JPH01317389A - 生化学反応用担体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、タンパク質、ハブテン、ホルモン、薬剤等の
生理活性物質を固定化して生化学反応を行なわせる用途
、特には酵素免疫測定等の用途で、抗原、抗体等の固定
化用担体として使用可能であり、作製が容易でかつ°扱
い易く、非特異的吸着の低い多孔性担体を提供するもの
である。

［従来の技術］ 本発明の対象を免疫測定を代表例として説明すると、従
来より、この測定分野では種々の分析操作法が、全血、
血清あるいは尿等の生物流体中の物質を測定するのに用
いられており、特に疾病の診断、処置に当たり、臨床上
意義のある物質の存在又は程度を正確に測定することは
疾病状態を把握する上で有益である。

人体の種々の障害の診断等に用いられている検定法の一
つとして酵素免疫測定法（以下ＥＩＡという）があり、
特にこのうちの固相ＥＩＡ　Ｗ作は、一般に安全性、使
用の容易さ、特異性及び感度に優れているため、抗体及
び抗原のアッセイにおいて好適であると考えられている
。また固相ＥＩＡ技術の特徴として、分光光度計のよう
な広く普及している機器による計測が可能であることが
知られ、その結果として、同方法は広く使用されるに至
っている。

この固相Ｅｌ八へ作の一つとしてサンドインチ注があり
、その手法を以下代表例をもって記す。

目的とする抗体又は抗原（以下被検抗体等という）の存
在が予想される試験試料を、この被検抗体等と免疫学的
に特異的に反応する対応した第１の抗原を物理的又は化
学的な結合で予め被覆しである固体（例えば実質的に不
活性なプラスチック又はガラスピーズ、その他の支持材
料）と初めに接触させる。その結果、当該試験試料中の
被検抗体等は、当該担体上に固相化されている上記第１
の抗原と結合する。

次に、第２の抗原又は抗体を含む試薬を、上記固相に接
触させると、この試薬中の第２の抗原又は抗体は、同相
化されている上記第１の抗原（又は抗体）に結合してい
る被検抗体等に更に結合する。

次に一回又はそれ以上の洗浄工程によって非結合物を反
応室より除去した後、上記第２の抗原又は抗体に標識さ
れている酵素に°より発色を呈するような指示薬物質を
反応室に添加する。

これにより、酵素の存在に反応して該指示薬物質は検出
可能な色反応を生じる。したがってこの発色反応の程度
により、試料中に存在している被検抗体等を、光学的機
器等を用いて測定することができる。

［発明が解決しようとする課題］ このようなアッセイにおいて、免疫学的反応により結合
した複合体を担持し固相化するための担体として使用さ
れるものには従来多くのもの知られている。しかし従来
公知の担体の多くは欠点がないわけではない。例えば、
このようなアッセイに使用し得る担体を製造する事が技
術的に困難であったり、担体に対する標識抗体（又は抗
原）等の非特異的吸着が高いという問題が指摘されてい
る。

本発明者の研究によれば、毛細管含有の多孔性担体とし
て例えばガラス繊維濾紙として知られるガラス繊維集積
体は、微量のサンプルを用いて簡便な測定操作を行なお
うとする場合、その毛細管構造の特質によって内部にサ
ンプル又は試薬等が容易に浸透し、抗体等との接触が良
好に得られる点で都合のよいものであると考えられた。

またこのガラス繊維濾紙は他の多くの多孔性材料に比へ
非特異的吸着が低いという特徴もある。

しかし反面において、このガラス繊維集積体は強度が非
常に弱いため、製造、試験等の際に取扱い性に難があり
、また抗体又は抗原を固定化する方法として従来より知
られる抗体又は抗原で被覆された固体粒子をガラス繊維
上に保持固定させる方法（例えば特開昭６２−２２８１
６７　、特開昭６１−２９２０５９　）のように、固定
化が必ずしも簡便ではないという欠点をもつ。

そこで本発明者は、上記の如く例えば免疫測定の抗体等
の固定化担体として使用し得るガラス繊維集積体を改良
することで、優れた取扱い性を実現し、したがって迅速
な測定を可能とする毛細管含有の多孔性担体を提供する
ことを目的とするところにある。

また本発明の別の特徴は、担体に対して固定化すべぎ物
質を物理的に固定化可能とすることにより、抗体等の固
定操作を容易とし、しかも非特異的吸着の低い毛細管含
有の多孔性担体を提供するところにある。

［課題を解決するための手段］ 上記目的を実現した本発明よりなる担体の特徴は、シラ
ンカップリング剤が表面に結合され、かつ内部に毛細管
構造をもったガラス繊維集積体であって、上記シランカ
ップリング剤は集積体を構成する繊維間を架橋している
という構成をなすところにある。

上記において、ガラス繊維の種類は自由に選択し得る。

このようなガラス繊維としては、例えばホウケイ酸ガラ
ス、石英ガラス、ソーダ石灰ガラス、鉛ガラスなどの繊
維があげられる。

これらのガラス繊維よりなり、微毛細管構造を有するも
のならば、本発明の担体として使用し得るが、人手のし
易さおよび微毛細管構造を有するという点から、市販の
ホウケイ酸ガラス製ガラス繊維濾紙が好ましいものとし
て例示できる。ガラス繊維集積体の厚さは特に限定され
ない。

本発明において使用し得るシランカップリング剤として
は、水あるいは水と混和する有機溶媒に可溶で、その重
合体が水に不溶および非膨潤であるならば特に限定され
ないが、官能基を有するものは、抗体又は抗原を化学的
に結合させることが出来る。

このようなシランカップリング剤としては、下記一般式 ％式％） （式中ｘ１は、グリシドキシ基、アミノ基、カルボキシ
基、インチオシアノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、
スルフィドリル基又はハロカルボニル基、Ｒ３は、塩素
、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基、Ｘ
、は、塩素、メトキシ基又はエトキシ基、Ｒ°２は、ア
ルキル基又はフェニル基を示す）のもの、具体的には例
えばγ−グリシドキシプロピルメチルジェトキシシラン
、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ−メルカ
プトプロピルトリエトキシシラン、γ−クロロプロピル
トリエトキシシラン等を例示でき、特に、γ−グリシド
キシプロビルトリメトキシシランをアセトニトリルに１
〜１００％好ましくは５〜１０％の濃度（Ｖ／Ｖ）で混
合した溶液は、免疫学的測定に最適な担体を製造するこ
とができる。

上記ガラス繊維集積体（以下これを基材という場合があ
る）は、基材のシランカップリング処理と同時に、重合
開始剤の存在下、該シランカップリング剤を重合させる
ことにより好適に製造することができる。重合開始剤と
しては下記式 ％式％（ （式中Ｒは、水素又はアルキル基を示す）のもの、具体
的には、テトラメチルアンモニウムハイドロキサイド、
テトラエチルアンモニウムハイドロキサイド、テトラプ
ロピルアンモニウムハイドロキサイド、テトラブチルア
ンモニウムハイドロキサイド、アンモニウム水等を例示
することができ、好ましくはテトラブチルアンモニウム
ハイドロキサイドを０．１％になるように添加すること
によりシランカップリング剤を好適に重合させることが
できる。

シランカップリング剤を重合させることにより、ガラス
繊維基材からなる集積体に十分な強度を持たせることが
でき、ガラス繊維基材からなる集積体の欠点である脆弱
さを改善することができる。

シラン処理は、重合開始剤を添加したシランカップリン
グ剤溶液をガラス繊維上に滴下し、乾燥させることによ
って為される。このシラン処理ガラス繊維集積体は、シ
ランカップリング剤の種類よって抗体又は抗原を物理的
又は化学的に結合させることが可能である。例えば、γ
−グリシドキシプロビルトリメトキシシランを用いた場
合、エポキシ基をケン化したものは、抗体又は抗原を物
理的に吸着させることかでき、またＮ、Ｎ’−カルボニ
ルジイミダゾールで活性化して、抗体又は抗原を反応さ
せることにより共有結合させることも可能である。

［発明の効果コ 本発明のシラン処理したガラス繊維基材からなる集積体
としての担体は、物理的にも化学的にも抗体又は抗原を
結合させることが可能で、非特異的吸着が低く、十分な
強度を持つ。また同担体は微毛細管構造を有する多孔性
担体であるため、毛細管の作用によって例えば抗体と抗
原を相互作用させることができる。また、これらの特性
により、デイツプスティック、ドライケミストリーおよ
びその他の公知の免疫学的測定用の担体等、生化学反応
用担体として用いることかできるという効果がある。

また本発明においては、タンパク質等を非特異的吸着を
俄レベルに維持したまま担体に物理的に結合可能である
という効果が確認された。

このことの意義は重要である。例えば煩雑な処理を必要
とする化学的結合の場合に比べて、物理的結合は処理が
極めて簡単であり、低コスト・邊 で迅速に大量の処理ができる効果かる。また物理的結合
によれば、微量の物質を担体に対し局所的に容易に固定
化できるため、微量の物質を有効に利用できると共に、
これにより以下説明する第１図のようにスポットの発色
を行なわせることができるので一つの担体上で複数の反
応結果を容易に比較することも可能となる効果がある。

更に被担持物を臨機応変に決定することが求められる場
合のある分野において、適宜かつ容易に本発明の担体と
所定の結合すべき物質の結合処理ができるという効果も
ある。

［実施例］ 次の実施例は本発明の新規な担体の製造法と、これを使
用した一例的な免疫学的測定法の操作を例示したもので
あるが、本発明の範囲を限定するものではない。

例１．シラン処理ガラス繊維集積体の製造５％（Ｖ／Ｖ
）γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランのアセ
トニトリル溶液１０ｍ１に、４０％テトラブチルアンモ
ニウムハイドロキサイド水溶液を２５μｌ添加し、水中
に置いた。

この溶液を、ワットマンＧＦ／Ｂガラス繊維濾紙（ワッ
トマン社製）４ｘ９ｃｍの切片上に、滴下と乾燥を３回
繰返して適用し、室温で一夜放置した。これを、ＩＮ塩
酸中で室温にて３時間反応させ、エポキシ基をケン化し
た後、精製水で洗浄し乾燥した。

例２．シラン処理ガラス繊維集積体の強度例１で作製し
たシラン処理ガラス繊維濾紙、未処理ガラス繊維濾紙（
ワットマンＧＦ／Ｂ）　、およびクロマトグラフィー用
イ慮紙（ワットマン３１ＥＴ　Ｃｈｒ；　ワットマン社
製）の径６ｍｍ切片を１枚づつそれぞれ試験管にとり、
５　ｒｎｌの水を加え、試験管ミキサー（ＭＴ−３１、
ヤマト化学）にて、同時に２分間攪拌した。その結果、
例１で得られた担体およびクロマトグラフィー用濾紙に
は変化が見られなかったが、未処理のガラス繊維濾紙は
表面が崩壊し始めていた。この結果から、ガラス繊維濾
紙は本発明の製造法による処理によって、クロマトグラ
フィー用濾紙と同等かあるいはそれ以上の強度を得たと
言える。

次に例１で作製した担体と、上記未処理のガラス繊維濾
紙の引張り強度を引張り試験装置（オートグラフ八Ｇ　
２０００Ｂ　　；島津製作所）にて測定し、その結果を
下記表１に示した。

この結果から、本発明の処理により引張り強度が約９倍
に増加したことが分る。

表１ニジラン処理ガラス繊維濾紙の強度例３．シラン処
処理ガラス繊維紙の非特異的吸着 例１のシラン処理ガラス繊維濾紙の径６ｍｍ切片２枚を
、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩溶液（ｐＨ７，５）［Ｐ
ＢＳ］　−１％牛血清アルブミン［ＢＳＡ］中で、４℃
にて一夜プロッキングした。これ等の切片およびブロッ
キングをしていない径６ｍｍ切片１枚を用い、それぞれ
１枚につき２０μｌのマウスイムノグロブリンＧ−アル
カリ性ホスファターゼ［ＡＬＰ］コンジュゲート（Ａ　
２８０＝４．２　Ｘｌ０−’）を滴下し、室温で１時間
放置した後に、ＰＢＳ−０，５％Ｔｗｅｅｎ　２０で洗
浄した。

これ等の切片のうちブロッキングした切片２枚を試験管
に移し、５ｍＭパラニトロフェニルホスフェート［ＰＮ
ＰＰ］の０．２５Ｍ　　２−アミノ−２−メチル−１−
プロパツール・酢酸（ｐＨ１０，０）［ＡＭＰ］溶液を
５００μｌ加え、室温で１．５時間反応させ、一方、ブ
ロッキングしていない切片は、１枚を試験管に穆して５
　ｍＭ　ＰＨＰＰの０．２５ＭＡＭＰ溶液をＳＯＯμｌ
を添加して室温で１時間反応させた。次に、それぞれに
０．１４Ｍリン酸緩衝−０，１ＭＥＤＴ＾（ｐＨ９，１
）　　［クエンチャ−］を５００μｍ添加し、反応を停
止させ、波長４０５ｒ＋ｍにおける吸光度を測定した。

比較例 また比較のためにクロマトグラフィー用濾紙（ワットマ
ン３１　ＥＴ　Ｃｈｒ、ワットマン社製）、ニトロセル
ロースフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ、東洋濾紙
社製）およびデュラボアフィルター（ポアサイズ０．２
２μｍ、ミリポア社製）についても、前述例３と同様な
操作を行った。

その結果を表２に示した。ここでブロッキングしたもの
の発色は、その素材に対するコンシュゲイトの非特異的
吸着を、ブロッキングしてないものの発色は、その素材
に対するコンシュゲイトの吸着量をそれぞれ反映すると
考えられる。

ここに選んだ多孔性材料の中で、シラン処理ガラス繊維
濾紙は、コンシュゲイト吸着量がニトロセルロースフィ
ルターおよびデュラボアフィルターと同程度であるが、
非特異的吸着は最も低いことが分る。これにより本発明
の担体には物理的結合によって効果的に結合が可能であ
り、非特異的吸着が低いことが確認された。

例４．インスリンの免疫学的測定 第１図に示したように、シラン処理ガラス繊維濾紙ｌＸ
４ｃｌＩｌ切片上の３点に、１　ｍｇ／ｍｌ抗インスリ
インスリン抗体Ｍ炭酸緩衝溶液（ｐＨ９，６）を２０μ
ｍ滴下し、室温で１時間放置して吸着、固定化した後Ｐ
ＢＳ−１％ＢＳＡ中、４℃で一夜プロッキングした。こ
の切片を吸水材（濾紙）の上に設置した。抗体を固定化
したスポット上に、第１図のようにインスリン標準血清
のＯμ［１／ｍｌ、　１６０　μＵ／ｍｌ、　３２０　
μｍ１７ｍ１をそれぞれ１０μ１１及び抗インスリン抗
体−ＡＬＰコンシュゲイト（Ａ２８０　＝４．２　Ｘｌ
０−３）を１０μｌそれぞれに滴下した。室温で１０分
間反応させ、ＰＢＳ−０，５％Ｔｗｅｅｎ　２０を滴下
して洗浄した後、１ｍｇ／ｍ１５−ブロモ−３−インド
リルホスフェート・Ｐ−）ルイジン塩の０．２ＳＭ　Ａ
ＭＰ溶液を滴下し、発色を調べた。その結果を第１図、
第２図に示した。

第１図から分るように、インスリン標準血清の０μＵ／
ｍｌを滴下した点に目視で肥められる発色はなく、１６
０　μＵ／ｍｌおよび３２０　μＵ／ｍｌを滴下した点
はスポット状の発色を示した。この切片の波長６００ｎ
ｍにおける反射吸収をデンシトメータ（クロマトスキャ
ナーＣ５−９３０；島津製作所）によって測定した結果
が第２図である。

これらの結果から、本発明のガラス繊維濾紙は抗体溶液
を滴下するだけで抗体を局所的に吸着させることが可能
であり、抗体の固定化が容易で、非特異的吸着が低く、
免疫学的測定の担体として有効であることが分る。また
、本担体を使用することにより短時間で、しかも微量の
サンプルで免疫学的測定を実施することか可能となる。

【図面の簡単な説明】 図面第１図は本発明の担体を用いてインスリンの測定を
行なった例４の発色の状態を説明するための図、第２図
は同発色の状態をデンシトメータで■■■の順にスキャ
ニングして波長８００ｎｍでの反射吸光を測定した結果
を示した図である。 トシラン処理ガラス繊維基材からなる濾紙２：固定化し
た抗インスリン抗体のスポット３：インスリン標準血清
（０μｍ１７ｍ１）の滴下点４＝インスリン標準血清（
１６０μｍ１７ｍ１）の滴下点５：インスリン標準血清
（３２０μＵ／ｍｌ）の鏑下点第１ト ガラス繊維濾紙上の 抗体のスポットと発色 第２図 インスリン標準血清

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　シランカップリング剤が結合され、かつ内部に毛細
   管構造をもったガラス繊維集積体であって、上記シラン
   カップリング剤は集積体を構成する繊維間を架橋してい
   ることを特徴とする生化学反応用担体。 ２　シランカップリング剤が下記一般式で表わせるもの
   であることを特徴とする請求項１に記載の生化学反応用
   担体 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘ＿１は、グリシドキシ基、アミノ基、カルボキ
   シ基、イソチオシアノ基、アルコキシ基、アルデヒド基
   、スルフィドリル基又 はハロカルボニル基、Ｒ＿１は、塩素、メチル基、エチ
   ル基、メトキシ基又はエトキシ 基、Ｘ＿２は、塩素、メトキシ基又はエトキシ基、Ｒ＿
   ２は、アルキル基又はフェニル基を示す）。 ３　上記シランカップリング処理と同時に、重合開始剤
   の存在下、該シランカップリング剤を重合させることを
   特徴とする請求項１又は２に記載の生化学反応用担体の
   製造方法。４　重合開始剤が、下記式で表わせるもので
   あることを特徴とする請求項３に記載の生化学反応用担
   体の製造方法 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは、水素又はアルキル基を示す）。