞蛋白質。使用Quant-iTTM PicoGreen dsDNA試劑(LIFE TECHNOLOGIES,Foster City,CA)偵測DNA。一個此類代表性實驗之結果展示於表IV中。
實施例10：使用陽離子交換層析及陰離子交換層析清除浸出之SpA配位子且進一步移除DNA及宿主細胞蛋白質
如下檢查自併有本發明SpA配位子之層析親和基質或含有重組SpA(rSPA)之層析親和基質(REPLIGEN,Waltham,MA)之洗提庫清除浸出之配位子且進一步移除宿主細胞蛋白質(HCP)及DNA。
來自重複進行若干次的實施例8中所述之實驗之洗提庫之組合提供用於使用陽離子交換層析進一步清除浸出之配位子及其他雜質的進料。
將Fractogel SO3 -(MILLIPORE,Billerica,MA)裝填至床尺寸為1.0 cm(內徑)×7 cm(床高度)之管柱中。用50 mM NaOAc(pH 4.5)以4 mS/cm平衡管柱，且用自蛋白質A洗提所彙集之IgG以140 cm/h加載。用EQ緩衝液洗滌管柱後，用超過20管柱體積之含0.5 N NaCl之50 mM NaOAc(線性梯度)洗提IgG。以10 mL洗提份收集洗提庫，且分析浸出之配位子、DNA及宿主細胞蛋白質。
進一步彙集來自Fractolgel SO3 -管柱之洗提份，且以12 mS/cm調節至pH 7.6。將此進料以1 mL/min之流動速率加載至預先平衡(Tris，25 mM，pH 7.6，約1 mS/cm)之ChromaSorb裝置(0.08 mL；MILLIPORE,Billerica,MA)上。每187管柱體積收集洗提份，且進一步分析浸出之配位子及宿主細胞蛋白質，如實施例8中所述。
如下表IV中所概述，在陽離子交換層析及陰離子交換層析後，可清除浸出之rSPA配位子以及除第一結構域以外之所有結構域均具有N端4個連續胺基酸缺失之Z結構域之五聚形式(胺基酸序列示於SEQ ID：84中)，至小於1 PPM。另外，宿主細胞蛋白質及DNA之移除符合工業標準，且在兩種情況下大致等效，亦如下表中所概述。
實施例11：N端胺基酸缺失數目對長期苛性浸泡後配位子之片段化的影響
在另一實驗中，使1個、2個、3個或4個胺基酸殘基自二聚Z結構域配位子之第二結構域之N端缺失(起始於1位)，且與對照二聚Z結構域配位子(A29K)相比，確定1個、2個、3個或4個胺基酸缺失對長期苛性浸泡後配位子之片段化的影響。
一個此類實驗之結果描繪於圖8所示之層析圖中。如圖8所展示，在將各配位子於0.5 M NaOH中長期苛性浸泡25小時，隨後進行SEC分析(如實施例5中所述)後，可觀測自二聚Z結構域配位子之第二結構域之N端缺失之胺基酸殘基數目對片段化的影響。
將配位子浸泡於0.5 M NaOH中25小時後，各對照配位子(SEQ ID NO：85)、僅自第二結構域之N端缺失第一胺基酸之配位子(SEQ ID NO：87)及自第二結構域之N端缺失前兩個胺基酸之配位子(SEQ ID NO：88)展示較低分子量之片段，如箭頭所示，由此證實片段化。然而，自第二結構域之N端缺失前三個胺基酸之配位子(SEQ ID NO：69)及自第二結構域之N端缺失前四個胺基酸之配位子(SEQ ID NO：78)展示在較低分子量下片段化顯著減少，如層析圖中之方框所示，由此證實片段化減少。
此等結果表明一或多個基於蛋白質A之結構域且自一或多個結構域之N端缺失至少3個胺基酸之親和配位子在長期苛性暴露後展現片段化減少，且因此為用作親和層析配位子之優良候選物。
實施例12：N端缺失C結構域五聚物與野生型C結構域五聚物(兩者均具有非Fab突變(G29K))所保留之結合能力比較
在此實驗中，檢查固定於基於聚乙烯醇之層析基質上的兩個C結構域五聚配位子所保留之結合能力，一個配位子在5個結構域中之每一者中具有N端4個胺基酸缺失(起始於1位)，其具有丙胺酸作為五聚體序列之第一胺基酸以有助於均質轉譯後處理且具有G29K突變(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：93中)；且另一個配位子對應於其具有G29K突變之野生型對應物(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：95中)。
將配位子經由多點附著而固定於基於聚乙烯醇之親和層析樹脂上(參見例如Hermanson等人,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,第51-136頁(1992))，且測試重複NaOH暴露後所保留之動態結合能力。
在一個實驗中，將層析基質裝填至管柱(0.66 cm內徑×1.0 cm床高度)中，且在平衡下進行標準層析操作，接著以60 cm/h施加30 mg多株人類IgG(hIgG)。用平衡緩衝液(10 mM磷酸鹽緩衝鹽水)澈底洗去未結合之蛋白質後，用洗提緩衝液(0.1 M檸檬酸，pH 3)以60 cm/h洗提結合之IgG。接著用0.7 M NaOH原位清洗(CIP)30分鐘。對管柱進行再平衡且再重複該操作16次(累積暴露於0.7 M NaOH 8小時)。藉由測定隨著時間洗提之IgG之總量(洗提體積乘以UV280下量測之IgG濃度)來量測所保留之結合能力。針對暴露於NaOH 0 min之首輪操作繪製相對保留能力之曲線，且展示於圖9中。重複此實驗3次得到類似結果。如圖9所展示，具有缺失及不具有缺失之C結構域五聚配位子在長期暴露於NaOH後隨著時間而保留類似的結合能力。此外，在另一實驗中，將不具有丙胺酸且具有G29K突變之C結構域五聚配位子(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：80中)所保留之結合能力與其具有G29K突變之野生型對應物(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：95中)所保留之結合能力進行比較，得到類似結果(資料未圖示)。
根據本說明書中所引用之參考文獻之教示最充分地理解本說明書，該等參考文獻藉此以引用的方式併入。本說明書中之具體實例提供本發明中具體實例之說明且不應視為限制本說明書之範疇。熟習此項技術者易於認識到本發明涵蓋許多其他具體實例。所有公開案及發明均以全文引用的方式併入。當以引用的方式併入之材料與本說明書相矛盾或不一致時，本說明書將取代任何此類材料。本文中對任何參考文獻之引用並非承認該等參考文獻為本發明之先前技術。
除非另有指示，否則本說明書(包含申請專利範圍)中所用之表示成分、細胞培養物、處理條件等之量的所有數字應理解為在所有情況下均由術語「約」修飾。因此，除非另有相反指示，否則數值參數為近似值且可視本發明設法獲得之所需特性而變化。除非另有指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指代該系列中之每個要素。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所述之本發明特定具體實例的許多等效物。該等等效物欲由以下申請專利範圍涵蓋。
如熟習此項技術者顯而易知，可在不偏離本發明之精神及範疇的情況下對本發明作出許多修改及變化。本文所述之特定具體實例僅作為實例提供且不欲以任何方式構成限制。預期本說明書及實施例僅視為例示性的，且本發明之真實範疇及精神由以下申請專利範圍指示。
圖1描繪由SEQ ID NO：1-6表示之SpA之野生型(wt)IgG結合域以及Z結構域之胺基酸序列比對。
圖2描繪以下質體之示意圖：含有編碼具有A29K突變之二聚Z結構域配位子之核酸序列且胺基酸序列示於SEQ ID NO：85中之質體pET11a(對照)，及含有編碼具有A29K突變以及包含自N端之4個連續胺基酸缺失之第二結構域之二聚Z結構域配位子之核酸序列且胺基酸序列示於SEQ ID NO：78中之質體pET11a。配位子構築體另外包含3'端處之His標籤序列。
圖3為用於分析在0.5 M NaOH中苛性浸泡25小時或未進行浸泡之自由二聚Z及C配位子以及固定二聚Z及C配位子之片段化模式的庫馬斯染色SDS-PAGE凝膠(Coomassie stained SDS-PAGE gel)。SDS-PAGE凝膠之各個泳道之描述如下。泳道1：分子標記物；泳道2：未經苛性暴露之二聚Z結構域配位子(A29K無缺失，示於SEQ ID NO：85中，其用作對照且包含His標籤)；泳道3：在0.5 M NaOH中浸泡25小時之二聚Z結構域配位子對照；泳道4：固定於瓊脂糖層析樹脂上之二聚Z結構域配位子對照，其在0.5 M NaOH中浸泡25小時；泳道5：第二結構域具有自N端之4個連續胺基酸缺失之二聚Z結構域配位子(第二結構域具有缺失且具有His標籤之A29K，示於SEQ ID NO：78中)，其未經苛性暴露；泳道6：具有His標籤之SEQ ID NO：78之二聚Z結構域配位子，其在0.5 M NaOH中浸泡25小時；泳道7：具有His標籤之SEQ ID NO：78之二聚Z結構域配位子，其固定於瓊脂糖層析樹脂上且在0.5 M NaOH中浸泡25小時；泳道8：未經苛性暴露之無缺失之二聚C結構域配位子，其用作對照(胺基酸序列示於SEQ ID NO：92中且具有His標籤)；泳道9：二聚C結構域配位子對照，其在0.5 M NaOH中浸泡25小時；泳道10：二聚C結構域配位子，其固定於瓊脂糖層析樹脂上且在0.5 M NaOH中浸泡25小時；泳道11：第二結構域具有N端缺失之二聚C結構域配位子(胺基酸序列示於SEQ ID NO：35中且具有His標籤)；泳道12：具有His標籤之SEQ ID NO：35之二聚C結構域配位子，其在0.5 M NaOH中浸泡25小時；及泳道13：具有His標籤之SEQ ID NO：35之二聚C配位子，其固定於瓊脂糖層析樹脂上且在0.5 M NaOH中浸泡25小時。
圖4為以上圖3之描述中概述之二聚Z配位子及二聚C配位子之SEC分析的層析圖。x軸表示滯留時間(分鐘)，較小分子之滯留時間長於較大分子之滯留時間。y軸表示280 nm下之UV吸收(mAU)。在長期苛性浸泡(亦即在0.5 M NaOH中浸泡25小時)後，第二結構域中具有N端缺失之二聚Z結構域配位子及二聚C結構域配位子之片段化減少的證據由層析圖上之方框展示，且二聚Z結構域對照及二聚C結構域對照之較小片段的存在由箭頭展示。
圖5為用於分析在0.5 M NaOH中苛性浸泡25小時或未進行浸泡之自由五聚Z結構域配位子及固定五聚Z結構域配位子之片段化模式的庫馬斯染色SDS-PAGE凝膠。SDS-PAGE凝膠之各個泳道之描述如下：泳道1：分子量標記物；泳道2：具有A29K突變及除第一結構域以外之所有結構域均具有自N端之4個連續胺基酸缺失的五聚Z結構域配位子，其胺基酸序列示於SEQ ID NO：84中，未經苛性暴露；泳道3：SEQ ID NO：84之五聚Z結構域配位子，其在0.5 M NaOH中浸泡25小時；泳道4：SEQ ID NO：84之五聚Z結構域配位子，其固定於瓊脂糖層析樹脂上且在0.5 M NaOH中浸泡25小時；泳道5：SEQ ID NO：91之五聚Z結構域配位子，其用作對照，未經苛性浸泡；泳道6：五聚Z結構域配位子對照，其在0.5 M NaOH中浸泡25小時；及泳道7：五聚Z結構域配位子對照，其固定於瓊脂糖層析樹脂上且在0.5 M NaOH中浸泡25小時。此外，泳道8、9及10係關於對rSPA進行類似處理而獲得之結果，其中泳道8表示未經任何苛性浸泡之rSPA；泳道9表示在0.5 M NaOH中浸泡25小時之rSPA及在0.5M NaOH中浸泡25小時之固定rSPA。色帶表示片段化，如箭頭所示。
圖6為以上圖5之描述中概述之五聚Z結構域配位子之SEC分析的層析圖。x軸表示滯留時間(分鐘)，較小分子之滯留時間長於較大分子之滯留時間。y軸表示280 nm下之UV吸收(mAU)。在長期苛性浸泡後，除第一結構域以外之所有結構域中均具有N端缺失之五聚Z結構域配位子之情況下片段化減少的證據由層析圖上之方框展示，且在五聚Z結構域對照之情況下所見之較小片段的存在由指向片段之箭頭展示。此外，亦可使用SEC觀測rSPA之大量片段化。
圖7為以上圖5之描述中概述之固定五聚Z結構域配位子之SEC分析的層析圖。x軸表示滯留時間(分鐘)，較小分子之滯留時間長於較大分子之滯留時間。y軸表示280 nm下之UV吸收(mAU)。在長期苛性浸泡後，第二結構域中具有N端缺失之固定五聚Z結構域配位子之情況下片段化減少的證據由層析圖上之方框展示，且在五聚Z結構域對照之情況下所見之較小片段的存在由指向片段之箭頭展示。此外，亦可使用SEC觀測固定rSPA之大量片段化。
圖8為自由二聚Z結構域配位子在長期苛性浸泡後之SEC分析的層析圖，其中該等配位子包含二聚配位子之第二結構域之前一個胺基酸(SEQ ID NO：87)、前兩個胺基酸(SEQ ID NO：88)、前三個胺基酸(SEQ ID NO：69)或前四個胺基酸(SEQ ID NO：78)之N端缺失。x軸表示滯留時間(分鐘)，較小分子之滯留時間長於較大分子之滯留時間。y軸表示280 nm下之UV吸收(mAU)。自第二結構域之N端缺失前三個或前四個胺基酸之二聚配位子在長期苛性浸泡後之片段化減少的證據由方框展示。無胺基酸缺失(SEQ ID NO：85)或自第二結構域之N端缺失第一胺基酸或缺失前兩個胺基酸之二聚配位子在長期苛性浸泡後所觀測之片段化的存在由層析圖上指向片段存在之箭頭展示。
圖9比較固定之C結構域五聚配位子在重複苛性暴露後所保留之結合能力，其中一個五聚配位子包含各結構域中之N端4個胺基酸缺失、各結構域中之G29K突變以及作為五聚物中之第一胺基酸之丙胺酸(胺基酸序列示於SEQ ID NO：93中)；且另一個五聚配位子為其具有G29K突變之野生型對應物(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：95中)。x軸表示歷經16次循環(每次循環30分鐘)之層析基質累積暴露於0.7 M NaOH之時間。y軸表示保留之結合能力百分比。
<110> EMD密理博公司(EMD MILLIPORE CORPORATION) <120> 包含新穎之基於金黃色葡萄球菌蛋白質A之配位子的層析基質 <130> MCA-1353 <140> <141> <150> 61/494,701 <151> 2011-06-08 <160> 96 <170> PatentIn 3.5版 <210> 1 <211> 51 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 1 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 2 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 3 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 4 <210> 5 <211> 61 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 5 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 6 <210> 7 <211> 159 <212> DNA <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 7 <210> 8 <211> 174 <212> DNA <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 8 <210> 9 <211> 174 <212> DNA <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 9 <210> 10 <211> 174 <212> DNA <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 10 <210> 11 <211> 177 <212> DNA <213> 金黃色葡萄球菌 <400> 11 <210> 12 <211> 174 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成聚核苷酸 <400> 12 <210> 13 <211> 55 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 13 <210> 14 <211> 55 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 14 <210> 15 <211> 55 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 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<220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 29 <210> 30 <211> 54 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 30 <210> 31 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 31 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 32 <210> 33 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 33 <210> 34 <211> 112 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 34 <210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 35 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 36 <210> 37 <211> 270 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 37 <210> 38 <211> 270 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 38 <210> 39 <211> 270 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 39 <210> 40 <211> 274 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 40 <210> 41 <211> 274 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 41 <210> 42 <211> 274 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列描述：合成多肽 <400> 42 <210> 43 <211> 51 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Claims (13)

  1. 一種親和層析配位子，其包括一或多個葡萄球菌蛋白質A(Staphylococcus Protein A，SpA)之C結構域，其中至少一個C結構域包括自N端之起始於對應於C結構域之野生型對應物的1位或2位之至少3個連續胺基酸缺失，其中該配位子與野生型對應物相比在暴露於0.5M NaOH至少5小時後展現片段化減少，且其中該配位子之一或多個結構域包括用以降低Fab結合之突變。
  2. 如申請專利範圍第1項之親和層析配位子，其中該親和層析配位子包括2個、3個、4個、5個、6個、7個或7個以上之葡萄球菌蛋白質A(SpA)C結構域，其中至少一個C結構域包括起始於1位或2位之自N端之3個連續胺基酸缺失或自N端之4個連續胺基酸缺失或自N端之5個連續胺基酸缺失。
  3. 如申請專利範圍第1項之親和層析配位子，其中該配位子之一或多個結構域在29位處包括用以降低Fab結合之胺基酸突變。
  4. 如申請專利範圍第3項之親和層析配位子，其中該胺基酸突變包括用離胺酸胺基酸殘基置換甘胺酸胺基酸殘基。
  5. 如申請專利範圍第1項之親和層析配位子，其包括兩個或兩個以上SpA之C結構域，其中該配位子與野生型對應物相比在暴露於0.5M NaOH 5小時後展現片段化減少。
  6. 一種親和層析基質，其包括附著於固體支撐物之如申 請專利範圍第1項之親和層析配位子。
  7. 如申請專利範圍第6項之親和層析基質，其中親和層析配位子經由多點附著而附著於該固體支撐物。
  8. 如申請專利範圍第6項之親和層析基質，其中該配位子當附著於該固體支撐物時與野生型對應物相比，在暴露於0.5M NaOH 5小時後展現片段化減少。
  9. 如申請專利範圍第6項之親和層析基質，其中該基質在0.5M NaOH中培育5小時後保留至少95%之其初始結合能力。
  10. 如申請專利範圍第6項之親和層析基質，其中該基質在0.1M NaOH中培育25小時後保留至少95%之其初始結合能力。
  11. 如申請專利範圍第6項或第7項之親和層析基質，其中該固體支撐物選自由受控孔玻璃、二氧化矽、氧化鋯、氧化鈦、瓊脂糖、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚乙烯醚、聚乙烯醇及聚苯乙烯及其衍生物組成之群。
  12. 一種自樣品中親和純化一或多種目標分子之方法，該方法包括以下步驟：(a)提供包括一或多種目標分子之樣品；(b)使該樣品與如申請專利範圍第6項之基質在使該一或多種目標分子結合於該基質之條件下接觸；及(c)藉由洗提回收該一或多種經結合之目標分子。
  13. 一種親和配位子，其包括以下結構： [(X)n,(Y)m]n+m，其中X表示SpA之C結構域；n表示在0至(m-1)範圍內之結構域數目；Y表示SpA之自N端缺失至少3個連續胺基酸之C結構域；且m表示在1至8範圍內之Y結構域數目，其中該配位子經由多點附著而附著於固體支撐物，且其中該配位子之一或多個結構域包括用以降低Fab結合之突變。
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