CN101910202A - 用于固定生物物质的生物相容性三维基质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制造携带有生物物质的固体涂布载体的方法。此外，本发明还涉及连接有生物物质的固体涂布载体以及所述固体涂布载体在制备医疗产品中的应用。此外，本发明还提供了一种接触、过滤或清洁患者的血液、淋巴或脑脊髓液的方法、诊断疾病的方法以及诊断组合物。

Description

用于固定生物物质的生物相容性三维基质
技术领域
本发明涉及一种制造携带有生物物质的固体涂布载体的方法。此外，本发明涉及一种连接有生物物质的固体涂布载体以及所述固体涂布载体用于制备医疗产品的应用。此外，本发明提供了一种用于接触、过滤或清洁患者血液、淋巴或脑脊髓液或其部分的方法、用于诊断疾病的方法以及诊断组合物。
整个本说明书提到了多篇文献。此处以引用的方式并入包括生产商手册在内的所述文献的全部公开内容。
背景技术
例如单克隆抗体或其他分子的全身性施用对于治疗肿瘤患者、代谢失调、免疫疾病或其他疾病是重要的且在不断发展的领域。然而，这些分子的全身性施用是极其昂贵的，并且经常伴随着严重的副作用和较高的死亡率。此外，所注射的生物制剂的去向通常难以确定，并且不能预见在个体患者中的严重副作用。
新治疗方法的施用的一种选择是使用具有经固定的抗体的(医学)装置。该方法优于利用抗体功能性的标准治疗，没有全身性施用所可能存在的不利影响。因此，利用基于(医学)装置的该安全方法未见到全身性使用抗体经常观察到的严重副作用。该装置在血流中的暂时或永久施用目的在于用固定在限定表面上的高度限定量的生物物质(例如可能意味着在限定的体积内有限定密度的生物物质)控制生理机能、免疫系统、免疫细胞或其他血液成分、或流动的肿瘤细胞，这将可以避免某些药物的全身性施用导致的重荷载。
在使用失活抗体如
Figure BPA00001178531300011
使TNFα失活的领域中描述有各种治疗方法。然而，已知将该抗体简单地施用于患者会伴随着严重甚至是致命的副作用(失明、休克和过敏反应等)。此外，完整抗体或其片段或衍生物的施用要求抗体的人源化和/或其他修饰，以减少或避免由于人类患者对抗体的免疫反应导致的抗体失活。
已知本领域描述的另一方法名为“
Figure BPA00001178531300021
”(Miltenyi BiotechGmbH，Bergisch-Gladbach，德国)(参见R.Bambauer等，Ther Apher Dial.2003，7(4)：382-390和G Wallukat等，International Journal of Cardiology，1996，54(2)：191-195)。用于除去LDL-胆固醇、免疫球蛋白、免疫复合物、抗体片段或纤维蛋白原。该方法中利用的分离柱(apheresiscolumn)包含结合有多克隆抗体的琼脂糖。该方法需要分离出细胞，以将血浆输送到所述柱中。这是该系统的一个主要缺点，因为这是一种过度开支。流速较低，因此仅能处理少量的血浆。而且，该系统因其复杂性而非常昂贵。
上述讨论表明，迄今为止可用于治疗所述疾病的方法和系统伴随有严重副作用或者相当难以实现。因此，本发明所要解决的技术问题是提供能够用例如细胞和蛋白质等生物物质治疗患者的手段和方法，这将改善所述情况。通过权利要求书中描述的实施方式可以解决该技术问题。
发明内容
因此，在第一实施方式中，本发明提供了一种制造携带有生物物质的固体涂布载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用包含0.1％～10％(重量/重量)或(体积/体积)的至少一种硅烷或其他适宜的偶联剂的溶液温育固体载体，随后除去所述溶液；
(b)通过用包含所述生物物质的优选经缓冲的水性溶液温育所述载体，随后除去所述水性溶液，从而将所述生物物质连接至所述载体上；和
(c)在(i)包含选自(多)肽、氨基酸、淀粉、糖、磷酸盐、多元醇、聚乙二醇(PEG)或其混合物的一种或多种物质的水性溶液、(ii)离子液体或(iii)相容性溶质中或它们的混合物中，温育所述载体，以使所述生物物质部分或全部由所述一种或多种物质覆盖。
按上述次序进行步骤(a)、(b)和(c)。
术语“固体载体”在本发明上下文中定义为固体材料构成的载体。所述载体的材料可以是紧实结构或多孔性结构。如下文所述，优选所述载体的材料选自由以下材料组成的组：玻璃、聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸类(polyacryl)、聚丙烯腈、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、羊毛填料、开孔泡沫塑料或玻璃、网状塑料或玻璃和得自海绵动物(多孔动物)的结构体。
本发明术语“优选经缓冲的”是指优选为缓冲溶液。
术语“生物物质”在本发明上下文中是指从活的或死的生物体或其部分分离的物质或能够在人造生物系统中产生的物质以及所述物质的化学修饰衍生物。人造生物系统的实例包括体外合成核酸分子或(多)肽或用重组DNA技术进行制备的手段。如下文所详细描述的，该生物物质的实例包括真核细胞、真核细胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古细菌、古细菌碎片、病毒和病毒碎片。真核细胞、原核生物、古细菌和病毒的所述碎片包括一种或多种(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖或其任何组合。作为选择，即使在自然界中没有发现对应物并且是例如(半)合成或重组制造的，这些(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖仍然为该术语生物物质所涵盖(见下文)。
本文使用的术语“(多)肽”是指包括肽组以及多肽组的分子组。肽组由至多30个氨基酸分子组成，多肽组由超过30个氨基酸分子组成。根据本发明，“多肽”组包括“蛋白质”。此外，根据所述定义，术语“(多)肽”描述了蛋白质片段。该术语的定义还包括作为二聚物、三聚物和更高的低聚物的多肽，即由超过一条的氨基酸分子链(经连接的氨基酸链)组成的多肽。如上所述，在蛋白质从真核细胞、原核生物、古细菌和病毒中分离得到的情况下，所述蛋白质也可被理解为真核细胞、原核生物、古细菌和病毒的碎片。该术语也适用于通过重组DNA技术制备的(多)肽或通过利用例如制备所述化合物所用的细胞的其他技术制备的(多)肽。
术语“寡核苷酸”在本发明上下文中是指由至少10个到至多30个核苷酸组成的核酸分子。术语“多核苷酸”是指由超过30个核苷酸组成的核酸分子。本文所述的寡核苷酸和多核苷酸可以是DNA、RNA和PNA等。包括在多核苷酸内的分子组还包括完整的基因或染色体及其片段。所述定义还包括载体，例如克隆载体和表达载体。
术语“多糖”在本发明上下文中定义为由两个以上的糖构成的聚合物，因此该术语包括本领域中另外称为低聚糖的分子。所述多糖可以由支化或非支化糖链组成。
本发明上下文中使用的术语“硅烷”与国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义一致，指的是由硅基质和氢组成的化合物的组。按照该定义的硅烷可以是支化的(异硅烷和新硅烷)或非支化的(正硅烷)。
适宜的偶联剂或偶联试剂是双官能或多官能化的有机分子，例如，二氨基烷烃(如1，6-二氨基己烷)、二羧酸(如1，6-己二酸)或者由例如氰基、氨基或羧基所官能化的聚乙二醇。
术语“体液”在本发明上下文中定义为可在来自患者(优选人类患者)的样品中获得的液体。该体液的实例包括血液、淋巴或脑脊髓液或其部分，例如血浆或包含清蛋白的液体部分，以及富集的白细胞(例如得自白细胞去除术)。
整个本发明中使用的术语“患者”包括生病或患病的以及健康的对象。根据本发明，患者是任何接受医学护养、护理或治疗的人。该人通常(但不一定)是生病或受伤的人，如果是生病或者受伤的人，则需要由医师或其他医疗专业人员治疗。换言之，术语“患者”与可能生病或可能没有生病的“对象”可以互换使用。对象可以是动物，优选为哺乳动物，最优选的是人类。如上所述，患者还可以是例如针对疾病或健康状态进行急诊或常规诊断的健康人类。换言之，本发明可以用于发现患者是否患有某种疾病(或多种疾病的组合)、是否容易感染该疾病或其组合。
除去溶液可以理解为溶液的定性除去。因此，至少将溶液除去至剩余溶液不会显著改变本发明方法的随后步骤中使用的溶液的品质的程度。可以例如通过吸取(例如通过利用可以连接移液管等的常规泵等)、压缩或吹风进行该除去。可选的是，将这些步骤组合，并可以进一步结合风干进行。优选的是，将该溶液除去至少95体积％，例如至少98体积％或至少99体积％、99.5体积％或99.8体积％。
术语“温育”是指在使步骤(a)至(c)中所述的化合物能够连接至所述载体或步骤(a)和/或(b)中所提及的分子层(可选地经间接结合进行)的条件下进行的温育。温育条件包括：取决于所述步骤和温度，进行20分钟至12小时的温育。通常，抗体在37℃温育1小时，37℃是IgM抗体稳定的最高温度。IgG抗体可以被温育至至高50℃。温度范围可以是4℃～50℃，优选为20℃～37℃，这取决于所述步骤和温育时间。优选的是，在步骤(a)中，温育在室温下进行20分钟，在步骤(b)中，温育在37℃进行1小时，在步骤(c)中，温育在室温下进行1小时。应当理解的是，为了加快该过程或为了改善结果，可以根据温育中使用的物质改变温育的时间和温度。例如，如果使用甲醇作为步骤(a)中的溶剂，应该保持20℃左右的较低温度，例如约15℃～约25℃，以使甲醇不发生蒸发。
本领域技术人员知道，术语“室温”可以指不同的温度，这取决于位置和外部温度。室温通常为17℃～23℃。
本发明的方法的步骤(a)中所述的溶液可以是水性溶液或非水性溶液。除了硅烷，本发明的方法的步骤(a)中的水性溶液可以还包含经稀释的蛋白质和其他经稀释的成分，例如糖或醇。在本文中，优选的蛋白质是清蛋白。根据本发明，清蛋白包括来自动物(优选哺乳动物，更优选来自人类)和来自植物种子的清蛋白。清蛋白形成哺乳动物中血清的主要成分。本发明的其他清蛋白的实例是动物的α-乳清蛋白和卵清蛋白、来自豌豆的豆清蛋白、来自小麦、黑麦或大麦的麦清蛋白或来自豆科植物的豆清蛋白。在可能的过敏原的情况下，优选对清蛋白进行水解，特别是增强与人类或其他动物体的相容性。这也适用于步骤(a)的替代实施方式中的非水性溶液。
在本发明上下文中，术语“水性溶剂”不局限于(但包括)H2O，而且扩展至可与水混合因此能形成均相的亲水性溶剂。
水性溶剂的实例包括但是不限于H2O、甲醇、乙醇或高级醇或其混合物。非水溶剂的实例包括但是不限于二甲亚砜(DMSO)、苯、甲苯、二甲苯和乙基苯，或脂肪族溶剂，如戊烷、己烷、庚烷或其混合物。
优选的是，步骤(a)中的溶液的溶剂是H2O、甲醇、乙醇或其混合物、二甲亚砜(DMSO)、苯、甲苯、二甲苯和乙基苯或戊烷、己烷、庚烷或其混合物。步骤(a)的溶液的最优选溶剂是甲醇或乙醇。相应地，溶液是指包含溶剂的溶液，而水性溶液是指包含亲水性溶剂的溶液。
根据本发明，所述方法的步骤(a)中的所述至少一种硅烷的浓度为0.1％～10％(重量/重量或体积/体积)，其中，该范围同时限定了所述溶液中的全部硅烷的浓度。换言之，如果使用多于一种的硅烷，则全部硅烷一共的总量为0.1％～10％(重量/重量或体积/体积)。优选的是，所述浓度为0.5％～5％(重量/重量或体积/体积)。
根据本发明的方法的步骤(b)，将生物物质连接至固体载体可以理解为在载体上固着所述物质。可以通过将生物物质直接结合至固体载体进行该固着。作为选择，可以利用第三化合物，例如覆盖固体载体的一种以上硅烷的层，通过间接结合进行该固着。根据本发明，术语“覆盖”包含固体载体的全部覆盖以及部分覆盖。在两种替代方案中，结合可以是通过共价键或非共价键进行的结合。按照本发明，共价键可以例如通过生物物质与载体材料之间的化学反应或(涂布载体材料的)硅烷与生物物质之间的化学反应获得。在后一情况中，硅烷用作分子桥。非共价键结合的实例包括弱键，例如范德华键或其他极性键。例如在(多)肽与具有聚乙烯表面的固体载体之间存在所述非共价键。
优选的是，用于连接生物物质例如抗体的水性溶液是经缓冲的，并具有低盐含量。本发明所述的低盐含量定义为0.9％(重量/重量)以下的盐浓度，优选低于0.2％(重量/重量)。通常，但不是绝对地，对于IgG和IgY类，可以使用例如由15mM碳酸钠和35mM碳酸氢钠水溶液组成的更为碱性的缓冲液(pH＝9)，但是对于连接IgM，优选使用更为中性的缓冲液(pH 7.0至7.4)，例如磷酸盐缓冲液(如PBS)。
由于根据本发明的方法的步骤(c)将连接有步骤(b)中的生物物质的所述载体在水性溶液中温育，生物物质包埋在涂布层/涂布基质中。通过该包埋，使生物物质的可及性表面最小化。这意味着可及性表面被部分或全部覆盖。整个本发明中所用的“全部覆盖”表示，生物物质的可及性表面上所有可能的结合位点被占据/覆盖。在非特异性结合的情况中，将生物物质全部覆盖的分子非特异性地结合。因此，在部分覆盖的情况中，可及性表面上仅有一部分特异性或非特异性结合位点被覆盖。由于部分或全部覆盖所致，生物物质不再受到其他物质的影响以及如辐射等非物质影响，或者至少降低了对于这二者的可及性。
步骤(c)的水性溶液优选具有如上所述的低盐含量。所述水性溶液可以可选地是经缓冲的水性溶液。
本发明的方法的所述步骤可以分批进行，其中交换各相应的溶液。
本发明的方法提供了涂布有基质的固体载体，而基质中包埋有所述的生物物质。示于图1的示意图中的剖面例示了本发明中所构想的包含所包埋的生物物质的所述固体涂布载体的实施方式和本发明的方法的两个优选实施方式。
由本发明的方法制造的固体载体可以用于治疗和诊断。
所述治疗包括脱除体液的毒素，例如二噁英、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、脂多糖(LPS)、腐败毒等。该载体还可以用于治疗细菌或病毒疾病。本发明的方法制造的载体一种设想的替代性应用是用于需要刺激、消除或除去患者某些细胞的治疗。消除特定细胞群可以见于例如增殖性疾病(例如，一般在治疗癌症，特别是治疗微量残留癌中)、自身免疫疾病的治疗或器官移植前的疾病的治疗。例如在通过激活免疫系统细胞进行的疾病治疗中可以设计对特定细胞群进行刺激，所述免疫系统细胞在激活后适于消除特定的患病细胞群。另一治疗方法是利用其中包埋有基因或以其他方式操纵的(例如通过与合成或天然化合物如细胞因子、丁酸、佛波醇肉豆蔻酸酯-乙酸酯(phorbol myristate acetate)或全反式视黄酸温育而分化的或通过物理操纵如热激、深低温保藏、离心而分化的)重组供体细胞或非操纵供体细胞的固体涂布载体。包埋的细胞可以分泌化合物，例如能够减轻或治愈内分泌失调或代谢紊乱的激素。以下将详细描述上述治疗方法的实例。该治疗方法可以包括在(医学)装置的情况下的本发明的方法制造的载体的体内应用以及间接体内(ex vivo)应用。因此，可以将包含固体涂布载体的装置植入患者中进行体内应用。对于间接体内应用，可以将包含固体涂布载体的装置与待处理体液的循环连接。例如可以将源自患者动脉或静脉的血液引导通过该装置，随后导回到该患者中(与血流连接)。作为选择，可以将体液样品与载体进行体外温育。在后一种治疗的随后步骤中，可以将体液再导入患者体内。
本发明的方法制造的固体载体的诊断应用是例如需要检测体液中毒素或特定细胞群的诊断方法。利用本发明制造的固体涂布载体的诊断应用可以用于毒素或特定细胞群的定量检测。在这些应用中，可以使用连接有单种类型的生物物质(例如抗体)的载体。将所述载体与得自患者的限定体积的体液温育，将能够在分析通过样品中连接的生物物质所检测到的化合物的量之后，定量推算出患者的整体的化合物的量。例如，使用连接有许多不同类型生物物质的载体，可以对毒素或特定细胞群进行定性检测。将所述固体涂布载体与来自患者的体液进行温育之后，本领域技术人员能够分析被样品中连接的生物物质特异性结合/检测到的是哪些毒素或细胞群。
上述治疗方法中，包埋的生物物质例如对血液、淋巴或脑脊髓液会具有治疗作用，由于所述生物物质固着在固体载体上，因而不会将连接/固定的生物物质释放到体液中。优选的是无显著量的连接/固定的生物物质释放到体液中。因此，治疗或诊断用的生物物质的所需量得以最小化。由于治疗或诊断用生物物质的固定，还可以使因循环活性生物物质引起的药物代谢动力学问题最小化。
本发明方法可以制造出载体表面包埋有明确限定密度的生物物质的载体。因此，可以明确且可再现地限定在所制造载体的基质中包埋的生物物质的有效性。此外，利用本发明的方法制造的载体的治疗可以例如通过将包含所述载体的(医学)装置与体液循环连接来实现治疗的限定起始，并且可以例如通过将所述装置与体液循环断开来实现治疗的限定终止。
本发明的方法制造的载体的另一个优异特征是，与通常制造的物质相比，包埋的生物物质的稳定性(保存期限)得到改善。尽管本申请人不希望受任何理论的约束，但是据信该改善是通过提供涂布基质实现的，该涂布基质通过部分或全部覆盖生物物质的表面而减小了其可及性表面，否则该表面可能发生变质过程。根据这一理解，包埋的生物物质被周围的涂布基质保护并支撑其结构。例如，由于施加至涂布了抗体之后的载体的第二层可保护并稳定这些抗体，因此可以延迟或抑制涂布至本发明载体上的抗体的降解或分解。
本发明的方法和所制造的涂布载体的另一优异特征是，施加至本发明的方法的步骤(c)中的载体的涂布层能够将所制造的载体灭菌。因此，本发明首次公开了一种制造涂布有通常相当不稳定且易变的生物物质的固体涂布载体的方法，该固体涂布载体能够被灭菌，因此可以用于治疗患者或用于需要无菌环境的方法中。如上所讨论的和如所附实施例中所示，除了增强生物物质的稳定性以外，第二层或涂布基质还可以很好地防止涂布到载体上的生物物质由于β射线辐射、γ射线辐射或X射线辐射而发生的降解。
在本发明的优选实施方式中，所述方法在步骤(c)之后还包括步骤(d)：
(d)将所述载体干燥至残留水含量＜20％(重量/重量)。
根据本发明的该优选实施方式，可以按已知的测定木材水含量的方式计算残留水含量。在木材的情况下，通过计算样品中的水质量(mw)与含水木材样品的质量(mu)之比，再乘以100，可确定木材水含量的百分比(x)。可以通过从含水木材样品的质量(mu)减去干燥之后的该样品的质量，来确定该样品中的水质量(mw)。因此，用下列公式计算木材水含量的百分比：
X ( % ) - m w m u × 100
可以类似地测定载体制备中的残留水含量，其中mw是载体样品中的水质量，mu是彻底干燥载体样品后的载体样品的质量。在海绵状载体的情况下，在将多余的水挤出空隙之后测定mw。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述方法在步骤(a)之后还包括步骤(a’)：
(a’)将所述载体干燥至溶液的残留含量小于初始施用溶液的10％，优选为低于5％，更优选低于2％，例如低于1％、0.5％或0.2％。优选的干燥方法如上所述。最优选的是采用风干法进行干燥。
本发明的方法可以在步骤(b)之后且在步骤(c)之前进一步包括步骤(b’)：
(b’)在包含封闭剂的经缓冲的水性溶液中温育所述载体，并除去所述水性溶液。
封闭剂可用于固体载体的制造方法中，以防止在该方法的后续步骤中加入的材料的非特异性结合。在根据步骤(c)于水性溶液中温育载体之前，该封闭还可以对生物物质的构象稳定性具有积极的作用。
根据本发明，封闭剂包括但是不局限于人类或动物血清和该血清的蛋白质(例如清蛋白)、奶、卵蛋白、植物源性(例如黄豆、小麦)蛋白，包括所述蛋白质的水解产物(例如明胶、胶原)。包含所述封闭剂的经缓冲的水性溶液还可以包含氨基酸(优选为甘氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肉碱、鸟氨酸、羟脯氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、菊粉、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸)或氨基酸的衍生物(例如N-乙酰基-色氨酸、β-丙氨酸、黑色素、多巴(DOPA))、糖(优选为葡萄糖、蔗精、蔗糖)、多元醇(优选为山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、木糖醇)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、磷酸盐(例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)、两性物质(优选为清洁剂，如聚山梨酯、Triton X-100)、缓冲剂(优选TRIS、HEPES)。
如上所述，优选的是包含封闭剂的水性溶液是经缓冲的水性溶液并具有低盐含量。所附实施例中给出了本发明的包含封闭剂的经缓冲的水性溶液的实例。优选在室温下进行封闭，通常1至4小时，优选为1小时。
作为步骤(b’)的替代，本发明方法包括在步骤(b)之后且在步骤(c)之前进行的步骤(b”)：
(b”)利用包含0.5％～10％(重量/重量)的下述物质的水性溶液封闭非结合的结合位点，所述物质选择由(多)肽(例如清蛋白、明胶或胶原)，羟乙基淀粉(HES)、甘露糖醇、山梨糖醇和聚乙二醇(PEG)、源自奶、大豆、小麦或蛋的蛋白质组成的组。
在一个更加优选的实施方式中，步骤(b’)或(b”)进一步包括在封闭后，利用限定的适用于上述步骤(b)的水性溶液进行一次或多次洗涤步骤。适用于该实施方式的水性溶液是例如含有1％人清蛋白的PBS。进行所述一次或多次洗涤步骤，以除去过量的封闭剂。根据载体的表面，通常优选在室温下进行10秒至10分钟的所述洗涤。
在另一个优选的实施方式中，在包含一种以上下述物质的水性溶液中温育步骤(c)中的载体，所述物质选自由清蛋白、羟乙基淀粉(HES)、甘露糖醇、山梨糖醇、聚乙二醇(PEG)和伴娘蛋白组成的组。伴娘蛋白在本领域中公知为参与折叠过程、蛋白质的转运或易位的蛋白，或者在与其他蛋白质接触时显示保护性的蛋白。在原核生物和真核生物中可发现所述伴娘蛋白。伴娘蛋白的主要实例是属于热激蛋白族系的蛋白，例如Hsp60和Hsp 10、Hsp 70、Hsp 90和Hsp 100。其他的伴娘蛋白是细菌GroES/GroEL复合物或哺乳动物DnaK蛋白。
伴娘蛋白还称为相容性溶质，也存在于极端嗜盐细菌中。它们是两性的、结合水的有机分子，可形成较大的水合外壳，并据报道可将嗜极生物中的蛋白和核酸稳定在其原生态。相容性溶质的特征在于其被排斥于蛋白表面之外的性质。该性质使得细胞能够积蓄高浓度的这些化合物，而同时不会影响它们的蛋白的结构和功能。此外，在所述细胞中产生的相容性溶质的不均匀分布对于蛋白的结构具有稳定作用。迄今为止，已经设计出了这些伴娘蛋白的合成衍生物。在本发明中也设计了天然的相容性溶质及其合成衍生物。示例性的相容性溶质是依克多因((4S)-2-甲基-3，4，5，6-四氢嘧啶-4-羧酸)、羟基依克多因、甜菜碱、甘氨酸-甜菜碱、脯氨酸-甜菜碱及其衍生物。
作为选择，在离子液体中温育步骤(c)中的载体。离子液体是这样的盐：其中的离子配位不良，结果导致这些溶剂为液体。至少一种离子具有离域化电荷，并且一种成分是有机成分，以防止形成稳定的晶格。原材料和其他溶剂的诸如熔点、粘度和溶解度等性质由有机成分上的取代基和反离子决定。
一些离子液体，如硝酸乙基铵，处于动态平衡，其中在任何时间多于99.99％的液体均由离子物种而非分子物种构成。不过在广义上，该术语包括所有的熔融盐，例如高于800℃的温度下的氯化钠，在本发明的上下文中，术语“离子液体”限定的是熔点相对较低(低于100℃)的液体盐。特别是，在室温时为液体的盐称为室温离子液体或RTIL，这些盐在本发明中尤其优选。RTIL由大体积的不对称有机阳离子构成，例如甲基咪唑鎓离子(mim)、1-烷基-3-甲基咪唑鎓离子(例如，乙基-mim(emim)、丁基-mim)、吡啶鎓离子(py)、1-烷基吡啶鎓离子(例如，丁基-py、丁基-甲基-py)、N-甲基N-烷基吡咯烷鎓离子或铵离子。大范围的阴离子可以使用，从通常表现高熔点的简单卤离子至无机阴离子，如四氟硼酸根和六氟磷酸根(PF6)，直至较大的有机阴离子，如双三氟磺酰亚胺、三氟甲磺酸根或甲苯磺酸根。也可以使用具有简单的非卤化有机阴离子的离子液体，所述有机阴离子例如为甲酸根、烷基硫酸根、烷基磷酸根或甘醇酸根。作为一个实例，具有咪唑骨架的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或[bmim][BF4]的熔点为约-80℃，其是无色液体，在室温时具有很高的粘度。第一RTIL之一是[emim]Cl与AlCl3的混合物，形成[emim][AlCl4]、[emim][Al2Cl7]和[emim][Al3Cl10]之间的一系列平衡。该RTIL是对水不稳定的。示例性的水不溶性RTIL是[bmim][PF6]。示例性的离子液体是(1-正丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸盐(BMIM[PF6])、BMIM双(三氟甲烷磺酰)-亚胺(BMIM[Tf2N])、甲基三辛基铵-[Tf2N](OMA[Tf2N])或1，3-二甲基-咪唑甲基硫酸盐[MMIM][MeSO4]。
离子液体显示出适合于保护涂布的物质而由此免受潜在的有害物的影响或辐射。在本发明的上下文中，离子液体被认为能够使生物物质在灭菌时不会分解。
根据本发明，进一步优选的是由本发明方法制造的载体的材料具有多孔性结构。
为了获得用作(医疗)产品的涂布载体的紧实设计，优选的是载体显示出与其总体量度相比相对较大的表面。这可以例如利用具有开孔结构的泡沫、羊毛(填料)或利用许多平行小管或细丝的设置，例如类似于目前在血液透析中使用的多孔性中空纤维设计(参见例如http://www.fmc-ag.com/internet/fmc/fmcag/agintpub.nsf/Content/Modern_hemodialysis_+the_first_hollow-fiber_dialyzers_2004)的那些来实现。该设计优选允许全血或上述其他体液自由流动，并且优选的是利用流入物和流出物之间的最小压差并使设备内任一点的血液流速＜1米/秒而在流变学上优化载体。优选的是没有“盲端”，并且针对血液成分与基质的活性表面的接触进行优化。具有多孔性结构的载体的具体优点是增加能够与生物物质连接的载体表面。即，通过增加单位载体体积的载体表面，增加可以连接/包埋于载体上的生物物质的量。
更优选的是，载体材料的特征在于表面/气体容积比为30cm-1～300cm-1。载体的表面被理解为全部管束(trabecula)表面的总和。气体容积被理解为具有多孔性结构的载体的全部管束中的气体的体积的总和。
可以通过例如切割具有限定的总体量度的泡沫小块来测定表面/气体容积比。对所述泡沫块的全部管束进行计数并通过显微镜进行测量。利用管束的平均长度和直径以及每cm3的管束计数，可以精确地获得比表面(xx cm2/cm3，其单位为cm-1，表示限定体积的材料的内表面)(假设管束的形状是圆形的)。
优选的是，具有多孔性结构的载体的材料的特征为材料体积比未压缩/压缩为4～40。
术语“材料体积比”在本发明上下文中理解为包含固体和气体成分的未压缩多孔性材料和压缩多孔性材料之间的比例。
在多孔性弹性泡沫例如PU泡沫的情况下，例如主要可以如下测定该比例。将具有20ml体积的圆柱形泡沫块(未压缩)放入具有20ml体积的注射器中，在将活塞完全压下后，可从注射器标记上读取压缩体积。用于压缩该材料(在PU多孔性泡沫的情况下)的力限定为至少20千克/平方厘米。体积减少的端点定义为将压缩压力加倍(在PU多孔性泡沫的情况下，该压力是40千克/平方厘米)也不会使体积进一步减少达10％时的体积。可以重复该过程(将压力加倍)，直至材料的体积不再进一步减小达10％。
根据本发明方法，进一步优选的是，载体材料选自由玻璃、聚氨酯(PU)、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸类(polyacryl)、聚丙烯腈、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羊毛填料、开孔泡沫塑料或玻璃、网状塑料或玻璃和得自海绵动物(多孔动物)的结构体组成的组。例如，可以按照对来自Pall，Dreieich(德国)的装置LG6的描述来使用聚酯羊毛(polyesterfleece)。玻璃细丝的非限定性实例包括南京双威科技实业有限责任公司销售的具有白细胞滤器(Leukocyte Removal Filter)的输血装置用生物过滤膜。合适的海绵动物的实例例如在D.Green等人的TissueEngineering.(2003)第9卷，第6期：第1159～1166页中有描述。
本发明的方法中可以使用的材料可以具有中空纤维的结构。优选的中空纤维包装件优选具有这样的特征：材料体积比未压缩/压缩为1～10，和/或表面/气体容积比是200cm-1～2000cm-1。
在本发明的方法的又一个优选实施方式中，步骤(a)中的溶液是水性溶液。在本发明的方法的一个替代性优选实施方式中，步骤(a)中的溶液是非水性溶液。前文已经说明相应溶液和优选溶液的实例。
按照本发明的方法，优选所述至少一种硅烷选自由烷氧基硅烷、有机官能性硅烷、氢硅(氧)烷、硅氧烷和包括具有其他官能团的甲硅烷基化合物在内的有机硅烷组成的组。
本发明上下文中的所述组的可使用的硅烷的实例包括：
N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺
N-环己基氨基甲基甲基二乙氧基硅烷
N-环己基氨基甲基三乙氧基硅烷
N-苯基氨基甲基三甲氧基硅烷
(甲基丙烯酰氧基甲基)甲基二甲氧基硅烷
甲基丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷
(甲基丙烯酰氧基甲基)甲基二乙氧基硅烷
甲基丙烯酰氧基甲基三乙氧基硅烷
(异氰酸甲基)甲基二甲氧基硅烷
N-三甲氧基甲硅烷基甲基-O-甲基氨基甲酸酯
N-二甲氧基(甲基)甲硅烷基甲基-O-甲基-氨基甲酸酯
N-环己基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷
3-氨基丙基三乙氧基硅烷
N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷
3-氨基丙基三甲氧基硅烷
3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷
3-甲基丙烯酰氧基丙基三乙酰氧基硅烷
3-异氰酸丙基三甲氧基硅烷
3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷
3-缩水甘油氧基丙基三乙氧基硅烷
3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐
3-(氨基丙基)三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]硅烷
(3-氨基丙基)三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷
(4-甲氧基苯基)三(邻甲苯基)硅烷
(4-苯氧基苯基)(苯基)(邻甲苯基)硅烷
二环己基-甲基-硅烷
二甲基(3-苯基丙基)硅烷
二甲基双(2，3，4，5-四甲基-2，4-环戊二烯-1-基)硅烷
二苯基(3-苯基丙基)硅烷
二苯基(4-甲氧基苯基)硅烷
二苯基(4-苯氧基苯基)硅烷
二苯基(二苯基甲氧基)(二苯基甲基)硅烷
二苯基(二苯基甲基)硅烷
二苯基(间甲苯基)硅烷
二苯基(邻甲苯基)(4-三甲基甲硅烷基)苯基)硅烷
二苯基(对甲苯基)硅烷
二苯基二(间甲苯基)硅烷
二苯基二(邻甲苯基)硅烷
二苯基甲基(邻甲苯基)硅烷
二苯基苯乙基(邻甲苯基)硅烷
十二烷基三(2-联苯基)硅烷
十二烷基三(2-环己基乙基)硅烷
十二烷基三(3-氟苯基)硅烷
十二烷基三(间甲苯基)硅烷
乙氧基三(邻甲苯基)硅烷
乙氧基三(2-甲氧基苯基)硅烷(1)
乙基-双-(2，4，6-三甲基苯基)-硅烷(1)
亚乙基双(三(癸基)硅烷)(1)
十六烷基硫基乙炔基-三甲基-硅烷
异丁基(三甲氧基)硅烷(2)
甲基-三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(1)
甲基苯基(4-(三甲基甲硅烷基甲基)苯基)硅烷(1)
甲基苯基(间甲苯基)硅烷(1)
甲基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷
苯基(邻甲苯基)硅烷(1)
苯基-三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(1)
苯基三(间甲苯基)硅烷(1)
苯基三(邻甲苯基)硅烷(1)
苯基三(对甲苯基)硅烷
苯基三(2-环己基乙基)硅烷
苯基三(2-乙基己基)硅烷
苯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷
苯基三(4-(三甲基甲硅烷基)苯基)硅烷
苯基三(9-乙基-3-咔唑基)硅烷
三(邻甲苯基)硅烷
三乙酰氧基(乙基)硅烷
三乙酰氧基(甲基)硅烷
三乙酰氧基(乙烯基)硅烷
三乙氧基(1-苯基乙烯基)硅烷
三乙氧基(3-异氰酸丙基)硅烷
三乙氧基(3-硫氰酸丙基)硅烷
三乙氧基(4-甲氧基苯基)硅烷
三乙氧基[4-(三氟甲基)苯基]硅烷
三乙氧基(乙基)硅烷
三乙氧基(异丁基)硅烷
三乙氧基(辛基)硅烷
三乙基(硅烷-d)
三(十六烷基)(4-(三甲基甲硅烷基)苯基)硅烷
三甲氧基[2-(7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-基)乙基]硅烷
三甲氧基(2-苯乙基)硅烷
三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷
三甲氧基[3-(苯基氨基)丙基]硅烷
三甲氧基(7-辛烯-1-基)硅烷
三甲氧基(十八烷基)硅烷
三甲氧基(辛基)硅烷
三甲氧基(丙基)硅烷
三甲氧基(乙烯基)硅烷
三甲基(1，2，3，4，5-五甲基-2，4-环戊二烯-1-基)硅烷
三甲基-(1-甲基-1-苯基丙氧基)-硅烷
三甲基(1-丙烯基)硅烷
三甲基(2，3，4，5-四甲基-2，4-环戊二烯-1-基)硅烷
三甲基(2-苯基-1，1-双(三甲基甲硅烷基)乙基)硅烷
三甲基-(4′-萘-1-基-联苯-4-基)硅烷
三甲基-(4-硝基-苯基乙炔基)硅烷
三甲基(4-(三甲基甲硅烷基)丁氧基)硅烷
三甲基(甲硫基)硅烷
三甲基(苯氧基)硅烷
三甲基(苯基)硅烷
三甲基(苯基硒代甲基)硅烷
三甲基(苯硫基)硅烷
三甲基(苯硫基甲基)硅烷
三甲基(炔丙基)硅烷
三甲基(丙氧基)硅烷
三甲基(乙烯基)硅烷
三苯基(1，2，2-三苯基乙基)硅烷
三苯基(3-(三苯基甲锗烷基)丙基)硅烷
三苯基(三苯基甲基)硅烷
三苯基(乙烯基)硅烷
三(1-萘基)硅烷
三(2-联苯基)硅烷
三(4-(三甲基甲硅烷基)苯基)硅烷
三(癸基)硅烷
三(十六烷基)硅烷
三(异丙硫基)硅烷
三(苯乙基)硅烷
三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷
三(三甲基甲硅烷基)硅烷
三乙基硅烷
1-(二甲基甲硅烷基)-2-苯乙炔
3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基异氰酸酯
3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯
3-[三(三甲基甲硅烷氧基)甲硅烷基]丙基甲基丙烯酸酯
烯丙基(4-甲氧基苯基)二甲基硅烷
二甲氧基-甲基-十八烷基硅烷
甲氧基聚乙二醇5,000三甲基甲硅烷基醚
N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]苯胺
炔丙基三甲基硅烷
硅2，3-萘酞菁双(三己基甲硅烷基氧化物)
叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯
四烯丙基原硅酸酯
四烯丙基硅烷
四(二甲基甲硅烷基)原硅酸酯
四甲基-d12原硅酸酯
三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯
三(二甲基甲硅烷氧基)苯基硅烷
乙烯基三甲氧基硅烷
乙烯基三甲基硅烷
乙烯基三甲基硅烷
3-(2-氨基乙基氨基)丙基-二甲氧基甲基硅烷
[3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷
烯丙基三甲基硅烷，和
甲基2-(三甲基甲硅烷基)丙酸酯
根据本发明的方法，另外优选的是，所述生物物质选自由真核细胞、真核细胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古细菌、古细菌碎片、病毒和病毒碎片组成的组。真核细胞、原核生物、古细菌和病毒的所述碎片包括(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸、多糖和它们的组合。
真核细胞组包括酵母细胞、低级植物和高级植物的细胞、昆虫细胞和高等动物细胞。优选的是，所述高等动物细胞是哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。
根据本发明，真核细胞、原核生物和古细菌的碎片应理解为包括膜部分(膜泡)或细胞区室(例如来自真核细胞的细胞核或细胞器)或细菌细胞壁的成分(例如脂多糖(LPS)、肽聚糖和脂磷壁酸)。真核细胞、原核生物和古细菌的碎片组还可以包括(多)肽，例如抗原性蛋白质(如菌毛、蛋白酶、热激蛋白、甲酰基-甲硫氨酰基肽和毒素)、Toll样受体(TLR)、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(Nod)和G-蛋白偶联受体、甲酰基-甲硫氨酰基肽受体、蛋白酶激活受体和糖蛋白。糖蛋白组包括免疫受体和配体。免疫受体和配体包括MHC复合物(负载有抗原性肽或单独的MHC分子)和共刺激分子。
根据本发明，病毒碎片的实例包括但是不限于诸如对于与宿主细胞膜的相互作用和融合具有重要作用的病毒外膜多肽(例如包膜蛋白)等分子。病毒碎片的其他实例还包括核病毒蛋白及其片段。
在本发明的方法的替代性实施方式中，所述生物物质选自由通过合成或半合成或重组制得的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖组成的组。通过对本发明的方法中使用的生物物质的该替代性限定，在自然界中没有对应物的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖，以及自然存在的和人造的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖的化学修饰衍生物也包括在内。合成或半合成或重组制备(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖的方法在本领域中是已知的。
根据本发明，特别优选所述(多)肽是受体。相应受体的实例包括膜结合受体和胞内受体以及可溶性受体。这种受体的特别优选实施方式是抗体。本发明上下文中的受体可理解为与配体(受体的对应物；在抗体的情况下为抗原)发生特异性相互作用。功能性受体(优选为信号转导受体，与非转导性受体或截短受体相对)与其配体的相互作用可以导致信号通路的启动。该功能性受体的实例包括参与免疫系统细胞的激活的T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)或共刺激受体(例如CD28)。功能性受体与其配体的相互作用还可以导致不同细胞信号的启动，例如通过Fas(CD95)或TNF超家族的其他受体(包括TNF-α受体家族、TRAIL、死亡受体(DeathReceptor)、Toll样受体和Fc-受体)引起的细胞凋亡。此外，按照本发明，功能性受体与其配体的相互作用还可能导致抑制信号(例如通过CTLA-4的信号)的启动。
如上所述，进一步优选所述受体是抗体、抗体片段或抗体衍生物。
本发明上下文中描述的抗体能够与表位特异性结合/相互作用。该表位可以是多肽结构，以及不包含氨基酸的化合物。本发明使用的术语“特异性结合/相互作用”是指抗体或抗体片段不与或者基本上不与类似结构的表位交叉反应。例如可以通过评估所研究的一组抗体在常规条件下与所关注的表位的结合以及与多种或多或少(在结构上和/或功能上)紧密相关的表位的结合，来测试所述抗体组的交叉反应性。只有在抗体的相关情况下(例如蛋白结构中的特定基序)与所关注的表位结合，但不与或基本上不与任何其他表位结合的那些抗体才被认为是对所关注的表位具有特异性。相应方法在例如Harlow和Lane的Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988或Harlow和Lane的UsingAntibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)中有描述。
抗体或抗体片段或抗体衍生物与抗原的构象表位或连续表位特异性结合/相互作用。多肽抗原的构象表位或非连续表位的特征为存在两个以上离散的氨基酸残基，其在一级序列上是分开的，但是当多肽折叠为天然蛋白/抗原时聚集在分子表面上(Sela，(1969)Science 166，1365；和Laver，(1990)Cell 61，553-556)。构成表位的两个以上离散的氨基酸残基存在于一条或多条(多)肽链的不同区域上。当所述一条或多条(多)肽链折叠成三维结构以构成表位时，这些残基聚集在分子的表面上。相反，线性表位或连续表位由两个以上离散的氨基酸残基构成，其中氨基酸残基存在于(多)肽链的单条线性节段中。
抗体可以是任何类别抗体的单克隆抗体或多克隆抗体。
术语“抗体”还包括仍保持有结合特异性的抗体衍生物或片段。本发明的抗体还包括例如合成的、嵌合的、单链的和人源化的抗体以及抗体片段等实施方式。
术语“抗体片段”涉及诸如Fab，F(ab2)’或Fv片段等片段。术语“抗体衍生物”在本发明上下文中定义的是经化学修饰的抗体和抗体片段。这包括scFv片段、单域抗体等。因此，抗体衍生物通常是来自抗体分子的(多)肽和/或经化学/生物化学或分子生物学方法修饰的(多)肽。抗体片段与其特异性抗原的特异性相互作用的最低要求是在能够实现抗体片段和表位配合的条件下存在来自母体抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的一个或多个CDR。可以利用合适的抗体骨架来提供所述条件。如本领域已知的，术语“骨架”在抗体或抗体衍生物的情形中是指下述氨基酸序列，其起到CDR之间的间隔子的作用，并延伸CDR的N-末端和C-末端，提供能够使CDR形成抗原结合位点的结构。为例如改善结合亲合性而通过分子生物学方法对骨架或CDR序列进行的修饰可以包括利用本领域已知的传统技术对(多)肽进行的修饰，所述传统技术例如为单独使用或组合使用本领域已知的氨基酸缺失、插入、取代、增加和/或重组和/或任何其他修饰(例如翻译后修饰和化学修饰，如糖基化和磷酸化)。将所述修饰引入构成免疫球蛋白链氨基酸序列基础的DNA序列的方法对于本领域技术人员而言是已知的(参见例如Sambrook等人的MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年第2版和2001年第3版；Gerhardt等人的Methods for General andMolecular Bacteriology，ASM Press，1994；Lefkovits的ImmunologyMethods Manual：The Comprehensive Sourcebook of Techniques，AcademicPress，1997；或Golemis的Protein-Protein Interactions：A Molecular CloningManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)。
在本发明的另外更为优选的实施方式中，所述生物物质是细胞因子或生长因子。细胞因子是本领域中公知的生长因子，包括例如骨形态生成蛋白(BMP)、白细胞介素(IL)或干扰素(IF)。在进而更为优选的实施方式中，所述细胞因子是BMP-2或BMP-7。
在其他更优选的实施方式中，所述生物物质是血管生成刺激生长因子。该生长因子包括基质金属蛋白酶(MMP)、VEGF(血管内皮生长因子)、PLGF(胎盘生长因子)、血管生成素、GFG、DII4(Δ样配体4)和PDGF(血小板源性生长因子)。具有血管生成作用的适宜的炎性介质例如是IL-1、IL-6和MCP-1。在进而更优选的实施方式中，血管生成刺激生长因子是PDGF。
如上所述，进一步优选抗体是单克隆抗体。
最优选的是所述(单克隆)抗体属于IgG类、IgM类或IgY类。
按照本发明的方法的另一个优选实施方式，步骤(b)中连接的生物物质共价键合到所述载体。在上文中已经描述了如何通过共价键实现生物物质与载体的连接的方法。
按照本发明的方法的另一个优选实施方式，在装有载体的转动的管体系中进行步骤(a)至步骤(c)。
此外，按照本发明的方法的另一个优选实施方式，通过泵在所述管体系中转动所述溶液。
在本发明的方法的另一个特别优选的实施方式中，由具有多孔性结构的材料制成的载体包含至少一种其他材料。例如，在本发明的载体由上述的提供一种以上化学物质的材料之一制成的情况下，可以加入一种以上其他材料，以提供不同化学物质或改变载体性质。这在载体由两种、三种或更多种材料制成的情况下也同样适用。换言之，除以上所限定的物质之外，可用于本发明的涂布的载体还包括至少一种其他材料。在制造载体时，可以通过混合各成分或通过用所述一种以上其他材料填充载体，将所述材料加工到载体中。优选的是，所述至少一种其他材料选自由碳、二氧化硅(SiO2)、羟乙基淀粉(HES)和生物素组成的组。包含一种其他材料的多孔性载体的实例包括例如来自Kinetic Concepts Inc.(KCI，Texas，USA)的碳填充聚氨酯和聚醚泡沫。
按照本发明的方法的另一个优选实施方式，步骤(a)至(c)中的所述溶液是包含0.5％～10％(体积/体积)清蛋白和0.5％～5％(体积/体积)甘露糖醇的水性溶液。根据本发明特别优选的是，步骤(a)至(c)中的所述水性溶液包含0.6％～3％(体积/体积)的清蛋白。该水性溶液优选包含0.6％～3％(体积/体积)的糖(例如甘露糖醇)。
在一个替代性的实施方式中，步骤(a)中的所述溶液是含0.1％～10％(体积/体积)硅烷的醇，步骤(b)中的所述溶液是包含生物物质(例如抗体)的水性溶液，步骤(c)中的所述溶液是包含0.5％～10％(体积/体积)清蛋白和0.5％～5％(体积/体积)甘露糖醇的水性溶液。根据本发明特别优选的是，步骤(a)至(c)中的所述水性溶液包含0.6％～3％(体积/体积)清蛋白。该水性溶液优选包含0.6％～3％(体积/体积)的糖(例如甘露糖醇)。
本发明的方法可以进一步包括对所述固体涂布载体进行灭菌的步骤(e)。对本发明的方法制造的固体涂布载体进行灭菌的能力尤其可实现在非无菌或半无菌的条件下制造所述固体涂布载体，其中如此制造的载体仍然可以用于包括使该固体涂布载体与体液的体内接触或间接体内接触的本发明的方法。这代表了本发明的方法和如此制造的载体的又一个优异特征，因为由于具有这样的特征，与制造不能进行灭菌的载体的成本相比，所述固体载体的制造成本可以降低。这是因为在制造过程中，不需要无菌的条件。众所周知，常规制备的载体不适于灭菌，因此必须在完全无菌的条件下制造。此外，对成本有利的特征是，所述载体在使用后可以通过灭菌而得以再生。该再生的载体可以随后用于进一步处理同一患者或不同患者，或者用于同样包括载体与体液的体内或间接体内接触的另一种诊断方法或同一诊断方法。
优选的是，根据载体材料，通过环氧乙烷(EO)、β辐射、γ辐射、X射线、热灭活、高压灭菌或等离子体灭菌进行载体的灭菌或再生。最优选的是，通过β辐射或γ辐射进行载体灭菌。适用于该实施方式的是利用10MeV的电子加速器，以25kGray(千格雷)的剂量进行β辐射。在一定程度上，环氧乙烷灭菌可以用于本发明的载体。通常，必须选择灭菌方法以不伤害到涂布生物物质的所需活性。这种方法可以用于上述的细胞碎片、(多)肽(特别是抗体或受体)、多核苷酸或多糖或它们的复合物。迄今为止还未知对任何种类的细胞均适合的灭菌手段。因此，活细胞用作所述生物物质并且对载体进行灭菌的实施方式不是本发明的一部分。
本发明的方法还可包括在步骤(e)之后洗涤所述涂布载体的步骤(f)。
以上提及的洗涤步骤用于部分或全部除去步骤(c)中所施用的涂层，即第二涂层。该洗涤步骤可以无视涂层是否全部或部分覆盖生物物质而应用。这样，生物物质，优选生物物质的功能性部分，如抗体的抗原结合位点、酶的催化位点或(多)肽上的蛋白相互作用位点，通常能够再次在本发明的载体的表面上部分或全部地可及，并履行其功能。利用基于所用生物物质的生物功能的测试，能够定量地测定生物物质由第二覆盖层显露的程度。在抗体用作生物物质的情况中，功能性部分(即，该情况中的抗原结合位点)的可及性可以例如通过使用与可检测标记物结合的特异性抗原进行测定，正如本领域技术人员所熟知的。同样，酶的催化位点的可及性或(多)肽的蛋白相互作用位点的可及性一般可通过使相应酶的底物或经标记的相互作用配对物或其相互作用片段与载体接触并检测底物的周转或相互作用配对物的存在而进行评估。为了确保用于本申请中别处所述目的的本发明的载体在洗涤步骤和测定生物物质的功能性部分的可及性之后仍然无菌，只对一个载体进行测试，而同一批中的其他载体用于其目的。
洗涤步骤优选使用适合于第二涂层中所含成分的溶液进行，该溶液可包含适当的盐和/或酶。加入的酶可用于分解第二层的某些成分，例如，蛋白或淀粉衍生物。即使洗涤溶液中包含酶，步骤(f)也仍然视为除去部分或全部的第二涂层的洗涤步骤。洗涤溶液的温度和pH值同样适合于源自所用第二涂层的成分的具体要求。最简单的洗涤溶液例如可以是等渗盐溶液。对于某些应用，所述溶液还可包含血浆替代物。根据涂布载体的应用，洗涤步骤还可例如以间接体内的方式用于体液：在例如透析、心肺机或用于伤口的敷治的过程中使载体与血液或血浆流接触。
除了暴露部分生物物质或所述生物物质的全部表面之外，上述洗涤步骤还可用于除去松散连接于载体的颗粒以获得所有部分均紧密连接的载体。
所述洗涤步骤在灭菌过程之后进行，不过优选在使用前即刻进行。这将确保新近灭菌的本发明的涂布载体不会因载体与(洗涤)溶液的在先接触而被污染。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种通过本发明的方法能够制造或已经制得的固体涂布载体。
在另一个替代性的实施方式中，本发明提供了一种连接有生物物质的固体涂布载体，其中生物物质包埋到涂布基质中，该涂布基质由直接接触载体的至少一种硅烷形成的第一层和部分或全部覆盖所述第一层的第二层构成，其中第二层由选自由至少一种(多)肽、至少一种氨基酸、淀粉、至少一种糖、至少一种磷酸盐(酯)、至少一种多元醇和聚乙二醇(PEG)或其混合物组成的组中的至少一种物质构成。更优选的是，所述第二层中的所述至少一种物质选自：包括尤其是人或动物的血清和该血清的蛋白(例如清蛋白)、伴娘蛋白、奶、卵蛋白、植物(例如大豆、小麦)源性蛋白(包括所述蛋白的水解产物(例如明胶、胶原))的组；氨基酸(优选为甘氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肉碱、鸟氨酸、羟基脯氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、菊粉、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸)或氨基酸衍生物(例如N-乙酰基色氨酸、β-丙氨酸、黑色素、多巴)的组；糖(优选葡萄糖、蔗精、蔗糖)、多元醇(优选为山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、木糖醇)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)的组；磷酸盐(例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)或其混合物的组。作为选择，第二层由离子液体或相容性溶质构成。
优选的是，根据本发明的方法制造所述固体涂布载体。
根据本发明的方法提供的载体、生物物质、生物物质与涂布基质材料的连接的定义和说明等可以比照适用于本发明的固体涂布载体。
此外，本发明的固体涂布载体的特别优异的特征已经在上文中的本发明的方法的特征表述的内容中进行了描述。
如在本发明的固体涂布载体的制造方法的部分中所述，还优选的是，载体材料选自由玻璃、聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸类、聚丙烯腈、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羊毛填料、开孔泡沫塑料、网状塑料和得自海绵动物(多孔动物)的结构体组成的组。
根据本发明的固体涂布载体的一个优选实施方式，生物物质选自由真核细胞、真核细胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古细菌、古细菌碎片、病毒和病毒碎片组成的组。优选的是，真核细胞碎片、原核生物碎片、古细菌碎片或病毒碎片选自由(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖组成的组。
在本发明的固体涂布载体的一个替代性实施方式中，生物物质选自由通过合成或半合成或重组制得的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖。
在本发明的载体的一个同样优选的实施方式中，第二层中的所述至少一种(多)肽是清蛋白，第二层中的所述淀粉是羟乙基淀粉(HES)，和/或第二层中的所述至少一种糖是甘露糖醇或山梨糖醇。
优选的是具有多孔性结构的载体材料的特征在于表面/气体容积比为30cm-1～300cm-1。
还优选的是，具有多孔性结构的载体材料的特征在于材料体积比未压缩/压缩为4～40。
在另一个优选的实施方式中，载体材料是中空纤维。中空纤维包装件优选具有如下特征：材料体积比未压缩/压缩为1～10，和/或表面/气体容积比为200cm-1～2000cm-1。
另外优选的是，所述第一层中的所述至少一种硅烷选自由烷氧基硅烷、有机官能性硅烷、氢硅(氧)烷、硅氧烷、有机硅烷(包括具有其他官能团的甲硅烷基化合物)组成的组。上文中已经提供适当硅烷的实例。
按照本发明，所述载体的第二层可以是包含清蛋白和甘露糖醇的优选为干燥的混合物。优选的是，所述混合物进一步包含聚乙二醇(PEG)。特别是，根据本发明，将所述混合物以液体形式施用于所述载体，随后在本发明的载体的表面上干燥。优选用风干法进行干燥。在另一个优选的实施方式中，第二层包含伴娘蛋白或由离子液体或相容性溶质构成，正如上文中关于本发明的方法所述。
在本发明的另一个优选实施方式中，生物物质共价结合至所述载体。上文和所附实施例2描述了实现生物物质与固体载体的共价结合的方法。
对于本发明的固体涂布载体而言进一步优选的是，在(b)项中包埋在涂布基质中的(多)肽是受体。更优选的是，所述受体是抗体或抗体片段。根据本发明的另一优选实施方式特别设计的是，所述抗体是单克隆抗体。
包埋到本发明的载体的涂布基质中的(单克隆)抗体可以是任何抗体种类的抗体。优选的是，所述抗体属于IgG类、IgY类或IgM类。
在另一个优选的实施方式中，(多)肽是正如上文中关于本发明的方法所述的细胞因子或促血管生成生长因子。更优选的是细胞因子为BMP，最优选BMP-2或BMP-7。在另一个更优选的实施方式中，促血管生成生长因子是PDGF。
特别优选的是，本发明的载体包含至少一种其他材料。例如，在本发明的载体由上述的提供一种以上化学物质的材料之一制成的情况下，可以加入一种以上其他材料，以提供不同化学物质或改变载体性质。这在载体由两种、三种或更多种材料制成的情况下也同样适用。换言之，除以上所限定的物质之外，可用于本发明的涂布的载体还包括至少一种其他材料。在制造载体时，可以通过混合各成分或通过用所述一种以上其他材料填充载体，将所述材料加工到载体中。优选的是，所述至少一种其他材料选自由碳、二氧化硅(SiO2)、羟乙基淀粉(HES)和生物素组成的组。
在本发明的另一个优选实施方式中，通过β辐射或γ辐射对载体进行灭菌。适用于该实施方式的是利用10MeV的电子加速器，以25kGray的剂量进行β辐射。
在另一个替代性实施方式中，本发明提供了本发明的固体涂布载体在制备用于接触、过滤或清洁患者的血液、淋巴或脑脊髓液的(医疗)设备中的应用。本发明上下文中的术语“(医疗)设备”是指包括本发明的固体涂布载体或用本发明的方法制造的固体涂布载体的设备。以下举例说明了该设备的实例。如上文中(固体涂布载体的制造方法的上下文中)所述，该设备适于实现通过将其与患者体液循环连接而接触、过滤或清洁患者的血液、淋巴或脑脊髓液，从而治疗患者。此外，同样如部分上文所述，所述(医疗)设备可以适用于定性或定量检测患者体液样品中的化合物以及俘获某些细胞，例如干细胞。干细胞包括多潜能性干细胞、多能性干细胞或全能性干细胞。通过利用适当涂布有一种以上的上述生物物质的本发明的载体，俘获某些细胞或一种以上细胞群(所述生物物质通过在体液样品中进行接触，特异性地结合到这些细胞或细胞群)，可以从样品中除去至少部分的这些细胞或细胞群。通常，通过在细胞表面上存在不同抗原，可以区别不同的细胞系、细胞物种或细胞的发育阶段。通过用例如抗原的相应受体或针对所述抗原的抗体涂布本发明的载体，可以实现所需细胞的选择性俘获。
在整个本申请中使用的术语“接触、过滤或清洁”是指从溶液中除去一种以上化合物的替代性手段。因此，术语“接触”可以是过滤和清洁的起始步骤。
所公开的优选的医疗设备可用于包括从体液脱除毒素(例如二噁英、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、LPS、腐败毒等)的治疗中。此外，所述设备可用于治疗细菌性疾病或病毒性疾病，特别是与血液或其他体液中的主要病毒负载有关的疾病(例如出血热、a型肝炎、b型肝炎、c型肝炎、d型肝炎、e型肝炎、HIV、登革热)或与血液或其他体液中的主要细菌负载有关的疾病(例如与脑膜炎球菌或肺炎球菌有关的败血症)。所公开的医疗设备的另一个设想的替代性应用是用于需要刺激或除去患者某些细胞的治疗。除去特定细胞群例如见于增殖性疾病(例如微量残留癌)、自身免疫疾病的治疗或器官移植所引起的疾病的治疗。刺激特定细胞群例如见于通过激活免疫系统细胞而可以治愈或减轻的疾病的治疗。激活细胞群适于消除特定的生病细胞群。
此外，利用固着至固体载体的适当抗体(例如抗CD34或CD133)俘获干细胞是该设备的有用的应用。俘获后，通过酶促释放、冷却液、机械力(振动等)或这些技术的组合收集细胞。
图3和4示意地描述了所公开的(医疗)设备的实施方式的实例。
(医疗)设备的一种实施方式包括暂时性或永久性植入物，其特征为表面本身是固体涂布载体，或表面连接有本发明的固体涂布载体或本发明的方法所制造的固体涂布载体。这包括接骨设备、重建外科手术等使用的材料以及新型支架。这种新型支架可以具有免疫催化特征(如上所述的刺激、抑制或消除特征)。
(医疗)设备的另外的实施方式包括引入体外系统中的导管、线路、设备，例如动脉滤器、充氧器、贮器、白细胞抑制模块(LIM)、白细胞刺激模块(LSM)、耐受诱导模块(Tolerance Induction Module)或人造淋巴结，其包含固体涂布载体，或者连接有本发明的固体涂布载体或根据本发明的方法制造的固体涂布载体。所述模块已经被描述过：例如，Scholz M等，ASAIO J 2005；51：144-147；Scholz M，Cinatl J Med Res Rev 2005；25：331-342；Scholz M等，J Thorac Cardiovasc Surg 2004；127：1735-1742；Moreno JB等，Perfusion 2004；19：11-16。
此外，(医疗)设备的另一个替代性实施方式是内壁为固体涂布载体的(医疗)设备，或连接有固体涂布载体的(医疗)设备，包括间接体内疫苗接种容器，分离设备(apheresis device)、干细胞分离设备、清洗设备、注射器和暂时性或永久性血液存储设备(例如血库，还有常规实验室或研究实验室中的实验室装置)。诊断用(医疗)设备的实例是ELISA板，其中该板(或至少反应孔)的表面是固体涂布载体或连接有固体涂布载体。
上述疾病的实例包括具有各种起因的严重高脂血症、纯合子型家族性高胆固醇血症、杂合子型家族性高胆固醇血症、Apo B-100缺陷症、分离型脂蛋白(a)升高、全身性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(
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syndrome)、混合性结缔组织病、扩张性心肌病(DCM)、与凝血因子抑制剂有关的疾病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性溶血性贫血、高丙种球蛋白血症中的高粘滞综合征、重症肌无力、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、异常蛋白血症性多神经病、骨髓移植、内分泌眼病、I型糖尿病(IDDM)、肺出血-肺炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、由免疫球蛋白或免疫复合物沉积引起的肾病、冷球蛋白血症、天疱疮、特应性皮炎、移植物抗宿主(GvH)疾病、宿主抗移植物(HvG)疾病和各种形式的血管炎。
本发明还提供了患者血液、淋巴或脑脊髓液的组成的控制的方法，所述方法包括将所述血液、淋巴或脑脊髓液与本发明的固体涂布载体接触。
术语体液的“组成的控制”定义为影响体液或不同体液样品的特性特征的过程。这包括液体的过滤或清洁。在这种情况下，载体上的生物物质，例如受体，将结合至体液的成分上，并保持所述成分。优选在上述生理条件下进行该步骤。该定义还包括诱导样品中包含的细胞的活化状态的变化，以及除去一种以上特定细胞群。
根据本发明，可以在体内、间接体内或体外进行患者血液、淋巴或脑脊髓液的组成的控制。
在患者的血液、淋巴或脑脊髓液的组成的控制的方法的间接体内或体外实施方式的后续步骤中，在与固体涂布载体接触后，从所述载体除去所述血液、淋巴或脑脊髓液。
在生物物质是细胞(例如供体细胞或基因工程细胞/重组细胞)的实施方式中，包含包埋的生物物质的载体的接触能够使包埋的细胞产生的物质分泌到患者体液中。所分泌的物质是治疗患者疾病的有效物质。可以用该方法治疗的疾病包括例如糖尿病(利用胰岛细胞或分泌胰岛素的其他细胞)、内分泌疾病(例如利用来自甲状腺或松果体的细胞或其他分泌有助于治疗疾病的激素的细胞)。因此，本文所述的患者的血液、淋巴或脑脊髓液的组成的控制方法使得能够治疗患者且副作用风险最小。这是因为如果以体外/间接体内方式施用，供体细胞或基因工程细胞/重组细胞不会进入患者。即使是体内应用(如上所述，其同样构成了本发明的实施方式)，由于所述的与固体载体连接的模式，这些细胞不会释放到血流或其他体液中。
优选的是，本发明的上述应用和方法的特征为血液、淋巴或脑脊髓液的组成的控制在包含固体涂布载体的间歇容器中进行。作为选择，血液、淋巴或脑脊髓液的组成的控制在包含固体涂布载体的流通式容器中进行。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种诊断疾病的方法。该方法包括以下步骤：
(a)使患者的体液与其中包埋有受体的本发明的固体涂布载体在适宜使指示所述疾病的病原体或标记蛋白与所包埋的受体特异性结合的条件下进行接触；和
(b)检测用于指示所述疾病的所述病原体或标记蛋白是否已经结合至所包埋的受体。
可以以体内、间接体内或体外方式进行所述方法。优选的是，所述受体是抗体或其片段或衍生物。最优选的是，所述抗体是单克隆抗体。
根据本发明，术语“其中包埋有受体的本发明的固体涂布载体”是指，通过本发明的方法能够制造或已经制得的固体涂布载体，其中所述方法的步骤(b)中的所述生物物质构成所述受体或包含所述受体。
利用本发明的诊断方法可诊断的疾病的实例包括以上在本发明的医学用途和治疗方法的内容中所描述的疾病。可以利用例如抗体样抗p24(HIV)(参见例如Schupbach等，J Aquir Immune Defic Syndr 2005；40：250-256.)或抗gB(HCMV)(参见例如Just-Nubling G等，Infection 2003；31：318-323)来检测所述病原体或标记蛋白。
可以通过在生理条件下根据本发明使患者体液样品与抗体覆盖的表面接触，来获得使用于指示所述疾病的病原体或标记蛋白与所连接的抗体特异性结合的适宜条件。
本发明的诊断方法可以包括在细胞培养条件下温育体液样品材料以富集病原体(如病毒、细菌或单细胞真核生物病原体)的步骤。
此外，本发明还提供了一种诊断组合物，所述诊断组合物包括本发明的固体涂布载体。本发明的诊断组合物将优选用于诊断疾病。
使用本发明的诊断组合物可诊断的疾病的实例已在上文中进行了描述。
此外，本发明提供了一种纯化化合物的方法，所述方法包括使包含待纯化的化合物的混合物与本发明的固体涂布载体接触。根据连接或涂布至载体的分子以及与化合物的特异性结合，本发明的方法可以用于纯化例如蛋白质、核酸、蛋白质复合物或生物来源或无机物来源的其他分子。
本发明的所述方法还适合于利用本发明的所述涂布载体，分离具有不同磷酸化状态或具有不同的翻译后修饰的同类蛋白质，其中涂布至载体的分子特异性地识别这些状态或修饰中的一种。
本发明方法的原理对应于本领域公知的亲和纯化的原理。本领域技术人员会意识到可使用不同形式来实施本发明的方法。例如，通常采用的形式是填充有亲和性材料(即本发明的涂布载体)的柱子。
在本发明的方法的一个优选实施方式中，连接至所述载体的分子例如是上述的抗体。
附图说明
附图展示了：
图1：
固定生物物质的涂布程序的示意图。举例说明的是用于如抗体或细胞(或片段)等生物物质的程序和它们在应力条件下的功能保持性。该图描述了还包括灭菌步骤和额外的洗涤步骤的优选方法。
图2：
展示所附实施例1中所述的实验结果的流式细胞计数斑点印迹分析。该分析揭示了EO灭菌后抗体介导的细胞凋亡诱导的保持。
图3：
治疗性毒素陷阱(trap)(例如二噁英陷阱)的实施例的示意性设计。该例举设计可实现低血流和预充容量。因此还可以例如在危重症护理中的创伤、休克和败血症和其他情形之后/期间用于不同的导管系统(例如Sheldon导管)。
图4：
(医疗)装置的实例的示意性图示，所述(医疗)装置由带有固定的抗体(例如抗CD95)的载有塑料盒体的聚氨酯泡沫组成。通过涂布，嗜中性粒细胞可以暂时粘附至通过涂布而被包埋的抗体上。抗体的结合可以引发嗜中性粒细胞失活信号。
具体实施方式
下列各实施例用于阐述本发明。
实施例1：
利用本发明的固体涂布载体诱导细胞群中的细胞凋亡。
该试验方法的目标是确定涂布程序在用环氧乙烷或β辐射灭菌之后的固定的抗Fas(CD95；APO-1)IgM抗体的功能活性方面的保护作用。
NUNC 8孔室玻片的涂布和抗Fas IgM的固定：
使用两个8孔室玻片进行涂布。在室温下，用250μl含有4％(2％～5％)N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺的甲醇对每个孔进行30分钟的处理。反向离心并在层流下干燥10分钟之后，在37℃和90％湿度，用200μl含抗体的缓冲液(1∶100表示在0.64cm2上每孔有1μg抗体)对部分的孔进行1小时的温育。未处理孔用作对照。随后，用封闭溶液(含有5％血清和5％甘露糖醇的PBS)处理各孔30分钟，用封闭溶液洗涤三次，并如上所述进行干燥。经涂布的孔可以在4℃保存数周。在1.7巴、45℃、180分钟6％EO、94％CO2条件下进行灭菌，最高温度为47℃。
用Jurkat细胞进行的分析：
于分裂后3至5天，在2％血清的存在下，向每个所准备的孔(根据上述说明)中加入1×105Jurkat细胞并温育过夜。48小时后，将8μl碘化丙啶(PI)和1μl膜联蛋白V加入各孔中。凋亡细胞结合膜联蛋白V，而坏死细胞吸收PI。15分钟后，从各个孔中逐渐除去细胞，并用流式细胞计测定荧光(细胞凋亡：FL1；坏死：FL2)。
用PBS仔细洗涤各孔，并保存在4℃，以测试较晚时间点涂布程序的保存期。
结果：
如图2中代表性图示的，经历自然细胞凋亡(A)的Jurkat细胞的百分比是6.9％(范围：6％～8％)。与在无固定抗体的情况下经历灭菌(B)的涂布孔接触的Jurkat细胞表现出稍微增强的细胞凋亡(17.9％；范围：16％～20％)。按照上述涂布程序(C)固定的抗Fas诱导了54.7％细胞发生细胞凋亡(范围：54％～58％)。用环氧乙烷(EO)灭菌后，Jurkat细胞中抗体介导的细胞凋亡的诱导(D)是43.1％(范围：40％～44％)。因此，与未灭菌的对照(没有EO气体的程序)相比，EO介导的抗体功能下降为约25％。斑点印迹分析(图2)显示了各细胞群的荧光分布(FL1＝细胞凋亡；FL2＝坏死)。
实施例2：白细胞抑制模块(LIM)的制造
为了制造LIM，将泡沫浸泡在98％甲醇和2％(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷(Sigma)的混合物中20分钟，然后干燥，随后在37℃在缓冲液中温育100μg抗体2小时，所述缓冲液由15mM碳酸钠和35mM碳酸氢钠的水溶液组成(pH 9)。作为选择，PBS可以用作抗体用缓冲液。然后，加入包含2％人清蛋白的蛋白质浓度的等渗NaCl溶液，再进行1小时的温育。随后利用包含1％人清蛋白的等渗氯化钠溶液进行10次洗涤循环。最后，用包含5％人清蛋白和5％甘露糖醇的等渗钠溶液温育30分钟然后干燥。环氧乙烷杀菌使抗体活性(用Jurkat细胞测试)降低约60％。利用10MeV电子加速器以25kGray剂量进行β辐射后，与未灭菌的活性相比，抗体活性保留约70％。作为选择，可以利用γ辐射(例如利用Co60源)进行灭菌。
图4图示了LIM的示意图。

Claims (66)

1.一种制造携带有生物物质的固体涂布载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用包含0.1％～10％(重量/重量)或(体积/体积)的至少一种硅烷或其他适宜的偶联剂的溶液温育固体载体，随后除去所述溶液；
(b)通过用包含所述生物物质的优选经缓冲的水性溶液温育所述载体，随后除去所述水性溶液，从而将所述生物物质连接至所述载体上；和
(c)在(i)包含选自(多)肽、氨基酸、淀粉、糖、磷酸盐、多元醇、聚乙二醇(PEG)或其混合物的一种或多种物质的水性溶液、(ii)离子液体或(iii)相容性溶质中或它们的混合物中，温育所述载体，以使所述生物物质部分或全部由所述一种或多种物质覆盖。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括步骤(d)：
(d)将所述载体干燥至残留水含量＜20％(重量/重量)。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括步骤(a’)：
(a’)将所述载体干燥至所述溶液的残留含量小于初始施用溶液的10％。
4.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括在所述步骤(b)之后且在步骤(c)之前的步骤(b’)：
(b’)在包含封闭剂的经缓冲的水性溶液中温育所述载体，并除去所述水性溶液。
5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述步骤(b)之后且在步骤(c)之前的步骤(b”)：
(b”)利用包含0.5％～10％(重量/重量)的下述物质的水性溶液封闭未结合的结合位点，所述物质选自由(多)肽、羟乙基淀粉(HES)、甘露糖醇、山梨糖醇和聚乙二醇(PEG)、源自奶、大豆、小麦或卵的蛋白质组成的组；并可选地在封闭后利用水性溶液进行一次或多次洗涤步骤。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，步骤(c)中的所述载体在包含选自由清蛋白、羟乙基淀粉(HES)、甘露糖醇、山梨糖醇、聚乙二醇(PEG)和伴娘蛋白组成的组中的一种或多种物质的水性溶液中温育。
7.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，步骤(c)中的所述载体在离子液体中温育。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述载体的材料具有多孔性结构。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述载体的材料的特征在于表面/气体容积比为30cm-1～300cm-1。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，所述载体的材料的特征在于材料体积比未压缩/压缩为4～40。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所述载体的材料具有中空纤维结构，优选具有如下特征：材料体积比未压缩/压缩为1～10和/或所述表面/气体容积比为200cm-1～2000cm-1。
12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述载体的材料选自由玻璃、聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸类、聚丙烯腈、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羊毛填料、开孔泡沫塑料或玻璃、网状塑料或玻璃、以及得自海绵动物(多孔动物)的结构体组成的组。
13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述溶液是水性溶液。
14.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述溶液是非水性溶液。
15.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述至少一种硅烷选自由烷氧基硅烷、有机官能性硅烷、氢硅(氧)烷、硅氧烷和包括具有其他官能团的甲硅烷基化合物在内的有机硅烷组成的组。
16.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，所述生物物质选自由真核细胞、真核细胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古细菌、古细菌碎片、病毒和病毒碎片组成的组。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述真核细胞碎片、原核生物碎片、古细菌碎片或病毒碎片选自由(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖组成的组。
18.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，所述生物物质选自由合成、半合成或重组制得的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖组成的组。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中，所述(多)肽是受体。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述受体是抗体、抗体片段或抗体衍生物。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中，所述抗体为IgG类、IgY类或IgM类。
23.如权利要求17或18所述的方法，其中，所述(多)肽是细胞因子或血管生长因子。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述细胞因子是BMP-2或BMP-7。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述血管生长因子是PDGF。
26.如权利要求1～25中任一项所述的方法，其中，所述生物物质通过共价键连接至步骤(b)中的所述载体上。
27.如权利要求1～26中任一项所述的方法，其中，所述步骤(a)至步骤(c)在装有所述载体的转动的管体系中进行。
28.如权利要求1～27中任一项所述的方法，其中，所述溶液通过泵在所述管体系中转动。
29.如权利要求8～28中任一项所述的方法，其中，由具有多孔性结构的材料制成的所述载体包含至少一种其他材料。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述至少一种其他材料选自由碳、SiO2、羟乙基淀粉和生物素组成的组。
31.如权利要求1～30中任一项所述的方法，其中，步骤(a)至(c)中的所述溶液是包含0.5％～10％(体积/体积)清蛋白和0.5％～5％(体积/体积)甘露糖醇的水性溶液。
32.如权利要求1～30中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述溶液是含有0.1％～10％(体积/体积)硅烷的醇，步骤(b)中的所述溶液是包含所述生物物质的水性溶液，步骤(c)中的所述溶液是包含0.5％～10％(体积/体积)清蛋白和0.5％～5％(体积/体积)甘露糖醇的水性溶液。
33.如权利要求1～32中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述固体涂布载体进行灭菌的步骤(e)。
34.如权利要求33所述的方法，其中，通过环氧乙烷(EO)、β辐射、γ辐射、X射线、热灭活、高压灭菌或等离子体灭菌对所述载体进行灭菌。
35.如权利要求33所述的方法，所述方法还包括在步骤(e)之后的步骤(f)洗涤所述涂布载体。
36.一种通过权利要求1～35中任一项所述的方法能够制造或者已经制得的固体涂布载体。
37.一种连接有生物物质的固体涂布载体，其中，所述生物物质包埋到涂布基质中，该涂布基质由直接接触所述载体的至少一种硅烷形成的第一层和部分或全部覆盖所述第一层的第二层构成，所述第二层由选自由至少一种(多)肽、至少一种氨基酸、淀粉、至少一种糖、至少一种磷酸盐、至少一种多元醇和聚乙二醇(PEG)或它们的混合物组成的组中的至少一种物质构成。
38.如权利要求37所述的载体，其中，所述载体的材料具有多孔性结构。
39.如权利要求37或38所述的载体，其中，所述载体的材料选自由玻璃、聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸类、聚丙烯腈、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羊毛填料、开孔泡沫塑料、网状塑料和得自海绵动物(多孔动物)的结构体组成的组。
40.如权利要求37～39中任一项所述的载体，其中，所述生物物质选自由真核细胞、真核细胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古细菌、古细菌碎片、病毒和病毒碎片组成的组。
41.如权利要求40所述的载体，其中，所述真核细胞碎片、原核生物碎片、古细菌碎片或病毒碎片选自由(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖组成的组。
42.如权利要求37～39中任一项所述的载体，其中，所述生物物质选自由合成或半合成或重组制得的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖组成的组。
43.如权利要求37～42中任一项所述的载体，其中，所述第二层的所述至少一种(多)肽是清蛋白，所述第二层的所述淀粉是羟乙基淀粉(HES)，和/或所述第二层的所述至少一种糖是甘露糖醇或山梨糖醇。
44.如权利要求37～43中任一项所述的载体，其中，具有多孔性结构的所述载体的材料的特征在于表面/气体容积比为30cm-1～300cm-1。
45.如权利要求38～44中任一项所述的载体，其中，具有多孔性结构的所述载体的材料的特征在于材料体积比未压缩/压缩为4～40。
46.如权利要求38～44中任一项所述的载体，其中，所述载体的材料是中空纤维，优选具有如下特征：材料体积比未压缩/压缩为1～10，和/或表面/气体容积比为200cm-1～2000cm-1。
47.如权利要求37～46中任一项所述的载体，其中，所述第一层的所述至少一种硅烷选自由烷氧基硅烷、有机官能性硅烷、氢硅(氧)烷、硅氧烷、包括具有其他官能团的甲硅烷基化合物在内的有机硅烷组成的组。
48.如权利要求37～47中任一项所述的载体，其中，所述第二层是包含清蛋白和甘露糖醇的优选为干燥的混合物。
49.如权利要求48所述的载体，其中，所述第二层还包含聚乙二醇(PEG)。
50.如权利要求37～49中任一项所述的载体，其中，所述生物物质通过共价键连接至所述载体。
51.如权利要求41～50中任一项所述的载体，其中，所述(多)肽是受体。
52.如权利要求51所述的载体，其中，所述受体是抗体、抗体片段或抗体衍生物。
53.如权利要求52所述的载体，其中，所述抗体是单克隆抗体。
54.如权利要求47或48所述的载体，其中，所述抗体为IgG类、IgY类或IgM类。
55.如权利要求41～50中任一项所述的载体，其中，所述(多)肽是细胞因子或血管生成生长因子。
56.如权利要求37～55中任一项所述的载体，其中，所述载体包含至少一种其他材料。
57.如权利要求56所述的载体，其中，所述至少一种其他材料选自由碳、二氧化硅、羟乙基淀粉和生物素组成的组。
58.如权利要求37～57中任一项所述的载体，其中，所述载体通过β辐射或γ辐射进行灭菌。
59.权利要求37～58中任一项所述的固体涂布载体在制备用于接触、过滤或清洁患者的血液、淋巴或脑脊髓液的医疗产品中的应用。
60.一种控制患者的血液、淋巴或脑脊髓液的组成的方法，所述方法包括将所述血液、淋巴或脑脊髓液与权利要求37～58中任一项所述的固体涂布载体接触。
61.如权利要求59所述的应用或如权利要求60所述的方法，其中，在包含所述固体涂布载体的间歇容器中进行患者的血液、淋巴或脑脊髓液的组成的控制。
62.如权利要求59所述的应用或如权利要求60所述的方法，其中，在包含所述固体涂布载体的流通式容器中进行患者的血液、淋巴或脑脊髓液的组成的控制。
63.一种诊断疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使患者的体液与权利要求51～58中任一项所述的固体涂布载体在适宜使指示所述疾病的病原体或标记蛋白与所包埋的受体特异性结合的条件下进行接触；和
(b)检测指示所述疾病的所述病原体或标记蛋白是否已经结合至所包埋的受体。
64.如权利要求63所述的方法，其中，所述受体是抗体、抗体片段或抗体衍生物。
65.一种诊断组合物，所述诊断组合物包含权利要求37～58中任一项所述的固体涂布载体。
66.一种纯化化合物的方法，所述方法包括：将包含待纯化的所述化合物的混合物与权利要求37～58中任一项所述的固体涂布载体接触。
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