KR20170121746A

KR20170121746A - 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법 및 단쇄 펩타이드 고정화 담체

Info

Publication number: KR20170121746A
Application number: KR1020177029097A
Authority: KR
Inventors: 고이치 미나미
Original assignee: 후지필름 가부시키가이샤
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2017-11-02
Also published as: BR112017022095A2; US20180037669A1; RU2017134828A3; EP3284757A4; EP3578571A1; WO2016167143A1; EP3284757B1; JPWO2016167143A1; CA2982430A1; RU2017134828A; SG11201708170VA; US10927188B2; JP6588535B2; CN107531799B; EP3284757A1; CN107531799A

Abstract

알코올 용매 및 알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기되고, 또한 복수의 고정화 관능기를 갖는 단쇄 펩타이드를 포함하는 알코올 용액을 준비하는 공정과, 고정화 관능기와 반응하는 반응성기를 갖는 스페이서가 결합된 담체와 알코올 용액을 접촉시켜, 단쇄 펩타이드를 스페이서에 고정화하는 공정을 포함하는, 단쇄 펩타이드의 2차 구조가 유지되는 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법이 제공된다.

Description

단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법 및 단쇄 펩타이드 고정화 담체{METHOD OF PRODUCING SHORT-CHAIN PEPTIDE IMMOBILIZATION CARRIER AND SHORT-CHAIN PEPTIDE IMMOBILIZATION CARRIER}

본 발명은 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법 및 단쇄 펩타이드 고정화 담체에 관한 것이다.

최근, 항체 의약의 개발이 활황을 나타내고 있다. 인간 면역 기능을 사용하는 항체 의약은 높은 효능을 기대할 수 있고, 부작용도 비교적 적기 때문에, 향후 의료의 중심으로 보여지고 있기 때문이다. 항체 의약의 개발·실용화에 없어서는 안될 기술이 항체의 연속·대량·고속의 정제 기술이다. 항체의 정제를 위하여, 현재 가장 일반적으로 이용되고 있는 방법은 프로테인 A를 리간드로서 이용한 어피니티 크로마토그래피법이다.

그러나, 프로테인 A는, 유전자 공학적 방법을 이용하여 제조되기 때문에, 제조 공정이 번잡하고, 프로테인 A 자체를 어피니티 크로마토그래피용 리간드로서 이용하면, 결과적으로 고비용이 된다는 문제가 있었다.

이와 같은 문제에 대해서는, 프로테인 A의 IgG(Immunoglobulin G; 면역 글로불린 G)와 상호 작용을 하는 부분의 아미노산 배열에 근거하여, 길이가 대략 50잔기 이하인 단쇄 펩타이드를 이용하는 것이 검토되어 왔다(예를 들면, 비특허문헌 1).

한편, 단쇄 펩타이드를 담체 상에 고정화하는 방법으로서는, 예를 들면 특허문헌 1에 기재된, 기판 상에 2차원 미세 박막을 형성하는 방법을 들 수 있다. 이 방법은, 박막을 형성하기 위한 유기 분자 재료로서, 적어도 펩타이드쇄를 갖고, 그 펩타이드쇄가, (1) 4~50의 아미노산 잔기로 구성되며, (2) 적어도 친수성 아미노산 잔기 및 소수성 아미노산 잔기를 갖고, 또한 (3) 기재 상에 흡착될 수 있으며, 흡착되었을 때에는 β-시트 구조를 형성할 수 있는 아미노산 배열을 갖는, 3조건을 모두 구비하는 것을 특징으로 하는 유기 분자 재료를 준비하는 공정과, 펩타이드쇄가 α-헬릭스 또는 랜덤 코일 구조를 유지할 수 있는 농도에서 그 유기 분자 재료를 포함하고, 또한 유기 분자 재료가 개개에 유리(遊離)하여 분산된 상태의 용액을 조제하는 공정과, 용액을 기재의 표면에 공급하여, 용액 중의 유기 분자 재료를 기재 상에 흡착시킴과 함께 기재 상에 흡착했을 때의 유기 분자 재료의 펩타이드쇄가 각각 β-시트를 형성하여 이루어지는 단분자막을 기재 상에 마련하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

특허문헌 1: 일본 공개특허공보 2010-001238호

비특허문헌 1: Braisted, A. C., 외 1명, "Minimizing a binding domain from protein A", 미국 과학 아카데미 기요, 미국 과학 아카데미, 1996년 6월, 제93권, 제12호, p. 5688-5692

그러나, 본 발명자가 검토한 바로는, 특허문헌 1에 기재된 방법으로는, 용액 중에서 단쇄 펩타이드에 유기(誘起)시킨 2차 구조를 유지한 채로 담체에 고정화하는 것이 곤란했다. 의도적으로 유기 형성한 2차 구조를 그대로 고정화할 수 없으므로, 고정화에 의하여 단쇄 펩타이드의 2차 구조가 변화하여, 항원 항체 반응 등의 입체 구조를 이용한 결합능이 저하되거나 소실되는 것이 문제가 된다. 또한, 단분자층 형성이 필요하고, 비용이 비싸, 실용되기 힘들었다.

따라서, 본 발명은, 단쇄 펩타이드의 2차 구조가 유지되는 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 알코올 용매 및 알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기되고, 또한 복수의 고정화 관능기를 갖는 단쇄 펩타이드를 포함하는 알코올 용액을 준비하는 공정과, 고정화 관능기와 반응하는 반응성기를 갖는 스페이서가 결합된 담체와 알코올 용액을 접촉시켜, 단쇄 펩타이드를 스페이서에 고정화하는 공정을 포함함으로써, 단쇄 펩타이드를, 2차 구조를 유지한 채로, 담체에 고정화할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 본 발명에서는, 항원 항체 반응이 가능한 단쇄 펩타이드 고정화 담체를 얻을 수 있고, 높은 결합성을 갖는 담체를 얻을 수 있다. 또한, 반응성기를 갖는 스페이서를 이용함으로써, 단분자층 형성이 불필요하여, 저비용화가 가능해진다.

즉, 본 발명은 이하의 (1)~(9)를 제공한다.

(1) 알코올 용매 및 알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기되고, 또한 복수의 고정화 관능기를 갖는 단쇄 펩타이드를 포함하는 알코올 용액을 준비하는 공정과,

고정화 관능기와 반응하는 반응성기를 갖는 스페이서가 결합된 담체와 알코올 용액을 접촉시켜, 단쇄 펩타이드를 스페이서에 고정화하는 공정을 포함하는, 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.

(2) 단쇄 펩타이드가 34잔기 이하인, 상기 (1)에 기재된 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.

(3) 단쇄 펩타이드와 스페이서가 공유 결합을 통하여 고정화되는, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.

(4) 스페이서의 분자량이 10000 이하인, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.

(5) 고정화 관능기가 싸이올기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.

(6) 고정화 관능기가 단쇄 펩타이드의 적어도 한쪽의 말단에 위치하는, 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.

(7) 단쇄 펩타이드가, 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기가 복수 포함되고, 또한 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기의 사이에 고정화 관능기를 갖지 않는 아미노산 잔기를 적어도 하나 포함하는 부분 구조를 갖는, 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.

(8) 담체와, 담체 상에 결합된 스페이서와, 스페이서 상에 배치되고, 또한 2차 구조가 유지되어 있는 단쇄 펩타이드를 갖는 단쇄 펩타이드 고정화 담체.

(9) 담체와 스페이서가 공유 결합에 의하여 결합되어 있는, 상기 (8)에 기재된 단쇄 펩타이드 고정화 담체.

본 발명에 의하면, 수계 용매 중에서도 단쇄 펩타이드의 2차 구조가 유지되는 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 수계 용매 중에서도 단쇄 펩타이드의 2차 구조가 유지된 단쇄 펩타이드 고정화 담체를 제공할 수 있다.

본 발명의 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법(이하, 간단히 "본 발명의 제조 방법"이라고 하는 경우가 있음)에 대하여 설명한다.

[단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법]

본 발명의 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법은, 알코올 용매 및 알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기되고, 또한 복수의 고정화 관능기를 갖는 단쇄 펩타이드를 포함하는 알코올 용액을 준비하는 공정(이하 "공정 A"라고 함)과, 고정화 관능기와 반응하는 반응성기를 갖는 스페이서가 결합된 담체와 알코올 용액을 접촉시켜, 단쇄 펩타이드를 스페이서에 고정화하는 공정(이하 "공정 B"라고 함)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

〈용어의 설명〉

먼저, 본 발명에 있어서 이용되는 용어에 대하여 설명한다.

1. 단쇄 펩타이드

(1) 단쇄 펩타이드의 정의

"단쇄 펩타이드"란, 아미노산 잔기수가 약 50잔기 이하인 펩타이드를 말한다. 단, 복수의 도메인이 결합한 융합 펩타이드에 있어서는, 아미노산 잔기의 총 수가 약 50잔기 이하인 융합 펩타이드를 말한다.

(2) 본 발명의 단쇄 펩타이드

본 발명에 있어서 이용하는 단쇄 펩타이드(이하 "본 발명의 단쇄 펩타이드"라고 하는 경우가 있음)는, 알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기되고, 또한 복수의 고정화 관능기를 갖는다.

본 발명의 단쇄 펩타이드는, 알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기된다. 여기에서, "2차 구조"는, 단쇄 펩타이드 주쇄의 부분적인 입체 구조를 말하며, 예를 들면 α헬릭스, β시트, β턴, 3₁₀ 헬릭스, π헬릭스, 및 2.2₇리본 등의 구조를 포함한다. 또한, "알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기된다"란, 알코올 용매 중에서의 2차 구조 함유율이, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid; 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰산)) 완충액, 트리스 완충액, 또는 인산 완충액 등의 pH가 5~9의 중성 부근이고 또한 10~30℃인 수계 용매 중에서의 2차 구조 함유율의 1.5배 이상이 되는 것을 말한다. 알코올 용매 중에서의 2차 구조 함유율은, 수계 용매 중에서의 2차 구조 함유율의 2배 이상이 바람직하고, 3배 이상이 보다 바람직하다. 여기에서, 2차 구조 함유율은, CD(circular dichroism; 원편광 이색성)에 의하여 산출할 수 있다. 예를 들면, 원이색성 분산계(J-820, 니혼 분코사제)를 이용하여 CD 스펙트럼을 측정하고, 얻어진 CD 스펙트럼을 바탕으로 단백질 2차 구조 해석 프로그램(JWSSE-480, 니혼 분코사제)을 이용하여 2차 구조를 해석하여 얻어진다.

본 발명의 단쇄 펩타이드의 아미노산 잔기수는, 50잔기 이하이면 특별히 제한되지 않는다. 알코올 용매에 대한 용해성의 관점에서, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 아미노산 잔기수는, 바람직하게는 34잔기 이하이고, 보다 바람직하게는 30잔기 이하이며, 더 바람직하게는 25잔기 이하이고, 보다 더 바람직하게는 20잔기 이하이다. 또한, 2차 구조를 유기하는 관점에서, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 아미노산 잔기수는, 바람직하게는 5잔기 이상이고, 보다 바람직하게는 7잔기 이상이며, 더 바람직하게는 10잔기 이상이다. 또한, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 아미노산 잔기수는, 바람직하게는 5~50잔기의 범위 내이고, 보다 바람직하게는 5~34잔기의 범위 내이며, 더 바람직하게는 7~30잔기의 범위 내이고, 보다 더 바람직하게는 7~25잔기의 범위 내이며, 보다 더 바람직하게는 10~20잔기의 범위 내이다.

또한, 본 발명에 있어서, 수치 범위를 "~"를 이용하여 나타낸 경우에는, 그 수치 범위의 양단을 그 수치 범위에 포함하는 것으로 한다. 예를 들면, "5~50"이라는 수치 범위에는, 하한인 "5" 및 상한인 "50"을 포함한다.

본 발명의 단쇄 펩타이드의 분자량은, 특별히 한정되지 않는다.

항원성의 관점에서, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 분자량은, 아미노산 잔기의 분자량의 합계로, 바람직하게는 5000 이하이고, 보다 바람직하게는 3500 이하이며, 더 바람직하게는 3000 이하이다. 또한, 2차 구조를 유기하는 관점에서, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 분자량은, 아미노산 잔기의 분자량의 합계로, 바람직하게는 500 이상이고, 보다 바람직하게는 600 이상이며, 더 바람직하게는 800 이상이다. 또한 항원성을 발현하지 않고, 2차 구조를 유기하는 관점에서, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 분자량은, 바람직하게는 500~5000이고, 보다 바람직하게는 600~3500이며, 더 바람직하게는 800~3000이다.

본 발명의 단쇄 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는, 천연 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기만을 포함하는 것이어도 되고, 또한 비천연 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 포함해도 된다. 천연 아미노산 및 비천연 아미노산에 대해서는 후술한다.

본 발명의 단쇄 펩타이드가 갖는 복수 개의 고정화 관능기(이하 "본 발명의 단쇄 펩타이드의 고정화 관능기"라고 하는 경우가 있음)는, 스페이서가 갖는 관능기와 반응성을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 단쇄 펩타이드의 고정화 관능기로서는, 예를 들면 아미노기(아마이드 결합 형성), 카복실기, 수산기, 및 싸이올기 등을 들 수 있다. 여기에서, 반응성이란, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 고정화 관능기와 스페이서가 갖는 관능기가 반응하여 공유 결합을 형성하는 성질을 말한다. 상기 공유 결합은, 특별히 한정되지 않지만, 안정적인 결합을 형성하는 것이 바람직하다. 상기 공유 결합으로서는, 예를 들면 다이설파이드 결합, 펩타이드 결합(아마이드 결합), 포스포다이에스터 결합, 글리코사이드 결합, 다이아조 결합, 싸이오에터 결합, 올레핀 결합, 에폭시 결합, 및 클릭 케미스트리(Click chemistry)의 반응의 결과 얻어지는 결합 등을 들 수 있다. 이들 공유 결합 중에서도, 결합 안정성의 관점에서, 펩타이드 결합, 싸이오에터 결합, 올레핀 결합, 및 클릭 케미스트리의 반응의 결과 얻어지는 결합으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 단쇄 펩타이드의 고정화 관능기로서는, 예를 들면 싸이올기, 아미노기, 카복시기, 하이드록시기, 인산 에스터기, 에폭시기, 글리시딜기, 아지도기, 및 알카인일기 등을 들 수 있다. 본 발명의 단쇄 펩타이드의 고정화 관능기로서는, 싸이올기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이 바람직하다.

또한, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 고정화 관능기의 종류는, 1종류여도 되고, 2종류 이상을 조합해도 된다.

본 발명의 단쇄 펩타이드에 있어서의 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기의 위치는, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 단쇄 펩타이드는, 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기가, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 펩타이드쇄의, N 말단측 또는 C 말단측의 한쪽에 집중하여 배치된 구조여도 되고, N 말단측 및 C 말단측의 양쪽 모두에 분산되어 배치된 구조여도 된다.

N 말단측에 집중하여 배치된 구조의 단쇄 펩타이드의 비한정적인 일례로서는, 배열 번호 1로 나타나는 펩타이드의 N 말단에 라이신 잔기(K)를 3개 결합한 "KKKEQQNAFY"를 들 수 있다. 또한, C 말단측에 집중하여 배치된 구조의 단쇄 펩타이드의 비한정적인 일례로서는, 배열 번호 1로 나타나는 펩타이드의 C 말단에 라이신 잔기(K)를 3개 결합한 "EQQNAFYKKK"를 들 수 있다. 또한, N 말단측 및 C 말단측의 양쪽 모두에 분산되어 배치된 구조의 단쇄 펩타이드의 비한정적인 일례로서는, 배열 번호 1로 나타나는 펩타이드의 N 말단 및 C 말단에 라이신 잔기(K)를 3개씩 결합한 "KKKEQQNAFYKKK"를 들 수 있다. 이 경우 고정화 관능기는, 라이신 잔기의 측쇄의 ε아미노기 및 N 말단의 아미노기이다.

또한, 단쇄 펩타이드는, 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기의 사이에, 고정화 관능기를 갖지 않는 아미노산 잔기를 적어도 하나 포함하는 부분 구조를 갖는 것이어도 된다.

고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기의 사이에, 고정화 관능기를 갖지 않는 아미노산 잔기를 적어도 하나 포함하는 부분 구조를 갖는 단쇄 펩타이드의 비한정적인 일례로서는, 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기로서 라이신 잔기(K)를 채용하고, 고정화 관능기를 갖지 않는 아미노산 잔기를 적어도 하나 포함하는 부분 구조로서 배열 번호 1로 나타나는 펩타이드 "EQQNAFY"를 채용한, "KEQQNAFYKEQQNAFYK"를 들 수 있다. 여기에서, 고정화 관능기는, 라이신 잔기의 측쇄의 ε아미노기 및 N 말단의 아미노기이다.

본 발명의 단쇄 펩타이드로서는, 항체 결합성을 갖는 단쇄 펩타이드가 바람직하다.

여기에서, 항체 결합성이란 항체 또는 항체 유도체와, 어느 친화성을 갖고 결합하는 성질을 말한다. 항체 또는 항체 유도체의 결합은, 항원 항체 반응에 의한 결합이 바람직하고, 결합하는 부위로서는, 항체 또는 항체 유도체의 정상 영역(Fc 영역, C_L영역, C_H영역)이 바람직하다.

"항체"란, 면역 글로불린 또는 그 유연체, 프래그먼트 혹은 융합체를 말한다. 여기에서, 유연체란, 면역 글로불린의 구조 또는 기능이 적어도 부분적으로 유지된, 천연의 혹은 인공적으로 제작된, 단백질 또는 콘주게이트를 말한다. 또한, 프래그먼트란, 효소적인 처리 또는 유전자 공학적인 설계에 의하여 제작된, 면역 글로불린의 부분 구조를 갖는 단백질을 말한다. 또한, 융합체란, 각종 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 등의 생물 활성을 갖는 단백질의 기능 부분을, 면역 글로불린의 전체 또는 일부와 유전자 공학적으로 융합시켜 제작한 단백질을 말한다. 또한, 항체로서는, 모노클로널 항체 또는 면역 글로불린의 Fc 영역을 갖는 융합체가 바람직하고, 모노클로널 항체가 보다 바람직하다. 또한 본 발명에 있어서, 면역 글로불린은, IgG(Immunoglobulin G, 면역 글로불린 G), IgM(Immunoglobulin M, 면역 글로불린 M), IgA(Immunoglobulin A, 면역 글로불린 A), IgD(Immunoglobulin D, 면역 글로불린 D) 및 IgE(Immunoglobulin E, 면역 글로불린 E)의 5종류의 클래스(아이소 타입) 중 어느 것이어도 되지만, IgG 또는 IgM이 바람직하고, IgG가 보다 바람직하다.

"항체 유도체"란, 인간 면역 글로불린의 Fc 영역과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 Fab 영역을 융합시킨 키메라 항체, 인간 면역 글로불린의 몇 가지의 Fc 영역과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 몇 가지의 Fv 영역을 융합시킨 키메라 항체, 인간 면역 글로불린의 CDR(상보성 결정 영역) 부분을 제외한 잔여 부분과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 CDR 부분을 융합시킨 인간형화 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 Fc 영역과 인간 면역 글로불린의 Fab 영역을 융합시킨 키메라 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 몇 가지의 Fc 영역과 인간 면역 글로불린의 몇 가지의 Fv 영역을 융합시킨 키메라 항체, 인간 면역 글로불린의 CDR 부분을 제외한 잔여 부분과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 CDR 부분을 융합시킨 비인간 포유 동물화 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 Fc 영역과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 Fab 영역을 융합시킨 키메라 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 몇 가지의 Fc 영역과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 몇 가지의 Fv 영역을 융합시킨 키메라 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 CDR(상보성 결정 영역) 부분을 제외한 잔여 부분과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 CDR 부분을 융합시킨 비인간 포유 동물형 항체, 및 이들 화학적 수식(修飾)을 첨가한 단백질로서, Fc 영역을 유지하는 단백질을 말한다.

본 발명의 단쇄 펩타이드는, 항체 결합 도메인과, 스페이서 결합 도메인으로 이루어지는 구조, 또는 도메인 사이를 연결하는 링커를 더 포함하는 구조인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 단쇄 펩타이드는, 항체 결합 도메인을 복수 갖는 융합 펩타이드여도 된다. 항체 결합성을 갖는 본 발명의 단쇄 펩타이드를, 2차 구조를 유지한 채 고정화함으로써, 항체 흡착제 및 항체 유지 담체 등이 저비용으로 실현될 수 있게 된다.

또한, 도메인 및 스페이서에 대해서는 후술한다.

상기 항체 결합 도메인의 아미노산 배열예는, 항체 결합성을 갖고, 또한, 항체 또는 항체 유도체에 결합할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 상기 항체 결합 도메인의 아미노산 배열예로서는, 표 1에 나타내는 배열 번호 1~38의 아미노산 배열예 중 적어도 하나와, 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 87% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 보다 바람직하며, 90% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 더 바람직하고, 95% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 보다 더 바람직하며, 배열 번호 1~38의 아미노산 배열예로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.

여기에서, 2개의 아미노산 배열예의 배열 상동성은, 다음과 같이 하여 구한다.

(a) 2개의 아미노산 배열의 얼라인먼트를 행함

일치(매치)는 ＋1, 불일치(미스 매치)는 -1, 갭은 -1의 스코어를 부여하고, 얼라인먼트·스코어가 최대가 되도록 얼라인먼트를 행한다.

(b) 배열 상동성을 계산함

얻어진 얼라인먼트에 근거하여, 다음 식에 의하여 배열 상동성을 계산한다.

배열 상동성[%]=(일치 포지션 수/전체 포지션 수)×100[%]

전체 포지션 수는 얼라인먼트의 길이이며, 일치 포지션 수는 아미노산의 종류가 일치하는 포지션의 수이다.

여기에서, 아미노산 잔기의 종류가 일치하는지 여부의 판단은, 그 아미노산 잔기의 바탕이 되는 아미노산의 측쇄(아미노산 측쇄)의 구조가 동일한지 여부에 의한 것으로 한다. 또한, 에난티오머의 관계에 있는 아미노산의 측쇄의 구조는 동일하지 않다.

(c) 배열 상동성의 계산예

예를 들면, 다음의 아미노산 배열을 생각한다.

배열 A EQQNAFY

배열 B KEQQSAFY

이것을 상술한 조건하에서 얼라인먼트하면, 다음과 같이 된다. 여기에서 배열 A, B 간에서 아미노산(잔기)의 종류가 일치하는 개소에는, 보기 쉽게 하기 위하여, 호몰로지·스트링 "｜"을 붙이고 있다. 또한, "-"은 갭이다.

배열 A -EQQNAFY

||| | ||

배열 B KEQQSAFY

이 얼라인먼트의 스코어는, 일치(＋1)×6＋불일치(-1)×1＋갭(-1)×1=4이다.

이 예에서는, 전체 포지션 수는 8이며, 일치 포지션 수는 6이기 때문에, 상기 식에 따라 산출한 배열 상동성은, 6/8×100=75.0%이다.

배열 번호 1로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFY)와 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열예(EGQNAFY), 배열 번호 7로 나타나는 아미노산 배열예(EQNAFY), 배열 번호 10으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFY) 등을 들 수 있다.

배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILH)와 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILHL), 배열 번호 11로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFYEILH) 등을 들 수 있다.

배열 번호 3으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILHL)와 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILH) 등을 들 수 있다.

배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열예(EGQNAFY)와 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 1로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFY), 배열 번호 7로 나타나는 아미노산 배열예(EQNAFY), 배열 번호 10으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFY) 등을 들 수 있다.

배열 번호 5로 나타나는 아미노산 배열예(EGQNAFYEILH)와 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 3으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILH), 배열 번호 11로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFYEILH) 등을 들 수 있다.

배열 번호 6으로 나타나는 아미노산 배열예(EGQNAFYEILHL)와 배열 상동성 85% 이상을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 3으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILHL) 등을 들 수 있다.

배열 번호 7로 나타나는 아미노산 배열예(EQNAFY)와 배열 상동성 85% 이상을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 1로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFY), 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열예(EGQNAFY) 등을 들 수 있다.

배열 번호 8로 나타나는 아미노산 배열예(EQNAFYEILH)와 배열 상동성 85% 이상을 갖는 아미노산 배열로서는, 예를 들면 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILH), 배열 번호 5로 나타나는 아미노산 배열예(EGQNAFYEILH), 배열 번호 9로 나타나는 아미노산 배열예(EQNAFYEILHL) 등을 들 수 있다.

배열 번호 9로 나타나는 아미노산 배열예(EQNAFYEILHL)와 배열 상동성 85% 이상을 갖는 아미노산 배열로서는, 예를 들면 배열 번호 3으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILHL), 배열 번호 6으로 나타나는 아미노산 배열예(EGQNAFYEILHL), 배열 번호 8로 나타나는 아미노산 배열예(EQNAFYEILH) 등을 들 수 있다.

배열 번호 10으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFY)와 배열 상동성 85% 이상을 갖는 아미노산 배열로서는, 예를 들면 배열 번호 1로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFY), 배열 번호 13으로 나타나는 아미노산 배열예(DQQSAFY) 등을 들 수 있다.

배열 번호 11로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFYEILH)와 배열 상동성 85% 이상을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILH), 배열 번호 12로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFYEILHL), 배열 번호 14로 나타나는 아미노산 배열예(DQQSAFYEILH) 등을 들 수 있다.

배열 번호 12로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFYEILHL)와 배열 상동성 85% 이상을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 3으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQNAFYEILHL), 배열 번호 11로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFYEILH), 배열 번호 15로 나타나는 아미노산 배열예(DQQSAFYEILHL) 등을 들 수 있다.

배열 번호 13으로 나타나는 아미노산 배열예(DQQSAFY)와 배열 상동성 85% 이상을 갖는 아미노산 배열예로서는, 예를 들면 배열 번호 10으로 나타나는 아미노산 배열예(EQQSAFY) 등을 들 수 있다.

[표 1]

(3) 아미노산 잔기/아미노산

3. 1) 아미노산 잔기

"아미노산 잔기"의 용어는, IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry; 국제 순정·응용 화학 연합) 골드·북의 정의에 따른다. 즉, 2개 이상의 아미노산이 분자 간에서 펩타이드 결합함으로써 펩타이드를 형성했을 때의, 아미노산 분자가 펩타이드 결합 시에 탈수된 나머지 부분을 아미노산 잔기라고 한다. 따라서, 펩타이드쇄를 구성하는 유닛은 아미노산 잔기이다. 또한, 펩타이드쇄에서는, C 말단의 아미노산 잔기를 C단 잔기라고 하고, N 말단의 아미노산 잔기를 N단 잔기라고 한다. 아미노산 잔기는 그 유래하는 아미노산의 종류가 동일하면 동일한 종류의 아미노산 잔기로서 취급한다.

3. 2) 아미노산

"아미노산"이란, 특별히 설명하지 않는 한, 분자 중에 아미노기(-NH₂) 또는 이미노기와 카복실기를 갖는 유기 화합물로서, 2개 이상이 펩타이드 결합함으로써 펩타이드를 형성할 수 있는 것을 말한다.

아미노산의 명칭, 약호는, 원칙으로서 국제 순정·응용 화학 연합과 국제 생화학·분자 생물학 연합에 의한 공동 명명 위원회(INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY and INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN))에서 채용된 명칭, 약호 등을 이용하여 나타낸다. 표 2에는, 1문자 약호 및 3문자 약호가 공식으로 인정된 α-아미노산의 명칭 및 약호(1문자 약호, 3문자 약호)를 나타낸다. 또한, 임의의 아미노산을 나타내는 “Xaa”는, 표 2에 나타내는 아미노산 이외의 아미노산을 나타내는 경우에도 이용할 수 있다.

[표 2]

본 발명에 있어서는, 천연 아미노산뿐만 아니라, 비천연 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기도 펩타이드쇄를 구성하는 유닛으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 단쇄 펩타이드는, 천연 아미노산에 의해서만 구성되어도 되고, 비천연 아미노산에 의해서만 구성되어도 되며, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산의 양쪽 모두를 포함해도 된다. 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함하는 경우의 천연 아미노산과 비천연 아미노산의 비율(몰 비율)은 특별히 한정되지 않는다.

3. 2. 1) 천연 아미노산

"천연 아미노산"이란, 천연에서 mRNA(messenger RNA; 전령 RNA; RNA=ribonucleotide) 상에 코드화되어 있는 아미노산을 말한다. 천연 아미노산이란, 구체적으로는, 글라이신(Gly), L-알라닌(Ala), L-아르지닌(Arg), L-아스파라진(Asn), L-아스파라진산(Asp), L-시스테인(Cys), L-글루타민(Gln), L-글루탐산(Glu), L-히스티딘(His), L-아이소류신(Ile), L-류신(Leu), L-라이신(Lys), L-메티오닌(Met), L-페닐알라닌(Phe), L-프롤린(Pro), L-세린(Ser), L-트레오닌(Thr), L-트립토판(Trp), L-타이로신(Tyr), L-발린(Val), L-피롤리신(Pyl) 및 L-셀레노시스테인(Sec)의 22종류의 아미노산을 말한다.

또한, 이들 아미노산(글라이신을 제외함)의 에난티오머는, 천연 아미노산에는 포함되지 않는다.

3. 2. 2) 비천연 아미노산

"비천연 아미노산"이란, 천연에서는 mRNA(messenger RNA; 전령 RNA; RNA=ribonucleotide) 상에 코드화되어 있지 않은 아미노산을 말한다. 비천연 아미노산은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 D-알라닌(D-Ala), D-아르지닌(D-Arg), D-아스파라진(D-Asn), D-아스파라진산(D-Asp), D-시스테인(D-Cys), D-글루타민(D-Gln), D-글루탐산(D-Glu), D-히스티딘(D-His), D-아이소류신(D-Ile), D-류신(D-Leu), D-라이신(D-Lys), D-메티오닌(D-Met), D-페닐알라닌(D-Phe), D-프롤린(D-Pro), D-세린(D-Ser), D-트레오닌(D-Thr), D-트립토판(D-Trp), D-타이로신(D-Tyr), D-발린(D-Val), D-피롤리신(D-Pyl) 및 D-셀레노시스테인(D-Sec) 등의, 천연 아미노산(글라이신을 제외함)의 에난티오머; 2-아미노아디프산(Aad), 2-아미노뷰티르산(Abu), 2-아미노헵탄산(Ahe), 2-아미노아이소뷰티르산(Aib), 2-아미노피멜산(Apm), 2,4-다이아미노뷰티르산(Dbu), 2,2'-다이아미노피멜산(Dpm), 2,3-다이아미노프로피온산(Dpr), 알로하이드록실라이신(aHyl), 알로아이소류신(aIle), 노발린(Nva), 노류신(Nle), 오니틴(Orn), 데스모신(Des), 아이소데스모신(Ide) 등의 비천연 α-아미노산; 6-N-메틸라이신(MeLys), 3-하이드록시프롤린(3Hyp), 4-하이드록시프롤린(4Hyp), β-알라닌(bAla), 3-아미노아이소뷰티르산(bAib), 3-아미노아디프산(bAad), 4-아미노뷰티르산(4Abu), 6-아미노카프로산(Acp) 등을 들 수 있다.

또한, 각 비천연 아미노산의 명칭 뒤의 괄호 내의 기호는, 각각의 비천연 아미노산을 나타내는 약호의 일례이다.

(4) 펩타이드/융합 펩타이드

4. 1) 펩타이드

"펩타이드"의 용어는, IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry; 국제 순정·응용 화학 연합) 골드·북의 정의에 따른다. 즉, 2개 이상의 아미노산이 분자 간에서 펩타이드 결합함으로써 얻어지는 아마이드 화합물이다.

특별히 명시하지 않는 한, 펩타이드의 아미노산 배열예("1차 구조"라고도 함)는, 좌단에서 우단에 걸쳐 N 말단에서 C 말단이 되도록 아미노산 잔기를 1차원으로 배열하여 나타낸다.

본 발명에 있어서는, 펩타이드쇄의 N 말단의 아미노기 및 C 말단의 카복실기는, 수식되어 있어도 된다. N 말단의 아미노기의 수식으로서는, 예를 들면 아세틸화 및 Boc(tert-뷰톡시카보닐)화 등을 들 수 있으며, C 말단의 카복실기의 수식으로서는, 예를 들면 아마이드화 및 에스터화 등을 들 수 있다.

4. 2) 융합 펩타이드

"융합 펩타이드"란, 어떤 물리 화학적 또는 생물 화학적인 기능을 갖는 펩타이드("도메인"에 해당함)가 2개 이상, 직접, 또는 링커를 통하여 연결됨으로써 구성되어 있는 고분자 화합물을 말한다.

상기 링커는, 상기 도메인 사이를 연결할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 상기 링커로서는, 예를 들면 펩타이드쇄로 이루어지는 펩타이드 링커, 폴리에틸렌글라이콜쇄로 이루어지는 PEG(polyethylene glycol; 폴리에틸렌글라이콜) 링커, 다이설파이드 결합(SS 결합), 싸이오에터 결합, 올레핀 결합, 클릭 케미스트리의 반응의 결과 얻어지는 결합, 및 이들 중 2개 이상의 조합 등을 들 수 있다.

4. 2. 1) 도메인

"도메인"이란, 단백질(융합 단백질을 포함함) 또는 펩타이드(융합 펩타이드를 포함함)의, 어떤 물리 화학적 또는 생물 화학적인 기능(이하, 간단히 "기능"이라고 하는 경우가 있음)을 발현할 수 있는, 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 더 바람직하게는 4개 이상, 또한 수백 개 이하의 아미노산 잔기에 의하여 구성되는 부분 또는 영역을 말한다.

도메인은, 그 기능에 의하여, 예를 들면, 항체 결합 도메인, 및 스페이서 결합 도메인 등으로 나눌 수 있다.

4. 2. 1. 1) 항체 결합 도메인

항체 결합 도메인은, 항체 결합성을 갖는 펩타이드로 구성되는 도메인이다.

항체 결합성은, 상술한 바와 같다.

4. 2. 1. 2) 스페이서 결합 도메인

스페이서 결합 도메인은, 항체 결합 도메인 이외의 부분으로서, 스페이서에 결합하는 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 도메인이다.

스페이서 결합 도메인으로서는, 도메인당, 고정화 관능기를 적어도 측쇄에 1개 이상 갖는 아미노산 잔기를 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 더 바람직하게는 3개 이상, 보다 더 바람직하게는 4개 이상 포함하는 것이 바람직하다. 여기에서, 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기로서는, 라이신 잔기(K), 오니틴 잔기, 다이아미노뷰티르산 잔기, 다이아미노프로피온산 잔기, 및 호모라이신 잔기 등의 측쇄에 아미노기를 갖는 아미노산 잔기, 시스테인 잔기(C), 및 호모시스테인 잔기 등의 측쇄에 싸이올기를 갖는 아미노산 잔기, 세린(S), 트레오닌(T), 및 타이로신(Y) 등의 측쇄에 하이드록시기를 갖는 아미노산 잔기 등을 들 수 있다. 이들 고정화 관능기 중 어느 하나와, 스페이서의 관능기의 커플링 반응에 의하여, 리간드인 단쇄 펩타이드가 스페이서와 결합한다. 스페이서의 관능기가 카복실기인 경우는, 카복실기와 반응성을 갖는 아미노기를 갖는 라이신 잔기(K), 오니틴 잔기, 다이아미노뷰티르산 잔기, 호모라이신 잔기, 또는 다이아미노프로피온산 잔기가 바람직하고, 라이신 잔기(K)가 경제성의 관점에서 특히 바람직하다.

또한, 본 발명의 단쇄 펩타이드는, 복수의 스페이서 결합 도메인을 포함하고 있어도 된다.

4. 2. 2) 링커

"링커"란, 융합 펩타이드에 있어서, 도메인의 상호 간을 연결하는 분자쇄 또는 결합이다.

상기 분자쇄로서는, 예를 들면 아미노산 또는 펩타이드로 이루어지는 펩타이드 링커, 에틸렌글라이콜 또는 폴리에틸렌글라이콜로 이루어지는 PEG(polyethylene glycol; 폴리에틸렌글라이콜) 링커 등을 들 수 있다. 링커는 2종류 이상을 조합하여 이용해도 되고, 예를 들면 펩타이드 및 PEG를 함께 포함하고 있어도 된다.

또한, 상기 결합으로서는, 예를 들면 다이설파이드 결합(SS 결합), 싸이오에터 결합, 올레핀 결합, 클릭 케미스트리의 반응의 결과 얻어지는 결합 등을 들 수 있다.

상기 펩타이드 링커를 구성하는 아미노산 잔기의 수는, 1개 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1~20개이고, 보다 바람직하게는 1~10개이며, 더 바람직하게는 1~5개이다.

또한, 상기 PEG 링커를 구성하는 에틸렌글라이콜 단위의 수는, 1개 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1~24개, 보다 바람직하게는 1~12개, 더 바람직하게는 4~8개이다.

여기에서, 상기 링커에 포함할 수 있는 아미노산 잔기의 종류는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 IgG 항체와의 상호 작용이 적은 Gly, Ala 및 Ser 등을 들 수 있다. 또한, 상기 링커는, 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기를 포함하고 있어도 된다.

2. 알코올 용매

본 발명에 있어서 이용하는 알코올 용매(간단히 "본 발명의 알코올 용매"라고 하는 경우가 있음)는 알코올을 포함하는 용매라면 특별히 한정되지 않는다.

상기 알코올로서는, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 2-프로판올(IPA, 아이소프로필알코올), tert-뷰틸알코올(tert-BuOH), 2,2,2-트라이플루오로에탄올(TFE, 트라이플루오로에탄올), 및 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP, 헥사플루오로아이소프로필알코올) 등을 들 수 있다.

펩타이드 용해성의 관점에서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 및 IPA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다.

또한, 상기 알코올은, 1종류를 단독으로, 또는 2종류 이상을 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 단쇄 펩타이드에 2차 구조를 유기시킬 때의 알코올 용매와, 단쇄 펩타이드를 담체에 고정화시킬 때의 알코올 용매는, 동종의 알코올 용매여도 되고, 이종의 알코올 용매여도 된다. 예를 들면, 메탄올 중에 단시간 침지하여 단쇄 펩타이드에 2차 구조를 유기시켜, 담체에 흡착시키고, 아이소프로필알코올 중에 장시간 침지하여 단쇄 펩타이드를 스페이서에 결합시켜도 된다.

본 발명의 알코올 용매 중의 알코올 함유량은, 특별히 한정되지 않지만, 2차 구조 형성의 관점에서, 바람직하게는 20%(v/v) 이상이고, 보다 바람직하게는 50%(v/v) 이상이며, 더 바람직하게는 70%(v/v) 이상이고, 보다 더 바람직하게는 95%(v/v) 이상이다.

본 발명의 알코올 용매 중의 알코올 이외의 용매는 2차 구조 형성을 저해하지 않는 용매라면, 특별히 한정되지 않는다. 상기 알코올 이외의 용매로서는, 펩타이드 용해성의 관점에서, 바람직하게는 순수 및 완충액으로부터 선택되는 적어도 1종이며, 보다 바람직하게는 순수이다. 상기 완충액으로서는, 예를 들면 HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰산) 완충액, Tris(트리스(하이드록시메틸)아미노메테인) 완충액, 및 인산 완충액 등을 들 수 있다.

3. 리간드/항체 결합성 리간드

"리간드"는, 특정 물질과, 어느 친화성을 갖고, 결합하는 분자를 말한다. 이와 같은 분자는, 단백질, 펩타이드, 또는 저분자량 화합물 등일 수 있다.

"항체 결합성 리간드"는, 항체 결합성을 갖는 리간드, 즉 항체 또는 항체 유도체와, 어느 친화성을 갖고 결합하는 리간드를 말한다. 항체 결합성 리간드는, 항체 또는 항체 유도체와, 특이적인 분자 간의 친화력이 작용하는 항원 항체 반응에 의하여 결합하는 것이 바람직하다. 항체 또는 항체 유도체의 항체 결합성 리간드가 결합하는 부위로서는, 정상 영역(Fc 영역, C_L영역(경쇄의 정상 영역) 또는 C_H영역(중쇄의 정상 영역))이 바람직하다.

본 발명에 있어서 이용하는 리간드(이하, 간단히 "본 발명의 리간드"라고 하는 경우가 있음)는, 상술한 본 발명의 단쇄 펩타이드이다. 본 발명의 리간드로서는, 본 발명의 단쇄 펩타이드 중에서도, 항체 결합성을 갖는 단쇄 펩타이드를 이용하는 것이 바람직하다.

4. 스페이서

"스페이서"란, 담체와 리간드의 사이에 개재하는 화합물이다.

본 발명에 있어서 이용하는 스페이서(이하, 간단히 "본 발명의 스페이서"라고 하는 경우가 있음)는, 본 발명의 단쇄 펩타이드가 갖는 고정화 관능기와 반응하는 반응성기를 갖는 것이며, 본 발명의 단쇄 펩타이드와의 사이에서 공유 결합을 형성하는 관능기를 갖는 것이 바람직하다.

상기 관능기로서는, 싸이올기, 아미노기, 카복실기, 다이아조기, 클로로아세틸기, 올레핀기, 글리시딜기, 카벤기, 수산기, 및 폼일기 등을 들 수 있다. 결합 안정성의 관점에서, 상기 관능기로서는, 싸이올기, 아미노기, 카복실기, 클로로아세틸기 및 글리시딜기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이 바람직하고, 카복실기 및 글리시딜기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이 더 바람직하다.

본 발명의 스페이서로서는, 다관능 카복실산이 바람직하고, 폴리아크릴산이 특히 바람직하다. 폴리아크릴산의 말단에는 아미노기 등의 관능기가 부가되어 있어도 된다.

본 발명의 스페이서의 길이는, 특별히 한정되지 않지만, 알코올 용매에서 단쇄 펩타이드의 2차 구조가 변화하는 부위를 포함한 위치에서, 다점에서 공유 결합할 수 있도록, 2차 구조를 유기한 단쇄 펩타이드의 외관의 길이보다 긴 것이 바람직하다.

본 발명의 스페이서의 분자량은 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 스페이서의 분자량은, 질량 평균 분자량으로, 바람직하게는 10000 이하이고, 보다 바람직하게는 9000 이하이며, 더 바람직하게는 5000 이하이고, 보다 더 바람직하게는 3000 이하이다.

또한, 본 발명의 스페이서의 분자량은, 질량 평균 분자량으로, 바람직하게는 300 이상이고, 보다 바람직하게는 500 이상이며, 더 바람직하게는 900 이상이고, 보다 더 바람직하게는 1500 이상이다. 또한, 본 발명의 스페이서의 분자량은, 질량 평균 분자량으로, 바람직하게는 300~10000의 범위 내이고, 보다 바람직하게는 900~9000의 범위 내이며, 더 바람직하게는 900~5000의 범위 내이고, 보다 더 바람직하게는 1500~3000의 범위 내이다.

본 발명의 스페이서의 분자량이 너무 작으면, 단쇄 펩타이드와의 결합점이 적어져, 단쇄 펩타이드의 2차 구조를 유지하는 것이 곤란해진다. 또한, 본 발명의 스페이서의 분자량이 너무 크면, 담체에 본 발명의 스페이서를 다량으로 결합하는 것이 곤란해진다.

스페이서는 후술하는 담체에 결합되어 있지만, 담체 상의 관능기에 직접, 또는 담체 상의 관능기의 사이에, 아마이드 결합, 말레이미드 결합, 에스터 결합, 에터 결합, 에폭시 결합, 또는 올레핀 결합 등의 공유 결합을 통하여 결합하는 것이 바람직하고, 결합력이 높은 아마이드 결합 또는 에폭시 결합이 보다 바람직하다.

5. 담체

담체는, 리간드를 담지하는 기재이다.

본 발명에 있어서 이용하는 담체로서는, 수불용성 담체가 바람직하다.

수불용성 담체로서는, 예를 들면 결정성 셀룰로스, 가교 셀룰로스, 가교 아가로스, 가교 덱스트란, 가교 풀루란 등의 다당류, 아크릴레이트계 중합체, 스타이렌계 중합체 등의 유기 담체, 유리 비즈, 실리카젤 등의 무기 담체와 이들의 조합에 의하여 얻어지는, 유기-유기, 및 유기-무기 등의 복합 담체 등을 들 수 있다.

수불용성 담체로서는, 알칼리 내성의 관점에서, 다당류 또는 아크릴레이트계 중합체가 보다 바람직하고, 아가로스 또는 셀룰로스 등의 다당류가 더 바람직하다.

수불용성 담체로서 이용할 수 있는 시판품으로서는, 예를 들면 다공질 셀룰로스젤인 셀루파인(Cellufine) GCL2000(JNC사제), 셀루파인 MAX(Cellufine MAX) CM(JNC사제), 알릴덱스트란과 메틸렌비스아크릴아마이드를 공유 결합으로 가교한 세파크릴(Sephacryl) S-1000 SF(GE 헬스케어사제), 아크릴레이트계의 담체인 토요펄(TOYOPEARL)(도소사제), 토요펄(TOYOPEARL) AF-Carboxy-650(도소사제), 토요펄(TOYOPEARL) GigaCap CM-650(도소사제), 아가로스계의 가교 담체인 세파로스(Sepharose) CL4B(GE 헬스케어사제), 에폭시기로 활성화된 폴리메타크릴아마이드인 유퍼깃(Eupergit) C250L(시그마 알드리치사제), 및 카복실메틸덱스트란을 금막 표면에 코트한 센서 칩 CM5(GE 헬스케어사제) 등을 들 수 있다. 단, 본 발명에 있어서의 수불용성 담체는, 이들 담체 또는 활성화 담체에만 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 이용하는 수불용성 담체는, 본 흡착 재료의 사용 목적 및 방법으로부터 보아, 표면적이 큰 것이 바람직하고, 적당한 크기의 미세 구멍을 다수 갖는 다공질인 것이 바람직하다. 담체의 형태로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 비즈 형상, 섬유 형상, 막 형상, 중공사 형상 등 모두 가능하며, 임의의 형태를 선택할 수 있다.

〈공정 A/공정 B〉

공정 A 및 공정 B의 순서에 대하여 설명한다.

1. 공정 A의 순서

공정 A에 있어서, 상술한 단쇄 펩타이드를 포함하는 알코올 용액을 준비하는 순서는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 소정의 단쇄 펩타이드를 알코올 용액에 첨가하여, 소정 시간 정치하는 방법 등을 들 수 있다.

알코올 용액 중에 있어서의 단쇄 펩타이드의 농도는 특별히 제한되지 않고, 사용되는 단쇄 펩타이드의 종류에 따라서 달라도 되지만, 알코올 용액 전체 질량에 대하여, 바람직하게는 0.0000001~5질량%이고, 보다 바람직하게는 0.00001~1질량%이며, 더 바람직하게는 0.001~1질량%이다.

또한, 상기 알코올 용액의 pH는, 특별히 한정되지 않지만, pH 4~12의 범위 내로 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 알코올 용액을 조제할 때의 온도는, 특별히 제한되지 않지만, 2~50℃에서 실시하는 것이 바람직하다.

2. 공정 B의 순서

공정 B에 있어서, 상술한 스페이서가 결합된 담체와, 상기 알코올 용액을 접촉시키는 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 알코올 용액 중에 상기 스페이서가 결합된 담체를 첨가하는 방법을 들 수 있다.

또한, 스페이서가 결합된 담체와 알코올 용액을 접촉시킬 때에는, 필요에 따라서 단쇄 펩타이드 중의 고정화 관능기와 스페이서 중의 반응성기의 반응을 촉진시키는 화합물을 존재시켜도 된다. 예를 들면, 고정화 관능기와 반응성기의 반응이 탈수축합 반응인 경우, 상기 화합물로서는 이른바 탈수 축합제(예를 들면, (1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드)) 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 탈수 축합제를 사용할 때에는, 먼저 탈수 축합제와 스페이서가 결합된 담체를 접촉시킨 후, 알코올 용액과 접촉시켜도 된다. 또한, 예를 들면 다이설파이드 결합의 경우에는 과산화 수소나 아이오딘과 같은 산화제를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 예를 들면 글리코사이드 결합의 경우에는, 산을 존재시키는 것이 바람직하다. 단쇄 펩타이드 중의 고정화 관능기와 스페이서 중의 반응성기의 반응은, 아미노 커플링 반응에 의하여 아미노기와 카복실기의 사이에서 아마이드 결합을 형성하는 것이 바람직하다. 또한, 필요에 따라서, 다이아자바이사이클로운데센(DBU), 다이아자바이사이클로옥테인(DABCO), 다이아자바이사이클로노넨(DBN), 메틸이미다졸, 다이메틸아닐린, 트라이에틸아민 및 피리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 염기를 첨가해도 된다.

담체에 고정화하는 단쇄 펩타이드의 밀도는 특별히 한정되지 않지만, 0.1mmol~1000mmol/충전제 1L가 바람직하고, 0.1mmol~500mmol/충전제 1L가 보다 바람직하며, 1mmol~100mmol/충전제 1L가 더 바람직하다. 이 범위 내이면, 단쇄 펩타이드의 사용량과 항체 정제 성능의 밸런스가 양호하고, 보다 저비용이며, 효율적으로 항체를 정제할 수 있다.

[단쇄 펩타이드 고정화 담체]

본 발명의 제조 방법에 의하여, 담체와, 담체 상에 결합된 스페이서와, 스페이서 상에 배치되고, 또한 2차 구조가 유지되어 있는 단쇄 펩타이드를 갖는 단쇄 펩타이드 고정화 담체를 제조할 수 있다.

단쇄 펩타이드로서 항체 결합성을 갖는 단쇄 펩타이드를 이용하면, 본 발명의 단쇄 펩타이드 고정화 담체는, 항체 결합성이 우수한 어피니티 크로마토그래피용 담체로서 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단쇄 펩타이드 고정화 담체는, 항원성 및 비용의 점에서, 프로테인 A에 비하여 유리한 어피니티 크로마토그래피용 담체이다.

이하에 실시예에 근거하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

[펩타이드의 합성]

전자동 펩타이드 합성 장치(PSSM-8, 시마즈 세이사쿠쇼사제)를 이용하여, 표 3에 나타내는 단쇄 펩타이드를 합성했다.

[표 3]

표 3 중, 고정화 관능기수는, 라이신 잔기의 측쇄에 있는 아미노기(ε아미노기) 및 N 말단 아미노기(α아미노기)의 합계이다.

또한, 표 3에 기재한 단쇄 펩타이드 1~8의 HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰산) 완충액 중 및 메탄올(MeOH) 중의 2차 구조 함유율을 표 4에 나타낸다.

[표 4]

단쇄 펩타이드 1~8의 HEPES 완충액 중 또는 메탄올(MeOH) 중의 2차 구조 함유율은, 각 단쇄 펩타이드의 HEPES 용액 또는 메탄올 용액에서의 CD(circular dichroism; 원편광 이색성) 스펙트럼을, 원이색성 분산계 J-820(니혼 분코사제)으로 측정하고, 얻어진 CD 스펙트럼을 바탕으로 단백질 2차 구조 해석 프로그램 JWSSE-480(니혼 분코사제)을 이용하여 2차 구조를 해석하여 얻어졌다. 또한, 표 4 중, 단쇄 펩타이드 1~8은, 각각 표 3에 기재한 단쇄 펩타이드 1~8이다. 또한, "HEPES 중"은 HEPES 완충액(10mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰산)-HCl(염산), 150mM NaCl(염화 나트륨), pH 7.4, 25℃) 중의 2차 구조 함유율을, "MeOH 중"은 메탄올(순도 99.5질량%) 중의 2차 구조 함유율을 나타낸다.

단쇄 펩타이드 1~8 모두, 메탄올(MeOH) 중의 2차 구조 함유율이 HEPES 중의 2차 구조 함유율의 2배 이상에서 4배 이상이며, 1.5배 이상이었던 점에서, 알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기되는 단쇄 펩타이드이다.

[실시예 1]

(1) 스페이서의 고정

시판 중인 CM5 센서 칩(카복시메틸덱스트란 도입 타입, GE 헬스케어사제)에, 0.47M의 EDC(1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드, 와코 준야쿠 고교(주)제) 및 0.35M의 NHS(N-hydroxysuccinimide; N-하이드록시석신산 이미드, 와코 준야쿠 고교(주)제)를 포함하는 DMSO(Dimethysulfoxide; 다이메틸설폭사이드, 와코 준야쿠 고교(주)제) 용액 50μL를 첨가하여, 실온에서 1시간 활성화했다.

DMSO로 세정한 후, 아미노기 말단 폴리아크릴산(질량 평균 분자량(Mw): 3120)(이하 "폴리아크릴산 1"이라고 하는 경우가 있음)을, DMSO(다이메틸설폭사이드)/DBU(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene; 다이아자바이사이클로운데센)(85: 15vol%) 용액에 용해하고, 50mM 용액을 조정하여, 그 용액을 센서 칩에 20μL 첨가하여, 2시간 실온에서 반응시켰다.

그 후, DMSO로 세정 후, 에탄올아민 용액에 의하여 블로킹 처리를 실시하여, 스페이서 고정화 담체(이하 "담체 A"라고 하는 경우가 있음)를 얻었다.

(2) 리간드의 고정

표면 플라즈몬 공명 장치(Biacore3000, GE 헬스케어사제)에, "(1) 스페이서의 고정"으로 얻어진 담체 A를 세팅하고, SPR(Surface Plasmon Resonance; 표면 플라즈몬 공명)용 HEPES 완충액(10mM HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰산)-HCl(염산), 150mM NaCl(염화 나트륨), pH 7.4)을 10μL/min의 유속으로 안정시켜, 0.2M의 EDC(1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드)와 0.04M의 NHS(N-하이드록시석신산 이미드) 혼합 수용액을 70μL 첨가했다. 그 후, 메탄올(고정화 용매에 해당함)에서 4μM에 희석시킨 단쇄 펩타이드 1의 시료액 10μL를 담체 시료에 공급하고, 그 후, 에탄올아민 용액에 의하여 블로킹 처리를 실시하며, 수산화 나트륨 수용액으로 세정하여, 고정화를 행했다. 동일한 순서로, 담체 A에 HEPES 완충액에서 4μM에 희석시킨 단쇄 펩타이드 1의 시료액을 이용하여, 별도의 유로에 고정했다. 얻어진 고정화 담체를, 이하 "고정화 담체 A"라고 한다.

(3) 항체 결합성 개선율의 평가

"(2) 리간드의 고정"으로 제조한 고정화 담체 A에, 10~3000nM의 인간 IgG 항체를 10분간 첨가하여, HEPES 완충액 중에서의 25℃에서의 해리를 측정하고, 결합 반응 곡선으로부터 항체의 결합 속도 Kon[nM/s] 및 해리 속도 Koff[1/s]를 산출하며, 또한 메탄올과 HEPES 완충액 각각에서 고정화했을 때의 단쇄 펩타이드 1과 인간 IgG 항체의 결합 반응에 있어서의 해리 정수 Kd[nM]를 산출했다. HEPES 완충액에서 고정화했을 때의 해리 정수 Kd[nM]에 대한, 메탄올에서 고정화했을 때의 해리 정수 Kd[nM]를 항체 결합성 개선율로 하고, 이하의 항체 결합성 개선율의 평가 기준에 근거하여 평가하여, 그 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에 나타낸다.

(항체 결합성 개선율의 평가 기준)

해리 정수(Kd)의 개선율이 10배 초과··············A

해리 정수(Kd)의 개선율이 3배 초과, 10배 이하·········B

해리 정수(Kd)의 개선율이 2배 초과, 3배 이하·········C

해리 정수(Kd)의 개선율이 1배 초과, 2배 이하·········D

해리 정수(Kd)의 개선율이 1배 이하····· ·········E

평가 A, B 및 C는 본 고정화에 의한 개선 효과가 충분한 것을 나타내고, 평가 D 및 E는 충분한 개선 효과를 볼 수 없는 것을 나타낸다. 충분한 개선 효과를 나타내는 리간드 고정화 상태를 이용함으로써, 항체와 특이적으로 결합할 수 있고, 보다 효율적으로 항체를 정제하는 것이 가능해져, 항체의 정제 비용을 보다 저감시킬 수 있다.

또한, 피팅 소프트웨어(BIAevaluation4.1, GE 헬스케어사제)를 이용하여 피팅을 행하고, 각각의 펩타이드의 각 용액에서의 CD(circular dichroism; 원편광 이색성) 스펙트럼을 측정하여, 2차 구조 함유율을 산출했다. 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에 나타낸다.

[실시예 2]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 2를 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 B를 얻었다.

(2) 고정화 담체 B를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 3]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 3을 이용한 점, 및 스페이서로서, 폴리아크릴산 1(아미노기 말단 폴리(아크릴산), Mw: 3120) DMSO/DBU(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene; 다이아자바이사이클로운데센)(85: 15vol%) 용액 대신에 폴리아크릴산 2(아미노기 말단 폴리(아크릴산), Mw: 1350) DMSO/DBU(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene; 다이아자바이사이클로운데센)(94: 6vol%) 용액을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 C를 얻었다.

(2) 고정화 담체 C를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 4]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 3을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 D를 얻었다.

(2) 고정화 담체 D를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 5]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 3을 이용한 점, 및 스페이서로서, 폴리아크릴산 1(아미노기 말단 폴리(아크릴산), Mw: 3120) DMSO/DBU(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene; 다이아자바이사이클로운데센)(85: 15vol%) 용액 대신에 폴리아크릴산 3(아미노기 말단 폴리(아크릴산), Mw: 8400) DMSO/DBU(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene; 다이아자바이사이클로운데센)(68: 32vol%) 용액을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 E를 얻었다.

(2) 고정화 담체 E를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 6]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 3을 이용한 점, 및 리간드를 고정할 때의 고정화 용매로서, 메탄올(MeOH) 대신에 아이소프로필알코올(IPA)을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 F를 얻었다.

(2) 고정화 담체 F를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 7]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 3을 이용한 점, 및 리간드를 고정할 때의 고정화 용매로서, 메탄올(MeOH) 대신에 에탄올(EtOH)을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 G를 얻었다.

(2) 고정화 담체 G를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 8]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 4를 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 H를 얻었다.

(2) 고정화 담체 H를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 9]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 5를 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 I를 얻었다.

(2) 고정화 담체 I를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 10]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 6을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 J를 얻었다.

(2) 고정화 담체 J를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 11]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 7을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 K를 얻었다.

(2) 고정화 담체 K를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[실시예 12]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 8을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 L을 얻었다.

(2) 고정화 담체 L을 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[비교예 1]

(1) 리간드를 고정할 때의 고정화 용매로서, 메탄올(MeOH) 대신에 HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰산)를 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 M을 얻었다. 또한, 스페이서의 고정 조작을 행하지 않고, CM5 센서 칩을 이용한 점, 및 메탄올 대신에 HEPES를 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 M2를 얻었다.

(2) 고정화 담체 M 및 고정화 담체 M2를 이용하여, 고정화 담체 M의 고정화 담체 M2에 대한 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 고정화 담체 M을 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[비교예 2]

(1) 스페이서의 고정 조작을 행하지 않고, CM5 센서 칩을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 N을 얻었다.

(2) 고정화 담체 N을 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[비교예 3]

(1) 단쇄 펩타이드 1 대신에 단쇄 펩타이드 3을 이용한 점, 및 스페이서의 고정 조작을 행하지 않고, CM5 센서 칩을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 고정화 담체 O를 얻었다.

(2) 고정화 담체 O를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 항체 결합성 개선율을 평가하고, 또한 2차 구조 함유율을 산출했다. 항체 결합성 개선율의 평가 결과를 표 5의 "항체 결합성 개선율"의 란에, 산출한 2차 구조 함유율을 표 5의 "2차 구조 함유율"의 란에, 각각 나타낸다.

[표 5]

표 5 중, 단쇄 펩타이드 1~8은, 각각, 표 3에 기재한 단쇄 펩타이드 1~8을 나타낸다.

또한, 표 5 중, 고정화 용매의 란의 MeOH는 메탄올을, EtOH는 에탄올을, IPA는 아이소프로필알코올을, HEPES는 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰산을, 각각 나타낸다.

또한, 표 5 중, 폴리아크릴산 1은 아미노기 말단 폴리(아크릴산)(Mw: 3120)를, 폴리아크릴산 2는 아미노기 말단 폴리(아크릴산)(Mw: 1350)를, 폴리아크릴산 3은 아미노기 말단 폴리(아크릴산)(Mw: 8400)를, 각각 나타낸다.

실시예 1~12의 고정화 담체는, 항체 결합성 개선율의 평가가 높고, 항체 결합성이 우수했다. 이것은, 알코올 용매 중에서 유기한 2차 구조를 유지한 채로, 단쇄 펩타이드를 담체에 고정화할 수 있었기 때문이라고 생각된다.

한편, 비교예 1~3의 고정화 담체는, 항체 결합성 개선율의 평가가 낮고, 항체 결합성이 실시예 1~12에 비하여 뒤떨어졌다. 이것은, 알코올 용매 중에서 유기한 2차 구조를 유지한 채로, 단쇄 펩타이드를 담체에 고정화할 수 없었기 때문이라고 생각된다.

배열표

국제 접수 특허 협력 조약에 근거하는 국제 출원원 W-5661PCT 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조방법 JP16060907 20160401----00060076051600669431 정상 20160401092425201603151608386370_P1AP101__W-_5.app

SEQUENCE LISTING <110> Fuji Film Corporation <120> Method of immobiliizng a short chain polypeptide on a carrier and a carrier-immobilized short chain polypeptide <130> W-5661PCT <150> JP2015-081768 <151> 2015-04-13 <150> JP2015-173944 <151> 2015-09-03 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq_ID_No.1: EQQNAFY <400> 1 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq_ID_No.2: EQQNAFYEILH <400> 2 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq_ID_No.3: EQQNAFYEILHL <400> 3 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq_ID_No.4: EGQNAFY <400> 4 Glu Gly Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq_ID_No.5: EGQNAFYEILH <400> 5 Glu Gly Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 1 5 10 <210> 6 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Claims

알코올 용매 및 상기 알코올 용매 중에서 2차 구조가 유기되고, 또한 복수의 고정화 관능기를 갖는 단쇄 펩타이드를 포함하는 알코올 용액을 준비하는 공정과,
상기 고정화 관능기와 반응하는 반응성기를 갖는 스페이서가 결합된 담체와 상기 알코올 용액을 접촉시켜, 상기 단쇄 펩타이드를 상기 스페이서에 고정화하는 공정을 포함하는, 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 단쇄 펩타이드가 34잔기 이하인, 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 단쇄 펩타이드와 상기 스페이서가 공유 결합을 통하여 고정화되는, 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스페이서의 분자량이 10000 이하인, 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고정화 관능기가 싸이올기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고정화 관능기가 상기 단쇄 펩타이드의 적어도 한쪽의 말단에 위치하는, 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단쇄 펩타이드가, 상기 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기가 복수 포함되고, 또한 상기 고정화 관능기를 갖는 아미노산 잔기의 사이에 고정화 관능기를 갖지 않는 아미노산 잔기를 적어도 하나 포함하는 부분 구조를 갖는, 단쇄 펩타이드 고정화 담체의 제조 방법.
담체와, 상기 담체 상에 결합된 스페이서와, 상기 스페이서 상에 배치되고, 또한 2차 구조가 유지되어 있는 단쇄 펩타이드를 갖는 단쇄 펩타이드 고정화 담체.
청구항 8에 있어서,
상기 담체와 상기 스페이서가 공유 결합에 의하여 결합되어 있는, 단쇄 펩타이드 고정화 담체.