CN107531799A - 短链肽固定化载体的制造方法及短链肽固定化载体 - Google Patents

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Abstract

本发明能够提供一种保持短链肽的二级结构的短链肽固定化载体的制造方法，其具备：准备醇溶剂及醇溶液的工序，所述醇溶液中包含有在醇溶剂中诱导二级结构且具有多个固定化官能团的短链肽；及通过使载体与醇溶液接触而将短链肽固定于间隔物的工序，所述载体结合有具有与固定化官能团进行反应的反应性基团的间隔物。

Description

短链肽固定化载体的制造方法及短链肽固定化载体
技术领域
本发明涉及一种短链肽固定化载体的制造方法及短链肽固定化载体。
背景技术
近年来，抗体药物的开发呈现活跃的状态。这是由于利用人体免疫功能的抗体药物可以期待高功效，而且副作用也比较少，因此被视为未来医疗的中心。在抗体药物的开发/实用化中不可或缺的技术为抗体的连续/大量/高速的纯化技术。为了纯化抗体，目前最普遍利用的方法是将蛋白A用作配体的亲和层析法。
然而，蛋白A是利用基因工程方法而制造的，因此制造工序复杂，若将蛋白A本身用作亲和层析用配体，则存在最终成为高成本的问题。
针对这种问题，一直以来进行了如下研究：根据与蛋白A的IgG(Immunog lobulinG；免疫球蛋白G)相互作用的部分的氨基酸序列，使用长度大致为50残基以下的短链肽(例如非专利文献1)。
另一方面，作为将短链肽固定于载体上的方法，可以举出例如在专利文献1中记载的在基板上形成二维微薄膜的方法。该方法的特征为包括：准备有机分子材料的工序，该有机分子材料的特征为具备以下三个条件中的任一个，作为用于形成薄膜的有机分子材料至少具有肽链，该肽链由(1)4～50的氨基酸残基构成、(2)至少具有亲水性氨基酸残基及疏水性氨基酸残基、及(3)可以被吸附于基材上，并具有在被吸附时可形成β-片结构的氨基酸序列；肽链以可以保持α-螺旋或无规卷曲结构的浓度包含该有机分子材料，且制备出有机分子材料分别游离而分散的状态的溶液的工序；及将溶液供给到基材的表面，将溶液中的有机分子材料吸附于基材上，并且在基材上设置吸附到基材上时的有机分子材料的肽链分别形成β-片而成的单分子膜的工序。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2010-001238号公报
非专利文献
Braisted，A.C.、另外1名、“Minimizing a binding domain from protein A”、美国科学院院刊、美国科学院、1996年6月、第93卷、第12号、p.5688-5692
发明内容
发明要解决的技术课题
然而，根据本发明人进行的研究，在专利文献1中所记载的方法中，在溶液中保持使短链肽诱导的二级结构的状态下固定于载体是比较困难的。由于无法将有意诱导形成的二级结构直接进行固定，因此通过固定短链肽的二级结构发生变化，存在利用抗原抗体反应等的立体结构的键能降低或丧失的问题。并且，需要形成单分子层，成本高且不实用。
于是，本发明的课题在于提供一种保持短链肽的二级结构的短链肽固定化载体的制造方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人为了解决上述课题而重复进行深入研究的结果，得知了通过具备如下工序，将短链肽在保持二级结构的状态下能够固定于载体，并完成了本发明：准备醇溶剂及醇溶液的工序，该醇溶液中包含有在醇溶剂中诱导二级结构且具有多个固定化官能团的短链肽；及通过使载体与醇溶液接触而将短链肽固定于间隔物的工序，所述载体结合有具有与固定化官能团进行反应的反应性基团的间隔物。在本发明中能够得到可以进行抗原抗体反应的短链肽固定化载体，并能够得到具有高结合性的载体。并且，通过利用具有反应性基团的间隔物，不需要形成单分子层，可以实现低成本化。
即，本发明提供以下(1)～(9)。
(1)一种短链肽固定化载体的制造方法，其具备：
准备包含醇溶剂和短链肽的醇溶液的工序，所述短链肽在醇溶剂中被诱导二级结构且具有多个固定化官能团；及
通过使载体与醇溶液接触而将短链肽固定于间隔物的工序，所述载体结合有具有与固定化官能团进行反应的反应性基团的间隔物。
(2)根据上述(1)所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，短链肽为34残基以下。
(3)根据上述(1)或(2)所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，短链肽和间隔物经由共价键而被固定。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，间隔物的分子量为10000以下。
(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，固定化官能团是选自硫醇基及氨基中的至少1种。
(6)根据上述(1)～(5)中任一项所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，固定化官能团位于短链肽的至少一个末端。
(7)根据上述(1)～(5)中任一项所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，短链肽具有如下局部结构：包含多个具有固定化官能团的氨基酸残基，且在具有固定化官能团的氨基酸残基之间包含至少一个不具有固定化官能团的氨基酸残基。
(8)一种短链肽固定化载体，其具有：载体、结合于载体上的间隔物、配置于间隔物上且保持二级结构的短链肽。
(9)根据上述(8)所述的短链肽固定化载体，其中，载体和间隔物通过共价键而被结合。
发明效果
根据本发明，能够提供一种在水系溶剂中也能够保持短链肽的二级结构的短链肽固定化载体的制造方法。
并且，根据本发明，能够提供一种在水系溶剂中也能够保持短链肽的二级结构的短链肽固定化载体。
具体实施方式
关于本发明的短链肽固定化载体的制造方法(以下，有时简称为“本发明的制造方法”。)进行说明。
[短链肽固定化载体的制造方法]
本发明的短链肽固定化载体的制造方法的特征在于具备：准备醇溶剂及醇溶液的工序，该醇溶液包含有在醇溶剂中诱导二级结构，且具有多个固定化官能团的短链肽(以下，称作“工序A”。)；及通过使载体和醇溶液接触而将短链肽固定于间隔物的工序，所述载体结合有具有与固定化官能团进行反应的反应性基团的间隔物(以下，称作“工序B”。)。
<术语的说明>
首先，关于在本发明中使用的术语进行说明。
1.短链肽
(1)短链肽的定义
“短链肽”是指氨基酸残基数约为50残基以下的肽。然而，在结合有多个结构域的融合肽时，是指氨基酸残基的总数约为50残基以下的融合肽。
(2)本发明的短链肽
在本发明中使用的短链肽(以下，有时称作“本发明的短链肽”。)在醇溶剂中诱导二级结构且具有多个固定化官能团。
本发明的短链肽在醇溶剂中诱导二级结构。在此，“二级结构”是指短链肽主链的部分立体结构，例如包括α螺旋、β片、β转角、310螺旋、π螺旋及2.27带等结构。并且，“在醇溶剂中诱导二级结构”是指醇溶剂中的二级结构含有率成为HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))缓冲液、Tris缓冲液或磷酸缓冲液等pH为5～9的接近中性且10～30℃的水系溶剂中的二级结构含有率的1.5倍以上。醇溶剂中的二级结构含有率优选在水系溶剂中的二级结构含有率的2倍以上，更优选3倍以上。在此，二级结构含有率能够通过CD(circular dichroism；圆二色光谱)而算出。例如使用圆二色光谱仪(J-820，JASCO Corporation制造)测定CD光谱，根据所得到的CD光谱，使用蛋白质二级结构分析程序(JWSSE-480，JASCO Corporation制造)来分析二级结构，从而可得到二级结构含有率。
本发明的短链肽的氨基酸残基数只要是50残基以下，则并无特别的限制。从对醇溶剂的溶解性的观点考虑，本发明的短链肽的氨基酸残基数优选为34残基以下，更优选为30残基以下，进一步优选为25残基以下，更进一步优选为20残基以下。并且，从诱导二级结构的观点考虑，本发明的短链肽的氨基酸残基数优选为5残基以上，更优选为7残基以上，进一步优选为10残基以上。而且，本发明的短链肽的氨基酸残基数优选在5～50残基的范围内，更优选在5～34残基的范围内，进一步优选在7～30残基的范围内，更进一步优选在7～25残基的范围内，更进一步优选在10～20残基的范围内。
另外，在本发明中，使用“～”来表示数值范围的情况下，该数值范围的两端包括在该数值范围内。例如在“5～50”的数值范围中，包括作为下限的“5”及作为上限的“50”。
本发明的短链肽的分子量并无特别的限定。
从抗原性的观点考虑，本发明的短链肽的分子量在氨基酸残基的总分子量中优选为5000以下，更优选为3500以下，进一步优选为3000以下。并且，从诱导二级结构的观点考虑，本发明的短链肽的分子量在氨基酸残基的总分子量中优选为500以上，更优选为600以上，进一步优选为800以上。而且，从不显现抗原性而诱导二级结构的观点考虑，本发明的短链肽的分子量优选为500～5000，更优选为600～3500，进一步优选为800～3000。
构成本发明的短链肽的氨基酸残基可以是仅包含来源于天然氨基酸的氨基酸残基，而且，也可以包含来源于非天然氨基酸的氨基酸残基。关于天然氨基酸及非天然氨基酸，将进行后述。
本发明的短链肽所具有的多个固定化官能团(以下，有时称作“本发明的短链肽的固定化官能团”。)只要与间隔物所具有的官能团具有反应性，则并无特别的限定。
作为本发明的短链肽的固定化官能团，可以举出例如氨基(酰胺键形成)、羧基、羟基及硫醇基等。在此，反应性是指本发明的短链肽的固定化官能团与间隔物所具有的官能团进行反应而形成共价键的性质。上述共价键并无特别的限定，但优选形成稳定的键。作为上述共价键，可以举出例如二硫键、肽键(酰胺键)、磷酸二酯键、糖苷键、重氮键、硫醚键、烯烃键、环氧键及通过点击化学反应的结果而得到的键等。在这些共价键中，从键稳定性的观点考虑，优选选自肽键、硫醚键、烯烃键及通过点击化学反应的结果而得到的键。
作为本发明的短链肽的固定化官能团，可以举出例如硫醇基、氨基、羧基、羟基、磷酸酯基、环氧酯、缩水甘油基、叠氮基及炔基等。作为本发明的短链肽的固定化官能团，优选为选自硫醇基及氨基中的至少1种。
另外，本发明的短链肽的固定化官能团的种类可以是1种，也可以组合2种类以上。
本发明的短链肽中的具有固定化官能团的氨基酸残基的位置并无特别的限定。例如本发明的短链肽可以是具有固定化官能团的氨基酸残基在本发明的短链肽的肽链的N末端侧或C末端侧的一方集中配置的结构，也可以是在N末端侧及C末端侧两侧分散配置的结构。
作为在N末端侧集中配置的结构的短链肽的非限定的一例，能够举出在用序列号1表示的肽的N末端结合有3个赖氨酸残基(K)的“KKKEQQNAFY”。并且，作为在C末端侧集中配置的结构的短链肽的非限定的一例，能够举出在用序列号1表示的肽的C末端结合有3个赖氨酸残基(K)的“EQQNAFYKKK”。而且，作为在N末端侧及C末端侧两侧分散配置的结构的短链肽的非限定的一例，能够举出用序列号1表示的肽的N末端及C末端结合有各3个赖氨酸残基(K)的“KKKEQQNAFYKKK”。该情况下，固定化官能团是赖氨酸残基的侧链的ε氨基及N末端的氨基。
并且，短链肽也可以具有如下局部结构，即在具有固定化官能团的氨基酸残基之间至少包含1个不具有固定化官能团的氨基酸残基。
作为具有固定化官能团的氨基酸残基之间至少包含1个不具有固定化官能团的氨基酸残基的局部结构的短链肽的非限定的一例，能够举出作为具有固定化官能团的氨基酸残基而采用赖氨酸残基(K)，作为包含至少1个不具有固定化官能团的氨基酸残基的局部结构而采用了用序列号1表示的肽“EQQNAFY”的“KEQQNAFYKEQQNAFYK”。在此，固定化官能团是赖氨酸残基的侧链的ε氨基及N末端的氨基。
作为本发明的短链肽，优选具有抗体结合性的短链肽。
在此，抗体结合性是指保持一定的亲和性而与抗体或抗体衍生物结合的性质。与抗体或抗体衍生物的结合优选基于抗原抗体反应的结合，作为结合的部位，优选抗体或抗体衍生物的恒定区(Fc区、CL区、CH区)。
“抗体”是指免疫球蛋白或其类似物、片断或融合体。在此，类似物是指免疫球蛋白的结构或功能至少部分得到保持的、以天然的或人工制作的蛋白质或蛋白质缀合物。并且，片断是指通过酶处理或基因工程设计而制作的、具有免疫球蛋白的局部结构的蛋白质。并且，融合体是指使具有各种细胞因子或细胞因子受体等生物活性的蛋白质的功能部分与免疫球蛋白的整体或一部分以基因工程的方式融合而制作出的蛋白质。并且，作为抗体，优选单克隆抗体或者具有免疫球蛋白的Fc区的融合体，更优选单克隆抗体。另外，在本发明中，免疫球蛋白可以是IgG(Immunoglobulin G，免疫球蛋白G)、IgM(Immunoglobulin M，免疫球蛋白M)、IgA(Immunoglobulin A，免疫球蛋白A)、IgD(Immunoglobulin D，免疫球蛋白D)及IgE(Immunoglobulin E，免疫球蛋白E)这5种类别(同种型)中的任一个，但优选IgG或IgM，更优选IgG。
“抗体衍生物”是指人免疫球蛋白的Fc区与非人类哺乳动物免疫球蛋白的Fab区融合的嵌合抗体、人免疫球蛋白的几个Fc区与非人类哺乳动物免疫球蛋白的几个Fv区融合的嵌合抗体、除去人免疫球蛋白的CDR(互补决定区)部分的剩余部分与非人类哺乳动物免疫球蛋白CDR的部分融合的人源化抗体、非人类哺乳动物免疫球蛋白的Fc区与人免疫球蛋白的Fab区融合的嵌合抗体、非人类哺乳动物免疫球蛋白的几个Fc区与人免疫球蛋白的几个Fv区融合的嵌合抗体、除去人免疫球蛋白的CDR部分的剩余部分与非人类哺乳动物免疫球蛋白的CDR部分融合的非人类哺乳动物化抗体、非人类哺乳动物免疫球蛋白的Fc区与非人类哺乳动物免疫球蛋白的Fab区融合的嵌合抗体、非人类哺乳动物球蛋白的几个Fc区与非人类哺乳动物免疫球蛋白的几个Fv区融合的嵌合抗体、除去非人类哺乳动物免疫球蛋白的CDR(互补决定区)部分的剩余部分与非人类哺乳动物免疫球蛋白CDR的部分融合的非人类哺乳动物型抗体、以及施加了所述抗体的化学修饰的蛋白质且保持Fc区的蛋白质。
本发明的短链肽优选为由抗体结合结构域和间隔物结合结构域构成的结构，或者还包括将结构域之间进行连接的连接体的结构。并且，本发明的短链肽可以是具有多个抗体结合结构域的融合肽。通过将具有抗体结合性的本发明的短链肽保持二级结构的状态下进行固定，能够以低成本实现抗体吸附剂及抗体保持载体等。
另外，关于结构域及间隔物进行后述。
上述抗体结合结构域的氨基酸序列只要具有抗体结合性，且可以与抗体或抗体衍生物结合，则无特别的限定。作为上述抗体结合结构域的氨基酸序列，优选至少1个在表1所示的序列号1～38的氨基酸序列和选自具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列中的氨基酸序列，更优选选自具有87％以上的序列同源性的氨基酸序列中的氨基酸序列，进一步优选选自具有90％以上的序列同源性的氨基酸序列中的氨基酸序列，更进一步优选选自具有95％以上的序列同源性的氨基酸序列中的氨基酸序列，尤其优选选自序列号1～38的氨基酸序列中的氨基酸序列。
在此，2个氨基酸序列的序列同源性如下求出。
(a)进行2个氨基酸序列的比对
赋予一致(匹配)为+1，不一致(不匹配)为-1，空位为-1的分数，以比对/分数成为最大的方式进行比对。
(b)计算序列同源性
根据所得到的比对，通过下式计算序列同源性。
序列同源性[％]＝(一致位置数量/总位置数量)×100[％]
总位置数量为比对的长度，一致位置数量为氨基酸的种类一致的位置数量。
在此，氨基酸残基的种类是否一致的判断是根据作为该氨基酸残基的来源的氨基酸的侧链(氨基酸侧链)的结构是否相同来进行的。另外，处于对映体的关系的氨基酸的侧链的结构并不相同。
(c)序列同源性的计算例
例如，考虑以下氨基酸序列。
序列A EQQNAFY
序列B KEQQSAFY
若在上述条件下将其进行比对，则成为如下。在此，为了便于观察，在序列A、序列B之间氨基酸(残基)的种类一致的部位标注同源/串“|”。并且，“-”是空位。
该比对的分数为一致(+1)×6+不一致(-1)×1+空位(-1)×1＝4。
该例中，总位置数量是8，一致位置数量是6，因此根据上述式算出的序列同源性为6/8×100＝75.0％。
作为用序列号1表示的氨基酸序列(EQQNAFY)和具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列，可以举出例如用序列号4表示的氨基酸序列(EGQNAFY)、用序列号7表示的氨基酸序列(EQNAFY)、用序列号10表示的氨基酸序列(EQQSAFY)等。
作为用序列号2表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILH)和具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列，可以举出例如用序列号4表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILHL)、用序列号11表示的氨基酸序列(EQQSAFYEILH)等。
作为用序列号3表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILHL)和具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列，可以举出例如用序列号2表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILH)等。
作为用序列号4表示的氨基酸序列(EGQNAFY)和具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列，可以举出例如用序列号1表示的氨基酸序列(EQQNAFY)、用序列号7表示的氨基酸序列(EQNAFY)、用序列号10表示的氨基酸序列(EQQSAFY)等。
作为用序列号5表示的氨基酸序列(EGQNAFYEILH)和具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列，可以举出例如用序列号3表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILH)、用序列号11表示的氨基酸序列(EQQSAFYEILH)等。
作为用序列号6表示的氨基酸序列(EGQNAFYEILHL)和具有序列同源性85％以上的氨基酸序列，可以举出例如用序列号3表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILHL)等。
作为用序列号7表示的氨基酸序列(EQNAFY)和具有序列同源性85％以上的氨基酸序列，可以举出例如用序列号1表示的氨基酸序列(EQQNAFY)、用序列号4表示的氨基酸序列(EGQNAFY)等。
作为用序列号8表示的氨基酸序列(EQNAFYEILH)和具有序列同源性85％以上的氨基酸序列，可以举出例如用序列号2表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILH)、用序列号5表示的氨基酸序列(EGQNAFYEILH)、用序列号9表示的氨基酸序列(EQNAFYEILHL)等。
作为用序列号9表示的氨基酸序列(EQNAFYEILHL)和具有序列同源性85％以上的氨基酸序列，可以举出例如用序列号3表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILHL)、用序列号6表示的氨基酸序列(EGQNAFYEILHL)、用序列号8表示的氨基酸序列(EQNAFYEILH)等。
作为用序列号10表示的氨基酸序列(EQQSAFY)和具有序列同源性85％以上的氨基酸序列，可以举出例如用序列号1表示的氨基酸序列(EQQNAFY)、用序列号13表示的氨基酸序列(DQQSAFY)等。
作为用序列号11表示的氨基酸序列(EQQSAFYEILH)和具有序列同源性85％以上的氨基酸序列，可以举出例如用序列号2表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILH)、用序列号12表示的氨基酸序列(EQQSAFYEILHL)、用序列号14表示的氨基酸序列(DQQSAFYEILH)等。
作为用序列号12表示的氨基酸序列(EQQSAFYEILHL)和具有序列同源性85％以上的氨基酸序列，可以举出例如用序列号3表示的氨基酸序列(EQQNAFYEILHL)、用序列号11表示的氨基酸序列(EQQSAFYEILH)、用序列号15表示的氨基酸序列(DQQSAFYEILHL)等。
作为用序列号13表示的氨基酸序列(DQQSAFY)和具有序列同源性85％以上的氨基酸序列，可以举出例如用序列号10表示的氨基酸序列(EQQSAFY)等。
[表1]
(3)氨基酸残基/氨基酸
3.1)氨基酸残基
“氨基酸残基”的术语根据IUPAC(International Union of Pure and AppliedChemistry；国际纯化学与应用化学联盟)金皮书的定义。即，是指通过2个以上的氨基酸在分子之间进行肽结合而形成了肽时的、氨基酸分子在肽结合时被脱水的剩余部分称作氨基酸残基。从而，构成肽链的单元是氨基酸残基。并且，在肽链中，将C末端的氨基酸残基称作C端残基，将N末端的氨基酸残基称作N端残基。氨基酸残基只要其来源的氨基酸的种类相同，则可作为相同种类的氨基酸残基而使用。
3.2)氨基酸
只要没有特别的说明，则“氨基酸”为在分子中具有氨基(-NH2)或亚氨基和羧基的有机化合物，是指通过2个以上的肽结合而可以形成肽的氨基酸。
氨基酸的名称、缩写在原则上使用基于国际纯化学与应用化学联盟和国际生物化学与分子生物学联盟的共同命名委员会(INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIEDCHEMISTRY and INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN))中所采用的名称、缩写等来表示。在表2中，1个字母缩写及3个字母缩写表示得到公认的α-氨基酸的名称及缩写(1个字母缩写、3个字母缩写)。另外，表示任意的氨基酸的“Xaa”也能够使用于表示除了表2所示的氨基酸以外的氨基酸的情况。
[表2]
在本发明中，不仅来源于天然氨基酸，而且来源于非天然氨基酸的氨基酸残基也能够作为构成肽链的单元而使用。本发明的短链肽可以仅通过天然氨基酸而构成，也可以仅通过非天然氨基酸构成，也可以含有天然氨基酸及非天然氨基酸两者。在含有天然氨基酸及非天然氨基酸的情况下，天然氨基酸与非天然氨基酸的比率(摩尔比率)并无特别的限定。
3.2.1)天然氨基酸
“天然氨基酸”是指在天然的mRNA(messenger RNA；信使RNA；RNA＝ribonucleotide)上被进行编码的氨基酸。具体而言，天然氨基酸是指甘氨酸(Gly)、L-丙胺酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬酰胺酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、L-缬氨酸(Val)、L-吡咯赖氨酸(Pyl)及L-硒半胱氨酸(Sec)22种氨基酸。
另外，这些氨基酸(甘氨酸除外。)的对映体不包括在天然氨基酸中。
3.2.2)非天然氨基酸
“非天然氨基酸”是指在天然的mRNA(messenger RNA；信使RNA；RNA＝ribonucleotide)上未被进行编码的氨基酸。非天然氨基酸并无特别的限定，可以举出例如D-丙胺酸(D-Ala)、D-精氨酸(D-Arg)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-天冬酰胺酸(D-Asp)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-蛋氨酸(D-Met)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-吡咯赖氨酸(D-Pyl)及D-硒半胱氨酸(D-Sec)等天然氨基酸(甘氨酸除外。)的对映体；2-氨基己二酸(Aad)、2-氨基丁酸(Abu)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2，4-二氨基丁酸(Dbu)、2，2’-二氨基庚二酸(Dpm)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、别羟基赖氨酸(aHyl)、别异亮氨酸(aIle)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、鸟氨酸(Orn)、锁链素(Des)、异锁链素(Ide)等非天然α-氨基酸；6-N-甲基赖氨酸(MeLys)、3-羟基脯氨酸(3Hyp)、4-羟基脯氨酸(4Hyp)、β-丙胺酸(bAla)、3-氨基异丁酸(bAib)、3-氨基己二酸(bAad)、4-氨基丁酸(4Abu)、6-氨基己酸(Acp)等。
另外，各非天然氨基酸的名称之后的括号内的记号是表示各非天然氨基酸的缩写的一例。
(4)肽/融合肽
4.1)肽
“肽”的术语根据IUPAC(International Union of Pure and AppliedChemistry；国际纯化学与应用化学联盟)金皮书的定义。即，是通过2个以上的氨基酸在分子之间进行肽结合而得到的酰胺化合物。
只要没有特别的规定，则肽的氨基酸序列(也称作“一级结构”。)以从左端至右端成为N末端至C末端的方式将氨基酸残基一维排列表示。
在本发明中，肽链的N末端的氨基及C末端的羧基可以被修饰。作为N末端的氨基的修饰，可以举出例如乙酰化及Boc(叔丁氧羰基)化等，作为C末端的羧基的修饰，可以举出例如酰胺化及酯化等。
4.2)融合肽
“融合肽”是指具有某些物理化学或生物化学的功能的2个以上的肽(相当于“结构域”)直接或经由连接体连接而构成的高分子化合物。
上述连接体只要能够连接上述结构域之间，则并无特别的限定。作为上述连接体，可以举出例如由肽链构成的肽连接体、由聚乙二醇链构成的PEG(polyethylene glycol；聚乙二醇)连接体、二硫键(SS键)、硫醚键、烯烃键、通过点击化学反应的结果而得到的键及其中2个以上的组合等。
4.2.1)结构域
“结构域”是指可以显现蛋白质(包括融合蛋白质。)或肽(包括融合肽。)的某些物理化学或生物化学的功能(以下，有时简称为“功能”。)的、通过1个以上、优选2个以上、更优选3个以上、进一步优选4个以上且通过几百个以下的氨基酸残基构成的部分或区域。
结构域根据该功能能够分为例如抗体结合结构域及间隔物结合结构域等。
4.2.1.1)抗体结合结构域
抗体结合结构域是由具有抗体结合性的肽构成的结构域。
抗体结合性如上所述。
4.2.1.2)间隔物结合结构域
间隔物结合结构域是除了抗体结合结构域以外的部分，是包含具有结合于间隔物的固定化官能团的氨基酸残基的结构域。
作为间隔物结合结构域，每一个结构域优选包含至少在侧链上具有1个以上固定化官能团的氨基酸残基1个以上，优选2个以上，更优选3个以上，进一步优选3个以上，更进一步优选4个以上。在此，作为具有固定化官能团的氨基酸残基，可以举出赖氨酸残基(K)、鸟氨酸残基、二氨基丁酸残基、二氨基丙酸残基及高赖氨酸残基等在侧链上具有氨基的氨基酸残基、半胱氨酸残基(C)及高半胱氨酸残基等在侧链上具有硫醇基的氨基酸残基、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)及酪氨酸(Y)等在侧链上具有羟基的氨基酸残基等。通过这些固定化官能团中的任一个与间隔物的官能团的偶联反应，作为配体的短链肽与间隔物进行结合。在间隔物的官能团为羧基的情况下，优选具备与羧基具有反应性的氨基的赖氨酸残基(K)、鸟氨酸残基、二氨基丁酸残基、高赖氨酸残基或二氨基丙酸残基，从经济观点考虑，尤其优选赖氨酸残基(K)。
并且，本发明的短链肽也可以包含多个间隔物结合结构域。
4.2.2)连接体
“连接体”是在融合肽中将结构域彼此之间进行连接的分子链或键。
作为上述分子链，可以举出例如由氨基酸或肽构成的肽连接体、由乙二醇或聚乙二醇构成的PEG(polyethylene glycol；聚乙二醇)连接体等。连接体可以组合2种类以上而使用，例如可以一同包含肽及PEG。
并且，作为上述键，可以举出例如二硫键(SS键)、硫醚键、烯烃键、通过点击化学反应的结果而得到的键等。
构成上述肽连接体的氨基酸残基的数量只要是1个以上，则并无特别的限定，但优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个。
并且，构成上述PEG连接体的乙二醇单元的数量只要是1个以上，则并无特别的限定，但优选为1～24个，更优选为1～12个，进一步优选为4～8个。
在此，能够包含于上述连接体中的氨基酸残基的种类并无特别的限制，可以举出例如与IgG抗体的相互作用少的Gly、Ala及Ser等。并且，上述连接体也可以包含具有固定化官能团的氨基酸残基。
2.醇溶剂
本发明中所使用的醇溶剂(有时简称为“本发明的醇溶剂”。)只要是包含醇的溶剂，则并无特别的限定。
作为上述醇，可以举出例如甲醇、乙醇、2-丙醇(IPA，异丙醇)、叔丁醇(tert-BuOH)、2，2，2-三氟乙醇(TFE，三氟乙醇)、1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP，六氟异丙醇)等。
从肽溶解性的观点考虑，上述醇优选为选自甲醇、乙醇及IPA中的至少1种。
并且，上述醇能够单独使用1种，或者组合2种类以上而使用。
另外，使短链肽诱导二级结构时的醇溶剂和将短链肽固定于载体时的醇溶剂，可以是相同种类的醇溶剂，也可以是不同种类的醇溶剂。例如在甲醇中通过短时间进行浸渍而使短链肽诱导二级结构，并吸附于载体，在异丙醇中也可以通过长时间进行浸渍而使短链肽与间隔物结合。
本发明的醇溶剂中的醇含量并无特别的限定，但从二级结构形成的观点考虑，优选为20％(v/v)以上，更优选为50％(v/v)以上，进一步优选为70％(v/v)以上，更进一步优选为95％(v/v)以上。
在本发明的醇溶剂中，除了醇以外的溶剂只要是不阻碍二级结构形成的溶剂，则并无特别的限定。作为除了上述醇以外的溶剂，从肽溶解性的观点考虑，优选为选自纯水及缓冲液的至少1种，更优选为纯水。作为上述缓冲液，可以举出例如HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))缓冲液、三(三(羟甲基)氨基甲烷)缓冲液及磷酸缓冲液等。
3.配体/抗体结合性配体
“配体”是指保持一定的亲和性而与特定的物质结合的分子。这种分子可以是蛋白质、肽或低分子量化合物等。
“抗体结合性配体”是指具有抗体结合性的配体，即保持一定的亲和性与抗体或抗体衍生物结合的配体。抗体结合性配体优选通过特异分子之间的亲和力发挥作用的抗原抗体反应而与抗体或抗体衍生物结合。作为抗体或抗体衍生物的抗体结合性配体结合的部位，优选恒定区(Fc区、CL区(轻链的恒定区)、CH区(重链的恒定区))。
本发明中所使用的配体(以下，有时简称为“本发明的配体”。)是上述本发明的短链肽。作为本发明的配体，优选在本发明的短链肽中也使用具有抗体结合性的短链肽。
4.间隔物
“间隔物”是介于载体与配体之间的化合物。
本发明中所使用的间隔物(以下，有时简称为“本发明的间隔物”。)具有与本发明的短链肽所具有的固定化官能团进行反应的反应性基团，优选具有在与本发明的短链肽之间形成共价键的官能团。
作为上述官能团，可以举出硫醇基、氨基、羧基、重氮基、氯乙酰基、烯烃基、缩水甘油基、卡宾基、羟基及甲酰基等。从键稳定性的观点考虑，作为上述官能团，优选选自硫醇基、氨基、羧基、氯乙酰基及缩水甘油基中的至少1种，进一步优选选自羧基及缩水甘油基中的至少1种。
作为本发明的间隔物，优选多官能羧酸，尤其优选聚丙烯酸。聚丙烯酸的末端也可以被附加氨基等官能团。
本发明的间隔物的长度并无特别的限定，优选比诱导二级结构的短链肽的表观的长度长，以便在醇溶剂中包含短链肽的二级结构发生变化的部位的位置在多个点上进行共价键合。
本发明的间隔物的分子量并无特别的限定。本发明的间隔物的分子量以质均分子量计优选为10000以下，更优选为9000以下，进一步优选为5000以下，更进一步优选为3000以下。
并且，本发明的间隔物的分子量以质均分子量计优选为300以上，更优选为500以上，进一步优选为900以上，更进一步优选为1500以上。而且，本发明的间隔物的分子量以质均分子量计优选在300～10000的范围内，更优选在900～9000的范围内，进一步优选在900～5000的范围内，更进一步优选在1500～3000的范围内。
若本发明的间隔物的分子量过小，则与短链肽的结合点变少，难以保持短链肽的二级结构。并且，若本发明的间隔物的分子量过大，则难以在载体上结合大量的本发明的间隔物。
间隔物被结合于后述载体上，优选在载体上的官能团上直接结合，或者与载体上的官能团之间经由酰胺键、马来酰亚胺、酯键、醚键、环氧键或烯烃键等共价键而结合，更优选结合力高的酰胺键或环氧键。
5.载体
载体是承载配体的基材。
作为本发明中所使用的载体，优选水不溶性载体。
作为水不溶性载体，可以举出例如结晶纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖、交联普鲁兰多糖等多糖类、丙烯酸酯系聚合物、苯乙烯系聚合物等有机载体、玻璃珠、硅胶等无机载体、以及通过它们的组合而得到的有机-有机及有机-无机等复合载体等。
作为水不溶性载体，从耐碱性的观点考虑，更优选多糖类或丙烯酸酯系聚合物，进一步优选琼脂糖或纤维素等多糖类。
作为可用作水不溶性载体的市售品，可以举出例如作为多孔质纤维素凝胶的Cellufine GCL2000(JNC Corporation.制造)Cellufine MAX CM(JNC Corporation.制造)、以共价键合的方式将烯丙基葡聚糖和亚甲基双丙稀酰胺进行交联的Sephacryl S-1000 SF(GE Healthcare公司制造)、作为丙烯酸类载体的TOYOPEARL(TOSOH CORPORATION制造)、TOYOPEARL AF-Carboxy-650(TOSOH CORPORATION制造)、TOYOPEARL GigaCap CM-650(TOSOH CORPORATION制造)、作为琼脂糖类交联载体的Sepharose CL4B(GE Healthcare公司制造)、作为被环氧基活性化的聚甲基丙烯酰胺的Eupergit C250L(Sigma-AldrichCo.LLC.制造)及将羧甲基葡聚糖涂布于金膜表面的传感器芯片CM5(GE Healthcare公司制造)等。然而，本发明中的水不溶性载体并不仅限定于这些载体或活性化载体。并且，从本吸附材料的使用目的及方法考虑，优选本发明中所使用的水不溶性载体的表面积较大，优选为具有适当大小的多个细孔的多孔质。载体的形式上无特别的限定，可以是珠状、纤维状、膜状、中空线状等任意一种，可以选择任意的形式。
<工序A/工序B>
关于工序A及工序B的顺序进行说明。
1.工序A的顺序
在工序A中，准备包含上述短链肽的醇溶液的顺序并无特别的限制，可以举出例如将规定的短链肽添加到醇溶液中静放规定时间。
醇溶液中的短链肽的浓度并无特别的限制，可以根据所使用的短链肽的种类而不同，但相对于醇溶液总质量，优选为0.0000001～5质量％，更优选为0.00001～1质量％，进一步优选为0.001～1质量％。
并且，上述醇溶液的pH并无特别的限定，优选在pH4～12的范围内。
并且，制备上述醇溶液时的温度并无特别的限制，优选在2～50℃下实施。
2.工序B的顺序
在工序B中，使结合有上述间隔物的载体与上述醇溶液接触的方法并无特别的限制，可以举出例如在醇溶液中添加结合有上述间隔物的载体的方法。
另外，在使结合有间隔物的载体与醇溶液接触时，根据需要，也可以存在促进短链肽中的固定化官能团与间隔物中的反应性基团的反应的化合物。例如固定化官能团与反应性基团的反应是脱水缩合反应的情况下，作为上述化合物，优选使用所谓的脱水缩合剂(例如(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺))等。在使用这种脱水缩合剂时，可以先使脱水缩合剂与结合有间隔物的载体接触之后与醇溶液接触。并且，例如在二硫键的情况下，优选使用如过氧化氢和碘之类的氧化剂。并且，例如在糖苷键的情况下，优选使酸存在。短链肽中的固定化官能团与间隔物中的反应性基团的反应优选通过氨基偶联反应在氨基与羧基之间形成酰胺键。而且，根据需要，也可以添加选自二氮杂二环(DBU)、二氮杂双环辛烷(DABCO)、二氮杂双环壬烯(DBN)、甲基咪唑、二甲基苯胺、三乙胺及吡啶中的至少1种碱基。
固定于载体上的短链肽的密度并无特别的限定，优选0.1mmol～1000mmol/填充剂1L，更优选0.1mmol～500mmol/填充剂1L，进一步优选1mmol～100mmol/填充剂1L。若在该范围内，则短链肽的使用量和抗体纯化性能的平衡性良好，能够以更低成本且高效地纯化抗体。
[短链肽固定化载体]
通过本发明的制造方法而能够制造短链肽固定化载体，其具有载体、结合于载体上的间隔物、配置于间隔物上且保持有二级结构的短链肽。
作为短链肽，若使用具有抗体结合性的短链肽，则本发明的短链肽固定化载体能够作为抗体结合性优异的亲和层析用载体而利用。并且，在抗原性及成本方面考虑，本发明的短链肽固定化载体是比蛋白A更有利的亲和层析用载体。
根据以下实施例，对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
[肽的合成]
利用全自动肽合成装置(PSSM-8、Shimadzu Corporation.制造)，合成了表3所示的短链肽。
[表3]
※1：“Ac-”表示N末端乙酰化。
表3中固定化官能团数是存在于赖氨酸残基的侧链上的氨基(ε氨基)及N末端氨基(α氨基)的合计。
并且，表4中示出表3中所记载的短链肽1～8的HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液中及甲醇(MeOH)中的二级结构含有率。
[表4]
将各短链肽的HEPES溶液或甲醇溶液中的CD(circular dichroism；圆二色光谱)光谱，用圆二色光谱仪J-820(JASCO Corporation制造)来进行测定，并根据所得到的CD光谱，使用蛋白质二级结构分析程序JWSSE-480(JASCO Corporation制造)分析二级结构，从而得到短链肽1～8的HEPES缓冲液中或甲醇(MeOH)中的二级结构含有率。另外，表4中，短链肽1～8分别是表3中所记载的短链肽1～8。并且，“HEPES中”表示HEPES缓冲液(10mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))-HCl(盐酸)、1.50mM NaCl(氯化钠)、pH7.4、25℃)中的二级结构含有率，“MeOH中”表示甲醇(纯度99.5质量％)中的二级结构含有率。
短链肽1～8在甲醇(MeOH)中的二级结构含有率均为HEPES中的二级结构含有率的2倍以上至4倍以上，由于是1.5倍以上，因此是在醇溶剂中诱导二级结构的短链肽。
[实施例1]
(1)间隔物的固定
在市售的CM5传感器芯片(羧甲基葡聚糖导入型，GE Healthcare公司制造)中，添加包含0.47M的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)及0.35M的NHS(N-hydroxysuccinimide；N-羟基琥珀酰亚胺，WakoPure Chemical Industries，Ltd.制造)的DMSO(Dimethysulfoxide；二甲基亚砜，WakoPure Chemical Industries，Ltd.制造)溶液50μL，在室温下进行了1小时的活性化。
用DMSO进行清洗之后，将氨基末端聚丙烯酸(质均分子量(Mw)：3120)(以下，有时称作“聚丙烯酸1”。)溶解于DMSO(二甲基亚砜)/DBU(1，8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；二氮杂二环)(85∶15vol％)溶液中而调整为50mM溶液，将20μL的该溶液添加于传感器芯片，在室温下使其反应2小时。
然后，用DMSO进行清洗之后，通过乙醇胺溶液而实施封闭处理，得到了间隔物固定化载体(以下，有时称作“载体A”。)。
(2)配体的固定
在表面等离子体共振装置(Biacore3000，GE Healthcare公司制造)上配置在“(1)间隔物的固定”中得到的载体A，以10μL/min的流速使SPR(Surface Plasmon Resonance；表面等离子体共振)用HEPES缓冲液(10mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))-HCl(盐酸)、150mM NaCl(氯化钠)、pH7.4)稳定，添加了70μL的0.2M的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)和0.04M的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混合水溶液。之后，将用甲醇(相当于固定化溶剂。)来稀释为4μM的短链肽1的10μL的试样溶液供给到载体试样中，之后，通过乙醇胺溶液实施封闭处理，用氢氧化钠水溶液来进行清洗并进行了固定。以相同的顺序，在载体A上，使用以HEPES缓冲液稀释为4μM的短链肽1的试样溶液固定于另一流路上。以下，将所得到的固定化载体称作“固定化载体A”。
(3)抗体结合性改善率的评价
在“(2)配体的固定”中制造的固体化载体A中，经10分钟添加10～3000nM的人IgG抗体，并测定HEPES缓冲液中的25℃下的解离，根据结合反应曲线算出抗体的结合速度Kon[nM/s]及解离速度Koff[l/s]，另外，算出分别利用甲醇和HEPES缓冲液进行了固定时的、短链肽1与人IgG抗体的结合反应中的解离常数Kd[nM]。将相对于利用HEPES缓冲液进行了固定时的解离常数Kd[nM]的、利用甲醇进行了固定时的解离常数Kd[nM]设为抗体结合性改善率，根据以下抗体结合性改善率的评价基准进行评价，将评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中。
(抗体结合性改善率的评价基准)
解离常数(Kd)的改善率超过10倍··········A
解离常数(Kd)的改善率超过3倍且10倍以下·····B
解离常数(Kd)的改善率超过2倍且3倍以下······C
解离常数(Kd)的改善率超过1倍且2倍以下······D
解离常数(Kd)的改善率为1倍以下··········E
评价A、B及C表示根据该固定化的改善效果充分，评价D及E表示未见到充分的改善效果。通过使用显示出充分的改善效果的配体固定化状态，能够与抗体进行特异性结合，可以更有效地纯化抗体，能够进一步降低抗体的纯化成本。
另外，使用拟合软件(BIAevaluation4.1，GE Healthcare公司制造)进行拟合，测定各种肽在各溶液中的CD(circular dichroism；圆二色光谱)光谱，算出二级结构含有率。将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例2]
(1)使用短链肽2来代替短链肽1，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体B。
(2)使用固定化载体B，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例3]
(1)使用短链肽3来代替短链肽1，以及作为间隔物而使用聚丙烯酸2(氨基末端聚(丙烯酸)、Mw：1350)DMSO/DBU(1，8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；二氮杂二环)(94∶6vol％)溶液来代替聚丙烯酸1(氨基末端聚(丙烯酸)、Mw：3120)DMSO/DBU(1，8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；二氮杂二环)(85∶15vol％)溶液，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体C。
(2)使用固定化载体C，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例4]
(1)使用短链肽3来代替短链肽1，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体D。
(2)使用固定化载体D，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例5]
(1)使用短链肽3来代替短链肽1、以及作为间隔物而使用聚丙烯酸3(氨基末端聚(丙烯酸)、Mw：8400)DMSO/DBU(1，8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；二氮杂二环)(68∶32vol％)溶液来代替聚丙烯酸1(氨基末端聚(丙烯酸)、Mw：3120)DMSO/DBU(1，8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；二氮杂二环)(85∶15vol％)溶液，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体E。
(2)使用固定化载体E，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例6]
(1)使用短链肽3来代替短链肽1、以及作为固定配体时的固定化溶剂，使用异丙醇(IPA)来代替甲醇(MeOH)，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体F。
(2)使用固定化载体F，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例7]
(1)使用短链肽3来代替短链肽1、以及作为固定配体时的固定化溶剂，使用乙醇(EtOH)来代替甲醇(MeOH)，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体G。
(2)使用固定化载体G，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例8]
(1)使用短链肽4来代替短链肽1，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体H。
(2)使用固定化载体H，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例9]
(1)使用短链肽5来代替短链肽1，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体I。
(2)使用固定化载体I，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例10]
(1)使用短链肽6来代替短链肽1，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体J。
(2)使用固定化载体J，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例11]
(1)使用短链肽7来代替短链肽1，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体K。
(2)使用固定化载体K，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[实施例12]
(1)使用短链肽8来代替短链肽1，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体L。
(2)使用固定化载体L，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[比较例1]
(1)作为固定配体时的固定化溶剂，使用HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)来代替甲醇(MeOH)，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体M。进而，不进行间隔物的固定操作而使用了CM5传感器芯片、以及使用HEPES来代替甲醇，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体M2。
(2)使用固定化载体M及固定化载体M2，评价固定化载体M相对于固定化载体M2的抗体结合性改善率，并且，使用固定化载体M，以与实施例1相同的方式算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[比较例2]
(1)不进行间隔物的固定操作，而使用了CM5传感器芯片，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体N。
(2)使用固定化载体N，以与实施例1相同的方式评价抗体结合性改善率，进而，算出了二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[比较例3]
(1)使用短链肽3来代替短链肽1、以及不进行间隔物的固定操作，而使用了CM5传感器芯片，除了这一点以外，以与实施例1相同的方式得到固定化载体0。
(2)使用固定化载体0，以与实施例1相同方式评价抗体结合性改善率，进而，算出二级结构含有率。将抗体结合性改善率的评价结果示于表5的“抗体结合性改善率”一栏中，将所算出的二级结构含有率示于表5的“二级结构含有率”一栏中。
[表5]
表5中，短链肽1～8分别表示表3中所记载的短链肽1～8。
并且，在表5中，固定化溶剂一栏的MeOH表示甲醇，EtOH表示乙醇，IPA表示异丙醇，HEPES表示4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
并且，在表5中，聚丙烯酸1表示氨基末端聚(丙烯酸)(Mw：3120)，聚丙烯酸2表示氨基末端聚(丙烯酸)(Mw：1350)，聚丙烯酸3表示氨基末端聚(丙烯酸)(Mw：8400)。
实施例1～12的固定化载体的抗体结合性改善率的评价高，抗体结合性优异。认为这是因为在保持醇溶剂中诱导的二级结构的状态下能够将短链肽固定于载体。
另一方面，比较例1～3的固定化载体的抗体结合性改善率的评价低，抗体结合性比实施例1～12差。认为这是因为在保持醇溶剂中诱导的二级结构的状态下未能够将短链肽固定于载体。

Claims (9)

1.一种短链肽固定化载体的制造方法，其具备：
准备包含醇溶剂和短链肽的醇溶液的工序，所述短链肽在所述醇溶剂中被诱导二级结构且具有多个固定化官能团；及
通过使载体与所述醇溶液接触而将所述短链肽固定于所述间隔物的工序，所述载体结合有具有与所述固定化官能团反应的反应性基团的间隔物。
2.根据权利要求1所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，
所述短链肽为34残基以下。
3.根据权利要求1或2所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，
所述短链肽和所述间隔物经由共价键而被固定。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，
所述间隔物的分子量为10000以下。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，
所述固定化官能团是选自硫醇基及氨基中的至少1种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，
所述固定化官能团位于所述短链肽的至少一个末端。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的短链肽固定化载体的制造方法，其中，
所述短链肽具有如下局部结构：包含多个具有所述固定化官能团的氨基酸残基，且在具有所述固定化官能团的氨基酸残基之间包含至少一个不具有固定化官能团的氨基酸残基。
8.一种短链肽固定化载体，其具有：载体、结合于所述载体上的间隔物、配置于所述间隔物上且保持二级结构的短链肽。
9.根据权利要求8所述的短链肽固定化载体，其中，
所述载体和所述间隔物通过共价键而被结合。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997017375A1 (en) * 1995-11-06 1997-05-15 Chiron Diagnostics Corporation Conjugation of ligand to immobilized protein in organic solvent
US5932483A (en) * 1990-10-16 1999-08-03 Northwestern University Synthetic peptide and its uses
WO2000023478A1 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Amersham Pharmacia Biotech Ab Squaric acid activated carrier usable for immobilisation of compounds containing amine groups
WO2002066984A2 (en) * 2001-02-16 2002-08-29 Pepscan Systems B.V. Arrays for determining binding of biomolecules
CN101910202A (zh) * 2007-11-07 2010-12-08 白血球保健股份有限公司 用于固定生物物质的生物相容性三维基质
WO2011103668A1 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 The Governors Of The University Of Alberta Cancer specific peptides and arrays for screening same
WO2011116028A1 (en) * 2010-03-15 2011-09-22 Anderson Forschung Group, Inc. Improved mass spectrometric assays for peptides
CN102671637A (zh) * 2012-05-16 2012-09-19 华南理工大学 以pamam为间隔臂的仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法与应用
US20120238477A1 (en) * 2011-03-18 2012-09-20 Tom Albert Methods for synthesis of an oligopeptide microarray
CN102895960A (zh) * 2011-06-08 2013-01-30 Emd密理博公司 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质
US20140079753A1 (en) * 2011-05-18 2014-03-20 Affinergy, Llc Bmp binding peptides
WO2015034056A1 (ja) * 2013-09-06 2015-03-12 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6420518B1 (en) * 1997-04-04 2002-07-16 Genetech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
AU2001269906A1 (en) * 2000-06-19 2002-01-02 Zyomyx, Inc. Methods for immobilizing polypeptides
DE10065787C1 (de) 2000-12-22 2002-07-18 Poly An Ges Zur Herstellung Vo Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, funktionalisiertes Trägermaterial und seine Verwendung
WO2009018126A2 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Ethicon, Inc. Collagen-related peptides and uses thereof
JP5311456B2 (ja) 2008-06-19 2013-10-09 国立大学法人 名古屋工業大学 二次元微細薄膜の作製方法
JP2010122071A (ja) * 2008-11-19 2010-06-03 Okayama Univ 物質を固定化した物質固定化担体および物質固定化担体を作製する方法
US20130052209A1 (en) 2010-04-23 2013-02-28 Purdue Research Foundation Protein drug formulations and packages
JP5769124B2 (ja) * 2010-06-30 2015-08-26 株式会社 京都モノテック 固定化タンパク質および固定化タンパク質作製用活性化担体
RU2515197C1 (ru) 2012-10-22 2014-05-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" Способ иммобилизации биомолекул на поверхности магнитоуправляемых наночастиц железа покрытых углеродной оболочкой
JP2014149199A (ja) * 2013-01-31 2014-08-21 Aisin Seiki Co Ltd ペプチドプローブ及び当該ペプチドプローブを利用した被検物質の測定方法
EP3019520B1 (en) * 2013-07-10 2019-12-11 GE Healthcare BioProcess R&D AB Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
ITRM20130557A1 (it) * 2013-10-11 2015-04-12 Angelo Fiadone Kit per il salto della corda.
BR112017006536A2 (pt) * 2014-09-29 2017-12-19 Fujifilm Corp polipeptídeo de ligação ao anticorpo, polipeptídeo de fusão de ligação ao anticorpo, e material de adsorção

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932483A (en) * 1990-10-16 1999-08-03 Northwestern University Synthetic peptide and its uses
WO1997017375A1 (en) * 1995-11-06 1997-05-15 Chiron Diagnostics Corporation Conjugation of ligand to immobilized protein in organic solvent
WO2000023478A1 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Amersham Pharmacia Biotech Ab Squaric acid activated carrier usable for immobilisation of compounds containing amine groups
WO2002066984A2 (en) * 2001-02-16 2002-08-29 Pepscan Systems B.V. Arrays for determining binding of biomolecules
CN101910202A (zh) * 2007-11-07 2010-12-08 白血球保健股份有限公司 用于固定生物物质的生物相容性三维基质
WO2011103668A1 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 The Governors Of The University Of Alberta Cancer specific peptides and arrays for screening same
WO2011116028A1 (en) * 2010-03-15 2011-09-22 Anderson Forschung Group, Inc. Improved mass spectrometric assays for peptides
US20120238477A1 (en) * 2011-03-18 2012-09-20 Tom Albert Methods for synthesis of an oligopeptide microarray
US20140079753A1 (en) * 2011-05-18 2014-03-20 Affinergy, Llc Bmp binding peptides
CN102895960A (zh) * 2011-06-08 2013-01-30 Emd密理博公司 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质
CN102671637A (zh) * 2012-05-16 2012-09-19 华南理工大学 以pamam为间隔臂的仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法与应用
WO2015034056A1 (ja) * 2013-09-06 2015-03-12 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMMMA LANG ET AL.: "Spectroscopic evidence that monoclonal antibodies recognize the dominant conformation of medium-sized synthetic peptides", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *
寿佩勤: "《免疫检验技术》", 31 March 2012, 人民军医出版社 *

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